Rongeurs

1 108 rongeurs, 810 souris et 298 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chaque animal reçoit une greffe de cellules tumorales dans le cerveau sous anesthésie, puis des séances d'imagerie, des injections d'agents thérapeutiques et des prélèvements sanguins, pour tester une combinaison d'ultrasons focalisés et de médicaments contre les gliomes. Le porteur indique que les traitements peuvent avoir une toxicité sur les organes sains et que le réveil après imagerie peut désorienter les animaux. Il revendique un fort "potentiel de transfert chez les patients", bénéfice renvoyé au conditionnel.

Objectifs

De nouvelles innovations thérapeutiques à base d’anticorps et de peptides spécifiques pourraient améliorer significativement les conséquences des cancers du cerveau les plus graves : les gliomes. Ces thérapies ciblent spécifiquement des molécules exprimées principalement par les gliomes et diminuent considérablement les effets secondaires tout en augmentant l’efficacité thérapeutique. Malheureusement l’efficacité de ces traitements est freinée une barrière naturelle, appelée « barrière hémato-encéphalique » (BHE), qui limite la diffusion dans le cerveau des médicaments qui pourraient être efficaces contre ces tumeurs. Les gliomes, qui sont des tumeurs cérébrales très agressives, restent essentiellement incurables même si la BHE est partiellement compromise par la présence de cette tumeur. L’objectif du projet est d’évaluer une stratégie thérapeutique qui vise à surmonter la limitation de la diffusion des médicaments dans la tumeur, en combinant des ultrasons focalisés à des médicaments innovants, associés ou non avec des isotopes thérapeutiques. Les isotopes directement injectés dans la circulation sanguine, agissent comme une radiothérapie interne. Ils ont aussi été montrés stimuler le système immunitaire en plus de leur effet thérapeutique sur les cellules tumorales. Les ultrasons focalisés ont prouvé leur capacité à faciliter la diffusion de divers médicaments dans le cerveau grâce à une ouverture transitoire et sécurisée de cette barrière sans causer de lésions cérébrales. Nous exploiterons cette perturbation de la BHE pour adresser les médicaments directement dans la tumeur, tout en y associant une radiothérapie interne. Cette stratégie sera évaluée sur des modèles de rongeurs (souris et rats) présentant soit un statut immunitaire normal soit une immunorésistance, pour évaluer toutes les conditions pouvant se présenter en clinique humaine. . Ce projet sera réparti entre deux établissements pour réaliser d’un côté la thérapie et de l’autre le suivi par imagerie.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à valider de nouvelles stratégies thérapeutiques en utilisant des traitements innovants et des ultrasons focalisés. Ces approches thérapeutiques présentent un fort potentiel de transfert chez les patients. Dans le cadre de ce projet, une évaluation des thérapies par imagerie TEP est également envisagée. Cette méthodologie, associée à l'utilisation de radioligands, pourrait bénéficier aux patients de deux manières : en améliorant la sélection des patients pouvant bénéficier des traitements innovants et en optimisant la dose médicamenteuse afin de réduire les effets toxiques potentiels.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : o La mise en place du modèle tumoral (45 minutes d’intervention chirurgicale, une seule injection par animaux) : des cellules tumorales seront injectées sous anesthésie générale dans une sous-structure du cerveau : le striatum pour la formation de tumeurs o L’injection de molécules permettant l’imagerie chez l’animal sous anesthésie générale pour le ciblage de biomarqueurs d’intérêt et pour le suivi du volume tumoral, réalisée via une injection systémique (temps d’injection 5 minutes, nombre total d’injections par souris/rats : maximum 3). o L’injection des agents thérapeutiques qui aura lieu tous les deux à trois jours pendant deux semaines environ (temps d’injection de la thérapie 5 minutes, nombre total d’injections par souris/rats : maximum 6). o Une anesthésie lors des différentes sessions imageries (temps d’anesthésie durant l’imagerie entre 15 minutes et 70 minutes, en comptant un maximum de 6 sessions d’imagerie. o Un prélèvement sanguin sur animaux sous anesthésie (maximum 5 minutes, 5 maximum au total ). Le diagnostic et la thérapie seront réalisés dans un premier établissement utilisateur alors que le suivi par imagerie sera réalisé dans un autre établissement utilisateur.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sur les animaux : • L’injection des radioligands en intra veineux peut induire une courte douleur (moins de 5min). • Les souris seront endormies lors des sessions d’imagerie (70 minutes maximum) par voie gazeuse. Lors du réveil les souris peuvent être désorientées et stressées. • Le geste chirurgical lors de la mise en place du modèle tumoral induira une douleur au niveau de la boite crânienne. L’acte chirurgical durera 30 min. Les traitements peuvent avoir une toxicité non spécifique au niveau des organes sains. La durée des traitements ne dépassera pas plus de 3 semaines. Cette toxicité sera limitée par l’utilisation de dose thérapeutique décrite et validée dans la littérature.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour des analyses ex vivo de biomarqueurs d’intérêt tumoraux et au niveau du système immunitaire.

