Rongeurs

Pour étudier la cicatrice immunitaire que laisse une pneumonie dans le poumon, 420 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement d'organes. Une partie est irradiée puis reconstituée en moelle osseuse par injection dans le sinus de l'oeil, toutes reçoivent une administration intra-trachéale et certaines des cellules cancéreuses par voie veineuse. Le porteur décrit une perte de poids transitoire après l'infection et annonce un modèle de métastases pulmonaires "sans souffrance" jusqu'au jour de la mise à mort. Les retombées contre les infections et le cancer restent présentées comme potentielles.

Objectifs

Nos travaux antérieurs montrent clairement que suite à une pneumonie aiguë, le poumon des souris ne revenait pas à l’état initial mais avait développé une cicatrice immunitaire. Cette cicatrice semble jouer un rôle majeur contre des infections secondaires et contre d’autres pathologies telles que le cancer. Les cellules immunitaires naviguent dans le poumon au sein de structures cellulaires particulières telles que les alvéoles pulmonaires et les bronchioles. Les objectifs de ce projet sont de caractériser : 1- l’impact de la cicatrice immunitaire pulmonaire sur les cellules de l’alvéole et 2- le rôle de ces cellules de l’alvéole dans la mise en place et le maintien de cette cicatrice immunitaire. L’utilisation des procédures mentionnées dans ce document nous permettra de répondre clairement à ces questions

Bénéfices attendus

Notre projet nous permettra d’évaluer l’impact de la cicatrice immunitaire sur les fonctions des cellules de l’alvéole et d’évaluer le rôle de cette paroi dans la mise en place de cette cicatrice en vue d’une potentielle valorisation et mise en place de traitement adapté pour lutter contre les infections bactériennes et le cancer.

Procédures

La moitié des animaux seront soumis à une irradiation (de quelques dizaines de secondes), suivie d’une reconstitution en moëlle osseuse par voie (IV) intraveineuse rétro-orbitaire sous anesthésie générale. Afin d’éviter le stress et la potentielle gêne consécutive à l’injection intra veineuse en rétro orbitale, nous réaliserons une injection sous cutanée de morphinique juste avant le geste. Tous les animaux de ce projet sont soumis à une administration intra-trachéale (IT) sous anesthésie générale. Une partie des animaux sont soumis à une administration de cellules cancéreuses par voie IV caudale en vigile. En fonction de l’état général des souris (grille de score d’évaluation des points limites) et si nécessaire, une ou plusieurs injections sous-cutanée (SC) de morphinique pourraient être réalisées sur animaux vigiles.. Tous les gestes IV, SC et IT sont très rapides et ne durent au maximum que quelques minutes.

Impact sur les animaux

Modèles d’infection bactérienne : Les modèles d’inflammation respiratoires aigues sont des modèles avec une récupération de l’état général des souris à partir de J2. Suite à l’infection, une perte de poids transitoire (2-3jours) et modérée (< 10%) est observée, sans perte de motricité. Après J2, les souris reprennent une courbe de poids normale. Les modèles cancéreux de métastases pulmonaires sont sans souffrance jusqu’à J21, temps d’euthanasie pour analyse. Le modèle d’irradiation avec recomplémentation de moëlle osseuse est un modèle expérimental modéré sans développement de pathologies. Les souris seront traitées avec des antibiotiques dans l’eau de boisson. Ce traitement est nécessaire pour compenser l’immunodéficience profonde mais transitoire résultant de la forte dose d’irradiation utilisée pour éliminer les cellules souches hématopoïétiques. Le traitement commencera le jour précedant l’irradiation, pour accomoder les souris au goût des antibiotiques, et se poursuivra pendant 2 semaines après l’irradiation.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans cette étude seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour prélèvement d’organes et analyse des modifications immunologiques.

Remplacement

Les paramètres étudiés dans ce travail ne peuvent être aujourd’hui remplacés par des procédures in vitro et le recours à l’utilisation de modèles animaux est indipensable. Les muliples intéractions entre types cellulaires différents et la complexité de la mise en place de l’immunité entraînée nous oblige à utiliser les modèles animaux pour appréhender ces phénomènes dans leur globalité.

Réduction

Le nombre de souris a été réduit au minimum (n=5) afin de permettre une analyse statistique fiable des résultats. Une valeur de p

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupe sociaux harmonieux (n≤5) dans des cages enrichies avec des frisottis, de taille normalisée. Les animaux ont un accès libre à l’eau et à la nourriture. Sauf mention contraire, l’état général des souris est évalué quotidiennement. Un tableau d’évaluation des points limites a été mis en place. Les procédures n’entrainent pas de douleur résiduelle. En fonction des scores obtenus, une ou plusieurs injections de morphiniques seront réalisées. Afin de limiter la douleur consécutive à l’administration intratrachéale, la sonde de gavage de 24G est préalablement enduite d’analgésiques afin d’anesthésier localement la trachée. Afin d’éviter le stress et la potentielle gêne consécutive à l’injection intra veineuse en rétro orbitale, nous réaliserons une injection sous cutanée de morphinique juste avant le geste.

