Rongeurs

30 hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont infectés par le SARS-CoV-2 par voie orale ou intranasale, pesés chaque jour, puis tués par prélèvement sanguin intracardiaque sous anesthésie pour autopsie, afin de valider la voie orale d'infection en vue d'un futur essai de probiotiques contre le Covid-19. Le porteur annonce une perte de poids limitée à 5-8 % et une absence de signes cliniques, en s'appuyant sur ses expériences antérieures. Ce projet est présenté comme une étape préliminaire de calage du modèle avant l'étude principale.

Objectifs

Le présent projet vise à valider la voie orale comme voie d'infection par le SARS-CoV2 chez le hamster. Ce projet représente un travail préliminaire à un autre projet dont l'objectif sera de caractériser l'efficacité de bifidobactéries (groupe de bactéries vivant à l'état naturel dans les intestins) dans la lutte contre les infections au SARS-CoV2, grâce à leur potentiel pouvoir d'inhibition de la fixation du virus SARS-CoV2 sur ses cellules cibles. Des expérimentations in-vitro sont actuellement en cours pour valider cette hypothèse. En cas de succès, et pour valider cette approche in-vivo, il sera nécessaire que les bifidobactéries testées se retrouvent sur le site d’infection virale. N’étant pas administrables par voie intra-nasale, il sera donc nécessaire d’administrer les bifidobacteries et le virus SARS-CoV2 par voie orale. En préalable, il est donc nécessaire de valider cette voie d’infection du SARS-CoV2 sur le modèle hamster qui sera utilisé.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de caractériser la voie orale d'infection chez le hamster syrien et de valider la dose infectante choisie. Différents paramètres seront étudiés : - courbe de poids - quantification du virus dans une sélection d'organes d'intérêt (Appareil respiratoire supérieur, rate, poumons) par culture cellulaire et quantification de matériel génétique - lésions pulmonaires par immunohistologie - séroconversion. Ces paramètres serviront de référence lors des expérimentations visant à évaluer le pouvoir des souches probiotiques à prévenir le Covid-19.

Procédures

Groupe témoin + groupe infecté par voie orale : les 18 animaux seront infectés à J0, par voie orale sans anesthésie, avec 200µl de virus à la dose de 10^5 TCID50. Groupe témoin infection i.n: Les 12 hamsters seront soumis à une légère anesthésie gazeuse (isoflurane 5%) afin de leur admnistrer à J0 (à l'aide d'une micropipette) par voie intranasale 40µL de virus à la dose de 10^5 TCID50 (soit 20µl par narine). Les animaux seront manipulés quotidiennement pour une pesée. L'ensemble des animaux seront anesthésiés (J+4 ou J+7) à l'isoflurane puis par injection de kétamine/xylazine afin de réaliser une prise de sang intracardiaque terminale avant autopsie.

Impact sur les animaux

Hormis une perte de poids des hamsters limitée à 5-8% (données issues de nos précédentes expériences), et dont le pic est attendu à J+6, les hamsters ne développent pas de signes cliniques lorsqu'ils sont infectés. A partir de J+6, les hamsters regagnent du poids

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort afin de réaliser une autopsie et une collecte d'organes/sang pour étudier la pathogénie du SARS-CoV2.

Remplacement

Des experimentations préliminaires in-vitro sont encours pour démontrer l'activité anti-protéase in-vitro sur des cellules caco2. Néanmoins, l'évaluation de la pathogénocité d'un virus (multiplication virale, distribution, lésions associées) ne peut se faire in-vitro et nécessite de passer par le modèle animal.

Réduction

le nombre d'animaux par groupe a été fixé à 12 afin d'avoir 6 animaux par point de mise à mort (J+4 et J+7) qui est le minimum généralement requis pour obtenir des résultats d'infection virale statistiquement significatifs . Seul Le groupe témoin ne comporte que 6 animaux, tous mis à mort à J+7 (pas de sacrifice à J+4).

Raffinement

Ces hamsters seront hébergés en cage de 2 à 3 individus avec un enrichissement composé de nombreux tunnels, abris (afin de satisfaire leur besoin de cachette), cellulose, et de bâtonnets de bois à ronger. Un contrôle de leur état de santé sera assuré tous les jours. Des points limites précis et suffisamment précoces pour leur éviter toute souffrance prolongée et inutile ont par ailleurs été définis.

Choix des espèces

Les études scientifiques menées sur le SARS-CoV-2 ont maintenant largement démontré que le hamster doré était un modèle expérimental qui présentait une forte sensibilité au virus (atteintes respiratoires, perte de poids) ainsi qu'une forte réceptivité (multiplication du virus dans les poumons). Le hamster est donc le modèle de choix pour l'évaluation de l'efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques ou de nouveaux vaccins. Nos précédentes expérimentations nous ont permis de caractériser la réceptivité et la sensibilité des hamsters adultes vis à vis des souches SARS-CoV2 utilisées au laboratoire. Nous utiliserons donc des hamsters adultes de 8 à 10 semaines à réception.

