Rongeurs
Contourner les récepteurs opioïdes pour une antalgie plus sûre : activation directe des canaux TREK1 en aval
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Toutes tuées à l'issue, 4 446 souris subissent l'induction de huit modèles de douleur différents, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant du léger au sévère, 552 souris classées en souffrance sévère et 30 anesthésiées puis tuées sans réveil. Le porteur décrit une douleur inflammatoire de la patte chez 480 animaux, puis chez 184 souris chacune une douleur post-chirurgicale, une arthrite du genou, deux douleurs neuropathiques dont l'une provoquée par chimiothérapie anticancéreuse, deux douleurs coliques et une migraine, avec des durées d'entretien de la douleur allant de trois heures à dix-sept jours. Les tests comportementaux réalisés après injection des composés ne sont pas détaillés. L'objectif déclaré consiste à évaluer des activateurs du canal TREK1 comme alternative aux opioïdes, le porteur indiquant que la mise à mort devient "obligatoire" en fin d'expérience parce que les modèles de douleur interdisent toute réutilisation.
Objectifs
Les opioïdes constituent une classe de médicaments antalgiques efficaces mais dont les effets indésirables sont un obstacle au soulagement des patients et à l’origine d’une crise sanitaire grave. La recherche d’alternatives thérapeutiques est aujourd’hui basée sur une évolution des modalités d’activation du récepteur mu aux opioïdes et ne résout que partiellement ce problème. Nous avons montré que le canal potassique TREK1 était impliqué dans l’effet antalgique de la morphine mais pas dans ses effets indésirables, et que l’activation directe de ce canal était antalgique et bien tolérée. En s’appuyant sur le récent développement de nouveaux activateurs du canal TREK1, ce projet vise à (1) déterminer dans quels contextes physiopathologiques cette stratégie antalgique est la plus efficace, (2) définir si cet effet antalgique fait intervenir les canaux TREK1 du système nerveux central et/ou périphérique pour guider le développement de futurs composés, et (3) évaluer les potentiels effets indésirables liés à l’activation de TREK1, notamment au niveau central. Ce travail permettrait une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques de la douleur, du potentiel antalgique des activateurs de TREK1 ainsi que de la sécurité de cette stratégie. Les activateurs du canal TREK1 pourraient en effet offrir une alternative aux opioïdes et constituer une nouvelle classe de médicaments antalgiques efficaces et mieux tolérés.
Bénéfices attendus
A l'issue de ce projet, nous aurons une vision claire du bénéfice thérapeutique potentiel des activateurs de TREK1, de leurs effets indésirables ainsi que des indications les plus pertinentes pour ces produits. L'étude de la contribution des canaux TREK1 centraux et périphériques à l'effet antalgique des composés permettra d'orienter le développement de nouveaux activateurs du canal. En effet, si l'effet antalgique est principalement périphérique, il pourra être intéressant de synthétiser des composés ne passant pas la barrière hémato-encéphalique pour limiter l'exposition du système nerveux central et donc les effets indésirables potentiels.
Procédures
Les interventions se limitent à des tests comportementaux réalisés dans les 3h suivant l'injection d'un composé chez des animaux, visant à évaluer l'effet anti-douleur et les éventuels effets indésirables de ce traitement. Chez certains animaux, un modèle de douleur est induit en amont de ces tests. Il s'agit de modèles de douleur inflammatoire de la patte : 3h30 chez 480 animaux - de douleur post-chirurgicale de la patte : 24h chez 184 animaux - d'arthrite du genou : 7 jours chez 184 animaux - de douleur neuropathique induite par chirurgie : 14 jours chez 184 animaux - de douleur neuropathique induite par chimio-thérapie anticancéreuse : 72h chez 184 animaux - de douleur colique inflammatoire : 12 jours chez 184 animaux - de douleur colique non-inflammatoire : 17 jours chez 184 animaux - de migraine : 9 jours chez 184 animaux
Impact sur les animaux
Les composés testés peuvent avoir une toxicité, que nous chercherons à évaluer par des échelles de doses. Ce projet nécessite également l'induction de modèles de douleur au sein de procédures qualifiées de modérées à sévèrees, et qui constituent de fait une nuisance pour les animaux.
Devenir
Les animaux seront tous euthanasiés à l'issue des expérimentations car les traitements réalisés ne permettent pas leur réutilisation. De plus, des procédures impliquent l'induction d'un modèle de douleur, ce qui rend leur euthanasie obligatoire en fin d'expérience.
Remplacement
Les composés activateurs de TREK1 seront sélectionnés par une approche in vitro, permettant le remplacement complet de l'utilisation d'animaux. Pour la troisième phase du projet, les premiers travaux seront réalisés ex vivo/in vitro sur des tissus ou des cultures de neurones. Ces expériences nécessitent le sacrifice d'animaux, mais permettent d'obtenir une grande quantité de résultats par animal, limitant le nombre total d'animaux utilisés au minimum. L'utilisation d'animaux vivants est donc limitée au strict nécessaire, à savoir l'évaluation de comportements et paramètres physiologiques nécessitant une approche intégrative, et qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne permet à ce jour d'appréhender.
Réduction
Les expérimentations sont organisées de façon à obtenir des résultats statistiquement exploitables avec le plus petit nombre d’animaux possible. La taille des groupes expérimentaux a été déterminée grace à un outil statistique dédié. Certaines procédures sont adaptées pour obtenir plus d'information à partir des mêmes animaux (par exemple, les tests de douleur seront couplés à un test de sédation), lorsque les tests réalisés chez les mêmes animaux n'interagissent pas ensemble et que la multiplication des tests n'engendre pas de nuisance supplémentaire. Pour les études de toxicité, le nombre d'animaux utilisé sera réduit au minimum par l'utilisation d'échelles de doses sur un petit nombre d'animaux (augmentation des doses jusqu'à atteindre la dose maximale ou apparition d'effets indésirables). Une banque de tissus sera maintenue pour les expériences d'histologie, réduisant le recours à de nouveaux animaux pour chaque expérience.
Raffinement
Afin d'obtenir un maximum d'information des animaux utilisés, des tissus seront prélevés en fin d'expérimentation comportementale lorsque cela est pertinent (pour l'étude de l'expression de TREK1 ou de l'activation neuronale chez les modèles de douleur notamment). Afin de prévenir une éventuelle souffrance, les animaux seront surveillés quotidiennement (Week-end et jours fériés compris) par l'expérimentateur et le personnel de l'animalerie, et sacrifiés si un point limite est franchi. En effet, si un animal présente une trop forte douleur, un comportement stéréotypé ou anormal, une posture anormale ou une réduction de poids de 20%, celui-ci sera euthanasié. Les cages contiendront un enrichissement de type maisonnette ainsi que du coton pour la constitution d'un nid.
Choix des espèces
Nous avons choisi de travailler sur le modèle souris car c'est sur ce modèle qu'ont été mis au point au laboratoire toutes les techniques d'investigation comportementale et électrophysiologique ainsi que les différents modèles de douleur utilisés. C'est également le modèle pour lequel nous disposons du plus de données dans la littérature. Enfin, notre animalerie est une animalerie petit rongeur concue pour l'hébergement des souris, modèle sur lequel notre personnel a le plus d'expertise. Les animaux utilisés seront des jeunes adultes (8-12 semaines). Si la douleur touche essentiellement des personnes âgées, travailler sur la souris âgée représenterait un risque et surcoût extrêmement important qui mettrait en péril le projet dans son ensemble (coût d'achat d'animaux âgés et surmortalité de ces animaux). L'animalerie et son personnel ne sont pas en mesure d'accueillir à grande échelle des animaux âgés demandant une surveillance et des soins accrus et adaptés. Enfin, les tests et modèles utilisés, comme les données disponibles dans la littérature, concernent sauf cas très spécifiques des animaux jeunes.
Étude de l’effet d’un anticorps sur le développement du cancer de l’ovaire, en absence et présence des prokinéticines
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système urogénital
Toutes tuées à l'issue pour prélever sang et tissus, 180 souris reçoivent des cellules de cancer de l'ovaire puis des injections répétées d'anticorps, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique que les injections intrapéritonéales répétées risquent de provoquer des péritonites, que la chirurgie de pose des mini-pompes peut causer douleur et infection, et que le développement tumoral peut entraîner perte de poids et inactivité. Chaque souris subit en outre une séance hebdomadaire d'imagerie par fluorescence sous anesthésie. Les retombées annoncées pour les patientes restent au conditionnel, et le porteur conclut que le recours au modèle animal est "indispensable" faute de pouvoir reproduire l'environnement tumoral in vitro.
Objectifs
Le cancer de l’ovaire est la principale cause de décès parmi les cancers gynécologiques. ll est responsable de plus de 140 000 décès chaque année dans le monde, représentant la cinquième cause de décès liés au cancer. Sa forme la plus commune est le cancer épithélial de l'ovaire (CEO), généralement diagnostiqué à un stade avancé, avec plus de 95% des tumeurs malignes de l'ovaire. Les traitements standard actuels ne sont toujours efficace pour améliorer la survie des patientes car il y a des récidives à cause du développement de résistances au traitement. La complexité biologique et génomique des CEO a conduit chercheurs et cliniciens à explorer des stratégies ciblées et plus adaptées pour contourner la toxicité des molécules utilisées en chimiothérapie. A ce jour, l’ensemble des tentatives thérapeutiques n'ont que très rarement conduit à des résultats concluants. Depuis une quinzaine d’années, la recherche s’intéresse à l’étude d’une famille de protéines d’intérêt. Ces protéines sont spécifiquement exprimées dans les tissus endocrines (ovaire, testicule, cortex surrénal et placenta) où elles agissent sur les cellules endothéliales (cellules tapissant les vaisseaux sanguins). Nous avons démontré que les niveaux circulants d’une de ces protéines étaient significativement plus élevés chez les patientes atteintes de CEO, suggérant qu’elles joueraient un rôle important dans le développement et ou la progression de ce type de cancer. De plus, une collaboration récente avec des chercheurs du Pays-de-Galles a également mis en évidence l’implication d’un récepteur dans de nombreux cancers dont notamment celui de l’ovaire. Leur équipe ont pu mettre au point un anticorps dirigé contre ce récepteur qui a déjà démontré de son efficacité sur la croissance tumorale du cancer de l’endomètre. Par ailleurs, une étude préliminaire clinique nous a permis de démontrer que les récepteurs des protéines d’intérêt étaient fortement exprimés par les adipocytes (cellules permettant dans le stockage des lipides) et les cellules immunitaires de l’environnement tumoral, plus particulièrement par les macrophages et les neutrophiles. En raison de l’absence de l’environnement tumoral dans les études in vitro, nous souhaitons développer un modèle murin du cancer de l’ovaire afin d’évaluer l’efficacité, in vivo, de l’anticorps dirigé contre le récepteur en combinaison avec un traitement avec les protéines d’intérêt .
