Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 2023-10-31 00:00:00
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-536262)
192 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger. Modifiées pour reproduire le syndrome DYRK1A, elles subissent des imageries rétiniennes et une électrorétinographie sous anesthésie, avec pose d’électrodes, puis sont tuées avant réveil pour prélever cerveau et rétines. Le porteur présente les imageries comme sans contact et indique que la principale gêne tient au stress du transfert et à l’anesthésie. Il écarte le poisson zèbre, porteur de deux gènes proches, et conclut que la souris est l’espèce « la mieux adaptée ».
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Note de l'OXA. Cette question est celle du formulaire européen de résumé non technique. Elle est posée au laboratoire qui demande l'autorisation, et sa réponse est écrite avant que la première procédure commence (arrêté du 1er février 2013, art. 5). Ces objectifs servent à justifier l'utilisation des animaux devant le comité d'éthique. Aucun document public ne dira ensuite s'ils ont été atteints : la directive permet aux États de faire mettre à jour le résumé avec les résultats de l'appréciation rétrospective (directive 2010/63/UE, art. 43), la base européenne prévoit de les recevoir, et aucune entrée française n'en porte (base ALURES).
Si l’augmentation d’expression d’un des gènes du chromosome 21 humain est considérée comme la cause de nombreux symptômes affectant les sujets atteints de trisomie 21, la diminution de son expression / de l’activité de la protéine codée par ce gène induit également des défauts de développement et de fonctionnement du système nerveux central. Le syndrome associé, initialement appelé MRD7, pour Retard Mental autosomal Dominant de type 7, a récemment été renommé syndrome DYRK1A. Il combine une déficience intellectuelle, une microcéphalie, des crises épileptiques et des troubles du spectre autistique. Trisomie 21 et syndrome DYRK1A sont également associés à des symptômes ophtalmologiques. Parmi eux, un épaississement rétinien a été observé chez les sujets trisomiques, et est retrouvé dans les modèles rongeurs. Aucune étude structurelle n’a encore été publiée en ce qui concerne les patients atteinst du syndrome DYRK1A, mais une pâleur du nerf optique a été rapportée. Elle pourrait être causée par un amincissement de la rétine, comme celui qui a été observé dans un modèle murin de la maladie. Dans ce dernier, une des deux copies du gène a été inactivée, ce qui conduit à une baisse d’expression de la protéine de 50%. Or chez les patients, on retrouve de nombreuses mutations ponctuelles n’affectant pas forcément le niveau d’expression de la protéine, ce qui peut influencer les symptômes – il y a de plus en plus d’indications que la quantité de protéine peut influencer sa répartition dans les cellules et/ou la répartition des protéines avec lesquelles elle interagit. Nous proposons donc d’étudier les conséquences de plusieurs mutations identifiées chez les patients, à travers la caractérisation ophtalmologique de modèles murins dans lesquels ces mutations ont été introduites.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Note de l'OXA. Le formulaire européen demande les bénéfices « susceptibles de découler » du projet. Il appelle donc une projection, et il l'obtient : ce que le laboratoire écrit ici est ce qu'il espère, avant d'avoir commencé. Deux chercheuses ont repris six corpus d'études précliniques déjà menées et pesé les dommages réellement infligés aux animaux contre les bénéfices cliniques réellement obtenus : moins de 7 % de ces études ressortaient défendables (Pound et Nicol, 2018).
Les données moléculaires disponibles pour certaines des mutations identifiées chez les patients atteints du syndrome DYRK1A laissent envisager des conséquences hétérogènes sur l’activité et/ou la stabilités des protéines mutées. Au niveau clinique, si nous mettons en évidence que ces différentes mutations conduisent à des changements rétiniens distincts et facilement détectables chez les patients, notamment à travers un examen rapide et non invasif (imagerie sans contact), on peut escompter une prédiction plus précise des conséquences de mutations nouvellement identifiées et donc une prise en charge adaptée plus précoce. Au niveau fondamental, disposer de données structurelles et fonctionnelles globales sur les rétines des différents modèles aidera à déterminer sur lesquels porter en premier nos efforts pour identifier l’impact sur les différentes populations neuronales de la rétine, une partie du système nerveux central dont la structure fine et régulière facilite les approches histologiques et fonctionnelles.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Note de l'OXA. La formule « en règle générale » autorise une réponse générale, et c'est l'un des points sur lesquels les examens de qualité trouvent ces documents défaillants. Cruelty Free International a établi en 2018 que les résumés allemands et britanniques, les seuls examinés à ce jour, décrivaient mal ce qui est fait aux animaux et ce que ceux-ci pourraient éprouver (Taylor et al., 2018). L'adoption d'un modèle commun européen a nettement amélioré le premier point, à peine le second (Taylor et al., 2024).
