Rongeurs

180 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont exposés au xénon dans une boîte d'inhalation pendant quatre heures et porteurs d'une pompe implantée chirurgicalement dans le dos pour délivrer un médicament, afin de tester si le xénon aide les traitements à franchir la barrière hémato-encéphalique. Le porteur indique que l'implantation de la pompe peut provoquer une infection et une réaction inflammatoire locales. Il reconnaît qu'une partie du projet repose sur des cultures cellulaires in vitro, mais affirme que la complexité anatomique impose un recours aux "systèmes intégrés", les rats étant tués pour prélever leurs organes.

Objectifs

La barrière hématoencéphalique (BHE) est une interface essentielle qui sépare le sang du système nerveux central (SNC), empêchant ainsi les substances indésirables d'atteindre le cerveau. Cette barrière constitue un obstacle majeur pour l'acheminement de médicaments ciblant le cerveau. Dans le cadre de ce projet, nous explorons l'utilisation du xénon pour moduler la perméabilité de la BHE, permettant ainsi l'entrée de médicaments dans le cerveau. Le xénon présente de nombreuses propriétés intéressantes pour diverses applications : 1) il est chimiquement inerte et soluble dans la plupart des fluides biologiques ; 2) in vitro, il peut être facilement introduit et retiré des échantillons cellulaires ; 3) in vivo, il est actuellement utilisé comme agent anesthésiant à l'hôpital. Les protéines membranaires ABC (ATP Binding Cassette), jouent un rôle clé dans les phénomènes généraux de pharmacocinétique et de pharmacologie clinique, qui concernent de nombreux médicaments, grâce à leur capacité de reconnaissance multi-spécifique. La BHE présente une perméabilité restreinte et sélective en raison de l'expression de ces protéines ABC et de la présence de jonctions serrées dans les espaces inter-endothéliaux, permettant ainsi de contrôler la composition du milieu interstitiel cérébral. Bien que nous sachions maintenant que le xénon franchit rapidement la BHE, il est intéressant d'évaluer la possibilité d'utiliser sa dynamique aide au passage des médicaments dans le cerveau. Si tel est le cas, obtenir des informations sur la perméabilité de la BHE serait utile pour de nombreuses applications médicales, telles que la détermination de doses pour l'administration de médicaments au cerveau.

Bénéfices attendus

L'étude vise à étudier la capacité du Xénon à favoriser le passage de composés à travers la BHE. Les résultats de cette étude sont porteurs d'applications pharmaceutiques potentielles, qui bénéficieront en fin de compte aux patients. La démonstration d'une augmentation des concentrations cérébrales de médicaments tels que des agents anticancéreux (vérapamil), des antiépileptiques (acide valproïque, clobazam, stiripentol, bumétadine) et/ou des agents anti-infectieux (tenofovir, zidovudine, lamivudine, lopinavir) grâce à l'utilisation du xénon pourrait ouvrir la voie à son utilisation chez l'homme. Cela est d'autant plus prometteur que le xénon est déjà utilisé en clinique humaine. Les bénéfices attendus de cette étude comprennent : 1- Amélioration de la délivrance de médicaments au cerveau : En évaluant l'impact du xénon sur la barrière hémato-encéphalique (BHE), l'étude cherche à déterminer la meilleure combinaison de xénon et d'oxygène-Air qui favorise le passage des composés à travers la BHE. Cela pourrait conduire à une meilleure diffusion des médicaments thérapeutiques dans le cerveau potentialisant ainsi les traitements actuels. 2- Potentiel d'optimisation des traitements existants : Si l'utilisation du xénon permet d'augmenter les concentrations cérébrales des médicaments mentionnés (anticancéreux, antiépileptiques, anti-infectieux), cela pourrait améliorer l'efficacité de ces traitements chez les patients atteints de ces affections. 3- Utilisation potentielle du xénon chez l'homme : Si les résultats expérimentaux démontrent l'effet bénéfique du xénon sur la perméabilité de la BHE et l'augmentation des concentrations cérébrales des médicaments, cela pourrait justifier l'utilisation du xénon chez les patients humains. Étant donné que le xénon est déjà utilisé en clinique humaine, cela faciliterait son adoption et son application dans le contexte médical. En résumé, l'étude vise à démontrer les avantages potentiels de l'utilisation du xénon pour améliorer la délivrance de médicaments au cerveau, ce qui pourrait conduire à des traitements plus efficaces pour les patients atteints de cancer, d'épilepsie et d'infections par exemple. Ces résultats ouvriraient également la voie à l'utilisation clinique du xénon chez les humains, en capitalisant sur sa sécurité et son utilisation déjà établies dans le domaine médical.

Procédures

Les rats seront placés dans une boite d’inhalation permettant l’exposition au xénon. Les médicaments seront administrés au moyen d’une pompe Alzet placée au dos de l’animal. L’animal sera libre de ses mouvements dans la cage d’inhalation. La durée de traitement est de 4h. A la fin de chaque traitement les animaux seront euthanasiés pour prélèvement d’organes.

Impact sur les animaux

Ces considérations seront prises en compte lors de l'étude : Stress lié à la manipulation des animaux et au placement dans la cage : 1- Problème d'infection suite à la chirurgie 2- Réaction inflammatoire : L'implantation des pompes peut provoquer une réaction inflammatoire locale.

Devenir

Les rats seront euthanasiés à la fin de chaque expérimentation pour des prélèvements d’organes.

Remplacement

Le projet que nous souhaitons mener repose sur diverses approches expérimentales complémentaires. La validation de l’utilisation du xénon comme marqueur de la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique sera réalisée à l’aide de modèles in vitro de cellules en culture. Ces modèles in vitro constituent un axe important du projet et leur étude apporteront des éléments précieux qui permettront de réduire au maximum l’utilisation d’animaux. Toutefois, l’un des objectifs importants du projet est de tester si l’administration du xénon par inhalation permet une meilleure biodisponibilité cérébrale des molécules thérapeutiques. La complexité anatomique des voies de communication entre le compartiment systémique et le cerveau est telle qu’elles ne sont pas modélisable in vitro. Nous devrons donc avoir recours à des systèmes intégrés afin de tester et valider nos hypothèses.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux (180 au total) nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude.

Raffinement

• Les animaux sont hébergés en groupe, dans un environnement enrichi. • L’application de critères d’arrêt et le suivi quotidien des animaux hébergés permettent de garantir leur bien-être. L’état de santé des animaux sera surveillé (état général) tout au long de l’expérience • Stress des animaux liés à leur mise en cage :Les animaux seront progressivement familiarisés avec la boîte d'inhalation en étant exposés à celle-ci pendant des sessions d'entraînement quotidienne sur une période de 15 jours avant le début des expérimentations. Au cours de ces sessions d'entraînement, les rats seront placés dans la boîte d'inhalation pendant des périodes croissantes, commençant par des durées plus courtes et augmentant progressivement jusqu'à atteindre la durée maximale de 4 heures prévue pour l'expérience. Cette approche graduelle visera à réduire l'anxiété et le stress liés à l'exposition à la boîte d'inhalation et aux manipulations associées. • Infection/inflammation du fait de la chirurgie pour l’implantation des pompes : Les animaux seront suivis quotidiennement suite à l’implantation des pompes t. En cas de signe d’infection/inflammation, le vétérinaire sera contacté pour savoir quelles mesures prendre.

Choix des espèces

L’étude de l’efficacité du xénon pour moduler la perméabilité de la BHE nécessite un modèle élaboré comme le rat couramment utilisé en pharmacologie. De plus celui-ci est préféré à la souris car sa plus grande taille rend les expérience plus sensible (la quantité de signal étant plus grande). Cette espèce sera aussi utilisée dans les études futures de toxicologie. Les rats adultes seront utilisés dans ce protocole. Cette première étude adresse les agents thérapeutiques pour une application dans un premier temps chez l’adulte. En conséquence, Il est nécessaire d’utiliser des animaux bien matures sur le plan du développement neuronal. En fonction des résultats nous envisagerons les animaux juvéniles.

616 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules de cancer du foie puis une chimiothérapie combinée à un anticorps deux fois par semaine pendant six semaines, pour tester si cette association ralentit la croissance tumorale. Le porteur indique que la tumeur peut provoquer une ulcération cutanée et que la chimiothérapie entraîne perte d'appétit et de poids. Il affirme avoir mené des études in vitro et sur tissus de patients, mais juge nécessaire une validation sur "animal entier" avant le passage chez l'humain.

