Rongeurs
1. Etude des conséquences de la modulation du métabolisme dans la voie nigro-striée chez le rat sain et dans des modèles rat de la maladie de parkinson
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
300 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une à deux neurochirurgies du cerveau, des prélèvements de sang et des tests répétés de motricité, d'anxiété et de motivation pendant plusieurs mois, dans des modèles reproduisant la maladie de Parkinson qui peuvent provoquer des déficits moteurs et une perte de poids. À l'issue, ils sont tués pour prélever leur cerveau. Le porteur affirme qu'il n'existe pas de méthode alternative et que l'étude des stades précoces de la maladie ne peut pas être menée chez l'humain.
Objectifs
Notre objectif principal est de mieux comprendre les mécanismes qui sont à l’origine de la mort des neurones dans la maladie de Parkinson afin de développer une stratégie de détection précoce de la maladie et proposer de nouvelles cibles thérapeutiques, en explorant particulièrement le rôle des marqueurs métaboliques.
Bénéfices attendus
Mieux comprendre l'origine de la maladie de Parkinson pour proposer une nouvelle cible thérapeutique plus efficace que celles existantes.
Procédures
Les animaux subissent une à deux neurochirurgies d'une durée maximale de 1h, anesthésie incluse. Ils subissent 2 à 3 prélèvements sanguins, espacés de plus de 5 semaines et n’excédant pas plus de 10 minutes, anesthésie incluse. Ils sont soumis 2 ou 3 fois à 2 tests moteurs complémentaires (durée maximum 1 heure) et un test d’anxiété (durée maximum 5 minutes), chaque session de tests étant séparée de la suivante d’au moins 6 semaines. Ils sont également soumis quotidiennement à un test pour mesurer la motivation (durée maximal 1 heure) pendant 17 semaines maximum.
Impact sur les animaux
Pour les procédures de chirurgie du cerveau, une nuisance ou des effets indésirables modérés pourront concerner essentiellement les douleurs post-opératoires. Pour les modèles de la maladie utilisés, ceux-ci peuvent présenter uniquement des déficits psychiatriques légers telle qu’une baisse de motivation (stade précoce) n’entraînant pas de difficulté à s’hydrater ou se nourrir ; ou également des déficits moteurs (stade avancé) pouvant conduire à des difficultés pour se déplacer et se nourrir et s’accompagner d’une perte de poids. Une souffrance légère pourra être liée aux échantillonnages sanguins réalisés par ponction de la veine de la queue sur animal anesthésié, pouvant induire chez l’animal stress et hémorragie locale. Enfin, l’ensemble des tests comportementaux pourra induire une nuisance légère due au stress généré par la préhension des animaux par l’expérimentateur.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés afin de pouvoir prélever leur cerveau pour réaliser les analyses nécessaires à l'étude.
Remplacement
Il n’existe pas de méthodes alternatives, n’impliquant pas d’animaux vivants, qui permettront l’évaluation à la fois du comportement, de la mort des neurones et des modifications des niveaux de certaines molécules exprimées dans le sang et le cerveau. D’autre part, une étude sur les stades précoces de la maladie de Parkinson ne peut pas être réalisée chez l’homme pour le moment car nous ne savons pas détecter la maladie si précocement.
Réduction
Le nombre d’animaux sera limité au nombre minimum nécessaire et suffisant par groupe afin d’avoir une chance de détecter une différence significative. Ce nombre a été estimé à l’aide d’approches statistiques appropriées à chaque type de données.
Raffinement
Les animaux sont hébergés pendant une semaine à leur arrivée pendant laquelle ils sont manipulés quotidiennement, avant le début des expérimentations, afin d’atténuer le stress pouvant être lié aux manipulations et aux contentions. Ins sont hébergés selon la procédure mise en place par l’animalerie afin de maintenir un milieu socialement riche et d’éviter tout stress supplémentaire. Les prélèvements sanguins sont réalisés sur les animaux endormis puis maintenus sous anesthésie volatile permettant un recueil de sang dans la queue. Chaque recueil se fait en un point différent du précédent pour limiter les risques lésionnels. Les chirurgies du cerveau sont réalisées sous anesthésie générale, les yeux sont protégés de la dessication et les points de contentions et d’incisions sont préalablement analgésiés. La température est maintenue constante. En post-opératoire les animaux sont placés sous une lampe chauffante jusqu’à leur réveil avec contrôle de la température. Les douleurs post-opératoires sont prévenues par injection d’un antalgique. A leur réveil, les animaux sont retournés dans leur cage avec leurs congénères. Le projet implique la mise en place d’un état pathologique de classe modérée chez le rongeur. Deux modèles sont utilisés car ils miment des aspects différents mais complémentaires de la maladie. Pour les animaux mimant la phase avancée de la maladie, les déficits moteurs peuvent conduire à des difficultés pour se déplacer et se nourrir et s’accompagner d’une perte de poids qui sera limitée par l’ajout dans la cage d’hébergement d’une nourriture appétante hypercalorique et humidifiée. Dans tous les cas, le suivi biquotidien et les pesées bihebdomadaires des animaux permettent de veiller à ce que les animaux ne souffrent pas et à mettre en place des stratégies de soin et des points limites adaptés.
Choix des espèces
Le rat apparaît comme l’espèce adéquate car il possède un degré de similitude important avec le cerveau humain, notamment au niveau des réseaux impliqués dans le développement de la maladie de Parkinson, et il est couramment utilisé (modèle animal principalement utilisé) pour les études sur cette maladie. Par ailleurs, cette étude étant basée sur de précédents résultats de la littérature obtenus dans la même espèce, il semble cohérent de continuer sur cette espèce. Au début de l’étude, les rats seront de jeunes adultes (7-8 semaines), ce qui permettra de travailler sur un système cérébral stable, mature, qui n’évoluera pas au cours des procédures expérimentales qui prendront plusieurs mois.
Jêune aigü et jeûne répété : des mécanismes identiques ou différents ?
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
192 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des cycles de jeûne de 24 heures alternés avec 24 heures d'alimentation pendant quatre semaines, des piqûres répétées de la queue pour mesurer la glycémie et un prélèvement de sang terminal, avant la mise à mort pour prélever le foie et d'autres organes. Le porteur étudie le rôle d'une protéine du foie chez des souris modifiées pour ne plus la produire, les bénéfices annoncés se limitant à comparer ces effets avec ceux d'un jeûne unique. Il affirme qu'il est "impossible" de reproduire ce processus par des méthodes sans animaux et conclut que le recours à la souris est "approprié".
Objectifs
Chez les animaux, des épisodes de jeûne sont fréquemment observés en cas de blessure ou de manque de nourriture ou encore lors de l'hibernation, dans le but d'économiser l'énergie et de s'adapter aux différents environnements. Les mammifères sont ainsi capables de tolérer de longues périodes de jeûne grâce à une réponse adaptative de l'organisme. Le foie joue un rôle majeur dans cette adaptation aux situations de jeûne car il permet la production de carburants, nécessaires au fonctionnement du cerveau et du coeur notamment. Cette production de carburants par le foie est primordiale et controlée par des protéines spécifiques. Parmi ces protéines importantes lors de périodes de jeûne figure la protéine PPARα. De nombreuses études examinent les effets sur la santé de différentes stratégies nutrtionnelles qui impliquent des périodes de jeûne. Ces stratégies qui alternent des périodes de jeûne et des périodes d'alimentation ont montré des effets bénéfiques sur plusieurs pathologies, notamment chez la souris. Dans ce projet, nous souhaitons évaluer le rôle de PPARa dans la réponse au jeûne lorsqu'il est alterné avec des périodes d'alimentation à volonté. Nous disposons au laboratoire de souris mâles et femelles qui n'ont pas la protéine PPARa dans le foie et leur contrôle, que nous soumettrons à des alternances de jeûne de 24h et d'alimentaion à volonté de 24h sur une période de 4 semaines. Les effets seront évalués grâce à des bilans sanguins et des analyses des prélèvements d’organes dont le foie.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de définir si PPARa spécifiquement dans le foie joue un rôle dans les réponses induites par des jeûnes répétées. Nous pourrons également comparer les effets avec le rôle connu de PPARa lors d'un jeûne unique.
Procédures
Les animaux seront nourris avec un régime standard à volonté ou soumis à des cycles jeûne de 24h/alimentation à volonté pendant 4 semaines. Les animaux seront pesés toutes les semaines. Chaque pesée prend environ 20 secondes par animal. La glycémie sera mesurée chaque semaine par prélèvement d’une seule goutte de sang (
Impact sur les animaux
Le jeûne unique et le jeûne répété peuvent induire une perte de poids, une baisse de la glycémie et de la température corporelle. La piqûre de la queue pour prélever la goutte de sang peut entraîner une légère douleur. Le prélèvement de sang terminal peut entraîner un stress des animaux lié à la contention et un épanchement au niveau de la joue.
Devenir
A la fin de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin de récolter le sang et différents organes pour effectuer les analyses permettant de répondre à la question scientifique.
Remplacement
Ce projet nécessite l’utilisation d’animaux de laboratoire car le jeûne est un processus physiologique qui fait intervenir différents tissus agissant en synergie, notamment le foie et le tissu adipeux, et plusieurs hormones qui agissent à distance. Il est impossible de mimer ceci par l’utilisation de méthodes alternatives. L’utilisation de souris transgéniques de laboratoire est appropriée car elle permet d'étudier le rôle d'une protéine spécifique.
Réduction
Le nombre d'animaux pour ce projet est défini pour permettre d'une part de répondre aux questions scientifiques et d'autre part de respecter la réduction du nombre d'animaux au maximum. Ainsi nous utiliserons le plus petit nombre d'animaux possible qui est requis pour répondre à nos questions scientifiques et conduire à des résultats exploitables et statistiquement significatifs. Ce nombre d'animaux a été déterminé par des tests statistiques appropriés (calcul de puissance) et est basé sur des résultats provenant d'expériences antérieures du laboratoire.
Raffinement
Nous veillerons au bien-être des animaux tout au long des expérimentations en leur assurant les meilleures conditions d’hébergement (hébergement collectif, environnement contrôlé, enrichissements du milieu de vie) Les animaux seront habitués à l’expérimentateur et les gestes techniques seront réalisés par une personne formée et expérimentée. Nous surveillerons également attentivement l’apparence physique externe, le poids et le comportement des animaux. Des points limites gradés seront mis en place pour l’évaluation de ces différents paramètres. Si un critère d'arrêt est atteint, l'animal sera retiré de la procédure, renourri et replacé en conditions d’hébergement standard après examination par la vétérinaire référente.
Choix des espèces
L’utilisation de souris de laboratoire est appropriée car elle permet d’étudier le rôle de protéines spécifiques en utilisant des souris transgéniques. Ces modèles existent uniquement chez la souris. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7 semaines d’âge minimum) car le développement du foie est terminé et nous nous intéressons au métabolisme chez l’individu adulte.