Remplacement

Dans une première approche, toutes les stratégies thérapeutiques sont évaluées sur des cultures cellulaires et des tumoroides pour déterminer leur pertinence, ainsi que pour identifier une éventuelle surexpression de biomarqueurs au niveau des tumeurs. Un travail impliquant plusieurs équipes spécialistes des gliomes et de la BHE porte notamment sur l’élaboration de modèles tumoroides couplant gliomes et microenvironnement tumoral pour évaluer in vitro les différentes stratégies thérapeutiques. Les tests in vitro préliminaires sont mis en place afin de définir la stratégie qui sera appliquée in vivo, ce qui permet de réduire le nombre d'animaux utilisés pour l'évaluation sur un modèle murin. Cependant, nos modèles in vitro sont limités quant à l’interaction entre les cellules tumorales et le microenvironnement tel que les différentes populations du système immunitaire.Afin de valider les thérapies et la stratégie associée par imagerie, il est nécessaire d'implanter les tumeurs dans l'organe cible, en l'occurrence le cerveau. L’ouverture de la BHE par l’utilisation d’ultrasons thérapeutiques ne peut être que testée dans un environnement complexe récapitulant le flux sanguin, les jonctions de la barrière cérébrales, l’infiltration immunitaire et les flux lymphatiques cérébraux uniquement observable in vivo. Cette approche permet de mieux simuler le contexte physiologique et de fournir des données plus pertinentes pour le transfert clinique de ces stratégies.

Réduction

L’imagerie TEP permettra de réduire drastiquement le nombre d’animaux étant donné que l’impact des traitements sera suivi de manière longitudinale sans avoir recours à des euthanasies à différents temps d’imagerie. Cette évaluation nécessitera d’avoir recours à un traitement des images et l’utilisation de modèles mathématiques pour extraire un maximum de données directement transférables en clinique. En tenant en compte les différentes données préliminaires et les données bibliographiques, le nombre d’animaux par groupe a été déterminé entre 10 et 12 afin d’être statistiquement significatif. Les données quantitatives issues de l’imagerie seront exprimées en moyenne avec un écart-type associés.

Raffinement

Toutes les interventions invasives à savoir les injections de radioligands, les procédures chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale par voie gazeuse complétée par une anesthésie locale et des soins post-opératoires adaptés afin de minimiser le stress de l’animal et les douleurs liés aux interventions. Un suivi régulier permettra d’éviter toute souffrance animale. Les animaux seront entrainés à la manipulation pour éviter tout stress. Les souris seront hébergées par 4 ou 5 en milieu enrichi. Des points limites sont définis pour éviter toute souffrance animale. Si une souffrance est observée, un antalgique pourra être administré en accord avec le/la vétérinaire référent-e. sera administrée. Les rongeurs seront transportés dans des cages adaptées aux transports comportant de la litière et de la nourriture gélifiée. Le transport sera réalisé dans un véhicule dédié aux transports des animaux avec une climatisation. Le parcours entre les deux sites est de 20 minutes maximum.

Choix des espèces

Ce projet a comme objectif d’évaluer de nouveaux axes thérapeutiques qui peuvent être directement transférables à l’humain. En fonction de la lignée cellulaire tumorale utilisée, la souris ou le rat sont des animaux de choix pour la mise en place de modèle tumoraux. Ayant une taille adaptée pour la manipulation et l’imagerie corps entiers. Les modèles permettant une implantation de la tumeur dans son environnement d’origine sont largement utilisés pour examiner le microenvironnement tumoral essentiel pour valider les stratégies thérapeutiques et les biomarqueurs prédictifs. Les souris et les rats utilisés dans ce projet auront atteint un stade jeune adulte (5 semaines) à adulte (8 semaines). Cette tranche d’âge permet d’être représentative des cancers cérébraux chez les patients majoritairement à l’âge adulte.

