Rongeurs
Impact de l’amoxicilline associée à l’acide clavulanique sur le microbiote intestinal de rats
- Recherche appliquée
- Maladies animales
36 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélever le gros intestin, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent de l'amoxicilline associée à l'acide clavulanique par gavage ou par injection intramusculaire, et leur abdomen est massé jusqu'à neuf fois pour provoquer la défécation. Le porteur prévoit douleur, stress, réactions d'hypersensibilité locale et diarrhées, et indique que les rats perdant 15 à 20 % de leur poids ou montrant des signes de douleur persistants seront mis à mort. L'objet du projet reste l'effet d'un antibiotique courant sur la flore intestinale, une question que le porteur affirme ne pouvoir trancher qu'in vivo pour mesurer directement la quantité d'antibiotique au contact du microbiote.
Objectifs
Le microbiote intestinal (MI) est fondamental pour la santé des mammifères. Les traitements antibiotiques causent un déséquilibre qui comporte l'augmentation d'espèces pathogènes et/ou porteurs de mécanismes de résistance, au détriment d'espèces bénéfiques à la santé de l'hôte. De plus, les antibiotiques sont souvent associés à l'inflammation des tissus intestinaux. Les voies d'administration par injection semblent avoir un effet moins important sur la sélection des résistances dans le MI, mais peuvent l'affecter en causant des déséquilibres au niveau de la composition du MI. L'association amoxicilline - acide clavulanique (AMC) est active contre plusieurs espèces bactériennes. L'AMC est utilisé chez l'Homme et les animaux. Les études sur l'impact de l'AMC sur la composition du MI, conduites chez l'Homme et certaines espèces animales, ne sont pas concluantes. Deux limites principales ont été observées: i) l'absence de comparaison avec un groupe contrôle constitué de sujets sains non traités; ii) dans certaines expérimentations chez l'animal, l'administration de l'AMC via la consommation ad libitum d'eau ne reflète pas la réalité d'un traitement et de l'exposition de l'indivdu à l'antibiotique. Les objectifs de cette étude sont : i) étudier l'impact de l'AMC sur la composition du MI chez le rat après administration par voie intramusculaire ou orale, versus des groupes contrôles sains non traités ; ii) quantifier les gènes de résistances dans les fèces avant et après l'administration d'AMC et en absence de traitement; iii) évaluer l'exposition du MI, selon les deux voies d'administration, par dosages de l'AMC dans les fèces et le gros intestin ; iv) évaluer la résilience (retour à la composition initiale) du MI après un traitement à l'AMC.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet concernent plusieurs aspects. L'analyse du MI via une analyse métagénomique par séquençage aléatoire à haut débit permettra de déterminer quelles communautés bactériennes et fonctions biologiques sont perturbées par l'AMC. Ces connaissances mettront les bases pour développer des stratégies afin de préserver les fonctions du MI. Chez l'Homme, la voie par injection est plus courante dans les hôpitaux avec un relais par voie orale dès que possible. En santé animale, selon les espèces, l'une des deux voies est privilégiée (injectable chez les bovins, orale chez les carnivores domestiques). Cette étude permettra de confirmer l'éventuel impact de la voie injectable sur le MI et donnera les bases pour privilégier une voie d'administration. La plupart des études se sont focalisées sur l'impact d'un traitement antibiotique sur la composition du MI sans évaluer, en parallèle, la quantification des gènes de résistance aux antibiotiques. Cette étude fournira, pour la première fois, une connaissance plus approfondie sur ces deux aspects.
Procédures
Les animaux seront soumis à une administration d'amoxicilline associée à l'acide clavulanique par voie orale (groupe B), soit par voie intramusculaire (groupe A). L'administration par voie intramusculaire se fera sous sédation gazeuse (durée : 1 minute) pour soulager l'inconfort et la douleur occasionnée par l'injection (durée : 30 secondes). Le gavage (durée : 1 minute) ne nécessite pas de sédation, puisque la pratique repose sur un geste techniqué et maîtrisé. Afin de réaliser les prélèvements de matières fécales, les rats seront disposés dans des boites préalablement désinfectées et l'abdomen de chaque animal sera massé pour favoriser la défécation spontanée. Cette manipulation sera effectuée neuf fois sur 24 rats et 8 fois sur 36 rats. Le gros intestin de tous les rats sera prélevé après sédation gazeuse et mise à mort.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sont la douleur et le stress dus à l'administration de l'antibiotique ainsi que des réactions d'hypersensibilités locales après l'administration intramusculaire de la solution d'AMC. Potentiellement des diarrhées peuvent émerger.
Devenir
J11 et J100, les rats seront mis à morts afin de prélever le gros intestin.
Remplacement
Le modèle animal choisi pour cette étude ne peut pas être remplacé. Seulement les études in vivo permettent de reproduire l'exposition di MI dans le cadre d'une thérapie antibiotique. La quantification directe de l'AMC dans l'intestin permettra d'objectiver directement la quantité d'AMC présente au contact du microbiote.
Réduction
Il est prévu d'utiliser le minimum de sujets nécessaires dans chaque groupe pour pouvoir rendre les résultats interprétables. Selon une approche statistique, il a été estimé qu'un total de 36 rats seraient nécessaires pour la totalité du projet. L'étude nécessite 4 groupes de 9 rats, en tenant compte d'un tiers sera utilisé pour une analyse du microbiote intestinal après la fin de l'administration de l'amoxicilline associée à l'acide clavulanique, et les deux tiers restants pour l'analyse à trois mois après la fin de l'administration de l'antibiotique.
Raffinement
Les rats auront une période d'acclimatation de 3 semaines avant d'effectuer le protocole. Les rats seront hébergés dans des cages spéciales rats qui leurs permettront la stature bipède. Un tunnel, des Sizzle-Nest et des os à ronger sont disponibles dans les cages. La socialité des animaux sera garantie en hébergeant 3 rats par cage. Pour réduire le stress dû à l'administration de l'AMC, les rats auront une sédation. Pour soulager la douleur due à l'injection d'AMC ou à une éventuelle hypersensibilité locale, de la pommade contenant de la lidocaïne sera placée sur la cuisse concernée. Pendant l'administration d'AMC, le poids des animaux sera monitoré. Si une perte de poids importante (-15 à -20% dans les 3 jours et comparée au poids pré-administration ou aux groupes contrôles) est observée, l'animal sera mis à mort. Si l'animal montre des signes de douleur( le poil hérissé, le dos arrondi, le faciès contracté et/ou l'isolement), du paracétamol (200 mg/kg) sera administré par voie orale (biberon), 3 fois maximum pendant 24h. Si les signes de douleur persistent au-delà de 3 jours, l'animal sera mis à mort. La diarrhée est un effet secondaire possible. L'incidence de la diarrhée associée à l'administration d'AMC chez le rat n'est pas connue. En se basant sur les observations conduites chez l'Homme, si une diarrhée de courte durée sans signes de douleurs et sans déshydratation (pli de peau persistant) émerge, aucune modification ne sera apportée au protocole. Cependant, en cas de signes de douleur, du paracétamol sera administré à tous les animaux pour éviter un biais lié à cette administration. Si la diarrhée se prolonge sur plus de 3 jours, associée à des signes de déshydratation et une perte de poids, l'animal sera mis à mort.
Choix des espèces
L'utilisation des rats comme modèle d'étude nous permet de contrôles les facteurs, comme l'âge, l'alimentation ou encore l'état de santé , qui peuvent jouer un rôle dans la composition du MI et donc être confondant pour l'évaluation de l'impact de l'AMC. Les rats sont le modèle le plus utilisé dans les études du microbiote intestinal. De plus, le rat est souvent utilisé pour les études sur le MI humain, car son MI conserve des caractéristiques communes à tous les mammifères, permettant la généralisation des résultats. Dans le cadre de l'étude de l'impact de l'AMC sur le MI, les rats seront adultes (8 semaines). En effet, à ce stade, la composition du MI est stabilisée. Ainsi, les perturbations observées après l'administration d'AMC peuvent être attribuées à l'antibiotique et non au sevrage des rats.
Utilisation de matériaux poreux comme vecteur de gaz et autres stratégies thérapeutiques pour les tumeurs hypoxiques.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
Rats : 504
Pour tester des nanoparticules poreuses censées porter des gaz et des médicaments jusqu'aux tumeurs, 1 692 souris et 504 rats sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous mis à mort pour prélever leurs organes. Une partie reçoit une implantation de cellules tumorales dans le cerveau sous anesthésie, puis trois séances d'irradiation de 4 Gy et des injections intraveineuses trois jours de suite. Le porteur s'attend à une perte de poids, de motricité et de sensibilité chez les animaux porteurs d'une tumeur cérébrale, ainsi qu'à une dégradation de l'état général jusqu'à une semaine après l'irradiation du crâne, avec pelades sur la tête et sécrétions au museau. Il justifie le projet par le "besoin d'améliorer" des thérapies dont il constate le manque d'efficacité, et présente le nombre annoncé comme un maximum susceptible d'être réduit si les seuils statistiques sont atteints plus tôt.
Objectifs
Ce projet a pour but de caractériser l’intérêt de nanoparticules (NPs) poreuses comme vecteur de thérapies (gazeuses et médicamenteuses) pour les tumeurs hypoxiques, décrites dans la littérature comme résistantes aux traitements actuels. En effet, un meilleur ciblage de la tumeur par ces NPs permettrait d’améliorer l’efficacité des traitements actuels tels que la radiothérapie (RT), les chimiothérapies (CT) ou encore les immunothérapies (IT). Devant le manque d’efficacité des thérapies standards, ce projet se justifie par le besoin d’améliorer, par des approches innovantes, les thérapies actuelles.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est une amélioration des stratégies thérapeutiques actuelles en utilisant comme vecteur des NPs qui ont montré, par nos études précédentes, leur capacité à s’accumuler dans la tumeur tout en préservant le tissu sain environnant .
Procédures
Les animaux sont soumis à plusieurs types d’interventions : - Chirurgie (implantation cérébrale de cellules tumorales sous anesthésie générale) : 30 minutes maximum par animal, réalisée une seule fois sur chaque animal. - Injection intraveineuse de cellules tumorales (animal vigile) : 1 fois à l’injection des cellules ; 5 minutes maximum par animal. - Injection sous-cutanée de cellules tumorales (animal vigile) : 1 fois à l’injection des cellules ; 5 minutes maximum par animal. - Injection intraveineuse des NPs (animal vigile) : 3 fois sur 3 jours consécutifs ; 5 minutes maximum par animal. - Injection intraveineuse des CT ou IT (animal vigile) : 3 fois sur 3 jours consécutifs ; 5 minutes maximum par animal. - Irradiation (sous anesthésie générale) : 3 séances de 4 Gy sur 3 jours consécutifs : 10 minutes maximum par animal. - Injection sous-cutanée de buprénorphine (animal vigile) : 1 fois avant la mise à mort pour tous les animaux et 3 fois pour les animaux avec des tumeurs cérébrales qui auront deux injections supplémentaires en péri-opératoire ; 2 minutes maximum par animal.
Impact sur les animaux
Parmi les procédures expérimentales, les injections intraveineuses (cellules tumorales, NP, CT ou IT) ou les injections sous-cutanées effectuées sur un animal vigile peuvent causer un stress à l'animal lors de l'intervention, ce qui peut être considéré comme une nuisance légère. De plus, au regard de l’expérience du laboratoire concernant les différentes procédures expérimentales, nous nous attendons à avoir des effets indésirable modérés avec une perte de poids, de motricité et de sensibilité chez les animaux qui auront un développement de tumeur cérébrale. Également, sur ces modèles de tumeur cérébrale, nous nous attendons à une fatigue et une dégradation de l’état général (porphyrine autour des yeux et de la bouche, sécrétions au niveau du museau, pelades sur la tête) induit par l'irradiation cérébrale jusqu’à une semaine après l’irradiation.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort pour prélèvement d'organes.
