Rongeurs
Manipulation transgénique des taux d’acides gras polyinsaturés dans des populations neuronales spécifiques: conséquences sur la prise de décision
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
840 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent une chirurgie stéréotaxique de quatre-vingt-dix minutes, une privation alimentaire maintenue à 90 % de leur poids pendant environ huit semaines et treize semaines de régimes lipidiques modifiés, puis un conditionnement opérant où il faut appuyer sur un levier pour obtenir de la nourriture. 720 sont tuées pour analyse histologique et les 120 géniteurs à sept ou huit mois, à la fin de leur période de reproduction. Le porteur qualifie les effets de la privation alimentaire de "très limités" et justifie le recours aux souris par des dimensions comportementales qu'il déclare non modélisables in vitro ou in silico.
Objectifs
Le but de ce projet est de déterminer quelles sont les types de neurons qui sont vulnérables à une déficience en acides gras polyinsaturés (AGPI) de type n-3. Pour cela, nous utiliserons une approche transgénique qui permettra de restaurer les taux d'AGPI dans des populations spécifiques de neurones en situation de carence générale en AGPI n-3. Nous testerons les processus de prise de décision par des tâches comportementales de conditionnement opérant où l'animal doit appuyer sur un levier pour obtenir une récompense alimentaire. Nous mesurerons l'activité neuronale par des approches d'imagerie in vivo chez l'animal se comportant.
Bénéfices attendus
Ces études permettront de comprendre comment le statut cérébral en AGPI - qui est perturbé dans plusieurs pathologies psychiatriques- influence les processus de prise de décision.
Procédures
Les procédures de conditionnement opérant nécessitent une déprivation alimentaire légère (maintien à 90% du poids ad libitum) durant environ 8 semaines - 1 chirurgie stéréotaxique d'environ 90 minutes- Exposition chronique à des régimes modifiés en lipides pendant environ 13 semaines
Impact sur les animaux
Une déprivation alimentaire légère (maintien à 90% du poids ad libitum) a des effets très limités pour l'animal. Les chirurgies stéréotaxiques présentent un degré de sévérité modéré durant la période entourant l'opération. L'exposition chronique à des régimes modifiés en lipides n'a pas d'impact évident pour l'animal.
Devenir
Tous les animaux expérimentaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour procéder à des analyses histologiques (720). Les géniteurs (120) seront mis à mort à l'âge de 7-8 mois, à la fin de la période de reproduction.
Remplacement
Ce projet ne peut être réalisé sans l'utilisation de modèles animaux puisqu'il s'intéresse à des dimensions comportementales, non modélisables sur des modèles in vitro ou in silico.
Réduction
Tous les efforts seront faits pour réduire le nombre d'animaux utilisés. En particulier, nous utiliserons une stratégie de croisements génétiques qui permettra l'utilisation de tous les animaux de la descendance et comparerons les mâles et les femelles. Du fait de cette stratégie, tous les animaux (génotypes et sexes) issus de nos croisements seront utilisés. Le nombre d'animaux nécessaires est basé sur des expériences précédemment effectuées au laboratoire permettant de révéler des différences statistiques entre groupes.
Raffinement
Tous les efforts seront faits pour réduire la souffrance des animaux. Les animaux seront hébergés en cages collectives et environnement enrichi (igloo, bâtons à ronger et lanières de papier). Du fait de la déprivation alimentaire durant les expériences de conditionnement opérant, les animaux seront observés et pesés tous les jours de la semaine. Concernant la chirurgie stéréotaxique, des analgésiques et anesthésiques seront administrés. Les animaux seront observés jusqu'au réveil puis 2 fois par jour pendant 3 jours. Les points limites seront évalués à l'aide d'une grille et seront consignés sur une fiche de scorage. Si un score élevé persiste pendant plus de 48h les animaux seront mis à mort. Dans tous les cas, si des blessures apparaissent, elles seront immédiatement soignées et les animaux seront surveillés 2 fois par jour. Si un animal présente un comportement anormal traduisant un état de mal-être il sera immédiatement isolé et surveillé. Si l'animal ne montre pas d'amélioration significative il sera mis à mort dans les 48h.
Choix des espèces
Ce projet nécessite l'utilisation de modèles transgéniques disponibles uniquement dans des modèles souris. Les animaux expérimentaux seront utilisés à l'âge adulte (>8 semaines) puisque le projet vise à évaluer les conséquences fonctionnelles des manipulations en AGPI sur le cerveau mature.
Travaux pratiques de formation réglementaire à la chirurgie chez la souris
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
Tuées encore sous anesthésie, sans reprise de conscience, 200 souris subissent une incision de l'abdomen puis des sutures, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent aussi une puce d'identification, jusqu'à quatre injections intrapéritonéales et deux injections sous-cutanées. Le projet ne produit aucune connaissance, il sert des travaux pratiques de formation réglementaire à la chirurgie, à raison d'une souris par binôme d'étudiants, jusqu'à 32 étudiants par session et deux sessions par an. Le porteur indique que les sutures sont d'abord apprises sur des cuisses de poulet, et que les souris utilisées sont des animaux "de réforme" issus d'élevage qui auraient de toute façon été tués.
Objectifs
L'objectif de ce projet est la réalisation de travaux pratiques dans le cadre d'une formation réglementaire de la chirurgie pour l'enseignement de la gestion de l'anesthésie, de l'asepsie et de la douleur au cours d'un acte chirurgical réalisé chez la souris. Les étudiants auront préalablement reçu des informations théoriques en présentiel sur les bonnes pratiques en chirurgie. Ils auront également pu s'entraîner à la réalisation de sutures sur des supports inertes.
Bénéfices attendus
Les étudiants pourront mettre en pratique les cours théoriques qu'ils auront préalablement suivis et mettre en application les différents moyens mis à leur disposition pour évaluer la profondeur de l'anesthésie et l'entretien d’une anesthésie chirurgicale, pour la préparation d'un champ stérile, le travail de manière aseptique, la réalisation d'une procédure chirurgicale tout en contrôlant en permanence la qualité et la profondeur de l'anesthésie.
Procédures
Injection d'une puce d'identification et de mesure de température. Durée : quelques secondes. Une à 4 injections intrapéritonéales. Durée : quelques secondes. Une anesthésie (gazeuse ou chimique). Durée 30 minutes. Deux injections sous cutanée. Durée : quelques secondes. Une procédure chirurgicale, une incision au niveau de l'abdomen, réalisée sous anesthésie sans reveil. Durée 1h maximum. Sutures des plans musculaires et cutanés réalisées sous anesthésie: 15 minutes
Impact sur les animaux
Les animaux subiront un stress lié aux administrations en intraperitonéal (IP) et en sous-cutané (SC) et un inconfort lié au réveil à la suite de l'anesthésie.
Devenir
Les animaux issus de cette enseignement ne pourront pas être réutiliser dans d'autres expériences car ils auront subi une procédure chirurgicale. Tous les animaux sont donc mis à mort à la fin de la procédure chirugicale encore sous anesthésie pour éviter toute angoisse ou douleur liées au reveil.
Remplacement
Plutôt que d'étre réalisé directement sur des souris, l'enseignement des différents types de sutures sera réalisé sur des cuisses de poulet en amont des travaux pratiques réalisés sur la souris. La structure des cuisses de poulet permet de différentier les sutures musculaires et cutanées et une prise en main et la maitrise du geste sur un support inerte avant de le réaliser sur l'animal.
Réduction
Plutôt que l'utilisation d'une souris par étudiant, il sera utilisé une souris par binôme sans que cela ne nuise à la qualité de l'enseignement. A raison d'un maximum de 32 étudiants par session, et 2 sessions par an, cela permet la réduction de l'utilisation de 32 souris/an. Les souris seront des souris de réforme qui auraient dû être mises à mort car issues d'élevage et non utilisées ou arrivées en fin de projet (témoins ...). Des souris seront commandées chez l'éleveur que s'il n'y a pas du tout ou pas suffisamment de souris de réforme.
Raffinement
Une anesthésie chirurgicale sera réalisée pour les animaux devant subir une insition au niveau de l'abdomen avec administration conjointe d'un antalgique dès l'induction de l'anesthésie. La température au cours de l'anesthésie sera monitorée à l'aide d'une puce introduite en sous-cutané. Un gel ophtalmique de type Ocrygel sera appliqué sur les yeux des souris pendant les anesthésies pour éviter toute lésion liée à un potentiel dessèchement de la cornée.
Choix des espèces
Le modèle souris se justifie car c'est le modèle le plus utilisé en expérimentation animale et qu'il est possible, sur notre site, d'utiliser des souris normalement vouées à être mises à mort car issues d'élevage mais non incluses dans des procédures.
Evaluation préclinique du potentiel thérapeutique d’un mélange polymérique pulvérisable sur l’évolution d’une plaie.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Pour tester un spray polymérique censé accélérer la cicatrisation, 336 souris subissent une incision chirurgicale de la patte droite, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées ensuite pour des prélèvements de tissus. Le porteur écrit que la douleur associée à la plaie "ne peut être soulagée car c'est l'objet de l'étude". Chaque souris enchaîne jusqu'à vingt-trois tests comportementaux, dont le RNT ne précise pas la nature au-delà d'une évaluation de la douleur, des troubles moteurs et du bien-être, avec pour certains un isolement d'une nuit ou un jeûne de 24 heures. Le porteur indique qu'il lui est "malheureusement impossible" de remplacer le modèle in vivo, l'observation comportementale exigeant selon lui un animal vivant et vigile.
Objectifs
Une plaie chronique peut être définie comme une plaie qui n'a pas bien cicatrisé dans les 3 mois suivant la blessure. Les plaies chroniques sont souvent appelées ulcères et peuvent être définies comme des plaies de pleine épaisseur qui ont tendance à cicatriser lentement. Ces dernières, souvent masquées par des comorbidités, représentent une épidémie silencieuse qui touche une grande partie de la population mondiale. On estime que 1 à 2 % de la population des pays développés développera une plaie chronique au cours de sa vie. L'augmentation de la population vieillissante accroît ces chiffres, car la vitesse de fermeture des plaies est inversement corrélée à l'âge. Les plaies chroniques entraînent des incapacités qui aggravent les conséquences des blessures, ce qui crée un cercle vicieux. Les complications des plaies chroniques comprennent les infections telles que la phlébite infectieuse, la nécrose, les hémorragies voire les amputations des membres inférieurs. Pour les patients diabétiques atteints d’ulcères aux pieds, le taux d’infection avoisine les 40% et des améliorations dans l’offre de soin sont attendues par les professionnels de santé et les patients. Actuellement il n’existe pas de traitement péri ou post-opératoire satisfaisant permettant de diminuer la proportion de ces plaies. L'objectif de ce projet est d'évaluer l'impact de l'efficacité d’une pulvérisation d’un mélange polymérique composé de polyarginine (PAR) et d’acide hyaluronique (HA) sur une incision dans un modèle de souris. Le but de cette étude sera d'évaluer en termes de sensibilité, de comportement et de locomotion l'effet d'un traitement par spray PAR/HA sur l'incision pendant le processus de cicatrisation, en comparaison avec un spray de solution saline.