Bénéfices attendus
Les analyses, réalisées précédemment sur des échantillons cliniques (de patientes atteintes du CEO) et sur modèles précliniques, suggèrent une implication de la famille des prokinéticines dans la croissance des tumeurs ovariennes par action directe sur l’environnement tumoral. L’action combinée entre un anticorps dirigé contre la tumeur et les prokinéticines pourrait représenter une nouvelle voie thérapeutique prometteuse, notamment chez les patientes qui développement des résistances aux traitement conventionnels. Le projet a pour but d’évaluer et de démontrer la valeur et l’efficacité thérapeutiques de l’anticorps seul ou en combinaison avec les prokinéticines dans le traitement de ce type de cancer.
Procédures
Les souris seront traitées par injection de l’anticorps sur animal anesthésié (durée : 1 minute), deux fois par semaine pendant 2 semaines, entre le 40ème et le 60ème jour après injection de cellules tumorales. La pose des mini-pompes dureront 20 minutes au maximum et Et seront installées pour deux semaines. Les souris seront imagées 1 fois/semaine par, un système d’imagerie utilisant la fluorescence. Cette procédure dure 15 minutes sous anesthesie. Au moment de l’euthanasie des animaux, un prélèvement sanguin qui durera au maximum 5 minutes, sera réalisé sur animaux préalablement analgésiés et anesthésiés.
Impact sur les animaux
L’étude implique des injections intrapéritonéales répétées qui risquent de provoquer le développement de péritonites, un stress à la souris, un léchage de la région d’injection La chirurgie pour la mise en place des mini-pompes peut présenter un stress chez la souris et un léchage de la région opérée, ainsi que de la douleur si une inflammation et une infection se développent. Le développement tumoral chez les souris peut aussi causer une perte de poids et de l’inactivité.
Devenir
Les animaux seront tous euthanasiés pour effectuer des prélèvement de sang pour des dosages sanguins et tissulaires pour faire différentes analyses comparatives du développement tumoral in situ en utilisant les techniques permettant d’étudier les protéines d’intérêt qui serviront à caractériser l’effet de l’anticorps et des protéines d’intérêts sur le développement tumoral
Remplacement
Une étude récente sur le cancer de l’ovaire a permis de faire la preuve de concept que les prokinéticines et leurs récepteurs sont directement impliqués dans l’ensemble des causes de ce cancer. Les protéines d’intérêts semblent agir directement sur l’environnement tumoral pour atténuer de façon indirecte sa croissance et progression. Ainsi, nous souhaitons avoir recours à des animaux, pour valider ces observations et combiner leurs actions avec celles de molécules qui agiraient directement sur la tumeur comme le nouvel anticorps. Les modèles in vitro ne nous permettant pas de démontrer les effets des cellules immunitaires sur la progression de ce cancer le recours au modèle animal est donc indispensable. Ces études sont à réaliser sur des animaux qui peuvent intégrer les mécanismes physiologiques complexes aboutissant à la pathologie.
Réduction
Au total nous envisageons d’utiliser 180 animaux répartis en 2 groupes : 60 animaux dans le groupe 1 et 120 animaux dans le groupe 2. Nous avons choisi d’inclure 20 souris pour chaque condition dans le groupe 1 (et 20 souris pour chaque condition dans le groupe 2 pour avoir le nombre nécessaire de souris différentes par technique envisagée dans ce projet. Ce nombre a été déterminé afin d’atteindre des résultats statistiquement interprétables.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe dans un environnement enrichi. L’application de critères d’arrêt et le suivi quotidien des animaux hébergés permettent de garantir leur bien-être. L’état de santé des animaux sera surveillé (état général) quotidiennement. Cela nous permettra d’intervenir rapidement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. Le poids des souris sera mesuré tous les jours. Des points limites spécifiques à ce projet seront également pris en compte afin de veiller au bien-être des animaux. Les interventions seront realisées sur animal anesthésié.
Choix des espèces
Le projet a pour but de déterminer l’efficacité d’un anticorps dans le contexte du cancer de l’ovaire et de caractériser le rôle des protéines d’intérêts dans l’environnement tumoral de ce cancer. Les souris utilisées dans nos expériences sont des souris immunocompétentes, c’est-à-dire possédant un système immunitaire complet et compétent. Ce modèle nous permettra d’étudier les interactions complexes entre les différents composants du système immunitaire et la cellule tumorale du cancer de l’ovaire. Plusieurs études ont montré qu’il existe une grande similitude entre le développement tumoral chez la souris et chez la femme et dans l’expression et la régulation des gènes tumoraux et que plusieurs facteurs de l’angiogenèse (phénomène de nouveaux vaisseaux sanguins) et de l’inflammation. Les femelles utilisées seront âgées entre 6 et 14 semaines. Ce stade de développement étant idéal pour la maturité sexuelle chez les souris femelles. Les femelles utilisées seront âgées entre 6 et 14 semaines. Ce stade de développement étant idéal pour la maturité sexuelle chez les souris femelles.
Evaluation de thérapie génique dans un modèle murin de pathologie dominante liée à RYR1
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système musculosquelettique
Pour tester une thérapie génique contre les mutations dominantes du gène RYR1, 336 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, 40 d'entre elles anesthésiées et tuées avant tout réveil. Elles reçoivent un poinçon à l'oreille pour le génotypage, une injection unique dans l'abdomen ou dans le muscle, puis des tests de comportement destinés à mesurer leur force musculaire, dont la nature n'est pas précisée, toutes les deux semaines pendant deux mois. Le porteur indique que l'anesthésie peut déclencher chez les souris porteuses de la mutation une crise d'hyperthermie maligne, avec montée de température et contraction musculaire généralisée aux effets parfois fatals, et que le traitement lui-même peut entraîner une fonte musculaire. Toutes sont tuées pour prélever les muscles, le porteur affirmant qu'aucune méthode sans animaux ne permet d'évaluer la force musculaire ou la sensibilité aux anesthésiques.
Objectifs
Le récepteur à la ryanodine RYR1 est une protéine essentielle à la contraction musculaire. Les mutations dans le gène qui code pour cette protéine conduisent chez l’homme à plusieurs maladies graves, héréditaires et rares du muscle squelettique. Les mutations dominantes de RYR1 peuvent ainsi conduire à la myopathie à cores centraux, ou à une maladie déclenchée comme l'hyperthermie maligne, les deux pouvant être associées chez un même patient. Il n'y a pas de traitement pour ces maladies qui peuvent être mortelles. La myopathie à cores centraux se caractérise par une faiblesse musculaire de sévérité variable chez les patients, prise en charge uniquement par kinésithérapie et corticothérapie en l'absence de tout traitement curatif. L’hyperthermie maligne est un accident d'anesthésie d'origine génétique induit par l'exposition à des certains produits anesthésiques. Elle se traduit lors de l'anesthésie par une augmentation rapide de la température du patient associée à une contracture généralisée qui conduisent à la mort si le patient ne reçoit pas rapidement un traitement adapté. La fréquence de l’hyperthermie maligne est d'environ 1/50 000 anesthésies. Ces deux pathologies étant intimement liées, après l'identification d'une mutation dans le gène RYR1, un patient myopathe est considéré comme sujet à risque d'hyperthermie maligne. Pour étudier les mécanismes physiopathologiques qui découlent de mutations dans le gène RYR1, plusieurs modèles de souris ont été développés. Dans ce projet, nous souhaitons développer une thérapie génique pour toutes les mutations dominantes de RYR1, quelque soit la pathologie qui en découle. Nous avons établi la preuve de concept dans des modèles de cellule en culture du bénéfice de cette approche, et nous souhaitons maintenant l'étudier chez l'animal. Nous utiliserons un modèle de souris porteur d'une mutation dominante qui conduit chez la souris à l'hyperthermie maligne.
Bénéfices attendus
Chez les patients atteints de mutation dominante, sur les deux copies du gène RYR1, une copie est porteuse de la mutation alors que l'autre copie est saine. Nous souhaitons enlever la copie mutée et ne conserver que la copie saine, qui assurera à elle seule la fonction normale du muscle. Nous avons montré dans des cellules musculaire en culture que les fonctions essentielles la protéine RYR1 étaient améliorées avec cette approche thérapeutique, et nous allons maintenant montrer que ces fonctions sont améliorées également dans un organisme entier. Cette stratégie est novatrice car la même approche pourrait s'appliquer à tous les patients porteurs de mutation dominante dans le gène RYR1, mais également dans d'autres gènes associés à d'autres maladies génétiques.
Procédures
Le génotype des animaux sera vérifié sur un prélèvement réalisé par un poinçon à l'oreille, le prélèvement durera quelques secondes (moins de 5 s). Chaque animal subira au maximum une injection (soit dans l'abdomen, soit dans le muscle) d'une durée de moins de 20 secondes par animal, 1 seule fois dans sa vie. Sa force musculaire sera éventuellement mesurée par des tests de comportement réalisés pendant 2 mois toutes les deux semaines et d'une durée de 30 min maximum. Il subira une anesthésie gazeuse de 20 min maximum.
Impact sur les animaux
Les souris du modèle de l'hyperthermie maligne ne présentent pas de signe en dehors de l'anesthésie. Cependant, des nuisances apparaissent chez les animaux porteurs de la mutation lors d’une anesthésie réalisée avec certains composés conduisant à l'apparition d’une crise d'hyperthermie maligne, associant une montée en température et une contraction musculaire généralisée au cours de l'anesthésie. Concernant les autres nuisances potientielles, nous pouvons attendre : 1- Chez certains animaux le traitement pourra entraîner une myopathie progressive avec une fonte musculaire et une perte de la force musculaire. 2- Les injections abdominales et dans le muscle (1 seule fois) peuvent aboutir à des hématomes au site d’injection. 3- Des effets indésirables liés à une hausse de la température centrale corporelle qui peuvent être fatals durant l'anesthésie.
Devenir
Les animaux sont mis à mort et les muscles prélevés pour réaliser des analyses moléculaires et biochimiques essentielles à la confirmation des phénotypes observés lors des tests comportementaux ou de sensibilité à l'anesthésique.
Remplacement
Il n’existe pas de méthodes alternatives, n’impliquant pas d’animaux vivants, permettant l’évaluation de la force musculaire ou la sensibilité à certains produits anesthésiques, et confirmant ainsi l'efficacite du traitement que nous voulons tester. Les outils ont été préalablement sélectionnés sur des cellules musculaires en culture et seul les meilleurs seront testés chez l'animal.
Réduction
Afin de limiter le nombre conditions et donc de réduire le nombre d'animaux vivants utilisés, nous réaliserons un criblage sur des cellules musculaires en culture, et seuls les outils validés seront testés chez les animaux. Le nombre d'animaux par groupe et le nombre de répétitions des expériences sont déterminés à l'aide de tests statistiques appropriés tout en optimisant l'interprétation statistique des informations recueillies. Le projet a été désigné pour une mise au point des étapes préliminaires sur un nombre réduit d'animaux, avant de tester uniquement la méthode optimale sur un plus grand nombre.
