Rongeurs
Implication de la phosphoinositide 3-kinase (PI3K) dans la rigidité artérielle chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil, 138 souris subissent la pose d'un cathéter dans la carotide gauche puis une échographie de trente minutes, avant de recevoir une dose létale d'anesthésique. Le porteur signale que la pose du cathéter peut déchirer la carotide et provoquer la mort par hémorragie, et qu'une heure sous isoflurane peut dérégler pression artérielle, température corporelle et rythme cardiaque. Les carotides, l'aorte et les artères fémorales sont ensuite prélevées pour des mesures ex vivo. Une partie de ces expériences, précise-t-il, répond à une demande de révision d'article en vue d'une publication.
Objectifs
Les maladies cardiovasculaires représentent la première cause de mortalité dans le monde. La rigidité artérielle (perte du potentiel élastique des artères) perturbe le fonctionnement du cœur et le fatigue. Ceci entraine à terme, des complications cardiovasculaires causées par la modification de la composition de la paroi artérielle (appelé remodelage). Ainsi, comprendre les différentes voies moléculaires impliquées dans le remodelage artérielle pourrait constituer une nouvelle approche pour découvrir de nouveaux médicaments réduisant la rigidité artérielle. Dans ce contexte, nos résultats in vitro et in vivo précédents ont montré qu'un nouvel acteur moléculaire est capable de réguler le remodelage de la paroi artérielle. Notre hypothèse est que ce nouvel acteur pourrait participer à l'apparition et à l'entretien la rigidité artérielle et constituerait une cible thérapeutique intéressante dans le traitement de la rigidité et de ses conséquences cardiovasculaires mais cela n'a pas encore été démontré. Ce projet a donc pour but de caractériser l’implication de ce nouvel acteur dans le contrôle de rigidité artérielle. Les résultats issus de ce projet pourraient démontrer si il s'agit d'une bonne cible thérapeutique permettant de prévenir la rigidité et le remodelage artériels, facteur de risque majeur des maladies cardiovasculaires. Une partie de ces expériences est demandée pour répondre à une révision d’article en vue de sa publication.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires conduisant à la rigidité artérielle et de développer de nouvelles thérapeutiques pour soigner l'établissement de cette rigidification de nos vaisseaux. Ainsi, une meilleur prise en charge de la rigidité artérielle permettrait d'améliorer le fonctionnement du coeur de limiter sa fatigue et par conséquent diminuer le risque cardiovasculaire.
Procédures
Les animaux subiront, sous anesthésie à l’isoflurane, une chirurgie d'environ 30 min (ouverture de la peu du cou, et insertion d'un cathéter mesurant la pression artérielle dans la carotide gauche) puis echographie de la carotides droite pendant 30 min maximum. En fin de procédure, une dose léthale d'anesthésiant est administrée. Le volume maximum de sang qu'il est possible de prendre sur animal mort sera prélevé via le cathéter déjà en place dans la carotide puis les carotides, l'aorte et les artères fémorales seront exisées pour des mesures ex-vivo.
Impact sur les animaux
La technique nécessite une chirurgie délicate et longue. La souris restera environ 1h maximum sous anesthésie à l’isoflurane, ce qui peut engendrer engendrer un déssèchement des yeux, des modifications de la pression artérielle, de la température corporelle, des fréquences respiratoires et cardiaques, en dessous ou au dessus des constantes normales et engendrer une perturbation du bien être de l'animal. Dans certains cas, l'isoflurane peut provoquer des spasmes. D’autre part, l'incision de la peau du cou et l'écartement des tissus adhérants à la carotides peuvent provoquer des petits saignements. Enfin, la pose d’un cathéter dans la carotide peut provoquer une déchirure de celle-ci et donc une mort de l’animal par hémorragie.
Devenir
Tous les animaux entrant en procédure sont mis à mort à la fin de la procédure car Il n’est pas possible d’enlever le cathéter placé dans la carotide sans que l’animal soit mis à mort. De plus, d’autres artères sont prélevées pour des études in vitro. L'animal est inconscient lors de sa mise à mort.
Remplacement
Un certain nombre d’expériences in vitro et in vivo ont déjà été réalisées avant de mener les expérimentations exposées ici. Les résultats suggèrent une implication potentielle de l’enzyme et ses unités régulatrices dans la régulation de la rigidité artérielle. Etudier la rigidité artérielle nécessite l’enregistrement des variations de la pression artérielle carotidienne en même temps que les variations de diamètre carotidien au cours du cycle cardiaque. Ceci n’est possible qu’in vivo. Le remplacement dans ce cas n'est pas possible.
Réduction
Nous faisons toutes les mesures échotracking et myographie sur un même animal. Le nombre de souris nécessaires a été calculé par une approche statistique sur la base d'études antérieures menées au sein de notre laboratoire pour permettre les analyses statistiques a postériori. Celui-ci est de n= 23 souris/groupe pour atteindre la puissance statistique soit au total, 138 souris. Si nous obtenons des résultats exploitables significatifs avant d’atteindre le nombre déclaré, les expériences seront stoppées.
Raffinement
Une observation des animaux est réalisée quotidiennement. La surface au sol des cages de souris étant de 500 cm2, les souris peuvent être hébergées de 2 à 6 souris par cage ventilées. L’environnement des animaux est enrichi : bandes de papier Sizzle-Nest et coton pour la nidification, buchettes de bois pour usure des dents, tunnels pour se cacher et grimper. Une anesthésie gazeuse sera pratiquée pendant la chirurgie et l’exploration fonctionnelle cardiovasculaire. Pendant tout ce temps, l’animal est sur une plaque chauffante pour maintenir sa température corporelle et sa fréquence respiratoire et sa fréquence cardiaque sont monitorées. Du gel ophtalmique est déposé sur les yeux pour éviter le dessèchement. Si l'un des points monitorés cités précédemment vient à être modifié, des actions correctives seraient entreprises ( modification de la température et/ou, de l'anesthésie gazeuse). Si ces actions correctives ne permettent pas de retrouver des constantes comprises dans la fourchette tolérable, nous atteindrions alors les points limites et nous serions obligés de mettre à mort l'animal. De plus, si la chirurgie induisait une hémorragie trop importante (déchirure de la carotide), l'animal sera mis à mort sans attendre.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris, seule espèce animale pour laquelle il existe des modèles animaux génétiquement modifiées des nos cibles enzymes d’intérêt. Les souris sont une espèce appropriée à l'étude du développement de la rigidité artérielle. Les souris adultes (12 à 18 semaines) seront utilisées pour la réalisation de ce projet, où l'appareil vasculaire a atteint sa pleine maturité.
Développement d’un nouveau modèle murin pour étudier le cancer du foie chez l’enfant
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
40 souris très jeunes et fortement immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur leur implante des cellules de cancer du foie de l'enfant après incision de l'abdomen et pose de sutures, administre une chimiothérapie deux fois par semaine, mesure les tumeurs par imagerie trois fois par semaine, puis les tue pour prélever ces tumeurs. Il affirme que la majorité des nuisances n'aura pas d'effet sur les animaux puisque les manipulations se font sous anesthésie. L'objectif immédiat consiste à montrer que ce modèle fonctionne, afin de tester ensuite d'autres médicaments.
Objectifs
L’hépatoblastome est le cancer primaire du foie le plus fréquent chez l’enfant de moins de 5 ans. Le traitement de référence utilise une chimiothérapie à l’aide d’un agent anticancéreux utilisé à l’hôpital. L’hépatoblastome est un cancer caractérisé par des mutations bien connues mais les mécanismes biologiques responsables de son émergence après la naissance chez l’Homme restent très mal comprises. La disponibilité d’un modèle de cancer du foie chez la souris très jeune permettrait de mimer la maladie observée chez les enfants et d’étudier les mécanismes moléculaires à l’origine de son apparition et également de tester l’efficacité de futurs médicaments dans un contexte physiopathologique plus en adéquation avec le très jeune âge des patients atteints de ce cancer.
Bénéfices attendus
Montrer que les cellules d’hépatoblastome se développent dans le foie de souris très jeunes et forment des tumeurs identiques à celles décrites chez les enfants. Montrer que ces cellules répondent à une chimiothérapie et donc que ce modèle animal est utile et nécessaire pour tester de futurs médicaments. Disposer d’un modèle chez la souris très jeune qui permette d’étudier avec plus d’exactitude les mécanismes à l’origine de ce cancer pédiatrique.
Procédures
Implantation de cellules tumorales dans le foie après une incision de la peau au niveau ventral (1 seule incision et implantation, 10 minutes). Points de sutures au niveau ventral (3 points de sutures, 10 minutes). Administration de médicaments 2 fois par semaine (20 secondes par injection). Mesure de la tumeur par imagerie à bioluminescence 3 fois par semaine (10 minutes par analyse). Pesée des souris deux fois par semaine (20 secondes par pesée).
Impact sur les animaux
Les nuisances sont la manipulation des cages et des souris, l’injection de cellules et de solutions chimiques avec une aiguille, un stress lors de manipulations répétées, une légère douleur au point de piqure, une légère douleur liée au medicament injecté, une légère sensation de froid lors du nettoyage de la peau à l’alcool. La moitié des animaux seront traités par une solution de médicament déjà administré à des enfants hospitalisés et dont les effets sont bien connus. Cependant, comme les souris sont manipulées sous anesthésie, la majorité de ces nuisances n’aura pas d’effet sur les animaux.
Devenir
Les 40 souris de ce projet seront euthanasiées afin de procéder au prélèvement des tumeurs et leur analyse par des approches cellulaires, moléculaires et histologiques.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative à la réalisation de ce projet, c’est-à-dire un système biologique qui reproduit partiellement ou entièrement les conditions cliniques, analytique et moléculaire de notre objet d'étude. II est impossible d'obtenir les informations fournies dans cette étude sans l'utilisation de cette souche de souris. Les conclusions recherchées ne peuvent être obtenues par des modèles alternatifs d'étude en boite de culture, car ces derniers ne reconstituent pas de manière optimale la complexité, la communication et la diversité d’interactions entre les cellules normales et les cellules tumorales dans un animal entier.
Réduction
Nos effectifs sont déterminés et nos résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Pour des raisons de réduction, nous utiliserons à la fois des mâles et des femelles.