Etude de l’effet de l’harmaline sur le développement de l’organisation modulaire du réseau olivo-cérébelleux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
563 souris vont être utilisées, les souriceaux tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, les 60 mères étant réutilisées pour l'élevage. Les souriceaux reçoivent deux injections intrapéritonéales d'harmaline par jour pendant cinq jours, ce qui provoque des tremblements aigus et une phase d'hyperactivité gênant la prise alimentaire. Le porteur indique un retard de poids inférieur à 4 % et signale que la manipulation peut conduire les mères à rejeter leurs petits. Il étudie le rôle de l'activité neuronale dans le développement d'un réseau du cervelet et affirme qu'une telle étude n'est pas possible en culture cellulaire.
Objectifs
Dans le cerveau, la cellule de Purkinje du cervelet reçoit différents types de connexions, dont celles des fibres grimpantes, axones des neurones de l’olive inférieure. L’activité neuronale régule la formation et le maintien des synapses entre fibres grimpantes et cellules de Purkinje, ce qui fait du réseau olivo-cérébelleux un système d’étude idéal pour analyser les mécanismes moléculaires dépendants de l’activité menant à l’établissement de réseaux neuronaux fonctionnels. De plus, le réseau olivo-cérébelleux présente une organisation en modules, traitant différentes informations sensorielles et motrices, et permettant un contrôle précis de différentes fonctions et en particulier la motricité. Nous proposons d’étudier le rôle de l’activité neuronale dans l’établissement de l’organisation modulaire de ce réseau ainsi que dans la régulation des facteurs moléculaires contrôlant sa mise en place.
Bénéfices attendus
Les maladies mentales et neurologiques constituent un réel problème de santé publique puisqu’elles sont la première cause d’invalidité dans le monde. Parmi ces maladies, la schizophrénie et l'autisme touchent chacune environ 1% de la population. Les symptômes associés à ces maladies sont très variés et apparaissent dans l'enfance pour l'autisme, et à la fin de l’adolescence ou chez le jeune adulte pour la schizophrénie. Les patients présentent par exemple des déficits cognitifs (concentration, attention, mémoire de travail…) qui apparaissent dans l’enfance et auraient pour origine des défauts neurodéveloppementaux. Les traitements, qui restent pour l’heure purement symptomatiques, sont la plupart du temps peu efficaces. Il est donc crucial de comprendre l’origine de ces maladies, pour pouvoir ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques. Les synapses, connexions permettant aux neurones de communiquer entre eux, sont indispensables au bon fonctionnement du cerveau. Aujourd’hui, il est très bien établi que des déficits de connectivité neuronale sont présents dans le cortex chez des patients atteints d'autisme ou de schizophrénie. En revanche, en dépit de la présence évidente de déficits cérébelleux chez certains patients, l’implication du cervelet dans ces pathologies reste très peu étudiée. La présente étude nous permettra d’identifier des déficits synaptiques dans le réseau olivo-cérébelleux, suite à la modulation de l’activité neuronale au cours du développement du cervelet et nous aidera à mettre en évidence les protéines synaptiques potentiellement modulées par l’activité neuronale qui pourraient provoquer l’apparition de certaines maladies du cerveau lorsqu’elles sont dérégulées.
Procédures
Nous injecterons les souris en intra-péritonéal, 2 fois par jours pendant 5 jours. Chaque injection prend moins d'une minute. Le poids des souriceaux sera déterminé avant chaque injection afin d'adapter la dose à injecter. Les animaux sont maintenus immobiles en réalisant un pli de peau au niveau du dos, légère contention permettant l’insertion de l’aiguille très fine dans l'abdomen. Lors des injections, les souriceaux sont séparés seulement quelques minutes de leur mère afin de minimiser le stress de la mère et des souriceaux. Lorsque l'âge voulu est atteint, les souris seront toutes anesthésiées grâce à un gaz anesthésiant puis euthanasiées.
Impact sur les animaux
Chez la souris, la dose de produit injectée conduit à des tremblements aigus et temporaires des muscles axiaux et a un effet de type anxiolytique. Après chaque injection, les souris présentent une période de quelques heures d’hyperactivité qui semble conduire à une difficulté à se nourrir pendant cette période, avec un retard de prise de poids que nous avons établi à moins de 4% par rapport aux contrôles dans notre précédent projet autorisé par le CEEA. Lorsque les souris sont en âge de se nourire, de la poudre de croquette humidifiée est ajouté dans la cage pour favoriser le nourrisage. La manipulation des souriceaux peu parfois amener les femelles à rejeter leurs petits. Pour éviter cela, les cages ne sont pas changées pendant la période d’injection pour conserver au maximum les odeurs familières et rouler les souriceaux dans la sciure souillée au moment de les remettre avec leur mère. Aucun autre effet indésirable n’a été observé sur ces animaux dans notre précédent projet.
Devenir
Pour les études d’électrophysiologie, de biochimie ou d'histologie, les 563 animaux injectés seront euthanasiés en fin de procédures. Les 60 mères seront réutiliées à des fins d'élevage dans notre animalerie. Après les injections, les animaux resteront auprès de leur mère dans une cage enrichie (cotons et dôme en carton pour leur nid) jusqu’à l’âge du prélèvement.
Remplacement
La souris est devenue un modèle de choix pour l’étude des mécanismes moléculaires régulant les grandes fonctions biologiques. Elle permet l’analyse in vivo de ces mécanismes et des conséquences de leurs perturbations à différents niveaux : comportemental, physiologique et moléculaire. Elle permet également de créer des modèles d’étude des pathologies humaines. Certaines études fonctionnelles ne peuvent pas être réalisées chez les patients. De plus, il est important d’étudier les réseaux cérébelleux dans le contexte du cerveau puisque le cervelet est connecté à d’autres régions du cerveau dont le cortex qui est déjà connu pour son implication, par exemple, dans l'autisme ou la schizophrénie. Une telle étude ne serait donc pas possible en culture cellulaire et nécessite d’avoir recourt à des animaux vivants.
Réduction
Le projet est conçu pour limiter le nombre de souris au minimum dans la limite de ce qui est permis pour obtenir des résultats statistiquement et scientifiquement valides en prenant en compte la nécessité d’avoir plusieurs échantillons et de reproduire les résultats de manière indépendante pour éviter les différences dues à la variabilité biologique (sexe, caractéristiques génétiques…), à la variabilité environnementale (différence liée à la vie avec la mère). Après sevrage des souriceaux, les mères peuvent continuer à être utilisées pour de nouveaux accouplements dans notre animalerie.
Raffinement
Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable que pourraient ressentir les animaux. Notamment, des compléments environnementaux (dômes en carton, cotons, baguettes en bois) sont ajoutés afin de permettre à la femelle de créer un meilleur nid, de diminuer tout stress éventuel et d'user ses dents. De même, les injections intrapéritonéales chez le souriceau seront réalisées avec des aiguilles très fines afin de minimiser la douleur. Lors de ces injections, les souriceaux sont séparés de la mère afin de minimiser le stress de la mère et des souriceaux. Les cages ne sont pas changées pendant la période d’injection pour conserver au maximum les odeurs familières et rouler les souriceaux dans la sciure souillée au moment de les remettre avec leur mère afin d’éviter le rejet des souriceaux par la mère. Les animaux sont surveillés quotidiennement jusqu’à leur euthanasie. Lorsque les souris sont en âge de se nourrir seules, de la poudre de croquette humidifiée est ajouté dans la cage pour favoriser le nourrissage après l'injection qui provoque des tremblements temporaires. Nous utilisons une grille de suivi des animaux, les points limites sont mis en place pour éviter toute douleurs ou mal être des animaux.
Choix des espèces
Les souris sont devenues des modèles de choix pour l’étude des mécanismes moléculaires régulant les grandes fonctions biologiques. En effet, elles permettent l’analyse in vivo de ces mécanismes et des conséquences de leurs perturbations à différents niveaux : comportemental, physiologique et moléculaire. Elles permettent également de créer des modèles d’étude des pathologies humaines. De plus, le court cycle de reproduction chez la souris et sa petite taille permettent de maintenir ces animaux relativement facilement, tout en gardant une espèce assez proche de l’homme en terme de développement. La topographie du réseau olivo-cérébelleux s’établit en plusieurs étapes, dont une étape de raffinement qui est dépendante de l' activité et qui se produit entre P5 et P21. Le stade auquel l’activité joue un rôle majeur n’est pas connu et sera défini en réalisant plusieurs séries d’expériences avec plusieurs groupes de souris entre P5 et P21. Nous utiliserons également des souris plus agées (P45) comme contrôles, car à ce stade la carte topographique est établie et l'activité neuronale continue de contrôler la connectivité.
Utilisation de l’imagerie in vivo pour l’évaluation des candidats vaccins et l’amélioration des vaccins existants
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
Rats : 200
Hamsters dorés : 300
Autres rongeurs : 200
Lapins : 100
Cochons : 100
Macaques à longue queue : 80
8 980 animaux non-humains vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, une partie tuée et les autres réutilisés, adoptés ou renvoyés à l'élevage. L'effectif comprend 8 000 souris, 300 hamsters dorés, 200 rats, 200 autres rongeurs, 100 lapins, 100 porcs miniatures et 80 macaques à longue queue, infectés par des bactéries ou virus modifiés puis suivis par imagerie sous anesthésie. Le porteur indique que les produits sont "en général bien tolérés" et n'attend que des réactions locales, sans détailler les effets de l'infection sur chaque espèce. Cette société décrit un service d'évaluation de vaccins destiné aux dossiers réglementaires et affirme que l'imagerie in vitro ne peut se substituer aux "organismes entiers".
Objectifs
Ce projet a pour objectifs d’évaluer la qualité de nouveaux vaccins (exemple à la base de l’ARNm) ou de vaccins existants grâce à l’imagerie par fluorescence et/ou par bioluminescence, ou par mesure du poids moléculaire des lipides grâce au MALDI-MSI (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization as a Mass Spectrometry Imaging). Les critères d’évaluation sont : - La protection des vaccins développés en traitements préventifs et/ou thérapeutiques de maladies infectieuses grâce au suivi des pathogènes (bactéries/virus génétiquement modifiées) ou marqués par des molécules fluorescentes - La biodistribution et le mécanisme d’action des différentes molécules (ex : cellules, antigènes, adjuvants, anticorps, nanoparticules). Le suivi de certaines molécules d’intérêt par fluorescence est possible grâce à un fluorochrome (molécules assez petite) pouvant se greffer sur des molécules biologiques avec une perturbation nulle ou minimale de leurs propriétés physico-chimiques. Ainsi, la fluorescence peut par exemple être utilisée pour un suivi de biodistribution effectué par exemple sur des anticorps, des peptides, ou bien des acides nucléiques. L’imagerie par bioluminescence est une modalité faisant appel au génie génétique. Son principe repose sur l’intégration du gène codant pour la luciférase qui est une enzyme présente, à l’état naturel, dans des organismes tels que la luciole ou l’anémone de mer. Si ce gène est correctement intégré, les cellules vivantes exprimeront la luciférase qui, au contact de son substrat, la luciférine, donnera lieu à une réaction enzymatique émettrice de photons. Ces photons seront détectés par la caméra à haute sensibilité. Il sera alors possible de localiser et de quantifier in vivo les cellules ayant intégrées la construction luciférase.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus pour ce projet sont multiples : i) Sélection des antigènes et des adjuvants constituant le vaccin, ii) Évaluation de la biodistribution et des mécanismes d’action du vaccin, iii) Évaluation de la performance du vaccin au niveau préclinique avant les essais cliniques chez l’homme, iv) Support au développement des procédés des antigènes et des adjuvants. Ces différentes données précliniques ont pour but de supporter des essais cliniques et l’enregistrement du candidat vaccin ou l’amélioration de vaccins existants. Ces données sont généralement incluses aux différents dossiers réglementaires.
