Rongeurs

768 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris transgéniques développent une sclérose latérale amyotrophique évolutive, avec troubles de la démarche, perte de force musculaire et perte de poids, reçoivent une injection tous les deux jours pendant plus de trois mois, et subissent des tests de locomotion ainsi qu'un test d'évitement par choc électrique aux pattes. Le porteur indique avoir d'abord travaillé sur la drosophile puis sur des larves de poissons zèbres avant de recourir à la souris. Il affirme que les modèles murins "ne peuvent pas être remplacés" en vue d'un développement clinique.

Objectifs

notre objectif est de valider une cible thérapeutique pour lutter contre la sclérose latérale amyotrophique. Notre étude permettra d'identifier des molécules capables de réduire les défauts locomoteurs et les atteintes cellulaires liés à cette maladie

Bénéfices attendus

Valider une cible thérapeutique et identifier un/des agents thérapeutiques pour lutter contre la sclérose latérale amyotrophique

Procédures

Tous les animaux (n=768) recoivent une injection intrapéritonéale tous les deux jours. L'impact sur le comportement est évalué du 21ème jour au 124ème jour. Les tissus nerveux des animaux sont analysés post-mortem

Impact sur les animaux

Les souris utilisées présentent un phenotype pathologique avec un décours différent suivant le sexe . Les mâles ont un phénotype plus rapide et prononcé. A 30 jours : apparition des trouble de la démarche et de l'équilibre. A 60 jours : aggravation des défauts de locomotion (diminution de la force musculaire). A 90 jours : début de la perte de poids (mâles). A 120 jours : perte de poids (femelles et mâles).Comme les souris montrent des déficit au niveau intestinal, elles auront accès à de la nourriture en gelée dès le 30ème jour pour limiter la perte de poids. La nuisance liée à l'injection en intrapéritonéale tous les 2 jours est minimisée en alternant le côté d'injection. Les tests de locomotion utilisés provoquent très peu d'effet indésirable. Pour le test d'évitement, les animaux reçoivent un faible choc électrique aversif par les pattes et on note leur réaction. Les chocs sont limités en intensité et en durée de façon à limiter la nuisance aux animaux. Toute variation importante de la sensibilité aux chocs conduit à l'arrêt de la procédure. Ce test ne sera pratiqué qu'une seule fois à la fin du projet

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour permettre l'étude des mécanismes d'action de la thérapie

Remplacement

La sclérose latérale amyotrophique est une maladie complexe se traduisant par une perte progressive des neurones de la moelle épinière et du cortex moteur. Elle se traduit par une diminution progressive des capacités motrices. Pour minimiser l'utilisation d'animaux vertébrés, nous avons dans un premier temps démontrer chez la drosophile que l'activation d'un récepteur est une cible thérapeutique d'intérêt. Pour identifier 3 nouveaux activateurs de ce récepteur avec un fort potentiel thérapeutique, une série d'activateurs sera d'abord testée sur des larves de poissons zèbres de 5 jours. Ensuite pour valider les 3 meilleurs activateurs candidats, nous avons besoin d'un modèle vertébré proche de la maladie avec une perte de neurones moteurs de la moelle épinière et des déficits progressive de locomotion. Les modèles murins sont les plus adaptés à ce type d'étude et ne peuvent pas être remplacés par d'autres modèles en vue d'un futur développement clinique.

Réduction

Pour déterminer le nombre d'animaux nécéssaire, on se base sur les études antérieures utilisant la même stratégie thérapeutique et les mêmes tests comportementaux pour d'autres maladies neurodégénératives. Le nombre d'animaux par groupe a été déterminé par un logiciel de statistique.

Raffinement

Afin de réduire l'angoisse et la souffrance, l'environnement des animaux sera enrichi avec des copeaux de cartons qui permettront aux animaux de se cacher et constituer un abri. Les animaux seront également manipulés toutes les semaines afin de réduire le stress que peut engendrer un expérimentateur lors d'une procédure expérimentale. Afin de réduire la difficulté des souris transgéniques pour s'alimenter, elles auront accès à de la nourriture en gelée dès le 30 ème jour. Afin de contrôler le bien-être des animaux, les souris seront pesées deux fois par semaine dès la naissance. Une feuille de bien-être, avec les points limites sera complétée par l'expérimentateur lorsque tout comportement suspect (plaie, lésions cutanés, agressivité, stéréotypie, apathie, convulsions, ...) sera remarqué. Dès lors une grille d'évaluation sera complétée tous les jours pour le suivi de l'animal. Si une souris présentait un score de souffrance trop élevé sur la grille d'évaluation, elle sera immédiatement euthanasiée par l'expérimentateur qualifié après en avoir averti le chef de projet et le vétérinaire.

Choix des espèces

La lignée de souris transgéniques utilisée a fait l'objet de nombreuses publications et son phénotype est donc bien caractérisé. L'utilisation de ces animaux est indispensable à l'élaboration de thérapies efficaces car ils représentent un des modèles les plus pertinents de la sclérose latérale amyotrophique. Ces souris présentent une altération progressive de leurs performances motrices et mnésiques comme observée dans cette pathologie : A 30 jours : apparition des premiers défauts de locomotion A 90 jours : début de la perte significative des neurones moteurs A 120 jours : aggravation des symptômes

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par la bactérie Citrobacter rodentium pour reproduire un syndrome de l'intestin irritable, reçoivent un gavage de probiotiques, puis subissent un labyrinthe en croix surélevé, un test de nage forcée et une distension colorectale avant le prélèvement de leurs organes. Le porteur décrit une hypersensibilité colique et un comportement de type anxieux persistant jusqu'à la fin des expériences. Il affirme qu'il est "indispensable" de travailler sur des animaux et que les modèles cellulaires in vitro ne sont pas envisageables.

