Rongeurs
Recherche de l’existence d’un endothelium hémogénique chez la souris adulte
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
394 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour rechercher l'existence de cellules productrices de sang dans l'aorte adulte. Une partie est irradiée, ce qui provoque une aplasie médullaire et une immunosuppression, puis greffée avec de la moelle et soumise à des injections répétées, les animaux dont le greffon échoue étant tués par dislocation cervicale. Lorsque la maladie du sang apparaît vers six mois, le porteur prévoit un prélèvement sanguin maximal auquel les souris ne peuvent survivre, suivi de la mise à mort. Il indique que des essais in vitro sur cellules humaines n'ont pas reproduit le phénomène et affirme que "seules des expériences chez l'animal" le permettront.
Objectifs
A l'âge adulte, les cellules sanguines sont produites dans la moelle osseuse, au cours du processus appelé « hématopoièse ». Les cellules souches hématopoïétiques sont donc un réservoir de cellules sanguines et pouvoir contrôler leur nombre ou leur fonction pourrait permettre des avancées thérapeutiques pour les greffes notamment. Il est actuellement établi que les cellules souches hématopoïétiques présentes à l'âge adulte ont été produites très tôt, pendant un laps de temps très court, au cours de la vie embryonnaire ; de façon étonnante, les cellules qui produisent les cellule souches hématopoïétiques sont des cellules de la paroi de l'aorte, appelées cellules endothéliales "hémogéniques". Il semble que ces cellules endothéliales hémogéniques n’existent pas uniquement chez le jeune embryon mais aussi chez le jeune animal. Cependant, à l'heure actuelle, aucune équipe n'a rapporté l'existence de telles cellules à l'âge adulte. Ces dernières années, notre équipe a étudié le rôle des cellules endothéliales adultes dans la formation de caillots sanguins. Nous nous sommes notamment intéressés aux cellules endothéliales mutées pour la protéine d'intéret. Cette protéïne activatrice de la mutation est très fréquemment retrouvée dans des maladies hématologiques, les néoplasies myéloprolifératives; nous avons créé deux modèles de souris au sein desquels, théoriquement, uniquement les cellules endothéliales adultes portent la mutation. Nous avons eu la surprise d'observer que certaines de ces souris développaient une maladie du sang, avec des cellules souches hématopoïétiques avec la présence de cette protéïne. Ces résultats suggèrent donc qu'il existerait, dans ces modèles murins, des cellules endothéliales hémogéniques. Notre projet de recherche vise à démontrer formellement l’existence de cellules endothéliales hémogéniques dans ces souris adultes. Si nous confirmons la présence de cellules endothéliales hémogéniques avec cette protéïne dans ces souris, nous chercherons à les isoler et les caractériser (marqueurs, profil d'expression génique).
Bénéfices attendus
La recherche sur les cellules souches hématopoïétiques est très active car non seulement elle est utile pour mieux comprendre (et traiter) des maladies hématologiques comme les leucémies, mais elle est aussi très utile pour envisager la production de cellules sanguines matures, qui pourraient servir pour des transfusions et ainsi s’affranchir des besoins réguliers en dons du sang (avec les risques inhérents aux transfusions sanguines). Mieux comprendre d’où viennent les cellules souches hématopoïétiques est donc un enjeu scientifique majeur, comme en attestent les fréquentes publications dans des journaux renommés. De nombreux efforts ont été faits ces dernières années pour tenter d’amplifier les cellules souches, sans qu’elles ne se différencient (car une fois qu’elles se différencient, elles perdent leur capacité à produire toutes les lignées sanguines et ne s’auto-renouvellent plus). L’avènement des IPS (Induced Pluripotent Stem cell) a susicté des espoirs pour arriver à reprogrammer des cellules matures en IPS et les faire ensuite se différencier en cellules souches hématopoïétiques. Mais malgré des efforts colossaux, aucun laboratoire n’a réussi à obtenir, à partir des IPS, de réelles cellules souches hématopoïétiques. Il n’y a donc à l’heure actuelle, aucune stratégie disponible pour produire de nouvelles cellules souches hématopoïétiques adultes. Ici, nous avons pour objectif de mettre en évidence des cellules endothéliales adultes, capables de fabriquer de nouvelles cellules souches hématopoïétiques. Les cellules souches hématopoïétiques étant un réservoir de cellules sanguines, pouvoir contrôler leur nombre ou leur fonction pourrait permettre des avancées thérapeutiques pour les greffes notamment.
Procédures
Lot 1 : 6 souris donneuses avec injection intrapéritonéale 1/jour pendant 2 x 5 jours (10jours), soit 10 interventions d'une durée de 20s par souris, plus 40 souris receveuses avec 1 seule injection intraveineuse (durée de l'intervention 1min30 par souris). Lot 2 : 6 souris donneuses avec injection intrapéritonéale 1/jour pendant 5 jours soit 5 interventions d'une durée de 20s par souris, plus 6 donneuses avec administration par gavage en une seule dose (durée de l'intervention 20s par souris), plus 80 souris receveuses avec 1 seule injection intraveineuse (durée de l'intervention 20s par souris). Lot 3 : 40 souris receveuses avec injection intrapéritonéale 1/jour pendant 5 jours soit 5 interventions d'une durée de 20s par souris, plus une seule injection intraveineuse (durée de l'intervention 1min30 par souris). Lot 4 : 40 souris receveuses avec injection intrapéritonéale 1/jour pendant 5 jours soit 5 interventions d'une durée de 20s par souris, plus une seule injection intraveineuse (durée de l'intervention 1min30 par souris). Lot 5 : 40 souris receveuses avec injection intrapéritonéale 1/jour pendant 2 x 5 jours (10jours), soit 10 interventions d'une durée de 20s par souris, plus 1 seule injection intraveineuse (durée de l'intervention 1min30 par souris). Lot 6 : 40 souris receveuses avec injection intrapéritonéale 1/jour pendant 2 x 5 jours (10jours), soit 10 interventions d'une durée de 20s par souris, plus une seule injection intraveineuse (durée de l'intervention 1min30 par souris). Lot 7 : 20 souris receveuses avec une seule injection intraveineuse (durée de l'intervention 1min30 par souris). Lot 8 : 20 souris avec injection intrapéritonéale 1/jour pendant 5 jours soit 5 interventions d'une durée de 20s par souris, plus une seule injection intraveineuse (durée de l'intervention 1min30 par souris). Lot 9 : 20 souris avec injection intrapéritonéale 1/jour pendant 5 jours soit 5 interventions d'une durée de 20s par souris, plus une seule injection intraveineuse (durée de l'intervention 1min30 par souris). Lot 10 : 10 souris avec une seule injection intraveineuse (durée de l'intervention 1min30 par souris).
Impact sur les animaux
L’aplasie médullaire et l’immunosuppression induites par l’irradiation constituent des effets dommageables sur l’animal. Nous resterons donc très vigilent les jours qui suivent l'irradaition. 24h après, les souris receveuses recevront en IV des cellules de moelle de souris donneuses. Pour les souris dont le greffon prendra bien, nous observerons dans la première semaine une perte de poids ne dépassant pas les 10%. Dans la deuxième semaine ces souris retrouveront un poids normal puis poursuivront leurs croissances pour le restant de l’étude. Pour les souris dont le greffon ne prendra pas, nous observerons une perte de poids d’environ 10% dans la première semaine qui se poursuivra dans la deuxième. Ces animaux seront alors mise à mort par dislocation cervicale.
Devenir
Lorsque que la maladie hématologique apparaitra vers 6 mois, un maximum de sang sera prélevé sur les animaux pour analyses. Les animaux ne pouvant survivre à un tel prélèvement, ils seront ensuite tous mis à mort.
Remplacement
Nous avons réalisé des études in vitro, à partir de cellules endothéliales humaines (HUVEC) exprimant la mutation. Nous n’avons pas observé de phénotype hémogénique dans ces cellules, ni d’expression de facteurs de transcription laissant penser qu’elles devenaient hémogéniques. Ces résultats ne sont pas surprenants car il était peu probable que Ia seule présence que la mutation dans n’importe quelle cellule endothéliale la rende hémogénique. Les HUVEC sont des cellules endothéliales provenant de cordon ombilical et donc pourtant assez jeunes et les plus « proches » possibles des cellules endothéliales embryonnaires. Il est probable que ce phénotype hémogénique ne soit conféré qu’à de très rares cellules endothéliales. Seules des experiences chez l’animal, permettant, l’expression de la mutation dans toutes les cellules endothéliales, nous permettra de voir quelle sous population de cellules endothéliales portant cette mutation est devenue hémogénique.
Réduction
Le nombre maximum d’animaux nécessaire à cette étude a été calculé à 394. 20 animaux dans chaque groupe expérimental et par expérience seront utilisés afin d'obtenir un résultat statistique cohérent. Les analyses statistiques des résultats seront réalisées avec le test adéquats. Ce nombre peut paraitre elevé, mais est necessaire compte tenu du fait que nous cherchons à greffer des cellules souches qui sont très rares dans les moelles qui servent de greffon. Ainsi, si nous voulons avoir des résultats scientifiquement valides, reproductibles et qui nous permettent d’estimer une fréquence de cellules souches, nous avons besoin de 20 animaux par lot.
Raffinement
L'hébergement des animaux permet de reduire le stress et l'inconfort : animalerie agrée, personnels formés, cages de 6 animaux maximum en portoirs ventilés avec libre accès à l'eau et la nourriture ainsi qu'un environnement enrichi avec igloo cortonné de carré de cellulose. Les animaux recevront systématiquement un antalgique 30 min avant l'anesthésie lors des administrations intraveineuse et des prélèvements sanguins et seront placé sur un tapis chauffant. Les anesthésies seront réalisées à l'aide d'un poste automatisé distrubuant un gaz anestésiant. Les animaux seront tout d'abord placés dans la boite pour induire l'anesthésie jusqu'à un endormissement profond puis seront transférés sous masque individuel pour réaliser administrations et prélèvements. Pour éviter les risques d'infection suite à l'irradiation, des précautions seront mise en place. Tout d'abord, nous transporterons (3 minutes) la boite d'irradiation avec les souris dans un sac isotherme décontaminé. De retour au laboratoire, elles seront transférées dans leurs cages d’hébergements pour portoirs ventilés qui auront été préalablement stérilisées par autoclavage avec litière et enrichissement. Les biberons et l’eau de boisson seront également stérilisés par autoclavage. Nous distribuerons à ces souris un aliment stérilisé par le fournisseur. Ces transferts seront réalisés sous une hotte perméttant de maintenir la stérilité de l’environnement des souris. Notre animalerie est de statut conventionnel, une attention toute particulaire sera apportée à ces cages. Durant la première semaine après la greffe une visite quotidienne sera nécessaire pour évaluer le bien-être des animaux à l'aide d'une grille d'Observations/Actions qui nous permettra d'identifier les points limites et d'apporter dans les plus brefs délais la mesure adaptée à l'animal.
Choix des espèces
La souris a été choisie comme modèle d'étude en raison de l'existence de souris transgéniques dont les gènes d'intérêt ont été mutés. Nous disposons dans notre laboratoire de différentes lignées de souris transgéniques mutées au niveau d'une ou plusieurs lignées de cellules hématopoïétiques. C'est un modèle de mammifère à sang chaud dont l'organisation structurale du réseau vasculaire et sanguin à de forte ressemblance avec l'homme. Pour toutes ces manip, les souris auront entre 16 et 18 semaines, qui est l'âge de l'apparition de la maladie. Les C57Bl6 seront entre 10 et 12 semaines, âge adulte de la souris où la formule sanguine et les composants du sang sont bien équilibrés et stables.
Biodisponibilité polyphénolique après gavage chez la rate gestante ou allaitante
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
72 rates gestantes ou allaitantes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un cocktail de polyphénols par gavage puis subissent quatre prélèvements de lait sous anesthésie, afin de mesurer le passage des composés dans le sang, le cerveau, le foie et les urines. L'objectif, présenté comme une étape vers un complément alimentaire destiné à la femme enceinte, prolonge des travaux antérieurs sur la neuroprotection de ratons soumis à une hypoxie-ischémie. Le porteur affirme que l'évaluation du métabolisme "nécessite une approche intégrative" sans remplacement disponible.
Objectifs
Les précédents travaux de l'équipe ont montré un rôle neuroprotecteur d'une supplémentation maternelle en polyphénols, dans le cadre de l'hypoxie-ischémie néonatale. L'administration orale de polyphénols chez des femelles Wistar gestantes ou allaitantes a induit une neuroprotection des ratons ayant subi une hypoxie-ischémie néonatale (modèle Rice-Vannucci). L'effet préventif des polyphénols s'est illustré par (i) une diminution des volumes lésionnels cérébraux, mesurée par IRM ainsi que par une préservation des aptitudes sensori-motrices des ratons mise en évidence par des tests comportementaux. Les doses utilisées étaient nutritionnelles, rendant impossible le suivi des polyphénols chez les mères de même que chez les ratons (doses inférieures au seuil de détectabilité). Afin d'attribuer les effets bénéfiques à un composé phénolique ou à un de ses métabolites et d'évaluer la capacité des polyphénols/métabolites à franchir les différentes barrières biologiques (placenta, barrière hémato-encéphalique), l'objectif du projet sera de mesurer dans différents tissus (urines, sang, cerveau, foie), les concentrations de polyphénols ainsi que de leurs métabolites, chez les mères ainsi que chez les ratons.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont une compréhension de la biodisponibilité et du métabolisme d'un cocktail naturel de polyphénols (extraits à partir du fruit de la passion), tant chez la rate gestante allaitante que chez les ratons (fœtus et nouveau-nés). Cela pourrait faire la lumière sur les effets bioactifs de ces molécules, ainsi que sur certains mécanismes d’action potentiels. Ce travail pourra participer à la mise sur le marché d'un complément alimentaire à destination de la femme enceinte.