Procédures
En plus des paramètres mesurés par imagerie in vivo, des prélèvements de sang ou autres fluides biologiques (écouvillonnages nasaux, vaginaux, lavages broncho-alvéolaires, liquide cérébro-spinal, etc.) peuvent être réalisés afin d’étudier la virémie ou la bactériémie à des temps intermédiaires. Occasionnellement, différents organes et fluides physiologiques sont prélevés en fin d'étude après euthanasie des animaux pour déterminer des charges virales, bactériennes, parasitaires, l'expression d'antigènes in vivo, réponses immunes pré et post-infection etc. Occasionnellement, des animaux infectés peuvent être euthanasiés avant la fin de l'étude pour répondre à des questions particulières (imagerie ex vivo, réponses immunes précoces à l'infection contre une charge infectieuse, etc.) Concrètement, les animaux sont soumis à : - Des observations cliniques quotidiennes (observation de l’état général des animaux, des sites injectes, gonflements des ganglions, mobilité, etc.) - Des pesées quotidiennes ou hebdomadaires (contention pour mesurer l’évolution du poids corporel) - Des anesthésies volatiles quotidiennes ou hebdomadaires ou chimiques, - Des injections par différentes voies d’administration, intramusculaire de 1 à 3 injections à 1 à 4 semaines d’intervalle, intranasale de 1 à 3 injections à 1 à 4 semaines d’intervalle, sublinguale de 1 à 3 injections à 1 à 4 semaines d’intervalle, intraveineuse , intrapéritonéale - Des prélèvements de sang, d’organes (1 fois en prélèvement terminal), de fluides corporels (urine, salive), fèces etc. - Des euthanasies en phase terminale effectuées sous anesthésies par du personnel spécifiquement formé et selon la procédure en vigueur.
Impact sur les animaux
Le projet consiste en l’administration d’un ou plusieurs antigènes marqués ou non et si nécessaire d’un adjuvant marqué ou non. Les produits sont en général bien tolérés. Aucune réaction systémique n’est attendue. Quelques réactions locales (rougeur, nodule, abcès froid) sont possibles.
Devenir
Certaines procédures nécessitent de l’imagerie ex vivo sur des organes spécifiques ce qui implique une euthanasie des animaux. Les autres animaux peuvent être réutilisés, replacés ou adoptés.
Remplacement
Des essais in vitro sont également utilisés pour déterminer les seuils de détection in vitro et ex vivo des appareils d’imagerie, ils apportent des données complémentaires mais, à ce jour, ne peuvent se substituer aux essais in vivo sur des organismes entiers.
Réduction
Les schémas expérimentaux de ce projet feront l’objet d’une revue par des biostatisticiens, afin de calculer au plus juste le nombre d’animaux nécessaire. Il est à noter que l’imagerie in vivo permet un suivi longitudinal sur une durée définie de chaque animal qui est par conséquent son propre témoin, ce qui permet de réduire considérablement le nombre d’animaux par étude. En effet, en se basant sur les études effectuées au cours des 5 dernières années, maximum 1000 souris par an seront dédiées aux études de biodistribution et de criblage des molécules, antigènes etc. Environ 50 souris par groupe avec 2 à 4 groupes par étude et 4 à 5 études par an. De plus, maximum 600 souris par an seront utilisées pour les autres études, par exemple, mécanisme d’action et la formation et preuve de concept. Maximum 60 hamsters et 40 rats par an seront dédiés à des études avec des agents pathogènes. Pour ces études 4 à 6 animaux par groupe seront utilisés avec 3 à 4 groupes par étude. Maximum 2 à 3 études par an seront réalisées. Maximum 20 lapins par an seront utilisé pour des recherches spécifiques d’inflammation. Pour ces tests 3 à 5 animaux par groupe avec 1 à 2 groupes par étude sont prévus. Une à deux études par an seront effectuées pour ces recherches spécifiques. Concernant les miniporcs et les PNH, nous allons effectuer deux études maximums par an et par espèce. Ces études rares seront dédiées pour étudier les mécanismes d’action de certaines molécules spécifiques ainsi que l’immunogénicité de ces molécules chez ces espèces. Quatre à six animaux par groupe avec 1 ou 2 groupes par étude sont prévus.
Raffinement
Pour les procédures ou d’effets indésirables sont attendus, des points limites sont mis en place afin d’éviter aux animaux toutes atteintes potentielles à leur bien être tout au long des dites procédures. Les animaux sont hébergés en groupe dans des cages contenant des dispositifs d’enrichissement. Les locaux utilisés sont conformes aux standards réglementaires et suivis par un personnel spécifiquement formé. De plus, le raffinement réside dans deux caractéristiques principales. Tout d’abord, dans la majorité des cas, cette technique est non invasive puisque les souris sont simplement anesthésiées pendant une courte durée lors des acquisitions d’images et réchauffées grâce à un plateau chauffant afin d’éviter les risques d’hypothermie. D’autre part, la sensibilité des appareils d’imagerie in vivo permet de diminuer les doses de pathogènes administrées aux animaux par rapport aux modèles classiques.
Choix des espèces
L’imagerie préclinique in vivo est une technique initialement adaptée au petit animal (principalement la souris et les rats/hamster avec un poids inférieur à 200g). Ceci est dû à la détection difficile du signal lumineux dans les tissus profonds des animaux de plus grande taille. Néanmoins, de nouvelles techniques semi-invasives permettent d’étendre le champ d’application de l’imagerie in vivo à des espèces plus grandes (ex : lapin, miniporc, macaque) et font l’objet d’une procédure spécifique. Le modèle animal utilisé est sélectionné également en fonction des antigènes évalués, du type de réponse immune analysé et des données de la littérature ou des connaissances scientifiques. D’autre part, certaines espèces animales sont sensibles aux pathogènes d’intérêt et d’autres non. D’autres aspects techniques sont aussi à prendre en compte : taille des animaux (voie ou volume des administrations, volume de prélèvement…), disponibilité des outils immunologiques adaptés à l’espèce (cytokines, marqueurs cellulaires…). Les souris mutantes ou transgéniques constituent dans certains cas une opportunité unique pour étudier les mécanismes d’actions et les voies associées à la réponse immunitaire.
Evaluation des effets anti-nociceptifs d’une ou plusieurs molécules dans différents modèles de douleur viscérale associés à différents tests chez le rat .
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
4 775 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 2 500 et sévère pour 2 275, la plupart tués et 625 réutilisés. Une hypersensibilité viscérale est provoquée par chirurgie ou injection, puis les animaux subissent des distensions colorectales par ballonnet, des contentions en tunnel et l'administration de composés par de multiples voies. Le porteur indique que les rats en procédure sévère sont tués en raison d'une douleur persistante liée à leur pathologie. Il teste des candidats-médicaments contre la douleur viscérale et affirme que seule l'étude chez l'animal vigile permet de distinguer la douleur de la simple nociception.
Objectifs
La douleur, très mal soignée ou avec de nombreux effets secondaires,nécessite une recherche constante de nouvelles pharmacologies de références. Le but de ce projet est d’offrir la possibilité de tester des candidats-médicaments dans différents modèles de douleur viscérale. Ces modèles et tests sont couramment décrit dans la littérature et sont réalisés au sein de la communauté scientifique depuis plusieurs années. La douleur viscérale, est un problème socio-économique non résolu qui affecte jusqu’à 20% de la population adulte. Les pathologies associées à la douleur viscérale sont les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin telles que la maladie de Crohn ou la colite ulcéreuse ou encore les troubles gastro-intestinaux fonctionnels. Le syndrome de l’intestin irritable est caractérisé par des douleurs abdominales, de l’inconfort et des habitudes intestinales altérées. Il n’existe pas de marqueurs biologiques, seuls les symptômes permettent le diagnostic de cette pathologie. Par exemple, lors d’une distension colorectale, les patients présentent des seuils de sensibilité viscérale inférieurs à ceux observés chez des sujets sains. Ceci démontre une hypersensibilité viscérale. Un des modèles d’hypersensibilité viscérale couramment utilisé est l’induction d’une inflammation du côlon chez le rat. Cette inflammation est induite par administration chirurgicale d'un produit chimique dans le côlon proximal. Dans ce modèle, le critère d’évaluation de cette hypersensibilité viscérale est la diminution du seuil nociceptif mesuré durant une distension colo-rectale. Le stress pourrait également jouer un rôle dans l'apparition des symptômes. Environ un malade sur deux rapporte une relation chronologique entre la survenue d’un stress et l’apparition des premiers symptômes du syndrome de l'intestin irritable. Il a été démontré que des stimuli stressants pouvaient engendrer une diminution des seuils de distension colo-rectale chez les rats. D’autre part, un modèle de crampe abdominale est développé chez le rat. Le comportement est alors observé (apparition de crampes, torsion du corps) et quantifié. L'objectif du projet, est de proposer des modèles et tests pertinents qui permettront l'évaluation de l'efficacité de nouvelles molécules qui pourront être utilisée en clinique. Le but à long terme, étant de mieux traiter les patients souffrant de douleurs viscérales
Bénéfices attendus
Les molécules de référence dans le traitement de la douleur sont soit peu efficaces, soit avec de nombreux effets secondaires (Opiacés : Impact sur le transit, tolérance…). Le but de ce projet est de tester de nouveaux candidats médicaments dans des modèles de douleur reconnus. Ils seront comparés aux molécules de références testées en cliniques. Le bénéfice à long terme de ce projet est donc la mise au point de nouveaux composés antalgiques efficaces et avec peu d’effets secondaires destinés à l’évaluation en étude clinique puis à la mise à disposition des patients. A plus court terme, la publication de certains résultats encourageants sera envisagée.
Procédures
Les animaux sont soumis à une chirurgie ou une injection en intrapéritonéale afin d’induire les modèles d’hypersensibilité viscérale. Lors des tests les animaux sont osumis à une contention dans un tunnel (2 heures maximum), un isolement dans des compartiments (30minutes à 4 heures maximum). Lors de la distension, le test est stoppé dès réaction de l’animal dans l’objectif de déterminer les seuils de sensibilité viscérale et de mettre en évidence une amélioration suite au traitement pharmacologique (maximum 8 minutes par cycle). Les animaux recevront des traitements de composés (voie intrapéritonéale, orale, sous-cutanée, intramusculaire, intranasale, intra-rectale, intra-colonique, intraveineuse, intrathécale, intra-articulaire). Ces actes durent quelques secondes. Ils pourront être réalisés une seule fois, ou plusieurs fois par jour espacé de 0min (simultanément) à plusieurs heures (2-4-6-8-12) ou même de plusieurs jours (une fois par semaine, un jour sur deux) Ceci est dépendant de la pharmacocinétique du composé testé. De plus, les animaux pourront subir des prélèvements de sang en répétés ou en prélèvement unique afin de suivre la pharmacocinétique du composé testé. Les prélèvements de sang durent maximum 3 minutes et les animaux peuvent être sous anesthésie pendant 5minutes. Les prélèvements sont limités à un maximum par jour selon les recommandations en vigueur.
