Rongeurs
Développement d’un traitement pour une maladie neurologique associée à une cardiomyopathie par thérapie génique chez les souris (3/3)
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
3 892 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, chacune pouvant subir jusqu'à treize tests de force, treize mesures de motricité et treize échocardiographies sous anesthésie gazeuse. Un quart d'entre elles, celles dont le gène est aboli, développent une cardiomyopathie vers huit semaines et meurent vers douze, en perdant du poids et en adoptant une posture anormale à partir de la onzième. Les nouveau-nés reçoivent une injection intraveineuse après immobilisation par hypothermie sur de la glace humide, et les animaux circulent entre trois établissements. Toutes sont tuées pour prélèvements terminaux, le porteur écrivant espérer restaurer la protéine défectueuse avant d'envisager un essai chez l'humain.
Objectifs
Les mutations du gène d’intérêt provoquent une maladie rare affectant le cerveau, le cœur et le foie. Ce type de maladie se manifeste dans les premiers mois de la vie et la majorité des enfants meurent vers l'âge de deux ans. À ce jour, il n'existe aucun traitement pour cette maladie. Le gène d’intérêt code pour une protéine essentielle pour la production d'énergie dans nos cellules. L’objectif général de ce projet est de développer un traitement pour la maladie causée par des mutations du gène d’intérêt par thérapie génique chez les souris. En particulier, nous allons développer des vecteurs thérapeutiques pour transporter la version normale du gène d'intérêt humain dans le corps des souris malades. L’expression de la version normale du gène d'intérêt peut réparer les dommages causés par la mutation du gène d'intérêt. En injectant ces vecteurs thérapeutiques dans les souris malades, nous espérons restaurer la fonction de la protéine défectueuse dans les organes touchés. Ce projet est multi-site et sera réalisé sur 3 établissements.
Bénéfices attendus
À ce jour, les maladies causées par des mutations du gènes d’intérêt ne disposent toujours pas de traitement curatif permettant de les guérir ou de contrôler leur évolution. Le projet permettra de développer et d'évaluer l'efficacité thérapeutique de notre approche chez la souris. Une fois que nous aurons prouvé que notre approche de thérapie génique fonctionne sur les souris malades, nous pourrons envisager de la tester sur des êtres humains dans le cadre d'essais cliniques.
Procédures
L'élevage des animaux transgéniques se fera dans l'établissement 1 avec biospsie de la queue sur animaux vigiles (1 fois par souris). Dans l'établissement 2 seront réalisées les -Injection par voie intraveineuse dans la veine caudale (30-60 secondes par souris; 1 fois maximum par souris ), -les tests destinés à évaluer le force (5 min par souris ; 13 fois maximum par souris) -Injection par voie intraveineuse dans la veine temporale (30 secondes par souris; 1 fois maximum par souris) - injection en IV sur souriceaux immobilisés par hypothermie (en contact avec de la glace humide) (30-60 secondes par souris; 1 fois maximum par souris). Les études par imagerie non invasive et test comportementauxseront réalisées dans l'établissement 3 : -mesure de la motricité dans un milieu ouvert (10 min par souris ; 13 fois maximum par souris), échographie non invasive sous anesthésie gazeuse (20 min par souris; 13 fois maximum par souris).
Impact sur les animaux
Les souris où l’expression du gène d’intérêt est abolie (seuls 25% des souris de chaque portée) développeront une cardiomyopathie autour 8 semaines, et mourront à 12 semaines. À partir de 11 semaines, ces souris peuvent commencer à perdre du poids et avoir une mobilité réduite avec une posture anormale. Les autres nuisances que les souris subiront sont le stress pendant la contention dans un tube en plastique spécial et l’injection, le stress pendant les tests comportementaux, l’échocardiographie et le stress pendant le transport vers le centre expert de l’échocardiographie.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort, pour prélèvements terminaux.
Remplacement
L’utilisation d’un modèle animal est nécessaire et indispensable dans notre étude car nous devons tester l'efficacité des vecteurs thérapeutiques dans la prévention de la maladie. De plus, en testant l'efficacité thérapeutique chez les souris, qui développent normalement la maladie, nous avons la possibilité de voir si la maladie est prévenue ou si elle est retardée. En outre, l'utilisation de modèles de souris est nécessaire parce que les vecteurs thérapeutiques peuvent exprimer la version normale du gène d’intérêt de différentes manières dans les tissus et les cellules en culture..
Réduction
Afin de réduire le nombre de souris utilisées pour les expériences, nous nous sommes basés sur nos précédents travaux sur l’étude d’autres modèles murins de maladies neurologique et sur des méthodes et analyses statistiques. Pour réduire le nombre total de souris, nous testerons d'abord l'efficacité de 4 vecteurs thérapeutiques sur une partie des souris. Seul le meilleur vecteur sera utilisé après dans les études suivantes. De plus, lorsque cela est possible, les prélèvements d’une même souris seront utilisés pour plusieurs analyses. L’échocardiographie est elle-même une méthode de réduction car elle permet un suivi longitudinal des souris, par opposition à une mise à mort séquentielle.
Raffinement
Dans un contexte de raffinement adapté, les animaux seront surveillés quotidiennement par les techniciens de l'animalerie (dans les weekends par les personnes d’astreinte), et une fois par semaine par les chercheurs travaillant sur ce projet, pour détecter un éventuel état de souffrance et/ou d’angoisse. Pour minimiser la détresse causée par les symptômes de la maladie et lors de l'injection du vecteur thérapeutique, nous avons établi des critères de décision pour la mise à mort des souris lorsque cela est nécessaire. Concernant les injections le volume injecté sera réduit au minimum possible et la solution sera chauffée à la température ambiante et l'aiguille pour l'injection sera la plus fine possible. Concernant l'injection chez les souriceaux nouveau-nés, nous prendrons des mesures pour minimiser leur stress : l'éloignement temporaire de la mère et la préservation de la litière de la cage maternelle. En outre les injections des nouveau-nés seront effectuées sous anesthésie par hypothermie induite par la stimulation du petit sur de la glace humide pendant 30-60 secondes. Concernant l'échocardiographie, les souris seront anesthésiées, pour être capable de mesurer correctement les différents paramètres du système cardiaque et éviter le stress. Pour assurer le bien-être des souris, elles seront placées en cage groupée dans un milieu enrichi avec des carrés de coton, des maisonnettes et des bâtonnets à ronger. L’enrichissement social des souris sera garanti. Le transfert des souris vers le centre expert de l’échocardiographie se fera dans des cages de transport sécurisées dans des véhicules dédiés tout en réduisant les vibrations et le bruit. En plus l'échographie et les tests comportementaux ne sont effectués que 7 jours après l'arrivée des souris pour permettre leur acclimatation.
Choix des espèces
Les souris sont génétiquement, physiologiquement et anatomiquement plus proches des humains. De plus, afin de tester l'efficacité du traitement pour le développement de la thérapie génique, l'utilisation de mammifères est indispensable et les souris représentent un bon modèle. Pour nos études, nous utiliserons des souris de différentes tranches d'âge. Pour l'injection, nous utiliserons des nouveau-nés et souris juvéniles. Les tests comportementaux et les échocardiographies seront réalisés sur des souris juvéniles et adultes
Apprentissage des méthodes, maintien des acquis techniques et développements technologiques
- Formation professionnelle
Rats : 750
Gavages quotidiens, prélèvements sanguins répétés, injections dans le sinus rétro-orbitaire deux fois par œil : 1 500 souris et 750 rats vont subir ces gestes pour que des personnels apprennent à les exécuter, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. L'inexpérience des apprenants peut causer une perforation de l'œsophage, une fausse route mortelle, une nécrose ou une brûlure de la queue, une section de la queue au scalpel, une éraflure de l'œil rendant l'animal borgne. L'objectif affiché reste pourtant de garantir le bien-être des animaux non-humains par la maîtrise du geste, pour cinq personnes formées par an pendant cinq ans. La mise à mort sert elle aussi d'exercice : le porteur indique qu'elle permettra à la personne formée d'apprendre la dislocation cervicale et l'appareil à hypoxie au CO2.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de permettre au personnel de notre laboratoire de pouvoir se former aux gestes et techniques de base de notre métier. Ces procédures menées sur les animaux de laboratoire doivent être accomplies avec une maîtrise parfaite des gestes techniques pour garantir leur bien-être ou pour réduire au maximum l’inconfort résultatnt de l'expérimentation. La période d’apprentissage de l’expérimentateur est importante car elle va conditionner la qualité du travail qui sera fourni ultérieurement.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu par ce projet est de former un personnel et de transmettre un savoir-faire en expérimentation animale à des personnels novices ou nécessitant une remise à niveau.
Procédures
Les administrations intra gastriques (gavages) ne doivent pas prendre plus de 15 secondes par animal que ce soit pour les souris ou pour les rats. Ils peuvent être répétés quotidiennement pour s’assurer que le geste est bien maîtrisé et qu’il n’entraîne pas de perte de poids. Les prélèvements sanguins pourront être faits jusqu’à 4 fois par animal avec un temps de récupération d'une semaine nécessaire avant de procéder à un nouveau prélèvement. Ce sera aussi l'occasion pour l'expérimentateur d'apprendre à utiliser le système dédié à l'anesthésie volatile gazeuse. Lorsque le prélèvement est maitrisé, un ultime prélèvement terminal pourra être fait en fin de procédure, il sera d’un volume plus important. S'ensuivra toujours sous anesthésie gazeuse, la mise à mort de l'animal par dislocation cervicale, toujours sous la surveillance d'une personne habilitée et expérimentée au sein de notre établissement utilisateur. Pour les souris, les administrations en sous-cutané, en intra-péritonéale, en intra-musculaire et intraveineuses pourront être faites jusqu’à 3 fois avec un minimum de 3 jours entre chaque injection. Dans le cas de l'injection intra veineuse au sinus rétro-orbitaire, chaque animal ne pourra être utilisé que 2 fois par œil injecté avec un délai de repos de 5 jours entre 2 injections. Chaque geste d’injection durera environ 10 secondes. Tous ces gestes sont effectués sous la surveillance d'une personne expérimentée au sein du laboratoire.
Impact sur les animaux
Lors des apprentissages certains effets néfastes peuvent être rencontrés dûs à l'inexpérience des utilisateurs. Lors des gavages, une irritation de l'oesophage voire la perforation est possible entrainant pour le premier une perte de poids et pour le second la perte de poids précédent la mort de l'animal. De même une fausse route entraînera la mort de l'animal. Lors des administrations intraveineuses à la veine caudale, l'injection d'une bulle d'air bien que ne devant pas se produire, pourrait arriver entrainant la mort de l'animal. Les injections répétées et/ ou ratées peuvent engendrer des lésions sur la queue de l'animal pouvant aller jusqu'à la nécrose, de même lorsque la queue est trempée dans de l'eau chaude pour dilater les veines, la brulûre de la queue est à envisager. Lors d'administrations intraveineuses au sinus retro orbitaire, une mauvaise insertion de l'aiguille peut entraîner une eraflure de l'oeil entrainant une cécité de l'oeil concerné. Une anesthésie gazeuse ou injectée mal maîtrisée peut entrainer l'arrêt cardio-respiratoire de l'animal et la mort. Lors des prélèvements de sang au sinus rétro-orbitaire l'éraflure de l'oeil avec le capilaire peut entrainer une cécité de l'oeil concerné, de même une mauvaise compression de l'oeil suivant le prélèvement peut engendrer un hématome entrainant l'exorbitation nécessitant la mise à mort de l'animal. Lors des prélèvements de sang à la veine caudale, une mauvaise maîtrise du geste de scarification au scalpel peut entrainer le sectionnement de la queue. Toutes des interventions sont qualifiées de modérées.