Objectifs

Le cancer du foie est le 3ème cancer le plus meurtrier dans le monde. Le traitement de référence des formes graves fait appel à une combinaison de chimiothérapie, mais seul un faible pourcentage de patients répond à ces traitements. Il y a donc urgence à améliorer les thérapies actuelles. Depuis une dizaine d’années nous avons développé un anticorps reconnaissant spécifiquement une protéine localisée sur la membrane des cellules et connue pour participer au développement de différents cancers, notamment celui du foie. Nous avons montré que notre anticorps conduisait à une inhibition partielle de la croissance du cancer du foie dans un modèle de souris ne présentant pas de système immunitaire. Nous avons également montré que le traitement chimiothérapeutique standards entraine une augmentation de l’expression de la protéine ciblée par notre anticorps. Cela suggère qu’une combinaison entre notre anticorps et le traitement de référence pourrait améliorer l’efficacité du traitement du cancer du foie. L’objectif de notre projet est tout d’abord d’identifier la dose adéquate de chimiothérapie à utiliser puis d’évaluer l’efficacité de la combinaison entre le traitement de référence et notre anticorps sur la progression tumorale.

Bénéfices attendus

Le cancer du foie est un cancer pour lequel le nombre de cas est en augmentation constante partout dans le monde, et les traitements actuels ne permettent de soigner qu’un faible pourcentage de malades. Notre projet est une étape vers la mise en place de nouveaux traitements. Nous pensons que notre anticorps peut améliorer l’efficacité des thérapies actuelles et ainsi la prise en charge des malades dans le futur. Cet anticorps a d’ailleurs déjà passé les tests de toxicité avec succès et est récemment entré en essai clinique pour le traitement d’autres pathologie du foie.

Procédures

Une partie des animaux de ce projet seront soumis à une injection unique sous la peau de cellules cancéreuses du foie. Cette injection prend environ une minute à être réalisée sur animaux anesthésiés. Les animaux recevront un traitement par chimiothérapie et anticorps 2 fois par semaine pendant 6 semaines par injection intrapéritonéale. Cette injection est réalisée sur animaux vigiles et prend moins d’une minute à être réalisée. Les animaux subiront un prélèvement de sang terminal. Cette procédure est réalisée sur animaux anesthésiés et est réalisé en environ 1 minute.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sont très limités. Pour les souris injectées sous la peau, la croissance de la tumeur peut entrainer l’apparition d’une ulcération cutanée. De même, les injections répétées intrapéritonéales peuvent parfois engendrer une douleur ou très rarement une ulcération au niveau des sites d’injection. Le traitement par chimiothérapie peut entrainer une perte de poids de la souris (perte d’appétit, fatigue).

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissues (tumeurs) qui seront utilisées pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Afin de remplacer les études in vivo, nous avons procédé à des études in vitro sur lignées cellulaires et ex vivo sur des tissus de patients afin de démontrer la validité de l’approche. Celle-ci nécessite maintenant une validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier avant transposition clinique chez l’humain.

Réduction

Afin de réduire la quantité de groupes d’étude, nous prévoyons d’adopter une démarche pas-à-pas, en améliorant au fur et à mesure les conditions d’étude de notre anticorps. Les tailles d’effectifs ont été déterminées à priori grâce à un logiciel dédié afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.

Raffinement

Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont, l’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification, des briques de tremble à ronger, un tunnel pour se cacher, et des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance.

Choix des espèces

Les souris sont de petits mammifères très proches de l’homme. Le modèle proposé dans cette étude a contribué dans le passé à établir le potentiel curatif des approches thérapeutiques actuellement prescrites chez l’homme. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de 8 semaines minimum. Il est préférable de greffer les cellules sur des animaux adultes afin que les tumeurs grandissantes entravent le moins possible leur capacité de mouvement.

1 258 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intrapéritonéale de bactéries provoquant une septicémie, puis des antibiotiques toutes les deux heures, pour tester l'efficacité de nouveaux traitements contre des Escherichia coli ultrarésistantes selon la quantité de bactéries. Le porteur décrit une septicémie apparaissant deux heures après l'inoculation et une surveillance par grille de score déclenchant la mise à mort dès l'atteinte d'un point limite. Il affirme que la complexité d'une infection in vivo rend le remplacement par des tubes à essai "non réalisable" et le passage par l'animal "indispensable".

Objectifs

Il est urgent de développer de nouvelles molécules antibiotiques pour lutter contre les bactéries ultrarésistantes. Parmi elles, Escherichia coli (E. coli) est la bactérie la plus fréquemment responsable d’infections urinaires et digestives et d’infections généralisées (septicémies) chez l’homme. Elle est aussi parmi les plus touchées actuellement par la résistance aux antibiotiques, avec parfois plus aucun antibiotique efficace (bactéries ultrarésistantes). De nouveaux antibiotiques ont été très récemment développés et ont montré leur efficacité pour tuer certaines bactéries ultrarésistantes. Ces antibiotiques ont montré leur efficacité au laboratoire dans des tubes à essai contre des souches de E. coli ultrarésistantes, mais chez l’homme, faute de données d’efficacité suffisamment nombreuses et du fait d’échecs de traitement rapportés chez certains malades, ces antibiotiques ne peuvent être utilisés qu’en dernier recours et lorsque le recours aux autres options disponibles n’est pas envisageable. On dispose actuellement de très peu de travaux de recherche sur l’utilisation de ces nouveaux antibiotiques, notamment peu de choses sur leur efficacité quand il y a une quantité importante de bactéries (appelé « inoculum important »). L’étude de l’efficacité des antibiotiques sur des quantités de bactéries différentes se fait au laboratoire « in vitro » c’est-à-dire dans des tubes à essai, mais l’utilisation de modèles vivants sont pour l’instant indispensables pour prendre en compte aussi les défenses immunitaires des êtres vivants et des paramètres de distribution dans le corps de l’antibiotique. C’est pourquoi avant de les tester chez l’homme il est nécessaire de faire des expériences chez l’animal, en l’occurrence la souris. L’objectif de notre travail est l’analyse de l’efficacité de ces nouveaux antibiotiques sur des quantités de bactéries différentes (ou inoculum différent) pour s’assurer qu’ils restent efficaces même pour tuer de grandes quantités de bactéries. Nous utilisions pour ces expériences un modèle d’infection intra abdominale de la souris qui provoque une septicémie et avec lequel on peut faire varier la quantité de bactéries. L’efficacité des antibiotiques sera évaluée en termes de survie des animaux infectés et nombre de bactéries présentes apres traitement au niveau de la rate des animaux (qui correspond à ce qui se trouve dans le sang).

Bénéfices attendus

Les résultats de ce travail pourront permettre de mieux définir les conditions de l’utilisation de ses molécules chez l’Homme et comprendre pourquoi parfois elles ne marchent pas.

Procédures

Les souris seront infectées par une injection dans le ventre (intra péritonéale) à l'aide d'une aiguille fine de 250μL contenant un mélange de bactéries sur animal vivant non anesthésié (durée du geste environ 5 secondes) et traitées par antibiotiques par une injection sous la peau du cou de 0,2mL toutes les deux heures (durée du geste 5 secondes). Elles seront surveillées de façon très rapproché puis euthanasiées si elles montrent le moindre signe de souffrance avant la fin de l'expérimentation. Aucun prélèvement ne sera réalisé sur souris vivante. Un prélèvement stérile de liquide péritonéal (2mL) et de la rate seront réalisés après euthanasie de la souris. Un prélèvement sanguin (2mL) par ponction intra-cardiaque sera également réalisé après l’euthanasie.

Impact sur les animaux

Ce modèle représente un modèle de sévérité modérée d’infection péritonéale bactérienne avec septicémie qui apparait à partir de 2h après l’inoculation bactérienne. Aucune douleur n’est à attendre, en revanche les souris peuvent être stressées, avec des signes tels que les poils hérissés et une fatigue.

Devenir

Toutes les souris seront euthanasiées à la fin de l'experimentation ou avant en cas d'atteinte d'un point limite pour limiter au maximum des souffrances inutiles. La durée totale est de 30h au maximum (2h infection + 24h traitement + 4h post traitement). Tous les animaux seront mis à mort, car nous aurons à faire des prélèvements des organes et du sang, qui ne peut se faire sur animal vivant.

Remplacement

L’étude de l’efficacité des antibiotiques sur des quantités de bactéries différentes se fait au laboratoire « in vitro » c’est-à-dire dans des tubes à essai, mais l’utilisation de modèles vivants sont pour l’instant indispensables pour prendre en compte aussi les défenses immunitaires des êtres vivants et des paramètres de distribution dans le corps de l’antibiotique. C’est pourquoi, avant de les tester chez l’homme, il est nécessaire de faire des expériences chez l’animal. En effet, la complexité d'une infection in vivo rend pour l’instant le remplacement de ce modèle expérimental par des modèles in vitro (tube à essai) non réalisable.