Impact sur les animaux
Les modèles décrits dans ce projet sont des modèles de douleur viscérale chronique (sévère) ou aigue (modérée) Les nuisances liées au développement de ces modèles sont : chirurgie, une contention dans un tunnel (nuisance modérée, 2heures maximum) ou injection intrapéritonéale afin d’induire le modèle, une perte de poids, une déshydratation ou une mauvaise cicatrisation (nuisances modérées). Les nuisances liées aux tests (notamment la distension colorectale) peuvent être : sensibilisation des tissus à la suite de l’introduction du ballonnet par la voie rectale (nuisance modérée) Les tests sont pratiqués sur animal en contention manuelle (nuisance légère 1min) ou dans une boîte en plexiglass avec une mobilité possible mais réduite (nuisance légère, durée maximale 4heures). Les tests peuvent être répétés plusieurs fois sur une même journée dans la limite de 6 points de cinétiques par jour. Ils peuvent être réalisés sur plusieurs jours. De plus, l’ensemble des animaux pourra subir des nuisances liées à l’administration unique ou répétée de composés (lésion superficielle, nuisance légère). Enfin, les animaux peuvent subir des prélèvements de sang en répétés ou unique afin de suivre la pharmacocinétique du composé (nuisance légère, 3min). Enfin, pour l’ensemble des procédures une mise à jeun est nécessaire (nuisance modérée, temps maximal 24h).
Devenir
Les animaux des procédures sévères sont mis à morts, ils ne peuvent être ni replacés ni réutilisés à cause de la douleur persistante liée à leur pathologie. Enfin bien que les animaux ne présentent plus d’effets post-test, nous ne connaissons pas les impacts potentiels que les administrations de composés en systémique ou non ont pu réaliser. Nous ne pouvons donc pas exclure un impact potentiel lors de la réutilisation des animaux. C’est pourquoi, dès la fin de la phase expérimentale, les animaux sont mis à mort par le personnel habilité. Dans le cas de la procédure 3 les animaux ne présentant pas de signe de souffrance pourront être réutilisés pour de la formation à des gestes techniques (traitements, tests par exemple).
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de candidats médicaments analgésiques. Les modèles in silico et in vitro permettent seulement d’étudier les effets de ces molécules sur la nociception, c’est-à-dire les mécanismes biologiques encodant les stimuli endommageant, ou susceptibles d’endommager les tissus. Selon sa définition , la douleur est une « expérience sensorielle et émotionnelle ». L’étude de potentiels traitements analgésiques doit donc être conduite dans des modèles restituant à la fois la composante sensorielle et émotionnelle et permettant l’analyse du comportement en plus de la physiologie; faute de quoi c’est la nociception et non la douleur qui est étudiée. L’étude des candidats médicaments analgésiques chez l’animal vigile reste la seule option pour démontrer l’efficacité sur la douleur avant le passage chez l’homme.
Réduction
Ces modèles sont couramment mis en place au sein de la communauté scientifique. De nombreuses données ont été générées afin de calculer au mieux le nombre d’animaux minimum nécessaire pour réaliser des analyses statistiques à postériori. Un système de surveillance de l’état général des animaux (grille de scoring) associé à des points limites est mis en place.
Raffinement
Les animaux ont accès dès leur arrivée dans l’animalerie à de l’enrichissement (tunnel en polycarbonate rouge transparent, briquettes en bois) et sont habitués à la salle d’expérimentation et aux tests (contention, enceinte…) afin de limiter leur stress. Lors des tests, des valeurs dites de cut-off sont fixées et correspondent à la stimulation maximale que peut subir l’animal. Ceci permet d’éviter les lésions dues au test ou les stimuli plus douloureux que nécessaire. Une anesthésie est appliquée avant chaque acte le nécessitant et le permettant : chirurgie, prélèvements, traitements particuliers. Une surveillance accrue des animaux est mise en place au vu de la thématique de la recherche. Des points limites sont clairement établis et des mesures sont mise en place suite aux inductions des modèles : soins post opératoires, aliments placés dans la cage de l’animal si difficultés à se nourrir, sous cutanée solution saline ou de Glucose en post chirurgie ou en cas de déshydratation. Un système de fiche de scoring est également mis en place afin de donner une vision objective des paramètres à suivre.
Choix des espèces
La question du remplacement des rongeurs par d’autres espèces est critique et suivie avec attention au sein du monde scientifique. Chez ces espèces la démonstration la capacité à ressentir la douleur telle que définie est récente et les modèles in vitro d’étude de la pharmacologie de la douleur à visée clinique ne sont pas encore développés. Le rat a été sélectionné pour ce projet en se basant sur plusieurs critères : a) sensibilité aux stimuli nociceptifs utilisés dans ce projet ; b) large caractérisation du comportement et des modèles dans la littérature ; c) efficacité dans cette espèce des médicaments utilisés chez l’homme pour soulager une douleur équivalente suggérant l’existence de mécanismes biologiques communs. Les animaux utilisés pour la procédure n°1 sont des animaux juvéniles/ péri-adolescents (4-6semaines ; 100-250g le jour d’induction du modèle). Ce stade a été choisi car il est adapté au screening de molècules, il permet d’éviter d’avoir des animaux âgés pour lesquels des pathologies liées à l’âge pourraient interférer avec nos résultats. Pour les procédures n°2 et 3 les animaux sont âgés d’environ de 7-8 semaines, stade adulte. Ce stade de développement a été choisi car le syndrome de l'intestin irritable touche des personnes adultes. De plus, les modèles ont été développés chez des sujets âgés.
Etude de la cardioprotection du coeur de souris diabétique de type 2 au cours de l’infarctus du myocarde
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
352 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent un diabète de type 2 d'origine génétique, reçoivent un médicament hypoglycémiant par gavage ou injection et passent des échographies cardiaques sous anesthésie, avant une injection létale pour prélever le cœur. Le porteur indique que les gavages, injections et prélèvements provoquent douleur et stress, aggravés par la pathologie diabétique. Il teste une molécule censée protéger le cœur diabétique lors d'un infarctus et affirme qu'aucune alternative non animale n'est disponible.
Objectifs
Nous avons récemment développé une molécule inhibant la mort cellulaire et protègeant le coeur au cours de l’attaque cardiaque (infarctus). Les expériences, pour faire cette preuve d’efficacité, ont été réalisées chez des souris saines. Cependant, parmi les patients qui font un infarctus, un grand nombre ont un diabète de type 2 qui est un facteur d’aggravation de l’infarctus augmentant leur risque de décès. De plus, en clinique humaine, les patients diabétiques de type 2 sont traités par un médicament diminuant le taux de glucose sanguin (traitement hypoglycémiant). Notre projet vise donc à explorer l’effet thérapeutique de notre molécule dans le cœur de souris diabétiques de type 2 ayant subi un infarctus et traitées par le médicament hypoglycémiant afin de mimer la situation clinique.
Bénéfices attendus
A ce jour, il n’existe aucune thérapie pharmacologique disponible pour protéger le cœur des patients diabétiques ayant un infarctus. Développer une molécule permettant de protéger le cœur diabétique est donc un enjeu majeur surtout en considérant l’épidémie de diabète qui sévit dans le monde actuellement. Ce type de traitement permettra de diminuer le risque de décès mais également de faire des économies sur les dépenses de santé publique. Nos résultats devraient également apporter une meilleure connaissance des aspects de la cardiopathie liée au diabète, en particulier les mécanismes de mort cellulaire.
Procédures
Un lot recevra le médicament hypoglycémiant par gavage (durée : 2 minutes; une fois /jour pendant 15 jours) et les souris seront pesées 4 fois. Le 2ème lot recevra 1 injection du médicament hypoglycémiant dans le péritoine (durée: 1 minute; une seule fois) et les souris seront pesées 3 fois. Les souris diabétiques ont un fonctionnement du coeur modifié sur le long terme. Cette pathologie sera évaluée par échographie sur animal anesthésié (durée: 35 min; une fois avant le gavage avec le médicament hypoglycémiant et une fois au jour 11 du traitement). Les animaux sont euthanasiés par une injection d’un composé létal dans la cavité abdominale pour prélever le cœur.
Impact sur les animaux
- douleurs et stress des gavages et injection intrapéritonéale (IP) - douleurs et stress des prélèvements sanguins - stress de l’anesthésie pour l’échographie - pathologie du diabète
Devenir
Euthanasie pour prélever le coeur qui sera analysé (coeur perfusé isolé).
Remplacement
Il n’y a pas d’alternatives non-animales disponibles pour ce projet. La cardioprotection par notre molécule se mesure sur cœur entier ex vivo¸ résultant à la fois d’effets vasculaires et musculaires après un traitement au long cours avec un hypoglycémiant (Metformine) pour mimer au mieux la situation in vivo.
Réduction
Pour limiter le nombre d’animaux, plusieurs mesures seront faites sur chaque individu : poids, mesure du taux de glucose sanguin (glycémie), échographie, analyse de la taille d’infarctus et de la mort cellulaire. Ensuite concernant les tests statistiques : prévision à priori du nombre de souris afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs (prévision réalisée grâce à un logiciel statistique).
Raffinement
Les protocoles ont été optimisés de manière à ce qu’ils soient les moins invasifs possibles, gavage et injection unique du médicament hypoglycémiant, échographie, puis une seule injection létale pour prélever le coeur et réaliser une expérience ex vivo (infarctus sur cœur isolé). Des points limites, une grille de score ont été établis afin de prendre en charge les nuisances. De plus, l'utilisation d'anesthésiques permet de limiter la souffrance des animaux pendant les procédures modérées. Raffinement des conditions d’hébergement : Les souris seront hébergées par 3 dans une cage et la litière sera changée fréquemment car ses souris urinent beaucoup. De plus le milieu des cages sera enrichi (maisons en carton) afin de réduire au minimum les nuisances (stress) et favoriser le bien-être des animaux. Concernant le modèle diabétique, il s'agit d'un diabète génétique spontané dans une lignée mutante à la place d'une souris alimentée durant une longue période avec une nourriture riche en graisse et riche en sucre pour induire le diabète.
