Rongeurs

25 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour réduire de 30% une population de neurones, elles subissent des tests comportementaux mesurant le sursaut à un souffle d'air et son inhibition par des sons, avant d'être tuées pour analyse du cerveau. Le porteur affirme qu'aucune intervention ni nuisance n'est attendue, alors que la modification génétique et la mise à mort sont au cœur du protocole. Il indique que le "modèle animal reste indispensable" pour étudier ces neurones à l'échelle de "l'organisme entier".

Objectifs

La partie du cerveau appelée néocortex contrôle la perception sensorielle (les organes des cinq sens), les comportements moteurs et la cognition, et repose sur des circuits neuronaux complexes. Les neurones sont des cellules spécialisées qui vont transmettre l'information à d'autres cellules nerveuses, musculaires ou glandulaires. Le rapport entre l'excitation et l'inhibition de ces neurones est essentiel au fonctionnement des circuits. Son déséquilibre est ainsi lié à l'origine de troubles du développement neurologique, notamment les troubles du spectre autistique ou la schizophrénie. La couche superficielle du néocortex constitue en particulier une entrée principale des circuits neuronaux. Malgré son rôle de plus en plus reconnu, nous n'avons encore qu'une compréhension limitée de la façon dont cette couche superficielle du néocortex s'organise au cours du développement. Des études récentes ont mis en évidence les rôles clés d'une population transitoire de neurones nés précocément dans cette zone, appelés cellules de Cajal-Retzius. Cependant, les rôles précis de ces cellules transitoires dans le développement des circuits neuronaux du néocortex, le comportement des souris et l'intégration multisensorielle restent à élucider.

Bénéfices attendus

Ces expériences nous permettront d'établir une corrélation entre la densité des cellules de Cajal-Retzius et les déficits comportementaux potentiels. Ces résultats seront importants car les mutations génétiques liées à ces cellules chez l'homme ont été associées à des troubles du développement neurologique. Ainsi, ce projet permettra des avancées importantes dans la recherche sur le développement neurologique, avec des applications potentielles dans l'étiologie des troubles du développement neurologique et de la santé mentale.

Procédures

Il n'y aura pas d'intervention sur les animaux dans le cadre de cette étude

Impact sur les animaux

Aucune nuisance ou effet indésirable n'est attendu sur les animaux

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l'issue de la réalisation de l'ensemble des tests.

Remplacement

L’objectif de nos expériences est de définir les rôles des cellules de Cajal-Retzius dans le développement et le fonctionnement du cortex cérébral à l’aide de manipulations génétiques qui réduisent de 30% le nombre de ces cellules. Pour comprendre les rôles de ces neurones particuliers, le modèle animal reste indispensable et nécessaire pour identifier l'effet à l'échelle de l'organisme entier, notamment dans le cadre de l'étude du développement du cortex cérébral, les anomalies de ce développement étant liées à des pathologies comme l'autisme ou la schizophrénie.

Réduction

L’amplitude du sursaut en réaction au souffle d’air et l’inhibition de celui-ci par les stimuli sonores seront comparées entre les souris contrôles et les souris mutantes en utilisant le test t de Student ou le test de Mann-Whitney selon la normalité des données. Afin de garder une analyse statistique fiable et reproductible, chaque groupe expérimental sera constitué de 12 animaux au minimum. Par ailleurs, nous nous attendons à avoir le même phénotype chez les mâles et les femelles, d'où des effectifs d'animaux mutants et contrôles combinant les 2 sexes pour arriver à un effectif total de 12 par génotype, et ainsi éviter de doubler les effectifs.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans les meilleures conditions possibles dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance de l'animal. Après les expériences comportementales, les animaux seront observés pour s'assurer de leur bien-être. Ils seront remis par cagée initiale à la fin des tests. En cas de signe de souffrance, le personnel qualifié et le vétérinaire pourront décider de l'arrêt de l'expérimentation et de l'euthanasie de l'animal.

Choix des espèces

Le modèle souris est très pertinent et est necessaire pour étudier la modification de notre gène d'intêret à l'échelle de l'organisme entier, notamment dans le cadre d'une étude portant sur le développement du cortex cérébral, les anomalies de ce développement étant liées à des pathologies comme l'autisme ou la schizophrénie. De plus, le modèle souris est très étudié et largement utlisé pour des analyses comportementales. Les tests comportementaux seront réalisés sur la souris adulte, à l'age de 9 mois environ.

66 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit un accident vasculaire cérébral provoqué par un caillot, la pose d'un cathéter, des injections répétées et des examens d'imagerie, avant une mise à mort par perfusion intracardiaque, pour étudier l'interaction entre deux traitements de l'AVC. Le porteur affirme n'avoir "pas observé de signe de douleur" lors de projets antérieurs similaires. Il indique que les techniques sans animaux "ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information".

Objectifs

Cette étude vise à comprende les intéraction entre l'activateur tissulaire du plasminogène (tPA) et l'antagoniste du recepteur à l'interleukin-1 (IL-1Ra) sur les dommages cérébraux et l'inflammation lors d'un accident vasculaire cérébral ischémique (AVC). Ce projet est une collaboration avec l'Université de Manchester. L'inflammation cérébrale joue un rôle majeur dans le développement les lésions neurologiques à la suite d’un accident vasculaire cérébral, en particulier, la cytokine pro-inflammatoire IL-1 est un médiateur central des processus inflammatoires lors de la phase aigue d’un AVC. Cette cytokine a été ciblé thérapeutiquement par le développement de la forme recombinante de l’antagoniste du récepteur à l’IL-1, IL-1Ra ou Anakinra. Dans un récent essai clinique de phase 2, IL-1Ra a été démontré comme étant efficace pour limiter l’inflammation. Cependant, une analyse secondaire de ces résultats a permis de découvrir un mécanisme alternatif conduisant une détérioration du devenir clinique des patient. Dans cette étude, IL1Ra été administré en combinaison avec l’Actilyse, une forme recombinant de l’activateur tissulaire du plasminogène qui permet la fibrinolyse et ainsi conduire à une recanalisation artérielle. Ces résultats cliniques nous permettent de suggérer la présence d'une interaction négative entre ces deux traitements. Notre projet vise à comprendre les interactions possibles entre le tPA et IL1Ra dans une étude pré-clinique. L’importance de la reperfusion pour l’efficacité d’IL1Ra va être exploré en utilisant un modèle thrombo-embolique d’AVC chez la souris. Dans ce modèle, la thrombolyse par le tPA est efficace pour détruire les caillots sanguins. La compréhension des interactions entre le tPA et IL1Ra est critique afin de progresser sur de futurs essais cliniques pour IL1Ra.