Choix des espèces

Les modèles murins d’infections bactériennes ainsi que les modèles tumoraux sont des modèles fiables et reproductibles. Les résultats issus de ces modèles peuvent être transposés à l’homme avec une très bonne correspondance des résultats trouvés à la fois en médecine humaine et en expérimentation animale pour les datas déjà générées dans ce projet de recherche. 7-14 semaines de vie. A ce stade le système immunitaire est mature

Enduites de crème Aldara provoquant une dermatite proche du psoriasis, 936 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvements de tissus. Elles reçoivent en plus des injections intrapéritonéales quotidiennes, une semaine sur deux pendant neuf semaines, et présentent stress et grattage. Le projet cherche le rôle de certaines enzymes dans l'inflammation cutanée, en vue de futures cibles thérapeutiques. Le porteur affirme avoir limité le nombre d'animaux par des travaux in vitro préalables, mais juge l'étape animale "indispensable".

Objectifs

Notre laboratoire étudie le rôle des médiateurs de l’inflammation au cours des pathologies inflammatoires chroniques de la peau telles que le psoriasis. La description de l’activité de ces médiateurs proinflammatoires permet d’identifier celles qui jouent un rôle primordial dans la physiopathologie de la maladie et de les cibler en thérapie. Bien que quelques médiateurs proinflammatoires constituent des cibles thérapeutiques validées en clinique, des mécanismes d’échappement sont toujours observés, nécessitant l’identification de nouvelles cibles originales. Dans le cadre d’une collaboration scientifique nationale, nous étudions le rôle de certaines enzymes du microenvironement inflammatoire. Les rôles respectivement pro-inflammatoires et anti-inflammatoires de ces molécules sont décrits dans un contexte tumorale et des outils de blocages de ces enzymes sont en cours de validation chez l’animal. Néanmoins, leurs expressions par les cellules résidentes cutanées (kératinocytes, fibroblastes) ou par les cellules immunitaires et leurs activités biologiques sont peu caractérisées dans les maladies inflammatoires chroniques cutanées. Des résultats préliminaires montrent que l’expression de ces enzymes est modifiée dans les lésions psoriasiques humaines et que les kératinocytes, les fibroblastes et les cellules immunes peuvent produire ces enzymes in vitro dans un contexte inflammatoire. Le but de notre projet est de démontrer les roles régulateurs de ces enzymes dans la dermatite psoriasiforme chez la souris en utilisant des animaux génétiquement modifiés n’exprimant pas ces enzymes et des inhibiteurs originaux spécifiques de ces enzymes.

Bénéfices attendus

Ces résultats nous permettront de mieux comprendre le rôle joué par certaines enzymes dans la régulation de l’inflammation cutanée. A terme, le développement des inhibiteurs testés dans notre projet pourrait améliorer la prise en charge des patients présentant des lésions chroniques en ciblant l'inflammation induite par ces enzymes.

Procédures

-Injection intrapéritonéale tous les jours pendant 5 jours, sur animal vigile (n=72 souris). -Anesthésie générale par injection intra-péritonéale (n=936 animaux). -Application quotidienne en vigile de crème Aldara ou de vaseline sur l’oreille et sur le dos de l’animal une semaine sur 2 pendant 9 semaines (n=936 animaux). -Injection quotidienne par voie intrapéritonéale une semaine sur 2 pendant 9 semaines (uniquement pour les animaux traités, n=468 animaux). -Administration une fois par semaine des inhibiteurs enzymatiques ou des excipients par application sur l’oreille et le dos, ou par injection intrapéritonéale pendant 9 semaines. (n=468 animaux).

Impact sur les animaux

-injections intrapéritonéales: douleur et stress légère et transitoire -Anesthésie fixe : incomfort léger et transitoire au réveil -Application de crème sur le dos et l’oreille : stress léger et transitoire. Phénomènes de grattage.

Devenir

Mise à mort pour prélèvements tissulaires et analyses histologiques et moléculaires

Remplacement

Nous avons limité le nombre d’animaux utilisés dans notre projet en réalisant en amont des expériences sur des modèles in vitro de kératinocytes, fibroblastes, monocytes et leucocytes. Ces données nous ont permis de cibler ces 4 types cellulaires et d’analyser les expressions et fonctions de ceraines enzymes dans l’inflammation. L’intégration de ces types cellulaires dans le tissu cutané in vivo est maintenant indispensable pour vérifier les profils d’expression et les fonctions identifiées in vitro. L’utilisation d’animaux génétiquement modifiés n’exprimant pas ces enzymes dans les types cellulaires cités est indispensable pour démontrer le rôle clé de ces molécules dans l’inflammation. De même, le blocage d’activité par des inhibiteurs originaux seront testés en amont sur des cultures in vitro. Seuls les outils validés in vitro et sans toxicité seront testés sur les souris. A ce jour, il n'existe pas de modèle in silico permettant de réaliser ce projet. La modélisation in vitro ou in silico n’est pas envisageable au vu de la complexité de la réponse inflammatoire cutanée étudiée.