Objectifs

L’hypersensibilité colique et les douleurs abdominales sont les principaux symptômes du SII. La prise en charge de ces douleurs en clinique est actuellement limitée. En effet, le manque d’efficacité des traitements disponibles rend le développement de nouveaux outils pharmacologiques nécessaire. Il est donc important de mieux comprendre les mécanismes de ces douleurs afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, puis de tester de nouveaux médicaments agissant sur ces nouvelles cibles. La complexité de cette pathologie faisant intervenir plusieurs organes rend impossible l’utilisation in vitro d’un modèle cellulaire. Ainsi, afin de tester de nouvelles molécules dans des conditions mimant ces pathologies, il est indispensable de développer un modèle animal présentant des origines communes à ce qui est observé chez le patient et permettant donc de reproduire ces pathologies douloureuses. Le protocole s’orientera sur les mécanismes périphériques impliqués dans l’initiation et/ou le développement d’une hypersensibilité viscérale d’origine colique sur des modèles animaux de syndrome de l’intestin irritable post-infectieux. En effet, parmi les différents facteurs étiologiques suspectés dans la physiopathologie de ces atteintes intestinales, il a été observé, chez des patients présentant de sévères douleurs abdominales, des facteurs communs tels qu’un dérèglement du système immunitaire ou des modifications de la composition du microbiote intestinal pouvant être l’origine d’une micro-inflammation locale et/ou d’une hypersensibilité viscérale d’origine colique. L’objectif de ce projet sera donc de clarifier le lien entre un désordre microbien, immunitaire et/ou inflammatoire à bas bruit et le développement d’une HSVC afin de proposer de nouvelles cibles pharmacologiques pour le traitement de la douleur viscérale d’origine colique.

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet étant de mieux comprendre les mécanismes des douleurs associées au syndrôme de l'intestin irritable afin de développer de nouveaux outils pharmacologiques, le premier bénéfice attendu serait la caractérisation de cette physiopathologie et l’identification de nouvelles cibles pharmacologiques. Dans un second temps, la validation pré-clinique des effets bénéfiques de nouvelles molécules agissant sur les nouvelles cibles identifiées nous permettraient d’envisager une étude clinique grâce à une collaboration avec des services de gastroentérologie . L’objectif à plus long terme serait donc de mettre en place cette étude clinique qui ferait intervenir des patients atteints de SII afin de tester les potentiels outils pharmacologiques développés au laboratoire. Cette étude permettrait d’ouvrir le champ des perspectives thérapeutiques visant à traiter les symptômes associés au syndrome de l'intestin irritable et, in fine, à soulager les patients douloureux. Le bénéfice à long terme serait ainsi une meilleure prise en charge des douleurs chez le patient, qui reste actuellement extrêmement limitée.

Procédures

Prélèvement de fèces à J3, 7, 10 et 16 post infection sur chaque souris pour évaluer l’état de colonisation du tractus digestif. Suite à cela, les souris recevront un traitement par gavage orale à base de bactéries probiotiques entre J16 et J23. A J21, les souris subiront un premier test comportementale (5 min par souris sur l'ensemble des souris) pour évaluer l'état d'anxiété des souris (Labyrinthe en croix surélevé) puis à J23 un second test comportementale (5 min par souris sur l'ensemble des souris) pour évaluer l'état de dépression des souris (test de la nage forcée). Enfin, à J24, les souris subiront un dernier test (40 min par souris sur l'ensemble des souris), le test de distension colorectale, afin d'évaluer leur sensibilité colique avant d'être mis à mort à la suite de ce test de distension colorectale.

Impact sur les animaux

Une perte de poids (au maximum, 5% du poids initial) peut être observée chez certains animaux durant la phase d’infection et notamment au pic d’infection (7 jours post-infection), mais ce phénomène est temporaire et naturellement résolu avec l’élimination du pathogène (16 jours post-infection). Ensuite, cette infection par C. rodentium induira chez les animaux les symptômes associés au SII-PI à savoir une hypersensibilité colique et un comportement de type anxieux en phase post-infectieuse (16 jours post-infection) et jusqu’à la fin des expérimentations prévues (24 jours post-infection).

Devenir

A l'issu de l'ensemble des procédures, les animaux seront mis à mort par overdose d'isoflurane suivi par une dislocation cervicale afin de réaliser des prélèvements d'organes.

Remplacement

Il apparait indispensable de travailler sur des animaux afin de pouvoir étudier l’impact de C. rodentium sur la sensibilité colique, le comportement et le microbiote intestinal. De plus, une étude comparant des données de métagénomique entre animaux infectés et animaux non infectés permettra d’établir un lien de causalité avec C. rodentium. Ce type d’étude n’est concevable que chez l’animal. D’autre part, nous voulons également évaluer les conséquences physiologiques sur la sensibilité viscérale et la perméabilité intestinale, pour lesquelles il n’existe pas d’autre alternative. L’utilisation de différents modèles cellulaires in vitro pour répondre aux objectifs de ce projet n’est donc pas envisageable.

Réduction

Les expérimentations sont organisées de façon à obtenir des résultats statistiquement exploitables avec le plus petit nombre d’animaux possible. Les tests statistiques seront réalisés grâce au programme d'analyse statistique GraphPad Prim 9.0 et les principales analyses, notamment de suivi du poids seront effectuées grâce à des test ANOVA one-way ou two-way suivi d'un post test adéquat en fonction du résultat.

Raffinement

Afin de réduire une éventuelle souffrance, les animaux seront surveillés quotidiennement (Week-end et jours fériés compris) par l'expérimentateur mais aussi par le personnel de l'animalerie. Si un animal présente une trop forte douleur, un comportement stéréotypé ou anormal, une posture anormale ou une réduction de poids de 20%, celui-ci sera euthanasié par le personnel de l’unité de stabulation animale. Ces animaux seront au maximum 5 par cage (5 mâles ou 5 femelles) et ceci en respect de la réglementation en vigueur concernant la superficie au sol par souris. De plus, ces cages contiendront des milieux d'enrichissements de type petite maisonnette ainsi que du coton.

