Rongeurs
Immunothérapie par combinaison d’anticorps pour le traitement des cancers du foie par modèle cellulaire orthotopique
- Recherche appliquée
- Cancers
552 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie abdominale sous anesthésie pour induire une tumeur du foie, des injections d'un anticorps deux fois par semaine pendant quatre semaines et des mesures de tumeur par imagerie, la tumeur pouvant provoquer gêne et douleurs. Le projet cherche à confirmer qu'un anticorps déjà développé freine le cancer du foie et l'associe à des immunothérapies existantes. Le porteur affirme qu'une "validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier" reste nécessaire avant tout passage chez l'humain.
Objectifs
Le cancer du foie qui est le 3ème cancer le plus meurtrier dans le monde. Le traitement de référence des formes graves fait appel à des anticorps ciblant le système immunitaire, mais seul un faible pourcentage de patients répond à ces traitements. Il y a donc urgence à améliorer les thérapies actuelles. Depuis une dizaine d’années nous avons développé un anticorps reconnaissant spécifiquement une protéine localisée sur la membrane des cellules et connue pour participer au développement de différents cancers, notamment celui du foie. Nous avons montré que notre anticorps conduisait à une inhibition partielle de la croissance du cancer du foie dans un modèle de souris ne présentant pas de système immunitaire. Nous avons également montré que le traitement de cellules issues de patients par notre anticorps permet d’activer les cellules immunitaires. Ceci suggère que notre anticorps pourrait améliorer l’efficacité des thérapies existantes ciblant le système immunitaire pour le traitement du cancer du foie. L’objectif de notre projet est tout d’abord de valider nos résultats précédents en confirmant la capacité de notre anticorps à inhiber la progression tumorale dans des souris présentant un système immunitaire fonctionnel, mais également d’évaluer l’efficacité de notre anticorps en combinaison avec des anticorps ciblant le système immunitaire.
Bénéfices attendus
Le cancer du foie est un cancer pour lequel le nombre de cas est en augmentation constante partout dans le monde, et les traitements actuels ne permettent de soigner qu’un faible pourcentage de malades. Notre projet est une étape vers la mise en place de nouveaux traitements. Nous pensons que notre anticorps peut améliorer l’efficacité des thérapies actuelles qui ciblent le système immunitaire et ainsi la prise en charge des malades dans le futur. Cet anticorps a d’ailleurs déjà passé les tests de toxicité avec succès et est récemment entré en essai clinique pour le traitement d’autres pathologie du foie.
Procédures
Tous les animaux de ce projet seront soumis à une opération chirurgicale sous anesthésie générale d’une durée d’environ 20 minutes. Une fois par semaine, les animaux recevront une injection d’un composé permettant de mesurer la taille des tumeurs sur animaux vigiles qui prend moins d’une minute. Puis les animaux seront anesthésiés afin de réaliser la mesure, qui dure au maximum 10 minutes. Certains animaux recevront un traitement par anticorps 2 fois par semaine pendant 4 semaines par injection réalisée sur animaux vigiles qui prend moins d’une minute à être réalisée. Les animaux subiront un prélèvement de sang terminal. Cette procédure est réalisée sur animaux anesthésiés et est réalisé en environ 1 minute.
Impact sur les animaux
Notre modèle induit des tumeurs dans le foie, qui peuvent entrainer une gêne et des douleurs au cas où la tumeur dépasse une certaine taille. De même, les injections répétées peuvent parfois engendrer de l’inflammation, une douleur ou très rarement une ulcération au niveau des sites d’injection.
Devenir
Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissues (tumeurs, foies) qui seront utilisées pour des analyses ultérieures.
Remplacement
Afin de remplacer les études in vivo, nous avons procédé à des études in vitro sur lignées cellulaires et ex vivo sur des tissus de patients afin de démontrer la validité de l’approche. Celle-ci nécessite maintenant une validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier avant transposition clinique chez l’humain.
Réduction
Afin de réduire la quantité de groupes d’étude, nous prévoyons d’adopter une démarche pas-à-pas, en améliorant au fur et à mesure les conditions d’étude de notre anticorps par le biais d'une étude pilote sur une petite cohorte d'animaux afin de choisir la dose la plus éfficace. Les tailles d’effectifs ont été déterminées à priori grâce à un logiciel dédié afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.
Raffinement
Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont. L’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton et de la frisure de kraft pour la nidification et des briques de tremble à ronger. Les animaux seront maintenus en groupe. Des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance. Les procédures invasives ou stressantes sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie. Avant les procédures le nécessitant, au cours de la période d’acclimatation de 7 jours, les souris seront laissées 2-3 jours sans manipulation puis habituées à la contention afin de diminuer le stress lié aux injections répétées.
Choix des espèces
Les souris sont de petits mammifères très proches de l’homme notamment du point de vue immunologique. Le modèle proposé dans cette étude a contribué dans le passé à établir le potentiel curatif des approches thérapeutiques ciblant le système immunitaire actuellement prescrites chez l’homme. Les animaux seront utilisés à un âge adulte à partir de 8 semaines afin qu’ils présentent un système immunitaire mature.
Travaux pratiques de la formation en expérimentation animale « application des procédures, Rongeurs »
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, pour l'entraînement de stagiaires. Chaque apprenant s'exerce sur une souris à la contention, au gavage et aux injections, l'animal étant ensuite anesthésié, soumis à des prélèvements puis tué et disséqué pour repérer les organes. Le projet ne produit aucune connaissance, il forme des techniciens et des personnels de laboratoire aux gestes de l'expérimentation. Le porteur affirme que l'usage d'animaux est "indispensable" malgré un passage préalable en centre de simulation.
Objectifs
L'objectif général est de former des jeunes au métier de technicien supérieur ou d'assistant ingénieur qui exerceront des activités dans le domaine de la santé humaine et animale, des biotechnologies, des industrie pharmaceutiques et de la toxicologie. Pour les étudiants de Master, la formation leur permettra de réaliser des projets de recherche sur rongeurs lors de leur stage de recherche. Cette formation est un atout lors de leur insertion professionnelle. Par ailleurs, l'objectif de ce projet est également de permettre d'acquérir les bases de manipulations des rongeurs dans le cadre de la formation règlementaire ouverte aux personnels universitaires et de laboratoires de recherche dont les missions concernent l'expérimentation animale en respect des règles éthiques et législatives appliquées en France. La formation concernera les étudiants de 3ème année (maximum 48/an) ainsi qu'un maximum de 12 personnes issues de parcours différents soit au maximum 60 stagiaires par an.
Bénéfices attendus
Ces travaux pratiques permettront l'acquisition des principaux gestes (manipulation, contention, injections, prélèvements) nécessaires à toute personne chargée d’appliquer les procédures expérimentales chez le rongeur en respect des règles éthiques et législatives françaises.
Procédures
Manipulation: environ 15 minutes, temps adapté selon l'étudiant Gavage: environ 15 minutes, temps adapté selon l'étudiant Injection intrapéritonéale sur animal vigile: 1 minute 1 injection intraveineuse (animal anesthésié): environ 15 minutes, temps adapté selon l'étudiant 2 prélèvements veineux (animal anesthésié): environ 15 minutes, temps adapté selon l'étudiant
Impact sur les animaux
Les nuisances sur animaux vigiles se limiteront au stress lié à la préhension, à l'apprentissage de la contention des animaux et du gavage par les stagiaires et à l'injection intra péritonéale de l'anesthésique qui peuvent être à'origine de douleurs légères. Ces gestes seront précédés d'une injection d'analgésique. Les autres gestes seront effectués sur animal anesthésié puis euthanasié.
Devenir
L'ensemble des animaux sera mis à mort : apprentissage de gestes complémentaires (marquage, injection sous cutanée, injection intra dermique) et dissection de chaque animal afin de visualiser les principaux organes ainsi que les systèmes reproducteurs (mâle et femelle) et cardiovasculaires.
Remplacement
Cette demande d’autorisation de projet a pour objectif de former les personnels appliquant des procédures expérimentales sur l'ensemble des gestes techniques les plus courants sur animal vivant et vigile. L’utilisation d’animaux est donc indispensable. Les manipulations sur animal seront précédées durant la formation d'un TP en centre de simulation permettant de visualiser l'anatomie et de simuler les gestes techniques.
Réduction
Les travaux pratiques (TP), de 4 heures chacun, comprendront 1 TP apprentissage sur souris, par candidat ce qui impliquera l'utilisation de 1 souris par apprenant. Au vu de notre expérience passée, ce nombre nous parait nécessaire mais suffisant pour permettre un apprentissage satisfaisant des principaux gestes techniques courammant utilisés dans le cadre de procédures expérimentales sur animaux. L'utilisation de chaque animal sera optimisée au maximum puisque les TP se termineront par un travail sur l'animal post mortem (marquage, injection sous cutanée, injection intradermique, dissection/anatomie). Les démonstrations seront effectuées par des formateurs expérimentés (1 pour 4 stagiaires) sur des animaux réutilisés par les stagiaires dans le cadre du même TP.
Raffinement
L'ensemble des animaux sera hébergé en groupes déterminés 1 semaine avant le début des TP dans des cages enrichies. Exceptés l'apprentissage de la contention et le gavage, l'ensemble des gestes sera effectué sous anesthésie générale. L'ensemble des gestes sera effectué sous contrôle direct d'un formateur (1 formateur pour 4 stagiaires) après une ou plusieurs démonstrations assurées par un formateur expérimenté. L’ensemble des animaux utilisés lors de ces TP auront été manipulés individuellement régulièrement par le personnel de l’animalerie afin de les habituer et de limiter leur stress lors des TP . Chaque stagiaire viendra prendre son animal et l’habituera à être manipulé avant de pratiquer la contention. Ces gestes seront précédés d'une injection d'analgésique. Le monitoring de l'anesthésie consistera à l'observation constante du rythme respiratoire et au test régulier (toutes les 15 minutes) de la réaction au pincement de la patte par les encadrants. En cas d'augmentation du rythme respiratoire et/ou de réaction au pincement de la patte, une 1/2 dose du mélange anesthésique sera injectée.
Choix des espèces
Le but de ces travaux pratiques est l'acquisition des principaux gestes (manipulation, contention, injections, prélèvements) nécessaires à toute personne chargée d’appliquer les procédures expérimentales chez le rongeur en respect des règles éthiques et législatives françaises. De ce fait, l'utilisation de souris est nécessaire. Les animaux utlilisés seront de jeunes adultes de 8/12 semaines, représentatifs de la plupart des animaux utlilisés dans le cadre de procédures expérimentales.