Bénéfices attendus

L’importance de la reperfusion pour l’efficacité d’IL1Ra va être exploré en utilisant un modèle thrombo-embolique d’AVC chez la souris. Dans ce modèle, la thrombolyse par le tPA est efficace pour détruire les caillots sanguins. Le bénéfice du projet est la compréhension des interactions entre le tPA et IL1Ra est critique afin de progresser sur de futurs essais cliniques pour IL1Ra.

Procédures

Procedure 1: 1) Modèle d’ischémie thromboembolique cérébrale focale (n=66, durée de la procedure :1.5heures) 2) Pose d’un cathéter intraveineux pour injection de tPA (n=66, durée de la procedure :15 minutes) 3) Injection sous-cutanée d'IL-1Ra (6 injections réparties sur 72h, n=66) 4) Evaluation de la perfusion cérébrale par doppler Speckle (n=66, durée de la procedure :15 minutes) 5) Evaluation des lesions cérébrales par Imagerie par Résonnance Magnétique (IRM) (n=66, durée de la procedure :15 minutes) 6) Mise à mort par perfusion intracardique (n=66, sans réveil)

Impact sur les animaux

Afin de limiter toutes douleur occasionnée par la chirurgie, nous utiliserons un analgesique lors du protocol chirurgical. Lors de projets précédents utilisant des procédures identiques ou similaires, nous n’avons pas observés de signe de douleur ni souffrance des animaux à la suite de la chirurgie. Les mesures pour réduire au maximum toute forme d’inconfort et de souffrance sont le suivi strict et rapproché des animaux, l’hébergement en petits groupes sociaux stables (n=5) avec un enrichissement minimum (un rouleau cartonné + une feuille de papier essuie-tout), et la manipulation uniquement par des personnels expérimentés. Les animaux seront maintenus dans des conditions optimales d’hébergement, dans un environnement stabilisé en température (21°), hygrométrie (55%), luminosité (100 lux), et durée du cycle de lumière (12h/12h).

Devenir

A l'issue de la procédure 1, les animaux seront euthanasiés.

Remplacement

Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, et selon nos travaux précédents publiés et la littérature. 66 souris seront nécessaires pour réaliser cette étude, et l’utilisation d’outils d’imagerie non invasive permettant de mesurer les lésions cérébrale et l’inflammation cérébrale permet de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet (nombre d’animaux total : 66) a été évalué via un test d’analyse de puissance (α=0.05 ; β=0.8). Les échantillons sont suffisamment importants pour pouvoir utiliser des tests paramétriques : ANOVA à 2 facteurs sur des données mises sur le rang puis test post-hoc de Dunnett. Nous pourrons utiliser également les tests de Mann-Whitney et de Wilcoxon.

Raffinement

Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards

Choix des espèces

La souris (mus musculus) est l’espèce de référence comme d’inflammation et l’ischémie cérébrale dans la littérature. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier la thrombolyse, la neuroprotection et la réponse inflammatoire suite à un AVC ischémique. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour notre étude. Les souris Swiss utilisées dans cette étude seront âgées de 8-12 semaines correspondant à un stade jeune adulte. Ce stade est classiquement utilisédans la littérature dans l'étude de la neuroinflammation et des AVC.

84 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont inoculées avec une bactérie transmise par les tiques, Rickettsia helvetica, par deux voies et trois doses, puis subissent des prélèvements de sang répétés à la mandibule ou à l'œil, pour évaluer le pouvoir infectieux de ce germe et repérer les organes cibles. Le porteur indique n'attendre "pas de symptômes importants" car la bactérie est rarement isolée chez l'animal ou l'humain, ce qui interroge l'ampleur du recours à l'infection. Il affirme qu'il n'existe "pas de modèle in vitro alternatif" pour tester ce pouvoir infectieux.

Objectifs

Notre projet a pour pour objectif d'évaluer le pouvoir infectieux chez la souris de Rickettsia helvetica, une bactérie très présente chez les tiques et transmise à l'Homme et les animaux (dont la souris), mais pourtant rarement isolée dans le tissu de l'Homme et des animaux. Pour cela deux types de souris seront infectées avec trois doses différentes et deux voies d'injection (sous cutanée et intra péritonéale) afin d'évaluer : - les symptômes (s'il y en a) observables suite à l'infection et les organes infectés par la bactérie - la dose infectieuse minimale nécessaire à l'infection chez la souris - la cinétique de multiplication de cette bactérie dans le sang des souris

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre le cycle épidémiologique de la bactérie Rickettsia helvetica et notamment l'implication potentielle des rongeurs (ici modèle souris) dans ce cycle dans la nature

Procédures

A J0 les animaux seront inoculés avec différentes doses de bactéries selon deux voies d'injection (Intrapéritonéale ou sous cutanée), puis tous les 2 jours entre J4 et J12, ils subiront une prise de 10µl de sang par prélèvement à la mandibule ou à l'oeil (sous anesthésie locale).

Impact sur les animaux

Nous ne connaissons pas le pouvoir pathogène de cette bactérie sur les souris, cependant cette bactérie semble très peu infectieuse chez l'animal et chez l'homme puisqu'il a été jusqu'à présent quasiment impossible de l'isoler d'un animal ou d'un homme. Elle a pour le moment seulement été isolée de tiques prélevées dans la nature. Nous n'attendons donc pas de symptômes importants tels que des paralysies chez les souris, mais nous suivrons les animaux tous les jours afin de contrôler l'apparition de symptômes éventuels.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure (J14) afin de pouvoir détecter la bactérie dans les différents organes et le sang des animaux et donc connaitre les organes cibles qui sont préférentiellement infectés par cette bactérie chez les souris.

Remplacement

La culture des Rickettsia est effectuée en culture in vitro de cellules de mammifères. Cependant, il n'existe pas de modèle in vitro alternatif permettant de tester le pouvoir infectieux de cette bactérie. Le modèle in vivo souris ne peut donc être remplacé dans cette expérimentation.