Remplacement
Les tumeurs sont connues pour être multi-compartimentales, c'est-à-dire qu’au-delà du simple compartiment de la cellule tumorale existent la vascularisation, l’hypoxie et l’inflammation qui influent fortement sur la cellule tumorale. L’utilisation de modèles in vivo complets permet d’intégrer ces différentes composantes, indispensables à la compréhension des mécanismes de développement tumoral et à la réponses aux différents traitements. Ce projet intervient après plusieurs étapes de validation in vitro ayant permis de retenir les meilleures NPs (taille, aspect de toxicité, oxygénation) mais ne peut pas s’effectuer intégralement sur des modèles de remplacement in vitro ou in silico.
Réduction
L’utilisation des méthodes d’imagerie non invasive et des modèles de tumeur sous-cutanés se conforment à la réglementation en vigueur dans le respect de la réduction du nombre d’animaux car elles permettent de suivre à différents temps l’évolution de la tumeur chez le même animal sans nécessité d’euthanasier plusieurs animaux à chacun des temps. Chaque animal est dans ce cas son propre contrôle et permet de réduire le nombre total d’animaux nécessaires pour l’étude. Toutefois, dans tous les protocoles d’imagerie, d’irradiation, les animaux seront anesthésiés par inhalation d’isoflurane, non sans risque pour l’animal. Afin de pouvoir réaliser des analyses statistiques, nous estimons qu’au minimum, 12 animaux par groupe au départ sont nécessaires afin de réaliser des tests statistiques puissants, et ainsi comparer les effets des différents traitements et ce, en fonction du temps. Ces 12 animaux sont calculés sur la base d’un test de puissance connaissant la variabilité intrinsèque des modèles tumoraux basés sur nos travaux antérieurs. Il est important de noter ici que le nombre d’animaux calculés est un nombre maximal. En effet, les expériences seront réalisées par plusieurs lots et si les seuils statistiques sont atteints alors le protocole sera stoppé.
Raffinement
A leur arrivée, les animaux seront placés en groupe sociaux (4 souris par cage et 3 à 2 rats par cage) dans des cages standards répondant aux normes européennes. Ils bénéficieront d’un temps d’adaptation de 7 jours minimum avant toutes expérimentations et bénéficierons également d’enrichissement (roue d’activité, tunnel en carton, stimulation sensorielle par différents objets). Les animaux seront surveillés de leur arrivée à la fin du protocole par un personnel compétent afin de déterminer leur état (poids, apparence physique) et la mise en place, si nécessaire, de mesures afin d’améliorer le bien-être animal. Cette évaluation sera réalisée quotidiennement pendant les phases critiques (implantation, irradiation) et 3 fois par semaine par la suite. Enfin, les différents protocoles ont été pensés de manière à limiter au maximum la souffrance animale par l’administration d’agents analgésiques et anesthésiques appropriés et par le choix de points limites cohérents. Pour les animaux immunodéprimé, la procédure est identique à l’exception de l’hébergement. En effet, les animaux sont placés dans des cages ventilées individuellement par des portoirs spécifiques, ces deniers étant eux-mêmes dans une zone spécifique et dédiée à la manipulation des animaux immunodéprimés pour la recherche en cancérologie.
Choix des espèces
La souris et le rat immunodéprimés sont des espèces de choix pour évaluer l’évolution du volume tumoral dans le temps dès lors que les cellules tumorales utilisées sont d’origine humaine. Notre expertise des différents modèles de tumeurs cérébrales, nous a permis d’établir que suivant le type cellulaire, nous obtenons des tumeurs plus ou moins hypoxiques et plus ou moins vascularisés (Corroyer-Dulmont et al., Biol Chem. 2013). Ces deux composantes, influençant la croissance tumorale et l’efficacité des traitements actuels, il est nécessaire de travailler avec ces différents modèles in vivo, afin de se rapprocher de la situation clinique. Lorsque les cellules tumorales (cérébrales et pulmonaires) sont d’origine murine (issues de souris C57Bl/6) alors nous pouvons utiliser des animaux immuno-compétents de même souche (souris C57Bl/6) dans ce projet afin de prendre en compte l’ensemble du système immunitaire et le contexte inflammatoire du micro-environnement étudié et connus pour participer à la réponse aux traitements. L’ensemble des animaux utilisés dans cette étude seront de jeunes adultes, mâles et femelles, âgés de 8 à 12 semaines en début de protocole. Cela permettra le développement de tumeurs plus reproductibles. De plus, à ce stade, le cerveau est mature et il est possible de suivre l’évolution des animaux sur des temps longs. Cet âge leur confère également une résistance aux protocoles expérimentaux utilisés.
Hébergement, reproduction et génotypage de souris génétiquement modifiées pour des études immunohistochimiques et électrophysiologiques
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
2 111 souris vont être utilisées dans un projet d'élevage et de génotypage de lignées génétiquement modifiées, 1 543 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger et 568 dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil. Le seul geste pratiqué sur l'animal vivant est le prélèvement d'un millimètre de queue pour le génotypage, dont le porteur reconnaît qu'il génère stress, douleur ponctuelle et saignement. Les souris dont le génotype ne convient pas à la gestion de l'élevage sont mises à mort, les reproducteurs sélectionnés étant maintenus en vie pour produire les portées suivantes. Le porteur indique qu'une des lignées manifeste des symptômes nuisant à sa santé et prévoit un génotypage avant la troisième semaine pour repérer les mutants avant l'apparition de la maladie.
Objectifs
L'équipe étudie le système nerveux moteur situé dans la moelle épinière impliqué dans la locomotion. Ce réseau de neurones, pour qu'il fonctionne correctement, doit être régulé finement. L'un des projets de l'équipe est d'étudier les mécanismes moléculaires au niveau de ces neurones qui seraient responsables de l'activation de ce réseau innervant les muscles locomoteurs. Des protéines particulières présentes en grande quantité à la surface des neurones, sont principalement ciblées. Ainsi, l'élevage de ces lignées de souris chez qui certaines protéines sont altérées ou spécifiques d'un neurone identifié, est primordial pour caractériser et spécifier leur activité générée dans les neurones du système nerveux.
Bénéfices attendus
La caractérisation génétique des animaux de ces lignées faite de façon précoce nous permet d'optimiser la gestion de l'élevage mais aussi de contrôler et maîtriser la non apparition du phénotype dommageable chez les souris susceptibles de le développer. L'utilisation de souris génétiquement modifiées est nécessaire pour mieux comprendre la contribution de protéines d'intérêt dans l'activité du réseau locomoteur spécifiquement dans des neurones identifiés. De plus, une inactivation de la protéine ciblée chez ces animaux particuliers, nous permet d'explorer des mécanismes qui lui sont spécifiques et ainsi mettre en lumière des concepts pouvant être communs à certaines pathologies comme la lésion de la moelle épinière, l'épilepsie ou d'autres maladies neurodégénératives. La recherche qui découle de ces lignées de souris profitera à l'ensemble de la communauté scientifique en lien avec ce domaine de recherche.
Procédures
La plupart des interventions sur ces animaux se fera post-mortem. La seule intervention que ces animaux subissent de leur vivant, est le prélèment de tissu à l'extrémité de la queue (segment de 1mm) pour le génotypage grâce à une paire de ciseaux adaptée, notamment chez le jeune qui n'a pas de poils. Il n'est prévu qu'une seule intervention par animal d'une durée de 1 minute. Une fois que le génotypage sera mis au point sur le follicule pileux, un génotypage plus tardif pourra être effectué si celui ci est compatible avec la technique expérimentale utilisée.
Impact sur les animaux
Biopsie de l'extrémité de la queue qui peut engendrer un stress, une douleur ponctuelle et un saignement. Les femelles reproductrices seront soumises à un stress accru lors de la dernière semaine de gestation du fait de leur isolement comme pour les mâles reproducteurs séparés de la femelle.
Devenir
Mise à mort des animaux de génotype non utile pour la gestion de l'élevage en gardant en vie les animaux reproducteurs sélectionnés en fonction de leur génotype. Utilisation des animaux sélectionnés pour les expérimentations pour l'objectif scientifique.
Remplacement
Nos évaluations et caractérisations nécessitent de pouvoir réaliser des observations sur des neurones connectés les uns aux autres formant ainsi un réseau complexe. Pour cela, nous utilisons des tissus prélevés sur souris d'élevage. En effet, il n'est pas possible de reproduire sur un modèle bioinformatique ou en culture cellulaire la complexité de ces connexions ou la particularité d'un neurone spécialisé, même si de nombreuses études préliminaires in vitro ont permis de diminuer le nombre d'animaux nécessaires et/ou à retarder leur utilisation.
Réduction
Les techniques de prédilection employées dans cette étude sont de l'ordre de 4. Elles nous permettent d'utiliser un même animal pour plusieurs mesures et différentes conditions d'exposition. Le nombre d'animaux nécessaire pour atteindre une significativité dans nos résultats est ainsi limité à son strict minimum. En effet, grâce à notre expérience et nos connaissances scientifiques, à chaque question scientifique posée, nous estimons un nombre d'individu minimal suffisant pour atteindre une significativité. Ainsi par exemple, pour tester l'efficacité d'une molécule médicamenteuse sur l'activité du neurone, nous choisissons deux techniques spécifiques qui nécessitent chacune, 8 animaux par condition. En revanche, pour toutes les questions relatives à l'efficacité d'une molécule médicamenteuse sur la quantité de protéine présente à la surface de neurones ou sur sa manière dont elle est exprimée à l'intérieur d'un tissu en fonction des traitements employés, cela nécessite l'emploi de 2 autres techniques qui demandent entre 4 et 12 animaux par condition. Sur l'ensemble de la saisine, il y aura 2111 souris qui seront génotypées. Plus de la moitié sera utilisée pour leur génotype d'intérêt en lien avec les questionnements scientifiques du projet de recherche, tandis que l'autre partie sera utile pour le maintien de la lignée. Dans un moyen long terme, nous estimons que la mise au point du génotypage sur follicule pileux nous permettra le maintien de la lignée sans geste invasif et sans phénotype dommageable, puisque l'on privilégiera les accouplements sans risque. Seul le prélèvement d'un peu de tissu de l'extrémité de la queue sera toujours effectué sur les souriceaux provenant d'un accouplement à risque dédié à une série expérimentale spécifique.
Raffinement
Après sevrage, les animaux seront hébergés entre 3 et 5 par cage en fonction de leur âge, de leur sexe et de leur poids. Les cages seront enrichies régulièrement de rondin de bois, de tunnel, de matériel de nidification. Concernant les accouplements à risque, une observation renforcée sera mise en place par l'expérimentateur et les zootechniciens pour cette lignée qui manifeste des symptômes nuisant à la bonne santé de l'animal uniquement chez les souris dont la mutation touche les gènes impliqués. Un génotypage systématique des animaux sera fait avant la 3eme semaine post-natale afin d'identifier les mutants le plus tôt possible avant l'apparition de symptômes de la pathologie. Un point d'arrêt sera de toute façon établi en cas d'apparition précoce des symptômes. La biopsie sera effectuée par un personnel qualifié qui maitrise le geste avec agilité et rapidité permettant ainsi de limiter le stress, l'inconfort et la douleur chez l'animal.