2 100 rongeurs, 480 souris et 1 620 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, une partie tuée à l'issue et 360 réutilisés dans d'autres projets. Les animaux reçoivent les substances à tester, peuvent recevoir un cathéter veineux et des puces RFID, subissent des prélèvements sanguins et sont soumis à des tests de conditionnement et de sevrage avec une restriction alimentaire à 80-90 % de leur ration. Le porteur indique que le test de sevrage peut provoquer hypothermie, tremblements et perte d'appétit, pour évaluer le potentiel d'addiction de candidats-médicaments. Il présente ces tests comme "requis par les agences réglementaires" et signale que des méthodes in vitro et in silico existent pour la sélection préalable des molécules.

Objectifs

L’objectif principal de ce projet est d’anticiper des problématiques de mésusage et pharmacodépendance pour de futurs candidats médicaments avant leur mise sur le marché. En effet, de par leurs actions au niveau du système nerveux central, des candidats médicaments une fois mis sur le marché peuvent êtres mésusés, leur utilisation détournée ou consommés de manière récréative et/ou de façon abusive. Les procédures décrites dans ce projet sont des tests comportementaux réalisés chez le rongeur et qui ont pour objet l'évaluation de l'innocuité de candidats médicaments sur le système nerveux central et suivent les recommandations des instances réglementaires (européenne et américaine).

Bénéfices attendus

Les procédures décritent dans ce projet permettent de vérifier l'absence d'effets indésirables tels que le mésusage et la pharmacodependance pour les candidats médicaments avant leur mise sur le marché. Si un risque de ce type est détecté, ces informations seront indiquées sur la notice d'utilisation, les conditions d’accès à ce médicament et son utilisation pourront alors être encadrées (médicament réservé à un usage hospitalier, par exemple). De plus les professionnels de santé seront informés du risque de détournement et pourront ainsi mettre en place un suivi du patient adapté afin de pouvoir détecter les signes relatifs à un état de dépendance tels que l’impossibilité d’arrêter ou de diminuer les doses du médicament; le fait d’avoir besoin de doses plus importantes pour obtenir les mêmes effets ; l'apparition d’un état de manque en l’absence de prise du médicament ; le fait de consacrer du temps à chercher à se procurer le médicament.

Procédures

Les substances à évaluer, les contrôles positifs et les contrôles négatifs sont administrées par bolus ou infusion d’une durée de quelques secondes. Les administrations peuvent être uniques ou répétées pendant plusieurs jours ou semaines, selon l’objectif de la procédure. Les procédures peuvent également nécessiter l’implantation de puces RFID (durée de quelques secondes à quelques minutes selon le site d’implantation) et/ou la pose d’un cathéter veineux sous anesthésie (durée d’environ 1 heure). Par ailleurs, des prélèvements de sang (durée du prélèvement : quelques secondes à 3 minutes) pourront être réalisés selon une fréquence déterminée dans la limite des considérations éthiques (8 maximum sur 24 heures). Les phases de test comportemental surviennent le plus souvent quotidiennement durant toute la durée de la procédure et peuvent consister en une simple observation de l'animal sans manipulation ou en des phases de conditionnement et de tests (visites de compartiments ou appuis sur leviers) dans des dispositifs spécifiques (durée de l'ordre de 20 minutes à 2 heures maximum, sur 5 jours ou plusieurs semaines en fonction des procédures).

Impact sur les animaux

Les administrations, les phases chirurgicales ou les prélèvements sanguins peuvent entrainer un stress ou une douleur. Dans le test de sevrage, l'animal peut ressentir des symptômes associés au sevrage pharmacologique (tels que l’hypothermie, des tremblements, une diminution de l’activité locomotrice, une perte d’appétit). Ces symptômes apparaissent généralement dans les 24 heures suivant l’arrêt du traitement et peuvent persister pendant toute la durée suivant la phase d'administration (en général 7 jours). Dans les autres tests, les animaux sont placés dans des dispositifs spécifiques (boites de conditionnement) pour une durée de 10-20 minutes à 2 heures, ce qui peut induire un stress lors de la première exposition du fait de la nouveauté de l'environnement (auquel les animaux s'habituent rapidement). Dans les procédures de conditionnement opérant, les animaux sont soumis à une légère restriction alimentaire (80-90% de la consommation quotidienne standard) qui peut augmenter la sensation de faim, mais n'empêche pas la croissance pondérale.