Choix des espèces
L’espèce Mus musculus a été choisie pour utiliser un modèle de souris génétiquement modifiées reconnu internationalement comme modèle de diabète de type 2. Ce sont des souris déficientes pour le récepteur à la Leptine (hormone de la satiété). Ces souris développeront spontanément un diabète de type 2 par augmentation de la prise alimentaire (hyperphagie) présentant l'avantage de ne pas leur faire subir un régime riche en gras et en sucre sur plusieurs semaines. -Petite taille des animaux. -Les conditions d’hébergement compatibles avec celles proposées par l’Institut où seront réalisées les expériences. -l’Homme et la souris possèdent 99% de gènes similaires donc le choix de la souris est très avantageux pour une étude qui permet d’étudier les effets d’une molécule qui sera appliquée en clinique humaine. Les animaux seront utilisés à 9 semaines et 10 semaines selon les protocoles appliqués.
Elevage de lignées de souris génétiquement modifiées et biopsies pour leur génotypage
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
12 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, une partie tuée et environ 200 réutilisées. Chaque animal subit le prélèvement d'un millimètre de queue sous anesthésie locale pour son génotypage, avant le sevrage. Le porteur indique que les souris au génotype recherché rejoignent d'autres procédures, tandis que celles sans intérêt sont réutilisées ou tuées. Il reconnaît qu'aucune méthode de génotypage moins invasive, comme la PCR sur poils, ne donne à ce jour de résultats exploitables dans son établissement.
Objectifs
Le projet consiste à produire des souris génétiquement modifiées qui nécessitent un prélèvement d'un petit bout de la queue (1mm maximum) afin de connaitre leur génétique et savoir si elles seront utilisables pour les projet de recherche ou non.
Bénéfices attendus
Raffiner la production de souris génétiquement modifiées en prenant en charge la douleur ressentie lors de l'acte de biopsie pour génotypage.
Procédures
Identification et prélèvement d'un petit bout de la queue pour caractérisation des souris (moins d'une minute).
Impact sur les animaux
Lors de l'acte de prélèvement d'un bout de queue les animaux peuvent ressentir de la douleur. C'est pourquoi nous réalisons cet acte sous anesthésie locale.
Devenir
Les animaux présantant un génotype d'intérêt seront utilisés dans des procédures expérimentales de notre établissement en utilisation continue. Les animaux dont le génotype n’a pas d’intérêt pour les projets expérimentaux initiaux seront soit réutilisés pour d’autres projets expérimentaux quand c’est possible, soit euthanasiés.
Remplacement
Différentes stratégies de remplacement peuvent être appliquées par les chercheurs en amont de l'élevage des souris (expériences préparatoires in vitro, modélisations, veille scientifique) ou en aval des expérimentations (modélisation, raffinement des méthodes statistiques). Pour ce projet précis, il n'est pas possible de remplacer l'élevage de lignées de souris car ces animaux correspondent au coeur-même des projets des utilisateurs. Pour le moment, aucune autre méthode de biopsie pour génotypage moins invasive fonctionne. En effet, les protocoles de génotypage par PCR sur des poils ne nous ont toujours pas permis d'obtenir des résultats exploitables pour déterminer le génotype de nos animaux. Mais nous sommes toujours dans le recherche d'un nouveau protocole et nous ne manquerons pas de changer pour une méthode de biopsie moins invasive dès que possible.
Réduction
La réduction en pratique d'élevage nécessite une optimisation de l'âge des animaux géniteurs afin d'obtenir la plus grande descendance avec un minimum de cages d'accouplement. Elle nécessite aussi un choix approprié des génotypes des géniteurs (choix du mâle vs femelle; utilisation hétéro/homozygote, etc). La production sera rationnalisée par l’établissement de programmes d’élevage afin de ne pas produire plus d'animaux que nécessaire pour la production de lots expérimentaux.
Raffinement
Le raffinement des conditions d'élevage se traduit par un enrichissement des cages de production et de stabulation des animaux (batonnets de coton, maison en carton, mise à disposition de l'aliment et/ou de la source hydratée sur la litière si besoin , etc... adaptation du nombre d'animaux / cage). Immédiatement avant l'acte de prélèvement du bout de la queue (1mm maximum), la pulvérisation d'un anesthésique sera effectuée sur la queue de l'animal afin de réduire au maximum toute douleur pouvant être ressentie. Une infection au niveau du site de biopsie serait le point seul point limite pouvant être atteint. Il s'agit ici d'une anticipation d'une potentielle infection car le cas ne nous est jamais arrivé, bien que nous réalisons ce geste sur un grand nombre d'animaux. Si cela devait nous arriver, nous désinfecterions la plaie avec de la povidone iodée (Vétédine) dans un premier temps et si l'état de l'animal ne s'améliore pas alors nous euthanasierons l'animal afin de stopper ses souffrances.
Choix des espèces
La souris est un animal permettant un grande variété de techniques génétiques permettant d'établir des relations entre gènes, fonctions, comportements et pathologies. L'acte de biopsie d'un bout de queue est réalisé sur les nouveau nés, ceci afin de pouvoir les génotyper avant le sevrage dans une optique de réduction.
Effets des anti-héparanases sur le glycocalyx et la dysfonction endothéliale dans un modèle d’ischémie-reperfusion pulmonaire
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
75 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit une laparotomie, une thoracotomie et une heure d'ischémie du poumon sous ventilation mécanique, avec des réveils entre trois temps opératoires étalés sur trois jours, avant le prélèvement du cœur et des poumons. Le porteur indique attendre des douleurs thoraciques et abdominales contrôlées par la morphine et une réduction de la mobilité de deux à trois heures. Il teste l'effet d'anti-héparanases sur l'endothélium pulmonaire et affirme qu'il n'existe pas encore de biomarqueur permettant cette étude chez l'humain.
Objectifs
La transplantation pulmonaire est le traitement de l’insuffisance respiratoire terminale chez des patients hypersélectionnés. La dysfonction primaire de greffon est un syndrome de détresse respiratoire aigüe qui survient dans les premiers jours suivants la transplantation (≤ 72h le plus souvent) chez 10 à 30% des greffons et compromet de façon importante la survie du patient à court et long terme. L’ischémie-reperfusion pulmonaire associée à la dysfonction endothéliale est une des causes majeures de dysfonction primaire de greffon pulmonaire qui apparaît dans les 72 heures postopératoires. Le glycocalyx est un acteur essentiel dans l’ischémie-reperfusion pulmonaire et sa préservation est essentielle dans la qualité de la fonction du greffon, de par son rôle protecteur dans la physiologie de l’endothélium vasculaire dont il constitue la surface luminale. La limitation de l’apparition d’une dysfonction primaire du greffon en postopératoire représente un enjeu de santé publique puisqu’elle est responsable d’une morbi-mortalité élevée après une transplantation pulmonaire, notamment par rapport aux autres types de transplantation. En effet, la mortalité à 5 ans est proche de 50%.
Bénéfices attendus
Observer les effets potentiellement bénéfiques des anti-héparanases sur le glycocalyx et la fonction endothéliale pulmonaire dans un modèle d’ischémie-reperfusion pulmonaire
Procédures
Cela concernera 25 rats par groupe. La première intervention durera entre 2 et 3h. La deuxième intervention à H3 et la troisième intervention à J3 seront d’une durée d’environ 30 minutes à 1 heure. L’animal sera réveillé entre chaque temps expérimental et bénéficiera d’une injection sous-cutanée d'un puissant dérivé de la morphine en cas de présence du moindre signe de souffrance objectif. Première intervention = induction anesthésique IP, injection SC dérivé de la morphine, intubation oro-trachéale pour ventilation mécanique, mini-laparotomie médiane, prélèvement sanguin/remplissage/injection molécule du groupe dans la veine cave, thoracotomie postéro-latérale gauche, ischémie pulmonaire 1h, injection anesthésique locale, réveil. Deuxième et troisième interventions à H3 et J3 respectivement : induction anesthésique IP. Réouverture laparo pour prélèvements sanguins. Prélèvement coeur-poumons à J3
Impact sur les animaux
La douleur et le stress des animaux seront contrôlés selon la stratégie de raffinement décrite dans le projet. Dans notre modèle, nous attendons des douleurs thoraciques et abdominales à J0 de l’intervention pendant quelques heures, qui seront contrôlées par l’injection SC de buprénorphine à dose maximale avant le début de l’intervention ainsi que par injection de lidocaïne juste avant le réveil au niveau de la thoracotomie. Il existera de façon concomitante une réduction de la mobilité du rat pendant 2-3h après l’intervention et sera rapidement réversible. Nous attendons une reprise rapide en quelques heures de l’alimentation et de l’hydratation per os des rats en post-opératoire, et nous n’attendons pas de perte de poids. Nous utilisons une grille d’évaluation du bien-être animal afin de mettre en place des points limites, et nous utilisons plusieurs méthodes afin de diminuer les nuisances et les effets indésirables sur les animaux (décrit en détail dans la partie raffinement)
Devenir
Tous les rats inclus dans ce protocole seront mis à mort à la fin de l’étude dans l’objectif de récupérer les organes pour des analyses fonctionnelles, moléculaires et structurelles, ainsi que pour limiter l'éventuelle présence de souffrance aussi minime soit-elle.
Remplacement
Actuellement, il n'existe pas encore chez l'homme de biomarqueurs permettant de diagnostiquer ou d'étudier la dysfonction endothéliale dans l'ischémie-reperfusion pulmonaire. Afin d'étudier les phénomènes physiopathologiques qui entourent une ischémie-reperfusion pulmonaire, des modèles ont été créés chez le petit animal tel que le rat. Grâce à ce modèle chez le rat, nous allons avoir un vrai modèle d'ischémie-reperfusion simulant les conditions réelles chez l'homme afin d'étudier l'impact sur la dysfonction endothéliale et le glycocalyx et pouvoir étudier l'effets des anti-héparanases, une molécule novatrice, sur ces conséquences.
Réduction
Nous optons pour des études chez des espèces d'animaux élevées à des fins scientifiques, caractérisés par une faible variation génétique entre individus, ce qui conduit à une moindre variabilité de la réponse biologique ce qui réduit le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux nécessaire a été aussi calculé d'après les précédentes études sur la dysfonction endothéliale réalisées dans le laboratoire, à l'aide d'outils statistiques.
Raffinement
Pour raffiner ; les animaux sont hébergés aux normes requises et un enrichissement des cages est mis en place. De plus, nous réaliserons un contrôle rigoureux de l’analgésie et de l’anesthésie : L’induction anesthésique sera réalisée par une injection intrapéritonéale d'anesthésiants prévus à cet effet. L’entretien de l’anesthésie sera réalisé avec une injection systématique d'anesthésiant toutes les 30 minutes. Une application d'anesthésiant local en gel sera réalisée sur la peau avant l’incision. Avant l’incision tous rats bénéficieront d’une analgésie complémentaire par un fort analgésiant par voie sous-cutanée, répétée toutes les 12 heures. Stratégie de limitation de l’angoisse : Les interventions auront lieu 1 à 2 semaines après l’arrivée des animaux au sein de l’animalerie afin que les animaux aient un temps d’adaptation et de repos suite au voyage. Les interventions chirurgicales et prélèvements auront lieu dans une pièce isolée, calme, avec un seul expérimentateur présent afin de limiter les mouvements et les sources de bruit. Les signes cliniques suivant seront ainsi observés pendant la durée de l’expérimentation : respiration pénible, bruyante et faible, poils hérissés, dos arrondis, animal recroquevillé, prostration avec réduction importante de l’activité motrice. En cas d’apparition d’un seul de ces signes cliniques qui détermine un point d’arrêt anticipé, l’animal sera exclu de l’étude et mis à mort pour éviter toute souffrance supplémentaire s'il n'existe aucun moyen de soulager efficacement et rapidement l'animal. . Nous utilisons une grille d’évaluation du bien-être animal basé sur la perte de poids, le comportement et l’état général afin de mettre en place des points limites, et nous utilisons plusieurs méthodes afin de diminuer les nuisances et les effets indésirables sur les animaux. De plus, les animaux seront manipulés régulièrement par les mêmes expérimentateurs pour tendre à une habituation. Tout au long de l’étude, les animaux seront nourris ad libitum et hébergé au nombre maximum de 3 animaux par cages avec de l’enrichissement. Le réveil se fera dans des cages individuelles.