Bénéfices attendus
Notre hypothèse est que la pulvérisation de PAR/HA peut avoir un effet positif sur la cicatrisation des plaies, en réduisant le temps de fermeture des plaies, en normalisant les seuils nociceptifs et en diminuant les déficiences locomotrices. Nous avons également ajouté des tests comportementaux pour évaluer si le spray lui-même peut avoir un impact sur le bien-être des animaux.
Procédures
Les animaux subiront donc une chirurgie au niveau de la patte droite d’une durée de 5 min environ sous anesthésie générale. Un groupe d’animaux recevra 4 pulvérisations d'un mélange polymérique: 2 pulvérisations au niveau du site de lésion pendant la chirurgie puis 1 pulvérisation 2h après sur la plaie et une dernière pulvérisation 24h après la chirurgie. Ces animaux subiront également plusieurs tests comportementaux durant de 3 à 10 min (maximum 23 tests par animal avec un délai de 24h minimum entre chaque test) afin d’évaluer leur douleur, leurs troubles moteurs et leur bien-être.
Impact sur les animaux
Il y a présence d’une plaie et d’une douleur associée qui ne peut être soulagée car c'est l'objet de l'étude. Suite à la chirurgie d’incision de la patte, une difficulté dans les déplacements des animaux est attendue mais disparaît dans les 6 jours après la chirurgie. La chirurgie incisionnelle va induire une réponse inflammatoire classique et attendue qui permet la mise en place de ce modèle d’étude. Pour un test, les souris seront isolées une nuit. Pour un autre test, les animaux réaliseront un jeûne préalable de 24h. Pas de nuisance particulière attendue par rapport à la pulvérisation du spray en lui-même en raison de l’absence de toxicité bien documentée dans la littérature des deux molécules.
Devenir
A l’issu de chaque procédure les animaux seront mis à mort pour des prélèvements de tissus.
Remplacement
Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in sillico. En effet, l'analyse de l’effet thérapeutique d’un mélange polymérique pulvérisable sur l’évolution d’une plaie et les troubles sensitifs et moteurs associés nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vivant et vigile.
Réduction
Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que faire se peut le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique par test. Au regard de la littérature et de la variabilité phénotypique interindividuelle, les groupes expérimentaux seront constitués au maximum de 14 souris mâles et 14 souris femelles, le risque de variabilité lié à l’activité intrinsèque du mélange polymérique pulvérisable étant inconnu et non négligeable. Un calcul statistique a également été réalisé pour s’assurer que les résultats obtenus sont valides au plan statistique. Toujours dans l’idée de diminuer au maximum le nombre d’animaux utilisés les animaux subiront un enchaînement de tests comportementaux au sein d'une même procédure.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en cohorte de 4 ou 5 individus pour respecter leurs besoins sociaux. Des carrés de coton seront placés dans la cage pour favoriser la nidation, et des barreaux de bois à ronger pour limiter les comportements d’agressivité. Une acclimatation de 2 semaines aux locaux et des habituations à l’expérimentateur (handling) et aux tests comportementaux sont systématiquement réalisés. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Durant les chirurgies des méthodes d’anesthésie sont systématiquement utilisées. Un suivi post-chirurgical rapproché sera réalisé. Des points limites sont mis en place pour l’ensemble des procédures expérimentales.
Choix des espèces
Les similarités entre la neurobiologie humaine et celle de la souris, ainsi que l'expérience du laboratoire dans l'évaluation comportementale des rongeurs, font de la souris un modèle pertinent. Etant donné que l’étude de comportements nécessite des systèmes neurobiologiques matures, des animaux adultes seront utilisés (arrivée des animaux à 8 semaines lorsqu’ils sont jeunes adultes puis début des procédures à partir de 10 semaines).
Développement d’un traitement pour une maladie neurologique associée à une cardiomyopathie par thérapie génique chez les souris (1/3)
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
3 892 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un quart de chaque portée développe une cardiomyopathie fatale, avec perte de poids, difficultés de mouvement et posture anormale, et les souriceaux nouveau-nés sont anesthésiés par hypothermie sur de la glace humide avant injection. Chaque souris peut subir jusqu'à treize échocardiographies sous anesthésie, autant de tests d'open field et de grip test, et des transports vers un centre extérieur. Le porteur affirme que le recours à la souris est "nécessaire et indispensable" pour tester des vecteurs de thérapie génique contre une maladie rare qui tue la plupart des enfants atteints avant deux ans.
Objectifs
Les mutations du gène d’intérêt provoquent une maladie rare affectant le cerveau, le cœur et le foie. Ce type de maladie se manifeste dans les premiers mois de la vie et la majorité des enfants meurent vers l'âge de deux ans. À ce jour, il n'existe aucun traitement pour cette maladie. Le gène d’intérêt code pour une protéine essentielle pour la production d'énergie dans nos cellules. L’objectif général de ce projet est de développer un traitement pour la maladie causée par des mutations du gène d’intérêt par thérapie génique chez les souris. En particulier, nous allons développer des vecteurs thérapeutiques pour transporter la version normale du gène d'intérêt humain dans le corps des souris malades. L’expression de la version normale du gène d'intérêt peut réparer les dommages causés par la mutation du gène d'intérêt. En injectant ces vecteurs thérapeutiques dans les souris malades, nous espérons restaurer la fonction de la protéine défectueuse dans les organes touchés.
Bénéfices attendus
À ce jour, les maladies causées par des mutations du gènes d’intérêt ne disposent toujours pas de traitement curatif permettant de les guérir ou de contrôler leur évolution. Le projet permettra de développer et d'évaluer l'efficacité thérapeutique de notre approche chez la souris. Une fois que nous aurons prouvé que notre approche de thérapie génique fonctionne sur les souris malades, nous pourrons envisager de la tester sur des êtres humains dans le cadre d'essais cliniques.
Procédures
-Injection par voie intraveineuse dans la veine caudale (30-60 secondes par souris; 1 fois maximum par souris ) -échocardiographie (20 min par souris; 13 fois maximum par souris) -anesthésie gazeuse (20 min par souris; 13 fois maximum par souris) -open field test (10 min par souris ; 13 fois maximum par souris) -grip test (5 min par souris ; 13 fois maximum par souris) -Injection par voie intraveineuse dans la veine temporale (30 secondes par souris; 1 fois maximum par souris) - anesthésie par hypothermie (en contact avec de la glace humide) (30-60 secondes par souris; 1 fois maximum par souris)
Impact sur les animaux
Les souris où l’expression du gène d’intérêt est abolie (seuls 25% des souris de chaque portée) développeront une cardiomyopathie fatale. En plus de la maladie cardiaque, ces souris peuvent présenter une perte de poids, des difficultés de mouvement et adopter une posture anormale. Les autres nuisances que les souris subiront sont le stress pendant la contention dans un tube en plastique spécial et l’injection, le stress pendant les tests comportementaux, l’échocardiographie et le stress pendant le transport vers le centre expert de l’échocardiographie.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort pour l'analyse des tissus.
Remplacement
L’utilisation d’un modèle animal est nécessaire et indispensable dans notre étude car nous devons tester l'efficacité des vecteurs thérapeutiques dans la prévention de la maladie. De plus, en testant l'efficacité thérapeutique chez les souris, qui développent normalement la maladie, nous avons la possibilité de voir si la maladie est prévenue ou si elle est retardée. En outre, l'utilisation de modèles de souris est nécessaire parce que les vecteurs thérapeutiques peuvent exprimer la version normale du gène d’intérêt de différentes manières dans les tissus et les cellules en culture..
Réduction
Afin de réduire le nombre de souris utilisées pour les expériences, nous nous sommes basés sur nos précédents travaux sur l’étude d’autres modèles murins de maladies neurologique et sur des méthodes et analyses statistiques. Pour réduire le nombre total de souris, nous testerons d'abord l'efficacité de 4 vecteurs thérapeutiques sur une partie des souris. Seul le meilleur vecteur sera utilisé après dans les études suivantes. De plus, lorsque cela est possible, les prélèvements d’une même souris seront utilisés pour plusieurs analyses. L’échocardiographie est elle-même une méthode de réduction car elle permet un suivi longitudinal des souris, par opposition à une mise à mort séquentielle.
Raffinement
Dans un contexte de raffinement adapté, les animaux seront surveillés quotidiennement par les techniciens de l'animalerie (dans les weekends par les personnes d’astreinte), et une fois par semaine par les chercheurs travaillant sur ce projet, pour détecter un éventuel état de souffrance et/ou d’angoisse. Pour minimiser la détresse causée par les symptômes de la maladie et lors de l'injection du vecteur thérapeutique, nous avons établi des critères de décision pour la mise à mort des souris lorsque cela est nécessaire. Concernant les injections le volume injecté sera réduit au minimum possible et la solution sera chauffée à la température ambiante et l'aiguille pour l'injection sera la plus fine possible. Concernant l'injection chez les souriceaux nouveau-nés, nous prendrons des mesures pour minimiser leur stress : l'éloignement temporaire de la mère et la préservation de la litière de la cage maternelle. En outre les injections des nouveau-nés seront effectuées sous anesthésie par hypothermie induite par la stimulation du petit sur de la glace humide pendant 30-60 secondes. Concernant l'échocardiographie, les souris seront anesthésiées, pour être capable de mesurer correctement les différents paramètres du système cardiaque et éviter le stress. Pour assurer le bien-être des souris, elles seront placées en cage groupée dans un milieu enrichi avec des carrés de coton, des maisonnettes et des bâtonnets à ronger. L’enrichissement social des souris sera garanti. Le transfert des souris vers le centre expert de l’échocardiographie se fera dans des cages de transport sécurisées dans des véhicules dédiés tout en réduisant les vibrations et le bruit. En plus l'échographie et les tests comportementaux ne sont effectués que 7 jours après l'arrivée des souris pour permettre leur acclimatation.
Choix des espèces
Les souris sont génétiquement, physiologiquement et anatomiquement plus proches des humains. De plus, afin de tester l'efficacité du traitement pour le développement de la thérapie génique, l'utilisation de mammifères est indispensable et les souris représentent un bon modèle. Pour nos études, nous utiliserons des souris de différentes tranches d'âge. Pour l'injection, nous utiliserons des nouveau-nés et souris juvéniles. Les tests comportementaux et les échocardiographies seront réalisés sur des souris juvéniles et adultes
Formation à la chirurgie cardiaque pour induire une insuffisance cardiaque chez le rongeur.
- Formation professionnelle
Rats : 105
Toutes tuées par dislocation cervicale à l'issue, 315 souris et rats subissent une ligature coronaire ou une constriction de l'aorte de vingt minutes sous anesthésie, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, 135 d'entre eux ne se réveillant jamais. Le projet ne vise aucune connaissance nouvelle, seulement l'entraînement de personnels aux gestes chirurgicaux avant les projets scientifiques. Le porteur indique que la douleur de l'infarctus est maximale pendant 24 heures et que l'insuffisance cardiaque qui s'installe s'accompagne d'ascite et d'œdème pulmonaire, provoquant fatigue, essoufflement, perte de poids et prostration. Il justifie ce recours par le risque d'avoir "trop de mortalité inutile" pendant les projets scientifiques ensuite, et affirme que l'usage de modèles animaux est "indispensable".