Raffinement
Concernant l’objectif de réduction de la souffrance, la douleur et l’angoisse infligées aux animaux, les souris seront hébergées en animalerie, suivies quotidiennement pour détecter d’éventuels signes cliniques par du personnel qualifié. Les procédures expérimentales seront réalisées sous anesthésie pour empêcher la douleur et le stress. Un analgésique sera utilisé 30 min avant toute opération. Les animaux sont hébergés en cages à raison de 3 mères et de 12 souriceaux par cage. Les conditions d’hébergements sont adaptées à la forte immunodépression de ces animaux : cages, nourritures et litières sont stérilisées. En cas de besoin et pour le bien-être des animaux, nous ajouterons de la nourriture humidifiée/ou du gel nutritif dans les cages ou feront des injections intrapéritonéales de sérum physiologique. De plus, chaque cage reçoit un enrichissement du milieu en l’occurrence des nids de Woodwoll. En ce qui concerne les données de comportement et de physiologie, l’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie. Si pour une raison quelconque, un animal est considéré comme en souffrance, il sera traité par des antalgiques. S’il n’y a pas d’amélioration, il sera euthanasié sans attendre. Enfin, nous appliquerons les points limites stricts et spécifiques du projet.
Choix des espèces
1. La souche de souris choisie est largement utilisée dans la recherche sur le cancer en raison de sa capacité à développer le processus étudié du fait de sa forte immunodépression. 2. L’expérience d’utilisation des chercheurs demandeurs. 3. Nous utiliserons des souris très jeunes pour mimer le plus justement possible le contexte de la maladie chez les enfants très jeunes.
BIOFILM : Détermination de l’efficacité de produits anti-Biofilm dans des modèles précliniques
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Toutes tuées à l'issue parce qu'infectées, 828 souris reçoivent deux plaies dorsales pratiquées au punch de biopsie puis une inoculation de bactéries formant un biofilm, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur suit la croissance de l'infection par imagerie quotidienne sous anesthésie gazeuse et par des prises de sang à la veine rétro-mandibulaire. Il annonce qu'aucune souris ne peut être réutilisée, placée ni adoptée, du fait de l'infection qu'il a provoquée. L'enjeu du projet reste de mettre au point ce modèle de plaie infectée pour y tester ensuite des produits anti-biofilm.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de développer des modèles précliniques de BIOFILM mimant les conditions d’infection chez l’homme. Ils permettront ainsi d’étudier la virulence/ pathologie de bactéries cliniquement pertinentes et d’évaluer ensuite l’activité des nouveaux composés prophylactiques ou thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet sont : (1) Mise au point/caractérisation de modèles murins de BIOFILM dans une plaie translatant une infection cliniquement pertinente induite par des agents bactériens Gram (+) ou Gram (-) (2) Mise en place d’un suivi longitudinal de la croissance d’un biofilm dans une plaie par le biais de l’utilisation de bactéries bioluminescences et de systèmes d’imagerie du petit animal. Les résultats de cette étude pourraient être ainsi prédictifs de l’approche thérapeutique à déployer chez les patients.
Procédures
Pour mimer les plaies aiguës chez l’homme, une plaie sera induite dans le cadre d’une procédure chirurgicale. Elle est induite au niveau dorsal de la souris (souris sous anesthésie générale et locale, injection d’analgésiques.) (Ensemble de la procédure 7-10min/souris). Au préalable de l’inoculation bactérienne (bactéries bioluminescentes), les souris seront traitées au niveau de la plaie par des approches différentes (dépôt direct au niveau plaie du produit candidat (20-30 secondes/souris), utilisation de pansement pré-imbibés ou pulvérisation du produit) (20-30 secondes/souris). Les souris seront suivies quotidiennement : suivi clinique (apparence, poids et taille de la plaie) + imagerie (croissance/dissémination du biofilm). Le suivi en imagerie est réalisé sous anesthésie gazeuse (3-5min/souris). Pour suivre la réponse immunitaire, des prises de sang précoces seront réalisées par la veine rétro-mandibulaire (3h et +1j) (1-2min/souris).
Impact sur les animaux
Mise au point d’un modèle de plaies aiguës • La mise en place de 2 plaies cutanées par souris à l’aide d’un punch de biopsie stérile entraine un stress et une douleur. o Les plaies seront induites chez des souris sous anesthésie gazeuse et ayant été préalablement traitées pour la prise en charge de la douleur. Le traitement sera renouvelé 2 fois/jours, pour une durée de 3 jours post opération • La formation de biofilm dans une plaie (induite par lésion cutanée) peut induire chez les animaux non traités une infection modérée. • Les plaies induites seront suivies quotidiennement : • Suivi clinique : état de la souris, poids • Croissance du biofilm et dissémination : ceci sera réalisée par imagerie à des temps différents) • Evaluation de l’activité prophylactique Pas d’effets indésirables prévus. Les solutions prophylactiques préalablement produites ont été évalués in vitro pour des effets indésirables éventuels.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils ont été préalablement infectés (plaies).
Remplacement
L’absence de modèles in vitro pertinent permettant de reproduire la majorité des interactions entre agent pathogène et/ou agent antimicrobien et système immunitaire (réponse inflammatoire) nous oriente vers l’utilisation de modèles animaux.
Réduction
L’évaluation du nombre minimal d’animaux à inclure pour pouvoir observer l’effet escompté a été déterminé avec des tests statistiques pour petits échantillons. Ceci a été réalisé en collaboration avec des biostatisticiens. Par ailleurs, L’utilisation des systèmes d’imagerie du petit animal permettra une réduction du nombre de souris en limitant le ainsi le recours au sacrifice des souris pour déterminer la charge bactérienne. En effet, elle permet un suivi longitudinal non invasif de l’infection.
Raffinement
Les animaux seront élevés en communauté dans des cages ventilées enrichies avec du sopalin. Tout au long du déroulement des expériences, une observation systématique de leur état clinique sera réalisée quotidiennement par les expérimentateurs afin de détecter au plus tôt une éventuelle souffrance animale. Pari ailleurs, Afin de prendre en compte la souffrance des animaux, un suivi par imagerie ainsi qu’un suivi clinique seront mis en place, basé sur des observations quotidiennes des souris. En fonction des observations (apparence générale, posture, activité, poids…) et du score clinique associé, des décisions graduelles seront enclenchées : couverture chauffante, injection d’analgésique, réhydratation sous-cutanée. Le score clinique permettra également de définir un point limite précoce et, en conséquence, de réduire la souffrance de l'animal ; dès le point limite atteint, il sera procédé à une mise à mort.
Choix des espèces
Les infections liées à des biofilms touchent majoritairement les personnes légèrement ou fortement immunodéprimées et impliquent souvent des bactéries commensales comme Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus et Pseudomonas aeruginosa. Ainsi, les personnes âgées, atteintes d’une maladie sévère, immunodéprimées, opérées ou exposées à un dispositif invasif (sonde urinaire, cathéter vasculaire ou intubation/trachéotomie) ont un risque particulièrement élevé. Les infections liées à des biofilms représentent un sérieux problème de santé publique. Dans la recherche préclinique, les modèles murins permettent d’intégrer un grand nombre des caractéristiques de la pathologie humaine. En plus, l’ensemble des technologies d’imagerie pré-clinique est conçu pour des rongeurs de petite taille, principalement la souris. Adultes, 7 à 12 semaines, ayant ainsi un système immunitaire immunocompétent.
Atténuation des souvenirs aversifs éthologiques
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 8
Exposées sans contact à un rat prédateur ou à un congénère agressif, soumises à des chocs électriques aux pattes, à une contention prolongée, à une séance de nage ou à dix jours d'isolement, 1 660 souris et 8 rats seront tous tués, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère. Certaines subissent en plus jusqu'à trois chirurgies cérébrales, ou une ligature du nerf sciatique provoquant une douleur chronique pendant trente jours. Les huit rats ne sont pas étudiés, ils servent de stimulus de peur, et une souche de souris est choisie pour son agressivité. Le porteur affirme que les fonctions visées, mémoire et peur, rendent l'animal vivant "incontournable".
Objectifs
L’objectif de ce projet est d'étudier les circuits neuronaux sous-jacents à l’atténuation de souvenirs traumatiques. Cela est important parce que les expériences traumatisantes génèrent de souvenirs très intenses qui souvent dégénérer en e trouble de stress post-traumatique. Malgré la fréquence élevée de ce trouble, les traitements disponibles sont pas très efficaces, ce qui indique que c’est nécessaire de mieux comprendre les mécanismes neuronaux sous-jacents à l'atténuation de la mémoire traumatique. Dans cette étude on va étudier l’atténuation de souvenirs traumatiques induits par l'exposition à des menaces naturelles, comme l’exposition à un prédateur ou à un congénère agressif. Cela nous permettra d’identifier les réseaux de neurones et les mécanismes neurophysiologiques nécessaires au bon fonctionnement de ce phénomène d’atténuation. Ce travail pourra contribuer au développement de stratégies thérapeutiques pour soulager les individus affectés par le trouble de stress post-traumatique chez lesquels l’extinction des souvenirs traumatiques est déficitaire.
Bénéfices attendus
Cette étude aidera à comprendre comment le cerveau peut se remettre de souvenirs traumatisants et atténuer les fortes réponses émotives qui y sont associées. Ce qui est unique dans ce projet, c'est qu'il modélisera cela en utilisant les souvenirs naturels de peur des souris résultant d’une exposition à un prédateur ou à un congénère agressif. Cela modélise avec plus de précision que les études classiques la complexité des traumatismes rencontrés en clinique. Ce faisant, notre projet permettra d'étudier les déficiences neurales à l'origine des déficits d'extinction et, à terme, de développer des cibles pour une thérapie spécifique dirigée contre le syndrome de stress post- traumatique.
Procédures
Notre projet implique des chirurgies cérébrales (la procédure chirurgicale dure au maximum 45 minutes. Temps de récupération post-chirurgicale complète max 5 jours ; les souris subiront un maximum de trois interventions chirurgicales espacées d'au moins une semaine). Certains souris subiront aussi des stress physiques (stimulation électrique aux pattes provoquant la peur (3 min), ligature du nerf sciatique provoquant une douleur chronique (max 30 jours) et/ou psychologiques d’une durée de maximum 10 minutes (contention prolongée, exposition sans contact à un prédateur, exposition à un congénère agressif, séance de nage). Enfin certains animaux seront isolés pour maximum 10 jours.