Devenir

Pour les procédures légères et modérées, les animaux peuvent être réutilisés après l’approbation du vétérinaire. Les animaux soumis à un prélèvement terminal seront euthanasiés.

Remplacement

Ces tests ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car ils permettent l’étude des potentiels effets secondaires de traitements expérimentaux dans un système complexe (interaction avec et entre les différents organes et systèmes physiologiques). De plus, ces tests sont requis par les agences réglementaires lorsque les candidats médicaments (ou leurs métabolites) ont une action sur le Système Nerveux Central. Cependant, il existe des tests in vitro et in silico permettant de sélectionner en amont des molécules efficaces et dont la toxicité n’est pas avérée.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés pour chaque test sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose/effet ou la comparaison par rapport à une substance de référence. Un effectif acceptable sera défini afin d'obtenir une puissance statistique suffisante pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des tests. En fonction des paramètres étudiés, les tests paramétriques ou non paramétriques pertinents seront appliqués. Aussi, autant que cela sera possible sans affecter le bien-être des animaux, des prélèvements sanguins en cours d'étude seront envisagés, permettant ainsi de collecter des données biochimiques sur la molécule testée sans utiliser un plus grand nombre d'animaux.

Raffinement

Le raffinement des méthodes expérimentales pour réduire au maximum la souffrance animale est mis en oeuvre grâce à l'utilisation de points limites clairement établis, permettant d'euthanasier tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse dépassant le cadre de l'étude. En cas de doute sur l’état général de l’animal, une évaluation approfondie sera réalisée quotidiennement jusqu'au retour aux paramètres physiologiques normaux (ou attendus) ou jusqu’à atteinte des points limites. Un formulaire interne spécifique à l’espèce sera alors complété. Il intègre l’aspect général, l’aspect du pelage, des yeux, la posture, les réactions de l’animal quand il est approché ou stimulé, la respiration, l’appétit, le poids, l’état d’hydratation, les tremblements ou les convulsions, la présence de plaie, de tumeurs ou autres évènements imprévisibles. Ce formulaire de suivi des points limites permet de prendre les bonnes décisions en évitant toute souffrance animale. Il est aussi mis en place un enrichissement complet dans l'hébergement des animaux (e.g. objets de nidification, objets à ronger ou mastiquer, présence de congénères...). Pour toute procédure nécessitant une phase chirurgicale, les animaux sont anesthésiés et analgésiés, le programme d’anesthésie et d’analgésie étant défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De plus, la phase de chirurgie est raffinée au maximum, par la mise à disposition d’oxygène ou air ambiant à concentration ajustable, de tapis chauffants et/ou de lampes chauffantes et de soins post-opératoires complets. En cas de prélèvements de sang, une anesthésie légère de type isolflurane sera appliquée afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance.

Choix des espèces

Aujourd’hui encore, les rongeurs (rats et souris) demeurent l'espèce privilégiée pour évaluer le potentiel addictif et/ou à induire une pharmacodépendance des candidats médicaments selon les recommandations des agences réglementaires et la littérature. Il s'agit principalement de rongeurs sevrés, âge variant entre 3 semaines et 2 ans, conformément à la littérature scientifique et aux textes réglementaires.

1 008 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent une biopsie de la queue à la naissance et des administrations de tamoxifène par gavage, une partie d'entre elles étant en outre irradiées aux pattes avant une greffe de moelle osseuse et un prélèvement sanguin rétro-orbital. L'objectif est de comprendre comment les macrophages survivent lorsque les fibroblastes produisent moitié moins de Csf1, une question de recherche fondamentale sur l'immunité. Les retombées thérapeutiques annoncées, de nouvelles cibles contre des maladies comme l'ostéopétrose, restent au conditionnel, tandis que le porteur affirme que ces mécanismes ne peuvent être étudiés qu'in vivo et juge la souris "cruciale".