Réduction

De nombreuses analyses seront réalisées en amont pour réduire les conditions testées et les animaux utilisés. Les analyses déjà réalisées au sein de l’équipe seront une base pour cibler les doses des traitements antibiotiques nécessaires, permettant de limiter le nombre d'animaux utilisés. Toutes les molécules testées sont des antibiotiques. Pour le cefiderocol, une étude de dose (pharmacocinétique) sera nécessaire car cette molécule n’a jamais été utilisée dans le modèle ; en revanche pour l’avibactam et aztreonam l’étude a déjà été réalisée dans notre laboratoire et ne sera donc pas refaite, pour limiter le nombre de souris utilisées. Des souris dites "contrôles", c'est a dire traitées avec des antibiotiques dont on sait qu'ils sont efficaces, seront utilisées, mais ces contrôles ne seront pas répétés à chaque experimentation pour limiter le nombre de souris utilisées. Les organes (rate, liquide péritonéal) seront congelés et conservés à -80°C pour permettre une analyse ultérieure en cas de besoin sans devoir recourir à nouveau à l'expérimentation chez la souris.

Raffinement

En ce qui concerne le raffinement, il sera obtenu grâce au respect d’un délai d’au moins 72h entre l’arrivée des souris au laboratoire et le début de l’expérimentation animale, le respect des conditions optimales d’hébergement des souris en animalerie en portoirs ventilés, c'est à dire en cages adaptées bien ventilées (5 souris par cage) et la surveillance des animaux toutes les 2 heures pendant toute l’expérimentation, avec accès facile à l’eau et à la nourriture. L’apparition de signes chez l’animal de souffrance avec un score de points limites sera surveillée de près. Les délais entre l’infection par les bactéries et le traitement antibiotique sont réduits à deux heures pour limiter le risque de souffrance. L’euthanasie sera programmée 4h après la fin du traitement antibiotique qui dure 24 h, sans attendre de décès spontané, ou avant si des signes de souffrance apparaissent (torpeur, poil hérissé ...). Un score de points a été établi, prenant en compte 3 paramètres, avec à chaque fois une gradation de 0 à 4: la posture normale voutée, voutée+ et voutée ++, la mobilité: normale, altérée, altérée + et prostrée et le poils: sans atteinte, hérissés, hérissés + et hérissés ++. Le point limite est atteint si la somme des points est > ou = à 6 ou si le score de 3 est atteint pour la mobilité ou la posture. En cas d’atteinte du point limite, l’animal sera euthanasié.

Choix des espèces

La souris est un animal vertébré dont l’anatomie et la physiopathologie de l’infection intrapéritonéale sont suffisamment proches de celle de l’homme pour autoriser l’étude des thèmes mentionnés plus haut. La souris est l’espèce la plus utilisée par la communauté scientifique internationale dans la thématique de l’infection intra-péritonéale. Les souris utilisées ont 8 semaines (environ 25 grammes). Ce sont des animaux adultes pour utiliser des souris de poids suffisant.

7 750 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines, génétiquement modifiées, reproduisent des maladies neurologiques rares et développent troubles moteurs, dégradation de l'état général et perte de poids, tandis que des candidats médicaments leur sont administrés jusqu'à treize semaines, avec pose de mini-pompes sous la peau et prélèvements sanguins répétés. Le porteur fixe un point limite à 20 % de perte de poids, seuil qui déclenche la mise à mort des animaux qui se dégradent. Il affirme que seul l'animal possède un répertoire comportemental et neurophysiologique intégré permettant de tester l'efficacité des composés.

Objectifs

En France, le nombre de personnes atteintes de maladies rares est estimé actuellement à 3.5 millions. Une maladie est dite rare lorsqu’elle affecte moins d’une personne sur 2000. Plus de 7000 maladies rares, dont environ 800 neurologiques, sont décrites, et de nouvelles sont identifiées chaque semaine. Les maladies rares sont généralement sévères, chroniques, handicapantes. L’atteinte peut être visible dès la naissance ou l’enfance, comme par exemple l’amyotrophie spinale infantile. Cependant, plus de 50% des maladies rares apparaissent à l’âge adulte, comme la maladie de Huntington, la sclérose latérale amyotrophique ou les ataxies spinocérébelleuses. La moitié des personnes atteintes présentent des déficits moteurs, sensitifs ou intellectuels et dans 9 % des cas, une perte totale d’autonomie. C’est dans ce contexte que notre équipe tente aujourd’hui d’identifier des composés issus de notre recherche capable de ralentir ou d’arrêter la progression de ces maladies, afin de proposer aux patients des traitements adaptés et personnalisés. Dans le cadre de la recherche de nouveaux médicaments, les composés, après avoir été sélectionnés grâce à des tests in vitro, sont testés in vivo chez la souris saine ou génétiquement modifiée afin d’évaluer leur effet dans le traitement des maladies rares neurologiques, et destinés à être administrés chez l’homme par différentes voies de traitement. La souris présente une forte homologie génétique, physiologique et comportementale avec l’homme et apporte ainsi une forte valeur translationnelle. En effet, 90% des gènes humains ont un équivalent chez la souris saine, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque l’homologie homme/souris n’est pas possible, le remplacement total ou partiel dans le génome du gène de la souris par son équivalent humain permet la création de lignées génétiquement modifiées. Nous avons également recours à des souris génétiquement modifiées répondant en tant que modèle de physiopathologie humaine récapitulant une partie des caractéristiques pathologiques observées chez l’Homme.

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans le cadre de la stratégie de recherche en neurosciences. Les bénéfices attendus de ce projet sont d’identifier et de sélectionner des candidats médicaments et de déterminer leur efficacité sur une cible donnée dans le cadre de maladies rares neurologiques.

Procédures

• Administration des médicaments vétérinaires analgésiques (contention d’une durée maximale de 30s) • Administration de composés testables, de référence ou véhicule (selon la voie d'administration) : animal vigile en simple contention d’une durée maximale de 30s – 1 fois par semaine pendant 13 semaines maximum ou sous anesthesie générale gazeuse et couverture analgésique (durée maximale de 25 minutes – 1 seule fois en début d’expérience) ou encore avec mise en place d’une mini-pompe pour l’administration continue de composé implantée sous anesthésie générale gazeuse et couverture analgésique (durée maximale de 10 min – 1 fois par mois si nécessité de changer la mini-pompe) • Prélèvement de sang sur animal vigile (1 fois toutes les 3 semaines pendant 30 semaines maximum) : Contention d’une durée maximale de 2min ; Piqûre de la veine marginale de la patte d’une durée maximale de quelques secondes ; Prélèvement de sang d’une durée maximale de 15 secondes

Impact sur les animaux

Une potentielle source de stress ou douleur peut provenir lors : -Des injections d’analgésiques et/ou d’anesthésiques. La contention de 30s et l’injection d’environ 10s peuvent également générer du stress. -de l’administration de composés testés réalisée dans la première procédure chez la souris vigile avec une contention de 30s et une injection d’environ 10s qui peuvent également générer du stress. -Ou, dans la seconde procédure de la phase chirurgicale nécessaire à l’administration du composé testé (d’une durée d’environ 20 minutes) et du suivi post-opératoire. -Des prélèvements de sang au niveau de la veine marginale de la patte. La contention d’une durée maximale de 2 min ainsi que le prélèvement (moins de 30s) peuvent générer du stress. -D’une perte de poids limitée à 20% du poids de l’animal. -Des signes cliniques observables associés à l’injection des composés (troubles du comportement, altération de l’état général). -De signes cliniques liés à l’expression des altérations génétiques : les souris génétiquement modifiées miment les pathologies humaines et sont susceptibles de développer ainsi des signes cliniques évolutifs tels que des troubles moteurs (incoordination motrice), une altération de l’état général, des dermatites, de la perte de poids.

Devenir

Toutes les souris sont soit euthanasiées en cours d’étude si des points limites éthiques sont atteints, soit euthanasiées en fin d’études afin de réaliser des prélèvements de fluides et/ou de tissus qui permettront d’effectuer des analyses biochimiques.

Remplacement

La recherche de nouveaux médicaments dans le domaine des maladies neurologiques rares repose sur une première étape d’identification de molécules efficaces sur leur cible au moyen de tests in vitro (cultures de neurones primaires, IPS…) et in silico. Toutefois l’efficacité thérapeutique d’une molécule ne peut être démontrée qu’après administration chez l’animal. Il est donc nécessaire que les molécules les plus abouties dans leur développement soient administrées in vivo. Plus spécifiquement pour ce projet, seul l’animal (sains et génétiquement modifié) possède de façon intégrée un répertoire comportemental et des caractéristiques neurophysiologiques permettant de tester l’efficacité de candidats médicaments pour le traitement de maladies neurologiques rares.