Impact sur les animaux
- Extinction éthologique: Isolement (max 10 jours, modéré) + exposition sans contact à un Prédateur/exposition à un congénère agressif/exposition à un stimulation électrique 0,8 mA, 2 secondes, 3 fois (modéré)= total modéré - Extinction éthologique (modéré) + 1 chirurgie stéréotaxique (modéré) = total sévère - Extinction éthologique (modéré)+ 3 chirurgie stéréotaxique (modéré) = total sévère - Extinction éthologique (modéré) + contention prolongée (moderé)+ séance de nage (moderé) = total sévère - Extinction éthologique (modéré) + ligature du nerf sciatique provoquant une douleur chronique (sévère)= total sévère La méthode de génotypage et d'identification pour totes les souris est fait par poinçonnage auriculaire.
Devenir
La mise à mort est prévue pour tous les souris expérimentales afin de prélever les cerveaux pour l'analyse biologique. Les souris CD1 et les rats seront mises à mort à la fin de chaque procédure (ils ne peuvent pas être conservée d’une procédure à l’autre parce que le délai entre les procédures nécessaire pour analyse des données est trop long).
Remplacement
Du fait des du sujet de ce projet, qui est de comprendre de fonctionnes complexes du cerveaux comme la mémoire et la peur, l’utilisation d’animaux vivants reste incontournable. En effet, à l’heure actuelle, il n'existe pas de méthodes substitutives qui prévoit pas l’utilise d’animaux vivantes pour obtenir des données sur ces processus mentale, bien trop complexes pour envisager toute simulation informatique. Le modèle souris est idéal du fait de la proximité fonctionnelle entre son système nerveux central et celui de l’humain quant à ses capacités à créer des souvenirs émotionnels simples (auxquels nous nous intéressons, type conditionnement pavlovien) et de sa petite taille. Ceci explique également l’impossibilité d’utiliser des modèles animaux invertébrés, trop éloignés de l’humain pour raisonnablement étudier une réponse émotionnelle à un souvenir ainsi que trop éloignés dans la configuration du système nerveux central, critique à notre étude inter-régions.
Réduction
Nous allons utiliser le moins d'animaux possible tout en obtenant des résultats biologiquement et statistiquement significatifs pour notre projet. Nous utilisons des calculs statistiques pour déterminer combien d'animaux sont nécessaires, en nous basant sur des données déjà disponibles dans des études similaires. Toutes les procédures expérimentales ont été perfectionnées afin d’obtenir des taux de réussites les plus élevés possibles, par le biais par exemple : De la mise en place de techniques chirurgicales communes et du partage des connaissances de “savoir- faire”. D’une veille technologique et d’une régulière mise à jour des équipements. De l’utilisation d'animaux qui sont pas à corriger. Cela nous permet de produire le nombre exact d’animaux nécessaires aux procédures expérimentales sans avoir à éliminer les animaux superflus. Enfin, nous avons réalisé des études pilotes basées sur l'analogie avec la littérature qui ont permis d'estimer le nombre d'animaux nécessaires pour chaque expérimentation avec le logiciel G*Power en considérant un α = 0.05 et Puissance = 0.95 (la taille de l'effet a été calculée pour chaque type d’expérience).
Raffinement
Les tests comportementaux que nous proposons sont particulièrement sensibles au niveau de stress des souris. Nous portons donc une attention particulière au bien-être des souris à la fois dans les conditions d'hébergement (enrichissement des cages : maison, matériel de nidification, bâtonnet en bois à ronger)) et dans la conception des tests expérimentaux (réduction de la douleur et de l'angoisse infligée à son minimum nécessaire pour produire les comportements recherchés). Les protocoles de chirurgie utilisés répondent aux meilleurs standards de l’anesthésiologie et de la prise en charge de la douleur. L’hypothermie induite lors de ces protocoles est contrée par l’utilisation d’un tapis chauffant spécialement conçu. Les conditions de réveil sont particulièrement surveillées. Les animaux seront régulièrement manipulés afin de les familiariser aux expérimentateurs. Des points limites adaptés et précoces nous permettront également de réagir de manière anticipée à toute dégradation superflue du bien-être de nos animaux.
Choix des espèces
Les comportements que nous souhaitons étudier sont trop complexes pour justifier de l’utilisation d’espèces non mammifères (drosophile, poisson-zèbre, etc.). De même, les méthodes alternatives qui prevoiyent pas l’utilise d’animaux vivantes ne sont pas assez développées pour modéliser ni la mémoire, ni le fonctionnement du cerveau à si grande échelle. Par ailleurs, eu égard au nombre d’animaux requis, les rongeurs (et plus particulièrement les souris) s’imposent de par la facilité et la stabilité de leur élevage. La souris a également été préférée au rat pour deux principales raisons : -La littérature relative à la mémoire, incluant tous nos précédents travaux, est bien plus riche chez la souris que chez le rat. -Notre équipe est déjà formée sur la souris, notamment pour la réalisation des chirurgies. Ne pas changer de modèle nous permettra de conserver ce savoir-faire, et ainsi de ne pas sacrifier d’animaux supplémentaires pour adapter les chirurgies à un nouveau modèle animal. Enfin, la souris constitue un excellent modèle pour l’étude des conséquences du stress d’un point de vue physiologique, comportemental ou cellulaire. Les mécanismes moléculaires du stress ainsi que les propriétés neuronales de ces rongeurs au niveau des structures sous-corticales étudiées sont très proches de ceux du cerveau humain. Cela nous permettra de réaliser des études dont l’impact sera important pour la compréhension de l’atténuation des souvenirs aversifs, et ainsi de pouvoir mieux cibler les approches thérapeutiques. Dans cette étude, des rats vont également être utilisé. Ces rats sont utilisés comme stimulus aversif envers nos souris expérimentales et non directement comme sujets étudiés. Pour cette raison, le nombre de rats utilisés dans cette étude est extrêmement limité (
Etude d’un nouveau traitement contre les douleurs chroniques
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 624
Pour tester des candidats médicaments contre la douleur chronique, 3 835 souris et 624 rats sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère, tous tués à l'issue. Le porteur inflige des atteintes du nerf sciatique, une incision de la voûte plantaire ou la ligature d'un nerf lombaire, et précise qu'aucune médication antalgique systématique ne sera appliquée puisque la douleur constitue le paramètre étudié. Les animaux qui perdent plus de 15 % de leur poids, qui présentent une paralysie de la patte opérée ou qui se blessent entre eux sont tués sans délai. Aucun placement ni aucune mise en liberté n'est prévu, la mise à mort servant, selon lui, à ne pas prolonger la douleur provoquée.
Objectifs
Une douleur qui dure plus de trois mois est définie comme chronique et en tant que telle représente un des problèmes de santé publique les plus importants dans les pays développés. Les douleurs chroniques affectent environ 20% de la population adulte, et sont pour la plupart résistantes aux traitements thérapeutiques actuels. De plus, l'utilisation de la morphine, molécule de référence pour le traitement de la douleur, est limitée en raison de l'apparition d'effets secondaires et de phénomènes de tolérance. Nous avons démontré que l’activation d’un récepteur neuronale spécifique est nécessaire et suffisant pour générer expérimentalement une douleur neuropathique (douleur liées aux nerfs) chez les rongeurs. Plus important encore, nous avons montré que, lorsque l’état de douleur neuropathique était installé, l'inhibition de ce récepteur suffisait à annuler les symptômes douloureux. De plus, nos découvertes récentes étendent le champ d’application aux maladies douloureuses pouvant être traitées avec des opioïdes (épargne morphinique) et élargissent le champ d’application des inhibiteurs de ce récepteur aux douleurs inflammatoires (DI). Ces résultats ont été publiés et fait l’objet de plusieurs brevets. Dans ce projet, l'implication de ce récepteur, nouvelle cible innovante dans les douleurs chroniques, sera étudiée. De façon plus précise, les effets de nouveaux antidouleur, des inhibiteurs de ce récepteur, seront générés et explorés dans des modèles d'étude des différents types de douleurs chroniques.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but, dans un premier temps, de compléter nos connaissances sur l’intégration de l’information douloureuse et son maintien, ainsi que d’amener de nouvelles clés à la compréhension des mécanismes autour de la douleur chronique. Ce travail, mené depuis maintenant plusieurs années, nous a déjà permis de mettre en avant un acteur essentiel dans les douleurs neuropathiques périphériques, mais surtout une cible potentielle pour de nouveaux composés thérapeutique. Le manque évident de traitement aux douleurs neuropathiques agit comme motivateur principal à ces travaux de recherche. Au vue de l’avancée de cet étude, il convient maintenant de développer nos composés antagonistes (bloqueur) au récepteur découvert et de tester leur efficacité sur les différents modèles de douleur (à la fois neuropathique et inflammatoire) dans le but d’avancer des candidats pré-cliniques pour le traitement des douleurs chroniques et réaliser ensuite des études cliniques chez l’homme.
Procédures
Les animaux pourront être soumis à 5 types de procédures chirurgicales différentes, induisant des douleurs neuropathiques ou inflammatoires. Les trois premières induisent des douleurs neuropathiques chez la souris et portent atteinte au nerf sciatique de manières différentes en fonction de la procédure, ces interventions durent entre 5 et 10 minutes et se font sur animaux anesthésiés par inhalation. La quatrième se fait également sur la souris et induit une douleur inflammatoire par une simple incision de la voûte plantaire, cette intervention dure 5 minutes et se fait sur animaux anesthésiés par inhalation. La cinquième se fait sur le rat et induit une douleur neuropathique par ligation (léger nœud) d'un nerf partant de la moelle épinière au niveau lombaire, cette intervention dure entre 15 et 20 minutes et se fait sur animaux anesthésiés par inhalation. Les prèlevements submandibulaires et de la veine caudale se feront sur animaux endormis et anesthésiés et durent approximativement 2 à 3 minutes.
Impact sur les animaux
La douleur étant le paramètre étudié, aucune médication antalgique ou analgésique systématique ne sera appliquée. D’autre part, des tests de toxicologie in vitro sont systématiquement réalisés sur nos composés avant tout test sur l’animal pour assurer la sûreté de nos produits. Aucun des composés déjà testés n’ont montré de problème de toxicologie, ni l’apparition d’effets secondaires sur l’animal. De ce fait, la douleur induite par nos différents modèles sera la seule nuisance pour les animaux. En cas de troubles comportementaux (perte de poids rapide supérieure à 15%, paralysie de la patte opérée, pilo-érection) suite à la chirurgie, les animaux seront euthanasiés sans délai afin d’éviter la mort par inanition. En cas de lésions dues à des attaques entre les animaux, ceux-ci seront séparés et/ou le milieu enrichi par ajout d’igloo. Si les attaques continuent et/ou les lésions sont trop importantes ou douloureuses pour l’animal, celui-ci sera euthanasié sans délai.