Objectifs

Les macrophages sont des cellules immunitaires présentes dans divers tissus, tels que la peau et le pancréas. Ils ont pour rôle d'ingérer les débris cellulaires et les agents pathogènes. La survie des macrophages dans les tissus dépend de la présence de Csf1, une cytokine produite par les cellules environnantes. Sans Csf1, le macrophage n'est pas capable de survivre et disparaît de manière permanente et complète du tissu ciblé. Des résultats préliminaires du laboratoire ont montré que la survie des macrophages pancréatiques et cutanés dépend du Csf1 produit par les fibroblastes. En effet, lorsque les fibroblastes ne produisent plus de Csf1, tous les macrophages pancréatiques et cutanés disparaissent. Cependant, si nous bloquons seulement la moitié de la production de Csf1 par les fibroblastes (ce qui signifie qu'ils produisent seulement la moitié de la quantité habituelle de Csf1), les macrophages pancréatiques et cutanés survivent normalement. L'objectif de ce projet sera donc de comprendre les mécanismes compensatoires mis en place au sein du pancréas et de la peau pour permettre la survie des macrophages avec seulement la moitié de Csf1 produit par les fibroblastes. Ce projet nous permettra ainsi d'approfondir notre compréhension des interactions entre les fibroblastes et les macrophages dans les tissus, ainsi que des mécanismes permettant aux macrophages de survivre dans des conditions de carence en Csf1.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche vise à comprendre comment les macrophages parviennent à survivre avec une quantité réduite de Csf1. Cela pourrait permettre le développement de nouvelles approches thérapeutiques. En effet, les souris avec une mutation dans le gène Csf1 ont une quasi-absence de tous leurs macrophages. Ces souris présentent des symptômes tels que nanisme, surdité, infertilité, ostéopétrose et une mortalité élevée quelques semaines après la naissance. Cependant, l'injection de Csf1 à ces souris permet de rétablir en grande partie le nombre de macrophages présents dans les tissus ainsi que les pathologies associées. De plus, chez des souris de 2 mois avec des fractures fémorales, l'administration de Csf1 perturbe la cicatrisation et semble induire une ostéopétrose. En revanche, la régénération osseuse chez les souris âgées a pu être ramenée à des niveaux normaux uniquement en stimulant l'activation des cellules souches du squelette et bloquant le Csf1. Ces résultats mettent en évidence l'importance de réguler finement les niveaux de Csf1 dans les tissus. Ce projet permettrait ainsi d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour les maladies liées à une perturbation de la signalisation du facteur Csf1, comme l'ostéopétrose. De plus, ce projet vise à développer des outils pour manipuler les macrophages que ce soit au cours de contexte physiologiques et pathologiques.

Procédures

Procédure 1 : 846 souris seront tatouées, et un morceau de queue sera prélevé 7 à 10 jours après leur naissance. 162 souris seront réutilisées pour les procédures 2 et 3. Procédure 2 : 90 souris seront traitées au tamoxifène par voie orale 2 fois à intervalle de 1 semaine puis mises à mort après un mois. Procédure 3 : 72 souris seront traitées au tamoxifène par voie orale 2 fois à intervalle de 1 semaine. 1 mois après, les souris seront irradiées pour dépléter la moelle osseuse endogène puis injectées par voie intra-veineuse avec des cellules de moelle osseuse exogène pour reconstitution, puis mises à mort 2 mois après la greffe. Ces mêmes souris seront prélevées par voie rétro-orbitale 1 fois avant la mise à mort.

Impact sur les animaux

- Une biopsie de la queue sera réalisée sur les animaux entre 7 et 10 jours après leur naissance. À cet âge, la perception de la douleur dans la queue par la souris est encore considérée comme faible, voire nulle, car le réseau neuronal de cette partie est encore sous-développé (nuisances légères). - L'administration de tamoxifène par voie orale, à l'aide d'une canule à embout flexible peut entrainer un léger inconfort et du stress pour la souris pendant l'administration qui dure environ 10 secondes ( nuisances légères). - Les animaux subiront une irradiation partielle des pattes arrières ainsi qu'une injection intraveineuse pour transplantation de moelle osseuse. Pendant toute la durée de l'irradiation ainsi que l'injection de moelle osseuse, les animaux seront maintenus sous anesthésie (envrion 15min au total) et ne ressentiront donc aucune douleur. L'anesthésie des animaux engendrera un stress à court terme des animaux, de plus, après l'irradiation, les aimaux se retouvent avec un système immunitaire incomplet pendant 15 jours augmentant ainsi le risque d'infection durant cette période. Les animaux seront ainsi plus vulnérables. Enfin l'injection intraveineuse, bien que faite sous anesthésie, entrainera une légère lésion pouvant entrainer un inconfort à court terme de la souris. L'ensemble de ces actes entraineront donc des nuisances considérées comme modérées.

Devenir

A l'issue des procédures les animaux sont mis à mort afin de prélever les organes.