Raffinement
1- Les animaux seront hébergés dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l’hébergement des animaux de l’Annexe II du premier février 2013 de l’arrêté fixant les conditions d’agrément, limitant ainsi les angoisses qui pourraient être induites par l’environnement. Les animaux sont hébergés en groupe, en milieu adapté, à température constante, éclairage alterné (12h/12h), avec boissons et aliments sans restriction. 2- Les injections sont réalisées à l'aide d'aiguilles fines et changées à chaque animal. 3- Les tests de comportement sont réalisés après une période d'entraînement permettant de limiter le stress de la nouveauté. 4- Une grille de cotation adaptée est établie afin d'identifier les points limites les plus précoces, et de mettre en place les actions correctrices à apporter (antidouleur dans l'eau de boisson; aliment hydraté dans la cage).
Choix des espèces
La souris est l'espèce animale qui a permis de comprendre de nombreuses pathologies humaines, et la plupart des modèles animaux de maladies humaines sont des modèles souris. Ainsi, nous disposons d'une souche de souris, le modèle murin R163C, permettant de modéliser une altération observée chez des patients atteints d’hyperthermie maligne. Nous avons la possibilité également de croiser des souris de différents fonds génétiques afin d’utiliser la variabilité génétique naturelle existant entre les lignées de souris pour valider nos outils thérapeutiques. Des souriceaux seront utilisés à l'age de 15 jours. Cet âge est choisi comme le plus précoce permettant de réaliser une injection abdominale sur des animaux de faible poids et donc de diminuer les quantités de vecteurs viraux à injecter. Cet âge sera destiné a apporter une preuve de concept de l'efficacité maximale de notre stratégie en se placant à un stade précoce. Des souris adultes seront utilisées à 8-10 semaines. Cet âge correspond à l'âge jeune adulte des patients chez lesquels on découvre une mutation dominante dans le gène RYR1 associée à une susceptibilité à l’hyperthermie maligne (lors d’une anesthésie le plus souvent) ou une myopathie. Cet âge sera destiné à se rapprocher des conditions cliniques réelles pour les patients atteints de pathologie dominante liée à RYR1.
Production de modèles de pathologies humaines de plaquettes à partir des mégacaryocytes dérivés des iPSC de patients
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Irradiées puis greffées de cellules humaines, 1 530 souris subissent quatre injections, une injection dans le fémur, une prise de sang et la section du bout de la queue pour mesurer leur temps de saignement, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à l'issue, une partie par laparotomie sans réveil, pour prélever tissus et organes. Le projet vise à tester l'effet de mutations rares sur la coagulation et la sécurité de plaquettes produites à partir de cellules souches, en vue de transfusions. Le porteur affirme être "contraint" de travailler sur la souris et indique que la thrombose ne peut s'étudier qu'in vivo, l'espèce étant retenue parce qu'elle tolère les greffes de cellules de patients.
Objectifs
Ce projet a pour objectif 1) étudier l’effet de différentes mutations trouvées dans les pathologies très rares sur la coagulation, évènement qui est impossible d’étudier in vitro, et tester l’effet des drogues identifiées dans une étude sur la coagulation réalisée en parallèle in vitro à partir de cellules souches de patients. 2) étudier la fonctionnalité des plaquettes générées à partir des plaquettes dérivés de cellules souches adultes, notamment leur capacité à participer à la formation de caillot ; et tester la sécurité de ces plaquettes dans le but de leur utilisation pour la transfusion (pas de développement d’hémopathies malignes).
Bénéfices attendus
1) Identification et validation de drogues permettant l’arrêt de saignement dans les maladies rares conduisant à des thrombopénies/thrombopathies 2) Développement de stratégie de production de plaquettes in vitro dans le but de transfusion, notamment test de fonctionnalité et sécurité des plaquettes produites in vitro à partir des cellules souches adultes plaquettaires.
Procédures
Irradiation par rayonnements ionisants à faible dose, pas d'effet délétère. Injections (n=4, durée 1 minute sous anesthésie locale). Injection intra-fémorale (n=1), durée 5 minutes sous anesthésie générale puis analgésie bi-modale., Prise de sang (n=1, durée 1min) .Mesure de temps de saignement : par section de l'extrémité de la queue sous anesthésie générale (durée maximale 10 minutes). Laparotomie sous anesthésie générale en procédure terminale, sans réveil.
Impact sur les animaux
Nous n’anticipons aucun effet indésirable après l’injection de MKs ou plaquettes dérivées de cellules souches. Les principales nuisances seront celles dues aux interventions. Injections simples, de contrainte légère sous anesthésie locale. L'irradiation a faible dose n'a pas d'effet délétère. L'injection intra-fémorale peut entraîner une gêne modérée transitoire. La section d'une petite partie de la queue pour étudier le temps de saignement entraîenra une contrainte légère et de courte durée.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés pour études sur tissus et organes, certains à l'issue d'une procédure terminale sans réveil.
Remplacement
Bien que les plaquettes soient étudiées chez les patients, il est rarement possible d’étudier toutes les étapes dérégulées et aboutissant à la pathologie. Ainsi, il est difficile de les étudier chez l’homme. Nous sommes donc contraints de travailler sur souris afin de comprendre le dysfonctionnement dans la production plaquettaire dans les thrombopénies héréditaires qui sont des maladies rares. Cela est possible uniquement sur un modèle animal avec un suivi sur une durée prolongée. Par ailleurs, pour bien comprendre les mécanismes sous-jacents à la pathologie, il est important de les valider sur un nombre de sujets valable sur le plan statistique, possible uniquement sur le modèle animal. De plus, nous nous intéressons, dans chaque pathologie étudiée, à la dérégulation de la thrombose qui peut être étudiée uniquement in vivo.
Réduction
Les effectifs des lots par condition ont été déterminés grâce à l'expérience antérieure du laboratoire et en tenant compte du taux de prise de greffe. Si nous nos résultats obtenus avec les cellules souches contrôles sont reproductibles entre trois expériences indépendantes, nous ferons les expériences uniquement avec les cellules souches mutées sans et avec la drogue ce qui permettra de réduire le nombre de souris greffées avec les cellules souches contrôles. Si certaines drogues sont inefficaces sur les souris greffées avec les cellueles souches mutése, elles ne seront pas re-testées dans les 2 autres expériences pour valider le résultat négatif. Les résultats seront analysés par analyse de variance.
Raffinement
Toutes les interventions (greffes, prélèvement de sang) seront faites sous anesthésie générale. Une surveillance quotidienne sera effectuée pour s'assurer de leur santé physique et comportementale. Un régime énergétique adapté sera ajouté dans les cages en cas de diminution de la prise alimentaire et les points limites strictement appliqués. Les animaux bénéficieront d'un environnement enrichi en tout temps (abri en carton, papier, coton, ...). Dans un souci de bien-être animal, les souris greffées, sous traitement ou non, seront suivies quotidiennement, les injections et prélèvements sanguins seront réalisés sous analgésie ou anesthésie et des points limites définis afin de limiter toute souffrance animale.
Choix des espèces
Nous travaillons sur la souris car nous voulons étudier l’impact de certaines mutations humaines sur un modèle animal tolérant les greffes de cellules de patients. Ainsi, les techniques de transgénèse et greffes sont bien documentées et maîtrisées chez la souris. De plus, en vue de nombreuses publications sur les modèles murins, cette dernière constitue un modèle pertinent pour les projets que nous menons. Les souris sont également adaptées à l’étude d’inhibiteurs que nous testons dans un but thérapeutique. Enfin, la souris semble plus adaptée à l’étude de la formation d’une thrombose in vivo car une étude similaire a déjà été publiée. Cette dernière est à approfondir sur certains aspects, ce que nous souhaitons faire. De plus, nous possédons l’expertise et les moyens techniques nécessaires (vidéomicroscopie chez le petit animal) pour apporter les réponses aux question posées. Pour certaines études, des contraines physilogiques (masses graisseuses autour des vaisseaux chez les animaux plus âgés empêchant la visualisation en vidéomicroscopie) nous imposent d’utiliser des souris âgées de 3 à 5 semaines (jeunes). Pour les autres études nous utiliserons des souris de 8 à 15 semaines (adultes).
Mécanismes moléculaires de la mise en place de l’hypersensibilité mécanique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour comprendre comment s'installe l'hypersensibilité mécanique, 306 souris reçoivent une injection sous-cutanée de la molécule testée ou d'un placebo, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées ensuite pour prélèvement de tissus. 114 subissent une incision de la peau de la patte au scalpel sous anesthésie et 114 autres l'injection d'un composé inflammatoire dans la patte. La sensibilité de la patte lésée est mesurée avec des filaments calibrés la veille et le lendemain, le porteur indiquant que ces lésions accroissent la sensibilité et peuvent entraîner une perte de poids. Il déclare viser à terme la prescription de la molécule comme antidouleur en clinique, et affirme que la douleur ne peut pas être dissociée du système physiologique global de l'animal.
Objectifs
Depuis 2013, notre équipe travaille sur une molécule nommée Tafa4. Cette molécule est présente naturellement en petite quantité dans notre organisme et celui des souris. Si on supprime cette molécule chez la souris, on transforme une douleur aigue en douleur chronique quel que soit le type de lésion. Nous avons aussi constaté que l'injection de Tafa4 permettait de réduire l'hypersensibilité mécanique suite à une lésion, c’est-à-dire qu’après une lésion, les souris sont moins en douleur. Cette molécule a donc une forte valeur thérapeuthique et notre équipe de recherche se propose d'étudier et de comprendre les mécanismes moléculaires à l'origine de cet effet. Recemment, nous avons montrés que l'injection de Tafa4 avant une lésion post opératoire (type chirurgie) empêchait la mise en place de l'hypersensibilité mécanique, ou de la douleur chez la souris. Ainsi, ce projet possède un double objectif. D'une part de comprendre comment la preinjection de tafa4 empêche la mise en place de l'hypersensibilité mécanique, augmentant encore son potentiel thérapeuthique. D'autre part, cet effet préventif est le modèle parfait pour comprendre comment l'hypersensibilité mécanique se met en place, ce qui est une question biologique ouverte depuis des années et qui serait à même d'avoir une incidence sur la prise en charge de certaines douleurs.
Bénéfices attendus
Le but final est que TAFA4 soit prescrite comme une molécule antidouleur en clinique. De plus, comprendre comment l'hypersensibilité se met en place ouvrira un nouveau panel de solution pour la prise en charge de patients souffrant de douleurs chroniques.