La totalité des animaux (192) sera examiné par deux techniques d’imagerie rétinienne sans contact, la tomographie par cohérence optique (OCT) et le fond d’œil, qui sont complémentaires. Ces deux modalités seront pratiquées, après dilatation des pupilles (application d’une goutte de mydriatique par œil) sur une même anesthésie gazeuse (maximum de 15 minutes), destinée à obtenir l’immobilité durant l’examen. Deux tiers des animaux (128) seront examinés par électrorétinographie, qui permet d’évaluer la fonctionnalité de la rétine (durée de l’examen < 30 minutes). Après dilatation de la pupille, les animaux seront endormis par une injection intrapéritonéale d’anesthésique. Des électrodes de référence sous-cutanées seront insérées au niveau des joues et de la base de la queue, et des électrodes DTL (fins filaments souples conducteurs) placées sur les cornées. Pour les différents examens, les animaux seront placés sur des coussins chauffants pour maintenir leur température corporelle, et du gel ophtalmique appliquée sur les cornées pour les maintenir hydratée.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Note de l'OXA. C'est l'endroit du document où les animaux devraient apparaître, et c'est celui qui résiste. Cruelty Free Europe a mesuré en 2024 que cinq des six éléments attendus sur les dommages prévus progressaient depuis l'adoption d'un modèle commun européen. Les effets indésirables sont le sixième : 41 % des résumés allemands et 48 % des britanniques les décrivent complètement. Les auteurs relèvent aussi des effets présentés comme minimes sur des projets classés modérés ou sévères (Taylor et al., 2024). Ces deux pays sont les seuls dont les résumés ont été examinés. Les résumés français relèvent du même modèle européen, et leur qualité n'a jamais été mesurée.
Les deux modalités d’imagerie, toutes deux sans contact, sont réalisées sur une courte anesthésie gazeuse (15 minutes au maximum), utilisée uniquement afin d’obtenir l’immobilité de l’animal. La seule nuisance en découlant est donc le stress lié au transfert de la souris de sa cage d’hébergement à la cage d’induction et l’exposition au gaz anesthésiant. L’euthanasie étant effectuée avant le réveil, la seule nuisance associée à l’électrorétinographie découle également de l’anesthésie (contention et injection intra-péritonéale).
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Note de l'OXA. Le formulaire demande de justifier ce sort, non de le décrire. L'analyse dommage-avantage que la directive impose au comité d'éthique porte sur « la souffrance, la douleur et l'angoisse » infligées aux animaux (directive 2010/63/UE, art. 38). Quand ce sort est la mise à mort, celle-ci ne figure donc pas parmi les dommages que le comité met en balance avec les bénéfices annoncés. L'OXA écrit « mise à mort » plutôt que « sacrifice », qui emprunte au registre du don consenti, ou « euthanasie », qui désigne une mort décidée dans l'intérêt de celui qui meurt.
Tous les animaux seront mis à mort avant leur sortie d’anesthésie, soit à l’issue de l’imagerie (64), soit à l’issu de l’électrorétinographie (128), pour prélever cerveau et rétines pour les études histologiques ou moléculaires.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Note de l'OXA. La directive demande au résumé « une démonstration de la conformité » aux exigences de remplacement, de réduction et de raffinement (directive 2010/63/UE, art. 43). C'est donc le demandeur qui démontre sa propre conformité, dans le document même qui sollicite l'autorisation. Cette démonstration peut prendre la forme d'une affirmation qu'aucune méthode de substitution n'existe, que le document n'a pas à sourcer. Ces trois exigences sont par ailleurs subordonnées à l'objectif du projet : elles cherchent à remplacer les animaux dans un projet donné, elles n'interrogent pas ce projet.
Il est impossible à l’heure actuelle d’obtenir une rétine complète in vitro. Obtenir des données structurelles et fonctionnelles facilement transposables à la clinique ne peut se faire que sur des modèles vertébrés, l’œil de invertébrés étant très différent dans son organisation. Le poisson zèbre ne peut être considéré ici, car il existe chez cette espèce deux orthologues de notre gène d’intérêt, ce qui rend délicat de reproduire l’impact d’une perte d’une copie ou de mutations ponctuelles. Le modèle murin hétérozygote est par contre bien caractérisé et reproduit de nombreux symptômes des patients atteints du syndrome DYRK1A. De plus, plusieurs lignées portant des mutations ponctuelles sont d’ores et déjà disponibles. La souris nous semble donc l’animal modèle le mieux adapté pour mener à bien le présent projet.
2. Réduction
Note de l'OXA. La réduction dont il est question ici porte sur le nombre d'animaux par groupe expérimental, calculé pour que l'analyse statistique tienne. Le total annoncé dans la fiche est une estimation portant sur une autorisation de cinq ans au maximum (code rural, art. R214-123) : il ne dit pas combien d'animaux seront effectivement utilisés, et il ne se rapporte pas à une année.