Objectifs
Ce projet vise à former des personnels à la réalisation de modèles animaux pour l’étude de l’insuffisance cardiaque. L’insuffisance cardiaque est une maladie fréquente, touchant un million de personnes en France et dont la fréquence d’apparition a doublé en 10 ans. Elle correspond à l’incapacité du cœur à pomper suffisamment de sang pour répondre aux besoins de l’organisme. Afin de respecter le principe des 3R (Réduction, Raffinement, Remplacement), le laboratoire développe au maximum des méthodes d’analyses in vitro. Cependant pour étudier la pathologie de l’insuffisance cardiaque, l’utilisation de modèles animaux est indispensable pour l’évaluation de la fonction cardiovasculaire. En effet le système cardiovasculaire est régulé par des mécanismes physiologiques qui ne sont pas simulables dans toute leur complexité in vitro. Pour cela nous utilisons des modèles d’insuffisance cardiaque chez la souris ou le rat générés par des procédures chirurgicales. L’évolution de la pathologie peut être suivie par échocardiographie et permet ainsi de tester les hypothèses mécanistiques et thérapeutiques. Ces procédures sont complexes et nécessitent un apprentissage approfondi par l’expérimentateur sur des animaux contrôles avant de réaliser les expériences liées aux projets scientifiques dans les meilleures conditions et de respecter ainsi pour tous les projets scientifiques le principe des 3R. En l’absence de formation préalable, le risque est d’avoir trop de mortalité inutile pendant les projets scientifiques.
Bénéfices attendus
L'objectif principal de ce projet est de former le personnel afin d'avoir des modèles reproductibles et standardisés afin de mettre en oeuvre nos projets scientifiques de manière plus efficace.
Procédures
135 animaux seront intégrés dans des procédures sans réveil. Ils seront soumis à une procédure chirurgicale (induisant l'insuffisance cardiaque) de 20 minutes sous anesthésie générale. 180 animaux seront intégrés dans des procédures avec réveil. Ils seront soumis à une procédure chirurgicale (induisant l'insuffisance cardiaque) de 20 minutes sous anesthésie générale. Ils seront ensuite soumis à 3 échographies cardiaque sous anesthésie générale durant 5 minutes.
Impact sur les animaux
L’infarctus du myocarde et la constriction de l'aorte peuvent entrainer plusieurs effets indésirables chez la souris et le rat. La douleur attribuable à l'infarctus du myocarde est maximale jusqu'à 24 h chez la souris et le rat . Les chirurgies réalisées entraineront des douleurs plus ou moins importantes selon que les animaux subiront ou non la ligature coronaire ou la constriction de l'aorte. L’insuffisance cardiaque qui va ensuite s’installer dans les groupes ayant subi la ligature de la coronaire ou la constriction de l'aorte va s’accompagner des signes cliniques de cette pathologie. Apparition d’une ascite et un œdème pulmonaire, qui provoquent fatigue, essoufflement, perte de poids et prostration. Au moment des chirurgies et de l’échographie les yeux des animaux peuvent subir un léger dessèchement.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure par disclocation cervicale afin de récupérer les différents tissus en vue d'expériences scientifiques ultérieures.
Remplacement
Le recours à des animaux se justifie par la nécessité d'étudier la fonction cardiaque dans un contexte physiopathologique complexe et multifactoriel impliquant une circulation sanguine. De plus, lors d’un infarctus, le corps met en place des régulations physiologiques impliquant le système neuro-hormonal. Ces régulations neuro-hormonales ne peuvent pas être reproduites in vitro ce qui rend indispensable l’expérimentation dans un modèle préclinique intégré. L'utilisation d'animaux se justifie également par l'incapacité d'obtenir une lignée cellulaire stable de cellules cardiaques.
Réduction
Les manipulateurs réaliseront une échocardiographie après chaque opération. Dès qu’une certaine homogénéité dans les opérations sera atteinte, celle-ci étant observée grâce à la mesure de fraction d’éjection, l’expérimentateur arrêtera son entrainement et pourra passer à un projet autorisé plus ciblé. Le critère de jugement principal sera la baisse de la fraction d’éjection cardiaque. Afin de minimiser le nombre d’animaux, cette formation utilisera des animaux issus de colonies transgéniques déjà présentes à l’animalerie et qui ne seront pas utilisés. A la fin des expérimentations les animaux sont euthanasiés et les organes pourront être prélevés afin de collecter le tissu pour des expérimentations de mise au point.
Raffinement
Les animaux seront surveillés quotidiennement et leur entretien sera effectué dans des conditions soigneusement contrôlées pour s’assurer qu’ils ne subissent aucun stress. Afin d’améliorer leurs conditions d’hébergement de l’enrichissement sera ajouté dans leurs cages. Les animaux seront mis en cage et observés tous les jours. Les cages seront changées 1 fois par semaine afin de minimiser une éventuelle infection. Les procédures seront réalisées en respectant au maximum le bien-être animal et en limitant la souffrance par le respect des méthodes anesthésiques et analgésiques. Les animaux seront placées sur une table chauffante thermorégulée à 37 °C durant tout le temps de l’intervention chirurgicale et des échographies. Pour chaque injection, une anesthésie locale par application d’un gel de lidocaïne au point d’injection sera réalisée. Les yeux seront protégés du dessèchement par un onguent ophtalmique et de la lumière par une compresse humidifiée. Des critères bien spécifiques ont été determinés afin de mettre en place les points limites de cette étude.
Choix des espèces
Le rat et la souris sont choisis car ce sont des mammifères qui constituent des modèles courants et classiques pour l'étude de la fonction cardiovasculaire y compris dans un contexte pathologique. Ce sont des modèles de choix car ils offrent la possibilité d’induire l’insuffisance cardiaque par des procédures chirurgicales. Des animaux adultes âgés de 7 à 10 semaines sont utilisés car les maladies cardiovasculaires se déclarent essentiellement à l’âge adulte.
Etude chez la souris du rôle joué par la neuroinflammation périnatale dans la progression de la tauopathie à l’âge adulte, une composante majeure de la maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Injectées dix fois en cinq jours peu après leur naissance, avec une substance inflammatoire ou une solution saline, puis opérées du cerveau à l'âge adulte pour une partie d'entre elles, 1 869 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Toutes sont tuées à l'issue pour l'analyse de leur cerveau, de même que les reproducteurs en fin de fertilité et les descendants au génotype non retenu. L'équipe veut savoir si cette inflammation précoce accélère ou freine l'accumulation de la protéine Tau chez des souris transgéniques ou injectées d'un vecteur viral, et une partie des souris passe quatre à cinq tests comportementaux de mémoire que le résumé ne nomme pas. Le porteur qualifie l'injection dans le cerveau d'acte "peu invasif" dont les souris récupèrent "très rapidement". Il indique aussi que, dans sa colonie, les souris porteuses de plaques amyloïdes connaissent une mortalité précoce liée à des crises d'épilepsie spontanées, de 6 % chez les mâles et 13 % chez les femelles, qui peut atteindre 30 % après une injection intracérébrale.
Objectifs
Il n'existe pas actuellement de traitement curatif de la maladie d’Alzheimer (MA) dont le nombre de cas est amené à augmenter régulièrement au cours des prochaines décennies du fait du vieillissement de la population. L'amélioration de la connaissance de la MA permettra d'identifier de nouvelles possibilités de traitements et de nouveaux marqueurs diagnostiques afin d'améliorer la prise en charge des patients, ce qui est un enjeu crucial de santé publique. Cette maladie, causée par une lente dégénérescence des neurones, se caractérise par la présence dans le cerveau de plaques amyloïdes, et de dégénérescences neurofibrillaires, résultant de l’accumulation de la protéine Tau. La protéine Tau est exprimée dans les axones des neurones, où elle régule la dynamique du réseau de microtubules (sortes d’armatures de soutien des cellules). Dans la MA, on assiste à une modification de la protéine Tau qui se traduit par une formation d'agrégats toxiques s’accumulant dans les neurones entrainant leur mort. Ce phénomène, appelé tauopathie, joue un rôle majeur dans la maladie d'Alzheimer, car il existe une très bonne corrélation entre la progression de la tauopathie et celle des symptômes de la maladie. Les recherches récentes désignent la neuroinflammation (mécanisme de l'immunité cérébrale pour protéger le cerveau des agressions) comme acteur majeur parmi l’ensemble des causes de la MA. Il est bien établi que la microglie, cellule immunitaire cérébrale, joue un rôle dans l’élimination des plaques amyloïdes. Le rôle de la microglie dans la tauopathie est cependant moins étudié. Pourtant, des études récentes suggèrent que la microglie joue un rôle dans la propagation de la tauopathie entre neurones connectés. Il est donc crucial de déterminer quel état microglial favorise ou au contraire ralentit la progression de la tauopathie. Pour répondre à cette question nous utiliserons deux modèles murins de la maladie d’Alzheimer dans lequel un syndrome inflammatoire sera induit par des injections de protéines stimulant la réaction immunitaire. Ce protocole sera appliqué sur différents animaux modèles de la MA soit transgéniques, soit par transfert de gène à l'aide de vecteurs AAV. Cela permettra d'analyser l'effet de la modification à long terme de la microglie sur l'évolution de la tauopathie, et de déterminer quel état d'activation microgliale il faut favoriser pour lutter contre la progression de la tauopathie.
Bénéfices attendus
La maladie d’Alzheimer est une maladie incurable et mortelle causée par la dégénérescence progressive des neurones,ayant pour conséquence des déficits cognitifs importants évoluant invariablement jusqu’à la démence et la perte d’autonomie complète. Elle touche près d’une personne sur 5 au-delà de 75 ans. Les traitements disponibles actuellement ne font que ralentir très modérément la progression de la maladie. Il est donc nécessaire de mettre au point des nouveaux traitements qui représenteront de réelles avancées thérapeutiques pour les patients et leurs proches. Pour mettre au point ces nouveaux traitements, il est nécessaire de mieux comprendre quelles sont les causes de la maladie, ce qui permettra d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. C’est l’objectif principal de ce projet qui vise à mieux comprendre l’implication d’un type de cellules cérébrales impliquées dans la réaction immunitaire, les cellules microgliales, dans la progression de la maladie d’Alzheimer. Ces cellules sont les macrophages résidents du cerveau et sont activées concomitamment à la neurodégénérescence. Nous utiliserons un modèle d’activation à long terme de la microglie obtenu par administration d’une cytokine pro-inflammatoire dans les jours qui suivent la naissance. Ce protocole sera combiné à des modèles murins de maladie d’Alzheimer. Afin de mieux cerner le rôle de la microglie dans le développement de la pathologie, les effets de l’injection de la substance activant la réaction inflammatoire sur l’évolution des symptômes cognitifs et des lésions tissulaires seront étudiés. Nous réaliserons également une étude des gènes exprimés par la microglie afin de caractériser les voies de signalisation et les processus métaboliques dérégulés. En plus de l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques, ce projet permettra de mieux comprendre le rôle de l’activation microgliale en fonction des phases de la maladie d’Alzheimer, et quelle(s) stratégie(s) thérapeutique(s) adoptée(s) aux différents stades de la pathologie.