Évaluation de l’efficacité thérapeutique d’un inhibiteur des myosines rapides dans la dystrophie musculaire de Duchenne
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
32 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteurs d'une forme sévère de dystrophie musculaire de Duchenne, ils reçoivent par voie orale un inhibiteur des myosines rapides, subissent des prises de sang au sinus rétro-orbitaire sous anesthésie et des tests d'agrippement, avant d'être tués pour analyses des muscles. Le porteur affirme tester un modèle qui "mime fidèlement" la maladie de l'enfant et renvoie le bénéfice thérapeutique au "long terme". Il conclut que la question ne peut être obtenue que chez "l'animal vivant avec l'ensemble de ses organes".
Objectifs
La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une myopathie génétique rare qui touche un garçon sur 3500 à la naissance. Le pronostic de la DMD est très sombre et les jeunes patients meurent prématurément d'insuffisance cardiorespiratoire. En l'absence de la protéine dystrophine, les fibres musculaires sont affaiblies et fragiles, au point de rompre lors d’une contraction musculaire qui agit comme un stress mécanique. Cela conduit à des cycles répétitifs de régénération et de dégénérescence des fibres, accompagnés d'une inflammation chronique douloureuse et d’une perte permanente des fibres musculaires par épuisement de la capacité de réparation du muscle. L'objectif de notre étude est de stopper la progression de la maladie à l'aide de nouvelles molécules qui réduisent la mort des fibres musculaires. L'efficacité d’un composé similaire a déjà été démontrée sur un modèle de souris DMD, cependant moins sévères que notre modèle de rat. Ce projet permettra de valider chez le rat l'efficacité de trois nouveaux composés dans une situation qui ressemble beaucoup à celles des enfants atteints de DMD.
Bénéfices attendus
Notre laboratoire vise à mieux caractériser les mécanismes de la DMD pour les contrer via des thérapies innovantes que nous testons sur un modèle qui mime fidèlement la sévérité de la maladie de l'enfant. Nous proposons ici de tester des composés innovants qui via un mécanisme protecteur de la membrane des fibres musculaires, améliore la survie de l'ensemble des muscles et réduisent la douleur de l'inflammation causée par la disparition massive des fibres. Ces composés permettront sur le long terme d'accélérer la récupération motrice. Nous projetons ainsi d'identifier une piste innovante qui pourrait devenir un traitement utilisable chez l’enfant en complément des outils de thérapie génique en cours de développement.
Procédures
Le traitement sera administré une seule fois par voie orale afin de maîtriser la dose administrée. Le geste dure 15 secondes. Le sang des animaux (1,7 ml au total) sera prélevé en deux fois au sinus rétro-orbitaire, sous anesthésie générale légère et locale. Le prélèvement dure 30 secondes, l'anesthésie complète environ 20 minutes. La durée d'une séquence de grip test est de 20 minutes.
Impact sur les animaux
Il a été montré que les produits administrés ne sont pas toxiques jusqu’à une inhibition de 50% de l’activité des fibres musculaires rapides (qui confère leur protection contre la mort). Le dosage utilisé, inférieur, sera limité à 15% d’inhibition, ce qui garantit l‘absence de toxicité. La procédure de ce projet inclut des animaux de 4-5 semaines chez lesquels les nuisances de l'évolution spontanée de la maladie sont très limitées et ne gênent l'exécution d'aucune de leurs tâches quotidiennes. Ils se déplacent, mangent, boivent, se toilettent et jouent comme leurs frères de portée non atteints par la maladie. L'administration du traitement par gavage utilisera une sonde plastique souple à bout arrondi qui supprime les perforations possibles de l'oesophage avec l'usage d'anciennes sondes métalliques. La contention pour ce geste, les prises de sang et le test d'agrippement est réalisée délicatement, ce qui élimine la réponse de stress de l'animal. Un effet indésirable du test d'agrippement est la cassure d'une griffe trop longue lors du saisissement de la barre, raison pour laquelle nous vérifions avant le test leur longueur et les raccourcissons si besoin.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires nécessaires.
Remplacement
Ce qui a pu être testé de l'efficacité des composés sans l'usage d'animaux a été réalisé en amont de ce projet. Les composés que nous allons administrer engage leur cible biologique et réduisent la contraction des fibres musculaires rapides. Leur innocuité dans un organisme mammifère a été validée chez des souris. Cette étape est indispensable pour évaluer l'éventuelle toxicité du produit administré, mais aussi de tous les composés issus de leur transformation par les organes du corps, en particulier le foie. Sur ces bases robustes, nous souhaitons avec ce projet répondre à la question qui ne peut être obtenue que chez l'animal vivant avec l'ensemble de ses organes en interrelation constante : l’action du composé testé permet-elle dans le modèle sévère de la maladie (le rat que nous utiliserons) de protéger suffisamment les muscles pour que cela confère un bénéfice fonctionnel quantifiable à l’échelle des muscles squelettiques, associée à une diminution également quantifiable des lésions musculaires délétère à l’échelle histologique.
Réduction
Notre laboratoire a cumulé de nombreuses données sur ce modèle de rats DMD. Les calculs de puissance statistique nous recommandent d'utiliser 8 rats par groupe, ce que nous avons validé avec d'autres projets terminés. Nous avons optimisé la correction des données avant analyse statistique. Puis, nous utilisons une analyse statistique adaptée à chaque type de comparaison, selon des critères stricts admis par la communauté scientifique. En raison du nombre important de projets qui incluent toujours des animaux sauvages (wildtype, WT) et DMD traités avec un placebo, nous avons accumulé de nombreuses données qui nous permettent de documenter avec fiabilité l'histoire naturelle de la maladie, en comparaison avec les congénères sauvages. Il a donc été possible ici de ne pas inclure d'animaux WT, sans perte d'information biologique de référence. Les molécules ont par ailleurs déjà été testées sur des rats sauvages.
Raffinement
Les animaux sont stabulés en portoirs à cages ventilées, dans des pièces dont la température et l'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Pour le bien-être des rats, nous avons fait le choix des plus grandes cages disponibles sur le marché, de sorte qu'ils peuvent marcher et se dresser sur leurs pattes arrière. Cet exercice spontané quotidien est pleinement justifié pour des rats dont nous évaluons les capacités locomotrices. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Le cycle d'éclairage respecte l'alternance jour/nuit. Les rats, des animaux sociaux, sont hébergés avec des congénères, l'isolement n'existe jamais et le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft, des bâtons de bois à ronger, des balles rondes, des tunnels ou des carrés de coton compacté. Pour éviter une réponse de stress induite par les divers tests, les animaux seront habitués dès leur arrivée à être manipulés régulièrement, le plus en douceur possible. Des points limites ont été établis et seront constamment évalués en observant individuellement les animaux chaque jour, week-ends et jours fériés inclus. Tout dépassement des points limites sera suivi d'une action correctrice et en cas d'absence de bénéfice (évolution irréversible), nous procèderons à la mise à mort compassionnelle de l'animal avant qu'il ne souffre. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux.
Choix des espèces
Le rat est une espèce de mammifère appartenant à la classe des Euarchontoglires qui contient également les primates (donc l'humain). À ce titre, le rat phylogénétiquement proche de nous constitue un modèle apprécié. Les outils récents d'édition du génome ont permis d'en faire un modèle de choix pour l'analyse des troubles musculosquelettiques. Notre nouveau modèle de rat DMD mime la maladie humaine de manière beaucoup plus fidèle que ne le fait le modèle emblématique de la souris mdx, tout en conservant les atouts des rongeurs (courte durée de gestation, taille raisonnable, longévité moyenne, effectifs plus importants). Il est un excellent complément au modèle de chien DMD. En médecine translationnelle, il s'insère entre les données obtenues in vitro et la validation translationnelle du chien dont la valeur est inestimable en médecine de précision (hétérogénéité génétique, épigénome, système immunitaire, partage des facteurs d'environnement, format). Nous utiliserons des animaux à l'âge de 4 à 5 semaines. Notre étude de caractérisation ainsi que les résultats in vitro montrent que la fibrose musculaire est significativement augmentée et quantifiable dès l’âge de 3 semaines. Le démarrage du traitement à 4-5 semaines permettra d’évaluer la capacité des composé testé à réduire l’endommagement musculaire et par conséquent, à différer l’installation progressive de la fibrose et ses conséquences fonctionnelles sur la musculature striée.
Effets d’un traitement aux glucocorticoïdes et à un inhibiteur de LSD1 dans un modèle inflammatoire au Dextran Sulfate Sodium (DSS)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles développent une inflammation de l'intestin par ingestion de Dextran Sulfate Sodium pendant six jours, avec saignements, douleur intestinale, déshydratation et perte de poids, puis reçoivent des injections de dexaméthasone et des gavages d'un inhibiteur de LSD1. Le porteur indique ne prévoir ni anesthésie ni analgésique, la buprénorphine interférant avec la réaction inflammatoire étudiée, et ne traiter les animaux que si au moins trois d'un même groupe atteignent un score de douleur élevé. Il conclut que le recours à un "organisme entier" est "nécessaire" et présente la souris comme un modèle de référence proche de l'intestin humain.
Objectifs
Les glucocorticoïdes sont de puissants agents anti-inflammatoires utilisés pour traiter les maladies inflammatoires chroniques telles que l’asthme, l’arthrite rhumatoïde, ou les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin. Néanmoins leur usage à long terme provoque de nombreux effets secondaires comme la fonte musculaire. Nous avons récemment montré que les effets délétères des glucocorticoïdes sur la masse musculaire étaient renforcés par une protéine nommée LSD1. Au niveau pharmacologique, l’injection de glucocorticoïdes combinée à la prise d’un inhibiteur de LSD1, le CC-90011, permet une réduction de la perte de muscle tout en conservant les effets anti-inflammatoires des glucocorticoïdes, ce qui présenterait un réel bénéfice pour les patients. Ces observations ayant été obtenues dans des conditions endogènes, nous souhaitons maintenant savoir si les effets anti-inflammatoires des glucocorticoïdes sont conservés dans un modèle d’inflammation de l'intestin.
Bénéfices attendus
Ces résultats nous permettront de déterminer les effets d'un traitement à la Dexaméthasone sur l'inflammation intestinale, et si un co-traitement avec le CC-90011 interfère avec les effets anti-inflammatoires des glucocorticoïdes. Contrôler l'activité du récepteur aux glucocorticoïdes en modulant celle des co-régulateurs tels que LSD1 ouvrira ainsi de nouvelles perspectives pour réduire les effets indésirables induits par les traitements aux glucocorticoïdes et améliorer le bien être des patients.
Procédures
Les animaux vont développer une inflammation de l'intestin par administration de Dextran Sulfate Sodium (DSS) dans l'eau de boisson pendant 6 jours. Ils subiront 3 injections par voie intrapéritonéale d'un glucocorticoïde, la Dexaméthasone, (1 min/ souris) afin de réduire l'inflammation et 3 gavages avec un inhibiteur de LSD1, le CC-90011, (1 min/ souris) qui permet de limiter les effets secondaires des glucocorticoïdes.