Réduction

Le nombre de souris utilisé par lot contrôle a été réduit de moitié (3 au lieu de 6) afin de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisé. Les lots de 6 souris pour les lots infectieux sont le minimum d'animaux permettant d'obtenir des résultats scientifiquement robustes.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par lot dans leur conditions classiques avec l’enrichissement nécessaire à leur bien-être (carré de coton, maison en plastique pour les souris).

Choix des espèces

Dans la nature et en laboratoire, les souris (comparativement à d’autres modèles animaux) sont sensibles à l’infection par différentes espèces de Rickettsia. En effet les micromammifères sont souvent impliqués dans les cycles de transmission naturels de ces agents pathogènes. Pour la Rickettsia qui nous intéresse des rongeurs sauvages ont été retrouvés positifs en test PCR mais nous ne connaissons pas leur réelle implication dans le cycle épidémiologique de cette bactérie. Les souris représentent donc le modèle idéal à tester en laboratoire pour palier à ce manque d'information.

186 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des chocs électriques pour induire un état de stress post-traumatique, sont hébergées seules pendant toute la procédure puis reçoivent des stimulations ultrasonores transcrâniennes évaluées par des tests comportementaux, avant une perfusion intracardiaque pour prélever le cerveau. Le porteur reconnaît que l'isolement, reproduit pour coller à un modèle existant, "risque d'induire un stress supplémentaire prolongé", et que ses résultats précédents n'avaient pas reproduit un vrai modèle de stress post-traumatique. Il affirme qu'aucune méthode in vitro n'est disponible, le modèle reposant sur l'observation du comportement de l'animal vivant.

Objectifs

Ce projet a été évalué sous le numéro L'État de Stress Post-Traumatique (ESPT ou PTSD, pour Post-Traumatic Stress Disorder, APA 1994) est une pathologie psychiatrique qui touche 8 à 12% de la population générale qui survient après l'expérience d'un événement traumatique pouvant être létal, causer une blessure grave ou menacer l'intégrité physique. Les bases neuroanatomiques et physiopathologiques sont bien établies. Elles font état d'une altération du système limbique (qui comprend notamment hippocampe et amygdale) avec une suractivation de l'amygdale et une sous-activation du cortex préfrontal. Cet état dysfonctionnel entraîne des troubles cognitifs et émotionnels (notamment un déficit dans l'extinction du conditionnement de peur) caractéristiques des symptômes du PTSD. La symptomatologie du PTSD se définit alors par un syndrome de reviviscence traumatique, un évitement et émoussement affectif et une activation neurovégétative. L’efficacité des thérapies pharmacologiques (antidépresseurs) ou psycho-cognitive utilisée pour le traitement de la pathologie est cependant relative et limitée. L'amélioration de l'arsenal thérapeutique représente donc un enjeu de santé publique majeur. Ces dernières années, les techniques de neurostimulation sont en train d’émerger. Au laboratoire, nous avons mis au point le traitement par Stimulation Transcrânienne Ultrasonore répétée (rTUS) du cortex infralimbique dans le traitement de la dépression. C’est une technique qui offre l’avantage d’être non-invasive. Employé dans le cadre du traitement du PTSD, cette option thérapeutique n'en est qu'à ses prémices. Le but de cette étude porte sur les effets de la rTUS sur la physiopathologie du PTSD et de comparer ces effets à ceux d’un traitement chronique avec un antidépresseur. Avenant : Le premier objectif sera donc d’obtenir un modèle murin de PTSD robuste et montrant différents aspects de la symptomatologie du PTSD. Après obtention du modèle murin de PTSD, l’efficacité thérapeutique de la rTUS sur le comportement des animaux sera évaluée. Les cerveaux seront prélevés pour d’ultérieures études mécanistiques.

Bénéfices attendus

Dans un premier temps, nous allons raffiner le modèle de Trouble de Stress Post-Traumatique. Il est impératif, pour des études sur des maladies psychiatriques en préclinique, d’avoir un modèle robuste reproductible et permettant de représenter différents symptômes de la maladie. Dans un second temps, nous reproduirons des résultats déjà démontré au laboratoire : l’activation neuronale induite par la stimulation ultrasonore. Cette approche à l’avantage d’être non invasive, plus focale et permettant d’aller stimuler des régions plus profondes que d’autres méthodes de neurostimulation. Cependant, cette technique n’a pas encore été testée en tant qu’approche thérapeutique dans un modèle préclinique de PTSD. Notre étude permettrait donc de mettre en évidence l’efficacité de l’activation répétée du cortex infralimbique dans notre modèle. A l’aide des différents tests comportementaux, nous pourront confirmer les effets thérapeutiques à long terme de la stimulation transcrânienne ultrasonore répétée ainsi que l’absence d’effets délétères sur le cerveau lié à la répétition de la stimulation.

Procédures

Dans un premier temps, les animaux seront soumis à des chocs électriques d’intensité modérée et de durée variable puis l’effet de ces chocs sera évalué par des tests comportementaux. Puis avec l'appui ce ces premiers résultats obtenus, nous réaliserons l’étude proprement dite impliquant la génération d’un stress, l’application d’ondes ultrasonores, des tests comportementaux pour évaluer les effets du stress et du traitement par stimulation ultrasonore. L’étude se poursuivra par une analyse immunohistochimique des cerveaux, une perfusion intracardiaque nous permettra de prélever les cerveaux pour tous les animaux.

Impact sur les animaux

Le PTSD est caractérisé selon les critères du DSM-5 par une persistance de différents symptômes envahissants sur une durée de plus d’un mois. Lors de la mise au point du modèle, nous serons donc tenus de montrer la persistance de différents symptômes sur le long terme. Il a de plus été montré à plusieurs reprises, au laboratoire comme dans d’autres études, que la mobilité des souris ayant subis le traumatisme était réduite lors de l’exploration dans différents contexte comparé à des souris n’ayant pas subis de traumatisme et ce plusieurs jours à plusieurs semaines après. De plus le souris montrerons des comportements de peur associé au contexte traumatique encore un mois après le conditionnement. Toutefois, les souris ne devraient pas montrer de perte de poids importante lié à l’induction du PTSD ni des signes de mal-être dans la cage d’hébergement. Enfin le modèle de PTSD a montré son efficacité chez la souris C57BL6N dans plusieurs études ultérieures. Dans ces études, les souris étaient hébergées seules au moins 14 jours avant le début des expérimentations. Nous hébergerons donc les souris en cages isolées afin de reproduire le modèle de PTSD et d’obtenir la même symptomatologie mais ceci risque d’induire un stress supplémentaire prolongé.