Choix des espèces

Le choix de la souris comme modèle expérimental est appuyé par sa pertinence pour l’étude des pathologies intestinales in vivo ainsi que par la disponibilité de lignées d’animaux génétiquement modifiés et l’existence de nombreux outils d’analyse (anticorps, kit ELISA…) développés pour cette espèce. De plus, la spécificité d’espèce de la souche bactérienne pathogène utilisée rend ce modèle encore plus approprié. Les souris seront utilisées au stade de jeune adulte (4-5 semaines). En effet, l’utilisation des animaux à ce stade de développement permet de limiter les biais liés à des différences pouvant se développer au cours de la vie de l’animal. La réduction de la variabilité inter-individus permet ainsi de réduire le nombre d’animaux à expérimenter.

80 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont nourris avec des protéines issues de levure et de bactérie, soumis à des prélèvements sanguins caudaux puis à une ponction intracardiaque sous anesthésie, avant le prélèvement de leurs contenus intestinaux et de leurs organes, pour évaluer l'intérêt nutritionnel de ces protéines pour l'alimentation humaine. Le porteur signale que ces aliments peuvent contenir des acides nucléiques potentiellement néfastes pour les reins. Il affirme qu'il n'existe "pas de méthode alternative validée in vitro" pour mesurer la digestibilité des acides aminés, mesurable seulement chez l'animal ou chez l'humain.

Objectifs

Face à l’accroissement de plus en plus rapide de la population, aux enjeux liés au changement climatique et à l’urbanisation croissante, sécuriser l’offre alimentaire constitue un défi majeur pour le secteur agricole. Une augmentation considérable des besoins de ressources en protéines est inévitable. Les ressources végétales et animales nécessitent la mobilisation de grandes surfaces agricoles et sont dépendantes des conditions climatiques et de la saisonnalité. La recherche de sources protéiques alternatives est ainsi en plein essor et les Protéines d’Organismes Unicellulaires (POU) représentent actuellement une filière en développement. Les microorganismes sont des ressources intéressantes à exploiter, de par leur vitesse de croissance, leur capacité d’accumulation et la possibilité de moduler leur métabolisme et leur composition en fonction des conditions d’environnement. Dans ce contexte, le projet Nutripou va produire des POU issues de bactérie et de levure à partir de procédés de culture, d’extraction et de purification optimisés afin d’obtenir des POU dont la composition nutritionnelle est adaptée à l’alimentation humaine. Les objectifs de l’étude animale que nous souhaitons mener sont : i- d’évaluer la qualité nutritionnelle de POU issues de levure et de bactérie et présentant des degrés de purification différents (procédures expérimentales 1 et 2) et ii- d’évaluer les effets métaboliques et physiopathologiques de l’ingestion durant 3 mois de ces mêmes POU (procédure expérimentale 3) chez le rat.

Bénéfices attendus

Les données de qualité nutritionnelle des POU de levure et de bactérie et les effets de leur ingestion obtenues dans notre étude permettront d’appréhender l’intérêt de cette nouvelle ressource en protéines. La caractérisation nutritionnelle permettra de valoriser ou d’envisager des pistes d’amélioration de la production des POU et elles pourront éventuellement venir compléter le catalogue des ressources alternatives en protéines permettant de faire face à la demande mondiale croissante.

Procédures

Dans les procédures 1 et 2, les animaux seront hébergés en cage individuelle en permanence. Dans la procédure 3, ils seront hébergés à 2 par cages et placés uniquement 3 fois 24h dans des cages individuelles pour la collecte des urines. Lors des procédures 2 et 3, avant l’euthanasie des animaux et pour collecter une quantité suffisante de sang, une ponction intracardiaque sera réalisée après anesthésie gazeuse profonde de l’animal. Lors de la procédure 3, des prélèvements sanguins sur la veine latérale de la queue seront réalisés sur les rats vigiles. Trois prélèvements seront réalisés (au début, à mi-parcours et à la fin de la procédure) et la durée de chaque prélèvement ne dépassera pas 5 minutes

Impact sur les animaux

Lors des procédures 1 et 2, il sera nécessaire d’héberger les animaux en cages individuelles car nous devrons suivre précisément la prise alimentaire de chaque rat (procédure 1) et les habituer à l’ingestion d’un repas-test (procédure 1). Lors de la procédure 3, les animaux seront hébergés à 2 par cage. La prise alimentaire n’étant pas le paramètre principal évalué lors de cette procédure, il est envisageable de diminuer la précision de cette mesure pour cette procédure. Les animaux seront placés en cage individuelle uniquement lors du recueil des urines, soit 3 fois une journée sur l’ensemble de la procédure. Les prélèvements sanguins de la procédure 3 sont susceptibles d’induire de la douleur. Les prélèvements se feront au niveau d’une veine latérale de la queue par un expérimentateur entraîné et les volumes prélevés seront modérés et ne dépasseront pas 15% du volume de sang des rats. Bien que la production des POU utilisées dans cette étude sera optimisée pour réduire les quantités d’acides nucléiques, les régimes à base de POU sont susceptibles de contenir des quantités faibles d’acides nucléiques pouvant être potentiellement néfastes pour la santé des rats. Les expérimentateurs seront donc particulièrement vigilant lors du suivi de l’état de santé globale des animaux. L’ingestion d’acides nucléiques pourrait avoir un effet sur le rein et l’excrétion des urines sera particulièrement observée.