Procédures
Afin d’étudier l’effet préventif de TAFA4, nous serons ammenés à injecter la molécule (ou un placebo) en sous-cutannée sur toutes les souris (306). 114 d’entre-elles seront opérées chirurgicalement sous anesthésie général. L’anesthésique sera administré par voie intra-péritonéale. La chirurgie consiste en une fine incision de la peau de la patte avec une lame de scalpel. Pour le modèle inflammatoire, nous injecterons un composé inflammatoire dans la patte de la souris sur 114 d’entre-elles. Ces interventions dureront moins de 20 minutes. Un jour avant et un jour après ces procédures, nous mesurerons la sensibilité au niveau de la patte des animaux grâce à des filaments exerçant une pression donnée.
Impact sur les animaux
Avec les differents modèles de lésions post-opératoires et inflammatoires, la sensibilité des souris au niveau de la patte lésée sera acrue. Ces lésions peuvent entrainer une perte de poids. Toutes ces procédures seront réalisées par un personnel qualifié et expérimenté et tout sera mis en oeuvre pour minimiser la nuisance provoquée. Il y aura une surveillance accrue les jours suivant les chirurgies.
Devenir
Les animaux seront mis à mort car nous devons prélever leurs tissus qui seront par la suite analysés. En effet, l’analyse est indispensable pour comprendre les mécanismes de la douleur et nottamment l’effet préventif de TAFA4.
Remplacement
La thématique principale de notre laboratoire étant de comprendre la physiologie de la douleur, notre projet nécessite l’utilisation d’animaux et ne peut recourir à des stratégies de remplacement par des méthodes non-animales. En effet, la douleur ne peut être dissociée du système physiologique global de l’animal. L’étude comportementale, constituant le point de départ de notre étude, est le résultat d’une intégration complexe de l’information sensorielle de la périphérie vers des zones spécialisées du cerveau. Ainsi, l’expérimentation animale sur des souris est indispensable à l’étude des phénomènes physiologiques et à la réalisation de notre projet. .
Réduction
Des stratégies seront mises en place afin d’éviter ou de limiter l'utilisation subséquente d'animaux supplémentaires tout en obtenant suffisamment de données pour répondre aux questions liées à l'étude. Ainsi, l’élaboration précise des protocoles de comportement et le choix pertinent des contrôles sont des éléments déterminants. De plus nous procèderons à une utilisation maximale des données obtenues en réalisant toute une série de tests comportementaux non-invasifs sur le même animal, sans pour autant compromettre le bien-être animal. Par ailleurs, l’utilisation d’outils statistiques permet d’estimer au mieux le nombre d’animaux nécessaire. Enfin, le contrôle des paramètres environnementaux mais également du statut sanitaire des animaux permettra de limiter la variabilité des résultats expérimentaux obtenus, et ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaire à l’obtention de résultats statistiquement valables. Les procédures décrites sont appliquées depuis plusieurs années au sein de notre équipe et sont maitrisées par les expérimentateurs. Nous avons donc l'expérience nécessaire concernant la réalisation des procédures et l’évaluation de l'impact sanitaire sur les animaux. La qualité de notre plan expérimental ainsi que l’étude détaillée du nombre d’animaux nécessaires à l’obtention d’un résultat scientifique statistiquement valable nous permettent d’optimiser le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les souris utilisées dans ce projet seront élevées en groupes sociaux, dans un environnement enrichi (coton et/ou dôme) pour optimiser les conditions d’hébergement et favoriser un comportement normal afin de diminuer au maximum le stress des animaux. Les élevages sont effectués au sein de notre établissement agréé et 5 personnes sont dédiées à l’organisation et l’entretien des élevages. De ce fait, l’état sanitaire et environnemental des animaux sont contrôlés tous les jours. Nous avons recours à l'anesthésie/analgésie lors du procédé chirurgical et des soins pré-, per- et post-opératoires adéquats sont administrés. Les procédures expérimentales seront planifiées (disponibilité des locaux d'expérimentation, du matériel, période d'acclimatation des animaux aux pièces d’expérimentation), ce qui permettra de diminuer le stress des animaux et de favoriser la validité des expériences. Enfin, des points limites les plus précoces possibles seront établis en fonction des tests de comportements utilisés. Un examen clinique sera effectué quotidiennement afin de vérifier la cicatrisation et l’état général de l’animal. Toutes ces stratégies d’optimisation seront mises en place dans le but de réduire voire supprimer la souffrance chez l’animal.
Choix des espèces
Chez la souris, les populations de neurones spécialisés dans l’intégration des stimuli douloureux sont similaires à celles décrites chez l’homme. De plus, differents tissus impliqués dans l'intégration nociceptives (peau, neurones sensoriels et moèlle epinière) sont parfaitement décrit chez la souris. La recherche sur la douleur est menée sur les rongeurs mâles depuis des décennies. Pourtant, plusieurs études ont montré que les femmes ont des seuils de douleur aiguë plus bas que les hommes et qu’elles sont prépondérantes parmi les patients souffrant de douleurs chroniques, ce qui suggère fortement des mécanismes sexuellement dimorphiques impliqués dans la perception, la modulation et le traitement de la douleur. Nos travaux seront donc réalisés sur des souris mâles et femelles. Lorsque les phénotypes étudiés sont comparables entre mâles et femelles, les données seront regroupées. Cela aura alors un impact considérable sur le nombre total de souris utilisées
Evaluation des mécanismes de mort des cellules hépatiques au cours de la maladie du foie gras reproduit chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Toutes reçoivent une injection intraveineuse de vecteur viral sous anesthésie, 980 sont soumises à un régime hypercalorique pendant douze ou vingt-quatre semaines et 500 à des prises de sang, rétro-orbitales pour partie, tous les quinze jours. Le porteur affirme que la maladie du foie gras induite "reste indolore" et ramène les atteintes à un manque d'appétence initial, tout en signalant que l'un des régimes provoque un diabète de type 2 et une polyurie. Il conclut que seuls les modèles in vivo reproduisent le caractère multifactoriel de cette pathologie.
Objectifs
Au cours de la maladie du foie gras (ou NASH), la mort des cellules principales du foie (hépatocyte) alimente l’état inflammatoire au sein de l’organe, participe à la chronicité et à l’aggravation de la maladie. Des travaux ont évalué indépendamment les 3 principales voies de mort cellulaire programmée (apoptose, nécroptose et pyroptose), suggérant que chacune d’elle pourrait contribuer à la mort des hépatocytes. En parallèle, des interconnexions entre ces différentes voies de mort cellulaire programmée ont été découvertes. Ces interconnexions peuvent conduire à un basculement d’une voie de mort cellulaire à une autre si l’une d’elle est inhibée. Une thérapie basée sur l’inhibition de la mort des hépatocytes devra donc cibler les différentes voies impliquées. Pour preuve, un inhibiteur de l’apoptose aggrave la NASH chez l’Homme probablement en favorisant une voie de mort pro-inflammatoire (nécroptose et/ou pyroptose). L’objectif de notre projet vise à évaluer la pertinence d’un ciblage multiple des principales voies de mort cellulaire programmée. Pour cela des lignées de souris génétiquement modifiées pour rendre les hépatocytes résistants à l’apoptose ou/et à la nécroptose ou/et à la pyroptose seront soumises à un protocole expérimental induisant une NASH. Nous comparerons alors la susceptibilité des différentes lignées à développer la maladie afin de déterminer quelle(s) combinaison(s) pourraient permettre de les protéger de la NASH.
Bénéfices attendus
Lors de la maladie du foie gras (NASH), la mort des cellules principales du foie, l’hépatocyte, alimente l’état inflammatoire du foie et contribue à la chronicité de l’hépatite et donc à son aggravation. Ce projet a pour but d’évaluer l’intérêt thérapeutique d’inhiber individuellement ou en combinaison les 3 principales voies de mort cellulaire programmée (apoptose, pyroptose et nécroptose) qui pourraient être activées au sein de l’hépatocyte au cours de la NASH. Ce projet permettra d’évaluer l’éventuelle nécessité d’un ciblage multiple de 2 ou des 3 types de mort cellulaire programmée. En effet, non seulement, différentes voies de mort cellulaire programmée pourraient être induites dans des hépatocytes distincts mais l’existence d’interconnexions entre elles pourrait permettre un basculement vers une voie de mort cellulaire programmée alternative lorsque celle initialement activée est inhibée. Evaluer l’intérêt d’un ciblage multiple sur les différentes voies de mort cellulaire programmée est donc un préalable pour envisager une thérapie visant à prévenir la mort des hépatocytes lors de la NASH.
Procédures
Différents protocoles expérimentaux seront appliqués sur des périodes de temps différentes s’étalant sur 2 semaines au minimum ou sur 25 semaines maximum. La totalité des animaux (1080) recevront une injection intraveineuse sous anesthésie générale pour inoculer soit un vecteur viral contrôle qui n’induit aucune réaction, soit un vecteur viral capable d’induire une recombinaison génétique ciblée. La procédure incluant la mise sous anesthésie, l'injection et le début du réveil dure moins de 5 min. Pour induire une NASH, des groupes de souris (980) seront soumis à un régime hypercalorique, sur une période de 12 ou 24 semaines selon le type de régime, capable d’induire la maladie du foie gras qui reste indolore. Pour suivre l’évolution de la maladie au cours du temps et permettre de réduire le nombre d’animaux à intégrer à l’étude, un prélèvement sanguin (inférieur à 150 µL) sera effectué tous les 15 jours sur toute la période de mise sous régime hypercalorique, sur une partie des animaux (500). Cette procédure de prélèvement intermédaire s'effectueant sous anesthésie durera moins de 5 min.
Impact sur les animaux
La maladie induite (NASH) est une pathologie indolore. Au cours du protocole expérimental, le seul léger désagrément transitoire ressenti par l’animal sera lié au manque d’appétence initiale pour les régimes alimentaires hypercaloriques. Par ailleurs, l'un de ces régimes induit après plusieurs semaines un diabète de type 2 pouvant résulter en une polyurie nécessitant un suivi régulier de l’état hygrométrique de la litière. Ce régime induit également une prise de poids plus importante qu’un régime standard.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour permettre le prélèvement de plusieurs organes nécessaires à l’analyse de différents paramètres cliniques indispensables à l’évaluation du stade d’avancement de la maladie.
Remplacement
Le développement des pathologies du foie comme la stéatose et la stéatohépatite (maladie du foie gras) dépendent étroitement de la communication entre les organes (foie, tissus adipeux, intestins et pancréas notamment) mais aussi de la communication entre les différents types cellulaires qui constituent le foie. Par conséquent, compte tenu de la nature multifactorielle de la physiopathologie de la NASH, de la composition hétérogène du microenvironnement cellulaire et de la contribution du microbiote intrahépatique, seuls les modèles précliniques in vivo permettent jusqu’à présent de reproduire les diverses caractéristiques d’un organisme multicellulaire atteint par cette pathologie.