Réduction

Dans un premier temps, une caractérisation des composés de référence est réalisée afin de déterminer la dose pharmacologiquement pertinente, choix basé sur les données de la littérature et les brevets issus de la concurrence (3 animaux par groupe suffisent à avoir une réponse reproductible). Les effets toxiques potentiels des traitements pharmacologiques seront évités en administrant aux doses définies dans la littérature ou après détermination de la première dose toxique par l’équipe de toxicologie. A l’issue des premiers résultats obtenus, nous pouvons tester à la dose identifiée les candidats médicaments avec un faible effectif (3 à 5 animaux par groupe suffisent à avoir une réponse reproductible). Ce premier filtre vivo permet de discriminer les composés afin de sélectionner uniquement les candidats pharmacologiquement intéressants. Ils seront ensuite évalués à différentes doses et différents temps post-administration à l’aide d’une approche descriptive (pas de tests statistiques). Les meilleurs candidats seront testés dans des études nécessitant plus d’animaux (pharmacocinétique / pharmacodynamie, …), une modélisation non linéaire et une approche statistique multi-critères est effectué en collaboration avec le service statistique dédié. Au cas par cas, en fonction du projet de recherche concerné et des questions posées, une consultation statistique sera programmée pour réajuster le nombre d’animaux nécessaire ainsi que pour travailler sur le design expérimental le plus adapté. La technique de prélèvement de sang dite par microsampling, peu invasive et rapide, permet de prélever des échantillons de sang plusieurs fois sur un même individu, contribuant ainsi à la réduction du nombre d’animaux, tout en respectant les limites de volémies physiologiques. Lors des prélèvements effectués à la fin des études, un maximum de tissus et de fluides seront collectés sur un même animal. Chaque tissu, cérébral ou périphérique, sera séparé en plusieurs échantillons permettant ainsi la multiplication des analyses biochimiques et/histologiques potentiellement réalisables. Ce process nous permet de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés par projet de recherche.

Raffinement

Les injections intracérébrales seront réalisées sous anesthésie générale gazeuse et avec analgésie pré, péri et post-opératoire. Seules les souris opérées pour l’implantation d’une mini-pompe (type pompe alzet) seront remises en groupe après la phase de chirurgie si les caractéristiques de la souche le permettent. Toute la phase chirurgicale, d’une durée d’environ 20 minutes, (de l’induction de l’anesthésie au réveil de l’animal) se fera sur couverture chauffante et/ou dans des enceintes chauffées réduisant ainsi significativement le risque d’hypothermie. Les éventuelles recommandations en termes de limite d’âge ou de conditions de maintien émises par la Structure de Bien-Etre Animal seront appliquées aux souris âgées ou génétiquement modifiées qui peuvent développer des signes pathologiques avec le temps. Des prélèvements de sang à la veine marginale de la patte peuvent être mis en œuvre afin d’obtenir des informations sur des possibles biomarqueurs ou sur le profil d’exposition du composé (évitant ainsi des études de pharmacocinétique dédiées). Si des prélèvements sanguins répétés sont prévus, le volume maximal prélevé n’excèdera pas 15% de volume de sang total sur 28 jours. Tous les animaux font l’objet d’un suivi quotidien qui est accru lors des périodes post-chirurgicales, pour les souris génétiquement altérées, et/ou soumises à une étude pharmacologique chronique (procédure 2), réalisé par les expérimentateurs et le personnel assurant leur soin. Un suivi particulier sera réalisé pour les animaux faisant l’objet d’une administration de composés par voie intracérébrale. Plus précisément, un suivi post injection sera assuré dès le réveil de l’animal et par l’intermédiaire d’une analyse observationnelle basée sur des critères définis par une grille d’observation spécifique scorée. Les animaux disposeront d’enrichissement dans leurs hébergements bâtonnets de coton ‘cocoon’ et de sizzle pad pour se construire un nid ou de morceau de bois à ronger dans leur cage d’hébergement et d’un tube en plexiglass.

Choix des espèces

La souris présente une forte homologie génétique, physiologique et comportementale avec l’homme et ainsi une forte valeur translationnelle. Les procédures d’évaluations décrites dans ce projet s’appuient sur une littérature scientifique et une expertise interne robustes. La souris est génétiquement modifiable, avec des techniques de plus en plus performantes (ex : édition du génome), et offre une large palette de modèles pertinents pour l’identification de nouveaux biomarqueurs et cibles des maladies neuropsychiatriques. Les souris seront utilisées du stade « jeune adulte sevré » au stade « animal âgé ». L’âge des souris au moment des études effectuées dépendra du modèle utilisé : Si l’étude concerne des injections de composés par voie cérébrale/orale ou périphérique, les souris utilisées sont de jeunes adultes sevrés ou adultes au moment de l’administration. Quel que soit le modèle, l’âge d’utilisation dépendra des éventuelles recommandations en termes de limite d’âge qui pourront être émises par la Structure de Bien-Etre Animal.

960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié subit une ischémie oculaire chirurgicale de 90 minutes par augmentation de la pression, avec injections virales intravitréennes, tests visuels et électrorétinogrammes, pour étudier le rôle d'un récepteur des cannabinoïdes dans la protection des neurones de la rétine. Le porteur indique que la manipulation de l'œil peut provoquer douleurs, cataractes et baisse de l'acuité visuelle. Il affirme qu'une caractérisation in vitro a été menée mais que le mécanisme ne peut être étudié que sur un modèle de lésion in vivo, les yeux étant prélevés après la mise à mort.

Objectifs

La rétine, située dans l'œil, transforme la lumière en signaux électriques pour nous permettre de voir. Bien qu'elle se trouve en périphérie, la rétine fait partie du système nerveux central, composé de neurones et de cellules gliales, qui soutiennent les neurones. La perte de ces neurones peut entraîner une cécité irréversible. Le glaucome et la rétinopathie diabétique, qui sont les principales causes de cécité dans le monde, surviennent lorsque les neurones meurent à la suite d'une augmentation de la pression ou de l'obstruction d'un vaisseau. Les traitements actuels atténuent les symptômes sans se concentrer sur la protection des neurones. Des études montrent que certains composés dérivés du cannabis peuvent contribuer à sauver ces cellules en agissant sur des récepteurs spécifiques de l'organisme. Ce projet vise à comprendre comment cela fonctionne, offrant ainsi un espoir pour le traitement des maladies oculaires.

Bénéfices attendus

L'ischémie oculaire, présente dans des maladies rétiniennes telles que le glaucome et le diabète rétinopathique, provoque la mort des cellules responsables de la transmission visuelle au cerveau, entraînant une cécité incurable. Actuellement, le glaucome est la principale cause de cécité irréversible, touchant 3,5% des personnes de 40 à 80 ans. Un défi majeur est que la perte de vision commence en périphérie du champ visuel, souvent imperceptible, d'où son surnom de "maladie silencieuse". Lorsqu'elle est détectée, environ la moitié des neurones sont déjà perdus, irrécupérables comme dans la maladie d'Alzheimer. Les cellules de Müller, abondantes dans la rétine, jouent un rôle clé. Normalement, elles sécrètent des facteurs protégeant les neurones rétiniens, mais en cas de dommages, ces facteurs altérés déclenchent la mort des cellules ganglionnaires de la rétine, induisant la cécité glaucomateuse. Ce projet vise à élucider le rôle neuroprotecteur des cannabinoïdes dans la rétine pour développer des traitements sauvant les cellules ganglionnaires de la rétine de la mort en cas de dommages rétiniens, notamment l'ischémie oculaire. Avec de nombreux patients affectés, des traitements efficaces auront un impact social et économique majeur, améliorant la qualité de vie et économisant des ressources. À court terme, le projet permettra d'explorer le système endocannabinoïde rétinien. Le récepteur cannabinoïde, crucial dans divers processus physiologiques et pathologiques, reste peu étudié dans l'organe visuel. Bien que la fonction neuroprotectrice des cannabinoïdes dans la rétine soit établie, le mécanisme précis reste inconnu. Comprendre cette neuroprotection permettrait le développement de traitements spécifiques pour les maladies cellules ganglionnaires de la rétine-induites, offrant un espoir crucial pour ceux confrontés à une cécité irréversible.

Procédures

Ischémie oculaire (90min). Tous les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale visant à provoquer une ischémie oculaire. La moitié d'entre eux appartiendra au groupe sham (seul l'œil sera canulé mais la pression ne sera pas augmentée) et l'autre moitié appartiendra au groupe ischémie oculaire (la pression sera augmentée). Cette procédure ne sera réalisée qu'une seule fois sur chaque animal et l'opération durera 90 minutes. Injection virale intravitréenne. A réaliser sur certains génotype d´animaux. Elle sera réalisée une seule fois et la procédure durera moins de 15 minutes. Test comportemental visuel (40min) et électrorétinogramme (25min). À effectuer sur tous les animaux à deux reprises : en préopératoire et en postopératoire. Traitement local aux cannabinoïdes (7jours) . À effectuer sur tous les animaux une fois par jour pendant 7 jours après l'opération. Traitement pharmacologique (8jours). À administrer à certains animaux, une fois par jour pendant 8 jours.