Devenir

Procédure 1: Les 40 rats seront réutilisés pour la procédure 2. Procédure 2: les 40 rats seront euthanasiés afin de collecter les digestats des différents compartiments intestinaux et évaluer la digestibilité de POU. Procédure 3: les 40 rats seront euthanasiés afin de prélever les organes et tissus permettant d'évaluer les effets de l'ingestion de POU sur des marqueurs inflammatoires et histologiques.

Remplacement

A l’heure actuelle il n’existe pas de méthode alternative validée in vitro pour déterminer la digestibilité de l’azote et des acides aminés des protéines. Les méthodes de digestion in vitro ne permettent pas en l’état actuel des connaissances d’obtenir des données représentatives de la digestibilité in vivo des acides aminés alimentaires. Ces mesures ne peuvent être réalisées que chez l’animal et chez l’homme. Néanmoins, les études de digestibilité des acides aminés nécessitent à l’heure actuelle l’accès aux contenus intestinaux au niveau iléal et sont très invasives chez l’homme. En outre, afin d’étudier l’innocuité de ces nouvelles sources de protéines alimentaires à moyen terme, et en particulier les effets de taux d’acides nucléiques non négligeables, il est nécessaire d’évaluer les effets sur différents marqueurs inflammatoires, métaboliques, du statut osseux, etc. et cela ne peut se faire que chez l’animal en ayant accès à l’ensemble des tissus et organes.

Réduction

A partir des données déjà publiées sur le sujet et dans des conditions expérimentales comparables, le nombre minimum d’animaux requis pour atteindre une puissance statistique suffisante et garantir l'exploitation des résultats est de 8 rats par groupe.

Raffinement

Afin de limiter l'impact de l'hébergement individuel dans les procédures 1 et 2, les cages sont en plexiglas transparent permettant le plus d’interactions visuelles entre les animaux et elles seront enrichies avec des tunnels en plexiglas opaque ainsi que des billes. Des regroupements dans des cages collectives (5 rats/cage) seront effectués une fois par semaine lors de ces 2 procédures. La capacité d’accueil de la cage de regroupement sera adaptée au nombre et au poids des rats et les animaux seront identifiés par un numéro inscrit au marqueur sur leur queue. Pour la procédure 3, les animaux seront hébergés à 2 par cage. Néanmoins, les animaux passeront 3 fois 24h en cage métabolique individuelle afin de collecter les urines. Ces cages seront également en plexiglas et enrichies avec des tunnels en plexiglas opaque ainsi que des billes. Afin de réduire la douleur lors des prises de sang au niveau d’une veine latérale caudale réalisées en procédure 3, les prélèvements se feront par un expérimentateur entraîné. Les volumes prélevés seront modérés (2mL/prélèvement, 3 prélèvements à J0, J45 et J90) et ne dépasseront pas 15% du volume de sang des rats. Les animaux seront habitués à la contention dans un tissu lors des pesées afin de réduire le stress généré lors de la contention pour réaliser la prise de sang et un analgésique sera appliqué sur la queue quelques minutes avant le prélèvement pour réduire les douleurs. La manipulation régulière des animaux par les mêmes expérimentateurs pour les mesures du poids et de la prise alimentaire permettra de suivre de manière rapprochée l’état de santé des animaux et de détecter des modifications éventuelles de leur état physique ou de leur comportement. Si une perte de poids de plus de 20% sans cause apparente et sans récupération, des diarrhées sans cause apparente ou des difficultés à uriner ou une modification de l’aspect des urines sont détectées grâce au suivi rapproché de chaque animal, il sera sorti du protocole expérimental et euthanasié si son état de santé ne s’améliore pas rapidement.

Choix des espèces

Le régime alimentaire et le système digestif du rat présentent des similarités suffisamment importantes avec ceux de l’Homme pour qu’une extrapolation des résultats obtenus soit envisagée. De plus, le rat est une espèce de référence pour les études nutritionnelles. Procédure 1 : Rats âgés de 3 semaines. L’évaluation du CEP est une procédure standardisée qui se réalise chez de jeunes rats pour rendre compte de la capacité de la protéine à soutenir la croissance. Procédure 2 : Rats issus de la procédure 1. Ils seront alors âgés de 8 semaines. Les études de digestibilité sont habituellement réalisées sur des rats de cet âge. C’est une fenêtre d’âge de référence utilisée dans la plupart des études quand il s’agit de normaliser les conditions d’expérimentations dans lesquelles l’âge de l’individu n’est pas l’objet de la recherche. Procédure 3 : Rats adultes âgés de 8 semaines. C’est une fenêtre d’âge de référence utilisée dans la plupart des études quand il s’agit de normaliser les conditions d’expérimentations dans lesquelles l’âge de l’individu n’est pas l’objet de la recherche.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau puis une injection de lymphocytes T par voie rétro-orbitale, avant le prélèvement de leurs tumeurs, rate et ganglions, pour étudier le rôle d'une protéine dans l'efficacité de l'immunothérapie du cancer. Le porteur fixe un point limite à un volume tumoral de 2 500 mm3, seuil au-delà duquel les souris qui l'atteignent sont mises à mort. Il indique avoir mené des expériences in vitro au préalable mais conclut que les interactions entre cellules tumorales et microenvironnement immunitaire "ne peuvent actuellement pas être remplacées" par des systèmes in vitro fiables.

Objectifs

La progression du cancer est grandement influencée par un équilibre délicat entre l'immunité et la tolérance aux tumeurs. En particulier, les lymphocytes T (LT) CD8 ont pour fonction de détruire les cellules tumorales. Leur étude a conduit au développement de deux types d’immunothérapies du cancer, qui ont révolutionné la prise en charge des patients : l’administration d’anticorps anti- PD-1 qui ciblent la fonction défectueuse des LT CD8, ainsi que l’injection de LT spécifiques d’un antigène tumoral et capables d’éliminer directement la tumeur. La combinaison de ces deux traitements est testée actuellement en clinique mais les mécanismes moléculaires régissant la réponse ou la résistance à ces thérapies sont mal connus. La protéine X joue un rôle critique dans la tolérance immunitaire dans le cancer et nos données préliminaires suggèrent qu’il pourrait également être un régulateur majeur de l’activité des LT CD8+. Dans ce contexte, nous émettons l’hypothèse que l’élimination des tumeurs par l’injection de LT spécifiques, en combinaison ou non avec une thérapie par anti-PD-1, requiert l’activation de X.