Devenir
La douleur chronique étant étudiée, et donc induite, chez ces animaux, le devenir de ceux-ci en fin de procédure expérimentale sera systématiquement la mise à mort afin de ne pas prolonger inutilement la douleur. Aucun placement ou mise en liberté n’est donc prévu pour ce projet.
Remplacement
A ce jour, il n'y a pas de modèles non animaux permettant d'étudier les mécanismes du système nerveux impliqués dans la transition entre douleur aiguë (court terme) et douleur chronique (long terme). Les effets pharmacologiques des molécules utilisées sur la chronicisation douloureuse, l'analgésie et l'état émotionnel, doivent être évalués au travers de systèmes intégrés par différents tests comportementaux, qui viennent appuyer et confirmer les données obtenues par des approches cellulaires. Il est donc indispensable d'avoir recours à des investigations sur l'animal afin de proposer des alternatives thérapeutiques pour une amélioration de la prise en charge de la douleur. La souris et le rat étant des mammifères dont la physiopathologie est proche de l'Homme, ces espèces seront utilisées dans le cadre du projet.
Réduction
Une stratégie par étape/boucle sera mise en place afin de minimiser le nombre d’animaux utilisés de manière rationnelle et efficace pour l’obtention de 2 candidats médicaments. Ainsi tous les antagonistes générés ne seront pas testés sur chacune des procédures, seulement les deux candidats médicaments devront être testés sur l’ensemble des procédures, ce qui réduit drastiquement le nombre d’animaux utilisés. Le nombre de rats et de souris par lot a été déterminé sur la base d’expérimentations précédentes réalisées. Ce nombre a été confirmé par le calcul de puissance via une analyse a priori à l’aide d’un logiciel. Le calcul de puissance à 80% indique un nombre de 8 rats par groupe pour observer une différence de 20% entre les animaux contrôles et les animaux traités. Pour les souris, le calcul de puissance à 80% indique un nombre de 13 souris par groupe pour observer une différence de 20% entre les animaux contrôles et les animaux traités.
Raffinement
Précédent chaque expérimentation, une habituation de minimum une semaine est réalisée au cours de laquelle les animaux sont placés dans la pièce expérimentale pendant minimum 1h et exposés aux différents tests sans application du stimulus nociceptif. Cela permet aux animaux de s’habituer à l’environnement et à l'expérimentateur limitant ainsi l’impact du stress (angoisse) lié à la procédure expérimentale. En outre, les rats seront soumis à une habituation supplémentaire d’une semaine au cours de laquelle l’expérimentateur manipulera chaque rat individuellement. Cette période d’habituation leur permettra de s’acclimater uniquement à l’expérimentateur et aux différentes contentions réalisées par celui-ci durant l’expérimentation. Ces périodes d’habituation sont fondamentales afin d’assurer une reproductibilité des tests nociceptifs et donc de limiter l’hétérogénéité des animaux, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Par ailleurs, afin de limiter la douleur chez les animaux, toute expérience est limitée dans le temps (maximum 1 mois après la lésion). Afin de limiter la douleur pendant les procédures expérimentales, tout acte opératoire sera réalisé sous anesthésie gazeuse. Par ailleurs, les animaux sont gardés en cage collective (10 souris/cage) dans une animalerie dans laquelle la température et l'hygrométrie sont contrôlées. Les locaux sont en légère surpression, les cages possèdent des couvercles filtrants, et les animaux bénéficient d'un enrichissement du milieu (copeaux, igloos en plastique, bâtonnets de cellulose). Un suivi de l’animal sera également mis en place afin de déterminer les points limites les plus précoces. Une fois par semaine seront relevés : le poids de l’animal, l’aspect de son pelage, ses comportements ainsi que sa vitesse de respiration. Un score pré-établi associé à chacun de ces paramètres nous permettra de determiner si la fréquence de ce suivi devra être augmenté ou si l’animal devra être euthanasié afin d’éviter des souffrances trop importantes.
Choix des espèces
La souris et le rat étant des mammifères dont la physiopathologie est proche de l'Homme, ces espèces seront utilisées dans le cadre du projet. Les souris utilisées seront adultes et auront entre 6 et 12 semaines afin que les animaux ne soient ni en croissance ni en phase de vieillissement. Les rats seront utilisés entre 5 et 6 semaines pour les mêmes raisons citées ci-dessus.
Etude de la formation de la cardiomyopathie atrial associée à la réponse immuno-inflammatoire dans le modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Rats : 70
Rendues obèses par un régime enrichi en graisse pendant un à quatre mois, opérées du cœur ou irradiées dix minutes sans anesthésie, 1 770 souris et 70 rats seront tous tués, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère. Le porteur décrit des risques d'arrêt cardio-respiratoire pendant la chirurgie, des arrêts cardiaques liés à l'insuffisance cardiaque provoquée, et un affaiblissement général après irradiation par perte du système immunitaire. Les tests métaboliques imposent huit prélèvements de sang à la queue en deux heures sur des animaux vigiles. Travaillant à l'échelle de l'organisme, le porteur juge "nécessaire" un modèle animal proche de la pathologie visée.
Objectifs
La fibrillation atriale est l’arythmie la plus fréquente en pratique clinique. Sa prévalence augmente avec le vieillissement de la population faisant craindre une épidémie dans les 50 prochaines années. La cardiomyopathie atriale définie une déformation du myocarde atrial, un remodelage du tissu et une désorganisation de la hiérarchie du tissu. A l’échelle fonctionnelle, les conductions électriques sont anormales et favorisent les troubles du rythme (arythmie). Récemment, il a été décrit une accumulation de tissu gras à l'épicarde de l'oreillette. Les maladies métaboliques comme l’obésité sont des facteurs de risques de la fibrillation atriale, dans lesquels ce tissu gras épicardique semble dégénérer et libérer des facteurs qui diffusent librement dans le myocarde. Une infiltration de cellules immunes est observée, perturbant l’environnement homéostasique. Quiescent dans le cœur sain, l’épicarde atrial est réactivé en réponse à un stress, et devient une source de progéniteurs capables de se différencier en myofibroblastes et en adipocytes. Un stress de l'environnement réactive les progéniteurs et induit une transformation de ces cellules en adipocytes qui composent le tissu gras. Aujourd'hui, rien n’est connu sur les échanges et l'impact des cellules inflammatoires avec les progéniteurs. Les objectifs sont d'identifier les cellules immunitaires infiltrées et de comprendre leur rôle.
Bénéfices attendus
Les projets portant sur la compréhension du changement de structure et de fonction de l'oreillette dans le contexte de l'obésité et de l'insuffisance cardiaque permettront de cibler le rôle de l'inflammation et ses conséquences dans le développement précoce des troubles du rythme atrial.
Procédures
Toutes les souris des lignées seront prélevées d'un petit bout de queue. La biopsie est déposée dans un tube. Une première partie des animaux (souris uniquement) sera mise sous régime enrichie en graisse pendant 1, 2 ou 4 mois. Nous réaliserons des tests métaboliques pour tester l'évolution de syndromes métaboliques impliquant une injection intrapéritonéale unique ou un gavage unique (quelques secondes sur animal vigile) suivi de la prise d'une goutte de sang répétée 8 fois en 2 heures au niveau de la queue (quelques secondes sur animal vigile). Des mesures cardiaques seront effectuées par un monitoring adapté (échocardiographie) qui dure 5 minutes par animal et des tests de troubles de rythme qui dure 5 minutes par animal seront aussi réalisés. Une seconde partie des animaux (souris et rats) subira une chirurgie cardiaque unique effectuée sous anesthésie générale et locale, avec une prise en charge analgésique multimodale. L'intervention est de 20 minutes. Des mesures cardiaques sous anesthésie seront effectuées par un monitoring adapté (échocardiographie) qui dure 5minutes par animal et des tests de troubles de rythme qui dure 5 minutes par animal seront aussi réalisés. Une troisième partie des animaux (souris uniquement) sera irradiée durant 10 minutes par animal non anesthésié. Le lendemain, elles sont transplantées avec des cellules issues de la moelle osseuse de souris donneuses par injection intraveineuse sous anesthésie. Elles seront ensuite mises sous régime enrichi en graisse pendant 1, 2 et 4 mois. A terme du régime, nous réaliserons des tests métaboliques pour tester l'évolution de syndromes métaboliques impliquant une injection intrapéritonéale unique ou un gavage unique (quelques secondes sur animal vigile) suivi de la prise d'une goutte de sang répétée 8 fois en 2 heures au niveau de la queue (quelques secondes sur animal vigile). Des mesures cardiaques sous anesthésie seront effectuées par un monitoring adapté (échocardiographie) qui dure 5 minutes par animal et des tests de troubles de rythme qui dure 5 minutes par animal seront aussi réalisés. En fin de période des procédures d'obésité (2 et 4 mois de régime), ou de chirurgie cardiaque (7jours, 1mois et 2 mois), l’ensemble des animaux seront anesthésiés, un prélèvement sanguin sera réalisé sous anesthésie immédiatement suivi d’une euthanasie selon une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
L'utilisation de lignées transgéniques nécessite l’identification génétique des animaux réalisée par un seul prélèvement à l’extrémité́ caudale (1-2mm) ce qui peut être source de stress et d’une douleur de courte durée. L’utilisation de régime obésogène provoque une prise de poids pouvant conduire à une obésité associée à diverses pathologies cardio-métaboliques. Les challenge métaboliques induisent un stress et une douleur de courte durée en raison des administrations et des quelques prélèvements d’une goutte de sang ainsi que des effets physiologiques tels qu’une hypo- ou une hyperglycémie durant quelques heures. La chirurgie peut conduire à des risques anesthésiques incluant : détresse respiratoire, hypothermie, arrêt cardio-respiratoire. Elle peut également engendrer des douleurs post-opératoires, des difficultés de déplacements et à s'alimenter. De plus, l'insuffisance cardiaque induite par la chirurgie peut conduire dans certains cas à des arrêts cardiaques. L'irradiation conduit à une perte du système immunitaire et donc à un affaiblissement général en plus d’un risque infectieux accru.
Devenir
La totalité des animaux seront euthanasiés à la fin des actes pour réalisation des prélèvements et analyses.
Remplacement
Les projets ont pour but de comprendre l’influence du métabolisme et de l'immunité sur l’activité cardiaque et le remodelage atrial. Comme nous travaillons sur les modifications à l’échelle de l’organisme, il est nécessaire d’utiliser un modèle expérimental proche de la pathologie ciblée dans notre étude. Toutefois, des biopsies de tissu provenant d'études antérieures seront utilisées pour ne pas reproduire les expériences. Des lignées de cellules seront aussi utilisées.