Procédures
Les animaux seront soumis à : - un gavage. Fréquence : 1 fois. Durée : quelques secondes – prélèvements de lait. Fréquence : 4 fois. Durée : 10 min. - prélèvement d'organes après mise à mort. Fréquence : 1 fois.
Impact sur les animaux
Le gavage nécessaire à l'administration du cocktail polyphénolique pourra entraîner un stress des femelles. Les prélèvements de lait pourraient entraîner un inconfort et un stress. Ces prélèvements seront réalisés sur des animaux anesthésiés. L'anesthésie pourrait entraîner un changement du rythme cardiaque et/ou respiratoire, mesurés grâce à un capteur placé sous l'animal.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin d'effectuer les prélèvements d'organes nécessaires aux dosages permettant de quantifier les polyphénols ainsi que leurs métabolites.
Remplacement
Le but final du projet est d'évaluer la biodisponibilité d'un cocktail polyphénolique ayant montré, in vivo, une neuroprotection d'une supplémentation maternelle dans le cadre d'une hypoxie-ischémie néonatale. L'évaluation du devenir du cocktail et de son métabolisme nécessite une approche intégrative, il n'existe pas de remplacement disponible à notre modèle expérimental.
Réduction
Les dosages polyphénoliques seront réalisés sur un nombre minimum d'animaux permettant de réduire les erreurs standard à la moyenne intergroupe sous les 5%..
Raffinement
Pour le gavage, les rates seront conditionnées à la contention un à deux jours avant la procédure. Le gavage est une procédure délicate, il sera réalisé par un expérimentateur expérimenté. Une canule à bout rond en plastique à usage unique sera utilisée afin de limiter les risques de blessure pour l'animal (perforation du tube digestif). Le volume administré, à température ambiante sera inférieur à 10 ml/kg. En l'absence de détresse respiratoire et de reflux, l'animal sera remis à sa cage. Dans l'heure qui suit, les signes cliniques de l’animal suite à l’exécution d’un gavage seront surveillés (détresse respiratoire, muqueuse pâle, isolement). Au niveau de l'hébergement, les animaux seront en cage (mère + portée), sur une litière de peuplier, caractérisée par un fort pouvoir absorbant et une granulométrie adaptée. L'hébergement sera enrichi avec un nid végétal, du coton et un tunnel en carton. Les animaux seront observés de façon journalière par le zootechnicien et/ou la personne en charge de l'expérimentation. Lors de ces observations, la capacité de l'animal à s'alimenter, le comportement et sa vivacité, la couleur de la peau ou l'état du pelage seront vérifiés. Un échange quotidien avec le zootechnicien et l'expérimentateur permettra une intervention et une prise de décision rapide en cas de souffrance constatée.
Choix des espèces
Le rat présente des avantages par rapport à la souris qui rendent le choix de l'espèce pertinent : la physiologie du rat est plus proche de celle de l'homme que ne l'est la physiologie de la souris. Ce point est important puisque ce projet devrait, en partie, mener au développement d'un complément alimentaire destiné à la femme enceinte. Les animaux seront utilisés aux stades de développement : - adulte, afin de définir la biodisponibilité chez les femelles gestantes ou allaitantes - fœtal, afin de définir la biodisponibilité chez les fœtus ainsi que la capacité des polyphénols et métabolites à traverser la barrière placentaire - nouveau-né, âgés de 8 jours, afin de définir la biodisponibilité chez les nouveau-nés et de déterminer la part de l'allaitement dans la neuroprotection.
Réponse au traitement et nouvelles thérapies contre l’infection par le VHD
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Pour chercher des marqueurs de réponse au bulevirtide et tester contre l'hépatite Delta l'upadacitinib, un médicament de l'arthrite rhumatoïde, 98 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent sous anesthésie une injection de cellules de foie humain dans la rate, puis sont infectées par les virus des hépatites B et Delta, traitées chaque jour par injection sous-cutanée ou gavage, et subissent une prise de sang toutes les deux semaines pendant 16 semaines. Chez environ 10 % d'entre elles, la greffe échoue et une insuffisance hépatique aiguë s'installe en deux à trois semaines, avec une perte de poids rapide, et les prises de sang peuvent entraîner inflammation et cécité. Le porteur évoque aussi une colonie de reproducteurs, où un couple sans portée depuis plus de trois mois est mis à mort, sans dire si ces souris entrent dans le total.
Objectifs
Le virus de l’hépatite Delta (VHD) est un virus satellite qui repose sur la présence du virus de l’hépatite B (VHB) pour sa multiplication. Les co-infections VHD-VHB représentent la forme la plus sévère des hépatites virales entraînant une accélération de la progression de la fibrose hépatique vers la cirrhose et le cancer du foie. Si certains traitements permettent aujourd’hui le contrôle de l’infection par le VHB, les traitements disponibles contre le VHD sont non satisfaisants, malgré le développement récent de nouvelles molécules. Notamment, le bulevirtide, inhibiteur d’entrée du virus dans les cellules, bénéficie d’une autorisation conditionnelle d’utilisation en Europe depuis 2020. Cependant, tous les patients ne répondent pas au traitement bulevirtide et les causes de cette variation entre patients est inconnue. De nouvelles stratégies de traitements contre le VHD et la compréhension de la réponse au traitement par bulevirtide sont indispensables. Dans ce contexte, nous avons récemment caractérisé l’activité anivirale d’une molécule utilisée dans le traitement contre l’arthrite rhumatoïde, l’upadacitinib, contre le VHD. Ce projet combine à la fois une analyse de la réponse au traitement par bulevirtide chez les souris co-infectées par le VHD et le VHB, à la recherche de marqueurs de la réponse au traitement, et le test in vivo de l’upadacitinib.
Bénéfices attendus
La thérapie antivirale de dernière génération pour l'infection par le VHD est le bulevirtide, qui conduit à une diminution significative de la charge virale dans les études cliniques chez 70% des patients. Cependant, aucun marqueur de réponse au traitement n'est disponible et des antiviraux plus efficaces sont nécessaires pour améliorer la durée de vie et la qualité de vie des patients infectés par le VHD. Cette étude vise à identifier des marqueurs pour la réponse au traitement par le bulevirtide et le risque de cancer. De plus, l'étude fournira une preuve de concept préclinique en utilisant une nouvelle molécule antivirale comme candidat médicament.
Procédures
Les animaux recevront tout d’abord une injection intraveineuse afin d’améliorer la prise de greffe. Cette injection est réalisée sur animaux anesthésiés ayant reçu une analgésie locale et prend moins d’une minute à être réalisée. Les animaux seront ensuite soumis à une petite chirurgie permettant la greffe de cellules de foie humain. L’injection de cellules de foie humain est réalisée dans la rate des animaux après anesthésie générale et analgésie. Cette chirurgie est réalisée en moins de 10 minutes. Un prélèvement de sang sous anesthésie générale et analgésie locale sera réalisé 3 mois après la greffe afin de nous assurer de la prise de greffe. Ce prélèvement prend moins d’une minute à être réalisé. L’infection par le VHB et le VHD sera réalisée par inoculation des virus par une injection unique dans le péritoine sur animaux vigils après désinfection à l’alcool de la zone à piquer. Cette injection prend moins d’une minute à être réalisée. Les traitements seront administrés de façon quotidienne par injection sous-cutanée après désinfection à l’alcool, ou par gavage oral sur animaux vigils. Injections et gavages oraux sont réalisés en moins d’une minute. Les animaux seront également soumis à un prélèvement de sang une fois toutes les 2 semaines pendant 16 semaines, soit un total de 8 prélèvements. Ces prélèvements sont réalisés sur animaux anesthésiés ayant reçu une analgésie locale et prennent moins d’une minute à être réalisés. Un prélèvement de sang terminal sera effectué en fin de protocole sous anesthésie générale, réalisé en 1 à 2 minutes.
Impact sur les animaux
Les souris chez lesquelles la prise de greffe sera infructueuse (environ 10% des animaux) vont développer une insuffisance hépatique aigüe en 2-3 semaines du fait de la mort des cellules du foie murin, qui se traduit par une perte de poids rapide. Les prélèvements sanguins peuvent entrainer inflammation et cécité. Les injections sous-cutanées peuvent entrainer l’apparition d’une inflammation et/ou d’une induration. Le gavage oral peut également entrainer une inflammation et des saignements/perforation de l’œsophage ou de l’estomac. Les traitements peuvent entrainer une augmentation temporaire de la concentration en acides biliaires dans le sang, qui est asymptomatique et sans conséquence sur la santé. Les traitements peuvent également être associés à une élévation de niveau des enzymes du foie dans le sang ainsi qu’à une augmentation des lipidiques et cholestérol dans le sang.
Devenir
Les animaux de la colonie de reproducteurs seront mis à mort lorsque la qualité de reproduction déclinera. Les 2 animaux d’un couple sont mis à mort si aucune portée n’est obtenue depuis plus de 3 mois. Les animaux greffés chez qui la prise de greffe n’est pas efficace seront mis à mort car ils ne pourront pas être utilisés pour d’autre procédures. Les animaux inoculés avec les virus de l’hépatite B et D ainsi que les animaux contrôles non infectés sont mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever le foie et le sang qui nous permettront de réaliser les différentes analyses nécessaires à ce projet.
Remplacement
Afin de remplacer l’utilisation d’animaux, une majorité d’expériences sont menées en amont sur des lignées cellulaires et sur des cellules du foie humain afin de nous assurer de la réelle nécessité de poursuivre sur ces modèles animaux greffés. Il est toutefois nécessaire d’utiliser des animaux pour ce projet car les lignées cellulaires sont dérivées de cellules cancéreuses et présentent de nombreuses modifications de leur ADN par rapport à des cellules normales du foie. De plus l’utilisation de cellules du foie issues de patients nécessiteraient un nombre très élevé de cellules fraichement isolées, les cellules congelées étant très difficiles à infecter in vitro. L’utilisation de biopsies humaines n’est également pas envisageable car les patients diagnostiqués avec une infection VHD sont très rares, et leur condition de conservation et la quantité de tissu n’est pas compatible avec nos besoins permettant d’analyser les modifications de l’ADN. Dès lors, notre modèle de souris au foie humanisé est une alternative indispensable à l’identification de nouvelles voies dérégulées par les virus et potentiellement cibles thérapeutiques.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, seul le nombre requis de souris seront greffées pour ce projet. Nous avons déterminé au préalable le nombre d’animaux nécessaire à ce projet sur la base de 2 critères principaux à savoir le taux de repeuplement du foie par les hépatocytes humains greffés, déterminés par dosage de l’albumine humaine sérique, et les charges virales VHB et VHD qui peuvent être très variables. Le nombre d'animaux par groupe a été déterminé grâce aux données d’une étude précédente sur des souris humanisées. Nous avons donc estimé qu’un nombre de 8 souris par groupe est le minimum requis afin d’obtenir des résultats intra et inter-groupes comparables et interprétables.
Raffinement
Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont, l’environnement des animaux est enrichi avec des tube de coton pour nidifier et des briques de tremble pour ronger, les animaux sont maintenus en groupe de 3 minimum afin d’éviter tout stress de l’animal isolé, les souris greffées auront un suivi quotidien adapté et tous les moyens nécessaires seront mis en œuvre pour éviter tout stress ou douleurs des procédures expérimentales (anesthésie, analgésie), des points limites adaptés et précoces ont été établis afin de soustraire les animaux à toute forme de souffrance inutile. Le nombre d’animaux inclus par groupe sera suffisant pour arriver à une conclusion claire et des résultats statistiquement fiables.
Choix des espèces
Seul le chimpanzé peut-être naturellement infecté, comme l’homme, par les virus VHB et VHD. L’utilisation du chimpanzé étant interdite depuis la nouvelle directive européenne relative à l’utilisation d’animaux en expérimentation animale, l’étude de ces virus in vivo est donc restreinte. Seuls les modèles de souris chimériques au foie humanisé peuvent maintenant être utilisés. De plus ces souris au foie humanisé permettent d’étudier précisément l’impact des maladies du foie et virales sur les cellules du foie humain et de tester des approches thérapeutiques pertinentes pour les patients. Les animaux seront utilisés à un âge adulte d’environ 8 semaines pour la greffe, afin de faciliter l’intervention, et à un âge d’environ 20 semaines au moment de l’inoculation des virus, la prise de greffe optimale étant à 3 mois post-greffe.