Réduction

L’expérience du laboratoire sur ce modèle d’inflammation chronique et la variabilité mesurée des différents paramêtres de l’inflammation nous ont permis d’utiliser un test de puissance et de calculer un effectif pour avoir des données interprétables statistiquement et robustes. Afin de limiter le nombre d'animaux, une analyse intermédiaire sera effectuée. Si aucune différence n’est observée entre les lots, l’expérience sera stoppée. Si une différence est observée nous procéderons à la réalisation des expériences sur le dernier groupe d’animaux. De même, le test des inhibiteurs enzymatiques ne sera effectué que si un phénotype est observé chez les souris génétiquement modifiées.

Raffinement

Afin de limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse des animaux, ceux-ci seront anesthésiés lors des phases d’expérimentation les plus longues avec contrôle de la température par tapis chauffant. Afin de satisfaire les besoins comportementaux des souris, celles-ci seront maintenues en groupe de 3 individus par cage ventilée. Leur milieu sera enrichi de structures adaptées leur permettant de se cacher (nid, tunnel, matériel à ronger). Dans certains modèles d’inflammation, une perte de poids temporaire, liée à une déshydratation de l’animal, peut être observée. Afin de compenser cette déshydratation une réhydration sera effectuée de façon préventive, un gel hydraté mis à disposition dans les cages et le poids des animaux mesuré quotidiennement pendant le traitement. Des points limites gradés précis et adaptés sont proposés et feront l’objet d’une surveillance quotidienne. Une prise en charge par un traitement antalgique sera mise en oeuvre précocemment en cas de besoin.

Choix des espèces

Le système immunitaire de la souris décrit et étudié depuis des décennies, autorise des comparaisons avec le système immunitaire humain. Les modèles murins, bien que pouvant présenter certaines limites par rapport à la physiologie humaine, restent largement utilisés pour étudier l’inflammation cutanée et évitent d’avoir recours à des espèces animales supérieures. De plus, le projet de recherche inclut des expériences utilisant des modèles animaux modifiés génétiquement disponibles uniquement chez la souris. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de 8 à 14 semaines lorsque leur système immunitaire est bien développé.

Irradiées vigiles puis greffées avec des cellules leucémiques par voie intraveineuse, 3400 souris seront toutes tuées pour prélèvement d'organes, dans des procédures classées en souffrance modérée. Le porteur décrit pourtant une maladie qui s'installe en quelques semaines, avec amaigrissement, paralysie des membres postérieurs empêchant l'animal de se déplacer et de s'alimenter, prostration et hypothermie. Certaines souris subissent en plus une ponction de moelle osseuse au fémur et des prélèvements sanguins répétés à la joue. L'étude porte sur les raisons de la colonisation d'autres organes par la leucémie aiguë myéloïde, avec des applications cliniques présentées comme lointaines.

Objectifs

Depuis ces dernières années, la recherche biomédicale s’est attachée à explorer « à grande échelle » la complexité liée aux gènes et aux différentes sous-populations de cellules cancéreuses, sans pour autant parvenir à saisir précisément les mécanismes à l’œuvre lors de la propagation des cellules cancéreuses dans l’organisme. Pourtant, celles-ci pourraient acquérir des caractères d’autant plus malins lorsqu’elles migrent d’un organe primaire (l’organe où se développe initialement ce cancer) vers des sites secondaires (organes qui sont colonisés dans un second temps). Pour comprendre si l’infiltration d’un site secondaire peut conférer aux cellules cancéreuses de nouvelles capacités malignes, nous avons choisi comme modèle d’étude la leucémie aiguë myéloïde (LAM) : les cellules leucémiques n’accumulent que peu de mutations (changements au niveau des gènes) et sont capables intrinsèquement de se déplacer dans le sang. Le projet que nous proposons ici cherche à comprendre quel est le bénéfice pour les leucémies aiguës de sortir de la moelle osseuse, site où la pathologie prend initialement place, pour aller infiltrer, non pas aléatoirement, mais bien spécifiquement des organes en particulier, comme le foie, la rate, ou le système nerveux central (SNC) et le cerveau. Nous allons tenter de répondre à ces questions en les considérant sous l’angle – encore peu abordé – de la dimension métabolique (soit la manière dont la cellule choisit de produire de l’énergie qu’elle utilise) et épigénétique (modifications affectant un gène sans en changer sa composition) qui pourrait moduler grandement l’aptitude des blastes leucémiques (cellules leucémiques)à infiltrer les organes à distance.