Réduction
La taille des effectifs est établie avec un calcul de puissance en amont et par la suite des analyses seront effectuées en plus du nombre d'animaux. Les lots d'animaux d'expérimentation sont 1770 souris et 70 rats ce qui fait la somme totale de 1840 animaux.
Raffinement
Afin de réduire le stress et l’anxiété, les animaux sont en cage par 5 avec du matériel d'enrichissement. Les souris rendues obèses seront surveillée quotidiennement, des tests de glycémie seront réalisés pour surveiller l'obésité et le diabète. La prise de poids est effectuée de manière hebdomadaire. Les points limites sont évalués par un personnel compétent, notamment sur l'aspect du pelage, le comportement et la mobilité. Dans le projet de l’insuffisance cardiaque, les animaux sont en cage par 5. Le jour de la chirurgie, ils sont anesthésiés puis rasés sur le thorax et désinfectés avec un antiseptique dermique. Une dose d'analgésique sera injectée en sous cutané chez l’animal 30 minutes avant la procédure chirurgicale et 10 minutes avant la fin de la procédure. De plus, une prise en charge de la douleur les 3 jours suivants sera également assurée au cours de la 1ère semaine, durant laquelle les animaux seront aussi nourris avec de la bouillie et l'apport d'eau sera facilité. Les souris seront surveillées quotidiennement et la prise de poids sera évaluée de manière hebdomadaire. Les points limites seront évalués quotidiennement par un personnel compétent et formé. Le comportement, la mobilité, la prise de poids, l'aspect du visage, l'aspect de la cicatrice seront des critères évalués quotidiennement par un scoring. Dans le projet de l’irradiation, les souris seront surveillées quotidiennement, une attention particulière sera effectuée sur la consommation de l’eau dans lequel un antibiotique sera ajouté pour contrôler la fragilité à l’infection. Une alimentation directement dans la cage pour faciliter l’hydratation en post-irradiation avec de la nourriture molle sera employée.
Choix des espèces
La souris est l’animal le plus approprié pour nos études concernant la réponse systémique dans le développement des arythmies cardiaques. Il s'agit du seul modèle dans lequel ont été générées des lignées déficientes pour l’expression de gènes d'intérêt. La souris permet de garantir l’homogénéité des résultats et la possibilité de surveiller le développement des complications cardiaques dans un espace de temps raisonnable. La souris est l'espèce pour laquelle la technologie de transgénèse est la plus fiable et la mieux établie. Le rat est l'animal le plus approprié pour nos études concernant l'isolement de cellules progénitrices de l"épicarde. Le modèle d'insuffisance cardiaque permet d'augmentere le nombre de cellules progénitrices in situ, de les isoler et de travailler par la suite in vitro. Souris et rats adultes de 8 semaines à 12 semaines d’âge. Ce stade de développement corrobore avec le début de l’âge adulte, un stade qui correspond au début du développement des maladies cardiovasculaires chez l’homme.
Elevage avec identification et génotypage invasifs
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système urogénital
Rats : 500
Réutilisés pour la plupart dans d'autres procédures, 24 500 souris et 500 rats subissent entre 7 et 12 jours de vie, sans anesthésie, un tatouage des doigts suivi d'une biopsie de la queue, dans des procédures d'un niveau de souffrance déclaré léger. Le porteur précise que les nouveau-nés dont le génotype ne convient à aucun projet sont tués dès le sevrage, et que d'autres sont tués pour prélever des organes. Il compte l'absence d'anesthésie parmi les avantages de ces deux gestes, et signale comme effets indésirables rares une hémorragie de la queue ou le rejet des petits par leur mère. Les essais de génotypage à partir de follicules pileux n'étant pas concluants, il conclut qu'il est "indispensable" de recourir à la biopsie caudale.
Objectifs
L'objectif de cette demande est d'identifier et de génotyper l'ensemble des animaux génétiquement altérés produits par l'Etablissement Utilisateur (EU) pour répondre aux besoins des équipes de recherche. Il s'agit d'un double geste invasif consistant en une identification par tatouage digital selon un code de numérotation défini suivi d'une biopsie de queue pour le génotypage réalisés sur un animal de 7 à 12 jours. Pour les animaux adultes, seule une biopsie d'oreille est réalisée. Cette identification et ce génotypage se justifient par la nécessité de sélectionner les animaux d'intérêt pour l'expérimentation, sélectionner les géniteurs permettant l'amplification et l'entretien des colonies, sélectionner les animaux pour la formation, le maintien des compétences et les prélèvements d'organes ou de tissus pour des études ex vivo. Les animaux dont les génotypes ne conviennent pas pour les projets expérimentaux soumis et n'étant pas utilisés pour les prélèvements post-mortem, pour les activités d'élevage ou encore pour la formation ne seront pas conservés.
Bénéfices attendus
La procédure d'identification et de génotypage est nécessaire à la sélection d'animaux d'intérêt dans les projets de recherche autorisés. L'identification par tatouage permet d'identifier individuellement les animaux de manière permanente. Le tatouage permet également d'éviter d'avoir recours à l'anesthésie. Le génotypage par biopsie de l'extrémité de la queue permet d'obtenir des résultats fiables grâce à une faible quantité de matériel génétique et de minimiser les risques de contaminations des échantillons. Il permet également de ne pas recourir à l'anesthésie des animaux.
Procédures
Prélèvement sur animal vigile Tatouage et prélèvement pour génotypage: 1 seule procédure par animal n'exédant pas 2 minutes
Impact sur les animaux
La procédure d'identification et de génotypage consiste en deux actes succéssifs. Ces deux gestes induisent une douleur légère de courte durée. L'animal est maintenu en contention pendant ces deux actes ce qui est une source de stress. Celle-ci sera minimisée au maximum par l'expérience du zootechnicien réalisant les gestes. Dans de très rares cas, certains effets indésirables supplémentaires peuvent survenir : une légère hémorragie à l'extrémité de la queue ou le rejet des nouveuax-nés par la mère.
Devenir
Tous les animaux sont gardés en vie à l'issue de la procédure. Leur devenir différe ensuite selon les résultats du génotypage : 1) Ils sont sélectionnés pour un projet, pour de la formation ou pour le maintien des compétences 2) Ils sont conservés pour l'entretien des colonies 3) Ils sont mis à mort pour des prélèvements post-mortem 4) Ils sont mis à mort dès le sevrage si leurs caractéristiques génétiques ne répondent pas aux besoins du projet expérimental et si aucune autre utilisation n'est possible.
Remplacement
Des essais sont en cours au niveau de la plateforme de génotypage afin de réaliser les génotypages à partir de prélèvements non invasifs de follicules pileux. Mais à ce jour, les résultats ne sont pas concluants et un doute sur des résultats conduirait à la nécessité de procéder à un nouveau prélèvement. En effet, une erreur de génotypage se traduirait par la mise en accouplement d'animaux n'ayant pas les caractéristiques attendues. Cela impliquerait : - une augmentation du nombre d'animaux produits inutilement - la naissance d'animaux avec un phénotype potentiellemnt délétère - l'utilisation d'animaux génétiquement sans intérêt dans des projets expérimentaux induisant des résultats erronés et non exploitables (si l'erreur n'est pas détectée précocement). Il est donc indispensable de recourir à une méthode de génotypage fiable. Or il n'existe pas actuellement de méthode de prélèvement non invasive aussi performante que la biopsie de l'extémité de la queue.
Réduction
A ce jour, nous ne disposons pas d'autres méthodes aussi efficaces nous permettant de sélectionner des animaux génétiquement altérés. Le responsable de l'EU établit un plan d'élevage en amont en concertation avec le/les porteur(s) de projet afin de réduire autant que possible le nombre d'animaux générés et donc d'animaux identifiés et génotypés. En outre, nous favorisons l'utilisation des animaux avec un génotype sans intérêt dans d'autres projets ou pour des formations afin de ne pas élever ces animaux à ces seules fins et de réduire le nombre global d'animaux produits dns l'EU.
Raffinement
Des points limites précoses sont mis en place. De plus, les actes d'identification et de prélèvement pour génotypage sont réalisés par du personnel expérimenté, formé par tutorat. La parfaite maîtrise du geste par des agents qualifiés permet de réduire l'inconfort et le stress ressentis par l'animal. Ces identifications et biopsies sont réalisées avec du matériel approprié permettant un geste rapide et précis dans le respect des règles d'asepsie établies dans l'EU. Par ailleurs, la procédure est réalisée dans une salle d'expérimentation calme. Les cages y sont amenées les unes après les autres afin de réduire autant que possible le stress des animaux. Enfin, dès que la procédure est terminée, les nouveaux-nés sont remis en présence de leur mère.
Choix des espèces
La souris et le rat sont des espèces de choix pour les projets ayant cours dans l'EU. Ces espèces permettent d'obtenir aisément des lignées génétiquement altérées par différentes méthodes et donc créer des modèles murins de pathologies bien caractérisées. La très grande majorité des animaux sont identifiés et prélevés entre 7 et 12 jours. A cet âge, les animaux sont aisément manipulables, le cartilage est souple et les groupes sociaux constitués sont stables. Nous éviterons autant que possible les biopsies sur animal adulte.
Étude de la synthèse des protéines neuronales chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
680 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une biopsie de la queue et deux à quatre injections intrapéritonéales avant analyse post-mortem, pour vérifier des invalidations géniques touchant la fabrication des protéines de surface des neurones. Le porteur qualifie ce travail d'étude pilote portant sur un nombre "relativement restreint" d'animaux, et l'un de ses objectifs affichés consiste à vérifier que ces invalidations ne provoquent pas de phénotype dommageable. La description des gestes infligés tient en une ligne, et les retombées annoncées pour les maladies humaines restent lointaines.
Objectifs
Le développement et la fonction des neurones requiert la genèse de nombreuses protéines de surface qui permettent aux neurones de percevoir et d’interagir avec leur environnement. Nos travaux précédents montrent que des étapes spécifiques de la maturation des protéines ne sont pas nécessaires pour la production de protéines de surface fonctionnelles par les neurones, contrastant avec d’autres types cellulaires où ces étapes sont requises. Les mécanismes cellulaires sous-jaccents sont cependant encore mal caractérisés. Des études étendues de ces processus ont été réalisées dans des modèles de culture cellulaire à l’aide d’agents pharmacologiques. Nous souhaitons maintenant généraliser ces résultats en utilisant des modèles d’invalidation génique chez la souris. Notre projet a pour but de valider cette approche par des analyses post mortem et de vérifier l’absence de phénotypes dommageables provoqués par ces invalidations géniques. Ces étapes de maturation sont modulées dans de nombreuses maladies neurologiques ou psychatriques. Ce projet de recherche fondamentalle permettra de mieux comprendre les bases cellulaires de ces variations, contribuant ainsi in fine à l’identification de nouveaux biomarqueurs ou de nouvelles cibles thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Les expériences réalisées nous permettront de préciser le rôle d’étapes importantes de la synthèse des protéines de surface des neurones, un mécanisme cellulaire fondamental, apportant des informations manquantes sur les causes responsables des dérégulations de ce processus qui sont observées dans de nombreuses maladies humaines sévères et actuellement non ou difficilement traitables.