Impact sur les animaux
L’inflammation chronique peut conduire à des saignements du fait de l'inflammation associés à une douleur intestinale, une déshydratation et une perte de poids de l’animal. Ce traitement dure 6 jours et les premiers effets sont observables en général au 3è jour. L’injection de Dexaméthasone par voie intrapéritonéale prend moins d'une minute par animal. Ces injections répétées (3 par souris) peuvent exceptionnellement causer des infections au niveau du site d'injection. Le gavage peut rarement conduire à des fausses routes et à une irritation. Les différentes administrations de traitement pourront éventuellement générer un stress chez l'animal ainsi qu'une douleur au niveau du site d'administration.
Devenir
L’ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de la procédure pour des études moléculaires et histologiques.
Remplacement
Afin de déterminer les effets d’un traitement simple ou combiné avec des glucocorticoïdes et l'inhibiteur de LSD1 CC-90011 sur l’inflammation intestinale, le recours à un organisme entier est nécessaire. Par ailleurs, de nombreux facteurs et hormones interviennent dans l’homéostasie tissulaire. Ainsi, il est nécessaire d’utiliser un modèle in vivo afin que tous les facteurs physiologiques pouvant intervenir dans ce processus soient pris en compte. A ce titre, la souris est un modèle de référence. En effet, l'histologie de l’intestin de la souris est similaire à celle de l'homme.
Réduction
Le modèle d'inflammation et les traitements aux glucocorticoïdes sont maitrisés au laboratoire, permettant ainsi la mise en place d’expérimentations de qualité et raffinées sur un nombre limité d'animaux. Dans ce but, une même souris sera utilisée pour les analyses moléculaires et histologiques. Le paramètre limitant pour le nombre de souris est l’analyse moléculaire, pour laquelle les études montrent qu’il faut 10 animaux par condition pour détecter la différence escomptée à l’aide d’un test statistique approprié au risque de se tromper de 5%.
Raffinement
Le personnel qui effectuera les gestes techniques est formé et compétent. Les expérimentations prévues dans ce protocole seront exécutées sur l'animal vigile. Le risque d’infection sera pris en considération au niveau de la zone d’injection des glucocorticoïdes en vérifiant la présence d'un éventuel abcès. Cependant, l’injection de Dexaméthasone n'est en général pas problématique pour l'animal. Le risque de fausse route au moment du gavage sera également pris en compte en évitant de mettre l'animal sur le dos et en lui délivrant lentement le liquide contenu dans la seringue. La sévérité de la procédure impliquera une surveillance stricte des souris. Ainsi, les animaux seront observés et pesés quotidiennement. L’état de chaque souris sera référencé dans un tableau comprenant des indicateurs comportementaux et physiologiques permettant de détecter la souffrance des animaux. Les paramètres utilisés seront le poids, l’abondance de diarrhées, la posture de l’animal, l’état de son pelage, son activité. Ces indicateurs nous permettront d’anticiper toute souffrance inutile, et d’intervenir au plus vite afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Cette évaluation sera faite en conditions normales d'hébergement avec enrichissement et en maintenant les liens sociaux entre les animaux. Travaillant sur l’inflammation, nous n'avons pas prévu d'anesthésier les souris, ni de leur administrer d'analgésiques. En effet, la Buprénorphine est connue pour interférer avec la réaction inflammatoire. Cependant, si au moins trois animaux d'un même groupe atteignent un score de pathologie trop élevé, ensemble des animaux sera traité à la Buprénorphine afin de ne pas générer de biais dans l'expérience.
Choix des espèces
Les effets des glucocorticoïdes sur un type cellulaire donné impliquent des voies de signalisation complexes ainsi que le microenvironnement cellulaire. Il en va de même pour les mécanismes d’inflammation. Ainsi, l'utilisation de modèles cellulaires reste limitée. La souris présente un intérêt particulier pour l'administration de traitements pharmacologiques du fait de sa facilité de manipulation, mais aussi de la similarité avec l'homme, tant au niveau histologique qu'au niveau du type de réponse aux traitements. Le projet s’intéresse au rôle des glucocorticoïdes dans l’organisme adulte. Les animaux seront donc traités entre 10 et 13 semaines d'âge.
Toxicité d’aérosols de type « mélanges gaz/particules » d’intérêt défense : cas des résidus de combustions issus de propergols solides composites
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
782 rats mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Ils sont exposés par inhalation "nez seul" pendant quatre heures à du chlorure d'hydrogène et des particules d'alumine, subissent aspirations oropharyngées, instillations intratrachéales, gavages, jusqu'à vingt-cinq prélèvements de sang, des tests d'anxiété et de mémoire, une trachéotomie puis une perfusion intracardiaque. Le projet vise à définir des valeurs limites d'exposition pour les personnels du Ministère des Armées et du secteur aérospatial soumis aux résidus de combustion des missiles. Le porteur affirme qu'il n'existe "pas de méthodes alternatives" et que les études in vivo sont "indispensables", ne retenant que des mâles au motif qu'aucune donnée féminine n'est disponible.
Objectifs
Avec l’émergence de nouveaux systèmes d’armes, le cumul des expositions des personnels du Ministère des Armées devient de plus en plus complexe, et ces derniers peuvent de fait être exposés à des mélanges de polluants au cours de leur carrière. C’est notamment le cas lors de l’utilisation de propulseurs tels que les propergols solides composites nécessaires à la mise à feu rapide de missiles où les personnels peuvent être exposés simultanément à du chlorure d’hydrogène et des particules d’alumines par inhalation. Seule une étude sur les effets de ce type d’exposition a montré des phénomènes d’inflammation pulmonaires et systémiques précoces. L’objectif de ce projet est de poursuivre cette évaluation, en déterminant notamment si l’inflammation observée à court terme est persistante et si ces expositions impliquent d’autres types d’effets. Les résultats de ce projet devraient permettre de contribuer à définir des valeurs seuils chez les travailleurs du Ministère des Armées et du secteur aérospatial (valeurs limites d’exposition professionnelles) susceptibles d’être exposés à ce type de substances dans leur environnement professionnel, d’établir de nouvelles recommandations et d’identifier des biomarqueurs à analyser pour un meilleur suivi médical (examens pulmonaires, prises de sang, tests cognitifs, etc.).
Bénéfices attendus
Les études réalisées dans le cadre de ce projet permettront : - De déterminer les effets à long terme de l’exposition aiguë et subaiguë à des mélanges de chlorure d’hydrogène et de particules d’alumine (fibrose pulmonaire, atteintes cognitives, pathologies neurodégénératives, génotoxicité, etc.) ; - D’obtenir des informations sur les mécanismes d’action toxiques induits par ce type d’exposition ; - De comparer les données in et ex vivo obtenues à des données d’études in vitro réalisées en parallèle, et de définir si les modèles in vitro testés permettent une bonne prédictivité de la toxicité de ces substances/mélanges ; - De fournir des données contribuant à l’établissement de valeurs limites d’exposition professionnelles et de préconisations pour le suivi des personnels du Ministère des Armées par la médecine de prévention.
Procédures
Identification (moins de 5 min) : 1 fois ; anesthésie, perçage d’une oreille à l’aide d’une pince et tatouage en utilisant une encre dédiée (animaux stabulés plus d’un 1 mois). Observations cliniques et pesées (moins de 5 min) : au moins 2 fois/semaine, au maximum tous les jours. Aspiration oropharyngée (moins de 10 min/exposition) : 5 aspirations (jour 1, 2, 3, 6 et 7) ; anesthésie, manipulations pour exposition et exposition à la solution d’essai par aspiration oropharyngée. Instillation intratrachéale (moins de 10 min/exposition) : 5 instillations (jour 1, 2, 3, 6 et 7) ; anesthésie, manipulations pour exposition et exposition à la solution d’essai par instillation intratrachéale. Exposition par inhalation en mode "nez seul" : 1, 4 (1 exposition/jour/4 jours consécutifs) ou entre 16 et 24 expositions (1 exposition/semaine/4 à 6 mois) ; habituation à la contention des tubes d’exposition (stabulation dans les tubes jusqu’à 30 min/jour/3 jours consécutifs), exposition aux substances/mélanges d’essai (4h/exposition). Gavage (moins de 3 min/administration) : 1 à 3 gavages (jour 1, jour 1+24h et jour 1+45h) ; contention manuelle des animaux vigiles, gavage avec la solution d’essai. Prélèvements de sang (moins de 5 min/prélèvement) : 1 à 25 prélèvements (2 prélèvements/semaine/12 mois) ; contention manuelle des animaux vigiles, manipulations et prélèvement d’une goutte de sang. Comportement (15 min à 1h15/évaluation suivant les tests) : 3 ou 4 fois (1, 3, 6 et pour certains animaux 12 mois après la dernière exposition) ; placement des animaux vigiles dans des dispositifs de mesure de l’activité, de l’anxiété et des capacités de mémorisation, et enregistrement de leurs déplacements. Pléthysmographie (moins de 1h15/évaluation) : 2 à 48 fois (1 évaluation/semaine ou par mois/2 semaines à 12 mois) ; placement des animaux vigiles dans des enceintes de pléthysmographie corps entier et enregistrement de paramètres respiratoires. Mécanique pulmonaire (moins de 45 min) : 1 fois préalablement à la fin de l’étude ; administration d’un antalgique, anesthésie, acte chirurgical (trachéotomie), administration d’un myorelaxant et mesure de la mécanique pulmonaire. Perfusion intracardiaque/exsanguination (moins de 45 min) : 1 fois en fin d’étude ; administration d’un antalgique, anesthésie, actes chirurgicaux (laparotomie et thoracotomie) et perfusion avec du tampon phosphate salin.
Impact sur les animaux
Tatouage : stress lié à l’anesthésie ; Aspiration o.p. : stress lié à l’anesthésie ; Instillation i.t. : stress lié à l’anesthésie ; Exposition par inhalation en mode "nez seul" : stress lié à la manipulation et à la contention du placement dans les tubes, à l'immobilisation, à l'impossibilité de se nourrir et s’abreuver, et à l'isolement ; Gavage : stress lié au gavage et à la contention manuelle nécessaire pour le réaliser ; Prélèvements de sang : stress lié à la contention manuelle nécessaire pour le réaliser ; Analyse comportementale/pléthysmographie : Stress lié à la manipulation et au placement dans les dispositifs de test, à l'impossibilité de se nourrir et s’abreuver, et à l'isolement ; De manière générale, la manipulation des animaux pourra modifier leurs réactions à la préhension et leur niveau d’activité, et une légère perte de poids pourra être observée dans les jours qui suivront notamment les expositions/administrations des substances/mélanges d’essai. Les expositions/administrations de substances/mélanges d’essai pourront également induire des effets locaux et systémiques susceptibles de faire souffrir les animaux. Des signes cliniques anormaux, affectant notamment la respiration, les muqueuses et la physiologie, pourront être observés.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort aux temps de fin d'étude définis en fonction des analyses ex vivo prévues selon une méthode autorisée chez le rat.