Choix des espèces
Les lignées de souris seront utilisées essentiellement jusqu'à la 2eme semaine post-natale en expérimentation pour l'enregistrement de l'activité des neurones ou la quantification de protéines d'intérêt à la surface des neurones et leur localisation dans le tissu nerveux. Ce stade précoce est essentiel pour la compréhension de la contribution des protéines ciblées dans la mise en place de l'activité neuronale. Une inactivation provoquée d'une de ces protéines chez des animaux génétiquement modifiés nous permet d'explorer des mécanismes qui lui sont spécifiques et ainsi mettre en lumière des concepts pouvant être communs à certaines pathologies comme la lésion de la moelle épinière, l'épilepsie, ou d'autres maladies neurodégénératives.
Evaluation d’un agoniste des récepteurs delta opioïdes dans un modèle de migraine NO-induite chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Soumis à une trachéotomie, à la canulation de la carotide et de la jugulaire puis à une craniotomie de quatre à six heures, 120 rats sont tués sans reprendre conscience, 80 dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil et 40 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Avant cette chirurgie terminale, ils reçoivent jusqu'à quatre injections intrapéritonéales sur animal vigile pour déclencher un état décrit comme migraineux. Le porteur affirme que ce modèle ne provoque "aucun effet indésirable" hormis une sensibilité exagérée du visage, et justifie la mise à mort par des risques "irréversibles" en cas de réveil. Il conclut qu'un "animal entier avec un système nerveux intégré" reste un préalable à toute étude sur la douleur et que les approches in silico restent trop "primaires".
Objectifs
Grace aux résultats obtenus lors d'un projet antérieur que la molécule d'intérêt à bien une activité dite antimigraineuse. Le but de ce projet est d'approfondir cette connaissance et de proposer un lieu et un mécanisme d'action.
Bénéfices attendus
A moyen terme, selon les résultats obtenus, ce projet nous permettra de connaitre le mécanisme d'action de la molécule d'intérêt et de proposer des cibles thérapeutiques avec des effets secondaires limités. Dans le contexte de ce projet, une diminution de l'effet inhibiteur sur l'activité neuronale indique que la majorité de l'effet antimigraineux de cette molécule est dû à une action sur les répéteurs localisés en périphérie. Il serait donc accessible à des molécules qui ne passent pas la barrière hémato-encéphalique ce que permettrai d’avoir la même efficacité associée à moins d'effets secondaires.
Procédures
Les interventions dans ce projet sont prévues sur une durée maximale de 5 jours. Ce sont des injections (intrapéritonéales i.p.) sur des animaux vigiles (maximum 4 injections). Chaque animal reçoit au maximum 1 injection i.p. par jour (durée d’intervention : 1min). L'électrophysiologie (chirurgie de préparation du rat et enregistrements à proprement dit) n’est réalisée qu'une fois sur chaque rat, en fin de procédure et sous anesthésie générale profonde au 5ème jour (durée d’intervention : entre 4 à 6h, sans réveil). La chirurgie inclut une trachéotomie , une canulation de la carotide , une canulation de la jugulaire , une craniotomie , et l’exposition de la region d'enregistrement.
Impact sur les animaux
Selon la littérature et notre expérience, le modèle de migraine ne montre pas d'effet indésirable sur les animaux autre que le développement d'une sensibilité exagerée, surtout à niveau facial. Les rats doivent pouvoir continuer à se mouvoir, se toiletter, exercer leurs gestes habituels comme manger et boire. Aucune nuisance ou effet indésirable est attendu pendant l'enregistrement électrophysiologique , l’animal est anesthésié (procédure sans réveil).
Devenir
Impossibilité de récupérer les animaux du fait de la procédure effectuée et des risques irreversibles (infectieux traumatiques) en cas de réveil.
Remplacement
Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. En effet il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique simultanément. Il n'existe dans la littérature aucune méthode alternative (in vitro ou in silico) pouvant répondre à l'efficacité d'un produit à potentiel thérapeutique antimigraineux. Un animal entier avec un système nerveux intégré, même sous anesthésie, est un préalable à une étude pertinente dans le domaine de la douleur. Une méthode in vitro ne pourrait rendre compte de la douleur car elle supprimerait de nombreux paramètres (régulations...) et rendrait le résultat réducteur voir inadapté. Des études électrophysiologiques chez l’animal vivant sont donc nécessaires pour mettre en évidence l'activation neuronale au niveau du complexe sensitif du trijumeau. Les études in silico constituent dans le domaine de la migraine une étape encore trop primaire aujourd'hui.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum (n=10/groupe/sexe). Les animaux seront hébergés collectivement (au moins 2 par cage), avec de l'enrichissement, afin d'éviter le stress. Pas de groupe témoin pour le modèle de migraine (reutilisations des donnes precedents). Le nombre d'animaux par groupe est défini à partir de notre expérience et des tests statistiques donnant le nombre nécessaire pour la discrimination des effets (http://www.quantativeskills.com/sisa). D’après les données du laboratoire nous prévoyons une perte maximum de 20 % de rats (qui pourront être écartés de l'étude), en raison de l'instabilité ou de la perte en cours de manipulation in vivo des enregistrements électrophysiologiques (baisse très importante de la pression artérielle témoin d'un problème homéostasique, ou perte du signal).
Raffinement
Pendant sept jours, les rats seront acclimatés à l’animalerie. Les conditions d'hébergement sont standard et enrichies à l'aide de rouleaux en carton permettant aux animaux de se cacher. Les animaux auront accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Animal naïf jusqu’au moment de l’enregistrement électrophysiologique (Groupe 1, 2,3 et Groupe 4). Enregistrement électrophysiologique sous anesthésie. Les expériences peuvent être interrompues par une mise à mort par overdose de pentobarbital iv, si les conditions physiologiques d'enregistrement ne sont plus assurées, suite à une altération durable et irréversible des paramètres cardiorespiratoires, comme par exemple une chute de pression artérielle durable sous les 70mmHg ou une hausse durable de CO2 supérieure à 6%.
Choix des espèces
Le rat est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires. C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Nous utiliserons des animaux entre 8-12 semaines, pour comparer avec les données du laboratoire. Les différentes études sur la migraine sont réalisées sur des animaux adultes. Cette pathologie est majoritaire chez les personnes adultes. Chez l'enfant, ses caractéristiques sont un peu différentes de l'adulte.
Hydrogel de régénération de la pulpe dentaire : relargage local et systémique d’une molécule modèle chez la souris ; étude pilote
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Toutes tuées à l'issue pour prélever les tissus autour de l'implant, 190 souris subissent une chirurgie sous la peau du dos puis neuf séances d'imagerie sous anesthésie, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. L'objet du projet reste étroit : mesurer la diffusion d'une molécule fluorescente hors d'un hydrogel implanté, dans une étude que le porteur qualifie lui-même de pilote. Il indique que l'incision dorsale et l'implantation peuvent provoquer douleurs et démangeaisons, et que les expositions répétées aux rayons X pourraient induire une légère perte de poids. Il affirme qu'"aucune méthode alternative" ne peut remplacer le recours aux souris, tout en présentant cette étape comme un préalable à des modèles "plus compliqués" avant toute application dentaire humaine.
Objectifs
A l’intérieur d’une dent se trouve un tissu nommé pulpe dentaire. A la base de la dent se trouve un orifice. C’est à travers cet orifice que les vaisseaux sanguins et les nerfs de la pulpe dentaire passent pour rejoindre les systèmes nerveux et sanguins dits systémiques. Lors d’une infection carieuse non traitée, la pulpe dentaire est attaquée, puis nécrose. On observe l’apparition d’un abcès à la base de la dent suite au passage de l’infection à travers l’apex pouvant conduire à des infections systémiques graves. Le traitement actuel consiste à remplacer la pulpe par un dérivé inerte de caoutchouc, et présente des limites en augmentant le risque de fracture de la dent ou de réinfection. Au risque de réinfection s’ajoute un risque de sélection de souches bactériennes résistantes ou multirésistantes. Des stratégies visant à régénérer la pulpe dentaire à partir d’hydrogels sont donc actuellement envisagées. Pour ce faire, il est nécessaire de concevoir des hydrogels bioactifs, associés à des molécules aux propriétés antibactériennes, capables de désinfecter à la fois l’intérieur de la dent et l'orifice. L’efficacité des hydrogels repose donc sur l’évaluation et le contrôle du relargage de l’agent antibactérien à travers l'orifice. L’objectif de ce projet est d’évaluer les variations de relargage à l'orifice et de maintien dans l’hydrogel d’une molécule fluorescente lorsque des éléments anatomiques et physicochimiques sont modifiés.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux connaître les cinétiques de relargage à partir d’hydrogels. Ces cinétiques sont très peu documentées, et plus particlièrement dans le cadre d’hydrogels pour la dent. L’objectif est de mieux comprendre et appréhender le comportement des hydrogels “in vivo”, afin de développer notre maitrise des cinétiques de relargage avant de proposer des études plus complexes sur la dent de souris à partir d’hydrogels formulés en conséquence. A long terme, ces travaux permettront la conception d’hydrogels antibactériens pour l'intérieur de la dent humaine. Il sera possible d’anticiper la libération des molécules antibiotiques, et donc de fournir aux patients un produit connu, maitrisé et par conséquent sécurisé. Ces produits permettront la désinfection à la fois de l'orifice et de l'interieur de la dent, et par conséquent la réduction du risque de d'infection du corps entier associé aux infections non traitées.
Procédures
Les animaux seront soumis à une opération de chirurgie sous cutanée sous anesthésie, puis à 9 procédures d'imagerie sous anesthésie également (imagerie en fluorescence ou en rayons X).
Impact sur les animaux
De précédentes études d’implantation d’hydrogel et de nanoparticules en sous-cutanée ne montrent pas signe de souffrance significative de l’animal. Toutefois, une attention particulière sera apportée concernant l’implantation des nanoparticules d’or. Il existe un risque de douleurs liées à l’incision dans le dos et à l’implantation d’un objet de grade chirurgical en sous cutanée. Les animaux pourraient souffrir de démangeaisons et douleurs dans le dos au niveau du lieu d’implantation. Par ailleurs, les animaux pourraient également souffrir de stress en raison de leur manipulation notamment pour l’imagerie quotidienne . Enfin, l’analyse au rayons X provoque une exposition à de faibles doses de rayons ionisants. Il n'y a pas d’effets secondaires dans la littérature. Cependant, ces expositions répétées pourraient induire une perte légère de poids et des démangeaisons pour lesquelles nous serons vigilants.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort, afin de rendre possible le prélevement de tissus sur environ 5mm autour de l'apex du modèle endodontique, et l'analyse des signes d'inflammation liés aux hydrogels.
Remplacement
Aucune méthode alternative ne peut se substituer à l'utilisation des animaux. Des tests “in vitro” ont au préalable été réalisés afin de limiter le nombre de conditions expérimentales (concentration en hydrogel, diamètres des apex…). Ce projet est une étape indispensable pour mimer un environnement associé à un système physiologique avant d’envisager des modèles plus compliqués à mettre en oeuvre et un passage vers la clinique. La souris, par sa petite taille, est un modèle adapté à l’imagerie corps entier, nécessaire ici pour suivre et quantifier la libération des molécules à partir des hydrogels.
Réduction
Le nombre d’animaux maximum nécessaire au total sur toutes procédures ,est de 190 sur 5 ans. Ce nombre, validé par une statisticienne , a été déterminé dans le but d’utiliser un nombre minimum d'animaux sans compromettre l’analyse statistique des résultats. L’utilisation de la tomographie par fluorescence permet de suivre la biodistribution sans mise à mort des animaux, limitant ainsi le nombre d’animaux nécessaire à cette étude.