Procédures
injections intrapéritonéales (entre 2 et 4) ou sous-cutanées (1) (gestes de 1-2 minutes)
Impact sur les animaux
Douleurs de quelques secondes lors des injections IP et de la biopsie de la queue.
Devenir
Les expériences prévues impliquent toutes une analyze post mortem des échantillons.
Remplacement
Les études qui seront réalisées font suite à des études étendues de ces processus dans des systèmes de culture cellulaire. Il est maintenant essentiel d’étudier ces mécanismes in vivo dans des neurones intégrés dans leur environnement tissulaire complexe pour étudier plus avant leur rôle physiopathologique.
Réduction
Nous réalisons ici une étude pilote sur un nombre relativement restreint d’animaux qui nous permettrons de tester la faisabilité d’expériences projetées dans des modèles de neuropathologies. Le nombre de souris requis a été estimé sur la base de nos travaux précédents et d’études comparables pour avoir des résultats statistiquement valides après analyse a posteriori.
Raffinement
Les résultats de cette étude pilote nous permettront d’optimiser nos procédures pour des analyses futures plus étendues. Les souris seront élevées en groupes sociaux dans des cages comprenant du matériel de nidification. Un personnel formé au bien-être animal surveille les animaux tous les jours. L’apparition de signes de stress ou de douleur sera attentivement suivie et la poursuite des expériences déterminées en fonction d’une évaluation régulière de points limites appropriés. Des anesthésiques et analgésiques seront utilisés pour prévenir la douleur des animaux.
Choix des espèces
La souris a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier la physiologie des mammifères dans une population homogène d’animaux. Les souris présentent un système nerveux suffisamment développé pour permettre une extrapolation des résultats à l’espèce humaine. Une autre raison pour utiliser la souris est la possibilité de manipuler de types précis de cellules chez des animaux transgéniques. Les animaux seront utilisés entre 2 semaines (stade le plus approprié pour le genotypage) et 6 mois de vie (stade suffisant pour le suivi longitudinal efficace de nos expériences avec des souris adultes).
Effet de l’enrichissement de l’environnement et de l’activité physique sur une maladie du cerveau EU1/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour mesurer les effets de l'enrichissement du milieu et de l'exercice sur un modèle murin de maladie d'Alzheimer, 480 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées pour prélèvements post-mortem. L'étude des bienfaits de l'environnement passe par un isolement en cage individuelle de trois mois pour 240 d'entre elles, et par 33 jours d'isolement pour les tests comportementaux, que le porteur reconnaît générateurs de stress. Un de ces tests place les souris dans une eau à 22 °C quatre fois par jour pendant six jours, avec risque d'hypothermie transitoire. Le porteur affirme qu'aucune alternative cellulaire ne convient et que seul l'animal entier permet ce travail.
Objectifs
L’environnement, tel que l’augmentation des activités sociales, de la nouveauté et de l’activité physique, influence positivement l’expression des gènes nécessaires à la plasticité neuronale dans le cerveau. Cela est possible grâce à des mécanismes appelés épigénétiques, c’est à dire qu’ils permettent l’adaptation des programmes génétiques. L’objectif de ce projet vise à établir ces régulations génétiques/épigénétiques à l’échelle de tout le génome, c’est à dire de doser tous les gènes qui seront changés par les conditions d’hébergement, et leur régulation au sein même du génome, ainsi que ceux qui seront relargués dans le sang. Pour ce faire, nous utilisons un modèle animal (souris) de maladie du cerveau. Une fois les transcrits identifiés dans le sang, ils pourraient servir de biomarqueurs pour faire valoir de l’efficacité d’un hébergement enrichi (environnement ou exercice physique). De plus, ces études seront menées de façon cellule-spécifique (cellules neuronales et non neuronales) car toutes les cellules ne répondent pas de la même façon à l’environnement. Ce projet questionne les mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents aux effets bénéfiques de ces changements d’environnement, leur efficacité au niveau cognitif (évaluations comportementales) et les modifications structurelles et fonctionnelles qu’ils induisent sur le cerveau (imagerie). Le projet sera mené sur des souris mâles et des souris femelles.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice attendu de ces études est l'obtention de données claires démontrant si des (et quelles) modifications épigénétiques et programmes génétiques sous-tendent les effets bénéfiques de l’environnement enrichi et de l’exercice physique dans un modèle de maladie du cerveau aussi répandu que la maladie d’Alzheimer. De plus, cette étude apportera des réponses concrètes sur les mécanismes d’action impactés par l’environnement et l’exercice sur le plan comportemental, cellulaire et moléculaire : formation de la mémoire à long terme dans l’hippocampe et le cortex frontal, transcription des gènes dans l’hippocampe, formation d’épine dendritiques dans l’hippocampe, impact sur les différentes structures cérébrales. En apportant des bases mécanistiques, ces études permettront d’étayer les connaissances plus fondamentales de l’effet bénéfique de l’environnement et leur implication en santé humaine. Ces études apporteront des bénéfices en santé humaine car elles dévoileront des pistes et des preuves de concept pour la mise en place de stratégies de prévention. En fournissant des informations sur les mécanismes moléculaires/cellulaires, dépendants du sexe et de l'âge, qui sous-tendent les interventions non pharmacologiques telles que l'environnement enrichi et l’exercice physqiue dans les principales régions cérébrales affectées par la maladie d’Alzheimer, nos données offriront de nouvelles opportunités pour la personnalisation de la médecine et leur mise en place aux stades les plus précoces. Ce projet devrait in fine permettre un traçage biologique (dans le sang) visant à utiliser des stratégies thérapeutiques nouvelles, ou combinatoires soutenant des stratégies non pharmacologiques (épi-médicaments ou thérapies basées sur l'ARN). Ces études permettront aussi de mieux comprendre la maladie d’Alzheimer, son développement et sa progression dans les modèles animaux, qui pourront être ensuite rapportés/étudiés chez l’Homme. Enfin, ce projet comprend les analyses conjointes sur les souris mâles et femelles. Les taux de prévalence de la maladie d'Alzheimer varient en fonction de l'âge mais aussi du sexe, les femmes représentant deux tiers des patients atteints. En apportant une analyse complète (cognitif, moléculaire, imagerie cérébrale) des différences entre mâles et femelles, ce projet apportera donc un bénéfice sur la compréhension de mécanismes pouvant être spécifiquement liés au sexe.
Procédures
240 animaux vigiles seront hébergés en cage isolée avec dispositif de nidification pendant 3 mois (de 6 à 9 mois), 120 bénéficieront d’une roue d’activité sur laquelle ils pourront tourner, cette roue sera bloquée pour les 120 autres animaux. Comportement réalisé sur 160 animaux vigiles sur une période de 33 jours/animal, période durant laquelle les animaux sont hébergés en cage individuelle pour tester différents aspects comportementaux et mnésiques (en moyenne 15 minutes par jour) sur 13 jours environ avec des phases de repos de 3 jours entre les tests. Les souris transgéniques modèle de maladie développent des déficits mnésiques à l’âge de 9 mois.
Impact sur les animaux
L’isolement des congénères nécessaire pendant les tests comportementaux (33 jours) et pendant l’hébergement en cage d’exercice, ainsi que et leurs contrôles (3 mois) peut générer un stress. Dans un des tests comportementaux, les animaux sont placés dans l’eau à 22°C pendant un temps inférieur à une minute (4 fois/jour pendant 6 jours), ce qui peut produire un stress thermique ainsi qu’une hypothermie transitoire. Les études de comportement pourront induire du stress aux animaux.
Devenir
Tous les animaux (480) seront mis à mort à l’issue de chaque procédure pour prélèvements et analyses post-mortem.
Remplacement
Dans la mesure où nos travaux portent sur les caractérisations comportementales et moléculaires suite à un changement des conditions environnementales (hébergement spécifique), il n’est pas possible de recourir à un autre type de modèle d’étude qu’à celui de l’animal entier. Nous ne pouvons pas utiliser d’alternative cellulaire. Notons que les modèles murins (souris) récapitulent les symptômes majeurs de la maladie (déficit de mémoire) et restent ainsi des outils uniques pour l'étude des mécanismes physiopathologiques, la validation de cibles thérapeutiques et la réalisation de tests précliniques.
Réduction
Nous avons réduit au strict nécessaire le nombre d’animaux pour permettre des analyses statistiques sur des groupes incluant mâles et femelles, soit 20 souris/groupe (10 mâles et 10 femelles) pour le comportement et l’imagerie cérébrale, et 6 souris/groupe (soit 3 mâles et 3 femelles) ainsi que 4 souris/groupe (soit 2 mâles et 2 femelles) pour les approches moléculaires. L’efficacité de chaque type d’hébergement sera effectuée à l’aide de tests statistiques adaptés. Les calculs fait tiennent compte de la variabilité interindividuelle. Ainsi, pour toutes nos analyses, nous utiliserons à la fois des animaux mâles et femelles dans nos expériences de manière à ne pas biaiser nos résultats, et les sexe ratios seront conservés entre les différents groupes.
Raffinement
Pour appliquer le principe de raffinement, un enrichissement environnemental est apporté dans les cages standards ainsi que dans les cages à roue : dispositif de nidification (certifié contact alimentaire) chaque semaine. Les changes seront opérés par les animaliers à l’aide de tunnels (polycarbonate transparent), permettant de réduire le stress des animaux, notamment efficace chez les souris (raffinement d’hébergement). Dans le cas d’hébergement en cage isolé (cages à roue et comportement), plusieurs cages (3 au minimum) seront maintenues côte à côte sur les rayonnages des racks de stabulation. Des points limites prédictifs sont mis en place pour limiter la souffrance : les souris sont observées lors de la visite journalière, et une surveillance plus détaillée des souris se fait tous les 15 jours (observation visuelle de l’aspect général, posture). Les souris sont habituées à la manipulation par l’expérimentateur pour réduire le stress lié à la manipulation lors des tests comportementaux. Les animaux sont testés dès le début de l’apparition des déficiences mnésiques afin de réduire le temps d’hébergement des animaux en animalerie. Les procédures incluant une perfusion sur cœur battant sous anesthésie profonde ou un prélèvement sanguin terminal sont réalisées sous anethésie additionnée d’une couverture analgésique locale. Pendant la semaine qui suit, le suivi quotidien est renforcé.