Etude d’un traitement pharmacologique pour le traitement du lymphome B
- Recherche fondamentale
- Oncologie
170 souris immunodéficientes NSG vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, pour tester un traitement du lymphome B en collaboration avec un partenaire industriel. Elles subissent une chirurgie abdominale de vingt à trente minutes pour greffer des cellules humaines dans la rate, puis des injections et un gavage cinq fois par semaine, avant des prélèvements de sang. Le porteur indique attendre des douleurs post-opératoires et le développement du lymphome. Il affirme qu'il n'existe "pas de modèle alternatif" intégrant la diffusion du produit et que l'efficacité préclinique chez la souris est un "pré-requis indispensable".
Objectifs
Ce projet de recherche a pour but de mieux traiter les lymphomes B, des cancers du sang qui se forment à partir de lymphocytes B qui sont les cellules luttant contre les infections. Malgré des progrès thérapeutiques récents, certains types de lymphome B avec des mutations génétiques particulières sont mortels pour encore 40% des patients. Ce projet, mené en collaboration avec un partenaire industriel, a pour objectif d'étudier un traitement pharmacologique anticancéreux ciblant les tumeurs présentant des mutations pour un gène impliqué dans ce cancer. Actuellement, des données préliminaires sur des cellules humaines de lymphome B ont montré une sensibilité accrue des cellules à la molécule étudiée en cas d'inactivation du gène étudiée. Le traitement en question est une molécule impliquée dans la mort cellulaire. Ainsi, pour l'étude chez la souris, le but est de réaliser des greffes de cellules humaines dans la rate sur des souris immunodéficientes. Les souris seront ensuite traitées avec le médicament, en combinaison ou non avec une deuxième molécule agissant également sur la mort cellulaire, pour potentiellement renforcer l'efficacité du traitement. Ainsi, ce projet s'inscrit dans le développement de la médecine personnalisée pour le cancer visant à adapter les traitements médicaux en fonction des caractéristiques individuelles de chaque patient, notamment leurs mutations génétiques.
Bénéfices attendus
Ce projet est indispensable pour passer de la preuve scientifique établie sur des modèles cellulaires à la réalisation d'un essai clinique de la molécule chez les patients ayant un lymphome B muté pour le gène étudié. Si le traitement s'avère efficace, il pourrait augmenter considérablement la survie des patients ayant actuellement un pronostic très dévaforable. Ainsi, pour consolider les données scientifiques, il est nécessaire de passer par un modèle préclinique chez la souris avant de lancer un essai clinique chez l'homme.
Procédures
Les soumis seront soumise saux interventions suivantes: une procédure de chirurgie sous anesthésie gazeuse (durée: 20 à 30min) pour inciser l'abdomen et avoir accès à la rate. Puis, un million de cellules humaines seront injectées dans la rate, ensuite l'abdomen sera recousue. Les souris seront ensuite attribuées à des groupes de traitement pour être traitées ou non avec 2 traitements pharmacologiques anticancéreux en combinaison ou seul. Le premier traitement sera injecté dans l'abdomen de la souris (10 secondes) une fois par semaine et le deuxième traitement sera administré par voie orale (10 secondes) 5 fois par semaine. Enfin, deux prélèvements de sang par souris seront réalisés après l'administration des traitements.
Impact sur les animaux
Pour l’ensemble des souris, un stress lié à la contention des animaux est attendu (pesée, prise de température, manipulation dans la cage). Plus spécifiquement, des nuisances post-opératoires sont attendues pour les souris en raison de la chirurgie sous anesthésie. Cette chirurgie est nécessaire à l’implantation de cellules humaines du fait de l’incision de la cavité abdominale lors des injections de cellules dans la rate. Après cette injection, des douleurs sont attendues en raison du développement du lymphome ou du vieillissement de la souris. Enfin, une douleur brève et circonscrite est attendue pour l'ensemble des souris qui recevront une injection de la molécule dans l'abdomenn (10s maximum pour une injection). Pour la deuxième molécule, la nuisance se fera au moment de l'administration par voie orale avec une sonde de gavage (5 à 10s maximum). Concernant les effets indésirables des deux molécules, il n'y a pas de toxicité particulière attendue chez la souris susceptible d'entraîner une souffrance avec les doses utilisées. Pour un des deux traitements, une toxicité sanguine légère est décrite chez la souris qui se traduit par une diminution des globules rouges et des lymphocytes.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. En effet, les souris NSG présentent un phénotype dommageable susceptible d'entraîner une souffrance à long terme pour l'élevage. Ensuite, les souris qui subirot la chirurgie et les traitements seront mises à mort dès que l'information scientifique sera obtenue pour éviter des souffrances inutiles.
Remplacement
Il n'existe pas encore de modèles alternatifs susceptibles de tester à la fois l'effet de la molécule étudiée dans ce projet directement sur les tumeurs tout en intégrant l'étude de la diffusion du produit dans un organisme. De plus, la réalisation d'études d'efficacité préclinique cherz la souris est actuellement un pré-requis indispensable avant de mener une étude clinique chez l'humain.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés dans nos expériences, les mesures suivantes seront prises : 1/ Partage des échantillons cellulaires post-mortem de souris au sein de l'équipe, de sorte qu'un même échantillon puisse servir à plusieurs projets, évitant ainsi d'utiliser plusieurs souris pour des expériences similaires. 2/ Réalisation d'analyse statistique pour comparer les groupes de souris et déterminer les différences qualitatives et quantitatives. Cela aide à éviter de répéter des expériences inutilement, ce qui réduira le besoin d'animaux. 3/ Optimisation de l'utilisation du matériel prélevé sur les tumeurs en le conservant de manière à ce qu'il puisse être utilisé plusieurs fois. Cela inclut la congélation des cellules provenant de différents organes, l'extraction de l'ADN et la préparation des organes pour des analyses. Cette approche évitera la duplication des expériences. 4/ Evaluation précise de la viabilité des échantillons avant injection chez la souris pour éviter d'injecter des souris inutilement.
Raffinement
Les souris immunodéficientes ne présentent pas de signes de souffrance particuliers puisque leur phénotype dommageable ne pourra pas s'exprimer lorsqu'elles sont élevées en conditions stériles. Les animaux qui subiront la chirurgie d'implantation de cellules humaines dans la rate (sous analgésique et anesthésie) seront laissées sur plaque chauffante à la fin de l'intervention et surveillées jusqu'au réveil complet puis replacées dans leur cage. Un hydratant occulaire aura été administré pour éviter un desséchement occulaire pendant l'anesthésie. De l'eau gélifiée et des croquettes humidifiées seront mises à disposition dans la cage des animaux pendant les 72h post-opératoires. Ces animaux seront observés 3 fois par semaine jusqu’à cicatrisation complète de la suture afin de mettre en évidence toute souffrance de l’animal. Si une infection cutanée est constatée, la plaie sera désinfectée deux fois par jour avec une solution antisceptique jusqu’à disparition des signes d’infection. Pour réduire au minimum la douleur associée au developpement d'un lymphome, des points limites assez prédictifs pour limiter les souffrances seront mise en place. La mise à mort de l'animal sera pratiquée lorsque l'un des points limites suivants sera atteint : mise en évidence d'une hépatosplénomégalie (gonflement de la rate ou du foie) par palpation de l'abdomen des souris, réduction de l’activité (prostration), poil hérissé et dos vouté. Les souris seront donc surveillées 3 fois par semaine jusqu'à l'âge de 1 an avec une prise de poids et de température hebdomadaire afin de mettre en évidence l'un des points limites qui entraînera alors la mise à mort de la souris. Dès qu'une perte de poids sera constatée par rapport au maximum mesuré dans les semaines précédentes, il sera ajouté de la gelée et des croquettes mouillées dans la cage. Si une perte de poids aggravée est constatée, la souris sera immédiatement mise à mort. Pour les souris ayant une baisse légère de température elles seront placées dans une enceinte chauffante pendant 48h. Si la température de l’animal ne remonte pas, il devra être mis à mort. Au delà de 1 an, les souris seront mises à mort si aucune prise tumorale n'est observée.
Choix des espèces
La souris est une espèce animale de choix pour étudier l'impact d'un traitement pharmacologique sur des greffes de cellules humaines. En effet, chez la souris, nous avons accès à des modèles très immunodéficients tels que les souris dites NSG présentant des déficits complets en cellules immunitaires. Ce modèle représente donc un modèle de choix pour reconstituer des pathologies humaines telles que des lymphomes par greffe de cellules humaines en évitant ainsi un rejet de greffe. Cette immunodéficience permet en outre l'apparition de métastases ce qui permet d'observer l'action d'un traitement pharmacologique sur la dissémination cellulaire. Les souris seront utilisées à partir de 8 semaines, ce qui correspond à l'âge adulte de ces animaux. La maturité des animaux est indispensable pour étudier la pharmacocinétique (c'est-à-dire le devenir du médicament dans l'organisme) des produits chez la souris. En effet, le métabolisme est aussi influencé (absoprtion, diffusion, élimination du médicament) par la maturité de l'animal.
Exploration du tandem CD44/E-sélectine : Implications dans la chimiorésistance et la migration des cellules de Leucémies Aiguës Lymphoblastiques T et B.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, pour étudier la résistance des leucémies aiguës lymphoblastiques à la chimiothérapie. Elles reçoivent une greffe de cellules leucémiques de patients, jusqu'à seize injections de chimiothérapie et un prélèvement de moelle osseuse au niveau du fémur, geste que le porteur décrit comme le plus invasif du protocole. L'expansion leucémique provoque une perte de poids, une augmentation de la taille de la rate et parfois une prostration avant la mise à mort. Le porteur reconnaît qu'une partie du projet est réalisable in vitro mais affirme que la migration des cellules "ne peut être jugée" que sur l'animal.
Objectifs
Les leucémies aiguës lymphoblastiques sont des cancers du sang dont le pronostic diffère grandement entre les patients jeunes et âgés. En effet, l’intensification de la chimiothérapie menée ces dernières années a permis d’améliorer la survie et la rémission des patients (superieur à 85% pour les enfants ; seulement 50% chez les adultes). L’une des explications de ces différences de survie propose que des facteurs physiologiques produits par le corps influencent la résistance des cellules leucémiques aux traitements. Si les cellules leucémiques se propagent dans la quasi-totalité des différents organes du patient, le tissu d’expansion de prédilection reste malgré tout la moelle osseuse, retrouvée dans les os. Or, la moelle osseuse est un environnement qui évolue grandement au cours du vieillissement. Il est par exemple pauvre en adipocytes (cellules graisseuses) à la naissance et devient très riche en ces cellules avec l’âge. Dans les os riches en adipocytes, les cellules leucémiques deviennent « dormantes » ce qui s’accompagne d’une résistance aux agents utilisés en chimiothérapie. Des travaux récents montrent que, dans ce contexte, les cellules leucémiques « dormantes » présentent l’expression forte d’une protéine de surface dont la fonction majeure est d’être un récepteur à une protéine exprimée à la surface des cellules endothéliales, qui tapissent les vaisseaux sanguins. Différents arguments laissent penser que cette liaison à la protéine endothéliale est utilisée par les cellules leucémiques pour échapper à la chimiothérapie. On parle alors de « niche chimiorésistante ». Notre projet a pour vocation de mieux comprendre ce mécanisme propice à la chimiorésistance des cellules leucémiques et de proposer l’inhibition de cette liaison comme piste thérapeutique. Le repositionnement d’une molécule utilisée en essai clinique sur une autre pathologie sanguine, qui empêche toutes les interactions avec la protéine des cellules endothéliales, semble être très pertinente dans notre contexte. Nous proposons donc son association à la chimiothérapie conventionnelle pour déloger les cellules leucémiques de leur niche chimiorésistante.
Bénéfices attendus
La rechute des leucémies aiguës lymphoblastiques est un enjeu majeur dont il faut améliorer la prise en charge. À ce jour, quelques thérapies innovantes commencent à émerger mais leurs limites apparaissent déjà puisque quelques cas de résistance sont relatés. L’ultime alternative proposée aux patients est la transplantation de cellules souches hématopoïétiques provenant d’un donneur compatible, qui est curative mais ne concerne qu’une partie des patients, principalement des patients jeunes. Les avancées récentes de la recherche permettent de proposer d’autres pistes thérapeutiques aux patients. Malgré tout, ces dernières présentent des limites, ainsi une meilleure compréhension de la chimiorésistance est nécessaire pour proposer de nouveaux traitements aux patients pour lesquels la réponse aux traitements conventionnels n’est pas pleinement satisfaisante. Récemment, une entreprise a développé une molécule spécifiquement dans le but d’empêcher l’interaction du couple ligand/récepteur qui nous intéresse. Cette molécule est actuellement utilisée dans un essai clinique pour son rôle pertinent permettant d’empêcher la formation de caillot sanguin dans la drépanocytose, une maladie génétique héréditaire touchant les globules rouges. La validation de l’intérêt d’inhiber cette interaction dans le cas des leucémies aiguës lymphoblastiques pourrait rendre éligible ce type de cancer du sang à un essai clinique étendu. De façon plus large, les traitements actuels proposés aux patients sont majoritairement développés pour cibler la cellule cancéreuse. Mais l’ensemble des connaissances démontre que la cellule cancéreuse communique avec son environnement cellulaire et qu’aujourd’hui, la thérapie innovante se doit d’intégrer cette vision d’ensemble. C’est exactement l’objectif de notre étude.