Devenir

Les animaux destinée à la mise au point du projet seront euthanasiés soit par injection léthale soit par asphyxie au CO2. Les souris étant isolées pour l’ensemble de la procédure afin de reproduire un modèle de PTSD existant et ayant été validée dans différentes études, il ne sera pas possible de les regrouper à la suite de cette procédure. En effet des souris regroupées après isolement deviennent agressives et tendent à se battre violemment. Les animaux ayant terminé l’expérimentation finale seront ensuite sacrifié pour prélever les cerveaux afin de réaliser l’étude immunohistochimique.

Remplacement

Aucune méthode alternative in vitro n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. Le PTSD chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant.

Réduction

Avenant : Afin de pouvoir étudier les effets d’une stimulation transcrânienne ultrasonore répétée et de se demander si cela peut être utilisée comme traitement contre le syndrome de Stress post-traumatique (PTSD), il est nécessaire d’avoir un modèle animal stable, reproductible et permettant de représenter différents symptômes de la maladie. Nos derniers résultats ont montré une ré-expérience de la peur lors de la réexposition au contexte, phénomène aussi visible lors d’un apprentissage de peur non traumatique, mais n’ont pas permis de reproduire les résultats obtenus dans d’autres études et permettant de parler de modèle de PTSD (l’évitement, la généralisation et sensibilisation de la peur, l’anxiété…). Nous avions pourtant un nombre d’animaux plus important que celui prévu pour les expériences finales. Il nous parait donc nécessaire de refaire des tests préliminaires pour valider le modèle avant de poursuivre l’étude. Nous serions de plus assurés d’avoir un protocole modélisant au mieux le PTSD. Enfin, les effectifs sont optimisés, les observations comportementales nécessitent une taille d’effectifs suffisant compte tenu de la variabilité inter-individuelle (n=15 sujets par groupe). Les souris seront uniquement mâles, afin d’éviter les variations comportementales provoquées par le cycle menstruel de la femelle et ainsi réduire le nombre total d’animaux.

Raffinement

Le stress traumatique appliqué aux animaux, deux chocs électriques de 2sec à 1.5 mA dans un contexte inconnu, peut être qualifié de moyen, en raison de sa brièveté. Les conditions d’élevage des animaux seront optimales au regard des normes en vigueur. Tous les animaux seront hébergés ensemble, stressés et non stressés, avec enrichissement du milieu (cabanes, smarthome® et tubes). Les expérimentateurs sont experts dans la préhension/contention des souris et sont soucieux d’éviter tout stress lors de la réalisation des procédures. Les injections quotidiennes d’antidépresseur ont été remplacées par un traitement dans l’eau de boisson. Pendant la stimulation rTUS, les animaux sont sous anesthésie gazeuse, ils sont placés sur une couverture chauffante pour éviter toute hypothermie et leurs cornées sont protégées de la déshydratation par un gel.

Choix des espèces

Le choix de la souris se justifie par la similarité entre la neurobiologie humaine et celle de la souris, par l’obtention de résultats pertinents avec cette même approche méthodologique ainsi que par l'expérience du laboratoire dans l'évaluation comportementale des rongeurs. En effet, la zone ciblée dans cette étude (cortex infralimbique) existe chez l’Homme (pour ce qui est du cortex moteur) ou alors sont des équivalents fonctionnels de zones existant chez l’Homme (le cortex infralimbique est un équivalent fonctionnel du cortex cingulaire antérieur subgénual BA 25 chez l’Homme). Les souris C57/BL6 seront adultes (âgées de 9 semaines) à J0 de l'expérimentation afin de comparer les effets chez des animaux dont le phénotype comportemental est stabilisé (période neuro-développementale terminée).

240 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une injection intraveineuse d'un conjugué anticorps-médicament puis huit prélèvements de sang sur vingt-et-un jours sous anesthésie, pour mesurer la durée de présence de la molécule anticancéreuse dans le sang. Le porteur indique que les organes seront prélevés après la mise à mort afin d'éviter une seconde expérience de biodistribution. Il justifie le choix du rat plutôt que de la souris par la "nécessité" de prélèvements répétés et par son statut de modèle "obligatoire" pour les études réglementaires.

Objectifs

Les modèles animaux permettent l’étude des effets positifs et négatifs de drogues anticancéreuses à l’échelle de l’organisme. Ces études précliniques sur l’animal permettent la validation de thérapies anticancéreuses plus efficaces et moins toxiques pour le traitement des patients. Les études proposées visent à determiner la durée de présence dans le sang de l'animal (pharmacocinétique) qui est étroitement corrélé avec son activité anti-cancéreuse. L'étude proposée vise à évaluer la pharmacocinétique de conjugués anticorps-médicaments innovant développés pour le traitement de cancers solides ne possédant à ce jour aucun traitement de thérapie ciblée. Connaître ce paramètre pour un composé permet de déterminer sa fenêtre d'efficacité et donc de déterminer la dose à utiliser. L'étude proposée porte sur différents variants d'un conjugué anticorps-médicament dont l'anticorps est validé par la FDA (Food and Drug Administration) et dont le médicament est un dérivé de molécule approuvé par la FDA. Ces conjugués anticorps-médicament sont en développement pre-clinique et l'étude vise à séléctionner le composé possédant le meilleur profile pharmacocinétique afin de le qualifier pour un développement pré-clinique plus poussé dans l'objectif de l'évaluer en clinique.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine, à moyen terme. Ce projet permettra d’étudier l’influence de l’agent masquant sur le profil pharmacocinétique du conjugué anticorps-médicament formulé en fonction de sa taille et de la molécule cytotoxique attachée. Ces études sont essentielles pour la sélection du ou des ADC (antibody-drug conjugate, conjugué anticorps-médicament) ayant la meilleure fenêtre thérapeutique, et de sélectionner le candidat médicament pour les études précliniques réglementaires avant une première administration chez l’homme.