Choix des espèces
Le modèle rongeur représente une alternative de choix pour la modélisation préclinique des maladies du cerveau ayant une origine génétique. En effet, les maladies du cerveau que nous étudions dans ce projet apparaissent à l’âge adulte (40-50 ans) lorsque ce sont des formes génétiques. Elles apparaissent plus tardivement, quand leur origine n’est pas connue, le vieillissement étant un facteur de risque majeur de ces pathologies. Ainsi, les animaux étudiés seront testés à l'âge de 9 mois, nos études antérieures ayant montré que cela correspond au moment où les premiers signes de déficits mnésiques apparaissent dans ce modèle. De plus, ces modèles permettent de répondre à la question posée car les souris possèdent des structures neuro-anatomiques comparables à celles du cerveau humain.
Effets d’un médicament anti-rejet de greffe sur la sensibilité colique
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à sévères. Elles reçoivent un immunosuppresseur par sonde orale à sept reprises, sont pesées dix-sept fois, puis subissent un test de distension colorectale de 40 minutes avant d'être tuées pour prélèvement d'organes. Le porteur annonce comme effets attendus une perte de poids, de la diarrhée, du sang dans les selles et des douleurs digestives, l'objectif étant justement de provoquer ces troubles pour mesurer la sensibilité du colon. Il indique que les études in vitro ne reproduisent pas la complexité du tube digestif et des tissus qui l'entourent.
Objectifs
La transplantation d’organe est un traitement de choix pour certaines pathologies chroniques. La greffe améliore la qualité de vie et la survie des patients. Ces dernières années, l’augmentation de la survie du greffon est attribuée à l’utilisation des traitements immunosuppresseurs afin d'éviter tout rejet. Cependant l'utilisation des immunosuppresseurs peut provoquer de nombreux effets indésirables. Une meilleure gestion de ces effets pourrait contribuer à l’amélioration de la qualité de vie des transplantés. L'acide mycophénolique (MPA) est l'un des médicaments immunosuppresseurs les plus utilisés dans les transplantations d'organes solides, comme le rein ou le foie. Le traitement au MPA est associé à des effets indésirables, parmi lesquels les troubles gastro-intestinaux constituent une préoccupation majeure. En effet, plus de 30 % des patients présentent des effets indésirables gastro-intestinaux. La seule option thérapeutique actuelle consiste en une réduction de la dose ou de la fréquence d'administration, ou à un remplacement par d’autres molécules moins efficaces, ce qui augmente le risque de rejet de greffe. Le MPA est responsable d’altérations du microbiote intestinal, appelées dysbiose. Le microbiote intestinal, qui est constitué de microorganismes comme des bactéries, est nécessaire au processus de digestion et, à travers la production d’acides gras à chaine courte (AGCC) particuliers, il protège la paroi intestinale. Notre objectif est de confirmer le développement d'effets indésirables gastro-intestinaux suite à l'aministration de MPA chez la souris, principalement au iveau de la sensibilité colique, afin de pouvoir par la suite proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour lutter contre une entéropathie modérée provoquée par le MPA chez la souris.
Bénéfices attendus
Le MPA est l’immunosuppresseur le plus utilisé pour éviter le rejet de greffes d’organes solides. L’entéropathie induite par le MPA touche aujourd’hui plus de 30% des patients transplantés : sont proposés à ces patients une diminution de la dose de MPA ou une substitution de cet immunosuppresseur par une autre classe thérapeutique moins efficace sur le maintien et la tolérance de la greffe. L'étude de la sensibilité colique pourrait permettre de proposer de nouvelles approches thératpeutiques pour soulager ces patients.
Procédures
- Préhension pour pesée (animal vigile, tous les animaux, moins de 30 secondes par animal, 17 fois par animal) - Contention pour habituation à l’administration par voie orale à l’aide d’une canule (animal vigile, tous les animaux, moins de 1 minute par animal, 9 fois par animal) - Administration par voie orale à l’aide d’une canule (animal vigile, tous les animaux, moins de 1 minute par animal, 7 fois par animal) - Prélèvement sanguin (animal anesthésié, tous les animaux, moins de 1 minute par animal, 1 fois par animal) Les modes d’administration utilisés (administration par voie orale à l’aide d’une canule) ont été décrites dans la littérature pour ces molécules, et sont reconnues efficaces. Enfin, en fin de précédure 2, les souris subiront un dernier test (40 min par souris sur l'ensemble des souris), le test de distension colorectale, afin d'évaluer leur sensibilité colique avant d'être mis à mort à la suite de ce test de distension colorectale.
Impact sur les animaux
Des effets indésirables sont attendus pour les animaux traités à l’immunosuppresseur comme une perte de poids, de la diarrhée, la présence de sang dans les selles, des douleurs digestives et des altérations du comportement.
Devenir
A l'issu de l'ensemble des procédures, les animaux seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements d'organes.
Remplacement
L’utilisation de cellules in vitro a permis de démontrer certains effets intéressants du médicament immunosuppresseur MPA et des AGCC. Cependant, les études in vitro ne permettent pas actuellement de reproduire la complexité du tube digestif et des tissus qui l’entourent. Or les effets globaux du MPA et des AGCC, s’ils existent, résulteront de l’interaction du médicament et des AGCC avec différentes cellules au sein de différents tissus et organes. A ce stade des travaux, les études in vitro doivent être complétée par des études sur l’animal afin d’apporter la preuve définitive de l’effet protecteur des AGCC vis-à-vis de l’entéropathie induite par le traitement immunosuppresseur chez les greffés.
Réduction
Dans le but de réduction du nombre d’animaux, le projet comprend 2 étapes : une étude pilote pour déterminer la dose de MPA à utiliser et l’étude à proprement parler des AGCC sur l’entéropathie induite par le MPA. Cette stratégie en deux étapes permet de limiter le nombre d’animaux utilisés dans l’étude de l’effet des AGCC. De plus, un test statistique dit puissance a été réalisé afin de déterminer le nombre minimal d’animaux à utiliser pour avoir des résultats exploitables. Enfin, des tests statistiques seront réalisés pour analyser les données.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à l’espèce et qui respectent leur bien-être : densité animale, température, hygrométrie contrôlées, présence d’enrichissement, eau et nourriture à volonté. Les animaux seront habitués aux expérimentateurs et aux manipulations. L’état général des animaux sera surveillé quotidiennement, voire deux ou trois fois par jour si l’état le nécessite. La douleur sera abrégée sans délai via l’administration d’antalgique dérivé de la morphine, ou si l’état le justifie, l’animal sera euthanasié. Les personnes qui manipuleront et observeront les souris sont expérimentées.
Choix des espèces
La souris est un modèle de référence pour l’étude des entéropathies que l’Homme développe. Les animaux utilisés seront des souris adultes d’un poids moyen de 24-26 g âgées de 8-10 semaines au début du projet. A ce stade de développement les souris présentent des caractéristiques physiologiques stables. De plus, ce stade de développement est celui utilisé dans les publications de référence pour le projet.
Etude de l’émergence de plusieurs populations de spermatogonies pendant la période prépubère chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
Toutes tuées entre neuf et quatorze jours de vie, 280 souris subissent une biopsie de la queue puis l'administration d'une substance activant la voie de l'acide rétinoïque, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié des mâles, écartés après génotypage parce que leur génotype ne convient pas, sont tués sans même être prélevés. La mise à mort passe par une anesthésie à dose létale suivie d'une perfusion de dix minutes, pour prélever les testicules. Le porteur affirme qu'une approche sur animaux est "indispensable" et qu'un système in vitro est impossible, et cite un contraceptif masculin parmi les retombées envisagées.
Objectifs
L’acide rétinoïque et les récepteurs de l’acide rétinoïque sont indispensables à la différentiation des spermatogonies pendant la spermatogenèse. Nos études suggèrent l'existence de différentes populations de spermatogonies qui émergent à différents stades du développement prépubère et qui seraient contrôlées par l’un ou l’autre des récepteurs de l’acide rétinoïque. Dans ce projet nous induisons la différentiation de spermatogonies chez des souris présentant un arrêt de la spermatogenèse par administration de diverses substances activatrices de la voie de signalisation de l’acide rétinoïque. Les testicules des animaux traités sont soumis à des analyses visant à élucider l’émergence de plusieurs populations de spermatogonies pendant la période prépubère.
Bénéfices attendus
Dans la mesure où inhiber la synthèse d’acide rétinoïque bloque la différenciation des spermatogonies dans de nombreuses espèces, y compris les êtres Humains, il est logique de penser que les mécanismes régissant la spermatogenèse qui sont découverts ici chez des souris altérées dans la voie de signalisation de l’acide rétinoïque sont pertinents pour les êtres Humains. En comprenant comment la voie de signalisation de l'acide rétinoïque agit sur les spermatogonies chez la souris, nous obtiendrons des pistes pour évaluer si des cas d'infertilité Humaine, qui sont en augmentation constante dans le monde, sont liés à des altérations du fonctionnement de ces voies de signalisation. La possibilité de perturber temporairement la signalisation de l'acide rétinoïque représente également une stratégie pour développer de nouveaux contraceptifs masculins non chirurgicaux.
Procédures
Toutes les interventions décrites ci-dessous nécessitent d’immobiliser les souris avec la main (contention non traumatisante de 20 à 30 secondes). - Biopsie de queue (entre le 1e et le 3e jour ou entre le 5e et le 10e jour) sur animaux vigiles pour génotyper les animaux. Réalisée 1 fois dans leur vie. - Administration d’un médicament à l’âge de 4 jours, 8 jours ou 13 jours pour rétablir la différentiation des spermatogonies. Réalisée 1 fois dans leur vie. - Administration d’anesthésique en dose létale pour perfuser un fixateur histologique. Etape finale de mise à mort réalisée entre l’âge de 9 jours et 14 jours. Les souris sous anesthésie sub-létale/profonde en moins de 5 minutes. La perfusion (10 minutes) résulte en la mort de l’animal.