Impact sur les animaux

Les procédures expérimentales prévues sont généralement douces, à l'exception de l'ischémie oculaire, et ne devraient pas causer d'inconfort ou d'effets indésirables significatifs. Les procédures peuvent être regroupées en fonction de la similitude des effets indésirables. L'ischémie oculaire aiguë et l'injection intravitréenne sont des procédures chirurgicales au cours desquelles la chambre antérieure et la chambre postérieure de l'œil seront manipulées, respectivement. Les deux procédures ainsi que l'électrorétinogramme seront effectués sous anesthésie, ce qui pourrait entraîner une hypothermie. En outre, la manipulation de l'œil peut provoquer des douleurs, des cataractes et une baisse de l'acuité visuelle. Le traitement intrapéritonéal peut provoquer un stress aigu chez les animaux injectés. Enfin, les tests comportementaux visuels peuvent être stressants pour les animaux, même s'ils ont été habitués à ces tests. Afin de minimiser les effets négatifs des tests effectués, toutes les précautions possibles doivent être prises pour assurer le bien-être des animaux tout au long de l'expérience.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort et les yeux seront récupérés.

Remplacement

D'un point de vue méthodologique, nous nous sommes engagés à respecter les règles de remplacement, de réduction et de raffinement. Par conséquent, nous avons effectué une première caractérisation du système in vitro, où l'expression du récepteur CB1 dans les cellules d'intérêt : les cellules de Müller et les cellules ganglionnaires de la rétine a été testée. En outre, la littérature et l'expérience antérieure des deux groupes démontrent le rôle neuroprotecteur des cannabinoïdes dans un modèle de lésions. Cependant, le mécanisme détaillé par lequel les cannabinoïdes sauvent les cellules ganglionnaires de la rétine de la mort n'a jamais été étudié. Malheureusement, cette question ne peut être résolue qu'avec un modèle de dommage in vivo, car il n'est pas possible de reproduire in vitro la complexité des interactions rétiniennes d'une part et, d'autre part, l'ischémie oculaire due à l'augmentation de la pression intraoculaire.

Réduction

Afin de respecter le principe de réduction, nous nous engageons à utiliser le nombre minimum d'animaux strictement nécessaire pour tirer une conclusion statistiquement valable de cette population. Le laboratoire collabore avec des experts des pathologies oculaires et en particulier des maladies de la rétine, et possède donc une grande expérience dans leur étude et dans la création de modèles animaux de pathologies oculaires telles que l'ischémie. Lors d'une expérience pilote réalisée dans son laboratoire, le protocole d'ischémie oculaire a été affiné, ce qui permet de réduire le nombre d'animaux à utiliser. Les groupes expérimentaux ne doivent pas dépasser 12 animaux. Ce nombre de souris est le minimum requis pour obtenir une signification statistique et est cohérent avec les études précédentes utilisant des méthodologies similaires. Toutefois, si nos premières expériences démontrent qu'il est possible de réduire le nombre de souris, ce nombre sera réduit en conséquence. Ce nombre d'animaux/groupe a été fixé (i) par des calculs de puissance qui nous permettraient d'obtenir une différence significative pour les différentes variables d'intérêt à évaluer dans l'étude et de rejeter une hypothèse nulle, et (ii) en se référant à des publications dans le domaine (iii) en tenant compte de la variabilité que nous trouvons habituellement dans le comportement d'intérêt. En outre, nous essaierons de minimiser le nombre d'animaux en étudiant le comportement visuel avant et après le dommage et après le traitement. Le traitement statistique des données suit les conventions traditionnelles dans ce domaine. Les méthodes d'analyse statistique sont choisies de manière à minimiser le nombre d'animaux par groupe.

Raffinement

Les animaux de cette étude bénéficient d'une surveillance constante par un personnel qualifié et l'expérimentateur. Hébergées dans des cages collectives, elles ont accès à la nourriture et à l'eau, assurant leur bien-être physique. À leur arrivée à l'animalerie, elles ont une semaine pour s'acclimater au cycle jour/nuit.Tous les animaux seront opérés soit dans le groupe sham, soit dans le groupe ischémie oculaire. À cette fin, une anesthésie générale est appliquée. La température corporelle est surveillée, évitant l'hypothermie avec une couverture thermique. Avant l'opération, de l´analgésique est injectée aux animaux pour atténuer la douleur causée par l'opération. Pendant la chirurgie, l'œil opéré est maintenu humide avec du sérum physiologique. Après, une anesthésie locale est appliquée et elles sont logées dans des cages collectives enrichies. Une injection intrapéritonéale de médicament anti-inflammatoire est administrée pour prévenir la douleur et répétée pendant deux jours. Le suivi quotidien rigoureux par du personnel qualifié et l'expérimentateur permet de détecter toute douleur ou détresse. Le poids est enregistré à l'arrivée et une fois par semaine, avec des mesures quotidiennes les trois jours suivant l'opération. Une perte de poids excessive sur deux jours ou des signes graves déclenchent des mesures appropriées. Les animaux sont habitués aux procédures pour minimiser la souffrance. Des précautions sont prises pour assurer le respect maximal des procédures, garantissant le bien-être et la santé des animaux tout au long de l'expérimentation. Pour toutes les procédures, des seuils ont été fixés pour arrêter la procédure si le bien-être de l'animal ne peut être assuré.

Choix des espèces

La souris est le modèle animal privilégié en raison de ses nombreux avantages. Les circuits neuronaux de la rétine sont conservés entre les rongeurs et les humains, assurant la pertinence des résultats obtenus. De plus, le système visuel est bien caractérisé fonctionnellement et histologiquement, facilitant l'affinement des procédures et la comparaison des résultats avec la littérature existante. La disponibilité de souris transgéniques CB1 permettra d'explorer en détail le mécanisme d'action des cannabinoïdes dans la neuroprotection rétinienne, en identifiant les cellules cruciales pour cette protection. Enfin, les installations sont équipées pour l'étude systématique des souris, garantissant leur bien-être conforme aux normes requises. Les souris utilisées seront des souris adultes âgées de 7 à 16 semaines. Le modèle d'ischémie et son traitement seront réalisés sur des animaux adultes car l'organe visuel est entièrement développé pour l'étude.

615 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par différentes souches de trypanosomes puis suivies par des prises de sang quotidiennes, pour comparer le pouvoir pathogène du parasite responsable de la trypanosomose animale africaine. Le porteur indique que l'infection peut provoquer perte de poids, poil hirsute, prostration et parfois la mort de l'animal. Il affirme que la culture in vitro ne permet pas d'étudier le comportement du parasite dans le sang circulant et que le passage par la souris est donc "indispensable".

Objectifs

L’élimination de la trypanosomose animale africaine (TAA) reste encore aujourd’hui un challenge, et ce à plusieurs titres. Effectivement, ces maladies parasitaires représentent un véritable fléau en termes de santé pour le bétail et constituent une forte contrainte au développement de l’élevage et de l’agriculture en Afrique. Dans le but d’enrayer l’infection due aux trypanosomes, nos recherches visent à étudier le pouvoir pathogène du parasite en identifiant quels sont les gènes responsables de la mise en place et du développement de la maladie chez son hôte. Ces découvertes pourraient permettre d’améliorer le diagnostic, de développer de nouveaux traitements et d’envisager une stratégie vaccinale. L’objectif de ce projet est d’étudier la fonction des gènes identifiés en comparant le comportement de plusieurs souches de trypanosomes chez la souris.

Bénéfices attendus

Dans un contexte d’amélioration des outils de diagnostic actuels et l’identification de molécules à visée thérapeutique et vaccinale, une meilleure connaissance de la biologie du parasite est nécessaire et passe par l’étude de gènes impliqués dans le processus d’infection chez son hôte. L’étude de ces gènes nous renseigne sur leur rôle dans les mécanismes de l’infection ainsi que sur leur implication dans les phénomènes mis en place par le trypanosome pour échapper au système de défense de l’hôte. Le suivi des infections sur souris nous permettra d’étudier le rôle que peuvent avoir ces gènes cibles dans le pouvoir pathogène du parasite et orientera nos recherches vers l’étude de nouvelles cibles diagnostiques, thérapeutiques et vaccinales.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections de parasites une fois en début d’expérimentation (1 min/ injection). Chaque jour pendant la durée de l’essai, une prise de sang d’un volume de maximum de 5 µl sera réalisée (30 sec /prélèvement) pour déterminer la parasitémie. De la même façon, un volume de sang de 70 µL sera prélevé avant infection et deux fois au cours de l’expérimentation (3 min / prélèvement) pour mesurer l’hématocrite. Les animaux seront également pesés quotidiennement avant chaque prélèvement de sang (1 min / pesée). En fin d’expérimentation, les animaux seront anesthésiés pour pouvoir prélever un plus grand volume de sang (~ 1,5 mL) (7 min / prélevement).