Procédures
Les animaux seront soumis à différentes interventions : - L’ensemble des animaux inclus dans les cohortes expérimentales recevront une injection d’une substance inflammatoire) ou de solution saline (10 injections sur 5 jours sur souriceaux vigiles [30 secondes par injection]). - Une partie des animaux recevra une injection intracérébrale à l’âge adulte (entre 3 et 9 mois en fonction des groupes) par une technique de chirurgie spécifique au cerveau (durée de la chirurgie : 20 à 30 minutes. Cet acte est peu invasif et les animaux récupèrent généralement très rapidement dans un délai de l’ordre de quelques heures. - Une partie des animaux recevra une injection unique de vecteur utilisé pour apporter le gène d’intérêt aux cellules cibles à l’âge adulte (2-3 mois). Cet acte dure moins d’une minute et se pratique sous anesthésie légère. Une partie des animaux sera soumise à 5 tests comportementaux peu stressants et destinés à évaluer leur capacités cognitives et mnésiques. Chacun de ces tests durent entre 30 sec et 6 min par souris et par jour. L’ensemble des tests est effectué sur une période de 4 à 6 semaines en fonction du nombre de tests prévus (4 à 5).
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à différents types de manipulations qui entraineront des effets indésirables différents : - L’injection de la substance inflammatoire aux souriceaux entraîne des effets secondaires minimes, principalement une inflammation périphérique et centrale, ainsi qu’une hypothermie transitoire. Tous ces effets cessent après l’administration. - Les effets secondaires liés à l’injection intracérébrale se limitent à une douleur transitoire au niveau de l’abord chirurgical (incision du scalp et pose d’agrafes). - Deux des trois modèles de souris utilisés ne présentent pas de symptômes plus invalidants que les déficits cognitifs décrits dans la littérature. - Les souris présentant des plaques amyloïdes ont un phénotype dommageable (présence d’un caractère qui altère gravement l’état général de l’animal) car elles présentent des crises d’épilepsie spontanées conduisant à une mortalité précoce avec un pic entre 1 et 3 mois d’âge. Dans notre colonie, la mortalité est de 6% chez les mâles et 13% chez les femelles, mais elle peut atteindre 30% suite à une injection intracérébrale. - L’injection intraveineuse peut entraîner une hémorragie légère qui se résorbe spontanément en quelques minutes. - Les tests comportementaux sont réalisés sur animaux vigiles et peuvent entraîner un stress léger. Ce stress sera réduit au minimum par l’habituation à l’expérimentateur avant chaque session de comportement.
Devenir
Tous les animaux qui seront inclus dans des cohortes expérimentales sont in fine destinés à une étude histologique (analyse des tissus) et/ou transcriptomique (analyse de l’expression des gènes) des régions atteintes du cerveau, ce qui nécessite leur euthanasie pour prélever cet organe. L’euthanasie interviendra par des méthodes adaptées et validées. Les animaux reproducteurs des différentes lignées transgéniques utilisés pour générer les souris incluses dans les cohortes expérimentales seront euthanasiées en fin de période de fertilité. Ces animaux ne seront en effet plus utilisables dans le cadre du projet, et ne pourront pas non plus être recyclés dans d’autres projets du fait des potentiels biais expérimentaux induits par la période de reproduction active (effets des changements hormonaux chez les femelles et développement de l’agressivité envers les congénères chez les mâles). L’euthanasie interviendra par des méthodes adaptées et validées. Afin de minimiser le temps d’élevage en captivité, les animaux issus de ces accouplements dont le génotype n’est pas souhaité pour le projet seront euthanasiés immédiatement à l’issue de la procédure de génotypage par les mêmes méthodes. Le fond génétique de ces différentes lignées, qui peut diverger de celui des souches de souris initiales, ne permet pas la reutilisation des animaux pour d’autres projets afin d’éviter tout risque de biais expérimental dû au fond génétique.
Remplacement
Ce projet fait appel à des modèles de souris déjà caractérisés de la maladie d’Alzheimer. A l’heure actuelle, ce projet ne peut ni être réalisé à l’aide de modèles cellulaires, ni être simulé par des techniques informatiques. En effet les symptômes neurologiques cognitifs de la maladie ne peuvent être répliqués que chez l’animal, notamment dans les modèles génétiques murins. Par ailleurs, les modifications de l’activation microgliale qui surviennent au cours du vieillissement normal et pathologique ne peuvent pas être reproduit dans des modèles cellulaires 2D ou organoïdes. Enfin, l’étude des relations entre cellules gliales et neurodégénérescence requiert toute la complexité des réseaux neuronaux qui se mettent en place au cours de la maturation et du vieillissement du cerveau. Il est donc nécessaire de réaliser ce projet sur une espèce modèle mammifère comme la souris, présentant le plus possible de similitudes avec la physiologie humaine, c’est à dire possédant un cerveau complexe doté d’un système limbique permettant d’exprimer des comportements sophistiqués. De plus la proximité entre l’espèce humaine et la souris maximisera la pertinence des cibles thérapeutiques identifiées au cours de ce projet.
Réduction
Une simulation statistique a été réalisée pour déterminer le nombre minimum d’animaux par groupe, nécessaire pour observer des effets significatifs compte tenu des valeurs attendues en fonction des analyses pratiquées pour chaque procédure. Cette simulation est fondée, d’une part, sur des données obtenues dans la littérature scientifique et, d’autre part, sur les valeurs que nous avons observées dans le passé lors d’expériences utilisant des analyses similaires. Ainsi, nous prévoyons d’utiliser 1869 animaux lors des expériences qui seront menées pendant les 5 années de l’étude. Ce nombre maximum, qui comprend 66 groupes expérimentaux et 52 groupes témoins de référence qui seront étudiés tout au long des 5 années du projet, a été déterminé en fonction des expériences à réaliser pour pouvoir répondre à la question scientifique. Pour minimiser le nombre d’animaux utilisés dans le projet nous prévoyons que les cohortes incluses dans les différentes procédures puissent être étudiées sur différents paramètres. Par exemple certains animaux seront utilisés à la fois pour des études transcriptomiques et histologiques.
Raffinement
Le suivi quotidien des souris hébergées en groupe dans un milieu enrichi et l’application de critères d’arrêt en élevage et en expérimentation permettra de garantir leur bien-être. En cas d’apparition d’effets inattendus, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin de mettre en œuvre des traitements appropriés. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience. Les protocoles d’anesthésie et d’analgésie des procédures chirurgicales ont été définis et validés par une équipe vétérinaire. Des échelles cliniques journalières, un soutien nutritionnel adapté et l’application de critères d’arrêts permettent de veiller au bien-être des rongeurs. Les animaux bénéficieront de périodes de récupération suffisantes après les anesthésies générales et les gestes chirurgicaux. L’état de santé des souriceaux sera surveillé de manière biquotidienne tout au long de la période de traitement périnatal. Leur état de forme sera évalué grâce à une grille de score permettant de définir le point limite au-delà duquel le traitement ne pourra être poursuivi pour l’animal en question. Les tests comportementaux seront précédés par une phase d’habituation à l’expérimentateur afin de minimiser le stress et d’assurer une reproductibilité optimale de ces expériences.
Choix des espèces
Choix de l’espèce modèle : L’objectif de ce projet est d’améliorer les connaissances sur la maladie d’Alzheimer afin d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques. La région initialement et la plus gravement atteinte dans la MA est le système limbique (connu sous le nom de cerveau émotionnel) qui gère la mémoire et les émotions. Les modèles animaux invertébrés ne possèdent pas de système limbique. Il est donc nécessaire de mener ce projet sur une espèce dotée d’un tel système, similaire à celui retrouvé dans l’espèce humaine. Les rongeurs, et la souris en particulier, possèdent un système limbique très proche de celui de l’espèce humaine. De plus, la grande proximité entre le génome de la souris et le génome humain assure une pertinence maximale des cibles thérapeutiques qui seront identifiées au cours de ce projet. Les souris qui seront utilisées reproduisent les différentes lésions anatomiques retrouvées dans le cerveau des patients atteints de MA. Elles présentent également des altérations cognitives (défauts de mémoire spatiale et de mémoire de travail) qui sont caractéristiques de la MA. Ces déficits peuvent être quantifiées par des tests comportementaux qui sont réalisés en routine au laboratoire. Choix du stade de développement étudié : Les administrations de cytokines seront réalisées à la période périnatale pour respecter le protocole d’activation microgliale à long terme largement validé et publié par nos collaborateurs. La MA se déclare la plupart du temps chez le sujet âgé, mais des déficits subtils apparaissent longtemps en amont du diagnostic. Nous étudierons donc les modèles animaux à un temps précoce et a un temps tardif pour refléter les effets observés en début et en fin du processus pathologique, soit entre 5 et 14 mois selon les différents modèles de MA qui seront étudiés au cours du projet.
ONCO-SC Evaluation de thérapies cancéreuses sur des modèles de tumeurs greffées en sous cutané
- Recherche appliquée
- Cancers
Rats : 5000
Pour évaluer des candidats-médicaments anticancéreux pour le compte de clients, 62 500 rongeurs, 57 500 souris et 5 000 rats, sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère, tous tués à l'issue parce qu'ils portent des tumeurs. Ils reçoivent une greffe tumorale, des castrations, ovariectomies et surrénalectomies, des implantations de minipompe ou de cathéter, des séances d'imagerie sous anesthésie, des biopsies ou résections de tumeur et des irradiations. Le porteur, prestataire de services en recherche préclinique, décrit près de 250 études par an et un volume ajusté "en fonction des demandes". Il indique que les méthodes de reconstruction de tumeurs en 3D restent "marginales" et affirme que les rongeurs immunodéprimés sont "indispensables" à l'implantation de cellules tumorales humaines.
Objectifs
Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. En 2020, quelque 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer (CIRC). Selon l’OMS, une personne sur cinq souffrira d’un cancer dans sa vie. Un homme sur huit et une femme sur onze en décèderont. Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, différents types de cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente à un traitement. L’objectif de ce projet est d’utiliser des modèles déjà mis en place ou bien d’en développer de nouveaux chez les rongeurs (rats ou souris), les plus prédictifs possible afin de refléter la pathologie cancéreuse et de pouvoir évaluer des nouveaux médicaments pour traiter le cancer. Cette évaluation chez l’animal permettra d’étudier ces nouveaux médicaments, seuls ou en combinaison, dans un contexte physiologique le plus proche possible de l’homme et d’arriver, avant les essais cliniques chez l’homme, à établir une réelle évaluation de l’efficacité des molécules destinées à traiter les cancers chez l’homme. Grace à ces modèles de cancer, une évaluation de la toxicité, de la pharmacocinétique et de la biodistribution des traitements pourra aussi être réalisée en plus de l’évaluation de l’efficacité antitumorale.
Bénéfices attendus
Notre société, prestataire de services en recherche préclinique propose un large panel de modèles in vivo nécessaires à l’évaluation de nouveau composés thérapeutiques pour la recherche contre le cancer. Ce projet a pour finalité de sélectionner des molécules thérapeutiques grâce à des modèles précliniques les plus prédictifs possibles afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Au cours des expériences réalisées, il sera possible d’étudier les mécanismes de croissance d’une tumeur dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme, d’étudier les mécanismes de résistance après des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique, et les mécanismes de progression tels que la formation de métastases. Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi par exemple possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre le cancer.