Procédures

- une seule injection de molécule thérapeutique dans la veine caudale. -prélèvement de sang dans la veine saphène. 8 prélèvements au total sur une durée de 21 jours. Les prélèvements sont effectués sur des animaux anesthésiés avec un anesthésie/analgésie adaptée.

Impact sur les animaux

- La dose administrée dans cette étude étant significativement plus faible que la dose maximum tolérée et les traitement étant stables en circulation, pas de nuisance concernant la perte de poids n'est attendue. - Injection unique d’un composé thérapeutique dans la veine caudale (degré de gravité modérée). - Prélèvement sanguins dans la veine saphène (degré de gravité modérée). Les prélèvements se font dans la veine saphène, superficielle, et n’entraîneront pas de difficultés locomotrices. - Douleur caudale si inflammation du point de prélèvement, 2h maximum.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure. L'ensemble des organes seront prélevés et conservés pour des études de biodistribution. En effet, l'étude ci-présente vise à déterminer le profile pharmacocinétique des composés, cependant un même schéma d'étude peut être effectué pour réaliser une étude de biodistribution. Le prélèvement des organes évitera donc de devoir réaliser une expérience similaire.

Remplacement

Cette étude vise à déterminer la durée de présence de nouvelles molécules dans le sang d’un organisme vivant, nécessitant ainsi l’utilisation d’un modèle animal. Des études in vitro ont été faites en amont afin de sélectionner uniquement les molécules ayant le plus grand intérêt thérapeutique pour les études in vivo.

Réduction

Le choix du rat versus la souris permet d’utiliser un nombre plus restreint d’animaux pour pouvoir réaliser des prélèvements sanguins répétés. Nous avons choisi des effectifs permettant une analyse statistique pertinente et une reproductibilité des résultats tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux, à savoir 10 rats par groupes. Dans une démarche de réduction, l'ensemble des organes seront prélevés et congelés pour d'éventuelles analyses de biodistribution.

Raffinement

Avant le début des procédures, les rats seront habitués aux expérimentateurs des études, afin de pouvoir réduire, supprimer ou soulager leur stress et leur détresse. Des points limites adaptés comme une surveillance quotidienne, des pesées régulières, un traitement antalgique, ont été définis pour détecter et minimiser toute souffrance, toute douleur et tout stress des animaux.

Choix des espèces

Le choix du rat pour l'étude pharmacocinétique (PK) s’explique par plusieurs raisons, la nécessité de prélèvements sanguins répétés justifie le choix du Rat par la règle des 3R. Une étude chez la souris nécessiterait de multiplier le nombre d’animaux pour réaliser les prélèvements dans des conditions éthiques. De plus, les prélèvements répétés en 48h peuvent être faits avec une seule piqure initiale, les autres se faisant par prélèvement de la goutte de sang qui se forme lorsque l’on gratte le sang séché. Par ailleurs, le Rat est un des modèles obligatoires pour les études de PK règlementaires, il est donc justifié de réaliser ces études chez le Rat plutôt que la Souris. Pour cette procédure, nous avons besoin d’utiliser des rats de 6 semaines pour avoir un poids idéal de 200g des rats au moment du traitement.

600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules cancéreuses mammaires, puis des traitements par gavage et injections pendant trois semaines et des séances répétées d'imagerie sous anesthésie, pour évaluer un agent de contraste et des immunothérapies ciblant les macrophages tumoraux. Le porteur décrit les examens d'imagerie comme non douloureux mais reconnaît que les animaux porteurs de tumeurs peuvent subir des effets délétères en fin d'étude. Il affirme qu'un modèle in vivo est "nécessaire" car ces processus seraient "trop complexes pour être reproduits artificiellement in vitro".

Objectifs

Au sein des tumeurs, les cellules cancéreuses sont associées à un micro-environnement d'une très grande hétérogénéité inter- et intra-tumorale. Ce micro-environnement, composé de protéines formant une matrice extracellulaire, de cellules endothéliales formant un réseau vasculaire, de cellules fibroblastiques de soutien, et de cellules de l’inflammation. Le microenvironnement tumoral prend une part active dans le développement cancéreux. En particulier, les tumeurs sont infiltrées de macrophages, cellules de l’immunité innée, que la tumeur «reprogramme » afin qu’ils soutiennent sa croissance et l’aident à résister aux traitements. La présence de macrophages tumoraux dans certains cancers, comme le cancer du sein, est le signe de tumeurs agressives et est associée à une plus courte espérance de vie. La possibilité de quantifier la présence des macrophages tumoraux et de visualiser leur répartition par imagerie médicale représenterait donc une avancée majeure pour le diagnostic des tumeurs, et pour le pronostic des prises en charges thérapeutiques. Par ailleurs, certaines molécules chimiques peuvent « transformer » les macrophages pro-tumoraux en macrophages cytotoxiques luttant contre les cellules cancéreuses. Ils représentent ainsi une cible thérapeutique innovante. Au cours de ce projet, nous proposons (1) de mettre en place des modèles murins de cancer du sein, pour (2) évaluer le tilmanocept, un agent de contraste d’imagerie médicale permettant de visualiser les macrophages pro-tumoraux, et (3) évaluer par imagerie non invasive multimodale des thérapies ciblant l’immunité anticancéreuse.

Bénéfices attendus

Le cancer du sein figure toujours en tête des cancers les plus meurtriers chez les femmes, à l’échelle mondiale comme en France. En particulier, les cancers du sein triple négatifs, non hormono-dépendants, généralement diagnostiqués chez les femmes de moins de 40 ans, représentent toujours un défi thérapeutique. Pour y répondre tout en limitant les effets secondaires des traitements, de nouvelles approches thérapeutiques ciblant non seulement les cellules cancéreuses mais aussi leur micro-environnement sont désormais à l’étude. Ce projet permettra de mieux comprendre et d'évaluer une approche d'immunothérapie innovante dans le cadre des cancers du sein. Par ailleurs, le développement d'un agent de contraste d’imagerie nucléaire médicale spécifique des macrophages pro-tumoraux est important pour mieux caractériser les cancers et suivre plus finement les traitements d'immunothérapie. Au delà des cancers, cet agent de contraste d'imagerie pourrait également être utile dans les événements cardiovasculaires, les troubles métaboliques et autres pathologies, où les macrophages jouent également un rôle essentiel dans l'évolution de la maladie.