Raffinement
Toutes les analyses d’imagerie ont lieu sous anesthésie afin de limiter l’angoisse des animaux, tout en conservant un temps de réveil court après endormissement. Lors de la chirurgie sous cutanée, les animaux seront anesthésiés et un traitement analgésique sera mis en place. L'apparence physique, le comportement (socialisation, nettoyage) seront observés 7/7 jours. et leur poids sera mesuré 2/7 jours.
Choix des espèces
L’utilisation de la souris permet, par sa petite taille, l’imagerie en corps entier. Par ailleurs, de précédent travaux mené sur la souris donne un meilleur recul et de plus grande chances de répétabilité. Les souris seront âgés de 8 semaines à leur réception. Le début des manipulations aura lieu lorsqu’elles auront 9 semaines (après une semaine d’acclimatation) et la mise à mort aura lieu à 10 semaines. A ce stade (jeune adulte, entre et 8 et 10 semaines) , la croissance est terminée, les souris sont pleinement formées, et le vieillissement n’a pas commencé. Cela permet de travailler avec un minimum d’interférences liées à la croissance physiologique de la souris, et donc de réduire la variabilité statistique. Plus cette variabilité est basse, moins le nombre d’animaux nécessaires est grand.
Etude des conséquences de l’exposition de souris gestantes aux nanoplastiques présents dans l’eau de boisson sur l’axe placenta-intestin-cerveau
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
Pour étudier les effets des nanoplastiques avalés pendant la gestation, 1 064 souris sont exploitées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue pour prélever sang et tissus. Les femelles boivent une eau chargée de nanoparticules de polystyrène une semaine avant l'accouplement puis pendant toute la gestation, et leurs petits sont soumis à des tests d'activité locomotrice, de mémorisation et d'anxiété à un et deux mois. Le porteur indique qu'un défaut de placentation peut entraîner une résorption fœtale, que les petits peuvent naître plus légers, et qu'un prélèvement de sang à la queue sans anesthésie provoque une douleur brève. Il décrit les modèles in vitro et les organoïdes comme "imparfaits" et présente le recours à la souris comme le seul moyen d'observer les conséquences sur la descendance.
Objectifs
L’exposition placentaire humaine aux nanoparticules de plastique est dorénavant documentée ainsi que leur passage transplacentaire. En effet, quatre études ont montré leur présence dans les placentas humains ainsi que dans le méconium des nouveau-nés, suggérant un passage materno-foetal. Des modèles in vitro et ex vivo ont permis d'étudier les conséquences de cette exposition sur les cellules placentaires humaines. Cependant, l’exposition n’est réalisable que sur des courtes durées et sur des cellules placentaires du 3ème trimestre. Or, les stades initiaux de la placentation sont cruciaux pour le bon déroulé de la grossesse, en particulier l’ancrage du placenta dans la muqueuse utérine. Ceci ne peut être étudié in vitro/ex vivo du fait de l'indisponibilité de placentas précoces avant 7 semaines d’aménorrhée. Aussi, les modèles d’organoides restent imparfaits tant dans leur structure cellulaire que dans l’exposition non-physiologique aux particules qui en résulte. Les conséquences sur le développement fœtal ne sont pas évaluables in vitro et ex vivo. Ainsi, les modèles actuels ne permettent pas d'étudier les conséquences sur le développement des nouveau-nés exposés in utero. A travers ce projet, nous nous intéresserons donc aux conséquences sur l’issue de grossesse de l’exposition aux nanoparticules de polystyrène au cours de la gestation et sur le devenir des nouveau-nés jusqu’au stade adulte. L’effet de deux lots de nanoparticules de polystyrène de diamètres différents présentant des caractéristiques d’internalisation différentes, sera étudié. De plus, les mécanismes d’action de ces nanoparticules variant selon leur concentration, l’effet de deux concentrations envionnementales et décrites dans la littérature sera analysé. Les souris (femelles) seront donc exposées une semaine avant l’accouplement puis tout au long de la gestation à ces particules via leur eau de boisson. L’objectif sera d’étudier le développement placentaire et l’issue de gestation de ces souris (poids foetal et maternel, anomalies placentaires, risque de retard de croissance intra-utérin). La descendance (exposée aux particules in utero) sera suivie jusqu’à l’âge adulte avec des analyses portant sur leur tractus digestif et leur dévelopement cérébral. L’ensemble de ce projet permettant ainsi d'étudier les conséquences d'une exposition in utero aux nanoparticules de plastiques sur l'issue de la gestation et le developpement global de la descendance.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera donc des connaissances sur l’absorption et la distribution sanguine des nanoparticules via le dosage de celles-ci. Des informations précieuses seront récoltées concernant les conséquences sur le développement et les fonctions placentaires mais aussi sur le développement des souris exposées in utero, tant sur la maturation intestinale et l’installation de leur microbiote que sur leur développement cérébral et comportemental. Ce projet s’inscrit dans un projet plus global et complètera les résultats obtenus sur les modèles in vitro et ex vivo. Ces résultats apporteront des connaissances essentielles concernant l’impact de l’exposition au cours de la grossesse aux polluants environnementaux avec une évaluation globale de l’axe placenta-intestin-cerveau. A long terme, ce projet participera à la détection des populations particulièrement à risque de grossesses pathologiques lié à une exposition environnementale ou professionnelle importante et au développement de mesures préventives.
Procédures
Les souris gestantes seront exposées 1 semaine avant l'accouplement puis tout au long de la gestation aux nanoparticules de plastique présentes dans leur eau de boisson. Un prélèvement bihebdomadaire, chez les souris gestantes, des fèces après émission spontanée sera réalisé pour un suivi du microbiote. Il est non-invasif, indolore et très court. Un prélèvement hebdomadaire des fèces après émission spontanée sera réalisé pour un suivi du microbiote jusqu’à J28 pour les souriceaux exposés in utero puis 1 fois à 1 et 2 mois. 15 jours après la mise-bas, en même temps que le prélèvement de fèces chez les souriceaux, un prélèvement de sang à la queue de la souris (sans anesthésie) sera pratiqué, provoquant une douleur légère de courte durée. Des tests comportementaux chez les souriceaux à 1 et 2 mois seront réalisés : tests d'activité locomotrice, de mémorisation et d'anxiété. Ils seront réalisés avec un intervalle de 2-3 jours. Les tests de locomotion, de mémorisation et d'anxiété durent respectivement 15 min, 30 min et 4min. Les prélèvements sanguins en fin d'expérimentation sont réalisés sous anesthésie prodonde pour éviter toute souffrance à la souris.
Impact sur les animaux
Les concentrations en nanoparticules choisies n’induisent pas de cytotoxicité aigue d’après les données de la littérature et les résultats in vitro sur cellules placentaires humaines. Aussi, l’exposition sera réalisée uniquement sur les souris femelles, au moment de la gestation à savoir, 1 semaine en amont de l’accouplement et durant l'ensemble de la gestation. Les effets indésirables prévus d’après les données de la littérature sont relativement faibles mais : il est possible qu’un défaut de placentation survienne entrainant alors un risque de résorption fœtale chez les souris gestantes. Un plus petit poids de naissance peut être observé chez les souriceaux exposés in utero aux particules. Aussi, les tests comportementaux pourront entrainer une possible anxiété et le prélèvement sanguin à J15 un risque d’hypovolémie. Les prélèvements de selles seront non-invasifs (isolement bref de 5min d’une souris et récupération de crotte) n’entrainant pas d’effets indésirables. Les mâles reproducteurs seront isolés brièvement entre les périodes d'accouplement; un risque d’ennui et de stress existe qui sera réduit par des cages transparentes leurs permettant de voir leur congénères et par un enrichissement de celle-ci.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour des prélèvements de sang et de tissus.
Remplacement
Des études in vitro et ex vivo ont été menées afin de tester la cytotoxicité des nanoparticules sur les cellules placentaires humaines. Les concentrations choisies n’induisent pas de cytotoxicité aigue in vitro. Aussi, ces travaux ont permis d’appréhender certains mécanismes d’action cellulaires qui seront recherchés dans ce modèle in vivo; seul modèle permettant d'étudier les conséquences d'une exposition aux nanoparticules de plastique, in utero, sur la descendance.
Réduction
Grâce aux données de la littérature, un calcul statistique de puissance a été réalisé afin d’évaluer le nombre d’animaux à inclure pour obtenir des résultats significatifs tout en réduisant au maximum ce nombre. Les analyses statistiques seront réalisées avec des tests non-paramétriques pour les petits nombres d’animaux par groupe (
Raffinement
Les souris gestantes seront exposées par l’eau de boisson à des concentrations environnementales en nanopolystyrene pour une durée d’un mois maximum. Pour maintenir l’interaction sociale, les souris seront placées au nombre de 3 à 4 par cage avec un enrichissement sous forme de coton, carton, bâtonnets de bois. Le soin et le suivi des animaux seront évalués par des personnes compétentes et expérimentées (zootechniciens) et de manière bihebdomadaire par l’expérimentateur. Des points limites bien définis à l’aide d’une grille de score seront mis en place avec mise à mort selon les scores atteints. L’anesthésie profonde au moment de la mise à mort sera vérifiée par pincement des doigts avant de procéder aux prélèvements.
Choix des espèces
Nous utiliserons la souris car elle possède un placenta hémochorial dont les échanges foetaux-placentaires sont extrapolables à l’espèce humaine. La gestation est de courte durée et la taille de la portée importante ce qui facilite l’étude concernant le devenir de la descendance exposée in utero aux nanoparticules. Les souris femelles gestantes et les males reproducteurs seront utilisés à l’âge adulte (8 semaines). Les souriceaux mâles et femelles seront utilisés à partir de la naissance. Les nanoparticules seront incluses dans l’eau de boisson des souris gestantes une semaine avant l’accouplement et tout au long de la gestation. Les souriceaux exposés in utero aux particules (males et femelles) sont inclus dans le protocole dès la naissance et jusqu’au stade adulte (2 mois). Des prélèvements de selles (passif, pas de gestes invasifs) sont pratiqués une fois par semaine jusqu’à J28 puis 1 fois par mois à 1 et 2 mois (J7, J15, J21, J28, J42, J56). Des tests comportementaux sont pratiqués à 1 et 2 mois.
Etude de l’activité anti-tumorale de vecteurs viraux ou vésicules extracellulaires de cellules infectées par des virus combinés ou non avec de l’immunothérapie dans des modèles murins de tumeurs syngéniques
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
10 656 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère pour 8 880 d'entre elles et modéré pour 1 776. Toutes reçoivent une greffe de cellules tumorales sur animal vigile puis jusqu'à trois injections de virus, et 7 776 subissent en plus des injections d'immunothérapie jusqu'à trois fois par semaine pendant 31 jours. Le porteur indique que les tumeurs greffées sous la peau peuvent nécroser, s'ulcérer et saigner, que les nodules pulmonaires peuvent entraîner des difficultés respiratoires, et que 180 souris guéries seront réinjectées de cellules tumorales. Les 1 776 souris comptées comme réutilisées sont destinées à l'entraînement de personnel, et seront tuées si aucune formation n'a lieu.