Impact sur les animaux

Les infections par les trypanosomes animaux peuvent induire chez la souris des effets indésirables de part le développement des parasites dans le sang. Ces effets sont variables d’une souche de trypanosomes à l’autre. Cela peut être par exemple une perte de poids, un poil hirsute, une prostration ou une légère perte de mobilité. Ils ne sont pas systématiques mais peuvent parfois entrainer la mort de l’animal.

Devenir

Les animaux ne pouvant pas être réutilisés pour d’autres projets ou procédures, ils seront euthanasiés sous anesthésie gazeuse à la fin de chaque procédure.

Remplacement

Pour avoir une vue d’ensemble des mécanismes mis en place par le parasite lors d’une infection et afin de tester son pouvoir pathogène, le remplacement des animaux est impossible. Même si la culture in vitro de trypanosomes existe, elle ne nous permet pas d’étudier le comportement d’un tel parasite dans le sang circulant. Le passage sur la souris est donc indispensable pour réaliser ces études.

Réduction

Le modèle souris/trypanosomes est déjà utilisé dans de nombreuses études avec un niveau de reproductibilité suffisant pour réduire le nombre d’animaux tout en permettant l’exploitation statistique des données générées.

Raffinement

Les animaux feront l’objet d’une observation quotidienne afin d’évaluer un changement de comportement anormal. Ils seront maintenus en groupe d’au moins 2 individus et des mesures d’enrichissement du milieu telles que l’utilisation de tunnels et/ou carrés de cellulose destinées à améliorer les conditions de vie et à réduire le stress des souris seront mises en place. De plus, un tapis chauffant sera utilisé lors des anesthésies afin de compenser la chute de température interne des animaux

Choix des espèces

La souris est une espèce classiquement utilisée pour la multiplication des souches de trypanosomes. Elles développent une infection comprise entre 3 et 10 jours post-infection en moyenne en fonction de la souche parasitaire utilisée. Les souris en expérimentation sont des souris adultes âgées de 8 à 12 semaines pour permettre une récolte suffisante de parasites à partir de prélèvements sanguins.

13 530 animaux non-humains vont être utilisés, en très grande majorité tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré : 6 400 souris, 4 800 rats, 1 250 macaques à longue queue, 540 chiens et 540 cochons. Ils reçoivent des administrations répétées de candidats médicaments, des prélèvements de sang, de moelle osseuse ou de liquide cérébrospinal et, pour les non-rongeurs, la pose chirurgicale d'implants de télémétrie, dans des études de toxicité réglementaire. Le porteur indique qu'une analyse terminale des organes est le plus souvent nécessaire, seuls 10 à 15 % des non-rongeurs pouvant être réutilisés et certains proposés à l'adoption. Il justifie l'emploi de deux espèces, dont un non-rongeur, par les lignes directrices internationales et l'extrapolation à l'humain, aucune méthode ne remplaçant selon lui l'"organisme entier".

Objectifs

Un médicament n’est mis sur le marché pour les patients qu’après plusieurs années de Recherche et Développement. Les études précliniques, en amont des essais chez l’Homme, sont indispensables à l’évaluation de l’innocuité et de l’efficacité d’un candidat médicament. Celles visant à qualifier la sécurité du candidat médicament sont réalisées en accord avec la réglementation qui impose cette évaluation sur deux espèces mammifères, un rongeur (rats ou souris) et un non rongeur (chiens, mini-porcs ou primates non humains) (sauf cas particulier, par exemple pour les anticorps si une seule espèce est pertinente). L’objectif de ce projet est de réaliser des études de sécurité préclinique afin d’évaluer les potentiels effets indésirables des candidats médicaments. Pour cela, les procédures mises en œuvre concernent le suivi clinique et biologique des animaux suite à l’administration unique ou répétée du candidat testé, par des voies, la plupart du temps, identiques à celles prévues chez l’Homme, avec des prélèvements de fluides biologiques (par exemple : sang, urines) permettant de mieux caractériser les effets observés. Cela permettra d’avoir des informations essentielles (choix de dose et index thérapeutique) avant la première administration chez l’Homme ou bien de stopper le développement d’un candidat ayant un profil non satisfaisant en termes de sécurité. Ce projet fait partie des prérequis indispensables à la mise sur le marché de nouveaux médicaments et de nouvelles stratégies thérapeutiques pour l’Homme, efficaces, plus sûrs et mieux tolérés et participe aux progrès scientifiques et biomédicaux.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif d’apporter les éléments d’information nécessaires aux prérequis toxicologiques en évaluant la sécurité et les effets indésirables des candidats médicaments chez l’animal vivant. Les avantages attendus sont la protection de l’Homme, d’une part en stoppant le développement de composés pour lesquels la toxicité est rédhibitoire et/ou innocuité insuffisante et d’autre part en fournissant les informations essentielles avant les administrations en clinique (par exemple calcul des index thérapeutiques, caractérisations des effets secondaires attendus, biomarqueurs).

Procédures

Les animaux vigiles seront concernés par l’administration unique ou répétée (quotidienne ou hebdomadaire) du candidat médicament, possibles par différentes voies (le plus souvent intra-veineuse ou orale), au cours de l’étude sur une durée maximale de 2 mois. Des prélèvements de sang ou autres fluides biologiques, associés à une contrainte légère de quelques minutes, seront nécessaires pour évaluer différents paramètres (par exemple hématologie, biochimie, immunologie) ; leur fréquence et leur volume sont conformes aux recommandations éthiques en vigueur et sont réalisés sous anesthésie/analgésie (entre 15 et 30 minutes) quand ils sont invasifs (par exemple moëlle osseuse, liquide cérébrospinal). Des mesures comme par exemple, la température corporelle (avec puce électronique), le poids (2 fois par semaine) sont réalisées en fonction de l’objectif de l’étude. Plus rarement, une procédure chirurgicale pourra être pratiquée chez les non-rongeurs afin de mettre en place un implant vasculaire ou de télémétrie pour mesurer par exemple les ECG et la pression artérielle (durée d’intervention sous anesthésie générale-analgésie d’environ 2 heures).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables seront limités à une contrainte modérée. L’administration du composé lui-même peut provoquer une baisse d’activité, une perte de poids, des modifications de la température corporelle par exemple. Les nuisances liées à la procédure (contention, administration, prélèvements de fluides ou tissus biologiques, etc.) se traduisent par un stress, une douleur de courte durée. La mise en place d’implants vasculaires par chirurgie provoquera une contrainte de courte durée (douleur légère, baisse d’appétit par exemple).

Devenir

Ce type d’étude nécessite le plus souvent une analyse anatomo-pathologique terminale pour évaluer les atteintes sur les organes et tissus. C’est seulement lorsque les objectifs de l’étude ne nécessitent pas cette analyse que certains animaux non-rongeurs pourront être ré-utilisés après approbation du vétérinaire. L’estimation de ce nombre d’animaux est d’environ 10-15%. Certains de ces animaux pourront être proposés à l’adoption via des associations et des structures d’accueil spécifiques et en accord avec les autorités compétentes.

Remplacement

Le projet est réalisé sur animal vivant car il n’existe aujourd’hui aucun modèle in vitro mimant la complexité des interactions d’un organisme entier et les effets possibles d’un candidat médicament sur celui-ci. Il n’existe pas de méthode substitutive pour remplacer l’ensemble des études menées pour l’évaluation des risques en sécurité préclinique. Cependant, l’utilisation de méthodes in silico (modélisation informatique) et in vitro (par exemple organ-on-chip) mimant la structure et la fonction d’un organe (par exemple : foie, cœur, rein) permet un premier criblage des futurs candidats ou de mieux caractériser l’atteinte de telle ou telle fonction.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe et le nombre de groupes sont définis sur des bases scientifiques (données bibliographiques et historiques, lignes directrices internationales et internes), et/ou avec l’apport des biostatistiques afin d'avoir un effectif minimum mais statistiquement exploitable pour pouvoir interpréter les éventuels effets adverses. Les tests statistiques utilisables sont dépendants des paramètres étudiés, et peuvent être par exemple, une analyse de variance, un test de tendance. La mise en place d’études combinant l’acquisition et l’analyse de paramètres de sécurité, pharmacodynamie et pharmacocinétique permet de réduire le nombre d’animaux utilisés. De plus, l’utilisation d’animaux contrôles n’est pas systématique et est soumis à réflexion en fonction des objectifs de l’étude. Enfin, lorsque les objectifs d’étude le permettent et en accord avec le Vétérinaire clinicien, certains animaux peuvent être réutilisés, ce qui participe à diminuer le nombre total d’animaux utilisés.