Remplacement

La complexité des interactions entre les cellules stromales des organes, telles que la peau et le pancréas, et les macrophages ne peut être étudiée efficacement à l'aide de modèles in vitro. Il est donc nécessaire d'utiliser des modèles animaux pour ce projet. En effet, comprendre comment les macrophages peuvent s'adapter en présence de niveaux réduits de Csf1 produits par les fibroblastes ne peut être réalisé qu'in vivo puisque les facteurs compensatoires mis en place pour la survie des macrophages peuvent provenir non seulement des fibroblastes, mais également d'autres types cellulaires présents dans ce microenvironnement. L'utilisation d'un modèle in vitro ne permet pas de refléter la complexité et la dynamique de cet environnement, qui joue un rôle crucial dans le maintien des macrophages pancréatiques ou cutanés. De même, l'étude du renouvellement des macrophages au sein des tissus requiert l'utilisation de modèles animaux, car les signaux permettant la migration des monocytes à travers les tissus et leur différenciation en macrophages ne peuvent être reproduits in vitro

Réduction

De manière générale, nous utiliserons le minimum de souris nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement significatifs pour nos expérimentations. Le nombre d'animaux nécessaires pour l'étude a été calculé sur http://Biomath.info/power/ttest.htm en prenant en compte des facteurs tels que la puissance statistique (Probabilité d’obtenir un résultat significatif même avec une faible différence = 80%), le niveau de risque acceptable (probabilité de se tromper et de conclure à une différence significative alors qu'il n'y en a pas = 5%) et l'écart de moyennes attendu entre les groupes expérimentaux et contrôles (différence attendue entre les groupes = 40%). Dans le cadre de cette étude, les accouplements seront faits pour permettre que toutes les femelles soient utilisées pour les expériences concernant ce projet, et que les mâles puissent être utilisés pour d’autres projets du laboratoire. Ceci permettra d’utiliser tous les animaux générés dans les élevages.

Raffinement

Les souris seront hébergées en groupes sociaux dans des environnements enrichis afin de satisfaire leur instinct grégaire, de favoriser les comportements naturels et limiter l’agressivité. Les conditions d'hébergement des souris respectent la directive 2010/63/UE : - Les cages utilisées permettent l'hébergement de 5 souris adultes d'un poids supérieur ou égal à 30 g (souris âgées de plus de 6 semaines). Dans chaque cage du coton pour confectionner des nids et des igloos seront introduits. Enfin, le statut EOPS de notre animalerie permet de minimaliser les variabilités dues au stress ou à des infections. Par ailleurs, la mise en place de points limites précoces, prédictifs et adaptés à chaque procédure, basés sur une observation quotidienne des animaux, de l’évolution de leur poids, de leur apparence et de leur comportement au cours de chaque procédure permettra de prendre les mesures adéquates pour limiter au maximum la douleur, la souffrance et le stress des animaux.

Choix des espèces

L´espèce murine a permis de développer de nombreux modèles génétiquement modifiés, et leur utilisation dans ce projet est cruciale pour répondre aux questions scientifiques posées. Les souris seront utilisées à partir de l’âge de 6 semaines puisque nous nous intéressons au rôle compensatoire du Csf1 sur les macrophages à l’âge adulte et non au cours du développement.

358 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Elles reçoivent des injections intraveineuses, une injection dans le cerveau et des injections répétées dans l'abdomen, ainsi que des prélèvements de sang, avant d'être tuées pour analyser les organes touchés. Le porteur met au point un modèle d'inflammation cérébrale médiée par des lymphocytes humains, présenté comme une alternative à l'usage de primates. Il affirme que cette étude animale est "la seule" à pouvoir valider son hypothèse.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont de mettre au point un modèle d’inflammation cérébrale chez la souris, médié par des lymphocytes T humains. Une fois le modèle mis au point, nous pourrons questionner le rôle d’une autre population lymphocytaire présentant in vitro un caractère cytotoxique et que nous avons trouvé accumulé dans le sang, le liquide céphalorachidien et les zones inflammatoires de patients atteints de maladie neurodégénérative. In fine, nous évaluerons une thérapie à base d’anticorps pouvant spécifiquement cibler cette population lymphocytaire agressive.