Choix des espèces
Les premiers modèles ont été developpés chez le rat. Le rat Wistar est une espèce largement utilisé dans les expériences animales Faible coût pour cette espèce. Les études antérieures dans le laboratoire analysant la dysfonction endothéliale sur le rat ont dévelopé des marqueurs de dysfonction. De plus, nous disposons au sein de notre animalerie d'une structure permettant l'hébergement et le confort des animaux. Les animaux utilisés pour l’étude seront des rats Wistar mâles âgés de 9 semaines et qui pèseront entre 400 et 500g. Nous choisissons des rats de ce poids minimum afin d'obtenir un volume sanguin suffisant pour pouvoir réaliser tous les analyses sanguines nécessaires dans notre projet.
Etude des mécanismes de rejet après tranplantation d’organe
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
1 596 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des greffes de cœur, de peau ou d'îlots pancréatiques sous anesthésie, l'implantation d'une pompe diffusant des traitements et jusqu'à neuf prélèvements sanguins, certaines recevant une induction chimique de diabète. Le porteur indique que les chirurgies entraînent gêne et douleur au réveil malgré les analgésiques et des difficultés de mouvement à la cicatrisation. Il étudie le rôle des cellules Natural Killer dans le rejet de greffe et affirme que ce phénomène ne peut être reproduit in vitro.
Objectifs
La transplantation d’organe consiste à remplacer un organe non fonctionnel par un organe provenant d’un donneur de la même espèce mais génétiquement différent. Un des principaux risques après une transplantation est le rejet de l’organe greffé. Celui-ci résulte de la capacité du système immunitaire du receveur à discriminer comme étranger le tissu transplanté. Actuellement, on considère que les lésions de rejet sont principalement le fait des lymphocytes T et des anticorps dirigés contre le greffon (réponse du système adaptatif). Récemment des preuves expérimentales ont montré que le rejet pouvait aussi être induit par l’activation d’une autre population cellulaire : les cellules Natural Killer (NK). Ce type de rejet étant nouveau, les mécanismes exacts ainsi que l’impact des différents immunosuppresseurs utilisés habituellement en transplantation pour prévenir le rejet est inconnu sur ce type de rejet.Les cibles cellulaires et moléculaires du greffon reconnues par le système immunitaire varient selon le type de rejet : cellules des vaisseaux sanguins du greffon ou cellules plus en profondeur du tissu transplanté par exemple. Les objectifs de ce projet qui sera mené chez la souris sont : i) d’acquérir des données nouvelles pour mieux comprendre le rôle des différents effecteurs immunitaires et l’interaction avec leurs cibles cellulaires et ou moléculaires, ii) tester des molécules pour pouvoir retarder le développement des lésions de rejet et prolonger la durée de vie des greffons. Il s’agit d’un objectif prioritaire en transplantation compte tenu de la pénurie d’organe. Ceci pourrait ainsi permettre d’améliorer l’accès à la greffe pour les patients qui le nécessitent. Différents types de greffe (dites vascularisés ou non vascularisés) seront nécessaires pour mettre en évidence les mécanismes impliqués (en termes de cibles cellulaires), ainsi des souches de souris transgéniques différentes afin de mimer les différences moléculaires entre donneurs et receveurs. Ce projet sera découpé en 6 procédures : en effet, chaque type de modèle de greffe (cardiaque, cutané ou pancréatique) sera étudié en vu des objectifs 1 et 2 suivants : 1) La caractérisation des mécanismes moléculaire et cellulaires impliqués dans les rejets de greffon cardiaque, cutané ou d’ilots et 2) la validation de molécules pour évaluer leurs capacités à réduire le risque de rejet de greffon cardiaque, cutané ou d’ilots sur une durée de 8 Semaines maximum. 1596 souris maximum
Bénéfices attendus
Une meilleure compréhension des mécanismes impliquant le système plaquettaire dans ce type de rejet ainsi que la validation de certaines molécules candidates nous permettraient de proposer de nouveaux traitements pour améliorer la survie du greffon aux patients transplantés
Procédures
Souris donneuses de greffon cardiaque : prélèvement du coeur sous anesthésie (injection dans le ventre) + analgésie morphinique - durée 1h Souris receveuses de greffon cardiaque : greffe cardiaque sous anesthésie (injection dans le ventre 30 sec) + analgésie morphinique (4 injections sous la peau 30 sec) – opération au niveau du cou (total opération 2h) Implantation sous la peau d’une pompe diffusant les traitements (sous anesthésie - injection dans le ventre) 2 fois maximum (total opération 30 minutes). Maximum 9 prélèvements sanguins (max 30 secondes) Expérience de maximum 49 jours Souris receveuses de greffon de pancreas : Injection dans le ventre pour une induction chimique de diabète (maximum 30 secondes) Greffe des cellules de pancréas sous anesthésie (injection dans le ventre 30 sec) + analgésie morphinique (4 injections sous la peau 30 sec) – au niveau du rein - Incision au niveau du flanc latéral. (total opération 2h). Implantation sous la peau d’une pompe diffusant les traitements (sous anesthésie - injection dans le ventre) 2 fois maximum (total opération 30 minutes). Maximum 9 prélèvements sanguins (max 30 secondes) + 2 avant la greffe – Expérience de maximum 49 jours Souris receveuses de greffon cutané : Greffe d’un morceau de peau sous anesthésie (injection dans le ventre) + analgésie morphinique (4 injections sous la peau 30 sec) au niveau du flanc (total opération 30-40 min). Implantation sous la peau d’une pompe diffusant les traitements (sous anesthésie - injection dans le ventre) 2 fois maximum (total opération 30 minutes). Maximum 9 prélèvements sanguins (max 30 secondes) + 2 avant la greffe Expérience de maximum 49 jours
Impact sur les animaux
Les injections intrapéritonéales et les prélèvements de sang (sinus, submandibulaire ou queue) sont susceptibles d’entrainer un stress (contention) et une légère douleur. La greffe de cœur, d’ilots ou de peau sont des procédures bien documentées, les potentiels effets indésirables sont associés la plupart du temps à des soucis d’anesthésie lors de la chirurgie ou de suture des vaisseaux. Chacun des 3 types de chirurgie entrainera une gêne lors du réveil et douleur malgré les analgésiques) et risque d’engendrer des difficultés de mouvements ou des démangeaisons lors de la cicatrisation. De manière générale, ces procédures peuvent donner lieu à des troubles des fonctions corporelles ou de l’état général des animaux.
Devenir
Les souris seront mises à mort en fin de procédure avec un prélèvement de sang et récupération des différents organes lymphoïdes et des greffons. Ces prélèvements d’organes et de sang sont nécessaires aux analyses biochimiques/biologiques.
Remplacement
Ce projet ne peut être mené sans l’utilisation d’animaux car le système immunitaire est un système biologique extrêmement complexe, et les interactions cellulaires qui aboutissent au rejet ne peuvent avoir lieu qu’au sein de l’architecture d’un ganglion ou de la rate, ce qui est impossible à reproduire in vitro. Le rejet d’organe ne peut pas être reproduit in vitro
Réduction
Des calculs d’effectifs ont permis d’établir le nombre minimal d’animaux par groupe pour que les résultats soient significatifs à 10 animaux par groupe. Nous tenons compte du taux de réussite de 80-90% pour les greffes cardiaques soit 12 initial, et la mise en place du diabète, taux de réussite 70% soit 14 initial pour obtenir 10 souris par groupe au final. Les groupes comporteront donc entre 10 et 14 individus au maximum afin d’avoir au moins 10 animaux analysables par groupe compte tenu des taux de réussite de chaque chirurgie. Au total, le nombre d’animaux nécessaires à ce projet est de 1596 souris (mus musculus).
Raffinement
Le bien-être des animaux sera analysé et pris en compte tout au long du protocole avec un suivi adapté en termes de fréquence et de détermination des points limites (poids, comportement aspect general). Différents traitements seront administrés pour réduire la douleur (analgésie) et les souris seront sous anésthésie générale pour les chirurgies Analgésie local pour les prélèvements sanguins. Pesée hebdomadaire, et fréquence augmentée à 2 fois par semaine si perte de poids > 10%. Suivi post op à 4-6h post opération, J1 et J2 Aucune chirurgie le jeudi et vendredi pour un suivi à J1 et J2. Mesure de la glycémie pour mesurer la prise de greffe Les animaux seront maintenus en groupes sociaux pour éviter le stress lié à l'isolement (ils ne seront isolés que s’ils présentent une lésion au niveau de la suture de la peau post chirurgie) -anésthésie locale avant l’incision sur la zone à opérer (pompe et greffon) et sur la zone avant suture -antiobiotique durant les 24h post chirurgie La perte du greffon, ilots, peau ou cœur, ne peut entrainer la mort de l’animal en soi. L’utilisation de la pompe permettra de traiter les souris quotidiennement sans avoir recours à des injections IP quotidienne. Les souris sont placées en armoire chauffante après la chirurgie durant 4-6hpuis remise dans leur cage sur portoir Les gestes techniques chirurgicaux sont réalisés par un chirurgien (chirurgie humaine) formée à la chirurgie sur rongeur et ces gestes précis en particulier. Les chirurgies sont réalisées sous hote avec des loupes binoculaires avec du materiel steril En cas d'infection, un traitement antibiotique sera administré. Des points limites précis et prédictifs ont été définis de manière à éviter toute souffrance inutile des animaux.
Choix des espèces
Du fait de leur similarité avec l’homme en termes de génétique, d’anatomie et de physiologie, la souris représente un modèle expérimental privilégié pour l’étude de la réponse immunitaire allogénique, c’est-à-dire entre souris de fond génétique différent. Notre projet nécessite le recours à des animaux génétiquement modifiés précédemment développés et disponibles présentant des défauts immunitaires plus ou moins importants. De tels modèles n'existent que dans l'espèce souris. Des souris âgées de plus de 8 semaines seront utilisées, afin qu'elles aient un système immunitaire mature.