Bénéfices attendus

Ce projet permet d’interroger les fondements biologiques de l’infiltration blastique (la colonisation d’un organe/tissu par des cellules leucémiques) vers des sites secondaires dans les LAM dont la cause est encore méconnue et qui contribue à l’apparition de cette maladie. Cette connaissance précise permettra d’identifier de nouvelles combinaisons thérapeutiques (association de plusieurs traitements permettant d’avoir un meilleur résultat) avec des chimiothérapies ou thérapies ciblées (médicament qui cible un élément impliqué dans l’apparition ou la progression de la maladie réduisant les effets secondaires) existantes qui pourront alors émerger dans le but d'améliorer la prise en charge et le traitement des patients atteints de LAM.

Procédures

Les animaux vigile (c’est-à-dire non endormis) seront tout d’abord irradiés. L’irradiation, introduction des souris dans une machine à rayon X (semblable à une radiographie),permet d’éliminer les cellules de la moelle osseuse afin de pouvoir injecter en une seule fois les cellules leucémiques par voie intraveineuse dans la veine de la queue (durée de l'injection: 1 min). Des prélèvements de sang au niveau d’une veine de la joue de moins de 1 minute espacés d’au moins 1 semaine (4 au maximum) seront réalisés pour évaluer la prise tumorale et récolter du matériel biologique pour des analyses ultérieures. En cas de non-détection des cellules leucémiques dans le sang périphérique, nous ferons une ponction de cellules au niveau du fémur (durée du prélèvement: 5 minutes; sous anesthésie et analgésie). Une fois l'invasion des cellules cancéreuses établie, les animaux recevront un traitement quotidien de durée variable selon le type de thérapie (injection sur souris éveillée soit dans la cavité abdominale pendant 5 jours et/ou par gavage). De plus, certaines souris recevront un antibiotique soit dans leur alimentation soit dans l'eau de boisson, qui ici joue le rôle d’interrupteur, permettant d’exprimer de molécules capables d'éteindre les gènes.

Impact sur les animaux

Les animaux traités avec les différentes molécules (gavage, intra-péritonéal, intra veineux), greffés (administration de cellules leucémiques) ou prélevés en vue d’examens biologiques pourraient être confrontés à des effets indésirables (stress et/ou perte de poids). Une gêne physique en cas d'administration orale quotidienne peut également survenir. La greffe de cellules leucémiques va, comme attendu, permettre l’établissement de la maladie et donc entrainer au bout de quelques semaines un amaigrissement, une paralysie des membres postérieurs empêchant l’animal d’être mobile et de s’alimenter, une perte d’activité, une prostration, une déshydratation et/ou une hypothermie. De manière plus exceptionnelle, en cas de ponction osseuse (introduction d’une aiguille dans la moelle osseuse pour récupérer de la moelle osseuse), les animaux peuvent ressentir une gêne temporaire au niveau de la mobilité. Très rarement, il peut y avoir également apparition de masses tumorales solides (amas de cellules cancéreuses forment une masse), d’origines leucémiques, dans diverses localisations (organes, tête), à distinguer avec les infiltrats de cellules leucémiques (colonisations des cellules leucémiques d’un tissu donné) sur lesquels ce projet repose et qui ne font pas de masse solide.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour prélever la moelle osseuse, le foie, la rate et le cerveau afin de définir les caractéristiques des cellules cancéreuses.

Remplacement

Pour comprendre pourquoi les cellules leucémiques sortent de la moelle osseuse pour aller coloniser des organes à distance, des tests chez l’animal sont nécessaires car il n’existe pas de modèles in vitro permettant de reproduire de façon fidèle l’évolution du cancer au sein d’un organisme entier. Bien que certains modèles in vitro (expériences pratiquées au laboratoire sans utilisation d'être vivant) permettent d’obtenir un premier niveau de compréhension, ils ne sont pas suffisants car ils ne tiennent pas en compte de l’environnement des cellules cancéreuses qui peut les influencer. Afin d’appliquer nos résultats au stade clinique chez l’homme, il est indispensable d’avoir des preuves d’efficacité dans des modèles pré-cliniques murins.

Réduction

Le nombre minimum de souris nécessaires par groupe a été établi grâce aux études antérieures du laboratoire et à l’utilisation de tests statistiques appropriés.