Objectifs
Le cancer est la deuxième cause de décès dans les pays développés après les maladies cardiovasculaires. Les traitements conventionnels de nombreux cancers tels que la radiothérapie, la chimiothérapie et la chirurgie ont démontré des limites d’efficacité nécessitant un besoin urgent de nouvelles stratégies thérapeutiques. Les virus ou les vésicules extracellulaires (EV) libérées par des cellules infectées par un virus sont une nouvelle classe d’agent thérapeutique pouvant être une alternative au traitement des cancers. Les virus candidats vont servir de vecteurs pour permettre l’expression d’agents thérapeutiques et bioactifs au sein des tumeurs pour lesquelles il y a un fort besoin médical en clinique humaine. Sachant que le développement clinique de ces virus prévoit de les combiner avec de l’immunothérapie afin de potentialiser l’activité anti-tumorale, le projet se propose d’explorer dans les modèles murins les combinaisons de ces virus (ou EV) avec des traitements d’immunothérapie pour le traitement de cancers de différentes origines. Le but de ce projet sera d’évaluer l’effet thérapeutique des virus candidats-médicaments en association ou non avec de l’immunothérapie. Ce projet vise à déterminer l’activité anti-tumorale de nos vecteurs et de relier l’activation du système immunitaire (obtenue dans des modèles In vitro et In Vivo) à un contrôle de la croissance tumorale et/ou une augmentation de survie. Les données générées nous permettront d’améliorer notre compréhension des mécanismes d’action dans un organisme complexe et d’envisager le développement de ce candidat en déterminant sa chronologie d’action et son efficacité.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à caractériser l’efficacité anti-tumorale de virus recombinants ou de vésicules extracellulaires de cellules infectées en combinaison ou non avec des produits d’immunothérapie. Il s’agit de mieux comprendre l’impact de l’injection de vecteurs viraux (ou EV) sur la croissance tumorale. Cette connaissance devrait nous permettre de mettre en place de nouvelles thérapies anti-cancéreuses chez l’Homme.
Procédures
Toutes les souris recevront une greffe de cellules qui sera effectuée sur souris vigile, durée environ 1 minute. Toutes les souris recevront au maximum 3 injections de virus. Chaque injection sera réalisée sur souris vigile mais geste rapide de l’ordre de la minute. Les injections seront séparées de 2 jours ou 8 jours maximum selon le virus ou EV candidat. 7776 souris recevront des injections de produits d’immunothérapie qui seront réalisées sur souris vigile, durée des injections environ 1 minute, maximum 3 injections par semaine durant 31 jours maximum. S’il y a guérison, 180 souris (maximum) seront ré-injectées avec des cellules tumorales. Ce geste sera réalisé sur souris vigiles, durée environ 1 minute.
Impact sur les animaux
Les souris greffées avec des cellules tumorales pourront voir leur état général s’altérer avec des signes cliniques d’affaiblissement (prostration, poils hirsutes, amaigrissement…). L’implantation de cellules tumorales en sous-cutané sur le flanc de la souris pourra entrainer une gêne dans la mobilité de l’animal mais on veillera à bien implanter les cellules au milieu du flanc pour éviter au maximum un développement proche des pattes. La tumeur implantée sur le flanc pourra nécroser voire ulcérer et saigner. L’implantation de cellules tumorales par voie intra-veineuse rendra le développement tumoral non visible pour l’expérimentateur mais des nodules tumoraux pourront apparaître au niveau des poumons notamment et entrainer des difficultés respiratoires avec une perte de poids et dégradation de l’état général. Les injections répétées chez la souris peuvent également être source de stress et d’angoisse mais tout est mis en œuvre pour limiter cette nuisance (gestes rapides inférieurs ou égaux à 1minute par du personnel formé, utilisation tunnel de change, …). Elles peuvent aussi induire une induration ou inflammation au site d’injection mais qui est transitoire et nous essaierons de décaler les sites d’injections pour éviter d’injecter 2 ou 3 fois au même endroit On ne peut pas exclure un effet secondaire des produits d’immunothérapie seuls ou en combinaison avec nos virus ou EVs. Si c’est le cas on peut s’attendre à une perte de poids transitoire ou un effet sur le comportement mais les doses seront choisies en fonction des données pharmacologiques publiées ou obtenues antérieurement.
Devenir
Les animaux surnuméraires pourront être utilisés dans le cadre de la formation continue ou formation des nouveaux arrivants après accord du responsable de la SBEA. Ces animaux seront classés en sévérité modérée. Dans le cas où aucune formation n’est nécessaire, ces animaux seront mis à mort. Toutes les souris incluses dans l’évaluation des virus (ou EV) seront mises à mort soit après atteinte d’un point limite, soit à la fin de l’étude à J+90 si guérison car souris non réutilisables suite à l’injection de cellules tumorales et virus (ou EV) soit après re-challenge et atteinte de points limites.
Remplacement
Avant d'être testés chez l'animal, les virus (ou EV) ont été testés dans des modèles in vitro. Seuls les virus (ou EV) avec une bonne activité dans ces modèles seront testés chez la souris. Démontrer une activité anti-tumorale avec survie et guérison nécessite un système complet permettant la croissance tumorale, la vascularisation, l'intervention du système immunitaire et toute la pharmacocinétique du médicament. A l'heure actuelle aucun système alternatif ne réunit toutes ces conditions.
Réduction
Avant d’être testés chez l’animal, les virus-candidats médicaments auront été évalués in vitro sur des modèles cellulaires de tumeurs humaines et murines établies et caractérisées, ainsi que dans des cellules primaires (non tumorales) pour sélectionner les virus candidats médicaments ayant une activité antitumorale et ne présentant pas de cytotoxicité. Le nombre d’animaux nécessaire à la réalisation des expériences a été déterminé en se basant sur les résultats obtenus lors de nos expériences antérieures. Nous avons retenu et validé le nombre d’animaux nécessaires à l’obtention de résultats fiables et robustes. Les virus (ou EV) qui ne devraient pas avoir une activité suffisante et concluante ne seront pas testés ultérieurement. Leur étude sera stoppée.
Raffinement
Tout au long de leur vie, une attention particulière est portée au bien-être des animaux en particulier par un enrichissement de leur milieu de vie (matériel de nidification : bâtonnet et carré de coton dans chaque cage) qui leur permet d’assouvir les comportements liés à leur espèce et la thermorégulation. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux pendant toute la durée des expérimentations, dans le but de préserver les interactions sociales entre congénères. A la réception des souris une phase d’acclimatation de 2 semaines minimum est prévue. Durant la première semaine les souris seront laissées dans leur nouvel environnement afin qu’elles se familiarisent avec celui-ci. Puis, l’expérimentateur habituera l’animal à la contention et aux gestes utilisés. L’utilisation d’un tunnel de change permettra également de réduire le stress et l’angoisse chez l’animal. La réalisation des gestes techniques par des techniciens rompus à ces manipulations garantissent la bonne reproductibilité des expériences. Ceci permet de limiter le nombre d’animaux inclus dans les procédures et un suivi optimal du bien-être des animaux. Des critères d’interruption de l’expérimentation en fonction de l’aspect clinique des animaux (mesure du volume tumoral, l’apparence de la tumeur, l’évolution pondérale, l’apparence physique générale, le comportement) sont mis en place afin de limiter autant que possible la souffrance des animaux.
Choix des espèces
La souris est un modèle de référence en oncologie. Il s’agit de mammifères au système immunitaire assez proche de l’homme pour pouvoir utiliser des données générées dans une approche translationnelle valide. De plus, ll existe de nombreux outils permettant de caractériser les réponses immunitaires chez cette espèce. Animaux adultes de 4 à 5 semaines minimum (à la réception), soit 6 semaines minimum au début de l’étude (avec 2 semaines de stabulation). Six semaines est l’âge où le système immunitaire est considéré comme suffisamment mature pour débuter l’étude
Mise au point de méthodes de délivrance de nanoparticules théranostiques, permettant de réduire le passage hépatique, sur un modèle de souris porteuses de tumeurs cérébrales
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Implantées de cellules tumorales dans le cerveau par chirurgie, puis soumises à des instillations nasales répétées sous contention ou à la pose d'un cathéter dans la carotide, 392 souris seront toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré pour 337 d'entre elles et sévère pour 55. Le porteur indique que la croissance de la tumeur peut provoquer une perte de poids, une prostration et des difficultés neurologiques au-delà de 3 à 4 mm de diamètre, et qu'une infection peut apparaître au point d'insertion du cathéter. L'hyperthermie magnétique porte la température locale à 44 °C pendant trente minutes, ce qu'il décrit comme sans "désagrément pérenne" pour l'animal. Sur le remplacement, il affirme que les essais in vitro ne prédisent pas le comportement des nanoparticules et conclut que le modèle animal ne peut être substitué à cette étape.
Objectifs
Une des limites actuelles aux stratégies de traitement de certaines tumeurs (notamment cérébrales) est liée au fait que les molécules thérapeutiques utilisées, bien qu’efficaces, ne sont pas délivrées spécifiquement dans le tissu tumoral. Une des voies explorées pour résoudre ce problème est le recours aux nanoparticules (NPs). Non seulement, les NPs peuvent être modifiées pour atteindre de façon spécifique une tumeur (particules dites fonctionnalisées) mais elles combinent potentiellement deux autres avantages : elles pourraient servir directement à une thérapie par chauffage local d’une tumeur (thermothérapie magnétique) et à un suivi par imagerie d’une tumeur. Nous souhaitons cibler des tumeurs cérébrales à l’aide de particules qui contiennent une molécule reconnaissant spécifiquement les cellules tumorales et qui contiennent un cœur de fer et nous souhaitons améliorer leur accumulation dans les tumeurs en limitant leur captation par les cellules macrophages du foie, phénomène décrit comme apparaissant rapidement après l’injection (moins de 10 min) par voie intraveineuse des NPs dans des études précédentes. Les animaux pourront recevoir si nécessaire des ultrasons localisés sur la zone tumorale pour ouvrir localement la barrière hémato-encéphalique, pour optimiser encore l’incorporation dans la tumeur. Nous souhaitons tester différentes méthodes décrites dans la littérature comme limitant la captation de produits actifs par les cellules du foie, dans le cadre de traitement de tumeurs cérébrales. Ces méthodes n’ont pas été décrites pour le type de NPs que nous utilisons. 1) Méthode par administration intra nasale : instillations nasales de faible volume. 2) Méthode par administration sublinguale : les NPs sont concentrées dans un gel appliqué entre la joue et la gencive. 3) Méthode par injections intra carotidiennes répétées en mettant en place un cathéter permanent dans la carotide. 4) Un traitement préalable à l’injection des NPs avec des liposomes qui encapsulent une molécule particulière (clodronate) et qui sont connus pour supprimer transitoirement les cellules macrophages du foie. Si une des méthodes permet d’optimiser de façon satisfaisante l’incorporation des particules dans les tumeurs, un traitement par hyperthermie magnétique sera réalisé.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont l’optimisation des procédures de traitements des tumeurs cérébrales par des nanoparticules pour une meilleure incorporation dans les tumeurs et donc un effet thérapeutique potentiellement supérieur.
Procédures
Les animaux seront traités avec les nanoparticules par un mode d’administration différent selon le groupe auxquels ils appartiennent. La durée de chaque traitement et le nombre d’administrations dépendent de la voie administration allant de quelques secondes à plusieurs fois quelques secondes toutes les 5 minutes pendant 45 min à 30 min. Une partie des animaux seront implantés avec des cellules tumorales par injection intracrânienne, la procédure dure 20 minutes/animal. Le devenir des particules sera suivi par Imagerie IRM (1 heure d’acquisition) après administration des particules, ainsi que 24h après la dernière administration. La croissance tumorale sera également suivie par Imagerie IRM. Pour chaque groupe d’animaux correspondant à un mode d’administration, une partie des animaux recevra un traitement visant à diminuer les macrophages du foie, traitement administré une fois par intraveineuse (d’une durée de quelques secondes) et dont l’effet perdure 5 jour. Les animaux pourront recevoir des ultrasons localisés sur la zone tumorale pour ouvrir localement la barrière hémato-encéphalique, cette procédure dure quelques minutes. Une partie des animaux sera traitée par hyperthermie en faisant chauffer la température localement dans la tumeur par hyperthermie magnétique (c’est le cœur de fer des nanoparticules qui chauffe).