Raffinement

Ce projet fait l’objet d’une démarche qualité rigoureuse avec la réalisation des études par du personnel formé et compétent, le respect des impératifs éthiques tels que les modalités d’administration et de prélèvements réalisés sous anesthésie-analgésie pour les plus invasifs, l’hébergement et l’enrichissement du milieu spécifique pour chaque espèce étudiée. Pour certains gestes techniques, une phase de désensibilisation/habituation est faite en amont de l’étude pour diminuer le stress de l’animal. L’administration est associée à une récompense physique (caresses, félicitations avec la voix) et/ou alimentaire. Les interventions chirurgicales sont réalisées en condition maximale d’asepsie et avec l’utilisation d’une analgésie multimodale. Le suivi clinique, au moins quotidien des animaux, permet la détection précoce de toute douleur, inconfort ou détresse et la mise en application de critères d’arrêt anticipés supervisée par le Directeur d’étude, le Vétérinaire clinicien et la Structure en charge du Bien-Etre Animal, afin que les animaux ne subissent pas plus qu’une contrainte modérée.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce est défini par : -les lignes directrices internationales (ICH) définissant que les études de Toxicologie Générale doivent être conduites à la fois chez le rongeur (rat, souris, génétiquement modifiés ou non) et chez le non rongeur (chien, mini-porc ou primate non humain) -les données scientifiques telles que la cible thérapeutique visée, le véhicule envisagé et les données disponibles (pharmacocinétique, métabolisme et de toxicologie). L’espèce utilisée doit être pertinente et est essentiellement fonction de la similitude du profil métabolique et des effets biologiques attendus chez l’Homme, afin de permettre l’extrapolation des données acquises à l’espèce humaine. Le choix de l’espèce non rongeur peut dépendre également de la modalité thérapeutique (par exemple, les primates non humains pour les biologiques). Les animaux utilisés sont des animaux sevrés, juvéniles ou adultes, pour répondre aux exigences de la réglementation internationale et aux spécificités découlant des différents programmes de recherche.

108 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent une mutation qui reproduit le syndrome de Stormorken et subissent des sections répétées du bout de la queue pour mesurer le temps de saignement, ainsi que des prélèvements sanguins à la veine cave, pour comprendre le phénotype hémorragique de la maladie. Le porteur précise que la lignée développe un déficit musculaire et hématologique mortel vers 32 semaines, mais fixe les procédures avant 20 semaines. Il qualifie le modèle murin d'"irremplaçable" au motif que l'hémostase ne serait pas modélisable in vitro.

Objectifs

Les plaquettes sont des acteurs essentiels du maintien de l’intégrité vasculaire. Elles sont les premiers éléments cellulaires à intervenir dans l’arrêt du saignement lors d’une blessure vasculaire en participant à la formation d’un thrombus, ceci constituant l’hémostase physiologique dite primaire. Des problèmes de saignements plus ou moins graves peuvent être dus à des défauts de production et de fonctions plaquettaire. La mutation gain de fonction de la protéine STIM1 R304W/+est associée à une anomalie de l'homeostasie calcique intra-cellulaire dont les conséquences sont une modification de la production et de la fonctionalité des plaquettes. Notre étude vise à décrypter les mécanismes moléculaires et cellulaires permettant de comprendre le phénotype hémorragique dû à cette mutation de STIM1.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'un point de vue fondamental de caractériser les mécanismes moléculaires et cellulaires du role de STIM1 dans la production et la fonction plaquettaire. D'un point de vue clinique, ce projet permettra de comprendre l'évolution de la maladie hémorragique chez l'homme.

Procédures

Une coupure (de 3 secondes) de 3 mm du bout de la queue de la souris anesthésiée par injection IP (intra-péritonéale) est réalisée. Le temps d'arrêt de saignement (évalué à 50μl maximum de sang avant l’arrêt du saignement) sera évalué jusqu’à 20 minutes maximum. 10 jours après, un prélèvement sanguin est réalisé au niveau de la veine cave inférieure après anesthésie par injection IP . La prise de sang dure 1-2 minutes et un volume de sang de 800 à 1000 μl est prélevé. La souris est anesthésiée par anesthésie gazeuse et injectée en IP avec un anti-douleur pour un prélèvement sanguin à la queue (environ 30μl, durée de 1 minute) suite à une coupure de 1 mm (de 3 secondes). Nous réalisons ensuite une injection IP du composé d’intérêt inoffensif et non irritant. Six prélèvements sanguins à la queue (environ 30μl, durée de 1 minute), suite à une coupure de 1 mm (durée de 3 secondes) est réalisé après anesthésie gazeuse et injection d’un anti-douleur sur une durée de 280h. 10 jours après, un prélèvement sanguin est réalisé comme décrit plus haut. Une injection d’un composé inoffensif et non-irritant est réalisée en intra-veineux pendant 10 secondes sur souris anesthésiée par anesthésie gazeuse. 1 heure après l’injection, puis toutes les 24 heures pendant 4 jours, un prélèvement sanguin à la queue (environ 30μl, durée de 1 minute) par coupure de 1 mm (durée de 3 secondes), est réalisé sur l’animal sous anesthésie gazeuse et injecté en intra-péritonéal avec un anti-douleur. 10 jours après, un prélèvement sanguin est réalisé comme décrit plus haut.

Impact sur les animaux

Le modèle murin génétiquement modifié STIM1 R304W/+ qui mime la pathologie humaine présente un déficit musculaire et hématologique qui entraine la mort à partir de 32 semaines de vie. Cependant toutes les procédures expérimentales seront réalisées avant 20 semaines. Pour les procédures expérimentales sur animaux vivants, les composés injectés ne sont pas irritables ou/et délétères (anesthésiques, anti-douleurs et anticorps). Les produits injectés ont déjà été utilisés par différents laboratoires, dont le nôtre, et n'ont montré aucun effet indésirable. Ces injections n'induisent qu'une légère douleur au moment de la piqûre et un stress qui ne durent que 5 à 10 secondes.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort car toutes les procédures nécessitent des prélèvements de sang et/ou d'organes.

Remplacement

Le recours au modèle murin est irremplaçable pour le déroulement de ce projet pour deux raisons majeures : (i) la complexicité des mécanismes mis en jeu dans un contexte physiopathologique intégré d’hémostase et thrombose non modélisable par des approches in vitro et (ii) l'utilisation de modèles murins génétiquement modifiés.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit au maximum : en suivant des protocoles expérimentaux déjà établis dans le laboratoire, en tenant compte d’expériences déjà réalisées dans l’équipe qui nous ont montré que nous pouvons obtenir des résultats statistiquement corrects en faisant des groupes de 12 souris pour chaque procédure réalisée. Nous nous limiterons aux seules expériences considérées comme absolument indispensables en évitant la répétition d’études antérieures déjà réalisées et/ou publiées et en fonction des résultats obtenus au cours des différentes procédures expérimentales. Nous obtiendrons dans un premier temps des résultats préliminaires sur 1 lot de 4 animaux nous permettant de définir s'il peut exister des différences statistiquement quantifiables entre les différents groupes, qui si elles existent, seront statistiquement affinées avec des groupes de 12 souris par procédure. L'approche statistique permettra d'analyser les différences obtenues entre groupes.

Raffinement

Les souris ont un accès illimité à la nourriture et boisson avec du papier sopalin, du carton et/ou des cubes de bois dans la cage. Une observation quotidienne des souris est réalisée par les zootechniciens ou les responsables du projet en terme de comportement général (prostration, activité anormale, isolement) et d'apparence (poils hérissés, plaies/blessures, amaigrissement anormal). Toutes les personnes impliquées dans ce projet (zootechniciens et les responsables de projet) sont formées et qualifiées au respect des conditions du bien-etre animal et diplômées en expérimentation animale. Toutes les procédures expérimentales se font sur souris anesthésiées et analgésiées sauf pour les injections intrapéritonéales qui sont des gestes rapides de moins de 10 secondes sur animaux vigiles. Un contrôle permanent de l'état d'anesthésie des souris sera réalisé par les expérimentateurs tout au long de la procédure. Tout au long des procédures, les animaux seront surveillés par les zootechniciens et les expérimentateurs. En cas de blessure, l'animal sera isolé et la blessure sera nettoyée 2 fois par jour pour favoriser une cicatrisation propre. Une mise à mort rapide de la naissance à la mort ou lors d'une procédure expérimentale sera effectuée conformément à une grille de score définie.