Remplacement
Il n’existe pas à l’heure actuelle de méthodes alternatives à l’expérimentation animale qui permettent seules de déterminer la toxicité aiguë et subaiguë de l’exposition par inhalation à du chlorure d’hydrogène et des particules d’alumines, seuls et en mélange, notamment des effets cliniques, pulmonaires, cognitifs et systémiques immédiats, et à court et à long terme. Les études in vivo sont pour cette évaluation indispensables. Concernant le choix des animaux, le projet suivra les recommandations des lignes directrices de l’Organisation de Coopération et de Développement Economiques pour l’étude des effets respiratoires d’utilisation du rat, de souche couramment utilisée en laboratoire, au stade jeune adulte au moment de l’exposition aux substances/mélanges d’essai et de mâles. L’âge et le sexe des animaux utilisé a été défini comme étant représentatifs de la population humaine cible de ce projet. Seuls des mâles seront utilisés car il n’est pas attendu de variations significatives entre les deux sexes concernant les paramètres qui seront analysés, que le sexe n’est pas un facteur d’intérêt dans ce projet et que des données étant actuellement uniquement disponibles chez des mâles, seule l’étude de ce sexe sera pertinente pour la confrontation des données.
Réduction
Le nombre d’animaux qui sera utilisé a été déterminé sur la base de l’effectif minimum nécessaire pour mettre au point et valider un protocole de développement de fibrose pulmonaire, un protocole d’induction de génotoxicité et évaluer la toxicité de l’exposition aux substances/mélanges d’essai chez le rat. Il a été établi à partir des données bibliographiques disponibles sur l’induction de ces modèles pathologiques et par rapport aux paramètres in vivo (fonctions respiratoires, mécanique pulmonaire, fonctions cognitives) et ex vivo (biodistribution de l’alumine, marqueurs histologiques et biochimiques de toxicité et de génotoxicité) qui seront étudiés pour permettre une analyse statistique robuste et une extrapolation inter-espèces pertinente des résultats. Des tests appropriés au traitement de chaque type de données et à leur distribution seront utilisés pour les comparer et ainsi évaluer les effets de l’exposition aux substances/mélanges d’essai. De plus, plusieurs paramètres seront évalués sur un même animal, permettant ainsi de minimiser le nombre de rats utilisés.
Raffinement
Les conditions d’hébergement seront adaptées aux rats et enrichies pour favoriser leur bien-être. Ils seront hébergés à plusieurs par groupe expérimental (2 ou 3 animaux par cage) pour leur socialisation. Un fond sonore sera diffusé la journée pour leur permettre de s’habituer au bruit généré par les manipulations et ainsi limiter le stress pouvant être ressenti durant les expérimentations. Du matériau leur permettant de nidifier et du matériau en bois à ronger seront disposés dans leurs cages d’hébergement pour favoriser leur développement cognitif. Pour les animaux exposés par inhalation « nez seul », des tubes semblables à ceux utilisés pour l’exposition seront disposés dans leurs cages d’hébergement pour leur permettre de se familiariser avec ces objets et de se cacher. Préalablement à la 1ère exposition, ces animaux seront habitués à la contention imposée par le placement dans les tubes en y étant stabulés jusqu’à 30 min par jour durant 3 jours consécutifs. Les tubes seront tapissés de matériaux absorbants pour assurer le confort des animaux. Après chaque phase d’habituation, de la nourriture sera déposée dans leurs cages d’hébergement en guise de récompense. Des critères de raffinement des gestes techniques qui seront pratiqués (manipulation précautionneuse, surveillance continue, posologie adaptée, etc.), des points limites relatifs à l’apparition de signes de douleur (perte de poids, lésion, comportement anormal, etc.) et des actions correctives visant à soulager les animaux (surveillance accrue, traitements médicamenteux, etc.) ont été définis en adéquation avec les paramètres étudiés pour assurer leur bien-être.
Choix des espèces
Ces expérimentations seront réalisées chez le rat car sa physiologie est largement connue et car il constitue un modèle de prédiction des effets toxicologiques reconnu par la réglementation (cf. Document d'orientation de l’Organisation de Coopération et de Développement Economiques n°39). Ce projet suivra les recommandations des lignes directrices de l’Organisation de Coopération et de Développement Economiques pour l’étude des effets respiratoires, d’utilisation du rat et de souche couramment utilisée en laboratoire. Des animaux jeunes adultes (âgés de 6 semaines au moment de la 1ère exposition) seront utilisés. L’âge des animaux au cours de l’étude (jeunes adultes/adultes étudiés durant au maximum 12 mois) sera ainsi représentatif des scénarios d’exposition réalistes étudiés.
Validation d’un modèle de leucémie évalué par bioluminescence chez la souris NSG, en vue de traitement par CAR-T cells innovants – EU1/2
- Recherche appliquée
- Cancers
24 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance de léger à sévère. Dépourvues de système immunitaire, elles reçoivent en intraveineuse des cellules leucémiques humaines et développent une leucémie suivie par imagerie, jusqu'à des signes tels que poils hérissés, perte de poids et début de paralysie des pattes. L'étude ne fait que valider un modèle de leucémie et déterminer la dose de cellules cancéreuses, avant de tester dans un autre projet des cellules CAR-VST issues de donneurs sains. Le porteur revendique un modèle murin "indispensable" pour toute étude préclinique de thérapie cellulaire des hémopathies malignes.
Objectifs
La thérapie anti-cancéreuse par CAR-T cells permet de traiter la leucémie. Ces cellules sont conçues à partir des cellules du patient et sont modifiées génétiquement pour les armer contre les cellules cancéreuses. Bien qu’elles soient efficaces et arrivent à tuer les cellules cancéreuses, leur efficacité reste à court terme. De plus, leur préparation est complexe, longue et présente un risque potentiel de contamination par des cellules malades. En conséquence, la production de cellules CAR-T à partir de donneurs sains se développe, pour les rendre immédiatement opérationnelles. Dans ce projet, nous souhaitons utiliser des cellules provenant de donneurs sains et qui sont anti-virales (VST). L’une des particularités des VST est qu’elles persistent à long terme chez les patients, ce qui permettrait d’apporter un bénéfice majeur à la production de CAR-T. Après modification génétique, ces nouvelles cellules (CAR-VST) possèdent une double fonction : elles s'attaquent à la leucémie et ciblent également d'autres virus demeurant dans l'organisme après une infection. Ces cellules anti-virales spécialisées ont déjà montré des résultats prometteurs chez les patients, avec une capacité de persistance prolongée, offrant ainsi une alternative potentiellement plus efficace pour lutter contre la leucémie. Le modèle de souris que nous souhaitons utiliser pour prouver notre hypothèse est très bien décrit dans littérature. Ce projet se déroule dans deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Cette étude préliminaire aidera à déterminer la quantité de cellules cancéreuses nécessaires pour créer une leucémie chez les souris. Cela nous aidera à savoir quand injecter les traitements futurs contre le cancer, qu'ils soient classiques (CAR-T cells) ou nouveaux (CAR-VST). Dans le traitement des cancers du sang, les CAR-T cells ont montré leur efficacité à court terme chez les humains. Cependant, elles disparaissent rapidement, ce qui peut causer des rechutes chez les patients. En utilisant nos cellules anti-virales comme matière première pour créer les CAR-VST, nous pourrions améliorer leur capacité à rester actives plus longtemps et offrir une protection supplémentaire contre les virus chez les patients dont le système immunitaire est affaibli. Les résultats de cette étude préliminaire sont essentiels pour continuer à développer ce traitement innovant en vue de réaliser des tests sur des patients.
Procédures
- Une injection de cellules leucémiques à la veine de la queue (souris vigiles) - développement d’une leucémie sur quelques semaines - injections abdominales d’un produit d’imagerie et suivi régulier (sous anesthésie, durée 30 minutes) de la progression tumorale 1 fois par semaine pendant quatre semaines par imagerie Etablissement utilisateur 1 : -Une injection intraveineuse sur animal vigile des cellules leucémiques au jour 0 (1min) Etablissement utilisateur 2 : - Imagerie des souris par bioluminescence : contention et injection intrapéritonéale (IP) d’une substance permettant de tracer les cellules leucémiques (1min). - retour en cage hébergement pendant le temps où la substance agit (10min) - au bout de 5 min, induction de l'anesthésie pour que l’animal reste immobile pendant l’imagerie (1min) - acquisition par bioluminescence (3min) avec possibilité de placer 5 souris dans l'appareil en même temps - arrêt de l’expérimentation au dernier jour (28e jour) ou lorsqu’un point limite est atteint et sacrifice des souris
Impact sur les animaux
- L’injection intraveineuse n’est pas douloureuse – au pire elle peut induire un saignement léger après retrait de l’aiguille au point de ponction (arrêté par compression avec une compresse stérile). - Dans les jours suivants l’injection des cellules cancéreuses, les souris présenteront des signes cliniques tels des poils hérissés, moins d'activité et une perte de poids, et en cas extrême, un début de paralysie des jambes. - Les animaux seront modérément stressés lors de l’injection dans l’abdomen du produit d’imagerie, suivi des anesthésiques. Pendant la prise d'images, les souris seront endormies et ne ressentiront aucune douleur .
Devenir
Les souris étant totalement dépourvues de système immunitaire et ayant reçu une injection des cellules leucémiques, une progression tumorale va pouvoir se développer. Afin d’éviter une souffrance à l’animal, les animaux ne seront pas conservés au-delà de 28 jours post injections ou en cas de point limite atteint.
Remplacement
Nous continuons à réaliser des expériences in vitro pour générer des résultats sur le ciblage des cellules tumorales et valider la fonctionnalité des cellules humaines anti-leucémiques, de façon à limiter le nombre d’expériences chez l’animal. La culture cellulaire à partir de cellules humaines est donc la base de notre projet pour produire des cellules traitement. Cependant, les cultures cellulaires ne permettent pas reproduire la complexité des interactions entre les cellules leucémiques et le microenvironnement tumoral développé in vivo. Cette saisine permet de valider un modèle de leucémie chez la souris, ce qui nous permettra dans une deuxième saisine de vérifier l’efficacité d’un nouveau traitement cellulaire par rapport à un traitement de référence. Ces informations sont cruciales pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques chez l’homme. La détermination des doses de cellules leucémiques à injecter chez la souris permettra de valider un modèle développant une tumeur identifiable sur plusieurs semaines.
Réduction
Nous utilisons le moins de souris possible pour obtenir des résultats statistiquement valables. Nous arrêterons les tests dès que nous verrons une grande différence entre les groupes, avec au moins 3 souris par groupe et au maximum 6.