Bénéfices attendus

Ces travaux pourraient permettre d’identifier un mécanisme moléculaire impliqué dans l’effet curatif des thérapies du cancer par injection de LT. D’autre part, ces études pourraient révéler des activités spécifiques de la protéine X qui peuvent être ciblées par de nouveaux agents thérapeutiques pour améliorer la fonction des LT, seule ou de concert avec des immunothérapies existantes.

Procédures

- Rasage du flanc des souris après désinfection a l’alcool 70% sous anesthésie isofluorane (1x 2 minutes/souris) -Injection sous-cutanée dans le flanc, sous anesthésie isofluorane, de cellules tumorales resuspendues dans du PBS1X stérile, dans un volume total de 100uL (1x 2 minute/souris) -Injection intraveineuse par voie rétro-orbitale, sous anesthésie isofluorane, de cellules LT resuspendues dans du PBS1X stérile, (ou du PBS1X comme témoin) dans un volume total de 100uL. (1x 2 minute/souris)

Impact sur les animaux

Les tumeurs B16F10-OVA et MC-38-OVA injectées par voie sous-cutanée ne développent pas de métastases et ne provoquent pas/peu de douleurs. Chez la souris, l’injection d’anti-PD-1 ne provoque pas d’effets secondaires délétères détectables. Les animaux subissent un ensemble d’étapes de classe de gravité légère, effectuées sous anesthésie isofluorane, mais susceptible d’entraîner une angoisse légère et de courte durée. La bonne connaissance des modèles expérimentaux, le suivi adapté des points limites et la manipulation des animaux sans stress par des personnes compétentes en expérimentation animale permettent de limiter au maximum toute douleur ou souffrance des souris. Nous évaluerons l'état de bien-être ou de souffrance des animaux 2 fois par semaine. Un enrichissement (morceau de coton) est ajouté à chaque cage et le cas échéant du DietGel et/ou de l’HydroGel sera utilisé.

Devenir

Les animaux seront mis à mort lorsqu’un des points limite (volume tumoral de 2500 mm3, nécrose de la tumeur ou altération de l'état général de la souris) sera en passe d’être atteint, par dislocation cervicale ; les tumeurs, rates et ganglions lymphatiques seront prélevées pour analyse du phénotype immunitaire par cytométrie en flux. Ceci permettra de documenter la fonction des protéines X non seulement dans la croissance tumorale mais aussi dans la composition et distribution du microenvironnement immunitaire.

Remplacement

Nous allons tout d’abord effectuer un certain nombre d'expériences in vitro. Cependant, la validation de nos résultats nécessitera une série d'expériences in vivo pour mesurer la fonction de la protéine X dans l’immunothérapie par transfert de LT. À notre connaissance, et malgré les progrès récents dans les domaines de la culture cellulaire et de la biologie computationnelle, l'étude de la pathologie, en particulier les interactions entre les cellules tumorales et leur microenvironnement immunitaire, ne peut actuellement pas être remplacée par des systèmes in vitro fiables.

Réduction

Le nombre de souris par groupe a été défini à minima afin de permettre une analyse statistique des résultats. Dans des études antérieures décrivant les lignées cellulaires utilisées ici, il a été démontré un écart-type de 150 mm3 au point final (1250 mm3). L'effet minimal souhaité de l’ablation de X serait une augmentation > 50% de la croissance tumorale, donc une taille de 2500 mm3 au point final. En prenant en compte une puissance de 90% et un alpha de 0.05, nous calculons une taille d'échantillon de 5 souris par groupe. Un test ANOVA à 2 voies suivi du post-test Bonferroni sera utilisé pour analyser la significativité des résultats. L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin du protocole (au plus tard à J21) ou dès l’atteinte d’un point limite par un individu pour réduire la variabilité expérimentale. Pour assurer la reproductibilité des résultats, nous répéterons l'expérience une fois. Il n’y a pas de double emploi des souris.

Raffinement

Les tumeurs B16F10-OVA et MC-38-OVA injectées par voie sous-cutanée ne développent pas de métastases et ne provoquent pas/peu de douleurs ou d'inconfort autre que le stress et la douleur liés à l'injection. Les animaux subissent donc un ensemble d’étapes de classe de gravité légère. Les protocoles que nous suivrons sont bien établis pour réduire au maximum la douleur et l’angoisse. De plus un suivi adapté des points limites précoces et prédictifs (2 fois par semaine), et la manipulation des animaux par des personnes compétentes, permettent de limiter la douleur ou souffrance des souris. Pour garantir le bien-être animal, un enrichissement (morceaux de coton, tunnel en carton, morceaux de bois) est ajouté à chaque cage et le cas échéant du DietGel et/ou de l’HydroGel sera utilisé.

Choix des espèces

Le choix de l’expérimentation sur la souris est justifié par l’existence de différents modèles transgéniques nous permettant de mesurer le rôle de NF-kB dans les réponses immunitaires anti-tumorales. D’autre part il existe un certain nombre de modèles de tumeurs transplantables chez la souris, largement décrits et utilisés par le passé. Pour atteindre la maturité du système immunitaire, les souris seront âgées de 7 à 10 semaines.