Impact sur les animaux
Nous générons des souris porteuses d’une mutation restreinte à un type cellulaire du testicule et aucun phénotype dommageable n’est attendu ; le phénotype attendu se limitant à une stérilité non obstructive chez les mâles. Une biopsie de la queue est réalisée pour le génotypage. L’administration de substances entraîne une douleur équivalente à celle de l’introduction d’une aiguille sous la peau.
Devenir
Après la réalisation du génotypage, les mâles ne présentant pas le génotype d'intérêt (contrôles non mutants) seront exclus de la procédure et euthanasiés sans prélèvement (1/2 des mâles). Tous les animaux mutants sont euthanasiés en fin de procédure pour prélever les testicules.
Remplacement
La spermatogenèse est un processus complexe impliquant divers types cellulaires du testicule. Les interactions entre les cellules somatiques et germinales sont cruciales pour assurer une production continue de spermatozoïdes. Notre étude vise à examiner le rôle de l'acide rétinoïque dans le maintien de ces interactions cellulaires dans un contexte physiologique. Il est important de souligner que l'utilisation d'une approche expérimentale avec des animaux est indispensable pour répondre à ces questions. Un remplacement par un système in vitro (conformément au 1e R de la règle des 3R) est impossible.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaires est calculé de manière précise pour répondre aux exigences de réduction de l'utilisation d'animaux, tout en garantissant la qualité des résultats et la robustesse de leur validité statistique. Étant donné que notre étude se focalise sur la spermatogenèse, seuls les mâles (représentant statistiquement la moitié des naissances) sont inclus dans les expériences. Les traitements sont administrés exclusivement aux mâles mutants préalablement sélectionnés par génotypage. Les mâles mutants représentent la moitié des individus produits par les croisements, et cette proportion ne peut être augmentée. Les testicules controlatéraux de chaque mâle sont utilisés pour évaluer l'efficacité des traitements. Les deux testicules sont fixés de manière distincte et servent à deux voire trois types d'analyses, ce qui s'aligne parfaitement avec le 2e R de la règle des 3R en réduisant le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Dans le souci du bien-être des animaux, une surveillance constante de leur état de santé est assurée. En cas de souffrance ou de modification de leur comportement, des mesures correctives sont rapidement prises en concertation avec les responsables de la structure du bien-être animal (SBEA) et le vétérinaire. Les animaux étudiés présentent des mutations dans les cellules de Sertoli du testicule, ce qui ne cause aucune souffrance car le phénotype attendu se limite à la stérilité non obstructive des mâles. Ce génotype d'intérêt concerne la moitié des mâles produits avec les croisements en place, et cette proportion ne peut être augmentée. Les procédures débutent par l'identification des mâles et la biopsie de queue pour le génotypage. Ces étapes sont effectuées avant l'administration du médicament, permettant ainsi une sélection visant exclusivement les animaux mutants d'intérêt. Ainsi, le raffinement (conformément au 3e R de la règle des 3R) est pleinement intégré dans notre projet.
Choix des espèces
La petite taille de la souris, ses nombreuses ressemblances génétiques avec l'Homme, et les facilités de modification de son génome, font d’elle un modèle animal de choix pour appréhender la physiopathologie des maladies humaines. Nous avons choisi une approche de génomique fonctionnelle pour laquelle la souris est particulièrement bien adaptée (possibilité de réaliser des mutations dans le génome : temps de génération court ; génome connu, outils moléculaires). D’autre part la souris possède 99% d’identité de gènes avec l’homme, et les mécanismes cellulaires à l’œuvre qui impliquent la voie de signalisation de l’acide rétinoïque sont conservés chez l’Homme. Nous identifions et génotypons tous les souriceaux mâles âgés de 1 à 10 jours pour choisir les mâles mutants qui seront traités par la suite. Les souris contrôles (non mutantes) dont le génotype n'est pas compatible à la suite de la procédure sont euthanasiées. Nous déclenchons la différenciation de toutes les spermatogonies à l'âge de 4 jours, 8 jours ou 13 jours en utilisant une méthode pharmacologique. Ces périodes correspondent aux moments où les gènes codant pour les récepteurs de l’acide rétinoïque commencent à s'exprimer, permettant une comparaison pertinente entre les moments d'expression et les moments d'administration des traitements. Nous analysons la différenciation des spermatogonies 24 heures après le traitement.
Etude histologique de l’évolution de l’ataxie de Friedreich sur les ganglions de la racine dorsale
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour étudier l'ataxie de Friedreich, 400 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance allant de léger à sévère, toutes tuées par perfusion intracardiaque afin de prélever leurs ganglions rachidiens. Le porteur indique que les souris porteuses de la mutation développent progressivement des signes de la maladie humaine, et fixe une grille de score, tremblements, hypolocomotion, dos voûté, perte de poids de plus de 10 %, au-delà de laquelle il les met à mort. La description des gestes infligés tient en une phrase, alors que la souffrance déclarée atteint le niveau sévère. Il affirme qu'aucune culture cellulaire ni modèle in silico ne permet d'étudier les cellules satellites gliales, "encore trop peu connues".
Objectifs
L’ataxie de Friedreich est une maladie neurodégénérative d’origine génétique. Elle est causée par une mutation du gène de la frataxine conduisant à une expression réduite de la protéine frataxine et à un dysfonctionnement des neurones présents dans des ganglions nerveux situés le long de la colonne vertébrale. Ces neurones sont recouverts de cellules satellites gliales qui contribuent à leur bon fonctionnement. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre les rôles des neurones et des cellules satellites gliales dans le développement de l’ataxie de Friedreich. Pour cela, nous utiliserons un modèle de souris permettant d’induire la baisse d’expression de la frataxine uniquement dans les neurones des ganglions touchés par la maladie. La procédure sera optimisée afin de respecter les devoirs de Réduction et Raffinement et pour assurer l'absence de douleur. La surveillance continue de l'animal permettra d'arrêter la procédure expérimentale lorsque l'animal montre des signes d’anxiété. La procédure vise à optimiser le confort des animaux et réduire le nombre d'animaux.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est de comprendre le rôle respectif des neurones proprioceptifs et des cellules satellites gliales dans le développement de l’ataxie de Friedreich, et de déterminer si les cellules satellites gliales peuvent constituer des cibles thérapeutiques potentielles.
Procédures
Les souris subiront une perfusion intracardiaque sous anesthésie chimique.
Impact sur les animaux
Dans notre étude, les animaux sont porteurs de la mutation de la frataxine seulement dans les neurones proprioceptifs vont progressivement développer certains des signes de la maladie humaine. Ils nécessiteront un suivi particulier et si une aggravation de leur état est observée, la procédure sera arrêtée pour ces animaux.
Devenir
A l'issue de la procédure 1, les animaux sont gardés en vie afin d'être inclus dans la procédure 2. En effet, la procédure 1 permet de produire les animaux utilisés dans la procédure 2. A l'issue de la procédure 2, les animaux seront mis à mort soit par perfusion intracardiaque précédée d’une anesthésie/analgésie chimique afin de prélever les ganglions rachidiens dorsaux et d’étudier au niveau cellulaire et moléculaire ces ganglions.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. L’utilisation de cultures de cellules satellites gliales ou de co-cultures neurones-cellules satellites gliales ne permet pas une étude physiopathologique des interactions propriocepteurs-cellules satellites gliales : les cultures induisent des altérations morphologiques et physiologiques majeures des propriocepteurs et des cellules satellites gliales ne reproduisant pas les mécanismes physiopathologiques existant in vivo. Il n’existe pas, dans notre domaine, d’alternatives satisfaisantes aux méthodes expérimentales proposées dans ce projet (expériences ex vivo et in vivo sur l’animal). Par ailleurs, aucun modèle in silico n'existe pour étudier les cellules satellites gliales, encore trop peu connues.
Réduction
Compte tenu de la littérature et de notre expérience, les expériences décrites nécessitent un minimum de 5 animaux. Nous utiliserons les tests statistiques appropriés pour analyser nos données. Les t-tests seront utilisés pour évaluer si deux groupes diffèrent l’un de l’autre. Les tests ANOVA seront utilisés pour réaliser des comparaisons multiples entre les différents groupes expérimentaux (plus de 2 groupes). Ces tests nécessitent d’avoir un nombre minimum d’animaux pour atteindre les seuils statistiques de significativité en fonction des expériences réalisées. De plus, les croisements et les lots seront optimisés selon les génotypes et les sexes afin d’avoir le plus d’animaux expérimentaux avec le bon génotype et avec une représentation homogène des sexes.
Raffinement
Les animaux seront placés dans des cages, en communauté de 2 à 5. L’eau, la nourriture et du matériel de nidification, seront placés dans chacune des cages. Chaque animal bénéficiera d’une attention et de soins de qualité par du personnel qualifié, afin d’assurer un bien-être optimal, tout au long de l’étude. Les animaux seront suivis quotidiennement par les mêmes expérimentateurs afin de réduire leur stress au maximum. Dès l’apparition des symptômes sensorimoteurs, même mineurs, les animaux seront nourris avec de la nourriture humide au sol pour faciliter leurs apports en nutriments et en eau. Une surveillance quotidienne des points-limites (apparence, comportement, signes cliniques) et un suivi du poids hebdomadaire sera mis en place. Les points limites suivants seront évalués : 1. Apparence de l’animal : 0=normale ; 1=manque de toilettage ; 2=poil ébouriffé, dos voûté, prostration ; 2. Comportement (tenant compte des symptômes attendus): 0=normal ; 1=fort tremblement, hypolocomotion; 2=manque d’alimentation/déshydratation ; 3. Poids : 0= perte de poids comprise entre 0 et 5% ; 1=perte de poids comprise entre 5 et 10% ; 2=perte de poids de plus de 10%. Si un animal atteint le score de 2 pour un des paramètres ou si le score total est supérieur à 3, l’animal sera mis à mort.
Choix des espèces
La souris est le modèle standard pour l'étude des fonctions et dysfonctions du système nerveux des mammifères. L'anatomie, la morphologie cellulaire, la biochimie et la physiologie du système nerveux de la souris sont bien caractérisés. Il existe une vaste littérature sur le comportement sensorimoteur et sensoriel de la souris. De plus, la possibilité d’utiliser des souris génétiquement modifiées est un grand avantage pour les études physiologiques car les gènes codant certaines protéines peuvent être manipulés (activés, inactivités, surexprimés) ou des transgènes exprimés chez ces animaux afin d’aider à mieux comprendre certains mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans les maladies neurodégénératives. Des souris adolescentes, jeunes adultes allant de 3,5 à 15,5 semaines seront utilisées afin de suivre l’évolution de la pathologie.