Raffinement
Les souris seront logées dans une grande cage avec des jouets et des matériaux, avec seulement 3 à 6 souris par cage, pour qu'elles aient suffisamment d'espace. La pièce où les souris seront logées sera bien aérée, dans une zone spéciale pour les souris nécessitant un suivi quotidien, avec un contrôle de la température, de l'humidité et de la lumière pour qu'elles se sentent bien. Leur nourriture est préparée de manière à être ultra propre pour éviter les problèmes de contamination microbienne, et leur eau est stérilisée pour éviter les maladies. Chaque jour, quelqu'un vérifiera leur état de santé et détectera d’éventuels signes de souffrance. Si elles ne se sentent pas bien, un guide permet de savoir la conduite à suivre pour réduire ou stopper la souffrance.
Choix des espèces
La souris NSG ne possédant pas de système immunitaire, accepte les cellules humaines normales et leucémiques. Ce modèle murin est mondialement reconnu et indispensable pour valider toute étude pré-clinique de thérapie cellulaire dans les hémopathies malignes. Ce modèle permet d’une part d’étudier l’impact de nouvelles thérapies cellulaires et l’effet anti-leucémique, et d’autre part d’analyser les mécanismes d’action des cellules de thérapie cellulaire. Les résultats obtenus seront indispensables à l’élaboration d’essais cliniques chez l’homme dans un second temps. Les souris sont expérimentées à partir de 8 à 10 semaines de vie, pour limiter la variabilité de poids, et parce que dans la littérature la prise de greffe humaine est meilleure dans cette période de vie.
Surexprimer le levier TET1 pour rajeunir les cellules oligodendrogliales et la cognition dans des modèles murins viellissants
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
448 souris vont être utilisées, tuées à l'issue de chaque procédure, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, un groupe étant conservé pour entretenir la lignée. Elles subissent une chirurgie d'injection dans le cerveau, un traitement dans l'eau de boisson qui peut faire perdre du poids et des tests comportementaux dont un apprentissage sur roue complexe avec isolement partiel pouvant provoquer des "troubles dépressifs". Le projet cherche à réactiver un levier moléculaire, TET1, pour "rajeunir" des cellules du cerveau et améliorer la mémoire de souris âgées, les retombées cliniques restant renvoyées au long terme. Le porteur indique que les organoïdes ne suffisent pas à saisir les fonctions cognitives et affirme qu'il reste "nécessaire" d'utiliser des souris.
Objectifs
La cognition et son déclin avec le vieillissement font partie intégrante des maladies psychiatriques et neurodégénératives liées au développement et à l'âge. Si les circuits neuronaux sont à la base de l'organisation cérébrale, une accumulation de preuves a désormais mis en évidence le rôle potentiel des cellules protégeants les neurones (les oligodencrocytes) dans la cognition, comme la mémoire et l'apprentissage. Récemment, un levier moléculaire (TET1) nécessaire à la réactivation de ces cellules de soutien a été observé comme déficitaire au cours du vieillissement. Nous avons ainsi développé une lignée de souris modélisant une perte de ce levier Tet1 dans les oligodendrocytes seulement, imitant donc un profil âgé, même dans les animaux jeunes. Dans ce projet, nous allons tentons de rajeunir ces oligodendrocytes en réactivant TET1, afin de tester si cela est suffisant pour améliorer les fonctions cognitives chez des animaux âgés. Ce projet est divisé en plusieurs étapes 1/ Caractériser l'efficacité et la spécificité de notre réactivation ; 2/ Caractériser l'effet de la réactivation de TET1 sur les fonctions de mémoire et d'apprentissage sur le modèle murin ; 3/ Identifier les cibles moléculaires et protéiques de TET1. En caractérisant l'effet de TET1 sur les oligodendrocytes et son potentiel rajeunissement de la cognition chez les souris vieillissantes, notre projet pourrait donner lieu à des développements cliniques à fort impact.
Bénéfices attendus
Nous espérons que ce projet répondra aux besoins scientifiques suivants. À court terme : une meilleure compréhension du rôle de TET1 dans la réactivation - et l'identification des voies moléculaires de réactivation - des oligodendrocytes dans des modèles de souris âgées. À long terme : développer des stratégies translationnelles basées sur ce levier pour rajeunir rajeunir les cellules du cerveau et donc limiter les pertes de fonctions cognitives au cours du vieillissement et dans les maladies neurodégénératives. Le déclin de la cognition représente un problème majeur de santé publique, car les déficits d'apprentissage développemental et la démence liée à l'âge peuvent fortement affecter la qualité de vie des personnes et les dépenses de santé globales.
Procédures
Quelques souris seront soumises à un bref (5 secondes, une fois) punch d'oreille pour le génotypage. Ces souris seront aussi soumises à un traitement dans l'eau de boisson (2 semaines, une fois). Les souris seront soumises à des tests comportementaux (1 à 2 semaines, une fois). Les souris seront injectées chirurgicalement dans une zone du cerveau (chirurgie de 30 minutes, comprennat le temps pré- et post-opératoire, une fois). Les souris seront anesthésiées avant d'être euthanasiées (1 minute, une fois).
Impact sur les animaux
Lors du génotype avant sevrage ou pendant la chirurgie, on pourrait noter quelques saignements. Le traitement dans l'eau de boisson peut induire une perte de poids. Lors des tests comportementaux, les souris seront partiellement isolées et peuvent donc présenter des troubles dépressifs. Après la chirurgie, les animaux pourraient ressentir de la douleur, qui devrait etre limitée par les traitement anti-douleur prévus.
Devenir
Toutes les animaux expérimentaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure. Un groupe de souris sera conservée dans notre animalerie, afin de préserver la lignée de souris générée pour des études ultérieures.
Remplacement
Si des progrès ont été réalisés pour modéliser les pathologies et la connectivité neuronale dans des modèles de cultures (organoïdes par exemple), ces modèles ne suffisent pas à appréhender pleinement les fonctions cognitives au niveau de l'organisme. À l'heure actuelle, il est nécessaire d'utiliser des modèles de souris pour mieux aborder le rôle de cellules spécifiques dans la mémoire et l'apprentissage. En parallèle, nous exploitons des modèles in vitro de co-cultures primaires, de lignées cellulaires et de cellules pluripotentes humaines. En effet, nous allons d'abord optimiser notre protocole sur des lignées cellulaires Olineu, afin de limiter les étapes d'optimisation sur des cultures cellulaires primaires de souris.
Réduction
Afin de calculer au plus juste le nombre d'animaux nécessaires dans chaque procédure expérimentale afin de détecter un effet statistiquement pertinent, nous avons effectué une analyse de puissance grâce à plusieurs tests statistiques. En raison de la variabilité interindividuelle, nous avons prévu d'inclure 5 à 10 souris par groupe, pour chacun des essais comportementaux. Nous n'avons remarqué aucune différence de comportement entre les sexes lors de nos études précédentes, nos groupes de souris seront donc composées de souris des deux sexes.
Raffinement
Les animaux sont sous la surveillance et l'observation quotidiennes de soigneurs animaliers formés et chargés de veiller à leur bien-être. Pour la chirurgie, les souris recevront une injection d'analgésique, une heure avant la chirurgie et deux fois par jour les 2 jours suivants. Les animaux seront anesthésié pendant toute la procédure. Les animaux seront placés sur un tapis chaufant pour maintenir leur température corporelle. Une pommade ophtalmique sera appliquée sur les yeux pour éviter le dessèchement de la cornée et les yeux seront ensuite couverts pour éviter une exposition intense à la luminosité pendant la procédure. La chirurgie sera réalisée dans des conditions stériles (gants, outils, instruments,...). Après la chirurgie, les animaux seraont placés sous une lampe chauffante jusqu'au réveil. Des granulés alimentaires ramollis et de l'eau supplémentaires seront fournis à l'intérieur de la cage, afin de facilité leur alimentation et hydratation, et donc limiter leur perte de poids. Pour la procédure d'apprentissage de la roue complexe, les animaux seront hébergés individuellement jusqu'à 7 jours dans une cage enrichie, dans laquelle nous n'observons normalement aucun phénotype d'isolement social. A noter que l'isolement est ici partiel : les cages sont transparentes donc l'animal a des contacts visuels et auditifs avec ces congénères. Cependant, si nous observons un changement de comportement ou un manque d'intérêt pour la roue, l'animal sera exclu de la procédure et replacé dans une cage en groupe. Les souris peuvent perdre du poids quand leur eau de boisson est supplémentée. Si l'état général du corps atteint des points limites, les souris seront euthanasiées par dislocation cervicale après anesthésie.
Choix des espèces
Les modèles de souris sont pertinents car ils sont couramment utilisés dans les études comportementales portant sur les fonctions et les déficits cognitifs. Comparer des souris jeunes et âgées, ici à l'âge de 2 moisou de 18 mois respectivement, nous permet de caractériser au mieux le déclin des fonctions d'apprentissage et de mémoire avec l'âge. Ces âges sont idéaux pour notre étude, car les souris jeunes possèdent de bonnes capacités d'apprentissage et de mémoires, alors que les souris âgées présentent des capacités réduites.
Analyse du rôle de DIS3 dans le développement embryonnaire
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
156 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les femelles reçoivent une double injection hormonale pour être superovulées, sont accouplées puis tuées pour prélever leurs embryons, les mâles étant réutilisés pour la reproduction avant d'être tués à leur tour. Le projet vise à comprendre le rôle de la protéine DIS3 dans le développement embryonnaire précoce, avec un lien seulement "à plus long terme" vers le myélome multiple humain. Le porteur conclut qu'aucun modèle ne reproduit le développement du zygote à la morula et qu'il n'existe donc "pas d'alternative de remplacement".
Objectifs
La protéine DIS3 est un facteur qui est fréquemment muté chez les patients souffrant d'un cancer : le myélome multiple. Il est donc important de caractériser cette protéine. Ce projet se propose d'adresser cette question, en commençant par caractériser l'impact de l'absence de DIS3 chez la souris, un organisme modèle mammifère. Des données préliminaires indiquent que DIS3 est importante pour le développement embryonnaire. Ce projet vise à comprendre quel est le rôle de DIS3 dans ce processus en: (i) déterminant le stade précis auquel les embryons dépourvus de DIS3 meurent, (ii) caractérisant spécifiquement les cibles de DIS3 dans des cellules mutantes durant la fenêtre de temps durant laquelle les embryons sont encore vivants alors que l'activité DIS3 est limitante), et (iii) en effectuant des expériences d’immunofluorescence afin de valider l’expression de DIS3, ainsi que de marqueur du développement embryonnaire précoce, avec des anticorps appropriés. Cette étude permettra de mieux comprendre le rôle de DIS3 dans un organisme mammifère modèle et donnera des bases pour contribuer ultérieurement à comprendre son rôle dans l'apparition de myélome multiple chez l'homme.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de déterminer les ARN dérégulés en absence de DIS3 et de comprendre comment l’absence de cette protéine conduit à une létalité précoce lors du développement embryonnaire. Ces données permettront aussi de déterminer les caractéristiques des ARN cibles de DIS3. A plus long terme, les caractéristiques de ces ARN affectés par DIS3 lors du développement précoce pourront être extrapoler pour suggérer comment l’altération de cette protéine conduit au développement de myélome multiple.