1 100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales dans le cerveau, le sein, le pancréas ou l'ovaire, puis des examens IRM répétés avec injection d'agents de contraste au gadolinium, avant une mise à mort par dislocation cervicale et le prélèvement d'organes pour doser le métal. Le porteur présente l'IRM comme "non invasive et atraumatique" et affirme qu'elle réduit le nombre d'animaux en permettant un suivi répété. Il indique que l'étude "ne peut se faire que sur un organisme vivant entier".

Objectifs

L’IRM est une technique qui est maintenant reconnue et largement utilisée en routine clinique. C’est une méthode qui utilise des champs magnétique et qui n’utilise ni rayons X ni rayonnement ionisants. Elle est non invasive et atraumatique. Pour un examen IRM les animaux sont endormis (anesthésie gazeuse sous isoflurane1.5%) afin d’éviter tout mouvement dans l’imageur qui provoque du flou sur les images et les rend ininterprétables. Leur fréquence respiratoire est contrôlée tout au long de l’acquisition des images (à l’aide d’un capteur placé sous la cage thoracique) Plusieurs étapes seront nécessaires afin d’étudier la réponse de l’agent de contraste pour détecter le carcinome ovarien : 1) Induction des modèles tumoraux. 2) Etude de la perfusion tumorale (vascularisation de la tumeur et perméabilité des vaisseaux) au cours du développement de la tumeur. Il s’agit de suivre l’intensité du signal au cours du temps (1heure) après injection de DOTAREM (agent utilisé en routine clinique) ou d’autres agents de contraste (4 différents). Un traitement mathématique de la courbe permet d’extraire des paramètres quantitatifs de perfusion afin de déterminer le stade de développement de la tumeur où elle est le plus vascularisée. 6 stades de développement seront utilisés au maximum (J2, J7, J14, J21 et J28 et J35 en fonction du modèle tumoral). Ce sont les mêmes souris que l’étape 1. Les agents de contraste (à base de lanthanides) qui seront synthétisés partent tous de la structure des agents commerciaux utilisés en routine clinique. Ils ont donc été approuvés pour leur mise sur le marché. Notre projet ne nécessite dons pas d’étude in vitro au préalable. Les agents de contraste seront injectés par voie intraveineuse. L’IRM est une technique qui est maintenant reconnue et largement utilisée en routine clinique. Cette une méthode qui utilise des champs magnétiques et qui n’utilise ni rayons X ni rayonnements ionisants. Elle est non invasive et atraumatique.

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est d’identifier le stade tumoral où la tumeur sera la plus vascularisée et les vaisseaux les plus perméables afin d’optimiser le passage de l’agent de contraste dans la tumeur pour un diagnostic le plus précoce possible. Ce projet devrait permettre d'améliorer la connaissance sur le développement d'une tumeur en terme d'hétérogénéité tissulaire et d'angiogénèse. Il devrait permettre de fournir une fenêtre temporelle là où la tumeur est le plus vascularisée et les vaisseaux suffisamment perméable pour laisser passer des agetns de contraste pour un diagnostic précoce ou des molécules thérapeutique.

Procédures

Imagerie par résonance magnétique. 1H par acquisition. Implantations de cellules tumorales en orthotopqiue (cerveau, sein, pancréas, ovaire)

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont liés à la croissance tumorale et feront l'objet de points limites.

Devenir

tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure par dislocation cervicale. Certains organes (rein, foie, rate) seront prélevés pour dosage de gadolinium par spectroscopie

Remplacement

le modèle animal est fondamental dans notre cas, puisque l’étude préclinique de croissance tumorale ne peut se faire que sur un organisme vivant entier.

Réduction

le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles. L’IRM pour le suivi des tumeurs permet aussi de réduire le nombre d’animaux puisque l’intérêt de l’IRM réside dans le fait qu’une même souris peut être observée plusieurs fois dans le temps. Les mêmes animaux seront suivis tout au long de la procédure d'imagerie au temps (J2, J7, J14, J21, J28, J35 post induction tumorale).

Raffinement

Les animaux seront hébergés 5 par cage et en portoir ventilé. Un enrichissement est mis en place avec des tubes, du côté et des petites maisonnettes en plastique. Ils sont observés quotidiennement scrupuleusement afin de respecter leur bien-être et d’éviter au maximum la douleur au moment de l’expérimentation. Les animaux sont anesthésiés pour les actes IRM. De plus, des points limites prédictifs ont été mis en place.

Choix des espèces

- La souris est un modèle adapté à notre imageur IRM (taille de l’ouverture). - Le modèle murin présente de nombreux avantages : nombreuses lignées génétiquement modifiées disponibles, existence de lignées immuno-compromises autorisant la greffe de cellules tumorales humaines (ici utilisation de souris Nude pour faciliter la prise de greffe tumorale dans le cas d’injection de cellules humaines). - L’administration de l’agent de contraste et son efficacité étant dépendantes de la physiologie, l’utilisation du modèle animal in vivo reste indispensable pour le présent projet Des souris femelles adultes de 8 semaines ; âge auquel tous les organes sont arrivés à maturation. Ce qui est important pour l’élimination des agents de contraste (en particulier les reins)

912 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour porter un système immunitaire humain, elles reçoivent une greffe de mélanome ou de cancer du pancréas, jusqu'à huit prélèvements de sang et des injections d'anticorps, pour tester des immunothérapies. Le porteur indique que les animaux peuvent développer une réaction du greffon contre l'hôte et être tués au plus tard 150 jours après reconstitution. Il affirme que "l'organisme animal entier reste le modèle le plus complet" pour évaluer ces thérapies.