Raffinement

En vue de réduire le stress subit par les animaux, le confort des cages sera optimisé par des buchettes en bois que les souris aiment ronger, des tunnels en carton où elles trouvent refuge et des nids en papier. Les animaux seront observés quotidiennement en faisant particulièrement attention aux signes cliniques et comportementaux tels que : niveau d’activité, agressivité, attitude/posture, réaction à la manipulation, toilettage/ consommation alimentaire et hydrique mais aussi des signes mesurables non subjectifs : perte de poids (une première pesée sera réalisé aux 9 eme jours après injection des cellules leucémiques, puis chaque 3 jours), rythme respiratoire, déshydratation (plis de la peau). Suivant la grille de suivi des souris et l’arbre décisionnel préalablement établi. Les protocoles seront étudiés afin de limiter au maximum le stress ainsi que la douleur subie par l'animal, en optimisant le mode et le volume d'injection et la durée de traitement. Les animaux seront anesthésiés et une analgésie sera effectuée lors des ponctions osseuses car il y a un risque plus important de gêne ou de douleur liée à cette procédure. De plus, les études antérieures ont permis de mieux appréhender les points limites (points qui permettent d’éviter une souffrance accrue et ou prolongée de l’animale) et d’établir d’une liste de différents points limites qui seuls ou cumulés vont nécessiter une intervention de l’expérimentateur afin de soulager l’animal. Une décision rapide et raisonnée sera prise pour éviter toute souffrance animale. En effet, si une douleur est constatée un antalgique sera administré à l’animal chaque fois que cela ne compromet pas les résultats attendus de l’expérience, si un antalgique ne peut être administré et/ou n’est pas suffisant à calmer la souffrance de l’animal, une mise à mort de l’animal sera réalisée.

Choix des espèces

Le modèle souris est à la base de la compréhension du développement du cancer chez l’homme. Du fait de la présence de nombreux gènes équivalents chez l’homme et la souris, ils intègrent les caractéristiques de la pathologie humaine (prolifération anormale de cellules sanguines anormales) et aident à comprendre pourquoi les cellules leucémiques sortent de la moelle osseuse pour aller infiltrer des organes à distance. Dans cette étude, nous utiliserons des souris âgées d’environ 6 à 11 semaines car les transplantations de cellules cancéreuses sont plus efficaces chez les jeunes adultes et permettent donc une meilleure prise de greffe.

Pour initier des étudiants aux techniques d'expérimentation animale, 150 souris et 150 rats sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués puis congelés pour être ensuite disséqués. Manipulés par des étudiants inexpérimentés, les animaux reçoivent des injections sous-cutanées, intrapéritonéales et des gavages d'eau physiologique. Le porteur détaille les précautions sonores demandées aux étudiants, chuchoter, couper les téléphones, éviter les parfums, pour limiter le stress des animaux. Il conclut qu'aucune méthode ne peut remplacer l'animal vivant, la certification imposant une manipulation sur animal réel.

Objectifs

Pédagogiquement, ces travaux pratiques permettent aux étudiants une initiation à l’expérimentation animale. Et comme demandé dans les compétences visées par le module, ils apprennent à mettre en oeuvre des techniques d’expérimentation animale. Les étudiants diplômés du bachelor universitaire de technologie (BUT) génie biologique parcours Biologie médicale et biotechnologie (BMB) peuvent être amenés à faire un stage dans des établissements utilisateurs d’animaux à des fins scientifiques ou à y travailler au cours de leur vie professionnelle. L'objectif est d’obtenir la certification d’expérimentation animale niveau applicateur, les étudiants ont une partie théorique puis une partie pratique (Travaux pratiques en expérimentation animale : initiation chez le rat et la souris).

Bénéfices attendus

Cet enseignement permettra aux étudiants de découvrir le monde de l'expérimentation animale, de pouvoir passer le Certificat d’expérimentation animale niveau applicateur et de pouvoir travailler pendant l’année scolaire comme vacataire dans un établissement utilisateur d’animaux. Ce projet permettra aux étudiants d'acquérir la compétence " Mener des études à l'échelle de l'organisme et de la cellule en biologie de la santé" exigées dans le cadre du bachelor universitaire de technologie (BUT) parcours Biologie médicale et biotechnologie (BMB(. L'acquisition de cette compétence nécessite pour l'étudiant de maitriser un certain nombre d'apprentissages critiques (AC) qui sont, pour cette compétence, : i) Mettre en oeuvre des procédures expérimentales d'études physiologiques. Le contenu de ce projet répond ainsi à ces apprentissages critiques et entre donc dans le processus d'acquisition de cette compétence en complément des autres enseignements théoriques et pratiques de la Ressource "Physiologie et Expérimentation animale" et de la SAé associée.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections sous-cutanée et intra-péritonéales d'eau physiologique. Un gavage pourra être pratiqué. Un animal recevra au maximum 1 IP et une sous cutanée pendant une séance de TP de 5 h.

Impact sur les animaux

Les animaux seront manipulés (administrations diverses – sous cutanée, intra-péritonéales, gavage, anesthésie) par des étudiants inexpérimentés, ce qui pourrait être source de stress et de nuisances pour les animaux. Donc avant le début de la séance, il sera demandé aux étudiants de chuchoter, de rester calme et d'éviter les déplacements (matériels et humains) durant la manipulation des animaux. Afin d'atténuer le stress des animaux, une musique d'ambiance calme pourra être mise en place à l' animalerie et dans la salle de TP pour créer un fond sonore homogène afin de réduire le stress des animaux. Enfin, il sera demander de couper les téléphones portable et d'éviter les parfums forts pour éviter l'inconfort des animaux.

Devenir

A l’issue des séances de travaux pratiques, les animaux seront euthanasiés. La mort de l’animal est vérifiée par contrôle de l'arrêt cardiaque en palpant la cage thoracique et par l' absence de reflexe. Les animaux morts seront ensuite stockés au congélateur dans le but d’être disséqués par les étudiants de première ou deuxième année de Génie biologique dans le cadre d'études d'histologie

Remplacement

Pour cet apprentissage, il n’est pas possible de remplacer l’utilisation des animaux vivants par une autre méthode pour observer et manipuler rats et souris. Les objectifs de ces TP sont d’être capable de mettre en oeuvre les techniques d'expérimentation animale pour des études de toxicologie, de pharmacocinétique, d’études du métabolisme ou de pharmacodynamie. Afin de respecter le programme national publié en 2021 par le ministère, un remplacement n’est pas possible dans ce contexte car, les titulaires du diplôme DU APEX doivent être en mesure d’intervenir en expérimentation animale in vivo et in vitro. De plus, la certification en expérimentation animale « niveau applicateur » ne peut être obtenu qu’après manipulation sur animal vivant (arrêté du 1er fevrier 2013). Afin de préparer au mieux les étudiants et ainsi éviter des mauvais gestes avec les animaux, les étudiants auront avant les travaux pratiques, une information théorique sur les différentes techniques avec des photos et ces photos seront disponibles pendant la scéance de TP. Une sensibilisation sur l'éthique et le bien être animal sera faite également avant les TP. Enfin, juste avant la séance de manipulation sur l'animal, une video explicative sera présentée.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été réduit au maximum en prenant en compte que la formation s’adresse à 5 étudiants qui au cours de chaque séance vont manipuler plusieurs animaux afin de pouvoir apprendre correctement sans toujours utiliser le même animal, et aussi bien des mâles et que des femelles. De plus, les animaux morts sont utilisés ensuite pour des séances de dissections en travaux pratiques.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe, dans des cages standards aux normes européennes, avec enrichissement. Le bien-être des animaux est suivi quotidiennement. Les principes éthiques et les standards de raffinement sont utilisés jusqu’à la mise à mort des animaux.

Choix des espèces

Les rongeurs sont les animaux les plus utilisés en expérimentation animale. Ce sont donc des animaux sur lesquels les étudiants seront susceptibles de travailler. De plus, la souris et le rat sont les animaux sur lesquels portent plus particulièrement le certificat d’expérimentation animale niveau applicateur.

Greffées avec des cellules de lymphome par voie intraveineuse ou sous-cutanée, 1100 souris seront toutes tuées pour prélever leur rate, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique que les cellules injectées forment des tumeurs dans plusieurs organes, ce qu'il décrit comme une source de souffrance pour l'animal. L'objectif est de comprendre l'activation et l'épuisement des cellules Natural Killer face à une tumeur. Les retombées pour la santé humaine restent au conditionnel, des résultats qui "pourraient à terme" mener à des développements.

Objectifs

Les cellules Natural Killer (NK) sont des cellules immunitaires spécialisées dans la lutte anti-tumorales. Lors du développement d'un cancer, après une phase d’activation au cours de laquelle les cellules NK éliminent les cellules tumorales, la persistance de la tumeur épuise les cellules NK et les rend inefficaces. Cet état d'épuisement conduit à une perte du contrôle sur la tumeur et à une reprise de la pousse tumorale. De nombreuses questions non-résolues subsistent sur le mode de régulation précis de ces deux phases (activation et épuisement). L'objectif de ce projet est de mieux comprendre cette régulation au cours de la réponse anti-tumorale. Pour cela, nous utiliserons un modèle tumoral chez la souris. Ce modèle est basé sur 2 lignées de lymphomes. Ces 2 lignées tumorales seront greffées à des souris normales ou déficientes dans les cellules NK uniquement pour les protéines que nous souhaitons étudier. Nous évaluerons l'impact de la déficience en chacune de ces protéines sur 1) la survie des souris suite à la greffe des cellules tumorales et 2) sur l’activation et l’épuisement des cellules NK.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux définir la régulation de l’activité anti-tumorale des cellules Natural Killer. Etant donné le rôle de ces cellules dans la réponse anti-tumorale, ces résultats pourraient à terme conduire à des développements en santé humaine.

Procédures

Les animaux seront greffés avec les cellules tumorales par injection intraveineuse dans la veine de la queue (1 injection par souris, 2 minutes) ou par injection sous-cutanée dans le flanc (1 injection par souris, 2 minutes).

Impact sur les animaux

Le modèle est bien caractérisé, ce qui nous permet de prédire les jours auxquels nous obtiendrons des cellules activées ou épuisées tout en limitant la souffrance des animaux. Lors d'une injection intraveineuse, les cellules injectées forment des tumeurs dans plusieurs organes, ce qui est source de souffrance pour l'animal. En ce qui concerne la voie d’injection sous-cutanée, la pousse de la masse tumorale sur le flanc est source d’inconfort pour l’animal.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en vue d'effectuer des prélèvements d'organe (rate) post-mortem afin d'effectuer des analyses phénotypiques et fonctionnelles des cellules Natural Killer.

Remplacement

Des expériences préliminaires en culture sur des cellules NK rendues déficientes pour les différents gènes testés dans ce projet ont été effectuées. Elles ont mis en évidence l'implication claire de ces gènes au cours de l’activation en culture. Ces modèles expérimentaux sont cependant limités, ne reproduisant qu’imparfaitement les conditions rencontrées dans un organisme, notamment la survenue de l’épuisement. Il nous est donc maintenant nécessaire de mettre en place un modèle animal.

Réduction

L'âge des souris utilisées étant assez étendu et leur sexe indifférent, tous les animaux produits dans notre établissement seront utilisés, évitant ainsi la mise à mort d'animaux inutiles. Nous utiliserons des méthodes d'analyses de pointe permettant de réaliser de multiples analyses et cela sur les cellules d’un même animal. Cela permettra ainsi d'optimiser l'utilisation des animaux. Lorsque cela est possible, la comparaison au sein d’une seule expérience des différentes lignées de souris testées permettra de réduire 1) le nombre de souris utilisées et 2) la variation expérimentale inhérente à la réalisation d’expériences indépendantes.

Raffinement

Le modèle est bien caractérisé, ce qui nous permet de prédire les jours auxquels nous obtiendrons des cellules Natural Killer activées ou épuisées tout en limitant la souffrance des animaux. D'autre part, nous nous baserons sur l'apparition d'une gêne des fonctions locomotrices postérieures due à la pousse tumorale dans la moelle osseuse. Ce signe précoce précède la dégradation de l'état général de l'animal. En cas d'apparition de ce signe sur un animal avant le jour prévu de mise à mort, tout le groupe sera mis à mort. Les groupes étant très homogènes, un tel mode opératoire nous permet d'obtenir des données interprétables et donc de réduire la variation intra-expérience. Enfin, afin de parer à toute éventualité, les expérimentateurs se tiendront prêts à réaliser l'expérience les jours précédant la mise à mort. Des visites seront effectuées tous les trois jours après la première semaine puis une surveillance accrue, visite matin et soir, sera réalisée les 3 jours précédents les dernières dates de mise à mort des animaux dans le but d'anticiper le moindre signe de souffrance. Enfin, des croquettes humidifiées seront placées dans la cage afin de faciliter l'accès des animaux à la nourriture. Des points limites prédictifs de la pousse tumorales ont été établis. Si une souris présente un des ces points limites, l’ensemble du groupe sera mis à mort pour analyse.

Choix des espèces

Les cellules Natural Killer ne sont présentes que chez les mammifères. Parmi ceux-ci, la souris est un modèle de choix. D'une part, et bien qu'il existe certaines différences entre l'immunologie murine et humaine, d'innombrables découvertes chez la souris sont transposables chez l'homme. D'autre part, la richesse des souches murines génétiquement modifiées et des réactifs disponibles permet une compréhension très approfondie des phénomènes mis en jeu du niveau moléculaire au niveau de l'organisme, un atout déterminant dans notre projet. Des souris âgées de 8 à 28 semaines seront utilisées. En effet, c'est à partir de l'âge de 8 semaine que les souris ont un système immunitaire mature. D'autre part, la réponse anti-tumorale ne varie pas sur la tranche d'âge considérée. Nous utiliserons de cette façon tous les animaux produits, évitant ainsi la mise à mort d'animaux inutiles.

198 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intradermiques de cellules tumorales au flanc, développent une tumeur locale et d'éventuelles métastases dans les ganglions, une partie recevant ensuite neuf injections intrapéritonéales sur trois semaines. Le projet cherche à préciser le rôle d'un facteur immunitaire dans le carcinome épidermoïde cutané et à repérer des cibles thérapeutiques. Le porteur renvoie les retombées cliniques au conditionnel, un blocage qui "pourrait" améliorer la survie des patients.

Objectifs

Le carcinome épidermoïde cutané est le deuxième cancer cutané le plus fréquent. Ce cancer est facilement traitable lorsqu’il est localisé, mais il a cependant un potentiel agressif et peut être responsable de métastases qui peuvent entrainer le décès. Les principaux facteurs de risque de survenue de ce cancer cutané sont l’âge et l’exposition chronique au soleil. Il est d’ailleurs plus fréquent et agressif en cas d’immunodépression, ce qui souligne le rôle du système immunitaire pour contrôler le développement du cancer. Comme dans de nombreux cancers, les cellules tumorales ont la capacité d’endormir le système immunitaire pour échapper à son contrôle. L’immunothérapie antitumorale fait partie des nouvelles stratégies pour restaurer une réponse immunitaire. Cependant, tous les patients ne répondent pas à ce traitement et une meilleure connaissance des cellules et molécules qui bloquent le système immunitaire et qui favorisent la progression tumorale est nécessaire. Le projet vise donc à déterminer ces facteurs, dans le but d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Nous nous intéressons en particulier à un facteur produit par les cellules de la peau. Ce facteur est connu pour être associé à un mauvais pronostic dans certains cancers, notamment le cancer du pancréas ou le cancer du sein. Nous émettons l’hypothèse que ce facteur pourrait modifier la réponse du système immunitaire dans le carcinome épidermoïde cutané et favoriser sa croissance.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre les signaux et cellules impliqués dans la réponse du système immunitaire contre le carcinome épidermoïde. Ceci permettra l’identification de potentielles cibles thérapeutiques, lesquelles seront testées pour déterminer si leur blocage pourrait être un traitement potentiel en clinique pour améliorer la qualité de vie et survie des patients.

Procédures

Lors de la première et deuxième procédure, 126 souris seront anesthésiées et injectées par voie intradermique avec des cellules tumorales (durée : 6 min par souris). Lors de la troisième procédure, 72 souris seront anesthésiées et injectées par voie intradermique avec des cellules tumorales (durée : 6 min par souris). Par la suite, ces 72 souris seront injectées par voie intrapéritonéale 3 fois par semaine pendant 3 semaines (durée : 10 secondes x 9 injections = 1 minute 30). La durée totale des actes par souris lors de la troisième procédure par souris est de 7 minutes 30 secondes.

Impact sur les animaux

Les animaux injectés avec des cellules tumorales par voie intradermique au niveau du flanc développeront une tumeur au niveau local et d’éventuelles métastases au niveau des ganglions lymphatiques drainant le flanc. Un suivi rigoureux du comportement, de la vivacité de tous les animaux sera effectué. Ainsi, tout signe de souffrance, de stress ou d’angoisse de l’animal provoquera son exclusion de l’étude. Tous les animaux seront surveillés et traités selon les points limites énoncés.

Devenir

A la fin de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour analyser la croissance tumorale et la réponse immunitaire au niveau des ganglions lymphatiques et de la tumeur.

Remplacement

L’étude de la réponse immunitaire met en jeu plusieurs organes et réseaux complexes impliquant plusieurs types cellulaires. Cette complexité rend nécessaire l’utilisation d’expériences in vivo pour comprendre le type d’interaction et les différentes voies de signalisation impliquées dans ces réponses immunitaires ainsi que le processus de progression tumorale.

Réduction

Le protocole sera appliqué à un maximum de 198 souris. Ces souris seront utilisées afin d’étudier le rôle du facteur étudié dans la progression tumorale. Le nombre de souris a été estimé de façon à pouvoir détecter des différences significatives dans la croissance de la tumeur ou dans la réponse cellulaire immunitaire contre la tumeur (nombre de cellules immunitaires au sein de la tumeur).

Raffinement

La greffe tumorale par le biais d’injection intradermique et la prise de photos nécessitent une anesthésie gazeuse légère de courte durée. Les souris seront remises dans leur cage avec une courte exposition à la lampe chauffante. Les souris seront maintenues en groupe pour préserver les interactions sociales. En plus de la surveillance journalière, le suivi de la progression tumorale (prise de photos, mesure de la taille de la tumeur) sera réalisé 3 fois par semaine (lundi, mercredi, vendredi). Des points limites, précis et gradés pour chacune des procédures expérimentales ont été définis. Si un animal atteint les points limites établis, il sera retiré de l’étude et euthanasié.

Choix des espèces

La réponse immunitaire dans le contexte tumoral met en jeu différents organes comme la peau et les ganglions lymphatiques, rendant nécessaire l’utilisation d’expériences in vivo pour comprendre cette réaction. Le modèle animal choisi pour étudier le CEC est la souris, car son système immunitaire est proche de celui de l’Homme avec une immunité innée et une immunité adaptative. De plus, la peau des souris présente des similitudes avec la peau humaine, rendant ce modèle pertinent pour l’étude du CEC. Les animaux seront utilisés à partir de 8 semaines de vie afin d’étudier le système immunitaire à l’âge adulte.