Procédures
Les souris femelles jeunes adultes seront super-ovulées: elles auront une injection intraperitonéale de deux hormones à 48 ou 72h d’intervalle. (Les injections intraperitonéales durent quelques secondes.) Les femelles sont accouplées avec des mâles fertiles juste après l’injection de la seconde hormone et les bouchons vaginaux sont relevés le lendemain matin (preuve de l’accouplement). Elles seront alors euthanasiées pour effectuer le prélèvement des embryons au stades souhaités. En cas d'absence de bouchon vaginal, les souris peuvent être gardées en quarantaine 3 semaines avant de suivre un nouveau cycle de superovulation. Ceci vise à réduire le nombre de femelles utilisées dans nos expérimentations. Durant cette quarantaine, les animaux sont gardés sous surveillance le temps de retrouver un cycle estrien normal et d'écarter toute femelle gestante qui serait dû à un bouchon vaginal manqué. Les souris mâles seront réutilisées autant que possible et euthanasiées par le même procédé une fois qu'elles ne seront plus requises.
Impact sur les animaux
La procédure invasive pouvant générer une souffrance animale pour cette étude sera une double injection d’hormone à 48h ou 72h d’intervalle pour super-ovuler les souris femelles. Seules les jeunes souris femelles adultes seront soumises aux injections d’hormones (procédure invasive) et serviront à obtenir des embryons. Plus généralement, les stress seront minimisés car le maintien des animaux sera effectué par des professionnels expérimentés et bien formés.
Devenir
Les souris femelles super-ovulées seront euthanasiées pour effectuer le prélèvement des embryons au stades souhaités.
Remplacement
Du fait des connaissances actuelles en particulier sur le développement embryonnaire, et de la disponibilité d’outils génétique performants, la souris est le modèle mammifère le plus adapté pour ce projet. Malgré les progrès récents dans la culture de cellules ayant des caractéristiques proches de celles présentes lors du développement précoce, l'embryon de modèles animaux reste le système modèle le plus avancé et le plus approprié pour étudier les mécanismes moléculaires de ce stade biologique. En effet, il n’y a pas de modèle récapitulant le développement du stade zygote au stade morula. En conclusion, aucun modèle ne permettant de reproduire le développement embryonnaire existant pour cette étude, il n'existe pas d'alternative de remplacement.
Réduction
(i) La super-ovulation optimisée permettra d'accroitre le nombre d'embryons par souris femelle et la qualité de ces derniers. Cela contribuera donc à réduire le nombre d'animaux utilisés. (ii) Pour accroitre le nombre d’embryon de bonne qualité, l'intervalle de temps entre les injections hormonales sera optimisé. (iii) Afin de limiter les mises au point avec des embryons, la qualité des anticorps sera validée au préalable en utilisant du matériel biologique dérivé de cellules les plus adaptées. (iv) Afin de limiter le nombre de souris mâle utilisée, les souris mâles fertiles seront réutilisées autant que possible. Aucun test statistique n'a été utilisé.
Raffinement
Pour un traitement optimisé, les deux hormones seront injectées en fonction du poids des animaux et en utilisant des sites d’injection différents. Les injections seront rapides et ne nécessitent pas de dérogation aux conditions règlementaires d’élevage (maintien des groupes sociaux, maintien de l’enrichissement). Les prélèvements pour le génotypage seront effectués à un stade de développement minimisant la souffrance. A tous les stades de ce projet, si un signe de douleur est observé, les animaux seront pris en charge (si besoin par euthanasie).
Choix des espèces
Cette étude vise à comprendre le rôle de DIS3 au cours du développement embryonnaire précoce chez les mammifères. Du fait des connaissances actuelles en particulier sur le développement embryonnaire, et de la disponibilité d’outils génétique performants, la souris est le modèle le plus adapté pour ce projet. Ce modèle bien standardisé et caractérisé a été largement utilisé pour des études de développement ce qui facilitera les analyses (et indirectement réduira le nombre d'animaux utilisés du fait des outils et connaissances déjà disponibles). Par ailleurs, la souris est très proche de l'homme dans ses mécanismes biologiques et en particulier le développement facilitant un transfert des connaissances acquises lors du projet. Les animaux femelles seront utilisés au stade jeune adulte (8-10 semaines) afin de maximiser le nombre et la qualités des embryons obtenus par souris et donc de réduire le nombre de souris utilisées.
Localisation et rôle d’une apolipoprotéine dans l’inflammation du tissu adipeux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie reçoit pendant un à trois mois un régime enrichi à 60 % de lipides pour développer une obésité avec insulinorésistance ou diabète, et toutes passent des mesures de composition corporelle qui les enferment seules dans un tube environ 80 secondes. La mise à mort sert à prélever sang et tissus pour situer une apolipoprotéine, l'ApoM, dans le tissu adipeux et son inflammation. Le porteur décrit des retombées de "connaissances théoriques" sur la biologie du tissu adipeux et indique que de nouvelles explorations physiologiques "nécessitent" le recours à l'animal.
Objectifs
L’obésité, caractérisée par un excès de tissu adipeux, s’accompagne à long terme de complications métaboliques et cardiovasculaires dont les mécanismes d’installation sont encore à clarifier. D'autre part, cette pathologie est décrite comme étant associée à une inflammation à bas niveau avec un recrutement de macrophages pro-inflammatoires. Longtemps considéré comme un tissu de réserve énergétique, le tissu adipeux est maintenant reconnu comme un organe central du métabolisme énergétique qui produit et sécrète des facteurs. Nommés adipokines, bénéfiques ou délétères, ces facteurs peuvent agir à distance ou au sein même du tissu. Une meilleure connaissance de ces adipokines participe à la compréhension des complications métaboliques associées à l'excès de masse grasse ainsi qu'à l'inflammation systémique ou adipocytaire souvent associée. Nous avons mis en évidence une nouvelle adipokine, l'ApoM,dont les caractéristiques fonctionnelles ont été très peu explorées dans le domaine de l’obésité; elle a été initialement décrite produite par le foie. Nous émettons l’hypothèse qu’une altération de la production de l'ApoM par le tissu adipeux pourrait contribuer au développement d’une inflammation locale voire sytémique. D'autre part, nous souhaitons étudier la localisation de cette adipokine au sein du tissu adipeux, mais également dans les adipocytes, cellulesconstituant majoritaires, ce qui pourrait nous aider à mieux comprendre son rôle dans ce tissu et cette cellule.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait nous apporter de nouvelles conaissances théoriques sur la biologie du tissu adipeux et mieux caractériser le lien entre l'ApoM et l'inflammation d'une part et l'ApoM et la fonction lipolytique (cette activité consiste en l'hydrolyse des triglycérides, réserves énergétiques de l'organisme, mobilisés lors des périodes de déficit énergétique comme après un jeûne, un exercice physique,...) des tissus adipeux d'autre part.
Procédures
Les principales interventions sont les suivantes : alimentation de certains animaux par du régime enrichi en lipides à hauteur de 60% pendant 1 ou 3 mois; mesure de la composition corporelle de manière mensuelle sur tous les animaux de la procédure n°1, mesure qui dure en moyenne 80 secondes par animal.
Impact sur les animaux
Des nuisances seront à noter lors de la mesure des compositions corporelles des animaux qui sont alors contraints dans un tube et isolés de leurs congénères pendant environ 80 secondes. Des nuisances, liées à la mise en régime enrichi en graisses pendant plusieurs mois pourront survenir, tels que développement d'une obésité associée à une insulino-résistance ou à un diabète.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort. En effet, le sang et de nombreux tissus seront prélevés pour des analyses d'expressions géniques, protéiques, de cytométrie en flux, histologiques ou immunocytochimiques de marqueurs ou cellules impliqués dans les processus inflammatoires ou permettant de visualiser des changements de localisation de notre apolipoprotéine d'intérêt.
Remplacement
Une corrélation négative entre l'expression de l'APOM dans les tissu adipeux blancs et l'indice de masse corporelle a été décrite chez l'Homme. Ainsi chez des personnes obèses présentant la plus forte inflammation le niveau de l'ApoM adipocytaire est grandement diminué par rapport à des sujets normo-pondérés pour lesquels le tissu adipeux est extrêmement peu inflammé. Pour mieux comprendre les liens entre ces deux phénomènes des analyses sont menées chez l'Homme mais de nouvelles explorations physiologiques nécessitent l'usage de modèles animaux. Ces expériences seront également complétées par des approches utilisant des cultures cellulaires et la mise en contact de milieux conditionnés d'adipocytes sur des lignées de macrophages.
Réduction
Grâce à l'utilisation du Minispec, appareil permettant de mesurer la répartition des masses grasse et maigre, nous pouvons réaliser un suivi longitudinal mensuel de l'évolution des ces paramètres sans avoir à mettre à mort les animaux. Comme l'animal est son propre contrôle, des analyses statistiques appariées type test de Wilcoxon pourront être utilisées. Sinon, la plupart du temps nous utiliserons des analyses à comparaisons multiples (ANOVA à une ou deux voies) grâce à un logiciel que nous maîtrisons bien depuis plusieurs années.
Raffinement
Les animaux seront hébergés par fratrie, dans des cahes sur portoirs ventilés en respectant le nombre maximal indiqué dans la Directive Européenne 2010/63/UE. De l'enrichissement type feuille de papier, bâtonnets en bois ou igloo seront systématiquement ajoutés dans les cages. Un suivi quotidien sera réalisé soit par le personnel de la zootcehnie soit par les expérimentateurs en charge du projet.
Choix des espèces
L’espèce Mus musculus (souris), mammifère proche d’Homo sapiens, est le modèle animal expérimental le plus étudié dans la littérature notamment pour les études physiologiques et métaboliques, ce qui permet de meilleures comparaisons et une certaine pertinence des résultats. Les animaux sont mis en régime dès leur sevrage et seront hébergés ainsi au maximum pendant 3 mois. Lors d'une précédente étude, nous avons pu montrer, par l'expression de quelques marqueurs, que le pic de l'inflammation était atteint dans les conditions décrites ci-dessus. Pour ce qui concerne la localisation cellulaire d'ApoM, il n'est pas nécessaire d'attendre si longtemps. Le tissu adipeux doit rester dynamique et répondeur aux divers stimulis, ce qui est constaté chez des animaux jeunes.
DETERMINATION DES CONDITIONS DE CROISSANCE DE CELLULES CANCEREUSES IMPLANTEES PAR VOIE INTRAVEINEUSE CHEZ LA SOURIS IMMUNODEPRIMEE OU IMMUNOCOMPETENTE
- Recherche appliquée
- Cancers
2 185 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent en intraveineuse des cellules tumorales humaines ou murines pour reproduire des leucémies, des lymphomes ou des métastases sanguines, puis subissent des injections répétées, des prélèvements de sang à la veine saphène et des séances d'imagerie sous anesthésie deux à trois fois par semaine. Le projet ne teste aucun traitement, il cale les conditions de greffe comme la densité cellulaire et la souche en amont d'études pharmacologiques menées ailleurs. Le porteur affirme que la recherche d'efficacité chez l'animal reste "indispensable" et présente cette mise au point comme un moyen de réduire le nombre d'animaux des études futures.
Objectifs
L’objectif de ce projet consiste en la mise en place d’un modèle tumoral « orthotopique » ou « métastatique » chez la souris par injection de cellules tumorales (humaines ou murines) par voie intraveineuse (IV) dans le but de mimer des tumeurs hématologiques (leucémies, lymphomes,…) ou des métastases expérimentales en « court-circuitant » les premières étapes du phénomène métastatique pouvant provenir de tumeurs solides (migration dans la matrice extracellulaire, intravasation dans le vaisseau sanguin) pour ne mimer que la dissémination dans la circulation sanguine. La mise au point et la caractérisation de ce modèle se situe en amont des études d’activité et d’efficacité anti-tumorale, afin de définir les caractéristiques de croissance, les conditions optimales de greffe (densité cellulaire, souche de souris, …), ainsi que la durée limite de l’étude sur laquelle nous pourrons réaliser les études pharmacologiques ultérieures. Ces études de mises au point sont primordiales puisqu’elles permettent d’acquérir une bonne connaissance des modèles et constituent un paramètre essentiel pour une évaluation pharmacologique optimale de nos produits anti-cancéreux. Des cellules cancéreuses humaines ou murines vont être greffées par injection intraveineuse, chez des souris soit immunodéprimées (c’est-à-dire avec un système immunitaire déficient voire absent) pour permettre la greffe de tumeurs humaines, soit immunocompétentes (c’est-à-dire avec un système immunitaire parfaitement fonctionnel) pour permettre la greffe de tumeurs murines. Ce second modèle permettra l’évaluation de produits anti-cancéreux ayant recours au système immunitaire pour être actif et efficace (comme l’immunothérapie ou les thérapies ciblées). Ce projet décrit deux modalités de suivi de la dissémination tumorale au cours du temps ; la première, qui sera privilégiée, utilise l’imagerie optique, mais ne peut être mise en œuvre que selon la disponibilité de lignées tumorales génétiquement modifiées pour être bioluminescentes. La seconde se basera sur des analyses ex-vivo après prélèvement des tissus et organes des souris
Bénéfices attendus
Ce projet s’inscrit dans le cadre de la recherche en oncologie. Les bénéfices attendus du projet sont la détermination des conditions optimales de greffe en intraveineuse (limitation de la variabilité inter individuelle et temps d’expérimentation correct pour pouvoir ensuite faire une étude pharmacologique) pour ensuite évaluer et sélectionner sur ces modèles, le meilleur candidat médicament (études réalisées dans le cadre d’un autre projet autorisé) . Ces modèles permettront de déterminer l’indication thérapeutique du candidat médicament, en monothérapie ou en combinaison avec d’autres molécules pour son développement clinique futur.
Procédures
Injection intraveineuse des cellules tumorales sur animal vigile (1 fois, moins de 30 secondes)) Injection intra-péritonéale de l'agent réactif pour les mesures en bioluminescence , 2 à 3 fois par semaine (moins de 10 secondes) ; 1 à 2 prélèvements de sang par microsampling par semaine à la veine saphène (moins de 30s) suivant les recommandations de la structure de bien-être animale ; anesthésie générale pour l'imagerie par bioluminescence, quelques minutes, 2-3 fois/sem.
Impact sur les animaux
Une potentielle source de stress/douleur peut provenir : De l’envahissement tumoral/ mestastases lié au modèle pathologique recherché. De la greffe de cellules tumorales par voie intraveineuse. La contention d’une durée maximale de 30s peut générer du stress et l’injection (moins de 30s) de la douleur. De l’injection en intra-péritonéale du substrat réactif (luciférine) pour les mesures d’imagerie par bioluminescence : la contention d’une durée maximale de 15s peut générer du stress et l’injection (moins de 10s) de la douleur. Pour les prélèvements de sang, il est nécessaire de tondre les pattes arrières de l’animal. La contention ainsi que la tonte de la patte d’une durée maximale de 30s peuvent générer du stress. Du prélèvement de sang au niveau de la veine marginale de la patte. La contention d’une durée maximale de 2min ainsi que le prélèvement (moins de 30s) peuvent générer du stress et de la douleur. De l’induction de l’anesthésie pour la mesure d’imagerie : l’induction qui est rapide peut générer du stress.
Devenir
Toutes les souris incluses dans les études sont euthanasiées si des points limites sont atteints ou en fin d’étude et les organes et le sang pourront être prélevés afin de vérifier l’envahissement tumoral et/ou métastatique via des analyses qualitatives.
Remplacement
La recherche d’efficacité de candidats chez l’animal reste aujourd’hui indispensable, c’est pourquoi les conditions expérimentales doivent être le plus possible fiabilisées afin de n’utiliser que le strict minimum d’animaux pour les études pharmacologiques ultérieures. Ce projet permet de déterminer ces conditions.
Réduction
Le système d’imagerie optique est non invasif et permet de suivre un même animal au cours du temps, réduisant considérablement le nombre d’animaux inclus par étude. Concernant les procédures pour lesquelles nous utiliserons des lignées tumorales non génétiquement modifiéesne permettant donc pas des mesures par imagerie bioluminescence, si les méthodes de détection des cellules tumorales dans le sang prélevé par microsampling (prélèvement de petits volume de sang, répétés au cours du temps sur un même animal) sont validées et corrélées avec l’envahissement tumoral réel, alors cette méthode pourra permettre d’effectuer le suivi de l’évolution sur un même animal et réduira donc considérablement le nombre d’animaux utilisés. Ce projet sert à définir les conditions expérimentales optimales de greffe et leurs caractéristiques de progression tumorale en amont des projets de recherche de traitements efficaces. Il contribue ainsi à la réduction du nombre d’animaux utilisés dans ces futures études en permettant une bonne connaissance des caractéristiques expérimentales comme la variabilité et de définir ainsi les designs et effectifs adaptés afin de garantir la réussite de ces études. Un accompagnement par le service bio-statistiques permettra de déterminer les meilleures conditions de expérimentales.
Raffinement
L’évaluation de la dissémination tumorale par bioluminescence est une technique non invasive pour l’animal et qui ne requiert qu’une simple anesthésie de courte durée. Le suivi du développement tumoral en imagerie sera effectué 2 à 3 fois/semaine, sous anesthésie gazeuse, sur une surface plane et thermostatée. Une surveillance accrue sera réalisée si les souris présentent un fort signal de bioluminescence. La mesure du poids corporel sera effectuée 2 à 3 fois/semaine ainsi que le suivi des signes cliniques. Cette surveillance accrue vise à suivre et anticiper l’application des points limites si nécessaire. Les souris immunodéprimées seront hébergées et manipulées dans un secteur à confinement spécifique avec des procédures d’accès, des conditions d’hébergement et de manipulations strictes appliquées par tout le personnel et intervenants, et ce afin de les protéger de tout risque d’infection et/ou contamination. Des prélèvements de sang « en microsampling » peuvent être mis en œuvre afin de réaliser le suivi de la dissémination cellulaires dans le cas où l’utilisation de l’imagerie n’est pas possible et que la détection des cellules dans le sang est possible. Si des prélèvements répétés sont prévus, le volume maximal prélevé n’excèdera pas 15% de volume de sang total sur 28 jours. Cette technique de prélèvement, peu invasive, rapide, et pour de très petits volumes, permet de prélever plusieurs fois sur un même individu, contribuant ainsi à la réduction du nombre d’animaux, tout en respectant les limites de volémie physiologiques et le bien-être animal. Dans le cas de greffes de cellules sans possibilité d’imagerie, les organes et tissus d’intérêt doivent etre prélevés en fin d’étude. Ces prélèvements terminaux sont réalisés sous anesthésie complétée d’une analgésie et sans réveil des souris. Les souris sont hébergées en groupes sociaux. Un enrichissement de milieu (éléments de nidification) adapté va également permettre de surveiller leur état général par l’observation de leur comportement vis-à-vis de celui-ci.
Choix des espèces
En oncologie, l’utilisation de souris est largement décrite dans les publications en recherche pré-clinique : ces modèles sont davantage étudiés et donc déployés chez la souris que chez le rat. Le modèle murin est à l’heure actuelle le modèle le plus couramment utilisé pour ce type de recherche en immuno-oncologie. Le choix du modèle animal est dicté par la tolérance des cellules à proliférer dans l’organisme de l’animal (souris immunocompétentes et/ou immunodéprimées) et le choix de la souche par les études de dissémination tumorale qui permettent de définir les conditions optimales de greffe. Les souris sont utilisées à partir de 6 semaines en début d’expérimentation. C’est l’âge classiquement utilisé dans tous les protocoles qui seront réalisés dans la sélection des candidats médicaments. Afin de ne pas avoir d’interférence avec les signes de vieillissement nous n’excéderons pas 10 mois d’âge à la fin des études.
Optimisation des traitements par Radiothérapie du petit animal
- Recherche fondamentale
- Oncologie
5 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis renvoyées vivantes à l'animalerie des clients ou collaborateurs via un transporteur. Elles arrivent porteuses de tumeurs greffées par des tiers et reçoivent une à dix séances de radiothérapie sous anesthésie gazeuse, l'établissement facturant ces irradiations comme une prestation de service à des sociétés privées ou des collaborateurs. Le porteur affirme qu'aucun effet secondaire n'est attendu de la radiothérapie et que la douleur ne justifie pas d'analgésique, tout en prévoyant la mise à mort des souris qui se dégraderaient. Sur le remplacement, il conclut que l'étude des médicaments ne peut se passer d'un "organisme entier" aux fonctions physiologiques intactes.
Objectifs
L’objectif des projets nécessitant de la radiothérapie (RT) préclinique est de développer l’association de la RT avec des traitements anticancéreux de types chimiothérapie, thérapie ciblée, nano médicaments ou encore immunothérapie. Ces projets nécessitent d’optimiser les schémas d’association (administrations simultanés ou en décallé, et dans ce cas optimiser l'ordre d'administration) et les fractionnements (dose et nombre de séances) optimums de la RT afin de pouvoir proposer en essai clinique des schémas d’associations les plus efficaces. Notre équipe possède un appareil de RT 3D guidée par l’image permettant de délivrer des traitements par RT similaires à ceux délivrés pour les patients. Ce type d’installation et de savoir-faire restent rares sur notre territoire Français et unique dans un rayon de 200km autour de notre établissement. C’est pourquoi des collaborateurs ou sociétés privées, évaluant ce type de combinaisons, font appel à nos services pour délivrer des traitements de RT sur leur souris. Ce projet concerne donc exclusivement le traitement par radiothérapie qui sera délivré pour nos clients ou collaborateur. Ces éances de radiothérapie sont réalisées sur des souris anesthésiés (anesthésie gazeuse) afin d'éviter les mouvements durant le traitement.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de développer et optimiser de nouvelles combinaisons et sera une base solide pour le développement d’essais cliniques.
Procédures
Les animaux seront traités par Radiothérapie externe (+/- imagerie par scanner pour des technique complexe de radiothérapie), sous anesthésie gazeusev(Isoflurane 2.5%). Ces séances pourront durer entre 5 minutes et 50 minutes selon la technique utilisée. Les animaux pourront recevoir de 1 à 10 séances de radiothérapie.
Impact sur les animaux
Les tumeurs formées par certianstypes de cellules peuvent former des nécroses en surface. En cas d’apparition de nécrose rune évaluation de potentielle de douleur sera réalisée par palpation de la tumeur nécrosée. Aucun effet secondaire ou nuisance dû à la Radiothérapie n’est attendu.
Devenir
Tous les animaux seront renvoyés à l’animalerie d’origine des collaborateurs / clients à l’issue de la procédure via un transporteur spécialisé.
Remplacement
L’étude de l’efficacité des médicaments ou des nanoparticules ne peut se passer d’un organisme entier avec ses fonctions physiologiques intactes et donc d’étude sur animaux. De plus, pour l’étude d’association avec des immunothérapies nécessites l’étude sur des animaux présentant un système immunitaire efficace. Enfin, il est largement décrit dans la littérature que l’effet de la radiothérapie dépend du niveau d’oxygénation (hétérogène uniquement en clinique et sur le modèle animal) et du microenvironnement tumoral composé à la fois de cellules cancéreuses, de cellules immunitaires, de fibroblastes, collagène et vaisseaux sanguins. Le REMPLACEMENT des animaux est donc impossible pour ces études. Toutefois des études préalables de l'activité des molécules d’intérêts sur culture cellulaire permettront de s’affranchir de l’utilisation d’animaux non justifiée (REMPLACEMENT).
Réduction
Les effectifs des animaux qui seront irradiés seront calculés et justifiés dans les DAPs de nos collaborateurs/clients. Ceux-ci seront calculés en fonctions des souches d’animaux utilisés, modèles tumoraux et des efficacités attendues de leurs combinaisons.
Raffinement
La totalité de la procédure expérimentale sera réalisée sous anesthésie isoflurane afin maintenir les animaux immobile et de réduire leur niveau de stress. La douleur associée à cette procédure ne nécessitera donc pas l’emploi d’analgésique. Après une séance de RT, les animaux sont réveillés sous lampe chauffante pour prévenir toute hypothermie puis replacés dans leur cage. Si besoin (cas de traitement par plusieurs séances de RT avec un les animaux pourront être hébergés dans notre animalerie afin de limiter le stress induit par les transports. Sinon les animaux, hébergés dans leur cage d'origine, avec les mêmes congénères, retourneront à l'animalerie des collaborateurs via un transporteur spécialisé, garantissant le maintien d'une tempéraure stable. Le trajet dure entre 5 minutes et 15 minutes. Dans le cas d'un hébergement dans notre animalerie, les souris seront maintenues dans des cages de 8-10 individus en présence d’enrichissement. Aucune toxicité n’est attendue suite à la RT délivrée. Cependant si des signes de douleur sont observés (animal prostré, perte d’orientation, perte de poids …), les animaux seront mis à mort après anesthésie gazeuse.
Choix des espèces
La petite taille des souris, leur grande fécondité, leur coût de production et d’entretien relativement peu élevé en font un animal de choix pour les laboratoires. De plus, le modèle murin est parfaitement approprié car les expérimentations in vitro ne permettent pas de simuler la complexité d’un organisme, notamment dans les études impliquant l’activation du système immunitaire. En oncologie, la plupart des modèles expérimentaux de cancers humains sont développés chez la souris. Dans le cas d’étude avec de l’immunothérapie, la souris porteuse de tumeurs syngéniques reste le modèle de choix dans les études de l’activation du système immunitaire anti-tumoral. La prise tumorale dans des souris avec un fonds génétique stable et homogène permet de travailler avec un nombre d’animaux relativement réduit et de traiter l’ensemble du groupe au même moment. Les animaux seront utilisés à l’âge déterminé par l’équipe qui greffe les tumeurs (âge dépendant du modèle, de la nécessité ou non d’avoir un système immunitaire mature…)
Etude de l’effet de la longueur de la chaine carbonée des acides gras sur la lipémie postprandiale
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
24 hamsters dorés vont être utilisés, tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent des gavages de matières grasses laitières une fois par semaine pendant trois semaines et des prélèvements de sang sous anesthésie, pour comparer l'effet de différents acides gras sur le taux de lipides après un repas. Le porteur indique réutiliser les mêmes individus sur deux cycles avec une semaine de repos, ce qui ramène l'effectif de 54 à 24. Les hamsters sont tués pour prélever le sang et les organes du métabolisme des lipides, les surnuméraires étant "recyclés" vers d'autres protocoles.
Objectifs
L’ingestion d’un repas riche en graisse provoque une augmentation excessive des lipides dans le sang. Cette augmentation est connue comme étant un facteur de risque de développer des maladies cardiovasculaires. Dans cette étude, nous allons vérifier si le remplacement d’une partie des lipides alimentaires par des acides gras qui ont une structure particulière (dits acides gras à chaînes courte et moyenne) entraînerait une moindre augmentation du taux de lipides après un repas et serait donc favorable à une meilleurs santé cardiovasculaire. Nous prévoyons donc d’administrer ces lipides laitiers par voie orale à des hamsters, d’analyser les différents taux de lipides dans le sang pendant les 6h qui suivent l’administration et de comparer les résultats avec ceux obtenus après l’administration chez ce même groupe de hamsters de lipides laitiers standards ou de l’huile de palme (acides gras connus pour leur effet délétère). Ces expériences seront réalisées sur deux lots d'animaux et les expérimentations sur chaque lot sont appelées par la suite cycle 1 d'expérimentation et cycle 2 d'expérimentation.
Bénéfices attendus
il est attendu une diminution des taux de lipides dans le sang après l’ingestion des lipides laitiers riches en acides gras à chaînes moyennes et courtes comparé aux lipides laitiers standard ou encore à l’huile de palme. Trois paramètres seront étudiés : l’évolution du taux de lipides pendant 6 heures après l’administration, taux cholestérol estérifié dans les HDL (bon cholestérol) et les LDL (mauvais cholestérol) et la mesure d’activité d’un transporteur de lipide (CETP). Les produits laitiers sont une source importante de protéines et de calcium, et leur consommation fait partie intégrante des habitudes alimentaires en France. La modification de leurs lipides pour les rendre moins susceptibles d’induire des maladies cardiovasculaires constituerait une amélioration significative de leur qualité nutritionnelle, et encouragerait davantage leur consommation.
Procédures
- Gavages une fois par semaine pendant 3 semaines. - Prélèvement de sang sous anesthésie gazeuse :
Impact sur les animaux
Gavage => nuisances en lien = stress de courte durée lié à la contention. Prélèvements sanguins sur animaux amnésiés => nuisances en lien = stress lié à l'anesthésie
Devenir
Juste après la dernière cinétique, les animaux seront mis à mort afin de récupérer le sang et les organes impliqués dans le métabolisme des lipides et en particulier dans la régulation de la lipémie postprandiale (foie, intestin, muscle, tissus adipeux). Si les animaux surnuméraires ne sont pas utilisés, ils seront recyclés dans la mesure du possible, vers les autres protocoles de l’animalerie .
Remplacement
La lipémie postprandiale est le résultat de plusieurs processus physiologiques impliquant la digestion, l'absorption, l'hydrolyse et la captation tissulaire. Il n'existe aucune méthode alternative (in silico ou in vitro) permettant de rendre compte de la complexité des mécanismes physiologiques impliqués dans la réponse postprandiale. Son évaluation exige donc une expérimentation in vivo.
Réduction
Afin de limiter le nombre d'animaux utilisés dans cette étude, nous avons prévu la réutilisation des animaux avec des périodes de Wash-out de minimum une semaine. En effet dans notre étude nous avons trois groupes correspondant chacun à une fraction lipidique. En théorie, il aurait fallu 54 animaux, au total, pour avoir 9 animaux/groupe/cycle d'expérience, alors que nous prévoyons seulement 24 hamsters pour la totalité de l'étude, soit une réduction de plus de 50%.
Raffinement
L'hébergement respecte les recommandations en vigueur chez les animaux de l'étude. L'enrichissement du milieu de vie est régulièrement amélioré (mise à disposition de carrés de coton, des tunnels, des morceaux de bois, du Sizzle dry Kraft pour occuper chaque individu dans la cage). Un suivi régulier des animaux est assuré par le personnel animalier (observation quotidienne de l’état général et du comportement, pesées hebdomadaires). Les protocoles expérimentaux pour chaque procédure sont optimisés afin d’obtenir le maximum d’informations et des résultats fiables. Les procédures utilisées étant de sévérité légère, nous utilisons des points limites adaptés qui consistent essentiellement à surveiller le poids des animaux, un animal ayant perdu du poids ne sera pas utilisé après la période de wash- out.
Choix des espèces
Le hamster syrien doré (Mesocricetus auratus) est un rongeur qui exprime la CETP (Cholesterol Ester Transfer Protein), ce qui en fait un modèle adapté à l'étude du métabolisme des lipides. En effet grâce à cette protéine de transfert, le hamster se caractérise par un profil lipoprotéique proche de l'Homme avec une répartition du cholestérol dans les LDL (Low Density Lipoprotein) et les HDL, contrairement à la souris ou au rat où l'essentiel du cholestérol est porté par les HDL. De manière similaire à l'homme, chez le hamster la production d'apolipoprotéine B est tissus-spécifique (intestinale pour la B48 et hépatique pour la l'apoB100) contrairement au rat et à la souris caractérisés par l'absence de cette spécificité. Ces caractéristiques seront tout à fait avantageuses pour l'étude de la lipémie postprandiale compte tenu du rôle de ces lipoprotéines dans la formation des chylomicrons et des VLDL. Les animaux commandés seront âgés de 8 semaines, soit à l'âge adulte. Pour une étude pilote sur la lipémie postprandiale, nous avons choisi de faire nos tests sur des mâles. En effet des études cliniques montrent que les hommes présentent une lipémie postprandiale plus élevée que les femmes en réponse aux mêmes repas. Si les résultats montrent une réponse postprandiale différente en fonction des fractions lipidiques ingérées, il serait intéressant d’envisager l'expérience sur des femelles.