Bénéfices attendus

Les bénéfices seront doubles : (1) mise au point d’un nouveau modèle d’inflammation cérébrale chez la souris, médié par les lymphocytes T humains qui permettra de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant particulièrement les cellules humaines. (2) évaluation d’une nouvelle stratégie thérapeutique ciblant une population lymphocytaire exacerbant les signes d’inflammation cérébrale chez l’homme.

Procédures

Les souris anesthésiées seront injectées en intraveineuse (i.v.), cet acte est rapide (

Impact sur les animaux

Effet de l’injection en i.v. et de la prise de sang sur les souris=> stress lié à l’anesthésie. Effet de l’injection i.p. =>stress lié à la contention. Effet lié à l'induction de l'anesthésie profonde pour l’injection intracérébrale sur les souris => stress lié à la contention. Douleurs post-opératoires potentielles minorées par des antalgiques =>stress lié à la contention pour l'injection d'antalgiques.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés pour permettre une analyse des organes cibles de la maladie induite.

Remplacement

In vitro, nous avons observé une accumulation de cellules immunitaires particulières dans des d’échantillons biologiques de patients atteints de sclérose en plaque (sang, liquide céphalorachidien, coupe de cerveau). Cette observation nous amène à émettre l'hypothèse qu’elles pourraient avoir un rôle délétère dans la maladie. Cette étude chez l’animal est la seule à pouvoir nous permettre de répondre à l’hypothèse dans sa complexité et à valider la stratégie thérapeutique envisagée sans avoir recours aux grands animaux.

Réduction

Le nombre de souris a été réduit au minimum afin de permettre une analyse statistique fiable des résultats. Deux études pilotes sont envisagées afin d'établir le protocole expériemental dans lequel seront évaluées nos hypothèses. Les procédures de cette DAP ne seront envisagées que si (1) les études pilotes sont validées et si (2) les GO/No GO inclus à la fin des expérimentations conduisent à des GO permettant de continuer l'étude pour vérifier les hypothèses. Enfin, les groupes ont été constitués grace au travail récent de scientifiques ayant présentés leurs résultats dans des journaux spécialisés et sujets à une évaluation par les paires. Les expériences pilotes et les GO/No GO permettront ainsi de réduire au strict nécessaire le nombre de souris utilisées.

Raffinement

Pour leur confort, les animaux seront hébergés dans des cages adaptées, avec enrichissement (frisottis et/ou dôme) et accès libre à l’eau et à la nourriture. Afin de réduire la douleur un certain nombre d’actes se feront sous anesthésie, sur tapis chauffant et le suivi clinique régulier des souris (surveillance du poids, aspect clinique général, administration d'antalgique) nous permettra de palier à la douleur éventuelle. Le bien-être des animaux est surveillé tout au long de l’étude avec une évaluation quotidienne des signes généraux.

Choix des espèces

Les souris immunodéficientes (NSG) sont des souris qui ne possèdent pas de système immunitaire propre et dans lesquelles peut se développer un système immunitaire humain après injection de cellules immunitaires humaines. On parle alors de souris humanisées. Le modèle expérimental proposé ici : l’humanisation de souris immunodéficientes (mâles et femelles) de 8-12 semaines de vie par l'injection de lymphocytes T CD4 +/- T CD8 humains est le seul qui nous permette de confirmer in vivo le pouvoir aggravateur des cellules CD8-NK-Like. Ces souris humanisées sont des modèles alternatifs à l'utilisation de primates pour tester des nouvelles stratégies thérapeutiques.

300 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales par voie intra-osseuse et un myélogramme transtibial, gestes que le porteur décrit comme provoquant une douleur importante justifiant l'anesthésie, avant d'être tuées à trois semaines. Le porteur teste des lymphocytes CAR-T contre un état préleucémique et indique le développement possible d'une anémie. Il affirme qu'il est "impossible" de reproduire in vitro cette maladie avec tous ses composants.

Objectifs

Ce projet vise à valider in vivo l’efficacité d’une approche par immunothérapie (CAR-T cells) pour traiter les syndromes myélodysplasiques (état préleucémique) en utilisant un modèle murin humanisé de syndromes myélodysplasiques. Il s'agit d'un projet multi-site qui se déroulera dans 2 animaleries différentes. Cette étude nous permettra de confirmer l'efficacité anti-tumorale des CAR-T cells contre les cellules myélodysplasiques dans un modèle in vivo de syndromes myélodysplasiques et en cas de résultats positifs de débuter un essai thérapeutique clinique. En effet, il y a peu d’alternative thérapeutique pour les patients réfractaires aux traitements de première ligne.