Procédures
Mise en place d’un système d’identification de l’animal, sous anesthésie générale (en conditions d’asepsie, réalisée entre 0 et 3 jours avant la greffe (
Impact sur les animaux
La greffe tumorale pourra engendrer une douleur et un stress léger. L’évolution du volume tumoral entrainera une distension de la peau. Il est aussi possible, que la progression tumorale entraîne une cachexie constatée par une perte de poids. Pour les études sur modèles hormonodépendants (modèles prostatiques/ovariens), les animaux pourront être castrés/ovariectomisés avec ou sans surrénalectomie entrainant une douleur modérée sur 1 ou 2 jours et un stress modéré. Les autres chirurgie (biopsie et, resection de tumeurs) entraineront une douleur modérée sur 1 ou 2 jours et un stress modéré Les traitements pourront induire un stress léger. Une chirurgie comme la résection de la tumeur pourra engendrer une douleur modéré sur 1 à 2 jours Au cours d’une étude, les animaux seront manipulés. Les mesures de poids et de volume tumoral entraînent un stress que l’on peut considérer comme faible, et qui diminue avec l’habituation. Le jour de la randomisation, les animaux seront potentiellement mis avec de nouveaux congénères. Cela pourra engendrer un stress de 1-2j.
Devenir
Du fait que les animaux sont porteurs de tumeurs, ils seront tous mis à mort en fin de procédure.
Remplacement
Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte globale ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais reste toutefois marginales et les résultats obtenus restent à ce jour difficilement transposable à l’homme.
Réduction
Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s). Le nombre de groupes contrôles sera ajusté à la question scientifique posée et des paramètres étudiés. Les variations de ces paramètres entre les groupes contrôles et traités seront comparées pour évaluer les composés testés. La validité scientifique nécessite d’utiliser un nombre minimum d’animaux par groupe pour que les tests statistiques soient valides et représentatifs d’éventuelles variations inter-individu. Près de 250 études sont réalisées chaque année, mais le nombre peut varier en fonction des demandes. Une étude peut être composée de 2 à 20 groupes. Le nombre d’animaux par groupe varie généralement entre 6 et 15 par dose de produit. Pour des études permettant de sélectionner des composés, il sera proposé d’utiliser 1 à 3 animaux par groupe. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal.
Raffinement
Toutes les procédures sur les animaux seront réalisées selon les standards validés par le vétérinaire. L’impact de ces procédures sera toujours analysé par la structure chargée du bien-être des animaux. Toutes les procédures invasives et faiblement invasives, sont réalisées sous anesthésie générale par des techniciens formés et dont les compétences ont été validées. La fréquence de mesure des volumes tumoraux seront adaptée à la vitesse de croissance du modèle. La fréquence de pesée des animaux sera adaptée à leur état général. Les animaux sont observés quotidiennement. Dès l’apparition des premiers signes cliniques qui pourront amener aux points limites des antalgiques pourront être prescrits sous l’autorité du vétérinaire. Les chirurgies pratiquées dans ce projet sont des procédures de gravité modérée, réalisée sous anesthésie. Les chirurgies sont réalisées de façon aseptique et les animaux reçoivent des l’antalgiques, avec surveillance post opératoire et soins post opératoires adaptés si nécessaires. Les injections/prélèvements seront effectués en suivant les recommandations vétérinaires. Un document de référence est à disposition des concepteurs et des techniciens. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître les signes de mal être des animaux. Les expérimentateurs et les personnes en charge du bien-être et du soin des animaux veillent au respect des points limites. En cas de suspicion de toxicité, un système d’alerte est mis en place pour statuer sur la mise à mort de l’animal ou sur l’arrêt des traitements. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal et sont listés en détail dans les procédures. Si l’un des signes cliniques liés aux points limites (mais sans dépassement du point limite) est observé, l’animal est mis en observation et un traitement de soins est mis en place. Par exemple, en cas de douleur constatée, le vétérinaire prescrira un traitement antalgique.
Choix des espèces
LLes petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines dans le cadre de la recherche en oncologie. De plus, diverses souches de souris et rats immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. De plus, les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7-8 semaines lors de leur première manipulation). Toutefois, ils pourraient être reçus à partir de 5 semaines mais ne seront pas manipulés avant 7 semaines minimum. Des animaux adultes sont utilisés afin qu’ils aient leur poids et leur morphologie adulte pour faciliter l’injection des cellules tumorales.
Evaluation de stratégies de prévention et de traitement de l’infection par SARS-CoV-2 chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Pour tester vaccins, anticorps et antiviraux contre le SARS-CoV-2, 5 660 souris porteuses du récepteur ACE2 humain sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées à l'issue. La majorité des études recourt au modèle dit sévère, dans lequel l'infection provoque une maladie mortelle, une perte de poids allant jusqu'à 30 % et une survie moyenne de cinq jours. Les souris reçoivent jusqu'à cinq inoculations et trois prélèvements sanguins, certaines subissant une chirurgie ou une mesure de fonction pulmonaire sans réveil. Le porteur présente ce modèle létal comme une "opportunité unique", faute d'équivalent chez d'autres espèces.
Objectifs
Depuis la fin de l'année 2019, la pandémie de COVID-19 s'est propagée dans le monde entier, causant plus de six millions de décès et affectant plusieurs centaines de millions de personnes. Cette maladie, causée par la transmission du virus SARS-CoV-2, se manifeste par différents symptômes. Les formes légères se caractérisent principalement par de la fièvre, de la toux, de la fatigue, des pertes de goût et d'odorat. Les formes les plus graves sont associées à un syndrome de détresse respiratoire aiguë, et une défaillance de plusieurs organes de très mauvais pronostic. Des recherches intensives ont permis des progrès importants dans la compréhension des mécanismes sous-tendant les manifestations cliniques. Cependant, il n’existe toujours pas de traitement totalement efficace contre la COVID-19. Le récepteur ACE2, nécessaire à l’entrée du virus SARS-CoV‑2 dans les cellules de l’hôte, est une protéine clé dans les mécanismes à l’origine de la maladie. Il est. Parmi les différents modèles d’étude précliniques utilisés dans la recherche de vaccins et molécules thérapeutiques, les modèles de souris génétiquement modifiées pour l’expression du récepteur ACE2 humain sont sensibles à l’infection par le virus SARS-CoV-2, et permettent une analyse expérimentale de la COVID-19. Certains de ces modèles dits ‘sévères’ développent après infection une forme létale de la maladie causée notamment par une réponse hyper-inflammatoire hors de contrôle. D’autres, dits ‘modérés’, développent une forme légère de la maladie. L’objectif de ce projet vise à la mise en place de modèles souris d’infection (sévère et modérée) au SARS-Cov-2 pour permettre d’étudier l’infection d’une part, et d’évaluer d’autre part une large gamme de stratégies de prévention et de traitements potentiels (vaccins, anticorps, anti-viraux, anti-inflammatoires) avant passage en phase clinique chez l’humain. Ce modèle, génétiquement modifié pour exprimer le récepteur ACE2 humain, permettra le suivi des paramètres immunologiques de l’infection, y compris avec des variants d’intérêt récents du virus. Du fait de sa petite taille de l’accessibilité facilitée à des modèles génétiquement modifiés, le modèle murin permet d’évaluer une large gamme de candidats médicaments pour traiter la cause (l’infection par le virus SARS-CoV-2) et les symptômes de la maladie induite après infection. Il permet donc en première intention, d’éviter le recours à des modèles plus complexes à mettre en œuvre.
Bénéfices attendus
Dans le contexte actuel de la pandémie COVID-19, il est urgent de pouvoir procéder à l’évaluation de traitements contre le virus lui-même ou contre les atteintes conséquentes à l’infection (respiratoires, vasculaires, neurologiques, cardiaques, inflammatoires). En permettant d’accroitre la capacité d’accès à plusieurs modèles pertinents de la maladie induite par l’infection au SARS-CoV-2, ce projet permettra d’augmenter significativement les options d’évaluation de nouvelles stratégies de traitement variées et adaptées à des situations cliniques (modérées et sévères) diverses. Dans le cadre de ce projet, nous mèneront à bien les campagne d’évaluation de composés candidats, avec l’objectif de permettre l’identification rapide de nouveaux produits efficaces contre SARS-CoV-2. A plus long terme, et ce, dans le cadre du projet collaboratif entre les différents partenaires du projet, de nouvelles approches technologiques en imagerie seront établies, permettant d’accroitre nos connaissances sur la réponse immunitaire mise en œuvre chez la souris dans le cadre d’infections causées par des pathogènes aéroportés.
Procédures
Les animaux de chaque étude seront soumis à plusieurs inoculations de composés tests, d’inoculation (au maximum 5 injections durée des interventions inférieur à 2min par animal). De plus, des prélèvements sanguins pourront être effectués sur les animaux (au maximum 3 prélèvements; durée des interventions inférieur à 2min par animal). Des procédures chirurgicales pourront être effectuées sous anesthésie, d’une durée de 15 minutes maximum par animal avant euthanasie terminale. Des expériences permettant de mesurer la fonction pulmonaire seront également effectuées sous anesthésie (environ 10 minutes par animal, c'est une procédure sans réveil, effectuée sur une fraction minime des animaux).
Impact sur les animaux
Deux types de modèles murins de l’infection au SARS-CoV-2 (sévère et modéré) seront établis. La grande majorité des études fera appel à un modèle d’infection sévère. Dans les modèles sévères, l’infection au SARS-CoV-2 induit une pathologie létale (aboutissant à la mort) qui s’accompagne d’une perte d’activité et de poids (jusqu’à 30%), avec une survie moyenne de 5 jours. Dans les modèle modérés (moins bien décris dans la littérature scientifique), l’infection au SARS-CoV-2 induit une pathologie limitée qui se résout d’elle-même en 1-2 semaines, sans signe clinique macroscopique particulier chez les jeunes animaux. Une perte de poids transitoire (de l’ordre de 10% à 3 jours post-infection) a été rapportée chez les animaux plus âgés (30 semaines). De plus, des effets indésirables peuvent être observés suite à des traitements (inflammation ou nécrose au site d’inoculation, intolérance et toxicité des traitements).
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure, afin de procéder à la collecte d’échantillons biologiques d’intérêt (notamment des tissues des voies aériennes).
Remplacement
L’utilisation des modèles de souris COVID-19, organismes vivant complexes à même de reproduire différents aspects de la maladie humaine, est indispensable pour faire progresser le programme d’évaluation de candidats thérapeutiques dans un contexte où la balance bénéfice/risque de nombreuses molécules peut se révéler négative in vivo malgré des résultats prometteurs obtenus in vitro. Le projet portant sur l’étude de la réponse immunitaire de l’organisme et l’évaluation de traitements, il est impossible de remplacer l’animal par un modèle ne représentant que partiellement un organisme. L’utilisation de ces modèles intervient en seconde ligne après l’évaluation des candidats médicaments in vitro dans plusieurs systèmes expérimentaux (biochimie, culture de lignées cellulaires, avec utilisation de plusieurs variants d’intérêt du SARS-CoV-2). En l’absence d’une efficacité auparavant démontrée in vitro, les candidats médicaments ne seront pas testés in vivo. La sélection préalable des candidats in vitro permet de réduire drastiquement le nombre de produits à tester in vivo.
Réduction
En nous basant sur des études antérieures sur le modèle hamster COVID d’une part, et sur les études effectuées sur un modèle murin sévère d’infection d’autre part, nous avons établi des effectifs de lots de 15 animaux pour pouvoir observer des différences statistiques entre groupes. Dans chaque lot, une fraction des animaux sera utilisée pour évaluer la charge virale pulmonaire et des paramètres de réponse immunitaire, et une autre fraction sera utilisé pour évaluer la survie à long terme (2 semaines) prodiguée par le traitement en cours d’évaluation. Les comparaisons des données des différents groupes d’animaux seront réalisées au travers d’analyses statistiques adéquates.