Procédures

Sauf pour les souris transgéniques PyMT, la mise en place des modèles cancéreux nécessite l'injection de cellules cancéreuses (une unique injection de 100 µL en sous cutané dans le flanc des souris nude et le coussinet adipeux mammaire des souris BalbC). Cette intervention de cinq minutes environ se fera sous anesthésie gazeuse à l'isoflurane. Nous aurons quatre groupes de traitement (contrôle, inhibiteur du CSF1, anti-PD1 et combinaison). Ces molécules sont déjà autorisées en clinique pour d'autres types de tumeurs. L'inhibiteur du CSF1 sera administré par gavage 3 fois par semaine pendant 3 semaines (500 μL pour une souris de 25 g). Le groupe contrôle recevra la solution de dilution (10% de DMSO et 90% d'huile d'olive). L’anticorps anti–PD-1 sera injecté par voie intra-péritonéale 2 fois par semaine pendant 3 semaines (50 μL pour une souris de 25 g). Le groupe contrôle recevra du sérum physiologique. Ces administrations se feront chez l'animal vigile et durent de 1 à 2 minutes. Les procédures d'imagerie (2 fois par semaines pendant 4 semaines) sont réalisées sur animaux anesthésiés. Il s'agit de procédures non invasives et non douleureuses. Les animaux sont anesthésiés (1 à 2h ) uniquement pour ne pas qu'ils ne bougent. Avant l'examen de TEP-TDM-US, soit une fois par semaine pendant 4 semaines les glycémies de tous les animaux seront prises sur les animaux anesthésiés par ponction de la veine caudale. Cette mesure se fait à l'aide d'un glucomètre commercial (Accu-chek Performa) associé à des bandelletes et ne nécessite qu'une gouttelette de sang de quelque microlitres.

Impact sur les animaux

La procédure potentiellement douloureuse de ce projet est l'injection de cellules cancéreuses en sous cutané dans le flanc ou dans le coussinet adipeux mammaire. Elles seront réalisées sous anesthésie générale. Les examens d'imagerie réalisés ensuite sont non invasifs et atraumatiques et impliquent au maximum l'injection d'un agent de contraste utilisé en clinique. L'inhibiteur du CSF1 (pexidartinib) et l'anticorps anti–PD-1 sont autorisés en clinique. Il n'a pas été décrit dans la littérature d'effets secondaires nuisibles chez la souris aux doses et à la durée de traitement retenues dans ce projet. Un contrôle attentif de l'état général des souris sera cependant mis en place. Les animaux inclus dans l'étude seront, par contre, porteurs de tumeurs, ce qui peut amener en fin d'étude à des effets délétaires dûs à la présence des lésions cancéreuses. Les animaux seront donc surveillés avec attention.

Devenir

A la fin de l’étude, au bout de trois semaines de traitement et le lendemain de la dernière acquisition d’imagerie, chaque animal de ce lot sera mis à mort par dislocation cervicale après sédation à l'isoflurane. L'euthanasie des animaux permettra d'éviter toute souffrance inutile à ces animaux porteurs de tumeurs, ainsi que le prélèvement des tumeurs pour valider les suivis par imagerie non invasive avec des analyses ex vivo.

Remplacement

Les systèmes et protocoles d'imagerie ont été optimisés et caractérisés sur des objets physiques de forme, géométrie, composition, etc... connus permettant ainsi de comparer images obtenues et réalité, avant de passer chez l'animal. Ce projet ayant pour but d'étudier le microenvironnement tumoral et les interactions au sein de la tumeur entre les cellules cancéreuses et différents types de cellules de l'inflammation, il est nécessaire d'utiliser un modèle in vivo, ces processus étant trop complexes pour être reproduits artificiellement in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire a été évalué à l'aide du logiciel disponible sur le site MF-Calc de calcul statistique pour l'expérimentation animale de l'Université de Lyon de façon à ce que les résultats obtenus soient suffisant statistiquement pour conclure sur l'efficacité anti-cancéreuse de nos approches thérapeutiques et diagnostisques. La méthode d'imagerie étant non invasive et non douloureuse, les animaux pourront être suivis au cours du temps et les paramètres étudiés seront mesurés plusieurs semaines d'affilée chez le même animal.

Raffinement

Toutes les procédures sur les animaux sont réalisées sous anesthésie générale. Les examens d'imagerie au centre du projet sont non invasifs et atraumatiques et impliquent au maximum l'injection d'un agent de contraste utilisé en clinique. Les animaux seront surveillés tout au long du protocole afin d’observer leur comportement. En cas de signes de souffrance, des traitements analgésiques seront utilisés. En cas d'échec de réduction de la douleur, les procédures seront arrêtées et les animaux euthanasiés.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus utilisé pour les études en cancérologie, et nous permettra de comparer nos résultats à ceux présentés dans la littérature. Les appareils d'imagerie dont nous disposons sont adaptés spécialement à l'étude des rongeurs. Nous utiliserons 3 espèces de souris de façon à obtenir quatre modèles de cancer du sein présentant des caractéristiques génotypiques et phénotypiques différentes. Les souris nude, immunodéficientes pour les lymphocytes T mais possédant des cellules de l’immunité innée et des lymphocytes B fonctionnels nous permettrons l'étude de cellules humaines. Elles permettront d'obtenir un modèle simplifié pour étudier le rôle des macrophages dans la croissance tumorale et notre capacité à suivre l'effet de leur repolarisation par imagerie. Afin de pouvoir étudier également l'interaction des macrophages et des lymphocytes T, le développement d'un modèle immunocompétent, les souris BAlbC allogreffées avec des cellules cancéreuses murines, est nécessaire. Enfin les souris transgéniques PyMT représentent un modèle plus complexe de développement cancéreux. Adulte de 6 semaines car c’est l’âge ou les animaux sont de jeunes adultes ayant atteints la maturité, ce qui permet de s’affranchir des problèmes liés à l’âge. C'est cet âge qui est le plus souvent rapporté dans la littérature pour ce type d'étude, ce qui nous permettra de confronter nos résultats avec ceux d'autres équipes.