Bénéfices attendus

Cette étude nous permettra de confirmer l'efficacité anti-tumorale des CAR-T cells contre les cellules myélodysplasiques dans un modèle in vivo de syndromes myélodysplasiques et en cas de résultats positifs de débuter un essai thérapeutique clinique. En effet, il y a peu d’alternative thérapeutique pour les patients réfractaires aux traitements de première ligne.

Procédures

1) Injection intratibiale des cellules tumorales sous anesthésie et analgésie (30 s). 2) Entre 1 mois et 3 mois post greffe : Confirmation prise de la prise de greffe par mesure de la luminescence par imagerie in vivo sous anesthésie générale (5 min). Réalisation d'un myélogramme par voie transtibiale sous anesthésie et analgésie (30 s) si absence de bioluminescence. 3) Injection intracaudale à J0 du traitement et des différents véhicules (5 min). 4) J7 et J15 prise de sang par ponction veine mandibulaire pour monitoring in vivo par CMF de l'expansion des CAR-T cells (2min) 5) Mesures de la luminescence par imagerie in vivo sous anesthésie générale (5 min) à J7, J10, J14 et J21. 6) A J21 post injection du traitement les animaux seront euthanasiés selon une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Les injections et les prélèvements sanguins vont engendrer une douleur légère et de courte durée. La ponction et l'injection médullaire transtibiale va engendrer une douleur importante le temps du geste justifiant une anesthésie générale avec analgésie. Le développement du syndrome myélodysplasique peut entrainer un inconfort en rapport avec l'anémique.

Devenir

Certains animaux issus de la procédure d’élevage entreront dans la procédure d’expérimentation s’ils ont l’âge requis pour la procédure de xénogreffe au moment de la disponibilité du matériel biologique nécessaire à la xénogreffe. Tous ces animaux atteignant le point-limite et/ou maintenus aprés la dernière imagerie seront finalement mis à mort pour les analyses biologiques invasives nécessaires à l'exploitation optimale des résultats. Les autres animaux (surnuméraires, ayant dépassé l’âge pour la réalisation de la xénogreffe ou vieux reproducteurs) seront euthanasiés.

Remplacement

Il est impossible, à l’heure actuelle, de reproduire de manière in vitro une hématopoïèse clonale complète d'un syndrome myélodysplasique avec tous ses composants et leurs interactions pourétudier l’efficacité anti-tumorale de lymphocytes T modifiés. Par ailleurs, aucun modèle mathématique ou informatique ne permet actuellement d’évaluer également cette réponse.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaires à cette étude a été réduit au minimum sur la base des besoins imposés par les tests statistiques que nous utiliserons. De fait, un nombre de 300 souris sera nécessaire.

Raffinement

L'ensemble des procédures pouvant s'accompagner d'une douleur/angoisse modérée, tous les efforts seront entrepris pour réduire au minimum de douleur, souffrance ou angoisse ressentie par les animaux. C'est pourquoi nous surveillerons l'état de santé des animaux tout au long des expériences afin de pouvoir intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de douleur, de souffrance ou d'angoisse. La greffe des cellules souches humaines sera réalisée par voie transtibial de même que les myélogrammes sous anesthésie générale injectable. Le projet est mis en oeuvre dans un établissement utilisateur agréé. Les personnels impliqués ont des compétences validées pour les manipulations des animaux. Les animaux seront hébergés dans un environnement stérile (isolateur) dans un environnement enrichi et contrôlé et observés quotidiennement afin d'anticiper l'apparition des points limites fixés. Les différents gestes chirurgicaux et les séances d'imagerie sont réalisés sous anesthésie générale. La méthode de mise à morts des animaux est réglementaire. Les animaux seront transportés dans des cages stériles prévues pour cet usage avec enrichissement de l’environnement et tout sera mis en œuvre pour limiter la durée de transport entre les 2 sites.

Choix des espèces

Il a été démontré que les souris avec ce profil particulier d'immunodépression permettent une meilleure prise de greffe des cellules souches hématopoïétiques humaines. Autre avantage de ces souris, elles n'ont pas besoin d'être préparées à la greffe par un conditionnement par irradiation ou une chimiothérapie. Ce conditionnement peut augmenter la létalité de la procédure. Souris entre 8 à 10 semaines de vie. Du fait du délai de prise de greffe (entre 1 à 3 mois), l'injection doit se faire précocement.