Objectifs

Ce projet vise à étudier l’efiicacité antitumorale de d’anticorps thérapeutqiues chez la souris présentant un système immunitaire humain. La première procédure permettra de déterminer la prise tumorale de modèles de mélanome et de cancer du pancréas dans ces souris, avant de déterminer l’effet des anticorps thérapeutiques sur la tumeur et les cellules immunitaires.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine, à moyen terme. Ce projet permettra de développer et caractériser des modèles animaux porteurs de tumeurs afin de les utiliser pour tester l’efficacité antitumorale de composés anticancéreux en développement. Nous l’avons focalisé sur le mélanome et le cancer du pancréas, deux indications avec peu/pas de solutions thérapeutiques. Le projet va permettre de développer en phase préclinique des composés qui permettront au mieux de guérir les patients atteints de ces cancers, au pire de ralentir la progression tumorale. Les composés dont l’efficacité aura été démontrée sur les modèles de souris humanisées devront encore passer par une phase préclinique règlementaire avant une première administration chez l’homme. Les bénéfices sont attendus à moyen terme.

Procédures

-Implantation de tumeur en sous-cutané sur animal vigile (degré de gravité léger) -prélèvement de sang dans la veine caudale sur animal vigile sous contention (degré de gravité modéré), pour un maximum de 8 prélèvements espacés de 3 semaines -injection intrapéritonéale de composés thérapeutiques non toxiques (degré de gravité léger), pour un maximum de 4 injections espacées de 7 jours

Impact sur les animaux

- Perte de poids constatée : plus de 10% non améliorée par ajout de nourriture humide en maximum 24h ; plus de 20% mise à mort de l’animal - Injection sous cutanée de cellules tumorales : quelques minutes, degré de gravité léger - Prélèvement de sang dans la veine caudale sur animal vigile sous contention (degré de gravité modéré), pour un maximum de 8 prélèvements espacés de 3 semaines - Injection intrapéritonéale de composés thérapeutiques non toxiques (degré de gravité léger), pour un maximum de 4 injections espacées de 7 jours - douleur caudale si inflammation du point de prélèvement 2h maximum- Risque d'apparition de GVHD au delà de 6 mois post reconstitution complète: les animaux seront mis à mort maximum 150 jours post reconstitution

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure. La mise à mort est justifiée à la procédure 1 car les souris auront atteint un point limite. Pour la procédure 2, la mise à mort est justifiée soit par le besoin de réaliser des prélèvements, soit par l'atteinte d'un point limite.

Remplacement

Les interactions entre le système immunitaire et la tumeur sont complexes et impactées par différents organes lymphoïdes (la rate, les ganglions etc), ainsi que par différents paramètres de la tumeur (structure cellulaire, rigidité etc). Si certaines caractéristiques individuelles sont étudiées in vitro/ex vivo, l’impact et l’efficacité de thérapies destinées à la clinique ne peuvent être pleinement évaluées que dans un système complet. A ce jour, l’organisme animal entier reste le modèle le plus complet.

Réduction

Les procédures seront faites sur le nombre minimal de souris nécessaires permettant de conclure de façon fiable statistiquement ; Les expériences sur les différents modèles seront réalisées en séquentiel, les résultats seront évalués pour déterminer la nécessité de poursuivre les expériences, afin de réduire autant que possible le nombre de souris utilisées

Raffinement

Avant la mise en place du protocole les souris seront acclimatées aux expérimentateurs du projet afin de limiter leur stress. Toutes les précautions seront prises pour détecter et minimiser la souffrance, la douleur et le stress des animaux (observation quotidienne, pesée des animaux, traitement antalgique si besoin).

Choix des espèces

Nous souhaitons travailler avec des animaux génétiquement modifiés, présentant un système immunitaire natif fortement immunodéprimé, permettant la reconstitution d’un système immunitaire humain fonctionnel. Les souris sont actuellement l’espèce permettant le mieux cette reconstitution. Nous avons choisi pour ce projet deux types de souris,nous souhaitons travailler sur ces deux types de souris car elles ne sont pas reconstituées de la même manière. Nous avons choisi des animaux âgés de 13 et 16 semaines. Ces âges sont les âges recommandés par les fournisseurs comme étant optimaux pour l’implantation tumorale.

60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie pour fixer une pièce au crâne, puis une exposition à des ondes 5G une heure par jour pendant quatre semaines, tête immobilisée par contention, suivie de tests comportementaux avant le prélèvement du cerveau. Le porteur qualifie la contention d'une heure de non douloureuse et présente les tests comme non stressants, fondés sur la curiosité des rongeurs. Il affirme qu'un modèle "in vitro ou ex vivo" est "inapproprié" pour observer des effets comportementaux.

Objectifs

Au cours des deux dernières décennies, les recherches relatives aux effets centraux des champs électromagnétiques de la téléphonie mobile ont essentiellement porté sur des signaux utilisés par les standards 2G, 3G ou 4G dont les fréquences porteuses étaient comprise entre 700 MHz et 2,6 GHz. Le spectre qui sera exploité par la 5G comporte, entre autres, des gammes de radiofréquence (RF) comprises entre 450 MHz et 6 GHz (5G sub-6). Ces radiofréquences plus élevées que celles utilisées par les standards 2-4G (≤ 2,6 GHz) assureront des couvertures géographiques beaucoup plus larges et leur pénétration intra tissulaire est compatible avec une absorption directe de l’énergie dans le système nerveux central, absorption dont les conséquences biologiques et fonctionnelles restent largement à déterminer. De plus, l’usage commun d’un téléphone portable entraine une exposition régulière du tissu cérébral aux signaux électromagnétiques vecteurs des télécommunications. A notre connaissance les effets centraux de signaux 5G sub-6GHz n’ont fait l’objet d’aucune étude. Notre programme de recherche porte sur les effets centraux, à des niveaux moléculaires et comportementaux, des signaux électromagnétiques exploités par les standards récents (5G) de la téléphonie mobile. Il comporte des analyses in vivo fondées sur un modèle murin, pour caractériser les effets d’expositions de la tête aux signaux 5G sur des fonctions cognitives.