Réduction
La stratégie expérimentale a été définie de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés en vue de l’obtention de résultats statistiquement significatifs tout en évitant des réplicas inutiles. En se basant sur les données de la littérature scientifique utilisant des modèles murins de maladie du foie gras induits par un régime alimentaire hypercalorique, un test statistique de calcul d’effectif minimal a été réalisé. Ainsi, un effectif de 10 animaux par groupe permettra de déceler de faibles variations quantitatives entre les groupes expérimentaux tout en prenant en compte la variabilité inter-individuelle et en conservant une sécurité en cas de perte accidentelle d’un individu lié au hasard. Par ailleurs, la conception du projet en étapes successives permet de limiter l’effectif nécessaire à la réalisation de l’étude. Ainsi, un arbre décisionnel d’intégration des lignées dans les étapes successives a été établi. La première étape sert à valider les vecteurs viraux sur un nombre limité de souris avant d’engager les étapes suivantes impliquant un plus grand nombre d’animaux. Alors que les 7 lignées de souris seront intégrées à l’étape suivante, seules celles présentant un phénotype spécifique de protection ou d’aggravation seront incluses aux étapes ultérieures. Enfin, un suivi longitudinal de l’évolution de la maladie par prises de sang régulières évite la constitution de groupes de souris supplémentaires pour des points de cinétique intermédiaires additionnels.
Raffinement
Les études seront conduites dans des installations modernes et agréées pour assurer un confort maximal aux animaux. Un suivi régulier de l’état des animaux sera mis en œuvre, a minima de façon hebdomadaire lors des pesées ou plus régulièrement si nécessaire. Par ailleurs, un grand nombre de mesures sur les échantillons prélevés sont envisagées pour récolter un maximum d’informations. Les manipulations sur les animaux seront réalisées sur des temps courts par un personnel expérimenté, dans une pièce d’expérimentation dédiée distincte de la pièce d’hébergement où résident leurs congénères. Toutes les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’au moins une semaine avant d’intégrer un protocole expérimental. Pour conserver une sociabilisation, les animaux d’une même fratrie seront hébergés à plusieurs au sein des cages. En cas de nécessité d’hébergement individuel lié à de l’agressivité de dominance, les cages disposeront d’un enrichissement approprié. Une anesthésie générale sera effectuée pour les injections ou les prélèvements retro-orbitaux et un anesthésique locorégional sera appliqué pour diminuer l’inconfort induit.
Choix des espèces
Cette espèce (souris) permet de modéliser la pathologie humaine sur des temps raccourcis à l’échelle de vie de cet animal. Par ailleurs, ce modèle murin permet de tester in vivo les conséquences de l’absence d’expression au sein de l’hépatocyte d’une ou plusieurs protéines potentiellement impliquées dans la pathologie. D’ailleurs, des animaux génétiquement modifiés sont déjà disponibles auprès de la communauté scientifique pour cibler spécifiquement les protéines d’intérêts identifiées pour ce projet. Les souris seront incluses aux protocoles expérimentaux au stade d’adultes (8 semaines). En effet, la pathologie du foie gras (NASH) se développe essentiellement chez les adultes. L’âge est d’ailleurs un facteur de risque majeur dans le développement de la NASH.
Thérapie génique de la perte d’audition
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Toutes tuées à l'issue, y compris les reproducteurs transgéniques tués à six mois puis remplacés, 8 132 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré pour tester des vecteurs de thérapie génique contre la surdité. Elles subissent cinq à six tests auditifs sous anesthésie, des injections intrapéritonéales de tamoxifène et une chirurgie intracochléaire de vingt minutes. Le porteur reconnaît que cette chirurgie peut léser l'oreille injectée et faire perdre l'audition, tout en indiquant qu'il ne s'attend à aucun signe de souffrance ni d'inconfort, la surdité provoquée restant unilatérale. Il affirme qu'aucune alternative n'existe, faute de pouvoir mettre en culture les systèmes auditifs périphérique et central.
Objectifs
Entendre, c’est pouvoir identifier et localiser les sources sonores dans l’espace, de jour comme de nuit ; l’audition contribue ainsi à la sécurité des individus. L’audition est devenue chez l’homme le sens prépondérant sur lequel repose la communication inter-individuelle. Or, l’importance de l’audition continue d’être fortement sous-estimée : le risque que la perte de l’audition fait peser sur les individus, risque qui inclut le déclin des fonctions cognitives, n’est ni compris, ni anticipé et les campagnes d’information et de prévention ont été jusqu’ici peu fructueuses. Par leur ampleur et leurs conséquences, les atteintes de l’audition constitueront, avant 2030, la 7ème cause la plus importante d’invalidité au quotidien, selon l’organisation mondiale de la santé. La thérapie génique est une approche thérapeutique de choix pour le traitement de maladies héréditaires. Elle représente une piste de plus en plus explorée pour le traitement des déficits auditifs précoces et profonds. Il a récemment été montré que plusieurs cas surdité liée à l’âge sont des troubles génétiques potentiellement traitables par thérapie génique. Le présent projet vise à établir la preuve de concept d’efficacité thérapeutique de vecteurs de thérapie génique que nous développons pour traiter/stopper la progression de surdités génétiques. La thérapie génique pourra être réalisée à tout moment, en fonction du modèle expérimental de surdité humaine auquel on s’adresse, précoce ou à développement tardif.
Bénéfices attendus
La thérapie génique est une approche thérapeutique de choix pour le traitement de maladies héréditaires ; elle représente une piste de plus en plus explorée pour le traitement des déficits auditifs précoces et profonds mais pas pour les déficits auditifs postnatales dont la presbyacousie. Cependant, il a récemment été montré que plusieurs cas surdité liée à l’âge sont des troubles génétiques potentiellement traitable par thérapie génique. De plus, il a récemment été mis en évidence l’existence de forme génétique de presbyacousie. Le présent projet vise à établir la preuve de concept d’efficacité thérapeutique de certains vecteurs de thérapie génique que nous développons pour traiter/stopper la progression des surdités. La thérapie génique pourra être réalisée à tout moment, en fonction du modèle expérimental de surdité humaine auquel on s’adresse, précoce ou à développement tardif. Si les résultats sont probants, ce projet pourrait poser les bases d’un développement clinique.
Procédures
Les animaux des modèles de surdité seront soumis à des tests auditifs, au nombre de 5 à 6 maximum, avec un intervalle minimal d’au moins un mois entre chaque tests. Le test complet correspond à une anesthésie fixe puis une mesure des amplitudes de la réponse auditive du tronc cérébral et suivie d’une mesure des produits de distorsion des otoémissions acoustiques. L’ensemble de la procédure prend entre 30 et 45 minutes. Les tests auditifs seront réalisés au plus tôt à P16. Des animaux seront soumis à des injections avec une dose unique ou fragmentée (3 fois maximum sur une même semaine) par voie intrapéritonéale avec 100µL d'une solution de tamoxifène (une injection prendra quelques secondes Les animaux seront soumis à des injections de vecteur de thérapie génique qui seront réalisées par voie intra cochléaire une seule fois sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane. L’ensemble de la chirurgie ne durera pas plus de 20 minutes.
Impact sur les animaux
Pour ce projet, les nuisances et effet indésirables attendus sur les animaux sont l’induction de la surdité (surdité congénitale ou acquise, profonde ou modérée, selon le modèle) et les suites de la chirurgie nécessaire à l’administration des vecteurs viraux dans la cochlée. Concernant l’induction de la surdité chez l’animal, nous ne nous attendons pas à ce que les animaux développent des signes souffrance ou d’inconfort. Nous ne nous attendons pas à ce que l’injection du tamoxifène puisse engendrer des effets secondaires. Nous nous attendons à ce que la chirurgie de la cochlée puisse entrainer des lésions et donc une baisse/perte d’audition de l’oreille injectée. La surdité potentielle étant unilatérale, nous ne nous attendons pas à ce que les animaux développent des signes souffrance ou d’inconfort. Concernant les suites chirurgicales, l’état général des souris sera régulièrement suivi après l’injection des vecteurs AAV afin de détecter les signes potentiels de souffrance ou d’inconfort (infection ou problème de cicatrisation du site d’injection, souriceau cyanosé ou délaissé par la mère, cachexie, expression faciale de souffrance (yeux plissés, oreilles couchées vers l’arrière), prostration, immobilité, poil non toiletté).
Devenir
A l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort. Animaux pour élevage : Les anciens reproducteurs sont des animaux transgéniques ne pouvant être adoptés, ils seront mis à mort au bout de 6 mois et renouvelés Animaux utilisés pour les expériences : Pour réaliser nos analyses histologiques sur les oreilles internes, les animaux seront mis à mort. Post mortem nous prélèverons donc les cochlées pour évaluer infra cliniquement performances de nos stratégies de vectorisation.
Remplacement
Les gènes responsables de surdité chez l’homme sont aussi responsables de déficits auditifs chez la souris, et l’architecture des systèmes auditifs périphérique et central de rongeurs, similaire à celle de l’homme, permet d’étudier chez ces animaux l’audition. Aujourd’hui, il n’existe aucune alternative à l’expérimentation animale, car nous avons besoin d’étudier le système auditif dans son ensemble (de l’oreille interne au cortex auditif). Il n’est pas possible aujourd’hui de mettre en culture les systèmes auditifs périphériques et centraux. De plus, aucun modèle informatique n’existe pour simuler le fonctionnement du système auditif dans son ensemble.
Réduction
Les groupes sont constitués afin de garantir une puissance statistique de 80% pour des différences de 10%. Nous utilisons classiquement les tests de student, de Mann-Whitney, test du Xhi2, et ANOVA pour tester la significativité de nos résultats. Afin de réduire le nombre d’animaux, nous utilisons des mâles et des femelles indifféremment, et génotypons les animaux afin de ne pas maintenir inutilement les animaux qui ne portent pas les modifications génétiques d’intérêt pour ce projet. Nous avons établi des tests de criblage de capsides in vitro pour réduire le nombre de vecteurs candidats à tester in vivo et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisé à son strict nécessaire. De plus nous nous appuyons sur les données obtenues dans nos précédentes expériences pour le nombre de vecteurs candidats à tester in vivo et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisé à son strict nécessaire.
Raffinement
Les animaux du projet seront suivis quotidiennement. Ce projet ne concerne que des procédures dont la mise en œuvre ne devrait se traduire ni par une dégradation de l’état de santé de l’animal ni par des douleurs importantes. Si nous observions un comportement anormal en termes de santé (perte de poids, du pelage, etc.) dès l’initiation de l’intégration dans un groupe expérimental, l’animal serait immédiatement mis à mort. Un bâtonnet de coton sera ajouté dans les cages d’hébergement pour faciliter la nidification, ainsi qu’un igloo pour les femelles avec portée. L’emploi d’analgésiques sera systématique tout comme l’application d’un gel ophtalmique lors des anesthésies de souris adultes. Nous utiliserons un matériel miniaturisé pour l’anesthésie gazeuse des animaux entre 0 et 21 jours après la naissance. Les animaux anesthésiés seront gardés sur un tapis chauffant jusqu’à leur réveil complet puis remis dans une cage propre et pourvue d’une coupelle de gel nutritif hydratant. Les animaux opérés seront surveillés tous les jours pendant une semaine après chirurgie puis deux fois par semaine minimum la semaine suivante pour détecter et traiter les éventuels signes d’inconfort tels que décrits dans notre grille d’évaluation de référence.