Procédures
Les animaux seront soumis au maximum à : - Une injection de cellules leucémiques de patients. Cet acte, qui ne dure que quelques secondes, est effectué sous sédation. Cette injection est un acte unique dans toutes les procédures. - Selon les procédures, les souris subiront ensuite une injection d’agents utilisés en chimiothérapie conventionnelle selon le même protocole que pour l’injection de cellules leucémiques. Cet acte effectué sous sédation ne dure que quelques secondes. - Selon les procédures, les souris subiront également l’injection (durée : 5 secondes) dans la cavité abdominale, d’autres drogues utilisées en chimiothérapie conventionnelle. La molécule à tester sera quant à elle injectée en sous-cutanée (durée de l’acte : 5 secondes). L’application d’un anesthésique local précèdera l’ensemble des ces injections qui seront toutes réalisées sur des souris vigiles. Selon les procédures, le nombre d’injections va de 1 à 16. - Enfin un prélèvement de moelle osseuse sera effectué sous sédation et analgésie. Pendant l’acte, les souris sont maintenues sur un tapis chauffant afin de réguler leur température. Ce prélèvement est effectué une seule fois dans l’ensemble des procédures. L’injection en sous-cutanée de l’analgésique est effectuée juste avant la sédation. Cet acte prend 1 à 2 minutes.
Impact sur les animaux
Notre expérience dans la réalisation de protocoles similaires dans un modèle murin, nous permet de nous attendre à des nuisances modérées sur les animaux utilisés dans ce projet. Plusieurs points sont à retenir : - Puisque l’injection des cellules leucémiques et/ou de certaines drogues utilisées en chimiothérapie est effectuée sous sédation, le stress provoqué à l’animal est principalement lié à la contention avant anesthésie. C’est pourquoi nous mettons en place une autre technique pour le transfert des animaux de leur cage vers la cage de sédation, sans contention par l’intermédiaire d’un tube de transfert dans lequel viennent se loger les animaux. Malgré tout, une douleur peut être engendrée par la piqure au site d’injection, comme c'est le cas pour les patients traités par certaines chimiothérapies. - L’expansion leucémique des cellules de patients dans le modèle murin provoque à long terme une perte de poids de l’animal ainsi qu’une augmentation de la taille de la rate. En point ultime d’expérience, nous notons parfois une prostration/manque de mobilité de l’animal. - La chimiothérapie utilisée provoque également une perte de poids liée à l’ensemble des effets adverses des agents utilisés. - Enfin, le prélèvement de moelle osseuse est le geste le plus invasif effectué dans nos procédures. Ce geste se fait au niveau des fémurs, la mise en place d’un traitement analgésique est associé.
Devenir
L’ensemble des animaux utilisés dans nos procédures seront euthanasiés soit dès la fin des traitements soit dès apparition de signes de souffrance au cours de la courbe de survie. Notre étude porte sur l’importance de la liaison d’un couple récepteur/ligand dans la moelle osseuse des cellules leucémiques chimiorésistantes. L’euthanasie est donc nécessaire pour récupérer les cellules leucémiques retrouvées dans les différentes moelles osseuses. C’est pourquoi, lors de l’euthanasie des animaux, plusieurs os (fémurs, vertèbres thoraciques et vertèbres caudales) seront prélevés pour en extraire les cellules leucémiques et/ou pour effectuer des coupes histologiques permettant d’analyser finement la localisation des cellules leucémiques dans la moelle osseuse.
Remplacement
L’objectif de notre projet étant d’étudier les communications des cellules leucémiques avec leur environnement, en particulier dans un contexte de résistance aux traitements, aucun modèle ne représentant que partiellement un organisme ne pourra mimer l’intégralité et la complexité des interactions. Aujourd’hui, la culture in vitro de cellules leucémiques avec un autre partenaire cellulaire est maîtrisée. Cependant, ce système ne peut pas être étendu à la co-culture avec plus de deux ou trois partenaires cellulaires, et ne représente donc pas la diversité des intervenants cellulaires de la moelle osseuse. Malgré l’émergence des mini organes sur puce (« organ on chip »), il n’existe aucun modèle assez complexe pour mimer l’intégralité des interactions que nous évoquons dans notre étude. C’est pour l’ensemble de ces raisons que le modèle animal ne peut être remplacé par un modèle simplifié in vitro concernant la partie du projet qui évalue la pertinence de l’ajout d’un inhibiteur de la liaison récepteur/ligand à la chimiothérapie conventionnelle. La seconde partie du projet qui évalue la diminution de fonction du récepteur d’intérêt pour la liaison à son ligand sera menée partiellement in vitro. En effet, il est possible de modifier la fonction du récepteur des cellules leucémiques puis d’évaluer la capacité de liaison à son ligand in vitro. Malgré cette preuve de concept in vitro, l’utilisation du modèle animal ne pourra être intégralement remplacée puisque l’objectif ultime de cet axe est d’évaluer le rôle de cette interaction récepteur/ligand dans la capacité des cellules leucémiques à coloniser différent organes. Ainsi, seul le modèle animal permettra de juger de la migration des cellules leucémiques de la circulation sanguine vers la moelle osseuse.
Réduction
Afin de développer le modèle préclinique le plus pertinent possible, nous tiendrons compte de la diversité de la maladie retrouvée chez les patients et nous utiliserons trois patients représentatifs, sélectionnés parmi les centaines de profils de patients disponibles au laboratoire. Les résultats obtenus à partir de notre modèle devraient ainsi être transposables à un nombre important de patients, limitant ainsi le nombre de modèles précliniques à mettre au point. De plus, il a été montré que les cellules leucémiques extraites des fémurs et des vertèbres thoraciques sont strictement identiques. Nous prélèverons donc les cellules leucémiques de ces deux localisations sur chaque animal, pour réduire le nombre d’animaux nécessaires à l’obtention de nos résultats.
Raffinement
Dans l’ensemble des procédures associées à cette demande, les animaux sont hébergés avec maximum six individus par cage. Selon les voies d’injections, elles seront pratiquées sous sédation ou non. L’application d’un anesthésique local sera utilisé pour limiter la douleur associée à la piqure. Les prélèvements de moelle osseuse seront effectués sous sédation associée à un analgésique pour limiter la douleur provoquée par le geste. Une seconde injection d’analgésique pourra-t-être administrée si les animaux présentent des signes de douleur après la durée d’action (4 heures) de la première dose. Les animaux seront surveillées quotidiennement pour détecter tout mal-être éventuel (prostration, pelage hirsute et tout autre signe comportemental). L’apparition de ces critères, notés selon une grille remplie par les animaliers ainsi que les expérimentateurs, permettra une prise de décision rapide quant à la mise en place de la stratégie à adopter pour arrêter la souffrance. Les points limites de chaque procédure ont été déterminés.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris immunodéficientes adultes que nous utilisons au laboratoire depuis de longues années, pour leur incapacité à rejeter la greffe de cellules d’une espèce étrangère, ici de cellules humaines. Outre l’absence de rejet, ce modèle est pertinent pour l’étude des cancers du sang puisqu’il est capable de récapituler l’expansion leucémique de patients dans un modèle vivant. Les cellules de patients interagissent alors avec l’ensemble des constituants cellulaires et moléculaires de l’animal au même titre qu’une cellule leucémique interagit avec son environnement chez le patient. L’utilisation d’un tel modèle permet également d’adresser une question majeure qui est celle de la diversité inter-individus pour une même maladie. En effet, le terme générique de « leucémie » intègre un ensemble de sous-groupes de leucémies. Au sein de chaque sous-groupe, il est également admis qu’il existe une multitude de sous-sous-groupes de la même pathologie. Ainsi, pour une même maladie, deux patients peuvent avoir une réponse totalement différente aux traitements. Contrairement aux modèles strictement murins dans lesquels se développent une leucémie murine, le modèle de transplantation de cellules humaines chez des souris immunodéficientes permet d’aborder la diversité inter-patients et ainsi devenir un modèle préclinique de référence. L’utilisation de souris immunodéficientes adultes permet l’étude de la maladie humaine dans un environnement murin bien défini/décrit et compris dans la littérature.
Criblage de candidats médicaments en terme d’efficacité antitumorale sur modèles de souris immunodéficientes porteuses de xénogreffes tumorales d’origine humaine.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
4 644 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour cribler des candidats médicaments anticancéreux de type anticorps-médicament. Elles reçoivent une greffe de tumeur humaine sous la peau sur animal vigile, puis des injections intraveineuses répétées, et sont mises à mort à l'atteinte de points limites ou en fin d'étude. Le porteur précise que les souris non entrées en protocole seront "réformées" pour l'entraînement aux gestes techniques avant d'être tuées. Il affirme que les preuves in vitro sont déjà faites et qu'"aucune alternative" ne peut se substituer au modèle souris pour une greffe de tumeur humaine.
Objectifs
Ce projet dans son ensemble vise à développer de nouvelle thérapie ciblée à visée thérapeutique humaine de type conjugué-drogue-anticorps (ADC). Ces thérapies de rupture permettent de cibler spécifiquement les cancers habituellement de très mauvais pronostiques (poumon, tète et cou, colorectal, utérus, ovaire, pancréas…), tout en minimisant les effets secondaires et représente l’un des meilleurs espoirs depuis l’avènement des immunothérapies anticancéreuses. Ces composés ayant une efficacité comparable entre humains/souris, les résultats d’efficacité permettront de désigner le meilleur candidat ainsi que sa dose minimale efficace et les meilleures fréquences d’administration. Ce projet est articulé en trois procédures consécutives et dépendantes les unes des autres : La Procédure-1 permettra de déterminer les meilleurs modèles de tumeurs humaines greffées dans des souris démunies de système immunitaire par rapport à des cibles thérapeutiques choisies (CDX). La procédure-2 consiste en une étude Pilote d’efficacité antitumorale en utilisant un/des médicament/s de référence. La Procédure-3 permettra de déterminer quels sont les meilleurs candidats médicaments, ainsi que leur dose et fréquences d’injections optimales en utilisant le/les modèles sélectionnés (CDX) dans les Procédures 1 et 2.
Bénéfices attendus
Ce projet dans son ensemble vise à développer de nouvelle thérapie ciblée à visée thérapeutique humaine de type conjugué-drogue-anticorps (ADC). Ces thérapies de rupture permettent de cibler spécifiquement les cancers habituellement de très mauvais pronostiques (poumon, tète et cou, colorectal, utérus, ovaire, pancréas…), tout en minimisant les effets secondaires et représente l’un des meilleurs espoirs depuis l’avènement des immunothérapies anticancéreuses. Les données d’efficacité sont les données les plus importantes avec les données de tolérance afin de pouvoir choisir les candidat médicaments ayant la meilleur fenêtre thérapeutique (c'est à dire la meilleur efficacité pour le moins d'effets indésirables), chez les patients. ainsi, ces études permettront de définir quels seront les meilleurs candidats médicaments contre les cancers ciblés et de modéliser au mieux les doses et les fréquences à utiliser lors des premières études cliniques chez l’Homme. La première et la seconde procédure permettront de sélectionner et caractériser le/les meilleurs modèles tumoraux. La troisième procédure permettra de déterminer quels sont les meilleurs candidats médicaments, ainsi que leur dose et fréquences d’injections optimales (en vue d’une phase clinique chez l’Homme), en utilisant le/les modèles sélectionnés dans les procédures précédentes.
Procédures
# Après une semaine d'adaptation à l'environement, les souris seront identifiées: - Soit par poinçonnage auriculaire sur souris vigiles (2-3 minutes si moins de 100 souris). - Soit par puçage électronique (injection sous-cutanée sous-scapulaire du transpondeur), sous anesthésie gazeuse (4-6 minutes). # Greffe tumorale sur souris vigile en sous-cutané (2-3 minutes). # Les prises de mesure seront effectuées trois fois par semaine et quotidiennement en cas d'approche des points limites. # Traitement des animaux par les differents médicaments par voie intraveineuse sur souris vigiles (2-3 minutes). # Les animaux atteignant les points limites ou en fin d’expérience seront mis à mort.
Impact sur les animaux
# Les animaux subiront un stress durant plusieurs minutes (pendant et suivant l’acte) lors de la manipulation : change, pesée, contention et anesthésie. # Les animaux subiront une douleur de légère à modérée durant plusieurs secondes pendant l’acte lors : (1) de la numérotation sur animal vigile par poinçonnage auriculaire, (2) de la greffe tumorale sur animal vigile par injection sous-cutanée ainsi que lors (3) de l’injection par intraveineuse dans le veine de la queue sur souris vigiles des candidats médicaments. # Pour les groupes traités, une diminution de la croissance tumorale est attendue.
Devenir
Pour chacune des trois procédures: - Tous les animaux ayant atteint les points limites ou en fin d’étude seront euthanasiés. - De même, les souris non entrées en protocole seront réformés pour l’entrainement aux gestes techniques avant d’etre mises à mort. La SBEA assurera le suivi des animaux réformés afin de garantir les conditions d’utilisation en formation et la conformité avec le présent projet.