Raffinement
L’hébergement des animaux sera réalisé dans des portoirs ventilés. Suivant nos observations, nous pourrons augmenter l’enrichissement des cages (deux cylindres au lieu d’un) ou diminuer le nombre d’animaux par cage (tout en évitant les individus seuls). . Un suivi clinique quotidien (a minima sur les 7 premiers jours de l’infection) des animaux avec pesée & évaluation des paramètres cliniques permet de s’assurer de l’évolution des signes cliniques de l’infection. Une grille de score clinique sera mise en œuvre, en nous basant sur les observations et pratiques déjà établies par d’autres collaborateurs académiques. Les critères suivis incluent l’apparence physique, la perte de poids, la mobilité et le comportement et permettent de déterminer un score clinique non dommageable, léger, modéré ou sévère. Une euthanasie préventive sera effectuée pour éviter des souffrances inutiles si les animaux présentent une forte perte poids ou un score clinique sévère. En cas de perte de poids intermédiaire, la nourriture et de l’eau gélifiée seront disposés en fond de cage ainsi qu’une réhydratation par injection sous-cutanée quotidienne. Prise en charge analgésique et anesthésique sur les gestes techniques le nécessitant.
Choix des espèces
Les souris génétiquement modifiées pour l’expression du récepteur ACE2 humain permettent d’accéder à une gamme de modèles expérimentaux reproduisant une pathologie soit sévère, soit modérée, après infection au SARS-CoV-2. Elles présentent l’avantage de pouvoir être explorées expérimentalement grâce à de très nombreux outils de biologie cellulaire et moléculaire, ce qui n’est pas le cas du modèle hamster syrien doré. Du fait de sa petite taille, et de l’accessibilité facilitée via des éleveurs agréés, le modèle permet, en première intention, d’éviter le recours à des modèles plus complexes à mettre en œuvre, comme les primates non-humains. Il est à noter que les modèles chez lesquels une pathologie sévère est obtenue n’ont pas d’équivalent dans d’autres espèces animales, et représentent donc une opportunité unique pour étudier une pathologie de type COVID. Les animaux utilisés pour ce projet seront âgés de 8 à 12 semaines (stade adulte), comme décrit jusqu’à maintenant dans la littérature scientifique disponible sur le sujet. Dans certains cas, il pourra être envisagé d’utiliser des animaux plus jeunes ou plus âgés, pour potentiellement reproduire des aspects de la maladie spécifiquement observés chez des individus humains jeunes ou âgés, respectivement.
Programmation métabolique de la fibrillation atriale chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Anesthésiées pour un prélèvement de sang intracardiaque et tuées sans reprise de conscience, 324 souris sont suralimentées après la naissance et privées du gène du BDNF dans leurs cellules endothéliales, pour relier ces conditions à un trouble du rythme cardiaque. Le porteur décrit un geste court, deux minutes en moyenne, et signale surtout le stress de la préhension ainsi que celui infligé aux mères par la constitution des groupes deux jours après la naissance. Le récit des atteintes s'arrête là, alors que le projet repose sur l'installation d'une obésité et d'une atteinte cardiaque. Il affirme qu'il est "indispensable" de travailler sur un "organisme entier", les modèles cellulaires ne reflétant pas l'environnement neuro-hormonal.
Objectifs
La fibrillation atriale (FA) est un trouble du rythme cardiaque touchant les oreillettes, qui les fait battre de manière irrégulière, c’est-à-dire de façon arythmique. Son apparition est favorisée par le vieillissement, l’obésité et par la dysfonction de l’endothélium vasculaire. Ce dernier est une barrière cellulaire entre les tissus et le sang. On parle de dysfonction endothéliale quand l’endothélium n’est plus en capacité d’assurer ses fonctions, comme la régulation de la perméabilité vasculaire et de la tonicité vasculaire (dilatation ou constriction des vaisseaux). L’activité endothéliale est dépendante de certains composés, notamment le brain-derived neurotrophic factor (BDNF). Le BDNF est fortement exprimé dans les cellules qui composent l’endothélium (cellules endothéliales : CE) et dans les cellules qui permettent la contraction du cœur (les cardiomyocytes). Sa diminution est associée au développement de l’obésité, du diabète et des maladies cardiovasculaires. A l’inverse, un article récent souligne que le BDNF limite le phénomène de mort cellulaire des CE et des CM. Malgré tous les éléments disponibles dans la littérature, le rôle précis du BDNF dans la mise en place de la FA associée à des anomalies du métabolisme reste à déterminer. De plus, l’environnement au cours des premières étapes de la vie, pendant les périodes fœtales et postnatales, joue un rôle clef dans la détermination de la santé d’un individu. Dans ce cadre, on sait désormais que les conditions nutritionnelles avant et après la naissance peuvent influencer non seulement le poids corporel et le pourcentage de masse grasse, mais aussi favoriser à long terme le développement de maladies cardiaques et métaboliques. Le modèle de suralimentation postnatale (SAPN) chez le rongeur est particulièrement pertinent pour étudier la mise en place progressive de maladies cardiaques et métaboliques retrouvées chez l’humain adulte, en lien avec l’alimentation du début de la vie. Notre hypothèse est que des changements précoces de l’environnement nutritionnel pourraient prédisposer le cœur au développement d’une FA médiée par la voie du BDNF. L’objectif de ce projet sera d’établir le lien entre l’expression du BDNF endothélial vasculaire et la survenue de FA chez des souris suralimentées post natalement et KO pour le BDNF dans les CE.
Bénéfices attendus
L'un des principaux résultats du projet sera d'aborder le rôle du BDNF dans la FA métabolique d'un point de vue translationnel, ce qui ouvre la voie à la découverte de nouveaux mécanismes, cibles et médicaments grâce à la genèse d'un large éventail de données innovantes. Par exemple, certains résultats obtenus sur des modèles expérimentaux de rongeurs pourraient être pris en compte dans des études cliniques à grande échelle afin de développer de nouveaux outils pharmacologiques pour traiter ou prévenir la FA. Ainsi, notre projet a des impacts scientifiques, socio-économiques et cliniques élevés. Les données obtenues dans ce projet seront régulièrement présentées à la communauté scientifique lors de conférences nationales et internationales annuelles. Les résultats seront publiés dans des revues d’audience internationale à comité de lecture.
Procédures
Des prélèvements sanguins intracardiaques et du tissu cardiaque seront nécessaires pour la réalisation de l’ensemble des expérimentations de ce projet. Ces prélèvements sont de courte durée et durent en moyenne 2 mins par souris, pour un temps d’anesthésie inférieur à 5 mins (induction + prélèvements).
Impact sur les animaux
La préhension préalable à l’induction de l’anesthésie en vue de prélever les tissus cardiaques ainsi que le sang pourrait induire un certain stress aux animaux. Les souris seront maniées avec douceur par du personnel formé à la manipulation de rongeurs de laboratoire. De plus, la constitution des groupes 2 jours après la naissance des souriceaux peut engendrer un stress chez les mères.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort à l’issue de ce projet afin de réaliser des prélèvements tissulaires et sanguins pour analyses biochimiques ultérieures.
Remplacement
Le syndrome métabolique est une pathologie multifactorielle. Pour apprécier l’incidence du syndrome métabolique induit par une SAPN sur la fonction cardiaque, il est indispensable de travailler sur un organisme entier et sur des cœurs isolés afin d’extraire uniquement un type cellulaire, notamment les cardiomyocytes. De plus, l’étude de la fonction et du métabolisme cardiaque ne peut se passer d’une étude chez l’animal. En effet, les modèles cellulaires ne reflètent pas l’environnement neuro-hormonal, ni la fonction cardiaque dans son ensemble (contraintes de pression par exemple).
Réduction
Ne seront utilisés que le nombre d’animaux strictement nécessaire à la conduite du projet et à l’obtention de statistiques suffisantes (utilisation de tests statistiques adaptés aux petits échantillons). Le nombre de 9 animaux par groupes est suffisant pour obtenir des résultats statistiques.
Raffinement
Les souris seront constamment hébergées en groupe avec un enrichissement de leur milieu de vie, dans une pièce calme et tempérée. Les aliments et l’eau de boisson seront fournis ad libitum. Les animaux seront observés quotidiennement par du personnel qualifié et des soins pourront être apportés si l’état de santé des rongeurs le nécessite. L’évaluation de la douleur se fera à l’aide d’une grille de score et sa prise en charge sera faite par l’utilisation d’anesthésiques locaux et généraux. Enfin, des points limites ont été définis et seront respectés pour l’ensemble des procédures.
Choix des espèces
Notre équipe de recherche a une longue expérience de projets expérimentaux conduits chez la souris. La souris nous permet d’envisager les effets de la suralimentation sur un modèle très étudié dans différents projets, au niveau national et international, et qui sert de témoin « sauvage » aux études sur animaux génétiquement modifiés qui seront aussi utilisés dans ce projet. Pour l’étude de l’impact à plus long terme d’une SAPN sur le risque cardiométabolique, les animaux auront 6 mois, ce qui correspond à un âge adulte chez la souris et à l’apparition des maladies cardiaques chez l’humain.
Travaux pratiques de Physiologie animale pour la Licence et le Master de Sciences de la Vie et de la Santé
- Enseignement supérieur
Tués avant tout réveil, 1 105 rats sont anesthésiés de trente minutes à trois heures pour que des étudiants de licence et de master s'exercent à canuler la trachée, la veine jugulaire, l'artère carotide et la vessie, avant une injection létale. Le porteur décrit ces séances comme une formation pratique et non comme un travail de recherche, un animal servant à deux ou trois étudiants. Il indique que des travaux pratiques virtuels ou sur organes isolés existent et sont utilisés quand les objectifs pédagogiques le permettent, tout en jugeant ces séances sur animaux vivants "indispensables" aux étudiants visant un poste de technicien. Il conclut à l'absence de toute sensation, les procédures étant classées sans réveil.
Objectifs
Le projet concerne la formation pratique à l’exploration fonctionnelle des fonctions physiologiques respiratoire et cardiovasculaire d'étudiants de licence et de master en sciences de la vie et de la santé. Les 5 procédures concernées, correspondant à 5 travaux pratiques (TP) visent à former les étudiants aux techniques de canulation (artère carotide, trachée, veine jugulaire et vessie) et d’analyse fonctionnelle respiratoire et cardiovasculaire sur le rat anesthésié par injection intra-péritonéale d'un anesthésique (kétamine) et d’un analgésique (xylazine), ainsi qu’une injection sous-cutanée d’un anesthésique local (lidocaïne). Ces TP sont indispensables aux étudiants désireux de s'insérer sur le marché du travail avec un niveau de technicien et constituent également, pour ceux qui souhaitent poursuivre leurs études en 2e année de Master et doctorat, des TP préparatoires aux méthodologies nécessaires pour certains lors de leur stage pratique en laboratoire.