Choix des espèces
Nous souhaitons recourir aux souris de laboratoire dont le système auditif est similaire à celui de l’homme. De plus, la souris de laboratoire est le seul mammifère modèle pour lequel on dispose d’outils génétiques conséquents. L’audition se met en place chez la souris autour de 10 jours après la naissance ; avant 8 jours après la naissance, le système auditif est immature, à 16 jours après la naissance le système auditif est fonctionnel, et à 30 jours après la naissance et au-delà, le système auditif est mature. En fonction des modèles de déficits auditifs (congénital ou induit), les animaux seront utilisés dès la naissance ou à l’âge adulte.
Développement d’une immuno-oncothérapie basée sur des vecteurs lentiviraux contre le cancer du sein et évaluation de son effet anti-tumoral dans un modèle orthotopique murin
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
1 144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. 992 reçoivent une injection intramammaire de cellules tumorales sous anesthésie, suivie de trois à quatre semaines de croissance tumorale, d'une à deux vaccinations intramusculaires et de deux à quatre injections intrapéritonéales. Le porteur précise que même les souris dont la tumeur a disparu sont tuées, leur système immunitaire modifié empêchant selon lui toute réutilisation, replacement ou adoption. Il affirme qu'aucun système cellulaire in vitro ne peut remplacer la recherche vaccinale et que la réponse anti-tumorale doit s'observer dans un "organisme entier".
Objectifs
Les cancers sont caractérisés par la prolifération incontrôlée de cellules qui subissent une transformation maligne. Le système immunitaire a un rôle majeur dans le contrôle de cette prolifération et plus particulièrement les lymphocytes T cytotoxiques, capables de détruire les cellules tumorales de façon spécifique. L’utilisation d’une vaccination thérapeutique basée sur des vecteurs lentiviraux ayant pour cible des antigènes tumoraux pertinents dans le cancer du sein, pourrait être particulièrement efficace pour permettre l’activation des lymphocytes T spécifiques de ces antigènes et le contrôle immunitaire de la prolifération tumorale. L’objectif du projet est d’établir la preuve de concept de cette immunothérapie contre le cancer du sein et d’étudier les mécanismes du contrôle immunitaire mis en place dans l’organisme par une immuno-thérapie basée sur des vecteurs lentiviraux. Ultimement, les vaccins candidats ayant une activité anti-tumorale notable seront développés en vue d’un essai clinique.
Bénéfices attendus
Les bénéfices à court terme sont la preuve du concept d'utilisation des vecteurs lentiviraux dans la vaccination contre le cancer du sein. Les vecteurs lentiviraux codant pour des antigènes pertinents se sont révélés sûrs et efficaces comme des candidats vaccins contre des flavivirus (ZIKA et Dengue), le SARS-CoV-2, Mycobacterium tuberculosis, d'autres agents pathologiques, ainsi que des tumeurs induites par des «Human Papilloma Virus» (HPV). Le dernier est en cours d’obtention de l’approbation de la FDA pour entrer en phase clinique I/IIa de traitement des cancers du col de l’utérus ou oro-pharyngés résultant des infections par HPV aux USA en 2024. Avec le projet actuel du cancer du sein, nous espérons prouver que les vaccins à base de vecteurs lentiviraux pourront être plus efficaces que les vaccins à base de peptides ou protéines adjuvantés ou d'ARN messager dans le cancer du sein. Les avantages à long terme seront l'utilisation de ces vaccins en clinique contre le cancer du sein.
Procédures
Dans une procédure de sévérité légère, environ 72 souris au maximum seront immunisées avec un candidat vaccin (quelques secondes), et mises à mort au bout de 30 jours afin d'analyser leur réponse immunitaire. Les autres procédures de sévérité moyenne, et à appliquer à un maximum de 992 souris, comprennent dans un premier temps l'injection intra-mammaires de cellules tumorales (quelques secondes) sous anesthésie gazeuse puis la surveillance de la croissance tumorale pendant 3 à 4 semaines. La vaccination sera ensuite réalisée en intramusculaire via 1 à 2 injections espacées de 3 semaines (quelques secondes). Dans le cadre de la dernière procédure, les souris subiront également 2 à 4 injections en intrapéritonéale (quelques secondes) sous deux semaines.
Impact sur les animaux
Les souris ressentiront une légère douleur au moment de l'injection mammaire du petit volume de suspension cellulaire. L'injection de cellules tumorales sera effectuée sous anesthésie générale. Normalement, la croissance de la tumeur est bien tolérée par les souris, mais peut dans certains cas s’associer à une perte d'activité normale, en particulier si la tumeur atteint la taille limite. La période maximale de nuisance sera de 1 à 2 jours.
Devenir
Les souris présentant des tumeurs seront mises à mort pour des raisons éthiques (pour éviter les souffrances). Si les souris ne présentent plus de tumeur grâce aux différents traitements, elles seront suivies pendant deux mois. Même les souris sans tumeur ne peuvent être réutilisées car leur système immunitaire a été modifié par la vaccination. Par conséquent, tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés.
Remplacement
L’objectif de ce projet est de tester l’efficacité de candidats vaccins destinés à l’humain. Ce type d’étude implique nécessairement une phase d’expérimentation animale du fait de la complexité de la réponse vaccinale et anti-tumorale au niveau d’un organisme entier. Cette étape constitue une preuve de concept requise par les agences réglementaires de santé en vue d’une application chez l’humain, en complément des études réalisées in vitro. Actuellement, aucun système cellulaire in vitro ne peut être utilisé pour remplacer la recherche vaccinale et immuno-thérapeutique sur les animaux.
Réduction
Sur les conseils d’un biostatisticien, les groupes seront constitués de 5 à 10 animaux, en fonction de la nature de l’expérience, et du fait de la variabilité de la croissance tumorale de façon à obtenir des différences statistiquement significatives entre les groupes, pourra être réduit si la variabilité observée est moins élevée que celle actuellement estimée. Des études précédentes ont permis d’optimiser le protocole de vaccination avec des vecteurs lentiviraux et de définir la cinétique de vaccination permettant de limiter le nombre d’animaux utilisés. Les vecteurs lentiviraux seront préalablement validés par des études d’immunogénicité chez la souris afin de s’assurer qu’ils permettent la mise en place de réponses cellulaires T spécifiques des tumeurs chez la souris. Avant chaque procédure, le résultat des procédures précédentes sera pris en considération. Si un candidat vaccin n'a pas d’effet significatif sur la croissance de la tumeur, les procédures suivantes, qui devraient permettre de comprendre le mécanisme d'action d'un vaccin, ne seront pas réalisées.
Raffinement
Selon notre expérience antérieure, l’injection de vecteurs lentiviraux n’induit aucun signe clinique chez les souris. L’implantation de tumeurs mammaires peut induire une gêne modérée, qui sera contrôlée au cours des expériences. Les tumeurs seront implantées seulement au niveau des 4èmes glandes mammaires (gauche ou droite) où, par rapport aux glandes mammaires situées plus haut, il y a plus d’espace pour la croissance tumorale et par conséquent sans gêner la mobilité des souris afin de limiter à minima la gêne occasionnée par la tumeur. Les animaux seront observés pour détecter tout signe d’inconfort ou de souffrance, si un point limite (nécrose ou la taille de tumeur) est atteint. La souffrance des animaux sera abrégée par leur mise à mort. Si les signes cliniques de souffrance sont légers, mais néanmoins présents, comme des poils hérissés, inactivité, plusieurs mesures seront prises, incluant l’ajout de gel hydrique, réhydratation sous cutanée, chauffage des cages ou bien l’amélioration de l’enrichissement qui consistera à ajouter la litière à base de cellulose quand les tumeurs seront palpables pour éviter l’irritation par les coupons de bois.
Choix des espèces
Le système immunitaire de la souris est proche du système immunitaire humain. Il existe de nombreux modèles de tumeurs qui peuvent être utilisés chez la souris pour tester nos candidats vaccins. De plus, des études précédentes montrent que les vecteurs lentiviraux sont immunogéniques chez la souris et de nombreux outils sont disponibles pour étudier les réponses immunitaires chez cette espèce. Les expériences envisagées requièrent des animaux avec un système immunitaire fonctionnel. Elles seront donc menées sur les souris adultes âgées de 6 semaines au minimum.
Inhibition de facteurs épigénétiques pour favoriser l’immunité anti-tumorale et surmonter la résistance au traitement du cancer du pancréas.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Soumises à une greffe de cellules tumorales pancréatiques par chirurgie, puis à des injections dans l'abdomen cinq jours par semaine pendant quatre semaines, 144 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère et toutes tuées pour prélèvement d'organes. Le porteur écrit qu'elles développeront "une pathologie potentiellement grave", le cancer du pancréas ayant chez l'humain un taux de survie à cinq ans inférieur à 7 %. Il avance qu'une hausse du taux de réponse de 1 % à 10 % bénéficierait à plus de 50 000 patients par an, chiffre posé sans étape intermédiaire entre ces souris et la clinique. Il conclut à un recours "indispensable" aux animaux, en s'appuyant sur le caractère très invasif des biopsies pancréatiques chez les patients.
Objectifs
L'adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC) est l'une des formes de cancer les plus mortelles et dont le taux de survie à 5 ans des patients diagnostiqués avec cette maladie est inférieur à 7 %. Le PDAC est connu pour son environnement tumoral immunosuppresseur bien développé qui entraîne une résistance aux thérapies conventionnelles et ciblées. Cette barrière immunitaire est également l'une des principales raisons de l'absence de réponse aux inhibiteurs de points de contrôle immunitaire dans la plupart des cas. Il y a donc un besoin urgent de développer des thérapies durables pour restaurer la réponse immunitaire anti-tumorale chez les patients atteints de PDAC.
Bénéfices attendus
Nous exploiterons l'ensemble des résultats obtenus ici dans le but de comprendre, valider puis cibler les vulnérabilités immunitaires spécifiques de la PDAC afin de restaurer l'immunité anti-tumorale chez les patients. Étant donné que plusieurs des molécules testées sont déjà appliquées en clinique pour d'autres maladies, le succès d'une seule molécule dans nos modèles précliniques de PDAC pourrait propulser cette thérapie rapidement vers des essais cliniques chez l'homme. L'augmentation du taux de réponse de la PDAC, ne serait-ce que de 10 % contre 1 % actuellement, bénéficierait à plus de 50 000 patients par an grâce à l'amélioration de leur qualité de vie et de leur survie globale.
Procédures
Les animaux seront soumisent à 1 procédure chirurgicale (durée 20 minutes), des injections dans l'abdomen (durée 30 secondes) 5 fois par semaine pendant 4 semaines et enfin, un prélèvement de sang sous anesthésie juste avant le sacrifice pour nécropsie pour prélèvement des organes d'intérêt (donc 1 seul prélèvement par souris, qui dure 30 secondes au maximum).
Impact sur les animaux
Les animaux seront transplantés avec des cellules tumorales et développeront donc une pathologie potentiellement grave. L'anesthésie constituera une nuisance sur les animaux. Les manipulations, ainsi que les pesées peuvent être source d'angoisse. D’autres nuisances éventuelles pourraient être induites lors l’injection éventuelle d’analgésiques en postopératoire, et les prélèvements sanguins.
Devenir
Le sort de tous les animaux sera la mise à mort sous anesthésie pour prélèvement d'organes en vue d'analyses cellulaires, biochimiques et histologiques.
Remplacement
Concernant le remplacement, le recours aux animaux est indispensable pour ce projet. D’une part, pour cette étude mécanistique, les données expérimentales devront être en grande partie obtenues sur des échantillons de tumeurs et organes corporels, et cette démarche est limitée chez l’homme. Les gestes de prélèvement de tissu pancréatique sont très invasifs en clinique ; une seule biopsie est faite par endoscopie au diagnostic de cancer du pancréas, et seuls les moins de 20% de patients montrant une tumeur localisée dans le pancréas sont éligibles pour une résection de la tumeur par chirurgie qui n’est faite qu’une seule fois. Ainsi nous ne disposons pas d’échantillon tumoral pour plus de 80% des patients et un suivi dynamique n’est possible chez aucun. A l'inverse, l'utilisation de modèles tumoraux orthotopiques est très courante dans la littérature, elle permet d'étudier l'environnement tumoral et de reproduire l’hétérogénéité tumorale qui ne peut être recréé in vitro (i.e. un seul organe isolé) ou chez une espèce autre que les mammifères. De plus, leur utilisation dans de nombreux projets scientifiques a permis des avancées significatives et le transfert vers des essais cliniques.
Réduction
Nous n'utiliserons que le nombre de souris nécessaires pour l'exploitation statistiques des données, à savoir 144 individus sur 2 années conformément à la règle de réduction. Ce chiffre a été déterminé par un calcul d'effectif prenant en compte les données statistiques connues pour ce modèle.
Raffinement
Les conditions d’hébergement respectent les besoins physiologiques et le bien-être des animaux. Les animaux seront hébergés dans des salles dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés (température : 20-22°C ; renouvellement d’air : 15 volumes/heure ; éclairage artificiel : 12h jour / 12h nuit). La nourriture et l’eau sont fournies ad libitum. Afin de respecter leur instinct grégaire, l’hébergement des animaux se fait en confinement en cages individuellement ventilées à raison de 5 souris par cage. L’environnement est enrichi à l’aide de coton, de lanières de papier utiles à la nidification, et éventuellement d’un dôme. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. Les contraintes par rapport à la douleur, la souffrance et l’angoisse dans le cadre de l’expérimentation présentées dans le projet seront réduites par une surveillance accrue avec des points limites spécifiques et adaptés. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée (comme par exemple l'apport d'un analgésique) à mener en fonction d’une grille de score du bien-être. Une anesthésie générale et une analgésie périopératoire appropriée seront administrées aux animaux durant les procédures chirurgicales de transplantation des cellules tumorales.
Choix des espèces
Le projet nécessite l’utilisation d’une espèce de la classe des mammifères proche de l’Homme pour sa physiologie. L'espèce choisie est la souris C57BL/6, car elle permet le transfert adoptif de cellules immunitaires et tumorales. Elle est couramment utilisée en oncologie et dans la recherche sur les cellules souches. Les tumeurs pancréatiques qui se développent chez la souris montrent de nombreuses similarités avec les tumeurs humaines, faisant de la souris un très bon modèle d’étude. De plus, il est connu que plus de 80% de protéines (séquences nucléiques codantes) sont homologues entre la souris et l'homme y compris au niveau immunitaire, ce qui renforce l'utilité du modèle pour ce projet qui concerne le système immunitaire. Pour toutes ces raisons, le choix de travailler chez la souris, qui présente l’avantage d’être de petite taille et facilement manipulable, est entièrement justifié. Les souris doivent être âgées de 6 à 10 semaines au moment de la greffe de cellules tumorales. Cet âge est nécessaire pour que les animaux soient d'une taille suffisant pour opérer et que système immunitaire soit mature.
Etude de la hiérarchie sociale chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour tester si l'absence de certaines molécules du stress prédétermine le rang social, 768 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, toutes tuées à six mois pour prélèvement du cerveau. Le test de préséance dans un tube dure dix minutes par jour et par souris pendant au moins six jours d'affilée, répété une fois par mois pendant quatre mois, suivi de deux tests d'anxiété que le RNT ne nomme pas. Le porteur indique que les mâles peuvent se battre et être blessés au moment du regroupement en cage. Il rattache le projet à la compréhension du lien entre statut social et pathologies psychiatriques chez l'humain, et écrit que la nature de sa recherche "nécessite" des animaux non-humains plutôt que des sujets humains.
Objectifs
La plupart des espèces animales vivent selon une organisation sociale qui engendre une individuation des comportements. Les mécanismes biologiques qui conduisent à son émergence restent mal connus. Il a été montré récemment que l'activité de certains neurones est impliquée dans l'établissement de hierarchies sociales. De plus, nous avons observé une apparition de traits comportementaux spécifiques en fonction du rang social en terme d'anxiété. Les neurones étudiés sont modulés par le stress, laissant entrevoir un rôle potentiel dans l'établissement d'une hierarchie. L'objectif de ce projet est de tester si l'absence de certaines molécules impliquées dans la réponse au stress dans des neurones spécifiques prédétermine le rang social des individus au sein d'une colonie.
Bénéfices attendus
Le statut économique et social chez l'homme est l'un des facteurs impactant le plus la santé physique et mentale. Il a été montré que des souris de rang inférieur présentaient une susceptibilité accrue à des phénotypes de type dépressifs ou addicts. Comprendre les mécanismes participant à la mise en place d'une hiérarchie au sein d'une colonie permettra d'améliorer la compréhension du lien entre vie sociale et pathologies psychiatriques.
Procédures
Les souris seront soumises à des tests comportementaux (mesure de la hierarchie sociale : détermination des souris dominées et dominantes par test de préséance dans un tube, et tests mesurant l'anxiété). Le test de hierarchie dure environ 10min par jour par souris pendant au moins 6 jours d'affilée. Ce test sera répété une fois par mois pendant une durée de 4 mois. Les 2 tests d'anxiété durent chacun 10 min par souris et ne seront pas répétés. A l'issue des tests, les souris sont euthanasiées par une méthode règlementaire en vue des différents prélèvements et analyses.
Impact sur les animaux
Les souris mâles peuvent parfois se battre et être blessées au moment où on les groupe dans la même cage. L'habituation des souris au passage dans le tube peut générer un léger stress pendant 1 ou 2 jours.
Devenir
Chaque animal (âge 6 mois) sera euthanasié à l'issue de la procédure et le cerveau collecté pour analyse anatomique ou biochimique.
Remplacement
Même si nous nous efforçons au maximum de travailler in vitro, la mise en place d'une hiérarchie sociale se fait à l’échelle de l’organisme. Les procédures décrites ici sont donc essentielles pour mieux comprendre la mise en place et le maintien d'une structure hiérarchique chez les animaux. Il n’existe pas encore de modèle computationnel des comportements complexes animaux. La nature expérimentale de notre recherche nécessite l’utilisation de modèles animaux plutôt que des sujets humains. Les résultats obtenus au laboratoire sont toutefois complémentaires à ceux obtenus chez l’homme. L’anatomie, la physiologie et les comportements murins sont suffisamment complexes pour modéliser de nombreux aspects de la biologie humaine. Nous étudions la souris afin de tirer profit des techniques de transgénèse conditionnelle pour l’étude de la fonction des gènes.
Réduction
Nous avons réduit le nombre d'animaux utilisés (768 souris) au maximum en calculant le nombre nécessaire par groupe expérimental grâce à une analyse prédictive du nombre d’animaux en réalisant un calcul de puissance. Nos travaux passés nous indiquent aussi que ces études comportementales nécessitent entre 12 et 24 colonies de 4 souris par groupe expérimental pour atteindre une puissance statistique satisfaisante. Nous analyserons nos résultats avec les tests statistiques appropriés afin d’obtenir des valeurs fiables et robustes. Pour les études anatomiques et de biochimie, nous utiliserons les animaux testés en comportement afin de réduire au maximum le nombre de cohortes
Raffinement
Les souris seront hébergées par groupe de 4 dans des cages adaptées à leur taille et leur nombre. Dans ces cages, l’enrichissement utilisé sera du nid végétal. Les animaux seront suivis 7 jours sur 7 durant l'ensemble de la procédure (acclimatation et handling puis expériences). Une pesée hebdomadaire sera effectuée. Une détérioration de leur état général (perte de poids, prostration, poils souillés) entrainera un arrêt immédiat de la procédure, un suivi journalier de l’animal avec traitement antalgique et éventuellement une euthanasie pour éviter toute souffrance. En cas de blessures, l’animal sera soigné si nécessaire et son état évalué le lendemain. S’il n’est pas complétement rétabli, la procédure sera alors arrêtée pour cet animal.Pour les tests comportementaux, les animaux sont habitués à être manipulés par les expérimentateurs avant le début des tests afin de réduire leur stress. Des points limites adaptés ont été définis pour toutes les procédures.
Choix des espèces
L’anatomie et la physiologie de la souris sont suffisamment complexes pour modéliser de nombreux aspects de la biologie et des comportements humains. Les circuits étudiés dans ce projet sont particulièrement bien conservés chez la souris tant d’un point de vue anatomique que fonctionnel. Dans nos études, les souris sont utilisées afin de tirer profit des techniques de transgénèse. En effet, l’intérêt croissant pour la souris comme modèle a alimenté le développement de techniques sophistiquées pour l’étude des comportements, dans l’organisme vivant. Tous les comportements seront réalisés sur des animaux adultes (entre 8 semaines et 6 mois). Des mâles et des femelles seront étudiés.
Cibler le métabolisme lipidique et les cytokines pour traiter les cancers au stade primaire et métastatique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
11 040 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement de tissus et d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie de trente minutes, jusqu'à trois prises de sang mandibulaires, des injections intrapéritonéales deux à quatre fois par semaine sur quatre semaines, un gavage quotidien et de l'imagerie sous anesthésie deux fois par semaine. Le porteur indique que la croissance tumorale peut aboutir à une dégradation de l'état général des souris. Sur le remplacement, il consacre deux phrases à affirmer que ces études sont "essentielles" et qu'elles ne peuvent pas être remplacées par des analyses in vitro, sans autre argument.
Objectifs
Des modulations de la production de lipides et de cytokines jouent un rôle majeur dans le développement du cancer. En effet, les cytokines et lipides sont des acteurs essentiels de la régulation de la fonction et du déplacement des cellules immunitaires. Ils participent également à réguler la capacité qu'ont certaines cellules immunitaires à reconnaitre et détruire les cellules tumorales. Certains de ces facteurs peuvent donc constituer des cibles thérapeutiques. Notre projet a pour objectif général de clarifier le rôle de certains lipides et de certaines cytokines dans des phénomènes clés de l'initiation et de la progression des cancers: prolifération, réponse et résistance aux traitements anticancéreux, migration et dissémination, modulation du microenvironnement tumoral incluant les réponses immunitaires locales et systémiques.
Bénéfices attendus
Les thérapies visant à stimuler les réponses immunitaires ont permis d'augmenter de façon considérable la survie des patients atteints de divers cancers et particulièrement les thérapies ciblant des protéines inhibitrices de la réponse immunitaire anti-tumorale. Cependant, de nombreux patients résistent à ces thérapies ou rechutent dans les 5 ans suivant l'initiation du traitement. Nos travaux visent à identifier de nouvelles thérapies permettant de lever certaines de ces résistances et d'essayer de transposer ces stratégies en clinique. Identifier plus particulièrement le rôle joué par les cytokines et lipides est essentiel au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques et à l'identification de potentiels biomarqueurs de réponse aux thérapies existantes.
Procédures
Les animaux inclus dans ces études pourront être soumis à des chirurgies. Une seule chirurgie sera pratiquée par animal et la durée n'excèdera pas 30 minutes. Les souris vigiles pourront également être soumises à des prélèvement de sang réalisés au niveau mandibulaire. Trois prélèvements maximum par souris espacés d'une semaine. Des injections au niveau de la peau (3 fois maximum par souris), intrapéritonéales (2 à 4 fois par semaine sur 4 semaines maximum) ou intraveineuses (1 fois pour chaque souris) pourront être pratiquées. Les souris pourront être imagées sous anesthésie à raison de 2 fois par semaine pendant 20 minutes maximum. Des traitements pourront être administrés par gavage à raison de 1 fois par jour maximum pendant la durée de l'expérience ou par injection intrapéritonéale à raison de 3 fois par semaines maximum pendant la durée de l'expérience.
Impact sur les animaux
Ce projet est associé à la réalisation de chirurgies pouvant induire des douleurs, une hypothermie, une déshydratation associées à l'opération. Les points de suture réalisés lors de la fermeture des plaies pourrons être associés à une gêne. Les traitements donnés aux animaux par voie orale et par injection pourront induire du stress, une gêne ou une douleur au point d'injection. Les traitements donnés aux souris auront également la possibilité de déclencher des troubles digestifs. Enfin, les modèles de croissance tumoraux peuvent provoquer une gêne et aboutir à une dégradation de l'état général des animaux. Le génotypage des souris élevées au sein de la structure sera réalisée selon une procédure générique standardisée du centre éleveur. Les nuisances associées sont décrites dans la DAP du centre éleveur (douleur légère et de courte durée).
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort à la fin de chaque procédure car des prélèvements de tissus et d'organes doivent être réalisés.
Remplacement
Ces études, réalisées chez la souris, sont essentielles afin d'évaluer l'impact de nouvelles thérapies sur le traitement des cancers et la mise en place des réponses immunitaires anti-tumorales. Ces études ne peuvent être remplacées par des analyses in vitro.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, une étude approfondie de la littérature a été effectuée afin de définir au mieux les objectifs de nos travaux et ne pas reproduire des résultats déjà existants dans la littérature. Cela nous a permis de définir les meilleurs protocoles possibles afin d'adapter le nombre d'animaux à la réalisation de nos objectifs. Des études pilotes seront mises en place afin d'optimiser les conditions de chaque nouvelle expérience.
Raffinement
Toutes les procédures seront réalisées par du personnel formé à l'expérimentation animale et quand nécessaire à la chirurgie. Nous porterons une attention particulière au stress et à la souffrance potentiellement ressentie par les animaux au cours de la réalisation des procédures. Les cages seront donc enrichies avec du sizzlenest pour la nidation, la préhension des souris sera réalisée grace à des tubes transparents ou des plateformes adaptées. Des narcoleptiques et analgésiques seront utilisés quand nécessaire. Les chirurgies seront réalisées sur des plaques chauffées à 37 degrés. Une injection sous cutanée de solution saline sera réalisée afin de prévenir la déshydratation potentielle des animaux. Le temps de chirurgie sera réduit au miximum (moins de 30 minutes). Des pots de gel diet seront ajoutés dans les cages pour faciliter la réhydration et la prise alimentaire des souris après chirurgie. Les volumes et les doses de traitements administrés sont optimisés et réduits au maximum afin de minimiser l'inconfort lors de l'administration et les potentiels effets indésirables. Des points limites spécifiques et adaptés à chaque procédure ont été définis. Cela permettra aux équipes des centres éleveur et investigateur de prendre une décision adaptée afin de stopper la souffrance des animaux.
Choix des espèces
De nombreuses thérapies maintenant utilisées en clinique pour le traitement de divers cancer ont été développées et optimisées en pré-clinique par utilisation de modèles murins génétiquement modifiés ou non. Cela inclus notamment les immunothérapies visant à bloquer les points de contrôle de l'immunité (Programmed cell-death1 [PD-1] et Cytotoxic T lymphocyte associated protein 4 [CTLA-4]). Non seulement l'efficacité de ces thérapies chez la souris a été confirmée chez l'Homme, mais de nouvelles combinaisons thérapeutiques développées chez la souris se montrent transposables à la clinique. Les animaux impliqués dans nos expériences seront âgés de 5 à 12 semaines. Les souris C57Bl6J et BalbC à cet âges là peuvent peser entre 16 et 21g. Tous nos traitements sont/seront optimisés (dose efficace et minimum d'effets indésirables) pour des souris rentrant dans cette fourchette de poids.
Tutorat des gestes techniques de base chez la souris
- Formation professionnelle
Toutes tuées à l'issue, 1 200 souris sont utilisées pour l'apprentissage de gestes techniques de base par des personnels en attente d'habilitation, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent un prélèvement pour génotypage entre 7 et 15 jours, puis au maximum deux piqûres dans leur vie, injection intrapéritonéale, injection sous-cutanée ou prise de sang. Le porteur inscrit la mise à mort elle-même parmi les gestes à apprendre, et indique que les souris utilisées proviennent des élevages internes, leur génotype n'intéressant aucun projet de recherche. Il affirme qu'un organisme vivant est "nécessaire" et que le tutorat ne peut pas se faire sur un autre modèle.
Objectifs
L'unité de service met, à disposition de la communauté scientifique, un ensemble de prestations liées à l’utilisation de modèles animaux à des fins scientifiques. Des modèles rongeurs sont gérés, hébergés, développés et maintenus dans les locaux, pour les besoins de la communauté scientifique qui, pour réaliser sa recherche fondamentale et biomédicale, doit disposer de modèles précliniques permettant de comprendre diverses fonctions biologiques dans les pathologies humaines (maladies immunitaires, métaboliques, infectieuses inflammatoires, cancéreuses, etc). Le service réglementation et la structure bien-être animal de l'unité a établi une procédure obligeant tout utilisateur en attente de son attestation d'habilitation, à suivre un tutorat interne des gestes techniques de base afin de s'assurer que toutes les personnes qui entrent dans l'animalerie respectent le bien être animal.
Bénéfices attendus
Ce projet permet d’assurer la formation sous forme de tutorat des différents gestes couramment utilisés en recherche utilisant des animaux à des fins scientifiques afin de s’assurer de leur bonne acquisition et ainsi garantir le bien-être animal et le respect des 3R sous la supervision de la structure chargée du bien-être animal. Le tutorat permet également un rappel réglementaire qui favorisera l'application des 3R et l'implication de la structure bien être animal dans les projets.
Procédures
Lorsqu'ils sont nouveaux nés (7-15 jours), un prélèvement sera réalisé pour génotypage. Pendant le projet, les animaux seront soumis à une injection intrapéritonéale une injection sous cutanée, et/ou un prélèvement sanguin (2 piqûres maximum par animal durant leur vie, durée de quelques secondes). Les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire en fin de projet.
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent ressentir un stress lors de leur manipulation. De la douleur légère et de courte durée peut être ressentie lors des différents gestes techniques (piqûre, biopsie pour les animaux qui auront été génotypés). Une hémorragie peut se déclarer exceptionnellement lors des prélèvements de sang. L’anesthésie pourra engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse respiratoire.
Devenir
L'euthanasie par une méthode réglementaire fait partie des gestes techniques de base en recherche animale nécessaires pour la réalisation des projets scientifiques.
Remplacement
Un organisme vivant est nécessaire pour mener à bien les divers projets scientifiques autorisés au sein de l'établissement. La souris est le modèle le plus utilisé par les chercheurs pour étudier les fonctions biologiques et les pathologies. Par conséquent, le tutorat ne peut pas être réalisé sur un autre modèle .
Réduction
Nous utiliserons 2 souris par personne lors du tutorat. Ces souris proviennent des élevages réalisés dans l'établissement, ce sont les animaux dont le génotype n'est pas d'intêret pour les projets de recherche et qui sont destinées à l'euthanasie. Dans le cadre des 3R, ces souris seront donc utilisées pour ce projet. Il n'y aura pas de test statistique réalisé dans le cadre de ce projet de tutorat. Au total 1200 animaux pourront être utilisés dans ce projet.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation avec un cycle jour nuit automatique : les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’isolement est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec un des enrichissements ci-après : carré de lanière kraft, batônnet en bois, rouleau en carton ou maisonnette. Les conditions de températures et d’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les animaux sont vérifiés quotidiennement. Deux souris seront utilisées par utilisateur afin de permettre leur récupération entre deux gestes techniques. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive et quotidienne des animaux (points limites, implication de la structure bien être animal).
Choix des espèces
La souris est le modèle le plus utilisé par les chercheurs pour étudier les fonctions biologiques et les pathologies. Le tutorat doit se dérouler sur des souris adultes pour être au plus proche des stades de développement utilisés dans les projets de recherche. De plus, dans un souci de bien être animal, les souris utilisées ne seront pas vieillissantes. Ainsi, les animaux auront entre 2 et 6 mois de vie.