Remplacement
Les preuves de concept d’efficacité de ces candidats médicaments anticancéreux hors organisme vivant (dits in-vitro et ex-vivo), ont déjà été effectuées avec succès. A présent, seul un modèle physiologique complexe (organisme vivant) est nécessaire pour permettre de poser les bases d’une étude clinique afin d’obtenir des résultats représentatifs en terme de doses et de fréquences. De plus, les candidats médicaments étudiés dans ce projet étant cross-réactif (cible anticancéreuse comparables entre l’Homme et la Souris), aucune alternative ne peux se substituer à un modèle Souris.
Réduction
La procédure-1 et 2 permettent de mettre au point les modèles, de les caractériser au mieux et de diminuer les nombres d'animaux utilisés en procédure-3. Elles sont toutes deux effectuées sur un nombre limité d’animaux (sans toutefois mettre en péril l’interprétation des résultats). En effet, seul(s) le(s) modèle(s) ayant donné satisfaction lors des procédures 1 et 2 seront utilisés pour la procédure-3 avec un nombre d'animaux optimisé par rapport à chaque modèle. Par ailleurs dans les procédures 2 et 3, le fait de tester une dose en injection unique ou répétée une à deux fois en fonction des résultats obtenus au fil de l’eau, permet de diminuer drastiquement le nombre de groupes utilisés.
Raffinement
Les animaux, démunis de système immunitaire, seront hébergés par groupe sociaux de 4 à 5 dans des cages transparentes et aux dimensions adaptées avec un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum et un enrichissement de l’environnement (coton pour nidification, tunnels, bâtons à ronger), dans des conditions sanitaires permettant de ne pas etre infectées. Il est à noter que les enrichissements de type nid ou rouleaux en cartons seront proscris à partir de la greffe tumorale afin d'éviter toute plaie sur les tumeurs et seront compensés par une augmentation des quantités de balles de coton et de bâtons à ronger. Avant la mise en place du protocole les souris seront acclimatées (période de stabulation) pendant une période d’une semaine afin de limiter leur stress. Une surveillance comportementale et physiologique poussée des animaux ainsi que la définition d’une grille de score adaptée et suffisamment prédictive permettra d’anticiper et éviter au mieux toute souffrance animale. La surveillance des animaux sera quotidienne et les prises de mesure effectuées trois fois par semaine avec une analyse scorée des critères physiques et comportementaux, du poids corporel et du volume tumoral et de la qualité de la tumeur (homogénéité, permettant la mobilité de l’animal…). Le point limite du volume tumoral sera de 1500mm3. La nécrose ou la gêne à la mobilité due à la tumeur constitueront également des points limites. Un système de surveillance est mis en place au sein de l'EU pour le suivi des animaux nécessitant une surveillance accrue le week-end et les jours fériés. Les animaux inclus dans la grille de score mais n’atteignant pas les critères éthiques de mise à mort recevront des soins conservateurs adaptés (alimentation et abreuvement facilités, réchauffement, isolement...). Les souris atteignant les points limites ou en fin d’expérience seront mises à mort. Les souris non entrées en protocole seront réformées pour entraiment des gestes techniques avant d’être mises à mort. La SBEA assurera le suivi des animaux réformés afin de garantir les conditions d’utilisation en formation et la conformité avec le présent projet.
Choix des espèces
S’agissant d’analyses d’efficacité par voie intraveineuse, un organisme entier et vivant est nécessaire afin d’obtenir des résultats représentatifs. Afin d’étudier les effets de candidats médicaments sur des greffes de tumeurs humaines, , des animaux immunodéprimés (démunis de système immunitaire), sont nécessaires afin d’éviter tout rejet des cellules humaines par le système immunitaire. La souris est une espèce animale à la fois petite et parfaitement caractérisée pour ces études (avec des données permettant de transposer ces données chez l’Homme). En plus, les données de tolérances et de pharmacocinétique seront générées sur cette même espèce animale afin de déterminer au mieux la fenêtre thérapeutique de ces candidats médicaments. Enfin, les candidats médicaments étudiés dans ce projet étant cross-réactif entre la souris et l’humain (cibles exprimées de façon identique entre la Souris et l’Homme), aucune alternative ne peux se substituer à un modèle Souris. Les animaux immunodéprimés (démunis de système immunitaire), seront livrés entre 7 et 8 semaines de développement et inclus en expérience entre 8 et 9 semaines (après 7 jours d’acclimatation dans l’EU). A cet âge-là, les animaux sont adultes avec des organes matures permettant une allométrie pertinente par rapport aux thérapies médiées par des anticorps. Il est à noter que le phénotype « immunodéprimé » ne sera pas un phénotype dommageable dans nos condition d’hébergement et d’expérimentation (animalerie SPF) et expérimentation sous PSM (les souris ne pouront pas contracter d'infections).
Evaluation de candidats vaccins contre la fièvre hémorragique de Crimée-Congo dans le modèle de la souris IFNAR-/-
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
72 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, pour comparer cinq candidats vaccins contre la fièvre hémorragique de Crimée-Congo. Elles sont vaccinées puis infectées par le virus, les douze souris non vaccinées devant développer perte de poids, dos voussé, fourrure ébouriffée, faciès émacié et léthargie jusqu'à un point limite atteint en quatre à cinq jours. Trente-six animaux sont tués au pic de la maladie, les autres subissant des prélèvements sanguins rétro-orbitaux avant mise à mort. Le porteur affirme qu'il est "impossible" de tester in vitro le degré de protection d'un vaccin et que le recours à des "organismes entiers" reste "indispensable".
Objectifs
Le projet se réalise dans 2 établissements utilisateurs. L’objectif de ce projet est de développer un vaccin contre la fièvre hémorragique de Crimée-Congo (CCHF). Il s’agit ici de déterminer quels seront les meilleurs candidats vaccins contre le virus CCHF parmi ceux que nous avons développé au laboratoire. En effet, des constructions vaccinales ont été réalisées et produites en quantité injectables mais seule une expérimentation animale peut permettre de tester leur efficacité à protéger contre CCHF. Pour cela, des souris, qui ont déjà été validées dans un modèle d’infection par le virus CCHF seront vaccinées à l’aide d’une première dose de vaccin environ 2 mois avant infection et une dose de rappel un mois après la première injection. Les animaux seront ensuite infectés par le virus pour tester le niveau de protection conféré par les vaccins. Cinq candidats vaccins seront testés en comparaison avec un groupe de souris n’ayant reçu que le milieu de resuspension des candidats vaccins, qui ne confère aucune protection contre le virus CCHF. Cette expérimentation permettra non seulement de valider l’efficacité de nos candidats vaccins mais aussi de les comparer entre eux pour définir celui ou ceux qui peuvent être engagés plus avant dans leur développement.
Bénéfices attendus
L’aire de répartition du virus CCHF s’étend et atteint déjà l’Europe de l’Ouest. Cette progression est principalement liée à la circulation des tiques du genre Ixodidae qui sont vecteurs de ce virus. Le virus CCHF infecte les humains et peut provoquer une fièvre hémorragique dont le taux de mortalité atteint 40%. Les humains se contaminent soit par morsure de tique soit par contact avec des fluides contaminés d’animaux infectés. En effet, les animaux d’élevage (bovins, caprins…) s’infectent suite à des morsures de tiques et peuvent répliquer le virus et le transmettre même s’ils ne sont pas symptomatiques. Les éleveurs et les personnels d’abattoirs sont donc à risque accru de contracter la maladie. Ce virus représente donc un problème de santé publique contre lequel il faut se prémunir. Comme très souvent dans le cas des infections virales aigües, la vaccination constitue une prophylaxie efficace en absence de traitements antiviraux. A ce jour, aucun vaccin contre le virus CCHF n’est commercialisé. Notre projet met à l’étude des candidats vaccins pour lesquels la plateforme vaccinale a déjà été éprouvée et l’innocuité du vecteur testée. Dans le cadre de ce projet, nous avons produit plusieurs candidats vaccins contre le virus CCHF et la phase suivante pour déterminer leur efficacité est de démontrer leur capacité à induire une réponse immunitaire protectrice contre l’infection par ce virus. Parmi les cinq candidats vaccins qui seront testés au cours de la même expérimentation, et grâce aux échantillons biologiques collectés auprès des animaux vaccinés (ou non) et infectés, nous pourrons évaluer l’efficacité du vaccin, vérifier l’absence de persistance virale et mesurer la synthèse d’anticorps spécifiques du virus. L’utilisation des animaux pour cette phase de validation est donc justifiée au vu de l’impact potentiel sur l’Homme de ce virus et pour la mise en place d’une prophylaxie. L’analyse des résultats de ce protocole permettra de mieux comparer l’efficacité des différents vaccins (quels candidats vaccins permettent la survie de tous les animaux d’un même groupe) et d’évaluer leur immunogénicité (quels sont les antigènes qui promeuvent la meilleure protection contre le virus).
Procédures
Les animaux seront en expérimentation pour deux périodes successives dans deux animaleries distinctes pour une durée totale d’environ 3 mois. Animalerie 1 : Dans cette animalerie, après répartition en 6 groupes de 12 animaux (6 mâles + 6 femelles par groupe, 5 vaccins testés soit 1 vaccin différent pour chaque groupe et un groupe non vacciné), les 72 animaux subiront les interventions suivantes : - Identification au sein d’un même groupe par encoches au niveau des oreilles. - Quatre anesthésies, deux pour l’injection des vaccins (primo-vaccination + rappel) à un mois d’intervalle et deux pour des prélèvements sanguins pour analyse génétique. Chaque animal sera anesthésié pendant environ 10 à 15 minutes le temps d’être vaccinés ou prélevés. Chacun des gestes effectués sur les animaux dans l’animalerie A1 ne durera pas plus de 2 à 3 minutes. Animalerie 2 : La seconde période est celle de l’infection avec le virus pour évaluer l’efficacité de protection des vaccins testés. - Tous les animaux subiront une première anesthésie au cours de laquelle une puce leur sera implantée pour mesurer leur température corporelle et où ils seront infectés avec le virus. Cette anesthésie durera environ 15 à 20 minutes pour chaque animal. - A J4 post infection, c’est-à-dire au pic des symptômes de la maladie provoquée par le virus, 36 animaux seront anesthésiés puis mis à mort afin de prélever le maximum de sang ainsi que leurs organes. - A J10 post infection, les animaux survivants seront anesthésiés pour leur prélever du sang. Cette anesthésie durera environ 10 à 15 minutes pour chaque animal. - Enfin, tous les animaux survivants à la date fixée de fin de protocole seront anesthésiés avant mise à mort afin de prélever le maximum de sang ainsi que leurs organes pour analyses anatomopathologiques. Au cours de chaque anesthésie, les animaux seront pesés. Chacun des gestes effectués sur les animaux dans l’animalerie A2 ne durera pas plus de 4 à 5 minutes.
Impact sur les animaux
Dans l’EU1/2, peu d’effets indésirables sont à prévoir. Les animaux subiront quatre anesthésies au cours d’un protocole d’environ deux mois et demi au cours desquelles il sera procédé à deux injections de vaccins et deux prélèvements de sang. Les plateformes vaccinales testées dans ce protocole ont déjà été utilisées et n’ont pas causé d’effets secondaires chez les animaux à l’exception d’une fièvre modérée dans les heures suivant l’injection. Les nuisances attendues devraient donc être très faibles. La prise de sang peut causer des hématomes mais la faible fréquence de prélèvements devrait limiter l’impact sur les animaux. Dans l’EU2/2, tous les animaux (n=72) subiront une anesthésie au cours de laquelle ils seront implantés d’un puce télémétrique sous-cutanée ente les épaules et ensuite infectés avec un virus pathogène. Les animaux non-vaccinés (n=12) devraient manifester rapidement les signes cliniques de l’infection avec perte de poids, dos voussé, fourrure ébouriffée, faciès émacié et léthargie pour atteindre un score clinique limite ou un point limite en 4 à 5 jours environ. Les animaux vaccinés ne devraient pas présenter de signes cliniques durant cette même période. Après la mise à mort des animaux à J4 (n=36), les animaux survivants (n=30) seront anesthésiés et un prélèvement sanguin rétro-orbital sera pratiqué. Les nuisances associées à ces gestes seront les mêmes qu’en post-vaccination.
Devenir
Certains animaux seront mis à mort au cours de la procédure afin de comparer au pic de la maladie induite par le virus si les vaccins les ont bien protégés en comparant leurs paramètres virologiques et anatomopathologiques avec ceux du groupe contrôle. Tous les animaux survivants seront mis à mort à la fin de l’étude dans les locaux de l’animalerie 2. Les animaux ayant survécus à l’infection grâce aux vaccins devront être étudiés en détail à travers l’étude de leurs organes et de leur sang qui seront prélevés en fin de protocole afin de vérifier si le virus inoculé persiste ou non dans l’organisme des animaux vaccinés.
Remplacement
Il est impossible à l’heure actuelle de déterminer par des expérimentations in vitro le degré de protection que peut conférer une solution vaccinale et donc de conclure sur l’efficacité de celle-ci. Le recours à des organismes entiers reste indispensable pour éprouver les candidats vaccins.
Réduction
Dans ce projet, 6 groupes de 12 animaux seront constitué : 5 groupes reçoivent chacun un vaccin différent, le sixième groupe constituant le groupe contrôle. Après vaccination, tous les animaux sont infectés avec un virus qui provoque la létalité dans ce modèle de souris. Afin de mesurer la protection induite par les vaccins au cours de l’infection, la moitié de l’effectif de chaque groupe est mise à mort au pic de la maladie afin de collecter le maximum d’échantillons biologiques pour analyser qualitativement et quantitativement la protection par rapport aux animaux non vaccinés. La mise à mort de six animaux par groupe constitue un minimum nécessaire pour évaluer la reproductibilité des observations d’un animal à l’autre et réaliser des tests statistiques robustes de comparaison de groupes. La comparaison de la survie entre animaux vaccinés et non vaccinés est donc établie sur un effectif de 6 animaux dans chaque groupe ce qui garantit également une analyse statistique de qualité : courbes de survie et analyse comparative des données issues de l’analyse des prélèvements biologiques effectués sur les animaux au moment de la mise à mort. La réduction du nombre d’individus dans chaque groupe pourrait altérer de façon significative la qualité de l’analyse des données, compromettant ainsi l’ensemble de la procédure et l’intérêt du recours à cet effectif animal pour évaluer l’efficacité de ces vaccins.
Raffinement
EU1/2 Les animaux, du fait de leur immunodéficience, seront hébergés dans des conditions sanitaires strictes (SPF) avec des cages autoclavées avec nourriture et boisson stériles pour éviter tout risque de contamination microbienne indésirable. Chaque geste technique (injections, prélèvements) sera réalisé sous poste de sécurité microbiologique (PSM) et une désinfection avant et après de la zone à injecter/prélever sera réalisée par application de vétédine. Tous les gestes techniques (injections et prélèvements) sont réalisés sous anesthésie afin de protéger les expérimentateurs des risques liés à la manipulation d’OGM MOT de classe 2. Ces anesthésies permettront de diminuer la douleur qui aurait pu être provoquée par l’injection du vaccin ou le prélèvement sanguin. Après chaque anesthésie, les animaux peuvent présenter transitoirement une fatigue post-anesthésie et/ou un déshydratation transitoire. Un enrichissement de l’environnement, une réhydratation des animaux à l’aide de sérum physiologique par voie sous-cutanée, l’ajout de gel hydrique ainsi que de friandises peuvent être appliqués ainsi qu’un réchauffement si besoin. EU2/2 La réalisation des gestes techniques sous anesthésie (injections et prélèvements) permet de réduire grandement le stress des animaux et d’éviter des contentions longues. Le faible nombre de prélèvements effectués permet de réduire le nombre d’anesthésie et les effets associés (perte d’appétit, fatigue post-anesthésie). Malgré le confinement strict lié aux activités de l’EU 2/2, les conditions d’hébergement classiques sont maintenues. Des observations journalières seront réalisées afin d’évaluer l’état de chacun des animaux selon une matrice de score établie pour ce modèle et selon le virus utilisé et les signes cliniques attendus. En période de week-end avant challenge viral, un système de vidéosurveillance permettra de visualiser si les animaux ont toujours de la nourriture et de la boisson. À tout moment, en cas de doute sur l’état d’un ou plusieurs animaux, une entrée en zone sera programmée pour procéder à une observation des animaux et à une possible décision d’arrêter le protocole.
Choix des espèces
Il a été démontré qu'une ligné ede souris était susceptible à l’infection par le virus de la fièvre hémorragique de Crimée Congo (CCHF) et en reproduisait la physio pathogénèse observée chez l’Homme. Ce modèle de souris a également été utilisé dans le cadre de plusieurs essais vaccinaux contre le virus CCHF. Il s’agit donc d’un modèle adapté pour comparer les différents candidats vaccins et évaluer leur efficacité. Les animaux utilisés seront des adultes (à partir de 2 mois). Il est nécessaire que le développement de leur système immunitaire soit mature pour évaluer au mieux la réponse immune mise en place suite à la vaccination.
Étude du rôle des comorbidités liées au vieillissement dans la réparation post ischémique dans un modèle de souris d’accident vasculaire cérébral (2/2)
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
496 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après trois mois de régime gras destiné à induire un surpoids, elles subissent un test d'intolérance au glucose par injection, puis une chirurgie reproduisant un accident vasculaire cérébral, suivie de tests comportementaux non précisés à sept et vingt-et-un jours. Le porteur indique attendre une douleur peropératoire, une perte sensorimotrice, une perte de poids et une déshydratation. L'objectif est de comprendre le rôle des comorbidités liées à l'âge dans l'AVC, le porteur justifiant le recours à l'animal par des mécanismes qui "ne peuvent s'envisager que dans un organisme entier".
Objectifs
Les maladies cardiaques sont l'une des principales causes de problèmes de santé et de décès chez les personnes âgées, en raison des problèmes de santé associés (vieillissement de leurs artères et troubles métaboliques). Ce projet de recherche se concentre sur l'accident vasculaire cérébral, maladie de plus en plus fréquente chez les personnes de plus de 60 ans. Aujourd’hui aucune thérapie ne permet une bonne prise en charge de la maladie. Chez ces patients, les comorbidités, telles que l’hyperglycémie et l’hyperlipidémie sont des facteurs de risque bien identifiés, aggravant les conséquences de la maladie. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre et caractériser le rôle des comorbidités liées à l’âge dans la modulation de la réponse des mécanismes de réparation après la survenue d’un accident vasculaire cérébral. Nous utiliserons un modèle classiquement utilisé et qui est proche de l’accident vasculaire cérébral chez l’Homme. Par ailleurs, la prise en compte des problèmes de santé associés à l'âge est nécessaire pour déterminer l’impact de nouvelles stratégies thérapeutiques. Cette étude, qui sera menée sur 2 établissements utilisateurs, permettra de mieux comprendre les caractéristiques de l'accident vasculaire cérébral dans le contexte de vieillissement et ses problèmes de santé associés dans l’optique d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle des comorbidités dans les conséquences de l'accident vasculaire cérébral. Les bénéfices attendus concernent la progression des connaissances scientifiques, connaissances qui pourront être appliquées à l'Homme et ce grâce à la prise en compte de la réalité de la clinique (âge et comorbidités).
Procédures
Après 3 mois d’administration d’un régime riche en protéines et en lipides et pauvre en glucides, les souris suivent un test d’intolérance au glucose (une injection de glucose intrapéritonéale et mesure de la glycémie). Cette première intervention sera réalisée dans un des 2 établissements utilisateur (EU1 et EU2). Puis, nous mimerons l’accident vasculaire cérébral en utilisant un modèle in vivo (chirurgie de 10 min) au sein de l'EU2. Les effets du régime sur la réponse après AVC seront analysés à J7 et J21 après la mise en place du modèle d’AVC à l’aide de tests de comportement.
Impact sur les animaux
L’âge (animaux âgés de plus de 6 mois) et le changement de l’alimentation induit une prise de poids (animaux de 35 – 60g). L’injection intrapéritonéale de glucose et la mesure de la glycémie sont également une nuisance pour l’animal. Le modèle d’AVC induit une douleur peropératoire et perte sensorimotrice. Une perte de poids et déshydratation peuvent également être attendues. Les tests comportementaux peuvent également être une source de stress pour les animaux.
Devenir
La mise à mort est nécessaire pour récupérer les tissus et faire les analyses histologiques, protéiques et génomiques
Remplacement
Notre projet a démarré par des études in vitro rapportant les effets d’un modèle de stress métabolique sur les fonctions de cellules endothéliales de vaisseaux cérébraux, notre but est maintenant d’étudier l’ischémie cérébrale dans ce contexte de stress métabolique (comorbidités), qui met jeu en des mécanismes à l’échelle de l’organisme entier. Il nécessite donc l’utilisation d’animaux vivants puisque l'étude des conséquences métaboliques du vieillissement et son retentissement sur le vaisseau et sa fonctionnalité, avec ou sans traitement, ne peut s'envisager que dans un organisme entier.
Réduction
Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum nécessaire et suffisant en accord avec notre expérience sur ces modèles et un calcul de puissance. Les résultats obtenus seront analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Afin de prévenir toute douleur qui pourrait être associée au modèle, les animaux recevront une analgésie en pré- per- et post-opératoire de manière systématique jusqu’à 48h. Avant la chirurgie, une anesthésie locale sera appliquée. La chirurgie est par ailleurs réalisée par une anesthésie adaptée (anesthésie gazeuse). En post-chirurgie une attention particulière sera portée aux animaux jusqu’au réveil. Un suivi clinique et une surveillance des animaux seront réalisés à l’aide d’une grille de score avec la mise en place de points limites. Tout animal présentant des signes de souffrance sera pris en charge et/ou mis à mort selon le score. Enfin, le bien-être animal sera aussi amélioré par l’enrichissement du milieu. Les cages seront pourvues de coton, bâtonnets de bois, igloo. Les souris sont placées dans une pièce au calme. Une chambre de réveil thermostatée sera utilisée en post-chirurgie. Le transport des animaux sera effectué en conditions ventilé et suivi de température.
Choix des espèces
Des études précédentes ont montré la pertinence du modèle souris pour étudier les maladies cardiovasculaires liées à l’âge et ses comorbidités. Le choix s’est porté sur la souris qui est un modèle reconnu pour reproduire la pathologie humaine de l’accident vasculaire cérébral (AVC) et pour lequel les outils sont nombreux pour le suivi de cette étude et ultérieurement pour le suivi de cette pathologie (anticorps, imagerie, modèles génétiquement modifiés). L’AVC étant essentiellement une pathologie de l’âge adulte. Le choix du modèle sera réalisé en utilisant des animaux âgés d’au moins 6 mois, âge permettant de mimer la physiologie du vaisseau à l’âge adulte. Pour prendre en compte les comorbidités liées au vieillissement, les animaux seront préparés par la mise en place d’un régime conduisant à des comorbidités en accord avec les recommandations données par le groupe de réflexion sur les modèles précliniques d’AVC. Les souris C57BL/6J utilisées pour cette étude seront âgées de 24 semaines (6 mois) avant les 3 mois de régime.
Etude d’effets physiologiques de l’administration d’une solution probiotique lactofermentée chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger, pour étudier l'effet d'un jus de fruit probiotique lactofermenté sur l'intestin. Elles reçoivent la solution par voie orale à la pipette après dix jours d'habituation, subissent des prélèvements de sang, de selles et d'urine, et passent des tests d'anxiété en champ ouvert, en labyrinthe en croix surélevé et en boîte clair-obscur. Le porteur vise à terme le développement d'aliments probiotiques "à effets dirigés" pour les humains, un bénéfice renvoyé au long terme. Sur le remplacement, il affirme que les organoïdes ne permettent qu'une étude cellulaire et que les prélèvements de tissu intestinal total ne sont "pas possibles chez l'homme".
Objectifs
Le projet a pour objectif d’étudier l’impact de l’administration d’un jus de fruit probiotique lactofermenté sur la physiologie du microbiote et de l’intestin. Le projet a recours à un modèle de souris afin de permettre l’étude de la physiologie de l'intestin et du comportement. La physiologie des animaux sera étudiée à partir d’analyse des selles, des urines, du sang, et de prélèvements intestinaux, ainsi que sur un plan comportemental avec une batterie de tests pour évaluer leur état d’anxiété. Un maximum de 100 souris sera nécessaire pour une étude scientifique pertinente. Chaque animal bénéficiera d’une attention et de soins de qualité, par du personnel qualifié, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de l’étude.
Bénéfices attendus
Le projet a pour but d’améliorer la connaissance sur l’impact de produits probiotiques alimentaires vivants sur la physiologie de la muqueuse intestinale. Les bénéfices seront à destination des humains, pour valider l’effet sur la santé d’une administration de probiotiques vivants. Les bénéfices à long terme consistent à développer des aliments probiotiques vivants à effets dirigés et connus dans un but de personnalisation.
Procédures
Des prélèvements de sang, de selles et d'urine seront réalisées au moment des manipulations des animaux (3 fois pendant la durée du protocole et espacés de 14 jours). Les tests comportementaux consistent a l'étude de l'anxiété d'exploration. L'ensemble des tests dure 40 minutes. L'animal dans une boite blanche pour étudier son déplacement, dans un labyrinthe en forme de croix, avec deux bras donnant sur le vide et deux bras protégés, et enfin dans une boite présentant une zone d'ombre et une zone fortement éclairée.
Impact sur les animaux
L’administration manuelle de la solution peut entrainer un stress chronique car répété. Cependant, la qualité sucrée de la solution peut aussi induire un conditionnement de l’animal, de plus une période d'habituation de 10 jours d'administration d'eau à la pipette sera réalisée avant le début de l'étude. Les tests comportementaux peuvent induire un stress temporaire le temps de la passation.
Devenir
A la fin de l'étude, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir recueillir le matériel biologique pour les études au laboratoire.
Remplacement
Notre projet nécessite l'utilisation d'animaux de laboratoire car il n'existe pas de techniques actuellement satisfaisantes pour étudier le retentissement à un niveau physiologique de l'administration de probiotiques (actuellement recours à des organoïdes permet seulement l'étude au niveau cellulaire voir tissulaire). L'étude nécessite des investigations sur des prélèvements non possible chez l’homme (tissu intestinal total, tissu cérébral). L'utilisation d'animaux permet de garantir une qualité scientifique optimale, en contrôlant a maxima les influences du milieu extérieur, ce qui est impossible chez l'homme.
Réduction
Le nombre d’animaux destiné au projet a été calculé afin de garantir une puissance nécessaire et suffisante d’analyse statistique. Le nombre d’animaux pour le protocole a été réduit au minimum mais reste élevé du fait de la variabilité importante et inhérente aux analyses comportementales. Les tests statistiques comportent des analyses descriptives et des analyses de comparaisons. Du fait du faible nombre de données les analyses seront menées par des tests non paramétriques.
Raffinement
Les nuisances pour les animaux seront prévenues par une surveillance accrue lors de l’exposition à la solution sur le plan du comportement, du stress, de la douleur et du poids. Afin de limiter le stress lié aux tests comportementaux, les animaux seront habitués aux procédures et au matériel de manière progressive. Afin de limiter la souffrance lors de l’administration de la solution, celle-ci n’est pas faite par gavage mais par délivrance orale à la pipette lors d’une manœuvre de contention manuelle. Pour limiter le stress engendré par la contention manuelle et l'administratin à la pipette, une période d'habituation de 10 jours d'administration de 20µL d'eau à la pipette lors d'une manoeuvre de contention manuelle sera réalisée, de plus l'habituation permettra de prévenir un biasi d'administration du volume par salivation ou régurgitation. Les cages d’hébergements seront enrichies (nid et bâton à ronger). Dans le cas où les souris mâles viendraient à se battre, il est prévu de les isoler en cages individuelles.
Choix des espèces
La connaissance de la physiologie intestinale et immunologique de la souris est avancée. Elle répond aux compétences de l’animalerie où l’expérimentation va être menée. Cette espèce est bien référencée sur les études comportementales et la littérature existante permettra une analyse de qualité. 1 lot d'animaux sera acheté à l’âge de 6 semaines, et sera utilisé dans le projet à l’âge de 8 semaines, ce lot correspond à l'âge adulte jeune, et permet d'étudier le retentissement physiologique sur un organisme pleinement fonctionnel. 1 lot d'animaux « âgés » de 48 semaines sera utilisé pour l’étude afin d’étudier l’impact des produits sur la physiologie des sujets âgés.
Production et caractérisation de souris transgéniques FMC1 KO (1/3)
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles musculosquelettiques
313 souris génétiquement modifiées pour modéliser le syndrome NARP vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des prélèvements de sang et d'urine à quatre âges, des tests de force musculaire, de motricité, d'équilibre et d'endurance, ainsi que des IRM et échocardiographies sous anesthésie, le porteur attendant un déficit de poids d'environ 20 %, un défaut cardiaque et musculaire. L'objectif est de caractériser cette lignée avant de tester des candidats médicaments, une étape que le porteur décrit comme "jamais faite auparavant de manière détaillée". Sur le remplacement, il affirme que les modèles cellulaires restent "incomplets" et que le recours à l'"organisme tout entier" est une "nécessité".
Objectifs
Le syndrome NARP (Neuropathie Ataxie Rétinite Pigmentaire) est une pathologie rare qui affecte majoritairement les fonctions cardiaques, musculaires, et neurologiques et pour laquelle il n'y a toujours pas de traitement. Au laboratoire nous avons identifié des candidats médicaments efficaces sur les cellules de patients atteints du syndrome NARP. Afin de pouvoir proposer le traitement à des patients il nous faut prouver leur efficité dans un animal entier (ici le modèle murin). Avant, il est nécessaire d'identifier des déficits clairs dans le modèle souris du syndrome de Barth. Ce projet vise donc à caractériser finement le modèle souris du Syndrome NARP d'un point de vue cardiaque, musculaire, comportementale etc.... Ceci permettra ensuite de tester si les candidats médicaments efficaces en cellules de patients sont capables de diminuer les défauts mis en évidence dans l'étape de caractérisation du modèle murin. Si tel est le cas, on aura la preuve de leur efficacité dans un animal entier. L'objectif ultime étant de proposer les candidats médicaments efficaces dans les cellules de patients et le modèle murin du syndrome NARP à des patients atteints du syndrome NARP.
Bénéfices attendus
Avant de tester des candidats médicaments, il est nécessaire de caractériser la lignée murine, modèle du syndrome NARP, dans nos animaleries afin d'identifier les meilleurs paramètres pour les futurs tests médicamenteux. Cela n'a jamais été fait auparavant de manière détaillée. Seront analysés, le comportement, le poids, la fertilité, les portées, les avortements spontanés, la mortalité périnatale, l'acidose, la force musculaire, l'endurance, la coordination, les fonctions cardiaques, les fonctions mitochondriales sur tissus et des dosages sanguins et urinaires.
Procédures
Prélèvements sanguins et urinaires aux âges de 1 mois, 2 mois, 4 mois et 6 mois. Chaque intervention n'excédera pas 10 minutes. Tests comportementaux (force musculaire, motricité, équilibre et endurance) aux âges de 2 mois, 4 mois et 6 mois. Chaque intervention n'excèdera pas 15 minutes. IRMs et echocardiographies aux âges de 2, 4 et 6 mois. Chaque intervention n'excèdera pas 30 minutes et les souris subiront des anesthésies.
Impact sur les animaux
Des nuisances liées aux souris présentant un phénotype dommageable peuvent être attendues. Comme d'autres modèles murins similaires (avec des déficits mitochondriaux) nous pouvons attendre, à l'echelle de l'animal entier un déficit de poids d'environ 20 pourcents, un défaut cardiaque et un défaut musculaire. Les nuisances/effets indésirables causés par les expérimentations (manipulations/gestes expérimentaux sur l'animal) sont classées de sévérité modéré. L'analyse par IRM et échocardographie nécesite une anesthésie. Il n'y a pas de conséquence sur le bien être de l'animal au delà de la période entourant le recueil des données IRM ou échocardiographiques. Le suivi des performances sur tapis de course, rotarod ou grip test teste les capacités motrices de l'animal vigile. Il n'y a pas de conséquence sur le bien être de l'animal au delà de la période entourant le recueil des données de la course.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour prélèvement terminaux de sang et organes. Ces prélèvements permettront de faire différentes analyses afin de caractériser à différents niveaux le modèle murin.
Remplacement
Nous utilisons des modèles cellulaires eucaryotes pour répondre à certaines questions, cependant, ces méthodes alternatives restent incomplètes pour l’étude de phénomènes physiologiques aussi complexes que les mécanismes impliqués dans le syndrome NARP, puisqu'elles ne tiennent pas compte de l’ensemble des interactions existantes au sein d’un organisme tout entier. L'utilisation du modèle animal est donc une nécessité pour compléter nos résultats in vitro mais également avant de procéder aux essais cliniques chez l'homme.
Réduction
Seules les expériences indispensables seront réalisées. Il n'y aura pas de répétition inutile d'expérience. Le nombre d'animaux nécessaires a été réduit au minimum, tout en permettant de garantir l’analyse statistique des résultats. Les mêmes animaux seront utilisés pour tous les gestes cités. Des travaux antérieurs ont montré des écarts types importants pour les différents paramètres analysés (analyse cardiaque, analyses biochimiques mitochondriales, expression des gènes). Cette variabilité impose de travailler avec des effectifs minimum de 8 animaux par groupe. Afin de palier une éventuelle mort prématurée des animaux (suite à une blessure par exemple), nous prévoyons 20-25 pourcents d’animaux en plus, soit 10 souris par groupe.
Raffinement
Nous raffinons nos conditions d'expérimentation et d'hébergement pour le bien-être de nos animaux. En concertation avec la Structure chargée du Bien Etre des Animaux (SBEA), les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. De plus les cages sont enrichies par des jouets. Les animaux sont surveillés quotidiennement. Le poids sera suivi 1 fois par semaine. Si l'animal perd entre 10 et 15 pourcents par rapport à son poids le plus haut, on rajoutera du gel alimentaire et on augmentera la fréquence de surveillance, et en cas de perte de 25 pourcents l'animal sera euthanasié. Si un animal montre un problème de comportement, de locomotion ou autre, des mesures conservatoires seront prises: nourriture mouillée dans la cage, biberon à longue tétine. Nous raffinons nos expérimentations en utilisant les animaux de chaque groupe pour recueillir plusieurs types de données. Sur chaque animal, l’ensemble des organes et tissus pouvant être recueillis sont prélevés afin d’anticiper les expérimentations futures. Pour toutes les procédures, les animaux seront observés quotidiennement, et les points limites seront évalués en détail: Plaie/Traumatisme, Comportement/Mouvement, Aspect général, Evolution pondérale. Un score sera attribué, qui déterminera les traitements/observations à suivre: Score 0-2 = aucune douleur => pas de traitement. Score 3-5 = Observation plus importante et gel diet et croquettes humides au fond de la cage. Score 6-7=douleur légère à modérée=>Nettoyer d'éventuelles plaies et injection en sous cutanée d'un anti douleur et euthanasie si pas d'amélioration sous 24H. Score 8-9 = euthanasie de l'animal pour ne pas attendre et laisser souffrir l’animal. Les animaux seront transférés dans différentes animaleries selon les analyses. Les animaux seront transférés par nos soins en voiture, en prenant toutes les précautions nécessaires (température adéquate et stress diminué au mieux en adaptant une conduite souple et non rapide). Le transfert ne durera pas plus de 30 minutes. Les animaux seront dans des cages de transport adaptées contenant copeaux, cotons et nourritures. Les souris contrôles seront toujours séparées des souris modèle de la maladie. Les transferts seront effectués une semaine avant les analyses pour laisser un temps d'acclimatation dans la nouvelle animalerie.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris comme modèle pour plusieurs raisons : - animal de petite taille, facile à héberger et à contentionner - modèle idéal pour la création de lignée : temps de gestation court (19 à 21 jours), - 6 à 15 souriceaux par portée - modèle très utilisé pour mimer les maladies humaines de par les 99 pourcents d'homologies entre son génome et le génome humain - modèle très bien maitrisé en terme de manipulation génétique. Les animaux seront suivis de leur naissance (mortalités, suivi des portées, génotypage, avortements spontanés) à l'âge de 2 ans. Les animaux seront caractérisés dès l'âge de 10 jours pour un suivi de poids hebdomadaire, aux âges de 2, 4 et 6 mois pour des tests d'endurance, de force musculaire, de coordination et de fonction cardiaque et aux âges de 1, 2 ,4 et 6 mois pour des dosages sanguins et urinaires, et des prélèvements d'organes.
Etude des systèmes monoaminergiques chez un modèle de souris TS65Dn du syndrome de Down : implication de la modulation allostérique du récepteur aux cannabinoïdes CB1
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
685 souris porteuses d'un modèle de trisomie 21 vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement du cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des injections répétées par voie intra-péritonéale ou sous-cutanée, jusqu'à cinq pour une partie d'entre elles, et sont hébergées en cage individuelle, source de stress que le porteur reconnaît. L'objectif est d'étudier la modulation d'un récepteur aux cannabinoïdes sur les réseaux de neurones, les pistes thérapeutiques annoncées restant qualifiées d'"inexplorées à ce jour". Sur le remplacement, le porteur indique avoir mené des analyses in silico et in vitro en amont, mais affirme qu'il n'existe "pas de méthode alternative" pour l'étude de systèmes intégrés.
Objectifs
La trisomie 21 ou syndrome de Down est une maladie grave caractérisée par la triplication de tout ou partie du chromosome 21. La trisomie 21 est la première cause de retard mental d’origine génétique affectant 60 millions de personnes dans le monde. Découvrir une thérapie pouvant atténuer les déficits intellectuels, notamment cognitifs, est donc un enjeu de santé publique. Le but de notre projet de recherche est d’ordre préclinique en utilisant un modèle animal. Des modèles du syndrome de Down ont été développés chez la souris et la lignée Ts65Dn est, à ce jour, la plus étudiée car ces souris ont une triplication de chromosomes (équivalent au chromosome 21), sont viables avec un développement non dommageable, et présentent des caractéristiques proches des symptômes observés chez les individus atteints de trisomie 21. Notamment, les souris Ts65Dn sont caractérisées par des déficits cognitifs (différents types de mémoire et apparition précoce de la maladie d’Alzheimer) et psychomoteurs. Des données scientifiques suggèrent un dysfonctionnement des réseaux de neurones chez les souris Ts65Dn et proposent des cibles potentielles pour le traitement des symptômes. L’objectif général de notre projet de recherche consiste donc à étudier les modifications des réseaux neuronaux chez les souris Ts65Dn présentant un syndrome de Down. Cette étude contribuera ainsi à mieux comprendre les mécanismes de régulation sur les réseaux de neurones dans le cadre la trisomie 21 afin d’identidier de nouvelles cibles thérapeutiques.