Nouvelles molécules impliquées dans le dialogue entre intestin et son microbiote : rôles dans le maintien de la santé intestinale
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère pour 680 d'entre elles et léger pour 220. Une colite est provoquée par du dextran sulfate de sodium ou des injections d'anticorps, puis les animaux, y compris des souriceaux, reçoivent des gavages répétés de micro-ARN, d'anti-inflammatoire ou de microbiote. Le porteur indique que la colite entraîne diarrhées et perte de poids et que les gavages stressent les animaux, notamment les nouveau-nés. Il affirme que la dynamique des maladies inflammatoires de l'intestin ne peut être imitée in vitro ou in silico.
Objectifs
Le côlon est un organe qui héberge une communauté complexe de microorganismes que l’on appelle microbiote. Des modifications du microbiote, sont observées et impliquées dans de nombreuses pathologies et notamment les MICI (Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin qui comprennent la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique), caractérisées par une inflammation chronique de la paroi du tube digestif. C’est pourquoi, un dialogue permanent entre l’hôte et le microbiote est essentiel dans le maintien de l’équilibre fonctionnel de l’intestin (homéostasie intestinale). En plus de la présence du microbiote, le contenu intestinal recèle d’autres éléments dont les micro-ARN (ou miARN, petites molécules présentes dans les cellules et qui freinent l’expression des gènes). Les miARN circulants (sanguins) ont récemment été étudiés pour leur rôle de marqueur de l’inflammation dans la colite expérimentale chez la souris et dans les MICI chez l’homme. De plus, des données nouvelles de la littérature scientifique ont mis en évidence que les niveaux d’accumulation de certains miARN contenus dans les selles (miARN fécaux) étaient affectés par la présence et la nature du microbiote. Le rôle déjà établi des miARN au niveau de nombreuses fonctions physiologiques dans l’organisme et la proximité des miARN fécaux avec les bactéries du microbiote laissent penser que les miARN et les bactéries du tube digestif peuvent interagir et influencer l’état de santé intestinal. L’objectif principal de notre projet est d’étudier le rôle des miARN présents dans le contenu intestinal, leur rôle comme intermédiaire entre l’hôte et le microbiote et leur potentiel anti-inflammatoire. Nous chercherons à comprendre le dialogue entre miARN et microbiote et les rôles respectifs de chacun dans l’inflammation intestinale.
Bénéfices attendus
Nos travaux contribueront à la compréhension des mécanismes par lesquelles les miARN et le microbiote interagissent et nous permettrons de mettre en évidence de nouveaux outils thérapeutiques, les miARN, pour le traitement des maladies humaines associées à l'inflammation chronique, en particulier les maladies inflammatoires de l'intestin (MICI).
Procédures
Les animaux seront soumis à une ou plusieurs de ces interventions ayant pour but soit de créer de la colite chez les souris soit de la traiter, ou alors de suivre l’évolution de la colite et du microbiote chez chaque animal : - Les fèces seront récoltés en disposant les animaux dans des petites boîtes en plastique pendant 30 à 60 min. Après que les animaux aient fait naturellement leurs besoins, ils seront replacés dans leur cage d’origine. - Un ou des gavages (selon la procédure : de miARN, de l’anti-inflammatoire 5-ASA ou de microbiote) seront effectués à l’aide d’une sonde souple non traumatique sur animal éveillé soit une fois par semaine pendant 10 semaines soit une fois par jour pendant 1 semaine. Chaque gavage dure environ 10 secondes. - 1 gavage par jour sera effectué à l’aide d’une sonde souple non traumatique sur des souriceaux de 7 à 10 jours. Chaque gavage dure environ 20 secondes. - Des injections d’anticorps anti-IL10, dans le but d’induire une colite, seront réalisées dans l’abdomen (4 injections au total : 1 par semaine pendant 4 semaines) des animaux éveillés. Chaque injection dure environ 10 secondes. - Les prélèvements de sang seront réalisés uniquement sur des animaux anesthésiés juste d’être euthanasié soit un seul prélèvement par animal. Ce geste dure environ 1 minute.
Impact sur les animaux
Des nuisances seront générées chez les animaux soumis à un traitement Dextran Sodium Sulfate, qui induit la colite. Les effets de la colite chez la souris sont l’apparition de diarrhées et une perte de poids. Il est aussi reconnu que les gavages utilisés par ailleurs dans certaines procédures, peuvent induire un stress chez les animaux. Le gavage des souriceaux est reconnu comme pouvant occasionner un stress supplémentaire aux souriceaux lié à la manipulation et la contention de nouveaux nés.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l'issue de chaque procédure afin de collecter les organes en post-mortem pour analyse ultérieure.
Remplacement
Les modèles cellulaires ou la modélisation informatique ne permet pas d’imiter la dynamique de la progression des MICI. Les conséquences liées à la maladie peuvent être validées uniquement dans des modèles qui présentent la véritable pathologie dans des conditions identiques/similaires à celles qui surviennent chez l'homme ou l’animal. Les expériences exploratoires ne peuvent pas être réalisées directement sur les sujets humains en raison des méthodes et procédures invasives et de l'incertitude des résultats. L’utilisation de l’animal permet d'analyser les mécanismes des MICI au niveau de l'organe et des cellules, de tester l'efficacité des traitements et d’évaluer leur risque relatif avant qu'ils ne soient testés sur des sujets humains. Comprendre comment les miARNs peuvent moduler l'inflammation intestinale permettra à terme le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques au bénéfice des patients atteints de MICI.
Réduction
Ces travaux s’inscrivent dans la continuité d’un projet de recherche et de travaux précédemment publiés. Des précedents travaux ainsi que des expérimentations préliminaires, ont donc permis d’établir un nombre optimal d’animaux par groupe et réduit au maximum pour obtenir des résultats interprétables. De plus, l’utilisation d’un logiciel, a permis de définir le nombre d’animaux nécessaires et suffisants pour avoir des résultats reproductibles et significatifs. Les données obtenues seront traitées en utilisant des tests statistiques.
Raffinement
Les souris seront surveillées quotidiennement pendant toute la durée du protocole par du personnel compétent. Les mesures nécessaires à la prise en charge de la douleur potentielle des souris avec colite seront adaptées en fonction de l’état des animaux (analgésie et suivi des signes de mieux/mal être avant et après le traitement). Les effets du traitement seront contrôlés par une surveillance selon un score standardisé. Ce score (prenant en compte la variation du poids de l’animal, son apparence externe, les signes cliniques mesurables et le changement de comportement) correspond à une grille d’évaluation clinique permettant de prendre des mesures progressives (points limites) en fonction de l’élévation du score (augmentation de la fréquence des observations, administration de solution saline pour lutter contre la déshydratation, administration d'antalgiques pouvant être renouvelé toutes les 12h, euthanasie précoce). Ainsi, le protocole expérimental pourra être atténué voire suspendu en cas de mauvaise tolérance ou de souffrance des animaux. L’environnement des animaux sera enrichi afin de leur permettre d’avoir un comportement le plus naturel possible (cotons, maisons, cycle jour/nuit).
Choix des espèces
Des souris qui présentent des colites ou des lésions similaires aux MICI humaines de façon à imiter le développement, les symptômes et les complications de la maladie sont indispensables pour la réalisation de ce projet. Notons que les miARNs sont les mêmes chez la souris et l'Homme et que des travaux antérieurs de la littérature scientifique ont validé l'utilisation de souris comme modèle animal pour l'étude de la colite, et l'inflammation. Enfin, de nombreux réactifs et outils de recherche, nécessaires à cette recherche, sont spécifiques et ont été validés dans cette espèce. Les souris utilisées pour les expériences auront de 7 jours à 112 jours de vie. Ceci correspond à l’âge optimal pour obtenir la meilleure reproductibilité de la colite et a été décidé en fonction de travaux antérieurs utilisant des modèles de colite murine.
Enseignement de la toxicologie expérimentale : exemple du Test de toxicité Embryo-Fœtale du Bleu Tripan
- Formation professionnelle
162 rates vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la plupart tuées pour prélever les fœtus in utero et une trentaine réutilisées. Les femelles sont accouplées, soumises à des frottis vaginaux puis à trois injections de bleu trypan, un colorant connu pour ses effets sur le développement embryonnaire. Le porteur indique que la substance colore les téguments en bleu sans effet manifeste sur la mère et que la manipulation par des étudiants inexpérimentés peut stresser les animaux. Il présente ce test réglementaire comme un exercice de formation d'agronomes et affirme qu'il ne peut être remplacé par une méthode sans animaux.
Objectifs
Pour initier les étudiants (formation professionalisante en agronomie bac+3) aux procédures expérimentales permettant de tester les effets toxiques et écotoxiques des molécules chimiques, nous avons décidé de réaliser un test de toxicité embryo-foetale tel que décrit dans les directives de l’OCDE (essai n° 414 : « Test de tératogénicité d’une substance ») et repris dans le règlement 2023/464 du 3 mars 2023 de la commission européenne sous la dénomination « test B.31 ». Ce test a été choisi car il reste peu invasif et ne présente pas d’effet délétère sur la femelle à la dose testée. D’un point de vue pédagogique, outre la mise en place des différentes procédures détaillées dans ce document, ce travail permettra aux étudiants de mettre en œuvre des techniques zootechniques de base (contrôle du cycle des femelles et des accouplements, suivi quotidien et entretien des animaux) et de Bonne Pratique de Laboratoire dans le respect des règles éthiques et enseignées par ailleurs. Afin de valoriser au mieux l’utilisation des animaux, en plus des compétences/connaissances techniques acquises, nous utiliserons ce test réglementaire pour faire le lien avec d’autres enseignements plus théoriques et discuter par exemple de questions de biologie de la reproduction et du développement. De plus, les données générées lors de ce travail pratique seront utilisées pour évaluer les connaissances en analyse de données acquises par les étudiants au cours de leur formation. Enfin, ces tests réglementaires de toxicité embryo-fœtale sont contextualisés dans la nécessité de s’assurer, avant obtention de mise sur le marché de produits phytopharmaceutiques, de leur innocuité vis-à-vis de la santé des populations humaines et de la nécessité d’avoir recours à des méthodes de protection des cultures moins impactantes sur l’environnement et la santé, un enjeux sociétal majeur auquel devront répondre les étudiants que nous formons.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus en terme de formation, pour nos futurs techniciens, sont principalement une amélioration de leur compétences techniques par la réalisation de gestes variés en milieu contrôlé (travail en animalerie conventionnel avec le respect des procédures et règles sanitaires ; mise en œuvre de Bonnes Pratiques de Laboratoire ; mise en œuvre des enseignements du suivi du bien-être des animaux; apprentissage de nouveaux gestes techniques). Toutefois, ce travail sera aussi l’occasion d’introduire certains concepts et de faire le lien avec de nombreux autres enseignements : importance mais aussi limites des tests sur animaux dans la cadre de tests de toxicité, notamment dans le contexte de mise au point de nouveaux produits phytopharmaceutiques ; analyses statistiques de données complexes à l’aide d’outils informatiques dédiés ; rappel de biologie de la reproduction et du développement.