264 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit cinq injections intrapéritonéales, subit une incision de 2,5 cm dans le muscle de la patte et un prélèvement de 100 mg créant une perte musculaire d'environ 20%, avant qu'un hydrogel expérimental ne soit déposé dans la plaie. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ne peut se substituer aux animaux et qu'un modèle physiologique est "nécessaire" pour valider la preuve de concept. Les retombées annoncées pour des personnes blessées, militaires et accidentés, restent renvoyées au conditionnel, l'objectif immédiat étant de caractériser les hydrogels sur la cicatrisation.

Objectifs

L’ingénierie tissulaire se base sur l’utilisation de biomatériaux reproduisant la matrice extracellulaire native en fournissant un support aux cellules et à la formation de nouveaux tissus. Les biomatériaux peuvent orienter les phénotypes cellulaires et guider la régénération de tissus fonctionnels à travers des propriétés mécaniques modulables. Ils sont donc de plus en plus étudiés comme nouvelle stratégie de régénération des tissus et organes lésés. Parmi ces biomatériaux, les hydrogels, sont des réseaux tridimensionnels de polymères hydrophiles. Leurs capacités d’hydratation et leurs propriétés mécaniques ajustables en font des biomatériaux attractifs. Si l’utilisation potentielle d’hydrogels comme supports de la régénération musculaire est étudiée de façon croissante, des difficultés persistent en regard de la qualité et fonctionnalité du tissu formé. De fait, peu d’études montrent l’obtention d’un muscle fonctionnel – permettant la contraction – suite à une plaie volumétrique. La régénération du muscle est basée sur la prolifération et la différentiation de cellules souches musculaire qui une fois activées par l’inflammation liée à la création de la plaie, peuvent coloniser la plaie et reconstruire les fibres musculaires endommagées. La bonne cicatrisation repose sur une coordination efficace de tous les acteurs cellulaires impliqués afin de retrouver l’homéostasie du tissu. Les plaies profondes graves entraînant une perte musculaire volumétrique significative provoque donc une altération fonctionnelle permanente et handicapante. Les conséquences pour les personnes affectées (militaires, accidentés, victimes) sont très importantes et il n’existe actuellement aucune solution clinique permettant de restaurer la fonctionnalité des tissus lésés. C’est dans ce contexte que ce projet s’intéresse à la régénération structurelle et fonctionnelle du muscle squelettique en cas de lésion en utilisant des hydrogels injectable et poreux innovants.

Bénéfices attendus

Cette approche permettra d’identifier des biomatériaux à utiliser à des fins biomédicales. Une fois implantés au niveau du tissu musculaire lésé, nous déterminerons si ces hydrogels sont capables de mimer l’environnement cellulaire, améliorant ainsi la réparation fonctionnelle des tissus et organes, en particulier le tissu musculaire.

Procédures

5 injections intrapéritonéales (traitement anti-douleur et anesthésie), sous anesthésie; incision de 2.5 cm dans le muscle qui loge le tibia et prelevement de 100mg de muscle et enfin traiter cette plaie à l'aide des hydrogels à tester.

Impact sur les animaux

La chirurgie d’implantation réalisée pourra entraîner des douleurs localisées au niveau de la zone d’implantation et une plaie volumétrique d’environ 20% pourra potentiellement créer dans un 1er temps (la 1ere semaine) une gêne pour marcher/se déplacer. Les dommages de types lésions musculaires sont souvent accompagnés d’une inflammation passagère.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de pouvoir prélever et analyser la zone d'implantation de l’hydrogel.

Remplacement

Aucune autre méthode alternative ne peut se substituer à l’utilisation d’animaux pour la réalisation de ce projet car la régénération du muscle repose sur des interactions complexes entres les tissus lésés et les systèmes immunitaires et vasculaires ainsi que sur la coordination efficace de multiples types cellulaires. Les preuves de concept in-vitro et ex-vivo de la biocompatibilité des hydrogels pour les cellules musculaires ont déjà été effectuées avec succès. A présent, un modèle physiologique complexe est nécessaire pour permettre d’en définir une première approche qualitative et cinétique.

Réduction

Cette étude est menée dans un but prospectif. Ainsi l’utilisation de 7 rats par groupe et par temps est considérée comme suffisant pour une validation de preuve de concept. Elle constitue en soi une réduction du nombre des animaux pour répondre à la question posée. La présence dans les 2 premiers bras de la procédure d'étapes d'évaluations décisionnelles engageant la poursuite de la procédure, nous permettra aussi de réduire le plus possible le nombre d’animaux.

Raffinement

Avant le début de chaque procédure, les animaux suivront une période d’acclimatation d’au moins une semaine. Les animaux seront observés et pesés quotidiennement pendant 1 semaine suivant la procédure expérimentale. La mise en place d’une grille de score (incluant la mobilité de l’animal, sa prostration ainsi que son niveau d’interaction sociale) et d’une fréquence de surveillance des animaux adaptée à l’étude, permettra d'éviter toute souffrance animale. La surveillance des animaux sera effectuée au moins 4 fois par semaine avec une analyse scorée du comportement animal et du poids corporel deux fois par semaine Une attention particulière sera portée au comportement moteur, l’activité, l’accès à la nourriture et à l’eau et à l’intégrité du pansement. Suite à la procédure de chirurgie, les animaux seront surveillés régulièrement (4 fois par semaine) afin d’identifier l’apparition de troubles du comportement pouvant traduire une douleur ou un stress néfaste. Les fils de suture non résorbables seront retirés au bout de trois semaines tandis que l’intégrité du pansement sera monitorée à chaque observation. Si un animal a retiré son pansement, la plaie sera désinfectée et un nouveau pansement mis en place. Les cages seront enrichies avec de la nourriture humide au cours de la première semaine post-opératoire, pour prendre en compte les difficultés éventuelles de mobilité. Leur ajout sera constamment ré-évalué au cours de la surveillance dans les semaines suivantes. De même, des analgésiques locaux seront appliqués aux abords de la plaie chirurgicale juste avant la suture et en cas de signe de douleur et/ou si le pansement a été retiré (lidocaïne 5mg/kg, 1-2 ml).