Au cours d’une étude précédente portant sur des groupes de 12 mâles, nous avions constaté, chez les souris n’ayant qu’une copie fonctionnelle de notre gène d’intérêt, un net amincissement de la rétine ainsi qu’une réduction du nombre des vaisseaux sanguins, et un léger allongement des segments externes, effet miroir de ce que nous avons observé chez des souris ayant trois copies de ce gène. Un effectif de 12 mâles et 12 femelles par génotype permettrait de confirmer ces observations en ayant autant de femelles que de mâles pour chacun des génotypes, et de pouvoir détecter des variations d’amplitude des différents effets entre mutants. Nous n’avons encore effectué aucun enregistrement avec l’équipement électrorétinographique qui vient d’être récupéré auprès d’un autre laboratoire. En absence de données nous permettant d’estimer la dispersion des mesures dans nos conditions d’enregistrement, nous nous orientons vers les effectifs classiquement utilisés pour les études électrorétinographiques, avec 8 souris par génotype et par sexe. Afin de tirer au mieux parti des données acquises, nous utiliserons un test statistique permettant de considérer séparément les mesures obtenues sur les deux yeux d’un même animal, plutôt que leur moyenne, afin d’augmenter la puissance statistique.
3. Raffinement
Note de l'OXA. Le raffinement nomme une amélioration technique de la procédure, sans dire ce qu'elle change pour l'animal qui la subit. La réglementation impose d'atténuer la douleur, dans une limite qu'elle inscrit elle-même : « pour autant que cela soit compatible avec la finalité de la procédure expérimentale » (code rural, art. R214-109). Ce qui reste de souffrance après cette limite est autorisé. Le raffinement ne porte par ailleurs que sur la procédure : les souffrances de la captivité elle-même, confinement, bruit, lumière, manipulations d'entretien, ne relèvent d'aucun des trois R.
Les animaux seront stabulés avec l’enrichissement classiquement utilisé dans notre animalerie (matériel de nidification). Les tests consistent en deux modalités d’imagerie non invasive (OCT et fond d’œil), ainsi que des enregistrements électrorétinographiques. Les deux premières procédures seront effectuées sur une même anesthésie gazeuse (15 minutes au maximum) afin d’obtenir l’immobilité de l’animal. Du gel ophtalmologique sera appliqué sur les deux cornées dès que l’animal sera endormi, ainsi qu’à la fin de la séance d’imagerie, afin d’éviter tout desséchement cornéen. L’animal sera placé sur un coussin chauffant pendant l’imagerie et jusqu’à son réveil, qui intervient très rapidement après une anesthésie courte comme ici. L’électrorétinographie nécessite une anesthésie plus longue et sans mouvements oculaires pouvant nuire à la stabilité des enregistrements, comme parfois observés sous isoflurane. Les animaux seront donc anesthésiés à travers l’injection intra-péritonéal d’un mélange de kétamine et de médétomidine, et maintenus sur un coussin chauffant avec du gel ophtalmique appliqué sur les deux cornées. Des électrodes DTL (fins filaments souples) seront préférés aux anneaux d’or souvent utilisés chez l’animal. Les animaux seront euthanasiés avant leur réveil par dislocation cervicale soit à la fin de l’imagerie (4 animaux par génotype et par sexe), soit après les enregistrements électrorétinographiques (8 animaux par génotype et par sexe).
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Note de l'OXA. Le dossier d'autorisation demande de justifier l'origine des animaux, leur espèce, leur nombre estimé et leur stade de développement (arrêté du 1er février 2013, art. 5). La justification attendue est technique : elle porte sur l'adéquation de l'espèce à l'objectif poursuivi. Ce que l'appartenance à une espèce autorise à faire subir à un individu est une question morale, et le formulaire ne la pose pas. L'appartenance à une espèce, prise seule, ne fonde pourtant pas de différence de statut moral entre des individus également capables de souffrir.
Obtenir des données structurelles et fonctionnelles sur la rétine, facilement transposables à la clinique humaine, ne peut se faire que sur des modèles vertébrés, l’œil de invertébrés étant très différent dans son organisation. Parmi les espèces dans lesquelles l’inactivation ou la mutation ponctuelle d’un gène peuvent être facilement obtenues, le poisson zèbre ne peut être retenu, car il possède deux autres gènes très proches du gène d’intérêt, rendant délicat la modélisation d’une perte de copie ou d’une mutation ponctuelle de ce gène. Le modèle murin hétérozygote est par contre bien caractérisé et reproduit de nombreux symptômes des patients atteints du syndrome DYRK1A. Plusieurs lignées avec des mutations ponctuelles sont déjà disponibles. La souris nous semble donc l’animal modèle le mieux adapté pour mener à bien le présent projet. Les souris devant être sacrifiées à 8 semaines pour des prélèvements histologiques, l’évaluation ophtalmologique sera réalisée au cours de la 8ème semaine, les animaux étant euthanasiés avant le réveil de l’anesthésie. A cet âge, la morphologie de la rétine est bien établie et les réponses électrorétinographiques stables.