Bénéfices attendus
La trisomie 21 est une maladie génétique causée par la triplication de tout ou partie du chromosome 21. Elle se manifeste par différents symptômes dont les plus fréquents sont le retard mental et les déficiences cognitives. Des données issues de la littérature mettent en évidences de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles pour le traitement de ces symptômes, bien qu’inexplorée à ce jour. En effet, une classes de composés pharmaceutiques sont capables d’inverser certains déficits d’apprentissage chez les souris trisomiques. Ce projet consistera ici à produire une meilleure connaissance des mécanismes fondamentaux sous-tendant la régulation des réseaux monoaminergiques par les récepteurs CB1 dans le cadre du syndrome de Down.
Procédures
L’ensemble des gestes techniques décrits ci-après sera réalisé par une personne compétente formée à l’expérimentation animale et aux gestes techniques, qui sera sous la responsabilité du porteur de projet et sera en contact régulier avec le personnel zootechnique de l’animalerie d’expérimentation et les responsables du bien-être animal. Dans ce projet, 400 animaux recevront une seule injection au cours de la procédure et 160 autres animaux recevront un total de 5 injections : une injection quoditienne pendant 4 jours puis une dernière injection 24h après ou 4 semaines après pour induire une anesthésie générale. Ces injections seront réalisées sur animal vigiles dans la limite des volumes d’injections préconisés pour la taille et l’espèce des animaux. La durée du geste technique pour effectuer une injection est d'environ 30 secondes.
Impact sur les animaux
L’administration des substances par voie intra-péritonéale et sous cutanée, ainsi que la contention nécessaire à la réalisation des administrations entrainent des douleurs et du stress. Des nuisances pourraient survenir à la mise en cage individuelle des animaux en raison du stress lié à l'hébergement individuel
Devenir
Au cours de ce projet tous les animaux seront mis à mort pour le prélèvement du cerveau afin de réaliser des analyses ex vivo immunohistochimique ultérieures.
Remplacement
Dans le cadre de la stratégie de remplacement, des approches substitutives à l’expérimentation animale ont été réalisées en amont de ce projet. Des analyses in silico nous ont permis d’identifier le site de fixation allostérique de la pregnenolone sur le récepteur CB1. De plus, des études in vitro ont permis de montrer l’effet régulateur de la PREG sur le récepteur CB1. Ce projet s’applique maintenant à l’étude de systèmes intégrés qui ne peuvent être réalisés que chez l’animal. En effet, il n’existe actuellement pas de modèle in vitro et donc de méthode alternative à l’utilisation des animaux. De plus, l’organisation du système nerveux central de la souris est assez proche de celle de l’homme, ce qui permettra une extrapolation à l’homme des résultats obtenus dans le projet de recherche.
Réduction
Dans le cadre de la stratégie de réduction, notre expérience au sein du laboratoire nous a permis de déterminer qu’un nombre de 10 souris par groupe expérimental est nécéssaire pour les prélèvements et analyses ex vivo, afin d’obtenir des données représentatives de l’échantillon de population. De plus, nous utiliserons des souris mâles et femelles afin de déterminer d’éventuelles différences liées au sexe. Le cas contraire, les données des mâles et femelles seront regroupées de sorte à augmenter le nombre d’individu par groupe pour étudier les effets traitement. Enfin, les études réalisées au cours du projet précédent et une connaissance accrue de la bilbiographie sur la pregnénolone et le récepteur CB1 nous permet de proposer des groupes expérimentaux pertinants avec des conditions témoins appropriées.
Raffinement
Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne, et ce dès leur réception. La manipulation des animaux et les soins éventuels seront prodigués par des personnes habilitées à l’expérimentation animale et compétentes, en accord avec la grille de score des points limites. De plus, une personne habilitée sera en charge de vérifier le pourcentage d’humidité dans l’air et la température, ainsi que le niveau sonore (si un bruit anormal survient) dans les pièces d’hébergement et d’expérimentation afin de détecter d’éventuelles nuisances et alerter les personnes compétentes pour pallier à celles-ci. A leur réception, les souris seront maintenues en cages d’hébergement collectives en présence d’enrichissement (carrés de cellulose, sizzle, tunnels en carton), et ce jusqu’à une semaine avant le début des expériences. Les animaux seront alors placés dans des cages individuelles transparentes et rapprochées les unes des autres afin de maintenir des contacts olfactifs et visuels entre les animaux et en présence du même enrichissement. La mise en cage individuelle est ici nécéssaire afin de minimiser l’impact potentiel de la hierarchie sociale sur le phénotype des et afin de reproduire les conditions d’hébergement dans le projet précédent. De plus, les animaux seront manipulés par un expérimentateur habilité à l’aide des tunnels en carton, afin de réduire le stress lié à cette manipulation. Les expériences seront réalisées dans une pièce dédiée dans l’animalerie. Le cas échéant, un enrichissement supplémentaire pourra être apporté dans les cages d’hébergement afin d’optimiser le bien-être des animaux.
Choix des espèces
Le modèle de trisomie 21 chez la souris Ts65Dn est très bien caractérisé dans la littérature et représente le modèle de choix pour les études d’efficacité préclinique. En effet, c’est un des modèles génétiques les plus largement utilisés du syndrome de Down car les souris Ts65Dn sont trisomiques pour environ 2/3 des gènes orthologues au chromosome 21 humain. Ces souris triploïdes présentent les avantages d’être viables, d’avoir un développement non dommageable et d’exprimer plusieurs phénotypes qui reproduisent les symptômes des individus trisomiques, comme des déficits d'apprentissage et de mémoire; et elles développent précocement les signes pathologiques de la maladie d'Alzheimer. Les expériences seront réalisées sur des animaux jeunes-adultes (entre 2 et 5 mois de vie) présentant des déficits cognitifs d'apprentissage et de mémoire et avant le développement de signes pathologiques précoces comme la maladie d'Alzheimer.
Ciblage thérapeutique des cellules gliales dans la maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
224 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Modifiées génétiquement pour modéliser la maladie d'Alzheimer, elles reçoivent des injections sous anesthésie, passent six tests de comportement mesurant l'anxiété, l'anhédonie, la sociabilité, l'apprentissage et la mémoire, et subissent pour certaines un prélèvement de liquide céphalo-rachidien et de sang avant mise à mort. Le porteur vise à évaluer le bénéfice thérapeutique de deux protéines des cellules gliales, mais les retombées pour les 900 000 personnes concernées restent renvoyées à un horizon lointain. Sur le remplacement, il affirme que les interactions entre neurones et cellules gliales ne sont pas reproduites in vitro et conclut à la nécessité de comparer ces régions sur l'"organe entier".
Objectifs
La maladie d’Alzheimer (MA) est une maladie neurodégénérative encore incurable, et dont l'apparition semble liée à des phénomènes d’inflammation dans le cerveau auquel participent les cellules gliales (astrocytes et microglies), qui sont des partenaires essentiels aux neurones. Ce projet vise à évaluer le bénéfice thérapeutique de deux protéines exprimées par les cellules gliales à des stades différents du développement de la MA, l’une étant exprimée lors de la phase précoce de la MA, l’autre ayant un rôle dans l’inflammation observée lors de la MA. La première protéine ciblée est exprimée à la surface des cellules microgliales, les cellules immunitaires du cerveau, c’est un récepteur microglial. La deuxième protéine ciblée est exprimée par les astrocytes. Ce projet cherche à évaluer l’impact d’une part de la perte d’expression du récepteur microglial et d’autre part de la surexpression de la protéine astrocytaire sur le comportement, et les atteintes affectant les tissus et organes, dans un modèle souris de la MA. L’objectif est de prévenir et ralentir le développement de certains symptômes comportementaux, déficits de la mémoire et altérations des cellules et du cerveau observés chez les personnes atteintes de la MA.
Bénéfices attendus
La MA touche plus de 900 000 personnes en France et représente un problème sociétal majeur. Jusqu'à présent, la plupart des stratégies thérapeutiques ont ciblé directement les neurones et ont malheureusement échoué en clinique. Les cellules gliales assurent des fonctions clés dans le cerveau qui peuvent être perturbées dans la MA. Cibler ces cellules pour les rendre plus bénéfiques aux neurones apparaît comme une stratégie alternative potentielle. Cette étude préclinique dans un modèle souris de la MA à de multiples niveaux (biochimique, cellulaire, tissulaire, comportemental), permettra d’établir le bénéfice thérapeutique à cibler les cellules gliales pour la MA.
Procédures
Certaines souris recevront une injection sous anesthésie gazeuse de cinq minutes et seront analysées quatre mois plus tard par des tests de comportement. Certaines souris passeront six tests de comportement à deux âges espacés de 3 mois. Ces tests visent à évaluer l’anxiété, l’anhédonie (incapacité à ressentir le plaisir), la sociabilité, l’apprentissage et la mémoire des souris, ils durent entre cinq minutes et une heure chacun et seront réalisés sur six semaines en laissant deux-trois jours de repos entre chaque test. Enfin, toutes les souris seront euthanasiées par une méthode validée pour la réalisation d’une analyse post-mortem histologique ou biochimique. Certaines souris auront un prélèvement de liquide céphalo rachidien et de sang sous anesthésie et analgésie avant leur euthanasie (prélèvement de trente minutes maximum)
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux utilisés sont une douleur limitée (en intensité et dans le temps) liée à l’injection intraperitonéale avant l’euthanasie ou l’injection intraveineuse sous anesthésie, ainsi que le stress lié à la contention et des tests comportementaux. Le stress sera réduit au minimum par l’habituation à l’expérimentateur avant chaque session de comportement. Le stress sera réduit au minimum par l’habituation à l’expérimentateur avant chaque session de comportement. La douleur lors des prélèvements de liquide céphalo-rachidien et de sang et avant perfusion sera pris en charge par la mise en place de procédures d’analgésie et d’anesthésie adaptées. Les changements comportementaux liés à la modélisation de la MA (réduction fine de la mémoire, légère anxiété mesurées sur des dispositifs dédiés et sensibles) représentent des nuisances extrêmement légères, qui n’entravent pas la capacité des souris à se nourrir, déplacer, et réaliser leurs comportement habituels…
Devenir
A la fin de chaque procédure les animaux seront euthanasiés par des méthodes adaptées et validées, pour la réalisation d’une analyse post mortem complète des tissus.
Remplacement
Le cerveau est un organe complexe dans lequel interviennent de nombreuses interactions entre neurones (les cellules vulnérables dans la MA) et les cellules gliales partenaires. Ces interactions cellulaires ne sont pour le moment pas fidèlement reproduites dans des modèles in vitro ou in silico, ce qui nécessite l’utilisation de modèles animaux. De plus la vulnérabilité de certaines régions cérébrales (ici préfrontal cortex et hippocampe) nécessite de comparer sur l’organe entier ces différentes régions qui ont parfois des connections anatomiques et fonctionnelles cruciales pour expliquer cette vulnérabilité sélective, et ne sont pas reproduite in vitro dans toute leur complexité. Les souris utilisées dans ce projet, permettent d’étudier les interactions neurones-astrocytes-cellules microgliales dans le contexte génétique de la MA. Elles reproduisent le phénomène d’agrégation de peptides amyloïdes et différents symptômes histologiques, biochimiques et cognitifs caractéristiques de la MA.
Réduction
Le projet prévoit au maximum 224 souris nées dans une animalerie agrée ou dans notre élevage. Le nombre d’animaux dans chacun des groupes expérimentaux est réduit au minimum nécessaire permettant une interprétation statistique fiable des résultats. Plusieurs paramètres sont mesurés sur les mêmes souris. Par exemple certaines souris auront une analyse sanguine et du liquide céphalorachidien ainsi qu’une évaluation histologique complète de plusieurs régions du cerveau avec quantification de plusieurs paramètres par souris. Ceci permet d’exploiter au mieux les informations biologiques de chaque souris, et de réduire le nombre total d’animaux utilisés, selon le principe des 3R.
Raffinement
Le suivi quotidien des souris hébergées en groupe dans un milieu enrichi et l’application de critères d’arrêt en élevage et en expérimentation, permettra de garantir leur bien-être. En cas d’apparition d’effets inattendus, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin de mettre en œuvre des traitements appropriés. Des points limites sont établis pour chaque procédure, pour lesquels les souris seront euthanasiées. La gestion de la douleur et de l’inconfort liés aux procédures expérimentales mettra en œuvre des méthodes d’anesthésie et d’analgésie pré- et post-opératoire, un soutien nutritionnel et thermique, ainsi qu’un suivi clinique post-opératoire incluant la prolongation des traitements analgésiques si besoin. L’habituation des souris à l’expérimentateur avant chacune des sessions de tests comportementaux permet de réduire le stress des souris à la manipulation. Un soutien thermique sera mis en place lors des anesthésies.
Choix des espèces
Ce projet vise à étudier les interactions entre neurones et cellules gliales ; les organismes modèles simples possèdent des cellules gliales ressemblantes mais pas identiques aux astrocytes du cerveau mammifère. Les souris modèles de la MA, utilisées pour ce projet, permettent d’étudier les interactions neurones-cellules gliales dans le contexte génétique de la MA. Elles présentent aussi des altérations cognitives et comportementales caractéristiques de MA. La MA est une maladie qui se déclare chez l’adulte. Les altérations histologiques et biochimiques, ainsi que les altérations du comportement apparaissant dans ce modèle de la MA vers 6-9 mois. Les souris seront analysées entre 6 et 10.5 mois en fonction de l’évolution des symptômes analysés.