Choix des espèces

Etude basée sur un modèle de perte volumétrique musculaire standardisée chez le rat [1]. De plus, pour cette étude, il est nécessaire d’avoir un muscle permettant la mise en place d’un défaut pouvant accueillir un volume d’au moins 100µL pour que le système d’injection soit opérant (tests déjà réalisés sur rats mis à mort pour la standardisation de la procédure). [1]X. Wu, B. T. Corona, X. Chen, and T. J. Walters, “A Standardized Rat Model of Volumetric Muscle Loss Injury for the Development of Tissue Engineering Therapies,” Biores. Open Access, vol. 1, no. 6, pp. 280–290, 2012. L’objectif du travail étant d’observer l’effet de biomatériaux dans les processus de cicatrisation, les rats utilisés dans le cadre de ce protocole seront âgés de 2 mois (Jeunes adultes) en début de protocole. Sexuellement mature pour les males (65-110jours) Sprague Dawley or Wistar (ceux qui sont préconisés pour aspect chirurgicaux). Les temps d’implantations ont été choisis pour caractérisation du tissu à 3 moments clés de la cicatrisation : - 3 semaines : fin de l’inflammation aigue et différentiation des cellules satellites en cours - 6 semaines : possibilité de quantification du nombre de fibres musculaires au sein de l’hydrogel - 3 mois : Validation du bon remodelage de la plaie.

540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit une greffe de cellules tumorales sous la peau, une autre un cancer colorectal chimiquement induit provoquant colite, diarrhée et saignements, pour étudier le rôle du gène Fpr1 dans la réponse à la chimiothérapie. Le porteur prévoit une mise à mort dès qu'une tumeur atteint 225 mm² ou qu'une souris perd plus de 20 % de son poids, et affirme que la réponse immunitaire au cancer ne peut s'étudier qu'in vivo. Les retombées annoncées pour les patients atteints de cancer du sein ou colorectal restent situées en amont de toute application.

Objectifs

Les dernières années ont vu l'émergence du concept de l'activation du système immunitaire contre le cancer, qui à son tour détermine le succès à long terme des traitements anticancéreux. Nous allons étudier comment compenser la perte de fonction du gène Fpr1 pour restaurer l’efficacité de la chimiothérapie in vivo. Les modèles expérimentaux in vivo sont les seuls moyens d’approche possibles car la réponse immunitaire n’a pas lieu dans les modèles in vitro ou ex vivo. Ce projet vise à une compensation des défauts associés à la perte de fonction de FPR1, un facteur pronostique négatif pour la réponse aux traitements anti-cancéreux à base d’anthracyclines et oxaliplatine, afin d’orienter la conception de nouvelles stratégies thérapeutiques chez les patients atteint de cancer du sein ou colorectal.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à une compensation des défauts associés à la perte de fonction de FPR1, un facteur pronostique négatif pour la réponse aux traitements anti-carcéraux à base d’anthracyclines et oxaliplatine, afin d’orienter la conception de nouvelles stratégies thérapeutiques chez les patients atteint de cancer du sein ou colorectal. Nous préconisions que l’accomplissement de ce projet fournira des connaissances sur la régulation de la réponse immunitaire aux cancers pour la mise en place de stratégies thérapeutiques ciblées.

Procédures

Les animaux seront soumis a : - Procédure 1 : L’injection de cellules tumorales en sous cutané sur l’animal anesthésié par inhalation d’isofluorane L’injection des traitements intra péritonéaux par contention de l’animal vigile - Procédure 2 : Un suivi du poids de l’animal vigile à l'aide d'un récipient posé sur une balance L’induction de cancer colorectal par l’injection des traitements intra péritonéaux par contention de l’animal vigile et l’administration d’un traitement dans l’eau de boisson en 3 cycles de 4 jours. Ce modèle aura pour conséquence l’induction d’une colite.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis a : - Une injection sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie - L’injection des traitements cités par voie intrapéritonéale par contention de l’animal vigile. Certains de ces traitements entrainent une altération de l’état de l’animal : perte de poids (inférieure à 20%) ainsi qu’une diarrhée passagère et d’éventuels saignements dans les feces. - Un suivi de la croissance tumorale par contention de l’animal vigile à l'aide d'un pied à coulisse 3 fois par semaine - Un suivi du poids sur l’animal vigile à l'aide d’une balance selon le planning décrit Ces différentes manipulations pouvant entrainer du stress chez l’animal, tout sera mis en œuvre pour le limiter. Notamment, l’injection de cellules tumorales sera faite sous anesthésie sur le dos de l’animal afin de réduire les phénomènes de gêne que peut engendrer la croissance tumorale. Les injections de traitements et le suivi de la croissance tumorale pseront effectuées par contention de l’animal vigile, technique parfaitement maitrisée par les expérimentateurs dans le but de limiter l’exposition des souris à des anesthésiques.

Devenir

Les souris seront euthanasiées dès l’atteinte des points limites suivants : lorsque les tumeurs atteindront 225 mm2, en cas de diarrhée prolongée (>4 jours); en cas de perte de poids supérieure à 20% du poids initial; comportement général anormal (prostration, auto-mutilation, perte de fourrure) ou à la fin de l’expérience 80 jours après l’injection d’AOM, l’euthanasie étant requise pour les analyses post-mortem.

Remplacement

La question scientifique ne peut être abordée qu’in vivo car il n’est pas possible d’étudier l’implication du système immunitaire sur le développement du cancer dans des systèmes in vitro.

Réduction

Nous souhaiterons effectuer cette étude sur un total de 540 souris pour permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Notamment, les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si nous constatons que notre hypothèse n’est pas confirmée par nos résultats expérimentaux. Le modèle choisit est très bien documenté, permettant ainsi de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Nous utiliserons des souris transgéniques viables, fertiles, de taille normale et ne présentent pas d'anomalies physiques ou comportementales. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et/ou tunnels en cartons). Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale. Il assure également une veille scientifique continue, évitant toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques, pratiques et éthiques : - Les souris âgées de 6 à 10 semaines seront utilisées dans cette étude. afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature. Les paramètres étudiés étant le développement de la masse tumorale après injection de cellules cancéreuses ou l’apparition de lésions cancéreuses induites, une souris juvénile ou trop âgée induirait un biais dans l’expérimentation. Les protocoles expérimentaux d’induction tumorale sont bien établis. - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - Nous utilisons principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce.