Rongeurs

2 310 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles servent de support d'entraînement à des gestes techniques, jusqu'à cinq par animal, gavage, injections sous la peau, dans le péritoine ou la veine de la queue, prélèvement derrière l'œil et ponction cardiaque. Le seul objet du projet est de former et d'entretenir les compétences des expérimentateurs, aucune connaissance scientifique n'étant produite. Le porteur affirme réaliser ces gestes "tout en impactant au minimum le bien-être des animaux non-humains", les souris étant tuées après cinq gestes au maximum ou réutilisées pour d'autres séances.

Objectifs

Ce projet a pour objectif d’enseigner et/ou d’entretenir les compétences des expérimentateurs sur différentes techniques d'administration et de prélèvement chez la souris. Celles-ci sont utilisées selon les besoins liés aux divers projets scientifiques.

Bénéfices attendus

Les bénéfices du projet sont doubles puisqu’il permettra de former et de maintenir les compétences et les connaissances des expérimentateurs pour la réalisation de prélèvement sanguin et/ou d’administration de qualité chez la souris, tout en impactant au minimum le bien-être des animaux.

Procédures

Un maximum de 5 administrations/prélèvements (procédures expérimentales 1, 2 et 3 confondues) pourra être réalisé sur un nombre maximum de 2310 animaux. Les 4 gestes techniques suivants seront réalisées sur animaux vigiles : 1. Administration d'un volume maximum de 10 mL/kg d'eau stérile par voie orale, à l'aide d'une sonde de gavage adaptée à la souris ; 2. Administration d'un volume maximal de 20 mL/kg (seringue de 1 mL + aiguille 26G) d’une solution tampon de phosphate salin (PBS) stérile par voie IP, dans le quart inférieur droit ; 3. Administration d'un volume maximal de 10 mL/kg (seringue de 1mL + aiguille 26G), de PBS stérile par voie SC (pli cutané au niveau du dos ou exposition au niveau du flanc) ; 4. Administration d'un volume maximal de 5 mL/kg (seringue 1 mL + aiguille 30G) de PBS stérile par voie IV, dans la veine caudale latérale. La souris sera positionnée dans une boîte de contention adaptée et conçue pour les injections veineuses à la queue. Les 2 gestes techniques suivants seront réalisés sous anesthésie générale (par voie gazeuse à l’isoflurane) associée à un analgésique local (instillation d’1 goutte de Tétracaïne 1% dans l’œil de l’animal) : 1. Administration d'un volume maximal de 5 mL/kg (seringue de 1 mL + aiguille 30G) de PBS stérile par voie IV au niveau du sinus rétro-orbital ; 2. Prélèvement rétro-orbital d'un volume maximal de 100 µL pour une souris de 25 g ou plus (soit V

Impact sur les animaux

Les gestes réalisés sur les animaux, dans les procédures 1 et 2, bien que pouvant être répétés et/ou multiples, sont de gravité légère. Aucune incidence significative sur le bien-être ou l’état général ne devrait être observée. La procédure 3 est menée intégralement sous anesthésie générale au terme de laquelle l’animal ne reprend pas conscience. Celle-ci n'occasionne aux souris aucune douleur, aucun mal ou dommage, ne provoque pas de grande anxiété et ne perturbe pas notablement leur état général.

Devenir

Dans les procédures 1 et 2, les animaux seront sacrifiés après un nombre d’administrations/prélèvements maximum de 5 (toutes procédures confondues) afin de limiter les nuisances sur le bien-être des animaux et éviter tout effet indésirable. Pour les animaux ayant subit un nombre inférieur à 5, ils pourront être réutilisés dans l’une des 3 procédures afin de limiter au maximum le nombre d’animaux entrant en expérimentation. La procédure 3 se déroule intégralement sous anesthésie générale, au terme de laquelle l’animal ne reprend pas conscience. Les animaux sont ainsi sacrifiés sans subir de nuisance ou d’effet indésirables.

Remplacement

L'objectif de ce projet est de maîtriser un certain nombre de techniques d'administration et de prélèvement chez la souris, dans des conditions comparables à celles utilisées dans les projets scientifiques. L'utilisation d'animaux est donc incontournable.

Réduction

Nous sommes dans le cadre d’une formation et aucune statistique ne sera utilisée. Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, ces derniers seront, dans la mesure du possible, des souris de réforme issues des élevages et/ou des animaux réutilisés d’un projet antérieur. Elles pourront être utilisées plusieurs fois dans la limite des volumes maximum recommandés et d’un nombre maximum d’administrations/prélèvements cumulés de 5.

Raffinement

Pendant toute la période précédant la mise en œuvre du projet, les animaux seront hébergés à 2-5 par cage avec un minimum de 2 enrichissements de milieu. En fonction de la procédure, afin de réduire au maximum les nuisances sur le bien-être des animaux, ces derniers pourront être anesthésiés (isoflurane) et/ou analgésiés (buprénorphine en préanesthésie, tétracaïne 1%).

Choix des espèces

La souris étant le modèle d'étude des expérimentateurs de l'animalerie, il est donc pertinent que la formation/maintien des compétences soit réalisé sur cette espèce. Les souris seront utilisées à partir de 7 semaines et jusqu'à une 20aine de semaines en fonction des euthanasies programmées dans l'animalerie (dans le cas de réformes issues des élevages et/ou d’animaux réutilisés d’un projet antérieur).

280 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur crée par chirurgie un défaut osseux dans le fémur, suivi au microscanner toutes les deux semaines pendant deux mois, pour tester le pouvoir de régénération de biomatériaux. Le porteur reconnaît que la chirurgie provoque une douleur et une gêne à la mobilité les premiers jours. Les rats sont tués au dioxyde de carbone à huit semaines pour l'analyse de l'os.

Objectifs

Pour étudier le potentiel ostéogénique du biomatériau, nous souhaiterions avoir recours à un modèle animal déjà développé et maîtrisé au sein de notre unité. Ce modèle est facile à mettre en œuvre et reproductible. Le modèle de défaut osseux diaphysaire est réalisé au niveau du fémur du rat afin de tester le pouvoir ostéogénique des biomatériaux implantés.

Bénéfices attendus

Ce projet permettrait de le développement de nouveaux dispositifs médicaux (matériaux de comblement ou membranes pour la régénération osseuse guidée).

Procédures

Les animaux subiront une chirurgie au niveau du fémur (création d'un défaut). Cette intervention dure environ 30 min par animal. Suite à l'opération, le suivi par micro scanner de la régénération osseuse pour chaque rat sera réalisée à des intervalles de temps espacés (toutes les 2 semaines). Lors de cette procédure, les rats seront anesthésiés à l'isoflurane (maintient au masque). Concernant cette procédure, l'acquisition du microscanner dure environ 15 min. Il est envisagé de réaliser 5 fois cette acquisition sur chaque rat (suivi longitudinal sur 2 mois, avec une acquisition à: T0, 2, 4, 6 et 8 semaines).

Impact sur les animaux

Les animaux subiront une intervention chirurgicale en site orthopédique (défaut unicorticale) et ne nécessitera pas de fixation interne de l'os. Toutefois, la chirurgie engendra une duleur pour les animaux et leur mobilité sera atteinte lors des premiers jours post-opératoires. Une surveillance sera établie afin de pallier à ces inconvénients.

Devenir

Suite à la procédure n°1 (chirurgie), les animaux seront maintenus en vie pour la procédure n°2 (scanner). Lors de la dernière acquisition au scanner (8 semaines), les animaux seront euthanasiés au dioxyde de carbone par le personnel de l'animalerie conventionnelle afin de pouvoir réaliser des analyses histologiques sur ces animaux.

Remplacement

Les produits destinés à être implantés chez l'humain doivent nécessairement être testés chez l'animal avant les essais cliniques. Il n'existe pas de méthode basée sur une approche in vitro permettant d'évaluer ces matériaux. Les matériaux doivent être d'abord testés dans modèle de rat, puis, si les résultats obtenus sont satisfaisants, ils doivent être testés dans modèle chez le gros animal

Réduction

Pour réduire le nombre d'animaux utilisé, un suivi longitudinal par analyse au micro scanner sera réalisé.