35 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont maintenus par restriction alimentaire à 90 % de leur poids pour les inciter à rapporter de la nourriture à leur nid pendant un mois d'apprentissage, avant mise à mort et prélèvement du cerveau pour un marquage du gène c-fos, afin d'identifier les régions cérébrales de l'intégration des trajets. Le porteur héberge individuellement une partie des rats et prévoit un retour à l'alimentation libre au-delà de 15 % de perte de poids. Il présente ce projet fondamental comme une remise en question possible de l'hypothèse de la carte cognitive dans la navigation.

Objectifs

La navigation spatiale chez les mammifères repose sur la perception et le traitement de multiples informations sensorielles dont la source peut être environnementale (informations allothétiques : visuelles, olfactives, auditives) ou interne à l'animal (informations idiothétiques générées par le déplacement: vestibulaires, tactiles, proprioceptives, etc.). La conjonction de ces informations va permettre à l’animal de mettre en œuvre des stratégies spatiales variées lui procurant une flexibilité comportementale. L'importance des informations idiothétiques et le rôle des régions cérébrales dans le traitement de ces informations ont longtemps été sous-estimés et restent méconnus. Des travaux comportementaux ont montré que les mammifères sont capables au cours de leur déplacement de revenir à un lieu de référence, par exemple leur "nid", en n'utilisant que des informations idiothétiques. Cette capacité est appelée intégration des trajets car elle repose sur l'intégration par le système vestibulaire des accélérations linéaires et angulaires lors du mouvement ce qui aboutit au calcul et à la mise à jour d'un vecteur pointant sur le lieu de retour. Dans une série d’études lésionnelles, nous avons montré que l'intégration des trajets implique plusieurs régions du cerveau, comme le cortex pariétal et le cortex entorhinal. Dans le cortex entorhinal, une population neuronale (les "cellules-grilles") pourrait être le centre de l’intégration des trajets du cerveau. Cette hypothèse est séduisante mais le cortex entorhinal n'est certainement pas la seule région du cerveau impliquée. Le traitement des informations idiothétiques dans le cerveau implique un réseau nerveux étendu mais notre connaissance des contours de ce réseau reste très lacunaire. L'objectif du projet est d'identifier l'ensemble des régions impliquées dans ce réseau en faisant un marquage de l'expression du gène d'expression précoce c-fos au cours d'une tâche d'intégration des trajets. Nous faisons l’hypothèse que la tâche implique une activation rapide du gène c-fos et donc une synthèse de proteines c-fos en particulier dans les structures sollicitées par le processus d’intégration des trajets.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet nous permettront d'identifier les structures cérébrales impliquées spécifiquement dans la mise en œuvre de l'intégration de trajet. Ces résultats nous permettront également de tester l'hypothèse selon laquelle l'intégration de trajet peut se faire à partir d'un autre point de l'environnement que celui à partir duquel l'animal initie son trajet. Ce dernier résultat, s'il est confirmé, nous permettrait de remettre en question le recours quasi-systématique à une hypothèse alternative (existence d'une carte cognitive) pour expliquer les comportements de navigation complexes observés chez les animaux (humains compris).

Procédures

Procédure comportementale : Apprentissage d'une tâche d'integration des trajets. Procédure se déroulant sur un mois environ à raison de 2 essais de durée variable (mais n'excédant pas 5 minutes chacun) par jour et par animal.

Impact sur les animaux

Afin d'assurer un contrôle individuel de la prise alimentaire, les animaux des groupes 1, 2 et 4 seront hébergés individuellement. Cette mesure particulière d'hébergement sera maintenue durant une période la plus courte possible et les rats ainsi isolés pourront avoir des contacts visuels, auditifs et olfactifs avec leurs congénères. Puisqu’un contrôle alimentaire est prévu pendant toute la durée de l’expérience afin de réduire le poids des animaux à 90% de leur poids initial, les rats sont pesés tous les jours afin d'éviter des réductions trop importantes de leur poids. Si la perte de poids d'un animal est trop importante (e.g. >15%), l’alimentation de l’animal devient ad libitum jusqu’au retour du poids désiré.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort (n=35) par injection d'euthanasiant (Pentobarbital sodique, 200 mg/kg, IP, soit 0.5 mL/kg d'EUTHASOL VET. SOLUTION INJECTABLE) après sédation profonde (Médétomidine, 500 μg/kg, IP, soit 0.5 mL/kg pour le DOMITOR). La mise à mort permet le prélèvement des cerveaux afin de réaliser le marquage de l'expression du gène d'expression c-fos par immunohistochimie. La quantification de ce marquage est l'objectif de l'étude car il permettra d'identifier les structures nerveuses impliquées dans l'intégration des trajets.

Remplacement

La nature même des expériences proposées dans ce projet ne permet pas d'envisager de remplacement. En effet, ces expériences reposent sur l'exploration de l'environnement effectuée par les animaux en réponse à diverses manipulations environnementales et ne peuvent être réalisées à partir de modèles in vitro, in silico ou ex vivo. Ces expériences, du fait du caractère invasif des procédures de collecte des données (prélèvement du cerveau afin de révéler le marquage de certaines structures nerveuses), ne peuvent pas non plus être conduites chez le sujet humain.

Réduction

Cette étude nécessitera un total de 35 rats. Deux groupes expérimentaux et deux groupes contrôles sont indispensables pour permettre de conclure sur l'implication des structures dans les processus ciblés : Un groupe expérimental (n=8) entraîné dans la tâche d'intégration des trajets, un groupe contrôle (n=8) entraîné dans une tâche spatiale ne nécessitant pas l'intégration des trajets, un groupe contrôle (n=6) ne réalisant aucune tâche (explorant librement l'environnement pendant 3 mn) et un deuxième groupe expérimental (n=8) entraîné dans une tâche alternative d'intégration de trajet. Enfin, 5 animaux sont ajoutés au total pour pallier d'éventuels problèmes de marquage immunohistochimique (aux alentours de 15%). Le nombre d'animaux dans ces groupes permet de tenir compte de la variabilité individuelle inhérente aux études comportementales et d'obtenir des résultats fiables. L'analyse des résultats comportementaux reposera essentiellement sur l'utilisation de tests statistiques de proportion (type Chi 2). En ce qui concerne l'analyse des résultats issus des marquages immunohistochimiques, plusieurs scenari sont envisagés. Si la normalité des distributions n'est pas avérée, nous utiliserons des tests statistiques non-paramétriques tels que le test de Kruskal-Wallis. Si la normalité des distributions est avérée mais pas l'homogénéité des variances, nous utiliserons l'ANOVA à un facteur de Welch (associé au test post-hoc de Games-Howell). Si la normalité et l'homogénéité sont avérées, nous aurons recours à un test ANOVA à un facteur (associé au test post-hoc de Tukey). Ce plan d'analyse statistique nous permettra d'exploiter les données quelque soit l'ampleur de la variabilité inter-individuelle tout en conservant des effectifs d'animaux réduits.

Raffinement

La tâche comportementale repose essentiellement sur le comportement spontané des rongeurs à explorer un environnement et à récupérer un morceau de nourriture pour le ramener dans son nid et le consommer. L'animal apprend à faire cette tâche sans contrainte externe ce qui réduit considérablement son état de stress. L'hébergement des animaux s'effectue dans le respect des protocoles d'enrichissement validés par la Structure de Bien-Etre Animal de notre établissement d'expérimentation. Puisqu’un contrôle alimentaire est prévu pendant toute la durée de l’expérience afin de réduire le poids des animaux à 90% de leur poids initial, les rats sont pesés tous les jours afin d'éviter des réductions trop importantes de leur poids. Si la perte de poids d'un animal est trop importante (e.g. >15%), l’alimentation de l’animal devient ad libitum jusqu’au retour du poids désiré.

Choix des espèces

Le rat constitue un modèle animal privilégié pour les études sur la navigation spatiale du fait de ses excellentes capacités d'orientation spatiale. Nous avons montré que ces animaux sont capables de réaliser la tâche d'intégration des trajets dans sa version classique (Groupe 1). L'étude de l'activation des réseaux de structures nerveuses au cours d'un comportement de déplacement dans l'environnement ne peut pas être réalisé en utilisant des procédures in vitro, ex vivo ou in silico. Les animaux seront des rats adultes agés de 4 mois. Les capacités d'apprentissage chez ces animaux de cet âge sont optimales.

250 souris "humanisées" vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sur une centaine de jours, elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau puis des cellules sanguines humaines et des anticorps monoclonaux, pour tester lesquels renforcent la réaction du greffon contre la tumeur. Le porteur prévoit une mise à mort dès qu'une tumeur atteint 2 000 mm³ ou qu'une souris perd 20 % de son poids, et décrit des tumeurs pouvant s'ulcérer et se nécroser. Il justifie le recours à ces souris immunodéficientes, seules à accepter des cellules humaines, comme une alternative aux primates en recherche préclinique.

Objectifs

En transplantation, l'effet greffon contre la tumeur a été observé après une greffe de cellules souches hématopoïétiques. Le greffon contient des cellules lymphocyte T du donneur qui peuvent être bénéfiques pour le receveur en éliminant les cellules malignes résiduelles. Dans le but d'évaluer le potentiel thérapeutique d'anticorps monoclonaux sur l'effet greffon contre la tumeur nous testons in vivo plusieurs candidats médicamenteux dans un modèle de greffe contre la tumeur chez la souris immunodifficiente. Ces anticorps monoclonaux ont été générés et validés in vitro mais les études in vivo sont indispensables pour pouvoir envisager des essais cliniques.

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus à l’issue de cette étude, permettront de : - Comparer les résultats in vivo aux data in vitro - Déterminer le potentiel thérapeutique des anticorps testés sur les réponses immunes dans le contexte de cette maladie - Comprendre les différents mécanismes d’action mis en place - Valider et sélectionner pré-cliniquement la meilleure molécule avant d’envisager les tests cliniques

Procédures

- Rasage des souris la veille de l’injection des cellules tumorales, cette action s’effectuera sur animal vigile (2min/animal)- Injection des cellules tumorales en sous-cutanée (sur toute les souris) sous anesthésie gazeuse (10min/animal), 8 jours avant le début de protocole - une fois que les tumeurs sont détectables par palpation injection des cellules sanguine humaines en intraveineuse sur animal vigile (hormis le groupe de tumeur seul) 5min/animal - Injection des traitements en intra-péritonéal sur animal vigile (1min/animal) en fonction des groupes, deux fois par semaine - Prélèvement sanguin (100µl de sang,) tous les deux semaines sur toutes les souris (10min/souris)sous anesthésie gazeuse - Euthanasie sous anesthésie général et dislocation cervical de toutes les souris. A préciser que la durée totale de l'expérience est de 100 jours, chaque intervention sera réalisées à part dans un instant t. A noter que l’utilisatrice est une personne expérimentée en procédure animale, ce qui réduira les temps d’intervention et par conséquence moins de stress et d’angoisse animal

Impact sur les animaux

Ce modèle murin de GvT consistera à injecter des cellules tumorales en sous-cutanée, ce qui engendre quelques paramètres à surveiller régulièrement qui concerne la masse tumorale et l’animal lui-même. *La masse tumorale : les cellules seront injectées localement en sous-cutanée, la tumeur prendra de volume au fur à mesure, une surveillance quotidienne sera appliquée pour vérifier si la tumeur pousse ou pas en mesurant la longueur et la hauteur pour calculer le volume ? ; si elle envahie les tissus voisins en palpant la masse tout en cherchant les contours et des éventuelles adhérences avec le tissu cutané ? si elle s’ulcère, une ulcération de la tumeur sera visible l’œil nu, la tumeur sera rouge et présente un point de nécrose, à noter que le flanc de l’animal sera toujours rasé pour faciliter l’observation. *Le poids : une perte de poids est un signe d’un mal-être, souffrance ou douleur ; le poids sera suivi 2-3 fois par semaine, une perte supérieure ou égale à 20% est considéré comme point limite qui oblige l’euthanasie de l’animale. *Comportement : le comportement d’un animal souffrant d’un mal-être sera modifié, une baisse d’activité, une voussure de dos, pelage ébouriffé, froidure et pâleur des extrémités… tous ces critères indiquent une douleur. L’animale sera soulagé par une l’administration de l’anti-douleur adéquat et disponible dans notre laboratoire. A savoir que les animaux qui souffrent de manière chronique vont être suivis avec une attention particulière non seulement pour soulager leur souffrance, mais aussi parce qu’ils nécessitent une gestion et un mode de vie particuliers (manipulation délicate, accès facile à l’eau et à la nourriture, réduire le nombre de souris dans la cage, administration d’anti-douleur Ci-dessous une liste des points limites qui déterminera l’euthanasie de l’animal La masse tumorale : • L’évolution de la croissance tumorale est un des paramètres clés de cette étude, mais la masse tumorale ne doit pas interférer les fonctions normales de l’animale ni induire une souffrance pour son déplacement. Un volume tumoral supérieur ou égal à 2000mm3 est un point limite. • Une ulcération/infection à l’emplacement de la tumeur • Un envahissement des tissus voisin par la tumeur localisée La perte de poids • Une perte supérieure ou égale 20 % du poids du corps d’un animal normal (en tenant compte de la masse tumorale) Comportement anormale • Une détresse, un mal-être

Devenir

Mise à mort

Remplacement

Des études fonctionnelles ont été réalisées in vitro à partir de cellules humaines, les résultats sont prometteurs mais sont limités par l’absence du contexte physiologique et de la complexité du système immunitaire et ne peuvent remplacer les études in vivo. Il est donc nécessaire de tester l’efficacité immuno-régulatrice des molécules d’intérêt dans un modèle in vivo proche de l’Homme. Une alternative solide à l’utilisation de primates en recherche préclinique est le modèle de souris dites « humanisées ».

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe est réduit à 25, nombre nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement interprétables. Les souris seront divisées en 10 groupes (25 souris/groupe). Le groupe témoin recevra un isotype contrôle ou PBS, les autres groupes seront traités avec les différents anticorps test. Le nombre de groupes a été réfléchi afin d’avoir les contrôles suffisants pour pouvoir conclure quant aux résultats obtenus. Le nombre total des animaux est de 250.

Raffinement

Afin de respecter le bien-être animal, au début de protocole les souris seront réparties par groupe de 3-5 souris par cage, avec des moyens d’enrichissement (frisottis, dôme et tunnel). Une surveillance quotidienne des animaux en protocole, pour déceler une douleurs, souffrance ou mal-être. Les animaux souffrants d’une douleur seront séparés des autres (étant donné qu’il existe toujours un animal dominant dans une cage, qui empêche l’animale faible d’accéder à la nourriture ou l’eau. En séparant les animaux faibles dans des cages offre une facilité d’accès à la nourriture et l’eau. Une administration d’analgésique buprénorphine 0.05mg/kg en sous cutané deux fois par jour pour tout animale souffrant, à noter que en cas de point limite (souffrance qui ne sera pas gérable par anti-douleur) l’animale sera euthanasié. Les différents points limites, une perte de poids de 20%, un volume tumoral de 2000mm3 ou montrant des signes physiques caractéristiques d’un mal-être seront euthanasiés (inhalation d'isoflurane suivie par une dislocation cervicale).

Choix des espèces

Les propriétés immuno-régulatrices de l’anticorps ne peuvent être testées que dans un modèle primate ou humanisé. Nous avons choisi les souris NOD/SCID/Il2R gamma-/- déficientes en cellules immunes car elles permettent l'acceptation de cellules immunes humaines. Un tel protocole chez des souris immunocompétentes ne serait pas possible, les cellules et tissus humains seraient rejetés par le système immunitaire. Ces souris sont issues de l'animalerie Charles River et sont reproduites au sein notre animalerie. A noter également que cette espèce animale présente une facilité de reproduction, d'hébergement et de manipulation.

40 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie d'implantation d'électrodes dans le cerveau avec injection d'un vecteur viral, puis sont soumis à une restriction alimentaire les maintenant à 90 % de leur poids pour les pousser à explorer un dispositif en quête de nourriture, l'objet étant de cartographier l'activité du cortex rétrosplénial pendant la navigation spatiale. Le porteur les héberge individuellement et prévoit un retour à l'alimentation libre si la perte de poids dépasse 15 %. Il présente les retombées pour les maladies neurodégénératives comme une simple piste de réflexion issue de cette recherche fondamentale.

Objectifs

Les capacités d'orientation et de mémoire sont déficitaires chez les sujets vieillissant et les patients atteints de la maladie d'Alzheimer. Le cortex rétrosplénial est impliqué dans ces processus mnésiques et de navigation. et semble être une structure fondamentale pour s'orienter dans des environnements complexes. Ce projet permet de comprendre quelles informations de l'espace sont nécessaires aux activités neuronales du cortex rétrosplénial et également d'étudier l'influence de cette structure sur les autres aires cérébrales impliquées dans la navigation, notamment le cortex entorhinal médian. Ce projet, de nature fondamentale, ouvre des pistes de réflexions sur la nature des déficits de navigation inhérents aux maladies neurodégénératives qui affectent la mémoire.

Bénéfices attendus

Ce projet, de nature fondamentale, ouvre des pistes de réflexions sur la nature des déficits de navigation inhérents aux maladies neurodégénératives qui affectent la mémoire.

Procédures

Procédure comportementales : exploration libre à la recherche de nourriture suite à une privation contrôlée de nourriture; et procédures chirurgicales : implantation d'un système d'électrode avec l'injection d'un vecteur viral pour utiliser les outils d'inactivation neuronale pharmacogénétique. Tous les animaux subiront la procédure comportementale. 1 groupe de 20 animaux sera soumis à la procédure chirurgicale d'implantation des électrodes seule, et un 2ème groupe d'animaux sera soumis à la chirurgies d'implantation d'électrode et d'injection du vecteur viral.

Impact sur les animaux

Afin d'assurer un contrôle individuel de la prise alimentaire, les animaux seront hébergés individuellement. Cette mesure particulière d'hébergement sera maintenue durant une période la plus courte possible et les rats ainsi isolés pourront avoir des contacts visuels, auditifs et olfactifs avec leurs congénères. Puisqu’un contrôle alimentaire est prévu pendant toute la durée de l’expérience afin de réduire le poids des animaux à 90% de leur poids initial, les rats sont pesés tous les jours afin d'éviter des réductions trop importantes de leur poids. Si la perte de poids d'un animal est trop importante (e.g. >15%), l’alimentation de l’animal devient ad libitum jusqu’au retour du poids désiré.

Devenir

La mise à mort permet le prélèvement des cerveaux afin de réaliser le marquage des neurones par cresyl violet ou thionine et d’identifier la position des électrodes d’enregistrement dans les structures d’intérêts. L'identification de la position des électrodes est cruciale car elle permet d'affirmer que les activités neuronales mises en évidence proviennent bien de la structure cérébrale ciblée dans le projet.

Remplacement

Ce projet repose sur les méthodes invasives d'enregistrement des neurones isolés ainsi que de l'inactivation de l'activité cérébrale chez le rat jeune adulte Long Evans, qui ne sont pas compatibles avec une approche chez le sujet humain, ni adaptables aux études in vitro ou de modélisation.

Réduction

Le projet comporte deux expériences qui utiliseront chacune 20 animaux. Ce nombre est indispensable pour deux raisons : 1-éviter statistiquement une variabilité inter-individuelle et 2-enregistrer un nombre suffisant d’activité neuronale pour effectuer des tests statistiques. L'analyse des résultats reposera essentiellement sur l'utilisation de tests statistiques paramétriques. Cependant, si la normalité des distributions n'est pas avérée, nous utiliserons des tests statistiques non paramétriques. Ce plan d'analyse statistique permettra d'exploiter les données si une variabilité inter-individuelle est toutefois présente tout en conservant des effectifs d'animaux réduits.

Raffinement

La tâche comportementale repose essentiellement sur le comportement spontané des rongeurs à explorer un environnement pour aller manger des granulés de nourriture. L'hébergement des animaux s'effectue dans le respect des protocoles d'enrichissement validés par la Structure de Bien-Etre Animal de notre établissement d'expérimentation. Puisqu’un contrôle alimentaire est prévu pendant toute la durée de l’expérience afin de réduire le poids des animaux à 90% de leur poids initial, les rats sont pesés tous les jours afin d'éviter des réductions trop importantes de leur poids. Si la perte de poids d'un animal est trop importante (e.g. >15%) ou en dessous de 90% de leur poids initial (points limites), l’alimentation de l’animal devient ad libitum jusqu’au retour du poids désiré. Une grille de score approuvée par la SBEA permet de s’assurer du bien-être animal pendant et en dehors des temps d’expérience. Cette grille permet d’évaluer si l’animal est dans un état normal ou en souffrance. L’arrêt des souffrances est prévu dans cette grille de score par des mesures d’observation attentive, des méthodes de soulagement, l’arrêt complet de l’expérience ou la mise à mort de l’animal. Les méthodes d’arrêt des souffrances se font de concert avec les zootechniciens de l’animalerie et sont reportées pour chaque animale sur une feuille de soins disponibles à l’animalerie.

Choix des espèces

Le rat représente le modèle de choix pour les études du comportement spatial qui est à la base des protocoles comportementaux qui seront utilisés. Il présente d'excellentes performances dans les tâches de navigation spatiale. Enfin, 90% des études portant sur les bases neurales de la navigation réalisées chez le rongeur reposent sur l'utilisation du rat, ce qui permet de disposer d'une littérature abondante sur laquelle s'appuyer. Par ailleurs, j'ai réalisé la seule étude qui a mis en évidence les cellules bidirectionnelles du cortex rétrosplénial chez le rat. Utiliser le rat me permet de comparer les résultats issus de ce projet avec ceux précédemment obtenus. Le projet vise à établir le rôle de certaines structures cérébrales chez le rat jeune adulte. Afin de pouvoir comparer les résultats avec les travaux antérieurs, nous utiliserons des animaux qui auront 3 mois au début de l'expérience.

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent sous anesthésie une chirurgie stéréotaxique d'injection de virus dans le cerveau, puis passent une série de tests comportementaux (labyrinthe surélevé, open field, reconnaissance d'objet et reconnaissance sociale, enfouissement de billes, nidification), pour tester une thérapie génique contre le syndrome de l'X fragile sur une lignée de souris Fmr1-KO. Le porteur revendique une preuve de concept déjà obtenue in vitro et affirme que ces mécanismes comportementaux ne peuvent être étudiés que dans un "organisme complexe" comme la souris. Les bénéfices annoncés pour les patients restent au stade de la preuve de concept, l'objectif immédiat étant de mesurer une correction du comportement avant prélèvement du cerveau.

Objectifs

Le syndrome de l’X fragile (FXS) représente la première cause héréditaire de déficience intellectuelle et d’autisme pour lequel il n'existe à ce jour aucune thérapie. Nous avons récemment découvert un mécanisme moléculaire qui serait à l’origine du FXS. Nous proposons maintenant de tester une approche par thérapie génique afin de corriger le mécanisme moléculaire défaillant pour traiter le FXS. Pour mettre en œuvre cette approche expérimentale, nous utiliserons un modèle animal FXS qui a été développé chez la souris. La souris FXS récapitule une grande partie des phénotypes observés chez l’homme et constitue un excellent modèle animal de la maladie. Ainsi ce projet vise à déterminer : 1. Est-ce que la thérapie génique permet de restaurer le mécanisme moléculaire défaillant pour traiter le FXS ? 2. Est-ce que la thérapie génique permet de restaurer le comportement du modèle de souris FXS ?

Bénéfices attendus

Notre étude a pour but de fournir la preuve de concept que le mécanismes moléculaire que nous avons identifié précédemment contribue à la pathologie du FXS. Nous proposons des nouveaux outils de thérapie génique pour corriger ce mécanisme moléculaire défaillant et le comportement du modèle de souris FXS. Jusqu'à présent, toutes les stratégies thérapeutiques envisagées pour traiter le FXS ont échoué cliniquement. Notre projet s'appuie sur des connaissances nouvelles acquises au laboratoire, et qui pour la première fois, lient le FXS à un nouveau mécanisme moléculaire. Notre approche repose ainsi sur des données préliminaires publiées et solides pour fournir de nouvelles stratégies thérapeutiques pour traiter le FXS.

Procédures

480 animaux subiront, sous anesthésie générale, une chirurgie stéréotaxique afin d’injecter des adénovirus associés dans une zone particulière du cerveau. La durée de la chirurgie, de l’induction de l’anesthésie au réveil, est 1h – 1h30. Après l'injection de virus, ils seront soumis à des tests comportementaux : semaine 1. Analyse du rythme circadian (36H) + Labyrinthe surelevé (5min). semaine 2.Open field (15min), toilettage (15min). semaine 3. nidification (24h) + reconnaissance d’objet (2x10min) + enfouissement de billes (15 min) semaine 4. Reconnaissance sociale (3x10min).

Impact sur les animaux

La chirurgie stereotaxique est utilisée pour délivrer des vecteurs viraux (adénovirus associés) dans une zone particulière du cerveau. Ces vecteurs permettront l'expression de notre protéine d'intérêt ou de récepteurs particulier dans des populations neuronales spécifiques. La chirurgie pourrait provoquer une réaction inflammatoire locale post- chirurgicale.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés et leur cerveau sera prélevé pour des études histologiques.

Remplacement

Toutes les validations experimentales in vitro ont été réalisées et publiées. Nous avons ainsi apporté la preuve de concept in vitro que notre approche expérimentale fonctionne. Il convient maintenant de valider in vivo nos données. Etant donné que le phénotype comportemental est l'un des traits les plus importants du FXS, ces mécanismes complexes ne peuvent être étudiés que dans des organismes complexes tels que la souris

Réduction

Nous utiliserons un total de 480 animaux. Le nombre d’animaux testés dans chaque expérience nous permettra une comparaison statistique adaptée entre les différents groupes tout en tenant compte des impératifs de réduction. Par ailleurs, toujours par souci de réduction, plusieurs procédures expérimentales (avec un temps de récupération adaptée pour les animaux) seront réalisées chez les mêmes cohortes de souris. Pour toutes ces raisons, le nombre d'animaux a éte déterminé en prennant en compte les contraintes experimentales.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages avec un enrichissement essentiel pour leur bien-être (Coton + Carton). La litière des animaux est remplacée une fois par semaine. Le stress lié aux procédures nécessitant l'isolement des animaux sera diminué par l'usage de cages transparentes rendant leurs congénères visibles. Aucune douleur ou souffrance n'est attendu dans la plupart des procédures expérimentales utilisées mais l'usage d'anesthésique et d'analgésique sera systématique pour les procédures expérimentales potentiellement douloureuses. L'habituation des souris à l'opérateur aura systématiquement lieu quelques jours avant l'expérience et les différentes expériences seront réalisées par du personnel qualifié afin d’éviter le stress lié à la manipulation des animaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement par du personnel qualifié pour prendre les mesures appropriées en cas d'apparition de signes d'inconfort ou de douleur après avis vétérinaire. Des points limites seront déterminés pour éviter toute souffrance animale. Les injections stéréotaxiques seront réalisées par une personne détentrice d'une formation en chirugie et formée spécifiquement à cet acte chirurgical.

Choix des espèces

L’utilisation des souris se justifie par l’existence d'une lignée génétiquement dans laquelle la protéine Fmr1 est invalidé. La souris Fmr1-KO récapitule une grande partie des phénotypes observés chez l’homme (altération de la mémoire, perte d’interaction sociale, hyperactivité, macro-orchidisme, anomalie des épines dendritiques) et constitue un excellent modèle animal de la maladie. Les chirurgies stéréotaxiques concernant l'injection des AAVs seront réalisées chez des animaux chez les nouveau nés à P0 pour prévenir le phénotype du FXS. Chez des souris âgées de 8 semaines (jeune adulte), stade auquel toutes les structures cérébrales sont pleinement développées et chez des anuimaux adultes de 20 semaines afin de corriger le FXS Les animaux seront injectés dès l'âge de 8 semaines pour la première partie du projet (PE1).

60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent deux injections d'un sérum d'auto-anticorps qui déclenche une arthrite, avec gonflement des articulations des pattes d'intensité variable, pour étudier le rôle des neutrophiles dans le déclenchement de la polyarthrite rhumatoïde. Le porteur prévoit une mise à mort des souris dont l'épaisseur des pattes dépasse 3,5 mm au pic de la maladie, et affirme que l'expérimentation animale est "indispensable" car les études in vitro ne peuvent que la compléter. Les bénéfices annoncés se limitent à poser les bases de travaux ultérieurs sur ces mécanismes.

Objectifs

La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une maladie inflammatoire chronique qui affecte principalement les articulations. Dans cette maladie des anticorps pathologiques (appelés " auto-anticorps" car il s'agit d'anticorps reconnaissant des molécules du soi) participent à l’induction et la pérennisation de la maladie. Certaines cellules immunitaires sont activées par ces auto-anticorps pathologiques et, de par ce fait, jouent un rôle dans l’induction de cette pathologie. Cependant les mécanismes impliqués restent méconnus. Notre objectif est donc d’identifier les mécanismes par lesquels différentes cellules immunitaires sont impliquées dans l’induction de l'arthrite suite à l’administration d’autoanticorps pathologiques.

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus poseront les bases pour réaliser par la suite une étude plus appronfondie des mécanismes impliqués dans l’induction de la pathologie par les auto-anticorps et qui sont dépendants des neutrophiles.

Procédures

Les souris seront injectées avec un sérum provoquant le développement de l'arthrite, par injection intra-péritonéale à J0 (début de l’expérience) et J1 (le lendemain). Avant injection, l’épaisseur des pattes postérieures sera mesurée à l’aide d’un pied à coulisse électronique. Chaque souris sera suivie quotidiennement pour évaluer la cinétique et la sévérité de l’arthrite, par mesure de l’épaisseur des pattes (pied à coulisse électronique, non invasif).

Impact sur les animaux

L'induction de l'arthrite provoque un gonflement des articulations des pattes des animaux, dont l'intensité varie d'un animal à l'autre et d'une articulation à l'autre. Du gel de nourriture hydratée est placé dans la cage pour faciliter l'accès à la nourriture des animaux arthritiques.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à différents temps après induction de l'arthrite pour pouvoir prélever différents organes et récupérer les cellules immunitaires d'intérêt dans les différentes phases de la maladie.

Remplacement

Le but du projet est d’identifier les mécanismes immunitaires impliqués dans l’induction de la PR qui sont dépendants des neutrophiles, afin de développer à terme, des nouvelles interventions thérapeutiques pour traiter cette maladie auto-immune. Ceci nécessite un modèle expérimental doté d’un système immunitaire complexe (et complet) et permettant l’étude intégrée de la réponse immunitaire dans un véritable contexte pathologique. Ceci étant difficilement possible chez l'homme, afin de progresser dans cette perspective les expérimentations animales sont indispensables. Des méthodes alternatives (études in vitro) peuvent être complementaires mais ne peuvent pas se substituer à l’utilisation des animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux prévus est basé sur des expériences réalisées précédemment au laboratoire. Grâce à l’expertise de l’équipe dans ce modèle expérimental, nous nous sommes basés sur le paramètre le plus variable pour estimer le nombre d'animaux nécessaire et suffisant. L’utilisation d’un minimum de 5 animaux par lot à chaque expérience est nécessaire car il garantit l’obtention d’un nombre suffisant de cellules immunitaires pour étudier leur rôle. Pour des raisons de reproductibilité et confirmation des résultats obtenus, les expériences doivent être réalisées en triplicat, d’où le nombre de 15 animaux par lot indiqué (3X5).

Raffinement

Les actes techniques réalisés (injections, suivi du gonflement de pattes) sont peu invasifs et conformes aux recommandations des textes de référence. Des mesures destinées à réduire la contrainte des animaux ont été prévues : enrichissement du milieu (carrés de cellulose, cabanes, …), gels de nourriture hydratée placés dans la litière afin de faciliter l’accès à la nourriture et à l’eau. Tout au long des expériences, une observation régulière du bien être des souris sera effectuée. Tout animal présentant un événtuel signe de souffrance sera soigné ou euthanasié. Par ailleurs, nous maîtrisons les gestes expérimentaux et nous surveillerons le site d'injection. Nous avons mis en place des points limites. Notamment, l’arthrite sera évaluée quotidiennement par la mesure de l’épaisseur des pattes postérieures. Si l’épaisseur de pattes suite à l’inflammation induite devient supérieure à 3,5 mm au pic de la maladie (7-8 jours), les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

Les animaux utilisés sont des souris pour lesquels des données scientifiques de la réponse immunitaire sont bien établies et de nombreux outils sont disponibles pour étudier de façon approfondie la réponse immunitaire, ceci avec un recul statistique. Le projet est basé sur l’utilisation d’une souche de souris présentant un système immunitaire complet (C57/Bl6) disponible commercialement. Le choix de cette souche (C57/Bl6) est justifié par leur système immunitaire compétent et pour leur susceptibilité à développer l'arthrite dans notre modèle expérimental. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 10 et 14 semaines) pour que le système immunitaire soit mature et pour permettre une induction de l’arthrite avec une incidence de 100% de façon synchronisée.