Bénéfices attendus
La mise en place de travaux pratiques utilisant des animaux vivants vise à initier les étudiants à l’expérimentation en physiologie animale, à leur enseigner les connaissances pratiques de techniques d'étude sur animal vivant et à les sensibiliser aux notions éthiques et réglementaires de l'expérimentation animale. Elle répond par ailleurs au référentiel de connaissances et de compétences en licence de Sciences de la Vie précisant que les étudiants doivent être formés à « appliquer les techniques expérimentales fondamentales en Sciences de la Vie dans le respect des bonnes pratiques de laboratoire ».
Procédures
Toutes les interventions sont réalisées sur animaux anesthésiés sans réveil, pour une durée de 30 minutes à 3 heures maximum, selon les procédures. Chaque intervention est réalisée une seule fois. - cathétérisation de la trachée (20 à 30 min selon le niveau de formation) - cathétérisation de la veine jugulaire (30 min) - cathétérisation de l’artère carotide (30 min) - cathétérisation de la vessie (15 min) - injections létales (30 secondes)
Impact sur les animaux
Toutes les procédures sont classées « sans réveil », donc en absence de sensation, notamment de douleur, souffrance ou mal-être, durant la procédure sous anesthésie et, par définition, de douleur post-opératoire. L’absence de sensation est assurée par le contrôle de la profondeur de l’anesthésie générale, combinée à l’injection d’un anesthésique local préalablement à la réalisation des gestes invasifs.Le stress de la contention ou un inconfort lié à l'injection d'anesthésique peuvent être observés.
Devenir
Les procédures étant sans réveil, les interventions pratiquées ne permettent pas le réveil des animaux, et les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure avant retour à l’état de conscience.
Remplacement
Dans une stratégie de remplacement, lorsque les objectifs pédagogiques sont compatibles, les travaux pratiques (TP) sont des TP virtuels, ou réalisés sur organes isolés, hors procédure. Les TP sur animaux se limitent à des enseignements de spécialisation, et concernent, par rapport aux effectifs totaux, un nombre restreint d’étudiants ayant choisi de suivre ces enseignements en rapport avec leurs objectifs professionnels
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, les étudiants dans les enseignements à forts effectifs (plus de 100 étudiants) travaillent en trinôme lors des 3 séances de TP. Pour les formations à plus faible effectif (moins de 20 étudiants), les étudiants travaillent en binômes. Un seul animal est donc utilisé pour 2 ou 3 étudiants, de manière à limiter le nombre d’animaux utilisés, en fonction des objectifs pédagogiques.
Raffinement
Toutes les procédures sont classées « sans réveil », donc en absence de sensation, notamment de douleur, souffrance ou mal-être, durant la procédure sous anesthésie et, par définition, de douleur post-opératoire. L’absence de sensation est assurée par le contrôle de la profondeur de l’anesthésie générale, combinée à l’injection d’un anesthésique local préalablement à la réalisation des gestes invasifs, superficiels. L’anesthésie est assurée par l’association d’un d'anesthésique général, la kétamine, associée à un sédatif/analgésique/myorelaxant, la xylazine, ce qui induit une anesthésie profonde d’environ 45 min. Durant l’anesthésie, la température corporelle est maintenue à la valeur physiologique (37°C) par le maintien de l’animal sur un tapis chauffant adapté. Pour limiter le stimulus nociceptif induit par la procédure de pose des cathéters, une anesthésie locale (lidocaïne) préalable des zones cathétérisées est réalisée. De plus, lorsque cela est compatible avec l’interprétabilité des données, les systèmes invasifs de recueil des paramètres physiologiques (comme la pose d’un cathéter trachéal) sont remplacés des systèmes non invasifs (comme la pose d’un masque à anesthésie). L’enregistrement des paramètres physiologiques n’est pas en lui-même douloureux. L’évaluation de la profondeur de l’anesthésie est évaluée régulièrement en peropératoire par l’absence de réflexe podal et de réflexe palpébral. Les signes avant-coureurs du réveil (réponse au pincement de la patte, réflexe palpébral, apparition de mouvement spontané) sont attentivement surveillés et, s'ils apparaissent avant le moment prévu de la réinjection régulière d’anesthésiques, entrainent une injection anticipée d’anesthésique et de sédatif, de façon à éviter toute souffrance ou angoisse à l'animal. Des points limites appropriés sont définis et appliqués. En amont des procédures proprement dites, le bien-être des animaux et l’absence de stress ou douleur sont assurés lors de l’accueil et de l’hébergement des animaux par une période d’acclimatation dans la zone de stabulation d’au moins 5 jours avant les TP et un hébergement en groupes sociaux stables dans un environnement calme avec un enrichissement adapté à l’espèce (tunnels translucides rouges ; lanières de bois pour paille de nid.)
Choix des espèces
Le rat, outre le fait d'être classiquement utilisé dans les laboratoires de recherche, présente l'avantage par rapport à la souris d'être de taille plus importante et donc de faciliter la canulation de la trachée, des différents vaisseaux et de la vessie. Animaux adultes jeunes de taille moyenne (250 - 400 g) afin de standardiser au maximum les procédures (adéquation entre le diamètre des vaisseaux et le diamètre des cathéters disponibles) et de faciliter la canulation des différents vaisseaux et de la vessie par les étudiants se formant à ces gestes techniques. Des rats mâles ou femelles seront utilisés selon leur disponibilité auprès des fournisseurs, l’analyse des paramètres étudiés ne dépendant pas du sexe.
Analyse de l’impact de la signalisation CAR en réponse à des expositions aux xénobiotiques
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système urogénital
1 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur expose les fœtus puis les nouveau-nés à un cocktail de molécules polluantes par l'alimentation pendant 33 jours, et suit les atteintes du foie et de la fertilité jusqu'à huit mois. Les femelles servant à entretenir la colonie sont tuées à six mois, et les animaux dont le génotype ne sert pas au projet sont tués vers trente jours, après génotypage. Il indique n'attendre aucun phénotype délétère majeur, tout en listant perte de poids anormale, hypoactivité, dos voûté et yeux enfoncés parmi les signes qu'il surveille.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de définir si les expositions à des polluants environnementaux lors de la grossesse ou bien lors de l'enfance peuvent entrainer des maladies à l'âge adulte et plus particulièrement des maladies du foie ou bien des troubles de la fertilité.
Bénéfices attendus
Les expositions environnementales sont suspectées d’être à l’origine d’un grand nombre de pathologies telles que les troubles de la fertilité ou l’apparition de maladies métaboliques. L'identification d'acteurs impliqués dans la prédisposition et la survenue de ces pathologies permettra une meilleure compréhension des mécanismes impliqués. Cela est d’autant plus nécessaire que dans le cadre d’une exposition systémique, les communications entre les organes par des voies notamment endocriniennes, peuvent participer à l’apparition de pathologies multiples et parfois interdépendantes. Ce projet permettra de définir l’implication de ces signalisations cellulaires dans la survenue et/ou la progression des pathologies hépatiques et des troubles de la fertilité masculine, tout en définissant la part relative des dialogues bidirectionnels entre le foie et les testicules dans l’apparition de ces pathologies. De plus ce projet définira de nouveaux marqueurs de diagnostic, de pronostics ; voire de nouvelles pistes thérapeutiques dans le traitement de ces pathologies.
Procédures
Les animaux seront soumis au prélèvement d'une biopsies pour le génotypage entre 7 à 10 jours après la naissance. Certains animaux sont des animaux génétiquement modifiés avec une invalidation tissu spécifique pour le gène CAR, les conséquences pouvant toucher les pathologies hépatiques et les troubles de la fertilité seront suivies au plus jusqu'à 8 mois. Les animaux seront soumis à des expositions à des cocktails de molécules environnementales part voie alimentaire pendant 33 jours (à partir de 6.5 jours de vie embryonnaire et jusqu'à 20 jours après la naissance). Les conséquences seront suivi au plus jusqu'à 8 mois.
Impact sur les animaux
Il est à noter que selon la littérature sur le l'invalidation du gène étudié ne présentent pas de phénotype délétère majeur. Aussi, le ciblage de l'invalidation dans un organe en particulier ne devrait pas engendrer de phénotypes dommageables systémiques conduisant à une atteinte majeure de la santé de l'individu. Cependant, les signes observés seront la perte anormale de poids de l’individu ou bien des troubles au niveau de son activité (hypoactivité), dos vouté, yeux enfoncés.... Chaque souris sera surveillée de façon quotidienne par le personnel animalier.
Devenir
Les animaux surnumérères de génotypes qui ne sont pas intéressants pour le projet seront mis à morts. Les animaux utilisés pour les analyses seront mis à morts pour les prélèvements d'organes.
Remplacement
Afin d'analyser l'impact à long terme à l'âge adulte d'exposition à des polluants environnementaux survenues lors de la grossesse et pendant la petite enfance, il n'y a pas à l'heure actuelle de possibilité de remplacer les modèles in vivo. D'autant plus dans notre étude où en plus de la considération temporelle, nous analyserons également les impacts d'un point de vue des dialogues entre plusieurs organes (foie et testicule). Ces considérations de communications entre les organes combinées avec les aspects développementaux (embryons/enfants jusqu'à l'adulte) ne permettent donc pas d'utiliser les approches en culture cellulaire. Cependant des analyses de la littérature combinée à certaines approches en culture cellulaire ont quand même permis de définir les doses à utiliser, permettant cependant partiellement remplacer l'utilisation de l'animal sur certaines questions. Ce qui in fine a permis de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Réduction
Le remplacement par des approches alternatives n'est pas possible dans le contexte des hypothèses des origines développementales de la santé et des pathologies (DOHaD) car aucune approche ne permettrait d'analyser les mécanismes de discussion bidirectionnelle entre les organes sur une cinétique de temps entre une exposition embryonnaire/néonatale et l'apparition de pathologies à l'âge adulte. Des analyses de la littérature combinée à certaines approches en culture cellulaire ont quand même permis de définir les doses à utiliser, permettant cependant partiellement remplacer l'utilisation de l'animal sur certaines questions. Ce qui in fine a permis de réduire le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d’animaux à utilisés a été réduit au maximum Le nombre d'animaux nécessaire pour permettre de mettre en évidence une différence statistique entre les groupes a été évalué en amont grâce aux expériences précédentes, menées ces dernières années dans le cadre d'autres projets et qui nous ont permis d'évaluer les variations attendues dans la réponse des animaux aux expositions à des polluants environnementaux. De plus, sur les animaux qui seront mis à mort dans le cadre de cette étude, nous prélèverons un maximum d'autres tissus que ceux directement ciblés par le projet, afin de pouvoir permettre le partage de tissus avec d'autres collègues permettant ainsi d'alimenter d'autres projets de recherche sans utiliser d'animaux supplémentaires.
Raffinement
Le raffinement reposera sur un hébergement et une surveillance des animaux ainsi que l'élaboration de protocoles prenant en compte au maximum le bien-être animal. Cela reposera notamment avec un enrichissement (tunnel en carton et maisons à souris) des cages et un maintien de plusieurs animaux par cage. De plus, nous avons défini un arbre décisionnel (annexe) avec des critères adaptés d'arrêt de l'expérimentation en cas de souffrance de l'animal.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris mâles modifiés génétiquement pour lequel le laboratoire a une très forte expertise dans l'analyse des impacts de molécules environnementales tant sur la physiologie hépatique que sur la physiopathologie testiculaire et les retombées sur la fertilité. Il s'agit ici d'exposition à un mélange de molécules environnementales permettant de développer ce type de pathologies avec une incidence suffisante pour réaliser des études moléculaires et physiologiques donnant des résultats statistiquement fiables. Des femelles seront utilisées pour l'entretien de la colonie et seront mis à mort à 6 mois; Les femelles et mâles qui ne seront pas utilisées ou de génotype sans intérêt pour le projet seront mis à mort après génotypages soit à 30 jours postnataux. Des mâles de génotypes intermediaires seront utlisés pour l'entretien de la colonie. Pour les mâles du génotype d'intérêt, nous utiliserons des souris à 5 jours, 10 jours, 1 mois, 3 mois et 12 mois postnatal pour l'analyse des phénotypes. Ces différents temps d'analyse correspondent à des moments précis où se déroulent des étapes clefs de la mise en place des fonctions testiculaires et hépatiques ainsi que la mise en place et le maintien de la fonction de reproduction.