Procédures
Les animaux seront mis en accouplement jusqu’à 5 jours successifs et seront soumis à la réalisation d’un frotti vaginal (entre 1 et 5 pour une durée maximale de réalisation d’une minute). Les animaux retenus subiront ensuite 3 injections successives (voie intrapéritonéale, sous-cutanée, per os ou intra rectale) de la mocécule testée. Chaque administration devrait durée moins d’une minute.
Impact sur les animaux
La substance testée est une molécule modèle, un colorant utilisé en histo-cytologie, connue pour avoir des effets sur le développement embryonnaire mais aucun effet manifeste chez la mère à la dose utilisée. La seule manifestation évidente est une coloration bleue des téguments. La douleur anticipée de l'injection est modérée et de courte durée.Il est cependant à noter, que les animaux pourraient être soumi à du stress lié à la manipulation par des étudiants qualifiés mais encore inexpérimentés.
Devenir
Tous les animaux intégrés dans la procédure seront mis à mort car il est nécessaire de prélever les foetus in utéro afin de ne pas sous-estimer le nombre de foetus atteints d'anomalie congénétale. Néanmoins, il est toujours possible que certains femelles ne se soient pas accouplées (estimation de 5 à 6 femelles par année) et n’aient pas été intégrées dans la procédure. Le cas échéant, elles seront mises à disposition d’autres procédures autorisées au sein de notre structure d’enseignement ou permettront de tester une voie d’administration moins invasive que l’intrapéritonéale.
Remplacement
Les tests de toxicité sur le développement sont destinés à livrer des informations générales concernant les effets de l'exposition prénatale d'une femelle gravide à une substance chimique, sur elle-même et sur l'organisme en développement qu'elle porte en elle. Par conséquent, ils ne peuvent être remplacés par d’autres méthodes ne faisant pas appel à des modèles animaux.D’un point de vue pédagogique, outre la mise en place des différentes procédures détaillées dans ce document, ce travail permettra aux étudiants de mettre en œuvre des techniques zootechniques de base (contrôle du cycle des femelles et des accouplements, suivi quotidien et entretien des animaux) et de Bonne Pratique de Laboratoire dans le respect des règles éthiques enseignées par ailleurs. Afin de valoriser au mieux l’utilisation des animaux, en plus des compétences/connaissances techniques acquises, nous utiliserons ce test réglementaire pour faire le lien avec d’autres enseignements plus théoriques et discuter par exemple de questions de biologie de la reproduction et du développement mais aussi de la nécessité d’avoir recours à des méthodes de protection des cultures moins impactantes sur l’environnement et la santé, un enjeux sociétal majeur auquel devront répondre les futurs agronomes que nous formons.
Réduction
Un test de toxicité embryo-fœtal nécessite le recours à deux espèces de mammifères (une espèce de rongeur et une espèce non-rongeur) et 4 à 5 lots (3 doses différentes et 1 ou deux témoins -conditions zootechniques et le cas échéant, véhicule de la substance testée-) d’un minimum de 20 femelles gravides chacun. Compte tenu de la visée pédagogique de ce travail, le nombre d’animaux sera réduit au strict minimum. Seul le lot correspondant à la dose d’intérêt chez une espèce, le rat, sera réalisé. Aussi, metterons nous 30 femelles en reproduction pour avoir au moins 25 femelles gravides par année (soit 30*5=150 femelles) ce qui correspond, d'une part aux exigences du test réglementaire et d'autres part aux effectifs de nos promotions (50 étudiants, 1 rat par binôme). Les résultats obtenus seront comparés à des données simulés informatiquement à partir de données de la littérature (les fréquences spontanées des principales anomalies congénitales et des résorptions sont en effet connues chez le rat). Dans un souci de raffinement, 12 rats supplémentaires seront utilisée pour tester une voie d’administration moins invasive. Soit 162 animaux sur 5 ans.
Raffinement
Le test de toxicité sera simplifié par rapport aux directives réglementaires pour réduire le nombre d’animaux utilisés. Les étudiants participants ont au préalable obtenu la qualification à l’expérimentation animale pour Applicateur et ont acquis un certain nombre de gestes techniques. La substance testée est une molécule modèle, un colorant utilisé en histo-cytologie, connue pour avoir des effets sur le développement embryonnaire mais aucun effet manifeste chez la mère à la dose utilisée. Le suivi est réalisé conjointement par les étudiants, le personnel de l’animalerie et le personnel enseignant à l’aide d’une grille d’évaluation mise en place par la Structure en charge du Bien-Etre Animal de notre structure. Chaque manipulation conduit à l’attribution d’une amande donnée par l’étudiant ayant réalisé l’intervention à titre de renforcement positif. Nous proposons de mettre en place une étude pilote permettant de définir une voie d’administration la moins invasive possible. Les animaux sont hébergés par groupe de 3 dans des conditions conforment à la réglementation avec un enrichissement varié et adapté ainsi qu'un contrôle quotidien.
Choix des espèces
Le rat est le modèle le plus utilisé après le lapin dans les études de toxicité embryo-fœtale. La forte prolificité de cette souche permet avec un nombre réduit de femelles d’obtenir une grande quantité d’information sur les fœtus. En outre la biologie de la reproduction de cette souche est parfaitement caractérisée facilitant la mise en place de la procédure mais aussi la simulation informatique du lot témoin (les fréquences spontanées des résorptions et des principales anomalies congénitales sont en effet connues). Seules des femelles primipares seront utilisées afin de ne pas confondre les résorptions précoces imputables au traitement avec des traces d’implantation d’évènements de reproduction ultérieurs. Les femelles devront atteindre un poids d’environ 300g pour augmenter les chances de fécondation lors des accouplements.
Modulation du microbiote digestif : effets sur la motivation alimentaire et la réactivité neuronale chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
124 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie stéréotaxique avec injection intracérébrale, une déplétion du microbiote par un cocktail d'antibiotiques et d'antifongiques dans l'eau pendant douze jours, puis un test de motivation alimentaire. Le porteur indique que la chirurgie peut causer douleur, infection et perte de poids et que le traitement peut induire une inflammation intestinale modérée. Il présente cette étude comme une "preuve de concept" préalable à des travaux chez l'humain et affirme qu'aucun modèle in vitro ne permet ces mesures neuro-comportementales.
Objectifs
L'appétit, la satiété et les préférences alimentaires sont influencés par le microbiote intestinal. Plusieurs études récentes indiquent que l'absence ou l'appauvrissement du microbiote intestinal augmente chez la souris la consommation d'aliments appétents. Néanmoins, les substrats et mécanismes neurobiologiques sous-jacents ne sont pas bien connus. Dans cette étude nous nous intéressons à l'insula, une structure cérébrale responsable de la perception du goût et des saveurs qui reçoit également des signaux viscéraux permettant l'interoception (perception de l'état interne). Les résultats issus de ce projet nous permettrons de tester l'hypothèse selon laquelle le microbiote et les signaux associés influencent le comportement alimentaire à travers des mécanismes dépendant de l'activité de l'insula.
Bénéfices attendus
Les données issues de ce projet contribueront à une meilleure compréhension des influences du microbiote intestinal sur l’activité cérébrale (en particulier celle de l'insula) en réaction à des stimuli alimentaires. Cette étude « preuve de concept » chez l’animal est nécessaire pour permettre d’envisager par la suite des études plus appliquées dans des modèles de troubles du comportement alimentaire ou chez l’Homme.
Procédures
Les souris seront soumises à des injections intracérébrales sous anesthésie générale par chirurgie stéréotaxique (au maximum 1 chirurgie par animal). Le microbiote intestinal des souris sera déplété par prise volontaire dans l'eau de boisson (prise quotidienne) d'un cocktail d'antifongique/antibiotiques pendant 12 jours. La motivation alimentaire des animaux sera testée lors d'un test comportemental dédié (au maximum 2 tests d'1h par animal).
Impact sur les animaux
La chirurgie stéréotaxique peut engendrer de la douleur pendant la chirurigie et en post-opératoire ainsi que des infections ou une perte de poids. Ces effets indésirables sont prévenus par une couverture analgésique appropriée en péri- et post-opératoire et le respect des conditions d’asepsie. L’administration d’un cocktail d’antifongique/antibiotiques pour dépléter le microbiote digestif peut induire des modifications de la motilité intestinale, une augmentation de l’hydratation des selles et une inflammation intestinale modérée. La durée de ce traitement a été limitée à une durée minimale permettant une dépletion efficace du microbiote intestinal.
Devenir
A l'issue des procédures, les animaux seront mis à mort selon la réglementation en vigueur. L'analyse de l'expression du traceur neuronal et du marqueur de réactivité neuronale nécessite le prélèvement du cerveau et donc l'euthanasie des animaux.
Remplacement
L'activité cérébrale peut être étudiée dans divers modèles incluant par exemple des modèles cellulaires complexes récapitulant une partie de son organisation et de ses fonctions comme les organoïdes. Néanmoins, cette étude comprend des mesures neuro-comportementales et ne peut être ni réalisée in vitro ni modélisée in silico. En effet, l'activité cérébrale qui sous-tend les comportements émerge d'une organisation anatomo-fonctionnelle cérébrale complexe et de l'intégration de signaux provenant d'organes périphériques que seul le modèle animal permet d'explorer. Aucun autre modèle à l'heure actuelle ne peut récapituler ces processus et permettre ces mesures neuro-comportementales. Cette étude nécessite donc l’utilisation d’animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux prévu a été déterminé grâce à des données issues de la littérature. Le nombre d’animaux prévu permet d’effectuer des analyses statistiques qui permettront de déterminer la pertinence de poursuite ou non de la méthode mise au point et de détecter des différences neuro-comportementales entre les groupes expérimentaux.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe dans des cages contenant un objet leur permettant de se mettre à l’abri et des carrés de cotons ou des sticks en papier pour réaliser un nid. Afin de limiter la douleur et l’inconfort pouvant être générés par la chirurgie stéréotaxique, l’asepsie sera respectée lors de la chirurgie pour limiter le risque d’infection et un protocole adapté de gestion de la douleur sera utilisé en péri- et post-opératoire. Le suivi du poids et une observation clinique quotidienne des souris permettront d’évaluer les points limites. Pour limiter le stress des animaux, l’administration du cocktail d’antibiotiques/antifongiques est réalisée dans l’eau de boisson (prise volontaire). Les prélèvements pour l’analyse histologique et la densité du microbiote sont post-mortem.
Choix des espèces
Le modèle souris est largement utilisé pour les recherches sur le comportement alimentaire, notamment dans l’obésité en raison de ses réponses reproductibles permettant une robustesse des résultats générés. L’abondance des données dans la littérature sur les mécanismes de régulation de la prise alimentaire dans cette espèce permet d’autre part le raffinement des méthodes (outils analytiques disponibles évitant la mise au point de certaines méthodes sur des animaux supplémentaires). Enfin, nous disposons déjà de données préliminaires sur ce modèle animal. Nous avons décidé de travailler sur individus « jeune adulte » âgées de 7-8 semaines pour éviter les effets liés au développement d’une part et au vieillissement d’autre part.