Impact sur les animaux
Les animaux ne seront pas tous confrontés aux mêmes effets indésirables, les effets indésirables prévus dépendent du mode d’administration, de l’induction ou non du modèle tumoral, l’utilisation de méthodes complémentaires (Ultra sons focalisés (FUS), suppression macrophage, hyperthermie…) et des examens qu’ils vont avoir. Les effets indésirables sont classés ci-dessous par type de méthode/examen : L’administration par instillation nasale nécessite soit une anesthésie, soit une contention ferme transitoire, réitérée toutes les 5 min environ sur une durée de 45 minutes. Cette contention peut générer du stress. En fonction de la prise en main du geste, l’une ou l’autre solution sera appliquée. Il est possible qu’un mauvais passage entraine des difficultés respiratoires. La thérapie par hyperthermie magnétique nécessite un examen IRM sous anesthésie, cette technologie entraine une augmentation de la température de l’animal, localisée et transitoire (44°C), durant la stimulation (30 minutes maximum), mais n’entraine pas de désagrément pérenne pour l’animal. Le shunt du premier passage au foie, qui permet aux particules de ne pas passer par le foie en première circulation après injection, réalisé par injections répétées nécessite la mise en place d’un cathéter carotidien, chirurgicalement. Une inflammation et une douleur transitoire sont prévisibles. Une manipulation minimale tous les 5 jours est nécessaire pour éviter que le cathéter ne se bouche. Une infection peut apparaitre au niveau de la zone d’insertion du cathéter. L’induction du modèle tumoral cérébral nécessite une chirurgie, entrainant une légère inflammation et une douleur transitoire. La croissance tumorale peut entrainer une perte de poids, une apathie ou une prostration et des difficultés neurologiques lorsque la tumeur atteint une taille supérieure à 3-4 mm de diamètre (mesurée par imagerie).
Devenir
Les animaux seront euthanasiés pour recueillir les organes afin de réaliser des études histologiques sur les tissus. L’imagerie IRM permet la quantification in vivo du fer accumulé dans les tumeurs mais il est nécessaire de vérifier les résultats IRM à l’aide d’une analyse histologique. Les images IRM n’ont pas la résolution nécessaire pour identifier les cellules ayant incorporées les nanoparticules, seule l’analyse post-mortem permet d’observer finement la répartition des particules par type cellulaire.
Remplacement
L’objectif de ce projet est de valider in vivo l'efficacité diagnostique et/ou thérapeutique de NPs après une accumulation optimisée dans une tumeur et activées par une stimulation externe. Des expériences in vitro ont permis de caractériser l’interaction de NPs isolées avec différents types cellulaires, mais elles ne sont pas prédictives des propriétés in vivo d’affinité, de spécificité et d’effet thérapeutique des NPs pour les cellules cancéreuses ciblées. Avant d’envisager un transfert à l’homme, il est nécessaire d’étudier dans un organisme vivant les relations entre le devenir des NPs (pharmacocinétique), notamment après une accumulation et la modulation de la pathologie (pharmacodynamique), d’évaluer les propriétés thérapeutiques de ces NPs. Par conséquent, à cette étape du projet, le modèle animal ne peut être substitué par un autre modèle d'étude in vitro ou in silico.
Réduction
Les études réalisées au laboratoire ont déjà permis de définir des conditions d’implantations des tumeurs, l’apprentissage des actes chirurgicaux se fera en amont, réduisant le nombre d’animaux nécessaire, notamment pour les animaux implantés avec un cathéter carotidien et une tumeur cérébrale. Le suivi longitudinal in vivo avec des dispositifs d’imagerie non invasifs (IRM) permet d’utiliser le même animal à différents temps, et ainsi d’acquérir une grande quantité d’information sur la croissance tumorale et la réponse à un traitement tout en limitant le nombre d’animaux. Le protocole est construit avec différentes étapes (comparaisons des voies d’administrations, ajout d’autres méthodes et pour finir test des paramètres d’hyperthermie avec la méthode la plus intéressante. Si une des voies d’administration testée en première instance ne permet pas de réduire la captation par le foie des particules par rapport à la voie de référence, elle ne sera plus évaluée lors des étapes suivantes, réduisant d’autant le nombre d’animaux. Le nombre de paramètres de traitements pourra être réduit si les premières expérimentations montrent une amélioration significative de la captation tumorale. La quantification du contenu en fer des tumeurs et du foie sera évaluée par IRM puis la présence des particules sera évaluée en post mortem par histologie (semi-quantitatif). Une analyse statistique tenant compte des différents paramètres étudiés (nombre de facteurs, données répétées), a été utilisée pour définir le nombre d’animaux nécessaires à l’atteinte de chaque objectif.
Raffinement
L’imagerie IRM, l’administration par voie sublinguale et /ou intranasale et les intraveineuses seront réalisées sous anesthésie. Les animaux utilisés pour l’implantation de cathéters et/ou de cellules tumorales recevront une antalgie préopératoire 30 minutes avant le début de la chirurgie, puis seront anesthésiés. Durant la chirurgie, les animaux seront placés sur un tapis chauffant pour éviter toute hypothermie, puis pendant la phase de réveil, seront maintenus dans une couveuse thermostatée pour favoriser la récupération. Des soins post opératoires seront réalisés, ainsi qu’un suivi tout au long de la durée de vie de l’animal pour évaluer l’état sanitaire ( mise en place de pointd limites).
Choix des espèces
Les modèles rongeurs représentent les modèles les plus utilisés en oncologie, notamment parce que les études comparatives sont facilitées par l’existence de nombreuses souches qui fournissent des animaux génétiquement similaires. II existe des modèles immunodéficients (Nude) permettant d’étudier des tumeurs issues de lignées cellulaires humaines sans risque élevé de rejet de la greffe tumorale. Nous utiliserons uniquement des mâles adultes pour corréler avec les études déjà réalisées avec les nanoparticules utilisées.
Etude des bases neurobiologiques impliquées dans la vulnérabilité à l’addiction à la cocaïne chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour étudier la vulnérabilité à l'addiction à la cocaïne, 652 rats sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour prélèvement d'échantillons. La plupart subissent une chirurgie cérébrale de deux heures puis la pose d'un cathéter veineux, avant trente séances d'autoadministration de cocaïne sur plusieurs semaines. Le porteur écrit que le rat "s'autoadministre à son gré et librement", une formulation qui gomme le dispositif expérimental imposant l'accès à la drogue. L'étude relève de la recherche fondamentale, ses applications thérapeutiques restant évoquées de façon générale.
Objectifs
L’addiction à la cocaïne est un enjeu de santé publique. Aucun traitement n’est actuellement approuvé pour cette addiction qui se développe chez environ 20% des usagers dits vulnérables. Au moyen d’un modèle validé chez le rat, qui permet d’identifier 20% de sujets à risque de développer un comportement de type addiction à la cocaïne, nous cherchons à comprendre les différences biologiques entre sujets vulnérables et résilients afin d’identifier des mécanismes pathologiques et des cibles thérapeutiques. Précisément, nous cherchons à identifier dans le comportement des animaux vis-à-vis de récompenses naturelles palatables des facteurs prédictifs de cette vulnérabilité à l’addiction à la cocaïne. Nous cherchons à comprendre les mécanismes cérébraux d’un comportement adapté vis-à-vis des récompenses naturelles et vis-à-vis de la cocaïne, et à établir comment sujets vulnérables et résilients à l’addiction diffèrent pour ces mécanismes.
Bénéfices attendus
La consommation de cocaïne est en forte expansion en Europe et un enjeu de santé publique mondial. Ce projet participe à la compréhension des mécanismes biologiques et comportementaux qui sous-tendent la vulnérabilité à cette addiction. Cette compréhension doit permettre de guider les approches thérapeutiques, y compris psycho-comportementales.
Procédures
380 animaux seront soumis à une chirurgie cérébrale (durée moyenne : 120 min) puis 20 à 30 jours plus tard à une chirurgie intraveineuse pour l'implantation d'un cathéter intraveineux (durée moyenne : 30 min) suivie de 30 sessions d'autoadministration de cocaïne (2h par jour, 5 jour par semaine). 192 animaux seront soumis à 30 sessions d'autoadministration orale d'une solution palatable (2h par jour, 5 jour par semaine) suivies d'une chirurgie intraveineuse pour l'implantation d'un cathéter intraveineux (durée moyenne : 30 min) suivie de 30 sessions d'autoadministration de cocaïne (2h par jour, 5 jour par semaine). 80 animaux seront soumis à une chirurgie cérébrale (durée moyenne : 120 min) suivi de 35 sessions d'autoadministration orale d'une solution palatable (2h par jour, 5 jour par semaine). Toutes les chirurgies sont effectuées sous anesthésie générale, en conditions aseptiques, sur couverture chauffante.
Impact sur les animaux
Les procédures appliquées dans ce projet sont toutes de gravité modérée. Les nuisances attendues sont celles associées à une chirurgie vasculaire ou cérébrale, dans des conditions où toutes les mesures sont prises pour réduire douleur et risque d’infections (aseptie, anesthésie générale, analgésie/anti-inflammatoire pré- et post-opératoire sur plusieurs jours). Les nuisances attendues sont celles associées à l'autoadministration de cocaïne dans des conditions où toutes les mesures sont prises pour minimiser les risques cardiovasculaires connus liés à l'usage de cette drogue (limite de la quantité prise par jour, alternance d'accès et de non accès à la drogue, traitement anti-thrombose). L'autoadministration est un comportement opérant ; le rat émet une réponse comportementale qui lui donne accès à la récompense (cocaïne ou solution palatable). Il s'autoadministre à son gré et librement.
Devenir
Au terme des trois procédures, les animaux seront mis à mort selon une méthode réglementaire, pour prélèvement d’échantillons.
Remplacement
Seul le modèle animal permet d’interroger les mécanismes neurobiologiques difficilement accessibles chez l’homme. De plus, l’étude du comportement addictif ne peut se réduire à la simple étude de l’effet de la drogue. Ce comportement met en jeu des mécanismes psychopharmacologiques complexes qui ne peuvent pas être appréhendés par des modèles ex vivo.
Réduction
L'utilisation d'un trop grand nombre d'animaux est contraire à l'éthique, mais si trop peu d'animaux sont utilisés, l'expérience peut manquer de puissance statistique. Nous procédons à des analyses statistiques afin de déterminer le nombre minimum de sujets nécessaires pour obtenir un résultat fiable. Notre grande maîtrise des chirurgies et des procédures comportementales que nous mettons en œuvre nous permet de ne pas dépasser ce nombre minimum.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en cycle inversé (obscurité : 7h-19h). Les expériences se déroulent dans la phase active de ces animaux nocturnes, respectant leur sommeil. Ils sont hébergés individuellement pour éviter des blessures ou dégâts aux implants entre congénères. Les cages transparentes sont disposées pour que chacun ait un contact visuel, auditif et olfactif avec deux de ses congénères. Pour enrichissement, des lanières de papier kraft sont placées dans la cage et renouvelés systématiquement lors du change. Les paramètres environnementaux sont contrôlés en permanence. Hors études comportementales, les animaux sont manipulés deux fois et pesés une fois par semaine. Dès le début des études comportementales, les animaux sont pris en main deux fois par jour (sauf week-end où ils sont observés). Une à deux semaines avant leur application, les animaux sont habitués à toutes les manipulations, jusqu’à ce que chaque animal, si c’était le cas, n’exprime plus d’inconfort. Un anti-inflammatoire/analgésique est administré en pré-opératoire. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale gazeuse ou anesthésie/analgésie chimique. Des mesures strictes d’asepsie sont appliquées. Les chirurgies sont réalisées sur couverture chauffante. Les périodes post-opératoires font l’objet d’un suivi spécifique pendant trois jours incluant une pesée quotidienne et un traitement antalgique/anti-inflammatoire. Des points limites stricts et spécifiques au projet ont été définis qui conduisent à décider d’une euthanasie en accord avec le vétérinaire.
Choix des espèces
Compte tenu des questions que nous posons, il est nécessaire d’utiliser une espèce mammifère dont le développement des réseaux neuronaux permet l’expression d’un comportement aussi complexe que la prise de drogue. Or il a été montré un continuum entre les mécanismes psychologiques et biologiques des processus de récompense entre le rat et l’homme, et ces processus sont à la base de l’addiction, étudiée dans ce projet. Nous utilisons des rats âgés de 8 à 10 semaines à leur arrivée au laboratoire (250-275 / 270-300g) correspondant au stade jeunes adultes, ce qui garantit, compte tenu des périodes d’habituation appliquée, d’étudier l’addiction de façon stable à l’âge adulte.
Evaluation des effets de composés dans des modèles cognitifs chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
22050 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 1800 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal peut subir jusqu'à 28 tests comportementaux non détaillés, 672 administrations de substances et 90 prélèvements sanguins, certains protocoles incluant des chocs électriques provoquant une réaction aversive. Le porteur signale désorientation, convulsions rares, apathie, perte de poids et léthargie selon les substances employées pour induire un trouble cognitif. Il reconnaît tester aussi des molécules déjà sur le marché, pour mesurer la "prédictivité" de ses propres modèles.
Objectifs
Le trouble cognitif est un trouble mental fréquent au cours du vieillissement normal puisqu'il touche jusqu'à 50 % des sujets âgés de plus de 55 ans. Les principaux types de troubles cognitifs marqués sont le délire, la démence, la perte d’attention et l'amnésie. Les cas les plus sévères sont associés aux maladies neurodégénératives telles que la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson ou la maladie de Huntington. A l’heure actuelle, il y a seulement quatre médicaments (donepezil, rivastigmine, galantamine et memantine) reconnus officiellement pour le traitement des symptômes cognitifs. Les effets de ces molécules restent modestes et ne sont pas dénués d’effets secondaires dont les plus courants sont des troubles gastro-intestinaux. Ainsi, la recherche vise à trouver un médicament plus efficace sans effets secondaires majeurs et à disséquer les mécanismes conduisant aux troubles cognitifs. A l’heure actuelle, le criblage des molécules aux effets procognitifs peut se faire sur les modèles basés sur la capacité d’apprentissage et de mémoire chez le rat ou la souris non transgéniques ayant un dysfonctionnement mnésique naturel lié au vieillissement ou induit pharmacologiquement. En effet, en fonction de la situation considérée les troubles cognitifs peuvent résulter de l’altération de différents phénomènes comme l’altération de la voie cholinergique, l’altération de la voie glutamatergique, l’augmentation de l’inflammation cérébrale,… Dans ce projet, nous nous proposons de tester des traitements en développement sur leur efficacité à améliorer la cognition. Chaque procédure de ce projet utilise un moyen diffèrent pour induit un trouble cognitif chez la souris afin de mimer différentes situations pathologiques de l’altération de la fonction cognitive mais utilise le même test d’évaluation de la cognition chez la souris.
Bénéfices attendus
Avec ce projet nous espérons participer à la sélection de nouveaux traitements pour traiter les troubles cognitifs. De plus comme nous testons également des molécules déjà sur le marché ou en phase clinique, nous participons à une meilleure connaissance de la prédictivité de nos modèles,c’est-à-dire de leur capacité à reproduire les effets des médicaments dans la situation expérimentale comme lors de son utilisation chez l’Homme.
Procédures
Les animaux de ce projet être amenés à réaliser 28 tests comportementaux d’évaluation de leur capacité cognitive et/ou de motricité (10-30 min), recevoir un maximum de 672 administrations et de 1 à 90 prélèvements sanguins sur une période de 168 en ne dépassant pas les recommandations éthiques en termes de volume prélevé et en garantissant le délai de récupération réglementaire. Les administrations durent moins de 30 secondes en prenant en compte le temps d’injection et également le temps de la contention. Une injection intraveineuse dure environ 5 min avec le temps de l’anesthésie, le temps de dilater la veine, l’injection et le point de compression au site d’injection. Concernant les prélèvements de sang, ils durent de 1 à 5 minutes selon la méthode utilisée.
Impact sur les animaux
Les administrations répétées ainsi que les potentiels prélèvements sanguins peuvent induire des souffrances au niveau des sites d’administration et de prélèvement comme une douleur passagère ou une irritation, une inflammation, une induration mais aussi un phénomène de mâchonnement et de fausse route pour la voie per os. Un stress lié aux différentes manipulations (administration de composés, contention, …) et tests comportementaux peut également apparaitre. Si le prélèvement terminal de sang nécessite une mise à jeun (
Devenir
A la fin de chaque procédure les animaux sera mis à mort à la fin de l'expérience, une partie des animaux est sacrifiée pour faire des prélèvements, l’autre partie ne peut pas être replacée ou ré-utilisée car les animaux sont traités avec des substances aux effets inconnus à long terme.
Remplacement
Bien qu'il soit possible de disséquer les mécanismes d’action des nouveaux médicaments in vitro, les réponses comportementales des animaux suite aux traitements sont des évènements difficiles à simuler et à prédire par des expériences in vitro. Ainsi vue notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. En effet, l'analyse des comportements liés à la mémoire nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vivant et vigile. Néanmoins, les molécules testées dans ce projet ont fait l’objet d’une sélection sur des tests in vitro afin de choisir celles qui ont le plus fort potentiel thérapeutique.
Réduction
Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’informations scientifiques par test. C’est pourquoi, très souvent, des prélèvements post-mortem seront associés aux études in vivo dans l’objectif de soutenir les données obtenues par des analyses histologiques. De plus, quand c’est possible et pertinent, nous associons plusieurs tests de comportement sur les mêmes animaux afin de ne pas multiplier les cohortes. Au regard de notre expertise, de la littérature et de la variabilité phénotypique inter-individuelle et d'une éventuelle différence inter-individuelle à l’exposition aux traitements, les groupes expérimentaux seront constitués au maximum de 10 à 15 animaux. Des analyses statistiques finales seront réalisées. Les animaux incluent dans ce projet vont nous permettre de mener 360 études réparties sur les 5 ans de l'autorisation.
Raffinement
Le bien-être des animaux est primordial durant les expérimentations. Ainsi un certain nombre de mesures sont mises en œuvre notamment l’inclusion de phase d’acclimatation (minimum 1 semaine) avant toute expérimentation. Les animaux sont hébergés dans des conditions optimales afin de réduire au maximum le stress lié à la captivité et aux expérimentations. Nous portons une attention particulière à ce que les animaux puissent exprimer certains de leurs comportements propres. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux. De plus, l’environnement des animaux est enrichi par du matériel de nidification, un dôme pour se cacher et un tunnel suspendu. Lors de l’utilisation de souris âgées le nombre d’animaux par cage est réduit et l’enrichissement doublé pour limiter les phénomènes de dominance. Le nombre et la durée des tests sont réduits et espacés autant que possible. De plus nous avons établis des points limites afin de soustraire l’animal à une douleur qui n’est pas en relation avec les signes attendus du projet. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec notre Structure du Bien Être Animal (SBEA) pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures. Chaque fois que les animaux sont soumis à divers tests, le choix des tests, la fréquence de mise en oeuvre et leur ordre d’exécution est établi afin d’impacter le moins possible le bien-être des animaux.
Choix des espèces
Dans le cadre de ce projet, nous utilisons des souris non transgéniques. Le choix de l’espèce a une importance primordiale dans la recherche à visée médicale. Ce choix prend en compte plusieurs critères mais le critère majeur est la pertinence scientifique du modèle. Nous n’utilisons que des modèles fiables qui présentent une prédictivité reconnue, une bonne reproductibilité et dont l’extrapolation des conclusions à l’homme est largement admise. C’est le cas pour la souris dans les études des phénomènes mnésiques. De plus tous nos modèles répondent favorablement aux médicaments déjà sur le marché ce qui prouve leur prédictivité et permettent aux industriels d’étudier l’apport de leurs nouvelles recherches par rapport aux traitements déjà existants. De plus, cette espèce dispose d’une énorme base d’informations physiopathologiques et d’outils de diagnostiques permettant ainsi de réduire considérablement les expérimentations pilotes. Les atteintes cognitives sont des phénomènes qui peuvent être liés à l’âge mais cela n’est pas systématiquement le cas. Ainsi dans ce projet nous utilisons des souris âgées au minimum 4 à 5 semaines au début du projet.
Evaluation de l’efficacité de composés à visée thérapeutique chez la souris immunodéprimée ou immunocompétente porteuse de tumeur induite par du 3-méthylcholanthrène en sous-cutanée
- Recherche appliquée
- Cancers
1080 souris vont être utilisées, toutes en souffrance sévère et toutes tuées, dans une évaluation de composés anticancéreux. Une tumeur leur est induite par injection sous-cutanée de 3-méthylcholanthrène, un cancérigène, avant des traitements répétés et de nombreux prélèvements sanguins, y compris par voie rétro-orbitaire. Le porteur prévoit des effets sévères liés à la tumeur, perte de poids, nécrose et ulcération, et des points limites déclenchant la mise à mort. Cette prestation d'évaluation vise une éventuelle utilisation clinique, formulée sans échéance.
Objectifs
Chaque année, le cancer affecte des millions de personnes et représente la deuxième cause de décès dans le monde. Les modèles murins jouent un rôle essentiel dans le domaine de l'oncologie, notamment, dans la compréhension de la physiopathologie du cancer, l’identification de nouvelles cibles et de nouveaux candidats médicaments ainsi que dans la compréhension des mécanismes de résistance. L’objectif de ce projet consiste à évaluer l’efficacité d’un composé à visée thérapeutique seul ou en combinaison chez la souris immunodéprimée ou immunocompétente porteuse de tumeur induite par du 3-méthylcholanthrène en sous-cutanée. Les doses et les fréquences de traitement seront déterminées grâce aux études de pharmacocinétique, de pharmacodynamie et de toxicité préalablement réalisées et/ou en se basant sur les données de la littérature et notre expérience. Remarque : Le 3-méthylcholantrène est un hydrocarbure aromatique polycyclique cancérigène dont l’administration sous-cutanée chez la souris induit la formation de tumeurs solides et mime ainsi le processus de tumorigenèse physiologique. Dans une souris génétiquement modifiée pour exprimer un antigène tumoral humain, celui-ci permet, notamment, l’induction de tumeurs exprimant cet antigène de manière endogène.
Bénéfices attendus
Le cancer est l’une des principales causes de mortalité dans le monde, avec 10 millions de décès en 2022. Malgré de nombreuses avancées dans les traitements proposés, le besoin médical en thérapies innovantes et efficaces est donc considérable. L’immunothérapie est aujourd’hui une nouvelle approche thérapeutique qui a permis une avancée majeure dans le traitement du cancer. Ce projet permettra d’évaluer l’efficacité de composés à visée thérapeutique chez la souris immunodéprimée ou immunocompétente porteuse de tumeur induite par du 3-méthylcholanthrène en sous-cutanée pour une éventuelle utilisation en clinique chez l’homme.
Procédures
• Sur animal vigile : Pesée (de 1 à 7 fois/semaine, 20 s) ; Tonte du flanc en vue de l’induction ou de la mesure du volume tumoral (1-3 fois, 10 s) ; Injection de 3-méthylcholanthrène en en sous-cutanée (1 injection, 15 s) ; Modification de la distribution des animaux dans les cages lors de la randomisation (1 fois) ; Administration de composé thérapeutique (maximum 1 fois /jour pendant 12 semaines maximum, 15 s) ; Mesure de tumeur (de 1 à 4 fois/semaine, 20 s) ; Microprélèvement de sang au niveau de la veine caudale (maximum 1 fois /jour dans la limite de 292 µL sur 28 jours pour un animal de 20g, 15 s). • Sur animal anesthésié (anesthésie gazeuse) : Prélèvement de sang par voie rétro-orbitaire (4 fois maximum, 30 s) ; Prélèvement de sang terminal par voie rétro-orbitaire (1 fois, 1 min) ou en intracardiaque sous analgésie (1 fois, 5 min) ; Administration de composé thérapeutique (maximum 2 fois /semaine pendant 12 semaines maximum, 15 s).
Impact sur les animaux
Stress et douleur légère, liés à l’administration du 3-méthylcholanthrène en sous-cutanée. Stress et douleur légère lors de l’administration du(des) composé(s) thérapeutique(s) en intra-péritonéal, sous-cutané, per os, intraveineux ou intra-tumoral. Inconfort lors de la manipulation de l’animal vigile pour les gestes de tonte du flanc, pesée et mesure de tumeur. Stress lié à la modification de la distribution des animaux dans les cages lors de la randomisation. Possible stress au moment de l’anesthésie gazeuse et difficulté de mobilité/engourdissement au réveil. Stress et douleur légère lors des micro-prélèvements sanguins. Possibilité d’effets indésirables sévères liés à l’induction tumorale : Perte de poids, modification du comportement, nécrose, ulcération et/ou inflammation de la tumeur. Possibilité d’effets indésirables sévères liés au(x) composé(s) thérapeutique(s) : Perte de poids transitoire, modification temporaire du comportement.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux (pour chaque procédure) lorsque l’une des conditions ci-après est remplie : Prélèvement d’organe ou de tumeur au cours de l’étude ; Atteinte d’un point limite justifiant l’euthanasie ; Fin de l’étude.
Remplacement
Evaluer les effets pharmacologiques d’un composé thérapeutique visant à réactiver le système immunitaire implique d’être dans un système biologique complexe. En effet, son efficacité dépend de son métabolisme et de sa distribution dans l'organisme ainsi que des caractéristiques de son environnement (et de la tumeur), ce qui n’est, actuellement pas possible de reproduire in vitro. Pour pouvoir effectuer ces évaluations in vivo, il est indispensable d’utiliser en premier lieu un modèle tumoral maitrisé et bien caractérisé en recréant la pathologie. L’animal porteur de tumeur devient ainsi un bon modèle expérimental pour évaluer les composés anti-cancéreux. Il est donc nécessaire d'utiliser des animaux dans le cadre de ce projet.
Réduction
Afin de limiter le recours aux animaux, les molécules sont préalablement testées in vitro et sélectionnées sur la base des résultats obtenus dans les modèles cellulaires. Seules celles présentant la meilleure activité sont choisies pour être évaluées chez l’animal. En se basant sur les données de la littérature et notre expérience, 10-15 souris par groupe sont nécessaires pour obtenir des résultats, statistiquement interprétables, en tenant compte de la variabilité inter-individuelle et de celle du succès de l’induction tumorale. Ces études sont menées à l’aide de différents modèles statistiques. Les volumes de prélèvement de sang sont limités pour obtenir la quantité minimale strictement nécessaire pour la réalisation des analyses. Ceci permet de prélever plusieurs fois un même animal, dans la limite des règles d’éthique et limiter ainsi le nombre d’animaux par étude. Un maximum de 10 études sera mené sur 5 ans. Au cours de l’étude, les organes et/ou tumeurs peuvent être prélevés pour mutualiser l’utilisation des animaux dans le but d’étudier différentes questions et paramètres au sein de la même étude et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés en évitant la multiplication des expériences.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupes sociaux, avec un minimum de 2 enrichissements de milieu. Dans le cas où une souris doit être maintenue seule (agressivité, euthanasie de ses congénères) un enrichissement supplémentaire sera ajouté dans la cage. Les souris seront hébergées dans des « zones protégées » dont les conditions d’environnement et d’hygiène sont contrôlées (barrière aseptique) pour éviter toute contamination et assurer ainsi le maintien de leur statut sanitaire. Le volume et la fréquence des prélèvements de sang suivront strictement les recommandations émises par la SBEA. Ils seront réalisés sous anesthésie gazeuse associée à un analgésique local, dans le cas de prélèvements rétro-orbitaires. Le prélèvement terminal sera réalisé sous anesthésie gazeuse en combinaison avec un analgésique opioïde. Les injections intraveineuses effectués au niveau du sinus rétro-orbital seront réalisées sous anesthésie gazeuse. La taille des aiguilles utilisées lors des injections sera la plus petite possible afin de limiter la douleur. Des points limites précoces relatifs à l’apparence/comportement de l’animal, à l’aspect et au volume de la tumeur ainsi qu’à la perte de poids seront suivis et évalués de manière précise, tout au long de l’étude, grâce à un tableau de scoring. Ils pourront justifier la mise en place d’enrichissement supplémentaire, d’une surveillance accrue ou l’euthanasie de l’animal. Le poids des animaux sera suivi au minimum 1 fois/semaine. Le(s) composé(s) injecté(s) pourra(ont) induire une perte de poids des animaux plusieurs jours post-injection. A partir de 10% de perte de poids, la fréquence des pesées sera augmentée et de la nourriture humidifiée ou gélifiée pourra être ajoutée au fond de la cage, afin de faciliter son accessibilité. Cette surveillance renforcée sera maintenue jusqu'à ce que leur poids ne diminue plus sur 2 pesées successives. Le volume des tumeurs sera suivi au minimum 1 fois/semaine. L’aspect général de l’animal (apparence, comportement, aspect des tumeurs) sera suivi lors des mesures de poids ou du volume tumoral (minimum 1 fois/semaine). Si un animal présente une lésion cutanée mineure, une pulvérisation de spray cicatrisant et antiseptique (3-4 foisminimum 2 fois/jour jusqu’à guérison complète) pourra être réalisée.
Choix des espèces
Le choix de la souris comme modèle in vivo est guidé par le haut niveau de similarité de sa biologie par rapport à l’homme, les outils et les structures disponibles pour sa manipulation et des temps de gestation et de sevrage courts. De plus, l’analogie fonctionnelle des systèmes immunitaires murin et humain et l’existence de lignées immunodéprimées et/ou génétiquement altérées font de la souris un modèle pertinent pour analyser l’efficacité de nouvelles thérapies et la réponse immunitaire associée. Les souris utilisées auront un âge compris entre 7 et 30 semaines lors de leur entrée dans l’étude, âge auquel le système immunitaire de l’animal est décrit comme mature.
Effet d’une molécule sur le poids corporel et la prise alimentaire de souris nourries avec un régime hyperlipidique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Toutes tuées pour prélèvement du foie, du coeur et des tissus gras, 84 souris rendues obèses par un régime hyperlipidique sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections sous-cutanées tous les deux à cinq jours pendant quatre semaines, puis une imagerie de composition corporelle sous anesthésie. Le projet teste les doses d'une molécule censée réduire la prise alimentaire, en préparation d'un essai clinique. Le porteur note que l'efficacité de cette molécule a "déjà été validée" par ses collaborateurs américains, ce qui interroge la nécessité de cette série supplémentaire.
Objectifs
L'obésité morbide est un problème de santé publique majeur et croissant qui est fréquemment associé à des complications métaboliques telles que le diabète de type 2, l'hypertension, des concentrations élevées en lipides dans le sang et les maladies hépatiques. Le développement de nouvelles molécules susceptibles de réguler la prise alimentaire est actuellement en plein essor. L’objectif de ce projet est de tester différentes doses et différentes fréquences d’administration d’une nouvelle molécule pharmaceutique d’intérêt.
Bénéfices attendus
Notre étude, en améliorant la connaissance sur les effets et le mode d’administration de nouvelles molécules affectant la prise alimentaire nous permettra de préparer la mise en place d’une étude clinique de phase 1 et à terme une meilleure prise en charge des patients obèses.
Procédures
Les souris vigiles recevront une injection sous cutanée tous les 2 ou 5 jours pendant 4 semaines. Les souris seront pesées chaque jour pendant 28 jours. A jour 28, une acquisition d’images d'une durée de 30 à 40 minutes sera réalisée sur animaux anesthésiés pour déterminer le pourcentage corporel en masse grasse et masse maigre.
Impact sur les animaux
Le protocole est modéré, il comporte des injections sous cutanées tous les 2 ou 5 jours, des prises de poids et une analyse non invasive terminale de mesure de composition corporelle. Nous n’attendons pas d’effets indésirables majeurs néanmoins une surveillance appuyée des sites d'injections sera réalisé pour s'assurer de la bonne tolérance de la molécule.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort à la fin de l'expérimentation afin de récolter le foie, le coeur et les tissus adipeux gonadaux et sous cutanées.
Remplacement
Le métabolisme énergétique et le développement de l'obésité est un processus physiologique complexe, impliquant l’action combinée d’une multitude d’organes et de diverses voies métaboliques. Il est donc actuellement impossible d’étudier ce paramètre d’une façon intégrale ex vivo ou in vitro et nous sommes malheureusement contraints d’utiliser les modèles animaux. il est à noter que l'efficacité de la molécule a déja été validée par nos collaborateurs américains via une étude pilote réalisée in vitro et in vivo.
Réduction
Ce projet a été construit avec la volonté de mettre en place et de respecter « la règle des 3 R ». Seules les expériences absolument indispensables au succès du projet seront mises en oeuvre. Le nombre d’animaux nécessaires pour chaque expérimentation a été défini en fonction de notre expérience passée. Nous avons pris soin d’optimiser au mieux nos expérimentations en choisissant les lignées murines les plus adaptées à l’étude. Le calcul d’effectif a été défini à l'aide d'un logiciel dédié.
Raffinement
Enfin, les procédures ont été réfléchies afin de réduire au maximum le stress et les souffrances des animaux soumis aux expérimentations. Les animaux seront hébergés 4 par cage dans un environnement sain. Les cages seront enrichies par des frisottis et un dôme en carton. Afin de limiter les souffrances expérimentales, une surveillance attentive et quotidienne des animaux sera réalisée au cours de la procédure. Des signes cliniques définissant les points limites ont été fixés au-delà desquels l’expérimentation serait arrêtée et l’animal euthanasié.
Choix des espèces
Le modèle murin est le modèle de choix, il est utilisé depuis longue date pour caractériser de manière intégrée les mécanismes de régulation de l'homéostasie énergétique. Nous utiliserons des souris à l’âge adulte, le début du protocole se fera sur des souris âgées de 8 semaines. Nous maitrisons un modèle de souris sauvages rendues obèses par un régime hyperlipidique.