Evaluation préclinique de produit de santé utilisés en diabétologie après implantation dans l’organisme
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Rats : 900
Cochons : 150
Pour tester les dispositifs médicaux de diabétologie de fabricants qui passent commande, 900 souris, 900 rats et 150 cochons sont utilisés dans des procédures allant de la chirurgie sans réveil au niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue. Chaque animal subit une intervention de deux à trois heures pour implanter le dispositif, parfois une seconde du même ordre pour l'enlever et observer la cicatrisation, plus des séries de un à dix prélèvements sanguins renouvelables toutes les deux semaines. Le porteur annonce environ 35 études sur cinq ans, le total dépendant du nombre de contrats signés avec les donneurs d'ordre. Il invoque la réglementation et la "nécessité" d'organismes entiers, et cite des raisons économiques parmi les critères de choix des rongeurs.
Objectifs
Ce projet vise à évaluer la tolérance (ou sécurité) ainsi que la performance (ou efficacité) des produits de santé en diabétologie. Chaque produit destiné à être mis en contact avec le corps humain doit être préalablement testé pour garantir le bon rétablissement des patients après chirurgie, et pour garantir son efficacité lors de l'utilisation clinique. Pour cela différents fabricants font appel à nous pour réaliser ces études, afin de tester un ou plusieurs de leurs produits de santé. Nous prévoyons environ 35 études sur 5 ans au regard de notre historique. La durée de l'étude est adaptée à l'utilisation clinique et à la durée d'implantation chez l'Homme (de quelques jours à plusieurs années). La réglementation exige de prouver l'efficacité des produits de santé et de réduire au minimum le risque de réactions indésirables avant de proposer un produit sur le marché. Compte-tenu de la complexité des mécanismes de régulation d'un organisme vivant, le recours au modèle animal est nécessaire pour répondre aux objectifs du projet.
Bénéfices attendus
Ce projet permet d'obtenir dans différents modèles animaux des données de performance et de tolérance des produits de santé en diabétologie. Ainsi, il est possible d’étudier ces produits en vue de répondre aux exigences des autorités réglementaires dans l'obtention d'une autorisation de mise sur le marché, élargissant l’offre et améliorant ainsi les chances de guérison et le confort des patients humains traités.
Procédures
Pour l'ensemble des procédures, tous les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale afin d'implanter le dispositif médical à tester ou de récupérer des îlots de Langherans (interventions chirurgicale peuvent durer entre 2h00 et 3h00). Ces intervention ont toujours lieu sous anesthésie générale (par injection et gazeuse) et analgésie. Certains animaux peuvent être soumis à une intervention chirurgicale supplémentaire si le but de l'étude est aussi d'évaluer la cicatrisation après retrait du dispositif de son site d'implantation (cette intervention chirurgicale peut durer entre 2h00 et 3h00). Cette intervention aura lieu dans les mêmes conditions que celles précédemment citées. Des prélèvements sanguins peuvent être réalisés en cours d'étude ou lors de la chirurgie (durée de prélèvements de quelques minutes maximum. Des sessions comprenant de 1 à 10 prélèvements peuvent être repetée maximum toutes les 2 semaines adapté à la durée de l'étude) . Ceux-ci pourront se faire sous anesthésie ou non, selon le contexte de réalisation de cet acte (en cours de chirurgie, pendant le temps de l’étude ou juste avant l’euthanasie des animaux en fin d’étude). D'autres type d'interventions non douloureuses, de type scanner ou radiographies pour observer le dispositif en cours d'étude, peuvent être réalisées sous anesthésie si nécessaire (en général, en fonction de la durée de l'étude 1 à 3 sessions d'imagerie peuvent être envisagées. L'anesthésie dans ce cas dure généralement moins d'1 heure).
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables pouvant survenir chez les animaux sont, selon les procédures, les suivants : - douleur et stress liés à la chirurgie, contrôlée par la prise d’analgésique (morphinique) et par la réalisation d’une anesthésie générale. Un suivi a minima quotidien des animaux permet de détecter les signes de douleur et d’adapter le traitement analgésique en conséquence pour diminuer autant que possible ces nuisances. - perte de poids ou d’appétit liée aux effets de l’anesthésie, de la chirurgie et/ou du dispositif implanté, à court ou long terme, contrôlée par le suivi quotidien du transit et/ou de l’alimentation et la mise en place de mesures de soutien, jusqu’à la reprise d’un comportement alimentaire normal spontané. Les mesures mises en place peuvent être par exemple : mise à disposition d’aliments plus appétants (friandise), distribution d’un aliment de convalescence (prise spontanée ou assistée)... - risque infectieux lié à la chirurgie, contrôlé par la mise en place de mesures d’asepsie et la prise d’antibiotiques en peropératoire. - hématome ou œdème au niveau du site opératoire, pouvant entrainer une gêne locomotrice en plus de la douleur.
Devenir
Pour répondre aux objectifs de chacune des procédures du projet, des observations post-mortem sont nécessaires. En effet, la sécurité des produits est évaluée en observant la réaction des tissus au contact du dispositif à tester, et ceci se fait par prélèvements des tissus et organes entourant le produit, afin de réaliser des analyses microscopiques (histologie notamment, qui est la meilleure méthode d'évaluation des effets locaux induits par un produit étranger à l'organisme, comme l'inflammation par exemple). De même la performance peut, elle aussi, être évaluée par des tests spécifiques sur les organes et le dispositif prélevé (exemple : évaluation de l’insulinémie, glycémie). En raison des objectifs des procédures de ce projet, il n'est pas possible de maintenir en vie les animaux utilisés.
Remplacement
L’utilisation d’animaux est requise dans la réglementation (ex : suivi des exigences des normes). A ce jour, il n'existe pas de méthode alternative permettant d’évaluer la performance et la tolérance locale des produits de santé en diabétologie. Particulièrement dans le contexte de dispositifs utilisés pour le traitement de patients diabétiques la nécessité d'organismes entier est crucial, en effet les hormones de systèmes endocrine pancréatique (par exemple: insuline, glucagon...) jouent un rôle important dans le maintien de différent systèmes (tel que la glycémie) par le biais des organes périphériques (foie, mucles...).
Réduction
Par ailleurs, pour réduire le nombre d'animaux inclus en étude, il est possible d'utiliser un même groupe "contrôle" (produit dont l'effet est déjà connu) pour plusieurs groupes "test" recevant des produits à tester différents. Les études de screening précédemment citées permettent également de sélectionner un produit test qui présente le plus d'intérêts à être développé, réduisant de ce fait le nombre de tests sur des produits ayant un intérêt moindre. Les études dites "pilotes", sur quelques animaux seulement, peuvent aussi servir à orienter les choix de poursuite de développement d'un produit ou le choix du modèle expérimental le plus approprié (matériel ou abord chirurgical le plus adéquat…), avant d'entamer les études réglementaires à plus grande échelle et devant répondre aux normes en vigueur pour l'élaboration du dossier pour la mise sur le marché (nombre d'animaux minimum, durée de mise en contact minimum, etc). Le nombre d’animaux est arbitré à partir du nombre de sites requis en analyse (par exemple pour les souris/rats/porcins, nous estimons 2 à 3 groupes expérimentaux par études à raison de n=10 animaux par groupe et d'une 30 aines d'étude rat/souris et 5 études porcins sur 5 ans répartie sur chaque procédure, ie pour rat/souris: 3 groupes x 10 animaux x 30 études = 900 animaux / pour porcins: 3 groupes x 10 animaux x 5 études = 150 animaux). Le nombre total d’animaux utilisés dépend directement du nombre d’études signées avec les différents donneurs d’ordre durant les 5 années du projet. De cette façon, le nombre d’animaux précisé ci-dessus constitue une estimation basée sur l’historique des essais conduits chez nous durant ces dernières années. De plus les normes requierent un nombre minimal d'animaux par produit analysé et par délai d'analyse, et le type de dispositif implanté ne permet pas toujours la réalisation d'un grand nombre de sites par animal.
Raffinement
Des mesures sont mises en place pour limiter : - Avant la chirurgie, une période d’habituation aux actes spécifiques est réalisée si nécessaire, pour réduire l’aspect anxiogène de ces manipulations. Des enrichissements renforcées en phase post-opératoire (ajout d’enrichissements alimentaires…). Lorsque l'hébergement est individuel un maintien des contacts visuels, auditifs, olfactifs est effectué avec la mise en place d'éléments compensatoires. - La douleur des animaux : En phase post-opératoire, les suivis sont renforcés et completée par des scores de suivi de la douleur. La présence d'un vétérinaire sur site permet également la réalisation de soins post-opératoires spécifiques et adaptés. Les signes cliniques servant de points limites sont établis en amont pour la prise de décision des mesures à mettre en place pour limiter les souffrances.
Choix des espèces
L’espèce animale choisie est définie dans le(s) texte(s) de référence. Les produits de petite taille/miniaturisés seront testés préférentiellement chez les rongeurs. Les produits de taille importante seront préférentiellement testés chez le modèles porcins. Lorsque plusieurs espèces répondent aux critères, le choix est arbitré par la durée de l’essai (pour une étude sur le long terme, utilisation d’espèces à longue durée de vie). Le choix du modèle animal peut également être défini selon la disponibilité et les caractéristiques des modèles diabétique génétique ou induit. Le choix entre les grands modèles repose aussi sur les similarités avec l’Homme : - Caractéristiques anatomiques, poids, propriétés endocrines - Caractéristiques anatomiques des rats et des souris. Ces espèces sont souvent utilisées également pour des raisons économiques et éthiques (exemple : réalisation d’études de faisabilités via la réutilisation d’animaux d’études précédentes ) Les critères pris en considération dans le choix du stade de développement sont les suivants : 1.Suivi des recommandations des textes de référence Le stade de développement est exprimé en âge ou en poids. Dans la plupart des cas, l’utilisation d’animaux adultes est recommandée. 2.Propriétés intrinsèques du produit à tester En l’absence de recommandation particulière dans le(s) texte(s) de référence et si la nature du produit le requiert, le stade de développement est pertinemment sélectionné. En l’absence d’exigence particulière, l’utilisation d’animaux au stade adulte est privilégiée. Nécessité d'utiliser des animaux doté d'un système immunitaire compétent. 3.Cas particulier des porcs Pas de recommandation spécifique réglementaire d’où choix d’utiliser des porcs domestiques en croissance (âgés d’au moins 8 semaines). Etant donné les conditions d’hébergement, le comportement social et la manipulation des animaux, l’utilisation de porcs domestiques en croissance est la plus appropriée dans ce projet.