Devenir
A l'issue de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés soit par dislocation cervicale, soit par hypoxie au CO2. On estime que ces animaux auront vieilli et ne seront plus suffisamment naïfs pour participer à d'autres études. De plus, ce sera l'occasion pour la personne formée d'apprendre à utiliser l'appareil à euthanasie par hypoxie au CO2 et d'apprendre la technique de dislocation cervicale sous le contrôle d'une personne habilitée et expérimentée.
Remplacement
Dans un premier temps, des vidéos ainsi que nos protocoles qualités seront mis à disposition des personnes devant se former aux gestes d'expérimentation sur les animaux. Ensuite, les apprentissages de préhension, injections et identifications par puces pourront se faire sur modèle inerte type CurVet Rat ou Mimicky Mouse. Une fois que la personne se sent suffisamment en confiance avec ses gestes, celui-ci pourra passer sur animaux vivants. L'utilisation de cadavres n'est envisageable que pour certaines actions ne nécessitant pas de visualiser une veine ou de nécessiter d'un reflux sanguin comme pour les intraveineuses. Ainsi, les cadavres pourront être utilisés pour les intra-péritonéales, les sous-cutanés ainsi que pour s'exercer à l'insertion d'un capillaire ou d'une aiguille dans le sinus rétro-orbitaire. Ils pourront également être utilisés pour les incisions de queue au scalpel ce qui permettra à l'apprenant d'appréhender le geste et les limites pour ne pas sectionner complètement la queue d'un animal vivant.
Réduction
Bien que n'ayant pas de vision à long terme du nombre de personnes à recruter et / ou former, nous estimons que la formation de 5 personnes par an est envisageable, en considérant aussi bien les besoins humains des projets en expansion que le "turn over" de la profession. En considérant 1 lot de 20 souris (ou 10 rats) pour l'apprentissage des gavages, 1 lot de 20 souris (ou 10 rats) pour les intraveineuses et un lot de 20 souris (ou 10 rats) pour les autres gestes qui peuvent être répétés tels que les IP, les sous-cutanés, cela par an pour 5 personnes en apprentissage, cela fait 15 lots de 20 souris par an et 15 lots de 10 rats par an soit 300 souris et 150 rats par an pour un total de 1500 souris et 750 rats pour la globalité du projet. Cette estimation est le maximum que nous pourrons utiliser sachant que parmi ces animaux, certains peuvent subir plusieurs gestes comme un gavage et un prélèvement sanguin. L'utilisation d'animaux de réforme n'est pas envisagée car nous n'avons pas d'élevage au sein de notre établissement utilisateur et les animaux de nos autres projets sont prévus pour une procédure précise et doivent être euthanasiés une fois la procédure achevée, il n'est pas prévu de réutilisation de ceux-ci.
Raffinement
Les apprentissages se feront dans un premier temps par le biais de vidéo éducative, puis par l'utilisation de modèle d'animaux inerte. Puis dans un second temps lorsque l'utilisation d'animaux vivants se trouvera nécessaire, une démonstration des gestes par 2 personnes du laboratoire habilitées et expérimentées sera faite. Lors de la phase d'exercice par la personne formée, celui-ci sera accompagné de personnes du laboratoire. Le formé s'occupera de ses propres animaux (change et soins) et procèdera à la pesée de ceux-ci afin de vérifier qu'ils s'alimentent et qu'il n'y pas de perte de poids nécessitant une mise à mort. Cela permettra également de former le nouvel entrant à repérer les signes de mal-être animal et de l'y sensibiliser. De plus, lorsque la personne formée se sent à l'aise avec les gestes qu'elle a acquis, une évaluation sera faite en présence du responsable du laboratoire vivo de l'établissement utilisateur ainsi que d'un assistant de recherche.
Choix des espèces
Le choix des espèces rats et souris pour ce projet de maintien de compétences et d'apprentissage de techniques est justifiée par le fait qu'il s'agit des espèces utilisées dans les programmes de recherches sur la sphère hépatointestinales effectuées au sein de notre établissement utilisateur. Les souris adultes et les rats matures seront employés car ils présentent les caractéristiques idéales pour l'apprentissage de personnel novices ou peu expérimentés
Etude de l’intérêt des implants en graphène dans l’amélioration du diagnostic des pathologies rétiniennes et en thérapeutique (restauration visuelle) chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
Neuf examens de la rétine, sept séances d'enregistrement d'une heure et jusqu'à quatre heures de stimulation électrique sous anesthésie : 500 rats vont être utilisés dans des procédures allant de la souffrance modérée à sévère, une partie opérée sans réveil, tous tués à l'issue pour des prélèvements post-mortem. Une partie reçoit une injection qui détruit leur rétine, d'autres portent une mutation qui les rend progressivement aveugles. La pose d'électrodes sous la rétine dure jusqu'à une heure trente, et le porteur décrit comme risques une inflammation persistante dans 5 % des cas, le décollement de la fenêtre crânienne, une hémorragie sous celle-ci ou l'arrachement du connecteur par l'animal. Le rat a été retenu parce que son œil est assez grand pour recevoir les implants, la souris ayant été écartée pour cette seule raison.
Objectifs
Les pathologies rétiniennes touchent chaque année 10 millions de personnes dans le monde. Les plus connues sont la rétinite pigmentaire (RP) et la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) qui se caractérisent par la dégradation progressive des photorécepteurs et mènent irrémédiablement à la cécité. Afin d’améliorer la prise en charge des patients atteints, il est essentiel de disposer d’outils performants pour les diagnostiquer le plus tôt possible et de développer des stratégies de restauration visuelle qui pallient les traitements médicamenteux actuels inefficaces. Divers types d’interfaces cerveau-machine ont été développés ces dernières années pour le diagnostic (enregistrement des signaux électrophysiologiques via des électrorétinogrammes) et pour la restauration visuelle (stimulation électrique des neurones résiduels). Le matériau des électrodes joue un rôle majeur dans les performances et la longévité de ces interfaces. Par exemple, les prothèses actuelles en tests cliniques ne permettent pas une résolution spatiale suffisante pour l’autonomie complète du patient aveugle. De même, les électrodes actuelles en or utilisées en diagnostic clinique ne fournissent pas une précision optimale pour la caractérisation des fonctions rétiniennes. Les matériaux carbonés possèdent de prometteuses propriétés électrochimiques qui permettraient une stimulation électrique plus efficace et/ou une restitution plus fidèle des signaux neuronaux rétiniens. L’objectif de ce projet est de démontrer la performance de ces nouveaux types d’implants, aussi bien dans la détection de signaux rétiniens anormaux (diagnostic) ou bien dans la stimulation électrique sous-rétinienne à la manière de photorécepteurs artificiels (thérapeutique). Cette étude sera menée sur deux modèles murins. Pour les implants en mode diagnostic, la validation fonctionnelle sera effectuée par enregistrements de l’activité de l’œil in vivo (électrorétinogrammes). En mode thérapie (restauration visuelle) la validation fonctionnelle sera réalisée par stimulation électrique de la prothèse et enregistrement simultanée des signaux corticaux.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de démontrer la supériorité des matériaux carbonés incorporé dans des interfaces cerveau-machine en permettant un enregistrement d’électrorétinogrammes (ERG) de qualité plus fine ainsi qu’en apportant une stimulation électrique plus stable et plus performante dans le temps. Ces implants, biocompatibles et plus performants que les prothèses classiques métalliques, permettront la mise en place d’une nouvelle génération d’interfaces dans l’espoir d’une translation clinique chez l’humain pour le diagnostic précoce de pathologies liées à la dégénérescence de l’épithélium rétinien pigmentaire (RPE) et pour la restauration visuelle.
Procédures
Les animaux sont soumis aux interventions suivantes : Injection d’un composé chimique induisant une dégénération de la rétine (5 min) : 1 fois par rat sous anesthésie générale et analgésie. Enregistrements des signaux rétiniens sur rats (1h) : 7 séances par animal sous anesthésie générale pour les rats normaux, et 5 fois par rat atteint de dégénérescence progressive de la rétine sous anesthésie générale (fixe) Examens de la rétine : - les rats normaux seront imagés un jour avant chaque session d’enregistrements rétiniens 7 fois sous anesthésie générale fixe, pendant 10 min. - les rats rat atteint de dégénérescence progressive de la rétine seront imagés 5 fois afin d’observer la dégénérescence sous anesthésie générale fixe, pendant 10 min. - Tous les rats avec des implants sous la rétine feront 9 examens de la rétine, le tout sous anesthésie générale fixe pendant 10 min. Chirurgie pour implantation sous la rétine d’électrodes : - rats normaux et aveugles, 1 fois par animal avec ou sans réveil pendant au maximum 1h30 sous anesthésie générale et sous analgésie Imagerie du cerveau et stimulation électrique de l’implant sous-rétinien sous anesthésie fixe - les rats avec un implant rétinien seront imagés et stimulés pendant 4h avec euthanasie à la fin de l’expérience. - autres rats avec un implants rétinien seront imagés sur 8 séances pendant 1h30. Mesures des propriétés électrochimiques l’implant : - les rats implantés avec un implant sous la rétine feront l’objet de mesures électrochimiques sur 9 séances, pendant 1h30/séance, sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Durant les chirurgies une mauvaise réaction à l’anesthésie peut survenir tel que : stress thermique, détresse cardio-respiratoire, arrêt cardiorespiratoire (rare). Les anesthésies par injection intrapéritonéales répétés peuvent engendrer à terme une résistance à l’anesthésie. Pour les animaux implantés en sous-rétinien, une éventuelle inflammation au niveau du site d’implantation peut apparaître, se résorbant naturellement généralement sous 7 jours (95 pour cent des cas). Dans les cas où l’inflammation ne se résorbe pas (5 pour cent), le rat sera surveillé, re-imagé à 14 jours et gardé s’il ne montre pas de signes de douleur, détresse ou de problèmes oculaires (paupière gonflée, paupière fermée, cataracte). La pose d’implants chronique avec fenêtre/aminci cranial peut engendrer dans les 3 premiers jours post-chirurgie un stress physique et une perte de poids, en plus du stress social lié à son isolement en cage. Il existe également un risque que la fenêtre chronique se décolle, que les fils de suture sautent (auxquels cas ils doivent être immédiatement recousus), qu’il y ait une hémorragie sous la fenêtre, ou encore que l’animal arrache le connecteur.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure. En effet, des prélèvements et analyses complémentaires sont nécessaires post-mortem.
Remplacement
Dans ce projet, l’enregistrement des électrorétinogrammes ainsi que la transmission de l’information visuelle au cerveau suite à un stimulus électrique ne peuvent pas être réalisés par des expérimentations ex vivo. Le suivi des caractéristiques électrochimiques dans des conditions proches de l’humain n’a de sens qu’évalué in vivo chez le rongeur en pré-clinique. De même, les activations neuronales et variations de flux sanguin mesurées par les techniques d’imagerie par ultrasons au niveau du cortex visuel ne peuvent être observées que sur un cerveau en fonctionnement. L’utilisation du modèle animal est donc indispensable.
Réduction
Basé sur l’expertise du laboratoire, sur des projets proches, le nombre d’animaux a été estimé pour obtenir un nombre minimum de résultats significatifs tenant compte des éventuelles pertes dues à une mauvaise implantation, une mauvaise réaction à l’anesthésie, ou par atteinte des points limites durant les procédures expérimentales. La rédaction d’un protocole précis ainsi que la bonne maîtrise des outils de chirurgie et d’imagerie par les expérimentateurs correspondants permet de minimiser les pertes inutiles. Une analyse de puissance statistique a été faite et le nombre d’animaux utilisé par protocole expérimental a été estimé en vue d’atteindre un compromis entre une puissance élevée et un nombre d’animaux raisonnable. Ceci implique l’utilisation de 500 animaux au total.
Raffinement
Les animaux en provenance de l’extérieur observeront une période d’acclimatation de 5 jours minimum, et sont hébergés en binôme avant le début des expériences. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce utilisée. Les animaux sont examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et/ou les expérimentateurs. Lors des différentes procédures, les animaux bénéficieront d’une anesthésie gazeuse ou fixe intrapéritonéale prodiguée par une seringue et une aiguille. Un analgésique, un anesthésiant local et un anti-inflammatoire seront administrés afin que l’animal sous anesthésie ne ressente aucune douleur pendant l’expérimentation. La douleur post-opératoire est gérée par l'administration d'analgésique jusqu’à 3 jours post-opération. Une signalétique spécifique mise en place permettra une surveillance quotidienne adaptée des animaux en expérimentation tout particulièrement pour les chirurgies. Tout signe d’inconfort ou de détresse sera pris en compte tels que l'apparence et la position anormale, dos courbé, position couchée sur le côté ; comportements anormaux : agressivité soudaine, abattement, inactivité, vocalisation et mutilation, isolement, réduction de la mobilité. Des points limites adaptés au projet ont été définis.
Choix des espèces
Les rats présentent une architecture de l’œil très proche de celui humain, une organisation de la rétine similaire. Nous utilisons généralement dans le cadre de nos études des rats normaux, dont la taille de l’œil est adaptée à celle des implants fabriqués. Un modèle plus petit tel que les souris n’aurait pas convenu, du fait du trop petit diamètre de l’œil comparé aux implants de diagnostic et de stimulation électrique. Leur rétine devient mature à partir de 8 semaines d’âge, aussi nous les utiliserons à partir de 9 semaines. Des rats de lignée transgénique modélisant la rétinite pigmentaire montre une dégénérescence des photorécepteurs au bout d’environ 9 mois. Nous les utiliserons à partir de cet âge là. Ce modèle génétiquement modifié n’est pas à phénotype dommageable. En effet, La mutation induite entraîne la dégradation progressive des photorécepteurs et donc une cécité progressive, mais pas de douleur, détresse ou souffrance supérieure à celle causée par l’introduction d’une aiguille. Nous utilisons également un autre un modèle de dégénérescence héréditaire de la rétine qui débute à partir de 3 semaines post-naissance. Les enregistrements classiques des signaux rétiniens à partir de 3 mois d’âge montrent un signal plat du fait de la dégénérescence totale. Nous les utiliserons à partir de 2 semaines d’âge jusqu’à 2 mois d’âge, afin de visualiser l’évolution des signaux rétiniens avec l’avancée de la pathologie.
Évaluation d’approches thérapeutiques dans un modèle murin humanisé de la Dystrophie Myotonique de type 1 (DM1)
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Toutes tuées à l'issue pour prélever leurs muscles, leur diaphragme et leur cœur, 1 880 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Porteuses de la mutation humaine de la dystrophie myotonique de type 1, activée par un antibiotique ajouté à la nourriture, elles reçoivent une à quatre injections intraveineuses sous anesthésie, deux prélèvements sanguins, des mesures de force d'agrippement, une échographie cardiaque et un électrocardiogramme. Une chirurgie de quinze minutes sous anesthésie profonde sert à mesurer la force musculaire, la mise à mort suivant immédiatement, avant tout réveil. Le porteur affirme que les souris ne montrent aucun signe de douleur même après plusieurs mois d'induction du phénotype, et renvoie le bénéfice attendu, un médicament, à un éventuel passage ultérieur en essai clinique.
Objectifs
La Dystrophie Myotonique de type 1 (DM1) est une des maladies neuromusculaires les plus fréquentes chez l’adulte. Cette maladie est caractérisée par de multiples symptômes parmi lesquels des atteintes musculaires (faiblesse et fonte musculaire, problème de relaxation), cardiaques (trouble du rythme) et neurologiques, particulièrement invalidantes. Actuellement il n’existe pas de traitement pour cette maladie mais de nombreuses approches thérapeutiques sont évaluées en laboratoire et en essais cliniques chez l’homme. L’utilisation de modèles animaux qui reproduisent des symptômes moléculaires et fonctionnels de la maladie est cruciale pour ces études. Un nouveau modèle murin de la DM1 qui exprime la mutation humaine et reproduit les symptômes musculaires a été caractérisé. Ce modèle qui combine les qualités des deux modèles précédemment les plus utilisés va devenir une nouvelle référence pour les études préclinique de composés thérapeutiques pour cette maladie. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est d’utiliser ce modèle pour évaluer plusieurs nouvelles approches thérapeutiques innovantes développées par le laboratoire. L'objectif à long terme reste d'identifier un composé thérapeutique capable d'aller en essai clinique chez l’homme et à terme devenir un médicament.
Bénéfices attendus
La dystrophie myotonique de type 1 (DM1) est la maladie musculaire la plus fréquente chez l’adulte (1 personne sur 8000 en moyenne au niveau mondial) et est très invalidante. Il n’y a encore aucun médicament pour cette maladie. L’attente des patients pour un traitement ciblé est donc très forte. L’objectif principal de ce projet est la validation de composés thérapeutiques innovants, développés dans notre laboratoire, qui permettraient une amélioration des symptômes spécifiques à la maladie dans le modèle murin, pour ensuite passer à des essais chez l’homme et avoir un médicament spécifique. Les composés évalués dans ce projet pourraient à terme bénéficier, en théorie, à tous les patients atteints de DM1. Par ailleurs, ce projet va également permettre de valider ce nouveau modèle murin comme modèle de référence pour l’évaluation d’approches thérapeutiques qui profitera ainsi à toute la communauté scientifique DM1 et donc accélérer le développement et à la validation d’autres médicaments pour la maladie.
Procédures
Les animaux feront l'objet d'injections en intraveineuse, sous anesthésie. Il y aura, selon les procédures, entre 1 et 4 injections espacées de 2 semaines. Chaque injection prend moins de 2 min par souris. Les souris feront également l'objet de prélèvements sanguins. Cette intervention de moins de 5 min se fera deux fois, un début et en fin de procédure avant l’euthanasie des animaux. Une partie des animaux fera l'objet d'évaluations fonctionnelles non-invasives (mesure de force d’agrippement, échographie cardiaque, électrocardiogramme, mesure de respiration). Enfin, les animaux feront l'objet d'une procédure de mesure de force nécessitant une intervention chirurgicale d’environs 15 min sous analgésie et anesthésie profonde. Cette mesure sera immédiatement suivie par l'euthanasie des animaux avant leur réveil.
Impact sur les animaux
En présence d’inducteur dans la nourriture, les souris vont développer un phénotype, très similaire à celui des patients atteints de Dystrophie Myotonique de type 1 (DM1), caractérisé par de la myotonie (défaut momentané de relaxation musculaire après une contraction) et de la faiblesse musculaire provoquant une baisse générale d’activité. Cependant nos études montrent que les souris ne montrent pas de problème à se déplacer ou à se nourrir. De plus les souris ne montrent pas de signe de douleur même après plusieurs mois d’induction. Donc les nuisances ou effets indésirables qu’elles pourraient expérimenter seront surtout liés à ce phénotype DM1, que nous cherchons à obtenir, similaire à celui des patients et aux procédures dont elles feront l’objet (pour l’identification à l’animalerie d’élevage ou les procédures du projet). A cause des actes dont elles feront l’objet, les souris pourraient ressentir une gêne au point d’injection/prélèvement, et une détresse légère lors des manipulations (comme la mesure du poids chaque semaine à partir du début du protocole ou la contention pour les injections). Les animaux pourraient également subir un stress thermique dû à l’anesthésie ainsi qu’éventuellement une petite hémorragie temporaire suite au prélèvement sanguin. Concernant les effets indésirables dus au traitement, des versions similaires aux composés qui seront évalués dans cette étude ont déjà tété injectées dans des modèles murins d’autres pathologies musculaires et n’ont pas montré de signes évidents d’effets secondaires délétères.
Devenir
Tous les animaux qui entreront dans ce projet (soit un maximum de 1880 souris) seront euthanasiés à la fin de la procédure à laquelle ils seront associés. En effet, dans le cadre de l'évaluation d'approches thérapeutiques comme celles décrites dans ce projet, nous devons vérifier la correction des symptômes moléculaires au niveau des organes atteints. Dans le cas du modèle murin de la maladie que nous étudions (Dystrophie myotonique de type 1), nous devons vérifier l'efficacité de notre traitement au niveau des muscles, du diaphragme et du cœur, ce qui rend strictement nécessaire l’euthanasie en fin de procédure afin de prélever ces organes. Ces marqueurs moléculaires sont très spécifiques à la maladie et corrèlent très bien avec l'état de sévérité et donc également avec l'efficacité du traitement. Ces études d'efficacité seront complétées par l'analyses de marqueurs sanguins pour déceler une éventuelle toxicité.
Remplacement
Dans un objectif de REMPLACEMENT, une sélection in vitro des composés thérapeutiques dans des modèles cellulaires de la maladie (Dystrophie Myotonique de Type 1 ou DM1) sera effectuée avant toute utilisation dans un organisme vivant. Cependant les modèles in vitro de cellules musculaires restent imparfaits puisqu’ils ne reproduisent pas le contexte tissulaire adulte de la fibre musculaire qui est une cellule hautement spécialisée et différenciée. L’évaluation in vivo de l’efficacité des différents composés thérapeutique nécessite d’avoir recours à des modèles de souris transgéniques qui expriment la mutation humaine DM1 et reproduisent la pathologie au niveau moléculaire et surtout physiologique. Ainsi, seuls les composés montrant une forte efficacité sans effet délétère seront injectés dans un premier temps en intramusculaire puis par voie intraveineuse dans les souris DM1.
Réduction
Afin de REDUIRE et d’optimiser le nombre d’animaux, le protocole d’étude a été développé avec une réduction du nombre d’animaux utilisés dans la mesure où tous les animaux issus des croisements (sans distinction de sexe) seront utilisés. Les souris n’ayant pas les symptômes d’intérêt seront utilisées comme contrôles négatifs dans les différentes expériences. De plus, le protocole est établi de manière à ce que chaque animal testé permette d’obtenir le plus de résultats possibles (études fonctionnelles et analyses moléculaires sur plusieurs organes comme les muscles et le cœur). Enfin ce projet se déroulera en plusieurs étapes. Ainsi la réussite de la première étape détermine la poursuite, la mise en place et l’utilisation des animaux prévus dans la seconde étape, et ainsi de suite. Nos études précédentes, ainsi que l’utilisation d’un logiciel de statistiques, nous ont permis de déterminer le nombre minimum de souris à utiliser afin de nous permettre d’évaluer de façon correcte les paramètres observés et assurer la distribution normale de nos données. Ensuite les groupes seront comparés grâce à des tests statistiques appropriés. Pour ce projet, un maximum de 1880 animaux sera utilisé.
Raffinement
Finalement, dans le but RAFFINER le protocole et, en conformité avec la réglementation, toutes les précautions seront prises afin de réduire à son maximum le stress et la souffrance animale. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation avec un cycle jour /nuit automatique : les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès illimité à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec un des enrichissements suivants : carré de lanière kraft, rouleau en carton, bâtonnet en bois ou abri en carton. Si un animal se retrouve isolé (seul mâle d’une portée, animal arrivé seul d’un fournisseur, agression entre congénères, dernier animal dans la cage...), il bénéficiera de deux enrichissements et il sera vérifié par la structure chargée du bien-être animal (SBEA) pour valider ses conditions d’hébergement. Les conditions de températures et d’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les animaux sont surveillés quotidiennement. Afin de réduire la souffrance et le stress des animaux, des points limites (spécifiques à chaque protocole mis en place) ont été établis et un suivi du bien-être des animaux sera réalisé régulièrement. Des modifications importantes de comportement laissant supposer une douleur ainsi qu’une de perte de poids importante seront considérés comme critères d’arrêt en cours d’expérimentation et conduiront à l’euthanasie des animaux concernés. Par ailleurs au cours des différentes procédures, tout acte le nécessitant sera accompagné d’une anesthésie et d’un traitement préventif de la douleur. De plus, une surveillance accrue des animaux sera effectuée pendant une à deux heures après chaque acte.
Choix des espèces
L’efficacité d’une approche thérapeutique pour la Dystrophie Myotonique de Type 1 (DM1) doit être validée sur un modèle animal de cette pathologie. A ce jour, des modèles murins, drosophile et poisson-zèbres ont été décrits pour la maladie. Cependant seuls les modèles murins montrent des symptômes robustes (physiologiques et moléculaires) similaires à ce qui est observé chez les patients. L’étude des différents modèles murins a permis la compréhension de plusieurs symptômes observés chez les patients. Dans ce contexte, le modèle murin DM1, utilisé pour ce projet, présente un énorme avantage : il a la mutation humaine qui ne s’active qu’après l’ajout d’un inducteur (ici un antibiotique : la doxycycline) dans la nourriture. Les souris ne présentent donc pas de symptômes pendant les périodes d’élevage. Quand on active la mutation, à l'âge adulte, les souris développent un phénotype similaire à ce qui est observé chez les patients DM1 : caractérisé par de la myotonie (défaut momentané de relaxation musculaire après une contraction et qui donne son nom à la maladie), de la faiblesse musculaire et de forts défauts moléculaires dans plusieurs organes. Aucune mortalité n’est observée. Pour le projet, les souris seront utilisées à l’âge adulte, quand tous les organes, et surtout les muscles, sont bien développés et que la croissance est terminée.
Intérêt d’associer activité physique et antipsychotique (aripiprazole) dans un modèle murin de schizophrénie
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Pour mesurer si l'exercice physique améliore la tolérance d'un antipsychotique, 214 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Un groupe reçoit une injection quotidienne de phencyclidine pendant quatorze jours, censée reproduire des symptômes de schizophrénie, puis de l'aripiprazole dans l'eau de boisson, deux séances d'imagerie sous anesthésie générale et un mois de tests comportementaux. Parmi eux, l'inhibition du réflexe de sursaut place chaque souris une trentaine de minutes dans un dispositif qui lui inflige trente sursauts mesurés. 118 souris pourront être réutilisées dans d'autres protocoles, les 96 autres étant tuées par perfusion-fixation pour prélever leurs tissus.
Objectifs
La schizophrénie est une pathologie psychiatrique fréquente (1% de la population), qui regroupe des troubles multiples, liés à la pathologie elle-même, au style de vie des patients mais aussi aux traitements et au caractère chronique de leur prise. Hormis les troubles directement liés à la pathologie, le style de vie des patients fait souvent empirer la situation (sédentarité, hygiène négligée, troubles du sommeil, mauvaise alimentation…). S’ajoutent à cela les effets indésirables et inévitables des traitements, qui sont généralement des traitements à vie. De façon très intéressante, la plupart de ces problèmes peuvent être en partie contrebalancés par l’activité physique, reconnue pour être un moyen non-pharmacologique très puissant pour améliorer la santé, non seulement physique mais aussi mentale. De plus en plus d’études révèlent que l’activité physique stimule les fonctions cérébrales en augmentant notamment le nombre de cellules gliales, de neurones, de synapses, et de dendrites, et de vaisseaux sanguins. De tels effets sont associés à une amélioration de la cognition et à une augmentation de la résistance au stress, aussi bien chez l’homme que chez l’animal. L’objectif de ce projet est d’une part, d’approfondir dans des modèles murins de schizophrénie l’impact d’un protocole d’entraînement physique sur l’efficacité et la tolérance d’un traitement chronique par l’aripiprazole (antipsychotique le plus prescrit en France) et d’autre part d’appréhender les mécanismes neurobiologiques sous-jacents à ces modulations physiologiques. Il s’organise en 2 parties. La première vise à développer un système innovant de suivi de l’activité physique volontaire chez des souris ne nécessitant pas d’isoler les animaux. Il sera d’abord testé chez des souris saines puis chez un modèle animal de schizophrénie (délétion du gène de la sérine racémase), connu pour son hyperactivité. La seconde partie est dédiée au traitement chronique, soit par l’aripiprazole, soit par l’entraînement physique ou les deux, d’un modèle animal de schizophrénie induit par l’administration subchronique de phencyclidine.
Bénéfices attendus
Ce projet préclinique s’inscrit en parallèle d’un essai clinique visant à démontrer les effets bénéfiques de l’activité physique adaptée chez les patients souffrant de schizophrénie. Les données recueillies chez l’animal permettront d’apporter des arguments scientifiques supplémentaires sur les bienfaits de l’activité physique sur le cerveau et sur la prévention des effets secondaires des antipsychotiques. La réalisation de ce programme permettra d’affiner la connaissance des mécanismes d’une part, sous tendant les effets bénéfiques de l’activité physique sur les altérations comportementales, anatomiques, électrophysiologiques et neurobiologiques en lien avec la schizophrénie et d’autre part, d’approfondir les mécanismes d’action synergique entre une telle activité physique et un traitement pharmacologique dans ce contexte. Il permettra enfin de développer de nouveaux outils pour le suivi d’activité physique (roues), avec des applications potentielles dans d’autres pathologies.
Procédures
Dans la première partie du projet, les animaux seront soumis à un suivi d’activité dans les roues durant 3 semaines. Dans la seconde partie du projet, les animaux seront soumis à environ 3 mois de suivi, avec 3 semaines d’induction du modèle, 7 semaines de traitements et 1 mois de tests comportementaux. Le modèle consiste en l’injection sous cutanée (durée : 1 minute) quotidienne d’un psychotrope durant 14 jours consécutifs. Le traitement consiste en l’administration d’un antipsychotique dans l’eau de boisson avec ou sans activité physique (roue). Pendant cette période, 2 sessions d’imagerie d’une heure maximum seront réalisées (anesthésie générale). Des séries de tests comportementaux seront ensuite réalisés, dont une majorité directement dans la cage d’hébergement (Intelllicage). L’inhibition du réflexe de sursaut sera évaluée en une seule session d’une durée d’environ 25 min pour chaque souris. La sociabilité de l’animal sera évaluée lors d’une session de 10 minutes. Enfin, une partie des souris seront mises à mort par la méthode de perfusion/fixation qui dure environ 15 minutes.
Impact sur les animaux
Pour les 2 parties du projet, l’utilisation d’isoflurane par voie inhalée pour l’anesthésie est à prendre en considération par son effet relativement désagréable durant quelques instants au niveau des muqueuses, et par la perte de connaissance qu’il induit. Pour la seconde partie du projet, s’ajoutent les nuisances liées au modèle animal et aux évaluations. Pour le modèle "PCP", outre les aspects stressants des injections quotidiennes de phencyclidine (PCP) (durée d’injection : environ 1 minute), ces administrations induisent des modifications comportementales qui miment certains symptômes rencontrés dans la schizophrénie (hyperlocomotion, troubles sociaux, troubles de mémoire, etc.) et qui sont la base du modèle de cette pathologie. Il ne s’agit pas à proprement parler de douleur mais d’une certaine déstabilisation du fonctionnement du cerveau qui peut induire une certaine angoisse. Le traitement antipsychotique n’a pas d’effet aigu notable et l’imagerie est réalisée sous anesthésie générale (1 heure maximum par session). Enfin, un certain niveau de stress sera possiblement lié aux tests comportementaux qui seront réalisés. Les évaluations comportementales en Intellicage sont en majorité des tests d’activité spontanée qui ne sont pas décrits pour induire un stress marqué. Seuls les tests d’impulsivité et la limitation temporelle de l’accès à l’eau peuvent induire un certain stress mais pas de douleur. Pour les autres tests, celui de l’inhibition du réflexe de sursaut peut aussi générer un stress. En effet, les animaux sont placés pour une durée d’environ 30 minutes dans le dispositif et les sons diffusés entraînent des sursauts qui sont mesurés (30 essais).
Devenir
Les animaux de la première partie du projet pourront tous être réutilisés, de même que les 10 « souris stimulus » utilisées dans le test de sociabilité de la seconde partie du projet. Les autres animaux de la seconde partie du projet seront mis à mort pour réaliser des prélèvements d’échantillons biologiques.
Remplacement
Dans la mesure où le projet présenté ici concerne une pathologie psychiatrique très complexe mettant en jeu de multiples facteurs liés au fonctionnement du cerveau, facteurs qui ne sont pas tous connus, ni maitrisés, il y a absolue nécessité de réaliser des études comportementales (in vivo). Par ailleurs, les aspects comportementaux qui seront étudiés et qui miment les symptômes très invalidants que vivent les patients, ne peuvent à l’heure actuelle pas être modélisés d’une autre manière.
Réduction
Le nombre d’animaux a été calculé au plus juste en fonction du niveau d’effet attendu en imagerie (réduction du volume de certaines structures cérébrales de 10% par exemple) et pour les études comportementales, pour obtenir une puissance statistique suffisante. Les données seront comparées par des tests non-paramétriques et/ou paramétriques en fonction de leur distribution. La première partie du projet contiendra des mâles et des femelles, afin d’évaluer les différences d’activité entre les sexes mais pour la seconde partie du projet, un seul sexe sera testé (mâles) afin de limiter le nombre de groupes d’animaux. Il est indéniable qu’une comparaison mâle / femelle serait idéale, cependant, cette étude est une preuve de concept et la pathologie cible, la schizophrénie, connue pour présenter des symptômes plus graves chez les patients masculins. Le suivi longitudinal par imagerie IRM permettra aussi de réduire le recours aux méthodes ex vivo.
Raffinement
Diverses mesures seront prises pour raffiner les expérimentations qui ne seront réalisées que par du personnel formé. Après leur arrivée au laboratoire, les animaux seront stabulés dans des cages contenant un igloo en papier mâché et des lamelles de papier kraft afin d’assurer un enrichissement, permettant aux animaux de trouver un abri en cas de conflit et d’avoir une activité minimale (construction de nid). Ils seront laissés au repos sans intervention (hormis la surveillance quotidienne et le change de cage bi-hebdomadaire) durant 1 semaine (habituation au cycle inversé jour / nuit), puis seront manipulés régulièrement durant la durée totale du projet afin de les habituer au contact humain. L’accès à une roue constitue aussi un enrichissement par rapport aux cages standards, en augmentant l’espace disponible pour les animaux et en permettant de faire de l’activité physique. Le traitement à l’aripiprazole sera administré dans l’eau de boisson, ce qui réduit le stress des animaux par rapport à un traitement par gavage. L’utilisation du système Intellicage permettra de réaliser des tests directement dans la cage d’hébergement en groupe, ce qui réduit le stress des animaux par rapport aux méthodes standards (isolation des animaux pour un suivi individuelle des performances). Enfin, l’utilisation d’anesthésique volatil et d’analgésique sera effectuée pour l’implantation des puces, l’imagerie et la mise à mort.
Choix des espèces
L’espèce choisie est la souris (Mus musculus). Il s’agit comme le rat, d’un animal sur lequel ont été mis au point des modèles de schizophrénie très utiles à la recherche des dysfonctionnements cérébraux liés à cette pathologie. La souris est une espèce plus facile que le rat à maintenir, en termes de coût et de place. Son comportement est bien connu et détaillé dans la littérature et sa proximité génétique avec l’espèce humaine permet d’accéder à des mécanismes cérébraux communs et à des fonctions cognitives et des comportements en beaucoup de points similaires et mesurables (mémoire à court et à long terme, sociabilité, exercice physique, réflexe de sursaut, activité spontanée). Par ailleurs, la sérine racémase ainsi que les cibles pharmacologiques des traitements sont présentes chez l’homme et la souris (récepteurs NMDA pour la PCP et récepteurs dopaminergiques et sérotoninergiques pour l’aripiprazole) et sont caractérisées par une activité fonctionnelle similaires dans les 2 espèces. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (à partir de 8 semaines), à un âge auquel les grands systèmes physiologiques sont matures. Cela correspond à l’âge d’apparition de la pathologie chez les patients.
Etude de pharmacocinétique et de pharmacodynamie de composés à visée thérapeutique chez la souris immunodéprimée ou immunocompétente porteuse ou non de tumeur
- Recherche appliquée
- Cancers
Greffées d'une tumeur sous la peau ou par voie intraveineuse, puis injectées jusqu'à une fois par jour pendant dix-huit semaines et saignées jusqu'à deux fois par jour à la veine caudale, 20 500 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. S'y ajoutent jusqu'à quatre prélèvements rétro-orbitaires sous anesthésie et un prélèvement terminal. L'objet du projet reste en amont de tout traitement : mesurer la concentration plasmatique de composés et calibrer les doses des études d'efficacité à venir, à raison de cent études sur cinq ans. Le porteur qualifie de "légères" les douleurs liées aux injections et aux prélèvements, tout en listant comme possibles la nécrose, l'ulcération de la tumeur et la paralysie.
Objectifs
Chaque année, le cancer affecte des millions de personnes et représente la deuxième cause de décès dans le monde. Les modèles murins jouent un rôle essentiel dans le domaine de l'oncologie, notamment, dans la compréhension de la physiopathologie du cancer, l’identification de nouvelles cibles et de nouveaux candidats médicaments ainsi que dans la compréhension des mécanismes de résistance. L’objectif de ce projet consiste à évaluer la concentration plasmatique de composés thérapeutiques, caractériser les niveaux et la durée de saturation de la cible à différentes doses et permettre l’identification de cellules immunitaires ou de facteurs solubles impliqués dans la réponse induite par ces composés. Les études menées sur des modèles de souris porteuses de tumeur permettront, également, d’analyser la corrélation entre ces paramètres et la croissance tumorale. L’ensemble des données recueillies dans ce projet serviront à affiner les doses et fréquences utilisées dans les études ultérieures d’efficacité.
Bénéfices attendus
Le cancer est l’une des principales causes de mortalité dans le monde, avec 10 millions de décès en 2022. Malgré de nombreuses avancées dans les traitements proposés, le besoin médical en thérapies innovantes et efficaces est donc considérable. L’immunothérapie est aujourd’hui une nouvelle approche thérapeutique qui a permis une avancée majeure dans le traitement du cancer. Ce projet permettra de caractériser des composés thérapeutiques à visée thérapeutique chez la souris immunodéprimée ou immunocompétente, et ainsi sélectionner ceux qui feront ensuite l'objet d'études d'efficacité dans le cadre d'autres projets.
Procédures
• Sur animal vigile : Greffe de cellules tumorales en sous-cutanée (1 injection, 15 s) ; Greffe de cellules tumorales en intraveineuse (1 injection, 15 s) ; Administration de composé thérapeutique en intra-péritonéal, sous-cutané, per os ou intra-tumoral (maximum 1 fois /jour pendant 18 semaines maximum, 15 s) ; Administration de la molécule déplétante/neutralisante en intra-péritonéal, sous-cutané ou per os (maximum 1 jour sur 2 pendant 18 semaines, 15 s) ; Microprélèvement de sang au niveau de la veine caudale (maximum 2 fois /jour, 30 s). • Sur animal anesthésié (anesthésie gazeuse) : Prélèvement de sang par voie rétro-orbitaire (4 fois maximum, 30 s) ; Administration de composé thérapeutique en intraveineuse (maximum 2 fois /semaine pendant 18 semaines maximum, 15 s) ; Administration de la molécule déplétante/neutralisante en intraveineuse (maximum 2 fois /semaine pendant 18 semaines maximum, 15 s) ; Prélèvement de sang terminal par voie rétro-orbitaire ou en intracardiaque.
Impact sur les animaux
Stress et douleur légère lors de l’injection des cellules tumorales. Stress et douleur légère lors de l’administration du composé thérapeutique. Stress et douleur légère lors de l’administration de la molécule déplétante/neutralisante. Stress et douleur légère lors des micro-prélèvements sanguins. Possibilité d’effets indésirables sévères liés à la greffe tumorale : Perte de poids, modification du comportement, nécrose, ulcération et/ou inflammation de la tumeur (tumeur en sous-cutanée), paralysie (tumeur en intraveineux). Possibilité d’effets indésirables sévères liés au composé thérapeutique : Perte de poids transitoire, modification temporaire du comportement.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux lorsque l’une des conditions ci-après est remplie : Prélèvement d’organe ou de tumeur au cours de l’étude ; Prélèvement sanguin terminal ; Atteinte d’un point limite justifiant l’euthanasie ; Fin de l’étude.
Remplacement
Evaluer les effets pharmacologiques d’un composé thérapeutique visant à réactiver le système immunitaire implique d’être dans un système biologique complexe. En effet, son efficacité dépend de son métabolisme et de sa distribution dans l'organisme ainsi que des caractéristiques de son environnement (et de la tumeur), ce qui n’est, actuellement pas possible de reproduire in vitro. Il est donc nécessaire d'utiliser des animaux dans le cadre de ce projet.
Réduction
Afin de limiter le recours aux animaux, les molécules sont préalablement testées in vitro et sélectionnées sur la base des résultats obtenus dans les modèles cellulaires. Seules celles présentant la meilleure activité sont choisies pour être évaluées chez l’animal. Les conditions et le taux de croissance tumorale pour chaque lignée à tester sont également déterminés dans un projet dédié et permettent de sélectionner les conditions optimales de greffe et le nombre d’animaux nécessaires dans les procédures impliquant une greffe tumorale. En se basant sur les données de la littérature et notre expérience, un minimum de 4 prélèvements par point temporel est nécessaire pour obtenir des paramètres pharmacocinétiques et/ou pharmacodynamiques statistiquement interprétables, en tenant compte de la variabilité inter-individuelle. Les volumes de prélèvement de sang sont limités pour obtenir la quantité minimale strictement nécessaire pour la réalisation des analyses. Ceci permet de prélever plusieurs fois un même animal, dans la limite des règles d’éthique et limiter ainsi le nombre d’animaux par étude. 20 animaux maximum par groupe sont donc requis pour l’étude d’un composé dans une procédure. Dans le cas où l’étude permet le développement de méthodes de dosage adaptées à des micro-volumes de sang, le nombre d’animaux utilisés est considérablement réduit par rapport à un prélèvement sanguin classique et les variations inter-individus sont également mieux maitrisées car l’ensemble des valeurs peuvent être obtenues sur un même animal. Dans ce cas, le nombre d’animaux par groupe peut être diminué à 4 minimum pour les études sans greffe tumorale et 10-15 pour celles avec greffe pour tenir compte de la variabilité du succès de l’induction et de la croissance tumorale. Un maximum de 100 études sera mené sur 5 ans. Au cours de l’étude, les organes et/ou les tumeurs peuvent être prélevés pour mutualiser l’utilisation des animaux dans le but d’étudier différentes questions et paramètres au sein de la même étude et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés en évitant la multiplication des expériences.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupes sociaux, avec un minimum de 2 enrichissements de milieu. Dans le cas où une souris doit être maintenue seule (agressivité, euthanasie de ses congénères) un enrichissement supplémentaire sera ajouté dans la cage. Les souris seront hébergées dans des « zones protégées » dont les conditions d’environnement et d’hygiène sont contrôlées (barrière aseptique) pour éviter toute contamination et assurer ainsi le maintien de leur statut sanitaire. Le volume et la fréquence des prélèvements de sang suivront strictement les recommandations émises par la Structure chargée du Bien Être des Animaux (SBEA). En fonction du site de prélèvement, ils seront réalisés sous anesthésie gazeuse associée à un analgésique local. Le prélèvement terminal sera réalisé sous anesthésie gazeuse en combinaison avec un analgésique opioïde. Certaines injections pourront être réalisées sous anesthésie gazeuse et la taille des aiguilles utilisées lors des injections sera la plus petite possible afin de limiter la douleur. Des points limites précoces relatifs à l’apparence/comportement de l’animal, à l’aspect et au volume de la tumeur ainsi qu’à la perte de poids seront suivis et évalués de manière précise, tout au long de l’étude, grâce à un tableau de scoring. Ils pourront justifier la mise en place d’enrichissement supplémentaire, d’une surveillance accrue ou l’euthanasie de l’animal. Le poids des animaux sera suivi au minimum 1 fois/semaine. Le composé administré et/ou les cellules tumorales greffées pourront induire une perte de poids des animaux plusieurs jours post-injection. Dans ce cas, la fréquence des pesées sera augmentée et de la nourriture humidifiée ou gélifiée pourra être ajoutée au fond de la cage, afin de faciliter son accessibilité. Cette surveillance renforcée sera maintenue jusqu'à ce que leur poids ne diminue plus sur 2 pesées successives. Le volume des tumeurs sera suivi au minimum 1 fois/semaine. L’aspect général de l’animal (apparence, comportement, aspect des tumeurs) sera suivi lors des mesures de poids ou du volume tumoral (minimum 1 fois/semaine). Si un animal présente une lésion cutanée mineure, une pulvérisation de spray cicatrisant et antiseptique (minimum 2 fois/jour jusqu’à guérison complète) pourra être réalisée.
Choix des espèces
Le choix de la souris comme modèle in vivo est guidé par le haut niveau de similarité de sa biologie par rapport à l’homme, les outils et les structures disponibles pour sa manipulation et des temps de gestation et de sevrage courts. De plus, l’analogie fonctionnelle des systèmes immunitaires murin et humain et l’existence de lignées immunodéprimées et/ou génétiquement altérées font de la souris un modèle pertinent pour analyser l’efficacité de nouvelles thérapies et la réponse immunitaire associée. Les souris utilisées auront un âge compris entre 7 et 30 semaines lors de leur entrée dans l’étude, âge auquel le système immunitaire de l’animal est décrit comme mature.
Etude des structures lymphoïdes tertiaires dans un modèle spontané d’inflammation du côlon
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Pour savoir si des agrégats de cellules immunitaires aggravent l'inflammation du côlon et préparent un cancer colorectal, 499 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, 354 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 145 dans des procédures déclarées légères. Toutes sont tuées pour des analyses post-mortem. Leurs mutations déclenchent une entérocolite dès trois semaines d'âge, avec perte de poids et saignements dans les selles et par le rectum, et le suivi se poursuit jusqu'à seize semaines. Le porteur souligne qu'aucun geste technique n'est pratiqué dans cette première phase, et prévoit, si les souris résistent à la colite, de leur administrer un produit inflammatoire dans l'eau de boisson à doses progressivement augmentées.
Objectifs
De nombreux organes, notamment le côlon, sont peuplés d’une accumulation de cellules immunitaires, prêtes à initier une réponse immunitaire rapide et ciblée en cas d’infection: ce sont les organes lymphoïdes secondaires. Ces structures apparaissent durant les premiers stades de développement embryonnaire et deviennent complètement matures après la naissance. Dans un contexte inflammatoire chronique, les cellules du système immunitaire se réorganisent pour former des agrégats dans le tissu inflammé : ce sont les structures lymphoïdes tertiaires (SLT). Ces nouveaux organes lymphoïdes reproduisent la structure et la fonction des organes lymphoïdes secondaires classiquement observés dans les tissus. Or dans les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) comme la maladie de Crohn, la présence et la densité de ces structures n’est pas systématiquement corrélée avec un pronostic favorable. En effet, il a récemment été démontré que les lymphocytes B, cellules immunitaires majoritaires des SLT, peuvent faire obstacle à la réparation de la muqueuse intestinale en contexte inflammatoire. Notre projet vise à caractériser les structures lymphoïdes tertiaires (SLT) dans l’inflammation du côlon et en particulier, de déterminer si ces SLT participent activement à la progression de l’inflammation colique dans les MICI et, par la suite, dans le cancer colorectal.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre à court terme d’étudier la formation et le rôle des structures lymphoïdes tertiaires dans l’inflammation du côlon. Il va ainsi permettre d’améliorer les connaissances sur les interactions entre les cellules immunitaires et les cellules épithéliales de la muqueuse intestinale en contexte inflammatoire chronique. A long terme, il pourrait permettre de mieux comprendre le rôle des SLT dans l’inflammation colique pré-cancéreuse et de mettre en évidence un nouveau mécanisme de cancérogenèse dans le côlon. Ceci pourrait participer à l’élaboration de nouveaux traitements des MICI ainsi que du cancer colorectal.
Procédures
Dans une première procédure, nous allons évaluer la cinétique d’apparition spontanée de l’inflammation du côlon dans des souris génétiquement modifiées en fonction de leur fonds génétique d’origine. Trois lots d’animaux seront comparés et suivis régulièrement de 4 à 16 semaines d’âge jusqu’à apparition d’une colite. Aucun geste technique ne sera réalisé sur les animaux. Néanmoins, les mutations étudiées entraineront l’inflammation du côlon à partir de l’âge de 3 semaines. Si les animaux utilisés dans cette première procédure ne présentent pas de signes de colite au bout de 16 semaines d’âge, nous réaliserons une deuxième procédure où les animaux seront traités avec un traitement inflammatoire dans l’eau de boisson, de 3 à 14 jours maximum. Les doses seront progressivement augmentées en cas de résistance avérée à l’apparition de la colite.
Impact sur les animaux
Les animaux d’intérêts peuvent présenter les premiers signes d’entérocolite spontanée dès 3 semaines d’âge (perte de poids, saignements dans les selles et rectaux). Le poids des animaux sera mesuré régulièrement tout au long de la procédure. Les selles seront vérifiées régulièrement. L’administration d’un traitement inflammatoire dans l’eau de boisson (DSS) peut engendrer une déshydratation et une inflammation de l’ensemble du tractus intestinal.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Il est nécessaire de réaliser les expériences sur des animaux afin de modéliser (i) le développement des structures lymphoïdes tertiaires dans l’inflammation colique et (ii) les interactions entre les différentes populations immunitaires et les cellules épithéliales adjacentes. Les expériences in vitro ne sont pas adaptées pour étudier les comportements immunitaires dans l’inflammation du côlon (interactions cellulaires multiples et complexes).
Réduction
Nous réaliserons des expériences-pilote afin de déterminer avec un nombre minimal d’animaux, les conditions optimales d’apparition de la colite spontanée et des SLT dans notre modèle murin. La deuxième procédure (traitement DSS) sera réalisée uniquement en cas de résultats négatifs issus de la procédure 1, c’est-à-dire dans le cas où les souris d’intérêts sur différents fonds génétique présentent une résistance à l’apparition d’une colite spontanée en conditions d’hébergement conventionnel. Tous les tissus murins collectés lors des expériences-pilote seront utilisés pour analyse immunologique. Le nombre d’animaux a été déterminé par une approche statistique.
Raffinement
Comme recommandé dans la littérature, les animaux sont suivis attentivement afin de détecter tout signe de souffrance ou d’angoisse, et d’assurer leur bien-être. Une grille de score adaptée est mise en place pour évaluer de manière objective l’état des animaux. En cas d’atteinte d’un point-limite tel que décrit dans la grille de score, l’animal sera mis à mort. En cas de perte de poids ou de déshydratation, du gel nutritif sera donné en complément de l’alimentation habituelle afin de faciliter la prise alimentaire qui peuvent être causés par la colite. En cas de déshydratation sévère, une réhydratation par injection de solutés en voie intra-péritonéale sera réalisée. De plus, l’inflammation du côlon peut être suivie par une méthode non invasive : la mesure du taux d’une protéine spécifique dans les selles.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en immunologie. La forte similitude des systèmes immunitaires humains et murins en fait un modèle idéal. Par ailleurs, nous utilisons des modèles murins génétiquement modifiés déjà développés et bien caractérisés qui sont les plus adaptés à ce projet. Les souris seront utilisées entre 3 et 16 semaines, selon le temps d’apparition de la colite.
Etude des mécanismes de sensibilisation nociceptive
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
À cinq jours de vie, des souriceaux reçoivent dans le cerveau une substance qui détruit leurs neurones dopaminergiques. À vingt et un jours vient une chirurgie d'implantation de deux heures, à quarante-neuf jours une restriction alimentaire de cinq jours, à cinquante-trois jours un enregistrement électrophysiologique de la moelle épinière de trois à cinq heures. 6 050 souris vont être utilisées ainsi, dont 3 540 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, pour étudier comment l'anxiété et le trouble de l'attention amplifient la douleur, certaines recevant en plus une injection articulaire qui provoque une arthrite. Le porteur annonce une évaluation comportementale sans préciser quels tests seront conduits, affirme que ses travaux "permettront de développer des traitements efficaces", et toutes les souris sont tuées pour vérifier au microscope les coordonnées des injections.
Objectifs
Nous nous intéressons à la régulation de la nociception dans le cerveau et à ses effets sur l’intégration sensorielle dans la moelle épinière. La nociception est une douleur déclenchée par une agression de l'organisme elle est ensuite intégré par le système nerveux central et périphérique dont la moelle épinière. Nous étudions en particulier les dysfonctionnements cérébraux qui caractérisent certaines pathologies émotionnelles et psychiatriques et qui sont aussi responsables de douleurs. A ce titre, nous nous intéressons aux anomalies sensorielles fréquemment décrites en clinique dans des conditions d’anxiété pathologique, ou dans les troubles de l’attention et de l’hyperactivité, avec ou sans impulsivité (TDAH). Plus précisément, nous cherchons à comprendre le rôle de différents systèmes moléculaires dans l'activité de certaines régions corticales et dans le développement de la douleur et des symptômes du TDAH. Dans ce but, nous combinons des approches méthodologiques variées pour étudier les comportements et pour analyser l’activité des populations neuronales impliquées
Bénéfices attendus
Les bénéfices de cette étude concernent le traitement de la douleur, et en particulier des douleurs associées à des pathologies anxieuses ou au TDAH. Au-delà d'un inconfort temporaire. la sensibilisation chronique à la douleur provoque une dégradation générale de la qualité de vie et entraîne un coût économique très important (arrêt de travail, consultations médicales, prise en charge complexe des patients). Cette sensibilisation amplifie à son tour les symptômes du TDAH et de l'anxiété et contribue à la mise en place d'un cercle vicieux qui aggrave les conditions médicales des patients. Nos études permettront de développer des traitements efficaces car ils empêcheront les interactions entre ces pathologies et les douleurs, et bloqueront l'aggravation mutuelle des symptômes. L’innovation consiste à étudier des circuits, ou des systèmes moléculaires, qui interviennent à la fois dans ces pathologies neuropsychiatriques et dans la douleur. Ce sont les mécanismes moléculaires partiellement communs aux douleurs et aux troubles neuropsychiatriques associés qui seront la cible des traitements à développer.
Procédures
Chirurgie et implantation à l’âge adulte à 21 jours (2heures), injection cérébrale et injection de substance qui induit la neurodégénérescence des neurones dopaminergiques chez les souriceaux à 5 jours (30minutes), restriction calorique à 49 jours (pendant 5 jours), imagerie et enregistrement électrophysiologique sur la moelle épinière à la fin de la procédure à 53 jours (3-5heures)
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent: 1/ Un risque de douleur durant la chirurgie et douleur aiguë lié à la récupération post-chirurgie implantatoire, ce risque est compensé par l’analgésie. 2/ Arthrite si injection dans l’articulation, dans le cas du projet ça provoque de l’inflammation locale. 3/ Un risque stress comportemental et stress alimentaire 4/Un risque de perte de poids et d'hypothermie à cause de l'injection de la 6-OHDA
Devenir
Mise à mort à la fin de la procédure pour collecter les tissus pour les analyses histologiques et la vérification des coorodonées des injections et l'histologie des tissus
Remplacement
La souris est l'espèce de choix pour étudier le système nerveux des vertébrés, ce qui fournit des informations très facilement transposables à l'homme. Pour vérifier et valider le concept du projet dans des approches plus intégrées, il est nécessaire d’utiliser des approches in vivo avec des animaux de façon à observer le cerveau en fonctionnement. Le recours au modèle animal est indispensable car ce projet demande une évaluation comportementale et aucun modèle in vitro (cellules ou tissus) ne peut reproduire les conditions des pathologies étudiées
Réduction
Dans cette étude, la réduction du nombre d’animaux est prise en compte tout en conservant une signification scientifique statistique (hétérogénéité inter-individuelle), le nombre de souris utilisées dans chacun des groupes expérimentaux ne dépassera pas ainsi 15 animaux par groupe. Nous avons adopté des mesures visant à réduire le nombre d'animaux lié à leur mode production : en utilisant pour la réalisation de ce projet tous les animaux quel que soit leur sexe (i.e mâle et femelle). La force de notre hypothèse, les expériences pilotes précédentes ainsi que la qualité de nos procédures basées sur des années d'expérience, nous permettront de réduire significativement le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux a été calculé par l'estimation de la variance observée avec ce type de donnée permettant d'atteindre une signification statistique. Nous utiliserons des tests statistiques appariés
Raffinement
Tous les protocoles sont optimisés pour soulager le stress et la douleur des animaux. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie gazeuse comme indiqué lors des procédures et un anti-douleur sera administré avant et après chirurgie pour éviter les douleurs post-chirurgicales. Les animaux seront surveillés quotidiennement par l'expérimentateur avec une surveillance renforcée après la chirurgie jusqu’à la fin de l’expérimentation avec la mise en place d’une réhydratation, un réchauffement et des traitements vétérinaires si besoin. Nos animaux naitront dans notre animalerie de haut statut sanitaire, hébergés en cages collectives sur racks ventiles, garnies de litières leur permettant de reproduire un comportement naturel de fouissage et d’un enrichissement constitué d'un nid végétal et de tubes de cartons, pour leur permettre de construire des nids, de jouer, ronger. Leur bien-être sera contrôlé par la cellule de bien-être de l’animalerie. Leur soin est confié à des personnels qualifiés et experts. Ils surveillent quotidiennement l’ensemble des animaux et de façon plus poussée et spécifique pendant les phases de récupération qui suit les procédures invasives (chirurgie). Des points limites sont définis pour éviter la souffrance des animaux. Dans toutes les procédures où cela sera possible, un antalgique sera donné. Pour les autres procédures, les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne renforcée, et les points limites définis permettront de maîtriser cette douleur.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du système nerveux central de la souris présentent de nombreuses similitudes avec d'autres mammifères, dont l'homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris sont largement transférables à l'homme. Les injections de virus seront effectuées sur des animaux âgés de P0 semaines à 3 semaines. Le reste des procédures expérimentales sera réalisé sur des animaux âgés de plus de 5 semaines, ce qui correspond à l'âge adulte chez cette espèce lorsque l'animal est en pleine capacité d'apprentissage. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection et/ou d'implantation.
Analyse d’un nouveau mécanisme intra-cellulaire dans le développement du foie gras chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Un gavage par jour pendant quatre semaines, soit vingt-huit gavages chacune : 216 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leurs organes. Elles reçoivent d'abord un adénovirus injecté dans le coin de l'œil sous anesthésie, puis subissent des jeûnes de six heures avant chaque mesure de glycémie, six prélèvements sanguins à la queue après une incision au scalpel, une injection de glucose, et un jeûne de douze heures avant la chirurgie terminale. Le porteur décrit une prostration et une gêne oculaire après l'injection, une gêne dans l'œsophage lors des gavages, une sensation de faim et une hypoglycémie avant la mise à mort. Il précise que le gavage d'un des composés est maintenu parce qu'il s'agit d'"un protocole demandé dans le cadre de la révision d'un article", alors qu'un autre composé a pu être simplement incorporé à la nourriture.
Objectifs
Le foie gras, qui se caractérise par l’accumulation de graisse dans les cellules du foie, touche un quart de la population française. Dans 20 % des cas, ce foie gras génère une inflammation et un durcissement du foie qui peut être à l’origine de cirrhose et de cancer du foie. Les personnes diabétiques, en surpoids ou souffrant d’affections liées au syndrome métabolique sont particulièrement à risque. Néanmoins, il n’existe pas à ce jour de moyens de diagnostic et de traitement pharmacologique du foie gras. Par conséquent, identifier les mécanismes à l’origine du foie gras est cruciale pour prévenir les stades plus avancés chez les patients à risque. Un nouveau mécanisme, avec une perte de communication entre différents constituants intracellulaires induite par des métabolites circulants, est associé au développement du foie gras et il convient de valider chez la souris le rôle causal de ce mécanisme dans l’accumulation de gras. L’objectif de ce projet est donc de valider ce mécanisme en surexprimant une molécule de liaison qui rapproche ces constituants intracellulaires dans le foie des souris, afin de démontrer que cela prévient le foie gras induit par des métabolites administrés chez la souris pendant 4 semaines.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet de recherche sont de valider une nouvelle hypothèse mécanistique impliquée dans l’accumulation de gras dans le foie et de mettre en évidence de futurs moyens de prévention et/ou traitement du foie gras. Si nos hypothèses sont validées chez la souris, nous initierons ensuite des tests chez l’homme et tenterons d’identifier des molécules capables de réguler ce mécanisme dans la cellule.
Procédures
Au cours de ce projet, toutes les souris seront soumises à : - une injection unique d’adénovirus dans le coin de l’œil sous anesthésie gazeuse (durée : 30 secondes). - un gavage quotidien pendant 4 semaines sur animal vigile (durée : 30 secondes). - une mise à jeun de 6 heures avant les mesures de glycémie - 6 prélèvements sanguins de petits volumes (5µl, n=6, 30 secondes) à la queue des souris pour les mesures de glycémie, associés à une incision unique de la queue. - une injection de glucose sur animal vigile lors du test de tolérance au glucose (durée : 30 secondes). - une mise à jeun de 12 heures avant chirurgie sous anesthésie profonde et sans réveil.
Impact sur les animaux
- une prostration et une gêne oculaire suite à l’injection d’adénovirus dans le coin de l’oeil - une prostration et gêne dans l'oesophage lors du gavage. - une douleur transitoire au point d’injection lors des injections dans la cavité abdominale et de l’incision au scalpel de la queue. - Une hyperglycémie transitoire au cours des test métaboliques. Ces variations de glycémie sont des réponses physiologiques transitoires qui n’affectent pas l’état général des souris. L’hyperglycémie provoquée lors des tests revient à la normale au bout de 90 minutes. - une sensation de faim et une hypoglycémie suite à la mise à jeun sur la nuit avant mise à mort. Ces modifications physiologiques peuvent donc être responsable d’un stress chez l’animal et d’une baisse d’activité les conduisant à nicher dans leur nid.
Devenir
A la fin des procédures, toutes les souris précédemment anesthésiées seront mises à mort pour le prélèvement des organes d’intérêt.
Remplacement
Ce projet vient compléter des données déjà obtenues dans des cellules en culture, où la surexpression d’une molécule de liaison rapprochant des constituants intracellulaires prévient l’accumulation de lipides induite par des métabolites. Ces observations doivent être validées chez la souris (organisme entier) pour attester de ce nouveau mécanisme dans la physiologie du foie gras. Il s’agit d’un projet de physiologie où aucune alternative non animale n’est disponible puisqu’il s’agit ici de valider le rôle de l’axe intestin-foie dans la pathologie du foie gras.
Réduction
Pour diminuer le nombre d’animaux utilisés, nous allons comparer différents traitements en même temps afin de n’avoir qu’un groupe de souris contrôle. Le nombre de souris est calculé au plus juste tout en offrant la puissance statistique nécessaire pour l’interprétation des résultats scientifiques. La modulation des contacts entre différents constituants intracellulaires par la surexpression d’une molécule de liaison étant très variable d’une souris à l’autre, un nombre de 18 souris par groupe est nécessaire. Néanmoins, un premier protocole avec n=12 souris/groupe sera d’abord réalisé, et complété avec n=6 souris/groupe si nécessaire.
Raffinement
Les souris sont surveillées individuellement 3 fois/semaine et nous utilisons des points limites adaptés. Les injections d’adénovirus seront réalisées sous anesthésie gazeuse. Les gavages seront réalisés par une personne expérimentée à l’aide d’une sonde de gavage adaptée à la taille des souris. Le gavage pour un des métabolites d’intérêt est nécessaire, car il s’agit ici d’un protocole demandé dans le cadre de la révision d’un article et il est préférable de procéder de manière identique afin de ne pas induire de biais expérimentaux. Par contre, dans un souci de raffinement, un autre métabolite a été testé incorporé dans la nourriture, et il a bien induit un foie gras sur 4 semaines de traitements. Par conséquent, les autres métabolites seront incorporés dans la diète des souris. Pour les prélèvements terminaux de sang qui nécessitent une chirurgie, les animaux sont analgésiés 30 minutes avant d’être anesthésiées.
Choix des espèces
La physiologie des souris est « proche » de l’homme pour la régulation du métabolisme lipidique. Les souris seront âgées de 5 semaines, elles ont un poids compatible pour la contention, les injections, les gavages et prélèvements sanguins.
Etude de l’effet du PEDF sur le processus d’ossification primaire chez la souris adulte
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Opérées du fémur droit sous anesthésie générale, puis passées deux fois au scanner sous anesthésie gazeuse pendant trente-cinq minutes, 32 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent aussi deux injections intrapéritonéales, cinq jours puis un jour avant leur mise à mort, et toutes sont tuées pour récupérer leurs fémurs et les analyser par histomorphométrie. Le fémur gauche de chaque animal sert de contrôle, ce que le porteur compte comme une réduction du nombre de souris utilisées. Il écrit par ailleurs que la procédure n'entraîne "ni douleur ni problème pour se déplacer" à long terme, à propos d'une chirurgie osseuse suivie d'une surveillance post-opératoire par grille de score.
Objectifs
L'ostéogénèse imparfaite de type VI est une maladie génétique dûe à des mutations sur le gène codant pour une protéine anti-angiogénique. Des études précédentes ont montré que l'injection d'un traitement ayant un effet anabolique sur la formation osseuse conduit à une surexpression de cette protéine. Notre équipe a donc cherché à trouver le lien entre l'effet de celle-ci sur la microvascularisation osseuse et la formation osseuse.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre l’implication de cette protéine anti-angiogénique dans la formation osseuse et particulièrement sur le processus d'ossification primaire qui conditionne le devenir de l'os adulte. Sur le long terme, cela nous permettra de mieux comprendre les processus pathologique impliqués dans l'ostéogénèse imparfaite de type VI et de proposer des traitements adaptés.
Procédures
Injection d'une substance (200ul) en intra-péritonéale x2 (5j et 1j avant mise à mort) et scanner x2 (48h après chirurgie et 1j avant mise à mort) sous anesthésie gazeuse (35min). Chirurgie au niveau du fémur droit sous anesthésie générale (10min).
Impact sur les animaux
L'injection d'une substance (200ul) en intra-péritonéale et le scanner s'effectue sous anesthésie gazeuse. On s’attend à un léger stress après les manipulations. La chirurgie se fait sous anesthésie générale. La procédure n'entraîne pas de douleur ni de problème pour se déplacer chez l'animal sur le long terme. Ces procédures sont donc de classe modérée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de pouvoir récupérer les fémurs afin de faire des analyses par histomorphométrie.
Remplacement
Nous cherchons à étudier la relation complexe entre la microvascularisation et la formation osseuse ainsi que les mécanismes moléculaires impliqués. Compte tenu du fait que la moelle osseuse est un tissu complexe constitué de très nombreux types cellulaires, il est impossible de modéliser ces expérimentations in vitro.
Réduction
En accord avec le pourcentage des variations observées dans les mesures des paramètres biologiques et pour réaliser une étude statistique solide, nous utiliserons 8 souris/groupe. Les génotypes seront séparés en 2 groupes, eux-même divisés en 2 sous-groupes mis à mort à J14 ou J21. Pour réduire le nombre d'animaux utilisés nous utiliserons le fémur gauche de chaque souris comme contrôle.
Raffinement
Les animaux seront manipulés en limitant le stress au maximum, par des personnes compétentes en expérimentation animale, un temps d’acclimatation sera prévu avant toute manipulation et une définition précise des points limites conduisant à l’arrêt du protocole et à la mise à mort immédiate des souris sera mise en place. Une surveillance adaptée (observation régulière des animaux et grille de scoring) sera mise en place post-chirurgie et permettra de limiter au maximum la souffrance. La chirurgie se fait sous anesthésie générale. Cette technique a déjà été utilisée dans notre laboratoire et elle est maîtrisée par un personnel compétent. La procédure n'entraîne pas de douleur ni de problème pour se déplacer chez l'animal sur le long terme. L'injection d'une substance (200ul) en intra-péritonéale et le scanner s'effectue sous anesthésie gazeuse. On s’attend à un léger stress après les manipulations. Ces procédures sont donc de classe modérée.
Choix des espèces
Nous cherchons à étudier la relation complexe entre la microvascularisation et la formation osseuse ce qui est impossible à faire in vitro. Nous avons, de plus, validé toutes nos mesures chez des souris et le travail sera effectué chez des souris dont le gène codant pour notre molécule d'intérêt a été invalidé. Ce mutant chez la souris est une souche robuste sur laquelle des études ont déjà été faites, c’est donc actuellement le meilleur modèle. Nous souhaitons étudier un processus d'ossification primaire, il est donc plus simple et plus rapide de le reproduire chez un animal adulte avec un os mature plutôt que de l'étudier chez un souriceau. La procédure se fait donc chez des souris de 2 mois. Des souris mâles et femelles seront utilisées car on ne s'attends pas à de différence entre les sexes au niveau de l'étude de ce processus.
Formation de gestes techniques pour concepteur et ou applicateur
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
Former des personnels aux gestes techniques, sans produire aucune connaissance : 450 souris vont être utilisées à cette seule fin, 300 dans des procédures menées sous anesthésie sans aucun réveil et 150 dans des procédures déclarées de souffrance légère. Toutes sont tuées, avec prélèvement de sang ou de tissus. Chaque animal subit soit deux gestes espacés de sept à quinze jours, un gavage de trente secondes et une injection de dix secondes par exemple, soit un seul geste sous sédation. Le porteur indique que ces souris proviennent de lots "non utiles" de son animalerie et "devaient être mises à mort pour réduction d'élevage", et ne justifie l'effectif de 450 que par la validation du geste après une ou deux manipulations par apprenant.
Objectifs
Ce projet a un seul but éducatif: former les personnels aux gestes techniques dans une démarche de bien-être animal optimisé à son maximum lors des futures procédures. Aucun animal ne sera acheté ou né pour ce projet. Tous les animaux utilisés viendront de notre animalerie.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet sont essentiellement en terme de maitrise de gestes en utilsant des animaux qui devaient être mis à mort pour réduction d'élevage
Procédures
chaque animal utilisé ne subira qu'une procédure: - soit 2 gestes non invasifs sur 2 temps bien distincts (1 gavage 30 sec et 1 injection 10 sec à 7 -15 js d'intervalle par ex) - soit un seul geste sous sédation ou anesthésie
Impact sur les animaux
Tous les animaux subiront une contention et un geste technique. Selon le geste la gravité sera classée légère ou sans réveil. Aucun geste ne sera sévère. Dans la première procédure classée légère, l'animal ne pourra subir que 2 gestes au maximum mais pas simultanement. Ex: Gavage et injection - entre 7 et 15js d'écart entre 2 gestes. Nuisances attendues: stress à la contention, douleur légère lors de l'injection oudu prélèvement
Devenir
entrainement à des gestes techniques. Mise à mort pour prélèvements sanguins ou tissulaires.
Remplacement
Cette formation est un support complémentaire à la formation théorique reçue préalablement à l'autorisation de travailler avec des animaux à des fins scientifiques.
Réduction
Les animaux utilisés viendront exclusivement de lots "non utiles" des élevages présents dans l'animalerie. Les gestes seront montrés aux personnels par une personne habilitée et formée. Le formateur validera le geste après 1 ou 2 manipulations, le nombre d'animaux utilisés sera réduit à son maximum selon les personnels
Raffinement
Tous les animaux seront issus d'élevage présents dans notre animalerie. Ils seront hébergés en fratrie comme à leur habitude. Si dans le lot "non utile", un animal montre un signe quelconque de souffrance, il ne sera pas utilisé pour un "test" et sera mise à mort éthiquement selon les méthodes réglementaires par une personne habilitée. L'application des points limites précités sera strictement surveillée.
Choix des espèces
Nous avons choisi le modèle de la souris car il est le plus utilisé en expérimentation animale, et les élevages de souris représentent 90% de notre animalerie tous les animaux surnuméraires pourront être utilisés à partir du sevrage
Elevage de lignées murines transgéniques avec génotypage par méthodes invasives
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système nerveux
- Système respiratoire
Nées de lignées transgéniques entretenues pour alimenter d'autres projets, 50 764 souris vont être utilisées dans des procédures déclarées de souffrance légère. Entre le septième et le douzième jour de vie, chacune est tatouée aux phalanges ou aux coussinets et subit l'ablation de l'extrémité de la queue pour le génotypage, les deux gestes enchaînés sous contention et sans anesthésie. Le porteur présente le tatouage comme un moyen "de ne pas mutiler les animaux" et retient la biopsie caudale notamment parce qu'elle évite l'anesthésie. 40 000 de ces souris passeront dans d'autres autorisations de projet, les autres sont tuées selon leur génotype, dès le sevrage si aucune utilisation n'est possible, plus tard si elles servent à l'élevage et deviennent trop âgées ou "mauvais reproducteurs".
Objectifs
L'objectif de cette demande est d’identifier et de caractériser génétiquement les animaux. Ces animaux sont identifiés par marquage et caractérisés à l’aide d'une biopsie (prélèvement de tissus). Cette demande d'autorisation de projet pour l'identification des animaux et le prélèvement de tissus se justifie par la nécessité de sélectionner les animaux d’intérêt pour l’expérimentation (inclus dans d'autres demandes de projet) ; sélectionner les animaux d'entretien des élevages ; sélectionner les animaux pour : • le maintien des compétences, • les prélèvements d’organes ou de tissus pour des études ex vivo.
Bénéfices attendus
La biopsie est une étape nécessaire pour déterminer quels sont les animaux dont le profil ADN est pertinent pour mener à bien les expérimentations, dans le but de trouver des thérapies innovantes qui puissent être transposées en recherche clinique. L’identification par tatouage permet : - d’identifier individuellement les animaux ; - d’identifier un grand nombre d’animaux ; - d’identifier les animaux de manière permanente ; - de ne pas mutiler les animaux ; d’éviter le recours à l’anesthésie. Le génotypage par biopsie de l’extrémité de la queue permet : - l’obtention de résultats fiables; - de minimiser les risques de contaminations entre échantillons ; - d’éviter le recours à l’anesthésie.
Procédures
Les animaux de cette DAP seront soumis à deux gestes techniques invasifs qui sont réalisés ensembles: 1/ l'identification par tatouage digital: 1 fois, durée de quelques secondes 2/ biopsie de queue: 1 fois, durée de quelques secondes
Impact sur les animaux
La procédure de génotypage décrite dans cette DAP est composée de deux actes techniques invasifs : - le tatouage au niveau des phalanges et/ou des coussinets - la biopsie de queue, qui consiste en un prélèvement de l’extrémité de la queue. Ces deux gestes provoquent une très légère douleur. L’animal est maintenu en contention pendant les deux actes et donc tout au long de la procédure ce qui est une source de stress.
Devenir
A l'issue de cette unique procédure, le devenir des animaux est différent selon leur génotype: a/- ils sont prévus pour expérimentation, formation ou maintien des compétences (inclus dans d'autres DAP): utilisation continue b/- ils sont sélectionnés pour entretien des colonies, puis mis à mort lorsque trop âgés ou mauvais reproducteurs c/- ils sont utilisés ex vivo, donc mis à mort avant utilisation d/- ils sont mis à mort dès sevrage si aucune utilisation possible au vu de leur génotype e/- ils sont mis à mort à tout moment si atteinte d'un point limite.
Remplacement
Les méthodes alternatives à l'expérimentation animale se développent de plus en plus, cependant pour certaines problématiques telles que l'étude de phénomènes physiologiques elles restent incomplètes et insuffisantes, puisqu'elles ne mettent pas en jeu toutes les interactions au sein d'un organisme vivant. A ce jour, les prélèvements salivaires et pileux pour génotypage ne sont pas suffisamment fiables. Il n’existe donc pas d’autres méthodes aussi performantes que les tatouages et la biopsie de queue.
Réduction
A ce jour, nous ne disposons pas d’autres moyens aussi efficaces nous permettant de sélectionner les animaux transgéniques. Le responsable de l’EU établi les plans d’élevage en amont, en concertation avec le porteur de projet, afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux générés et donc d’animaux identifiés et génotypés. En outre, nous favorisons l’utilisation des animaux au génotype sans intérêt dans d’autres projets ou des formations afin de ne pas élever ces animaux à ces seules fins et de réduire le nombre d’animaux global produits dans l’EU. De la même façon, certains animaux non utilisés dans les projets sont conservés avec d’autres animaux qui auraient été isolés sans cela.
Raffinement
Les actes d’identification et de génotypage sont réalisés par un personnel expérimenté à jour de ses formations et qui ont un bon regard sur les points limites découlants de ces gestes. La parfaite maîtrise du geste par les agents qualifiés permet de réduire l’inconfort et le stress ressentis par l’animal. Ces identifications et génotypages des animaux sont réalisés avec du matériel adapté en respectant les conditions d’asepsie établies dans l’établissement. Par ailleurs, la procédure est réalisée dans une salle d’expérimentation calme. Les cages y sont amenées les unes après les autres afin de réduire autant que possible le stress des animaux. Ces cages sont enrichies avec des palets de Woodwool qui permettent au souris de nidifier et de se cacher. Enfin, dès que la procédure est terminée, les nouveau-nés sont remis en présence de leur mère.
Choix des espèces
Au sein de notre EU les équipes de recherche utilisent le modèle souris pour sa facilité de manipulation technique, génétique, la rapidité de production de lots expérimentaux, et le grand nombre de pathologies humaines qu'il est possible de modéliser. Les animaux sont identifiés et prélevés entre 7 et 12 de manière à cibler l'orientation des animaux avant sevrage.