Choix des espèces

Nous utilisons des souris car les mécanismes d’hémostase et thrombose sont transposables à l'homme mais aussi car nous disposons de modèles murins génétiquement modifiés invalidés pour nos protéines d'intérêt car il n'existe pas à ce jour d'inhibiteurs pharmacologiques. Stade adulte de 8 à 20 semaines car de part et d'autre de cette fourchette d'âge les réponses fonctionelles en hémostase et thrombose peuvent être modifiées.

1 344 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des distensions colorectales par ballonnet répétées et, dans cet établissement, des séances d'imagerie IRMf pour mesurer la réponse cérébrale à la distension, dans un modèle de stress reproduisant l'hypersensibilité viscérale du syndrome de l'intestin irritable. Le porteur signale que la distension peut provoquer une diarrhée et parfois une perforation du colon. Il conclut, après des essais sur organoïdes humains, que le recours à l'animal reste "incontournable" au motif que la nociception mobiliserait l'"organisme entier".

Objectifs

La douleur viscérale chronique atteignant le tractus intestinal est communément retrouvée chez les patients SII (atteints de syndrome de l’intestin irritable). Comprendre les mécanismes de régulation de la nociception (douleur) est indispensable au développement de nouvelles cibles thérapeutiques pour soulager la douleur nociceptive. A ce jour, il a été mis en évidence le rôle de médiateurs présents au niveau du tissu intestinal modulant l’hyperexcitabilité des entéro-neurones et responsables de douleur nociceptive. Comprendre comment ces médiateurs sont modulés au niveau de la barrière intestinale est essentiel pour palier l’hypersensibilité viscérale. Le stress est un facteur important prédisposant à une hypersensibilité viscérale, incluant chez les patients SII. Notre projet vise (1) à évaluer l’effet du stress sur la production et l’activation de médiateurs d'intérêt au niveau de l’intestin et de leur contribution au développement d’une hypersensibilité viscérale ; et (2) à moduler leur activité par l’utilisation de molécules pharmacologiques afin de valider de nouvelles cibles thérapeutiques pour la douleur viscérale. Un modèle rat est choisi dans cette étude car c’est le modèle animal de référence pour étudier le stress psychologique et ses effets, notamment sur la douleur viscérale. Ce projet se déroulera dans trois établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de tester de nouvelles molécules pharmacologiques afin de valider de nouvelles cibles thérapeutiques contre la douleur viscérale

Procédures

Dans l'EU 1/3 et 3/3: Un minimum de 3-4 séries de distensions colorectales sera réalisé (2-3 séries de distensions «basales» et 1 série post traitement) par animal et espacées de minimum 3 jours pour les basales. Si les séries de distensions colorectales «basales» (sans traitement) présentent une variabilité importante, nous pourrons décider d’augmenter leur nombre. Nous pourrons aussi décider d’évaluer la reproductibilité des séries de distensions colorectales au cours du temps (sans traitement) sur le même animal ainsi que l’effet de la distension sur les paramètres protéolytiques (mesurés dans les lavages coliques et selles). Ainsi, au maximum, nous pourrons faire jusqu’à 6 séries de distensions colorectales par animal (la durée d'une série de distensions est de 1h15 et inclue 30 min d'habituation au ballon, c'est à dire que le ballon n'est pas gonflé). Des administrations de molécules pourront être effectuées (par voie intrapéritonéale, intra colique, orale, sous cutanée) avant la dernière série de distensions colorectales. Administrations intrapéritonéales et intra coliques de molécules (2 par animaux). Lavages colique (maximum 3 par rat). Dans l'EU 2/3: Nous pourrons évaluer la réponse du système nerveux central (cerveau) en réponse à la distension colorectale par imagerie IRMf (30 min-1h par animal)

Impact sur les animaux

Le modèle de stress n'induit pas de douleur spontanée mais une hypersensibilité viscérale lors de la distension colorectale, ainsi qu’une diarrhée dès 15 min post traitement. La motilité et la perméabilité intestinales sont modifiées dès 15 min, mais elles sont toutes deux restaurées entre 1h à 2h post-traitement. La distension colorectale ne cause pas de dommages tissulaires et donc peut être reproduite sur les animaux au cours du temps. Cependant, un effet indésirable suite à la distension peut être une perforation du colon mis en évidence par la présence de sang sur le ballonnet et/ou au niveau anal.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à la fin de chaque procédure car des prélèvements de tissus et d'organes doivent être réalisés

Remplacement

La douleur chronique intestinale, dont souffrent les patients atteints de syndrome de l'intestin irritable (SII), peut affecter fortement leur condition de vie. Cependant, les causes de cette douleur chronique sont encore mal comprises, notamment si c'est la perception de la douleur en centrale qui est altérée, et/ou bien si c'est la sensibilisation des neurones en périphérique et/ou en central qui est perturbée. Comprendre les mécanismes de régulation de la nociception est ainsi indispensable au développement de nouvelles cibles thérapeutiques pour soulager la douleur nociceptive chronique. In vitro, il est possible d’étudier des échantillons coliques provenant de patients SII (biopsies, selles, organoïdes en culture...), nous avons par exemple montré dans des études préliminaires que le traitement d’organoïdes intestinaux par des hormones de stress modifiait la balance protéolytique. Suite à la preuve de concept in vitro d’un effet des hormones de stress sur les médiateurs d’intérêt au niveau de l’intestin (techniques de culture d’organoïdes intestinaux), l'expérimentation animale est nécessaire pour valider ces résultats, c’est a dire pour évaluer la conséquence de l’altération de ces facteurs sur la douleur viscérale (en condition de stimulation nociceptive c'est à dire par exemple en réponse à la distension colorectale). L’étude des mécanismes de nociception requiert une réaction intégrée de l'organisme entier impossible à reproduire in vitro dans son intégralité. Ainsi, ces limitations rendent incontournables le recours à l'expérimentation animale afin de valider de nouvelles cibles thérapeutiques pour les douleurs viscérales.

Réduction

La technique de mesure de la douleur utilisée ici peut être reproduite sur un même animal au cours du temps et peut être couplée à l’utilisation d’autres méthodes de suivi clinique non-invasives (suivi de poids, consistance des selles …) ce qui permet d’observer et de suivre au cours du temps un seul animal, (par opposition à d’autres méthodes d’évaluation de la douleur viscérale comme par exemple l’implantation d’électrodes au niveau des muscles abdominaux par chirurgie) permettant ainsi de réduire sensiblement le nombre d’animaux. De plus, les résultats de distension obtenus peuvent être utilisés pour comparer plusieurs groupes entre eux (exemple: groupe contrôle versus traité) ainsi que pour comparer le même animal au cours du temps (exemple: série de distensions avant traitement versus série de distensions après traitement). Cependant, il existe de la variabilité de la réponse à la distension au sein du même animal au cours du temps et entre les animaux entre eux. Cette variabilité peut être associée notamment au stress dû à la distension, ainsi, pour réduire cette variabilité au maximum, nous habituons les animaux avant la première série de distensions et nous reproduisons les distensions au sein du même animal plusieurs fois afin de réduire le stress et donc la variabilité intra et inter-individus et en conséquence le nombre d’animaux requis pour une étude. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux et/ou d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale.

Raffinement

Afin de suivre la directive européenne 2010/63/UE, un enrichissement sera rajouté aux animaux. A savoir, des tunnels et des carrés de coton pur ou du papier absorbant permettant aux animaux de faire une nidation. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux et/ou d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale. Par exemple nous avons mis en place une période d’habituation des animaux pendant 1h durant les 3 jours précédant la première série de distensions (habituation au manipulateur et habituation aux tubes de contention) afin de réduire le stress. Durant toute la période d’expérimentation, l’état général des animaux sera observé au minimum une fois par semaine en plus de la surveillance quotidienne réalisée par les zootechniciens. Pour chaque procédure des points limites ont été définis pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal et l'animal sera euthanasié s’il présente un de ces points limites d’arrêt de la procédure. De plus, les personnes responsables du projet et expérimentateurs ont été formées à l’utilisation des animaux à des fins scientifiques ; et en particulier aux techniques spécifiquement utilisées ici (distension colorectale, injections intra coliques). L’apprentissage et la maitrise des gestes techniques sont reportés dans les livrets de compétences des personnes concernées. Transport de moins de 50 km. Nous nous assurerons que les animaux sont protégés en permanence des intempéries, des rayons du soleil, des températures extrêmes (climatisation du véhicule 19-21 degrés), conduite souple, limitation au bruit

Choix des espèces

Le rat est un modèle communément utilisé dans les études de stress psychologique et de mesure de douleur viscérale, il a ete choisi par rapport a une publication de reference du modele cortagine Les rats seront ages d'au moins 7 semaines car nous souhaitons utiliser des animaux adultes et matures et pesant minimum 200g.