Bénéfices attendus

Notre projet vise une première caractérisation des effets centraux à des niveaux comportementaux et moléculaires de l'exposition journalière à des signaux 5G-3,5GHz. Etant donné le déploiement extrêmement rapide de la 5G dans de nombreux pays, toutes les études montrant que les animaux ont, ou pas, des déficits comportementaux et des altérations de transcriptome issu du tissu cérébral, est extrêmement important pour le développement des normes d’utilisation de cette nouvelle technologie. Il sera particulièrement important de déterminer le seuil à partir duquel des effets biologiques sont observés, ce qui nécessitera surement d’autres études non incluses dans ce projet.

Procédures

- Procédure chirurgicale (1 par animal) pour la mise en place préalable d’une pièce solidarisée au crâne - Exposition au champ électromagnétique (20h : 1h par jour pendant 4 semaines (5 jours/semaine)) - Tests comportementaux (7 : 1 par jour pendant 7 jours)

Impact sur les animaux

- Présence de douleurs postopératoires. La présence de douleurs est déterminée d’après les indicateurs comportementaux suivant : réduction de la mobilité avec dos voûté et/ou tressautements du corps. Dans ce cas une analgésie supplémentaire et une antibiothérapie est mise en place. L’animal est euthanasié si les douleurs persistent plus de 24h. - Infections postopératoires (écoulements) ou perte de l’implant crânien. Dans ce cas, l’animal est euthanasié. - La perte de poids importante (plus de 20% de son poids). Dans ce cas l’animal est euthanasié.

Devenir

A l’issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés et leurs cerveaux prélevés.

Remplacement

Le programme de recherche vise à étudier les effets des signaux électromagnétiques de type 5G sur le système nerveux central dans son ensemble mais surtout sur les effets cognitifs en utilisant des tests comportementaux. L’exposition à ces ondes électromagnétiques est répétée sur plusieurs jours (20 jours), avec une durée quotidienne de 1h, ce qui peut ressembler à l’usage commun d’un téléphone portable chez l’être humain. Ces modèles animaux rendent possibles des analyses de mécanismes cellulaires ou moléculaires associés à toute modification comportementale induite par un agent environnemental. Un modèle in-vitro ou ex-vivo est donc inapproprié pour observer de possibles modifications comportementales ou pour associer des modifications moléculaires et cellulaires au comportement.

Réduction

A notre connaissance les effets centraux de signaux 5G exploitant des radiofréquences plus élevées que celles utilisées par les standards 2-4 G (≤ 2,6 GHz) n’ont fait l’objet d’aucune étude. Notre projet vise ainsi une première caractérisation des effets centraux de signaux 5G-3,5GHz à des niveaux moléculaires et comportementaux. Au niveau comportemental, le nombre d’animaux par groupe correspond au minimum nécessaire pour une démonstration convaincante des principes scientifiques étudiés sur la base d’arguments statistiques valides, y compris pour des études pilotes. Sur la base des études publiées et de notre expérience, un maximum de 15 souris par groupe est nécessaire. Nous utilisons des tests statistiques non paramétriques adaptés aux petits échantillons (

Raffinement

Les animaux d’une même fratrie ou du même âge sont regroupés dans une large cage (Techniplast, 530 cm²). Les souris ont de la nourriture (A04, 18% de protéines, en zone conventionnelle) et de la boisson ad libitum, ainsi que de l’enrichissement (tunnels et maisons en carton). Les 7 jours suivant l'opération chirurgicale, les animaux sont surveillés et pesés tous les jours par l'expérimentateur et/ou les animaliers (avec une fiche post-opératoire pour chaque animaux), et reçoivent si besoin un analgésique par voie orale ou en injection sous-cutanée. Pendant la période de repos, aucune manipulation expérimentale n’est entreprise. La procédure d’exposition au champ électromagnétique et les tests de comportement durent 4 semaines, dont 20h d’exposition. Pour éviter de possibles effets de l’anesthésie sur le système nerveux central et permettre à la souris de réaliser des tâches comportementales à la fin du protocole, il est nécessaire que la souris soit exposée en étant vigile. De plus, il est important que lors de l’exposition aux ondes électromagnétiques d’une antenne 5G, l’animal soit en contention partielle pour recevoir précisément pendant 1h la dose de degré d’absorption spécifique (DAS) qui a été sélectionnée. Pour que la tête de l’animal soit dans une position fixe tout en ayant un environnement qui ne soit pas trop stressant, un dispositif de contention immobilisera la tête de la souris pendant 1h tout en lui permettant de bouger son corps dans un tube en plexiglas. Cette immobilisation pendant 1h, lorsque la souris a compris la tâche n’est aucunement douloureux et le système de contention décrit dans l’annexe 1 est le même que celui qui a été utilisé dans de nombreuses expériences impliquant l’acquisition de réponses calciques en imagerie bi-photonique. Les tests de comportement qui suivront l’exposition ne sont pas stressants et sont basés sur la curiosité naturelle des rongeurs pour la nouveauté.

Choix des espèces

Il est important que lors de l’exposition aux ondes électromagnétiques 5G, la tête de l’animal soit dans une position constante pour recevoir précisément la dose de degré d’absorption spécifique (DAS) sélectionnée pendant 1h. L’espèce utilisée, la souris, a déjà montré une capacité d’habituation à une contention modérée (à savoir ne pas bouger la tête, alors que le corps et les pattes peuvent bouger) lors de nombreuses expériences sur souris éveillée. Les tests comportementaux qui seront réalisés ont déjà été réalisés chez la souris dans de très nombreuses études comportementales, ce qui nous permettra de nous référer à des données connues de la littérature. Les souris auront 2 mois au début de l’expérience. Cette étude s’applique sur l’animal adulte.