Raffinement

Pour réduire l’angoisse : une période d’adaptation d’une semaine sera respectée avant le début des expérimentations. Une cage après l’autre sera amenée à la salle de chirurgie, séparée de la zone d’hébergement des animaux pour éviter toutes sources de stress des animaux opérés et des animaux à opérer. Après la chirurgie, chaque rat se réveille dans une cage à part pour éviter le contact avec des congénères non anesthésiés. Après le réveil complet, la souris reviendra dans sa cage d’origine. Raffinement des conditions d’hébergement : pour enrichissement de l’environnement d’hébergement, que de la litière en copeaux de peupliers et des jouets.

Choix des espèces

Le Rat est une espèce adaptée à la première étape de validation chez l'animal de matériaux destinés au traitement des pertes osseuses. De par sa taille, il permet de réaliser des lésions circulaires de diamètre suffisant au niveau du fémur. Le rat permet ainsi de valider la biocompatibilité, la stabilité dans le temps et l'efficacité thérapeutique du produit. En cas de résultats satisfaisant et supérieur à ce qui est obtenu avec les produits de référence actuellement sur le marché, une validation chez le gros animal sera nécessaire. Des rats Sprague Dawley adultes de 10 semaines, d'un poids d'environ 400 g seront utilisés. En effet les animaux utilisés doivent avoir achevé leur développement et leur croissance.

2 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles passent le test de la barre, qui mesure la catalepsie par l'incapacité de l'animal à quitter une position imposée, pour vérifier qu'un candidat médicament ne provoque pas cet effet indésirable. Le porteur indique que toute souris atteignant un point limite est aussitôt mise à mort, et que les prélèvements sanguins se font par ponction cardiaque ou par décapitation à la guillotine sous anesthésie. Le cerveau est ensuite prélevé pour analyse.

Objectifs

La catalepsie se caractérise par une rigidité musculaire et par une perte des mouvements volontaires. C'est un des effets indésirables que peuvent provoquer certains médicaments psychotropes. L'objectif de ce projet est de vérifier qu'un médicament candidat n'induit pas de catalepsie. Celle-ci est mesurée par le test de la barre. Le principe de ce test repose sur l’incapacité d’un animal à se libérer d’une position imposée par l’expérimentateur. Le temps mis par l’animal pour quitter cette position est alors utilisé pour évaluer l’intensité de la catalepsie. Plus le temps mis par la souris pour revenir à une position « normale » est important et plus la catalepsie est sévère.

Bénéfices attendus

Les antipsychotiques, tel que l’halopéridol, utilisé dans le traitement de la schizophrénie et d’autres troubles psychiques, engendrent des effets secondaires extrapyramidaux tel que la catalepsie. La catalepsie induite par l'halopéridol est due au blocage des récepteurs dopaminergiques et à une réduction de la transmission dopaminergique.C'est pourquoi, la mesure des effets cataleptiques potentiels est importante dans la recherche de nouveaux médicaments antipsychotiques, afin de limiter les effets secondaires de ces derniers.

Procédures

La collecte de sang et le prélèvement de cerveau sont des demandes fréquentes dans les études de recherche préclinique. Ils permettent de réaliser des mesures de paramètres biochimiques. Les différents prélèvements (sang + cerveau) sont effectués à la fin du test comportemental ; juste avant la mise à mort de l’animal. Selon les directives du donneur d’ordre les prélèvements de sang sont réalisés : 1) soit en intracardiaque sous isoflurane pour un prélèvement sanguin compris entre 0.5 ml à 1 ml maximum ; 2) soit par décapitation, sous anesthésie générale, avec une guillotine dans le cas d’une nécessité de prélèvement sanguin important (supérieur à 1 ml). A la suite, du prélèvement sanguin, le cerveau de l’animal est prélevé.

Impact sur les animaux

Au moment du test, l’état général des animaux est également évalué selon notre grille de surveillance. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort. Une grille de score, comprenant les points limites prédictifs, est remplie chaque jour de test et 24h après. Des paramètres supplémentaires ont été rajoutés, ils concernent les effets indésirables potentiels qu’un traitement pourrait provoquer. L’expérimentateur doit alors noter l’intensité de chacun de ces paramètres.

Devenir

A la fin du test de la catalepsie, les animaux seront soumis: 1) à un prélèvement de sang en intracardiaque sous anesthésie générale ou par décapitation, sous anesthésie générale, avec une guillotine dans le cas d'une nécessité de prélèvement sanguin important et 2) à un prélèvement de cerveau.

Remplacement

A ce jour, il n'existe pas de méthodes alternatives permettant d’évaluer les effets cataleptiques potentiels des médicaments. Le recours à l’animal de laboratoire s’avère donc nécessaire.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables. Il correspond généralement à ce qui est classiquement utilisé en expérimentation animale. Les données sont présentées en moyenne ± SEM. La différence entre les groupes est évaluée à l'aide de tests paramétriques : t de Student et de l'analyse de la variance (ANOVA). Une valeur de p < 0,05 est considérée comme statistiquement significative. NB : Les tests paramétriques sont utilisés en première intention car présentant une puissance statistique supérieure aux tests non paramétriques c’est-à-dire permettant la mise en évidence d’une différence avec des effectifs plus faibles. Ces analyses statistiques ont montré qu’un nombre de 10 animaux par groupe est nécessaire pour l’obtention de résultats fiables et reproductibles.

Raffinement

Nous portons une attention particulière au raffinement des conditions d’hébergement (enrichissement du milieu, soin aux animaux) et d’expérimentation (méthode de manipulation, durée du test), afin d’assurer à nos animaux des conditions de vie les meilleures possibles. Les animaux seront pesés et leur état général évalué quotidiennement selon notre grille de surveillance pour détecter des signes éventuels de douleurs. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Les rongeurs sont des modèles simples à élever et leur reproduction est relativement bien contrôlée. Dans ce projet : - Les lignées de souris utilisées sont : C57Bl/6 J (consanguine) et SWISS (non consanguine). - Une lignée de souris transgénique-KO est également utilisée : GPR88-KO (pas de phénotype dommageable) Stade de développement : 6-7 semaines au moment du test (âge adulte). Les produits testés sont destinés à des patients adultes.

3 888 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Maintenues à 85 % de leur poids par restriction alimentaire et isolées en cage individuelle, elles passent un test d'impulsivité dans un labyrinthe en T, avec administration de candidats médicaments par gavage, pour modéliser un trouble de l'attention avec hyperactivité. Le porteur indique que toute souris atteignant un point limite est mise à mort immédiatement, et que les prélèvements de sang se font par ponction cardiaque ou par décapitation à la guillotine sous anesthésie. Il précise qu'aucun traitement curatif du trouble n'existe à ce jour.

Objectifs

Le trouble d'hyperactivité avec déficit de l'attention (TDAH) est un trouble complexe du développement cérébral caractérisé par l'hyperactivité/l'impulsivité et l'inattention. Les médicaments les plus couramment prescrits pour le traitement du TDAH modulent les systèmes dopaminergiques et noradrénergique. Deux grandes classes pharmacologiques de médicaments sont utilisées : les psychostimulants (ex : Méthylphénidate, d-amphétamine) et les inhibiteurs non stimulants du recaptage de la noradrénaline (ex : Atomoxétine) Dans ce projet, seul un des symptômes centraux du TDAH sera étudié : l'impulsivité. Le test du labyrinthe en T, qui sollicite la capacité à attendre, permet d’étudier l’impulsivité (incapacité à attendre) et de mesurer les effets d’agents pharmacologiques sur ce comportement. Il permet de mettre en évidence des améliorations de l’impulsivité par des traitements destinés au TDAH. Ce test constitue donc un modèle préclinique pour l’étude de substances destinées au traitement du TDAH. L’objectif de ce projet sera dans un premier temps la mise en place de ce modèle chez la souris puis d’étudier une potentielle efficacité de plusieurs candidats médicaments sur l’impulsivité.

Bénéfices attendus

A ce jour, il n’existe aucun traitement curatif, seul des médicaments modulant les transmissions aminergiques tels que les psychostimulants (ex : Méthylphénidate, d-amphétamine) et non psychostimulants (ex : Atomoxétine) sont utilisés actuellement comme pharmacothérapies. Ces médicaments augmentent les transmissions dopaminergiques et noradrénergiques; ces systèmes de neurotransmission sont les cibles privilégiées dans la recherche de nouveaux traitements. Ce modèle animal est donc un outil précieux pour étudier les mécanismes comportementaux du TDAH et pour étudier une potentielle efficacité de plusieurs candidats médicaments sur l’impulsivité.

Procédures

La collecte de sang et le prélèvement de cerveau sont des demandes fréquentes dans les études de recherche préclinique. Ils permettent de réaliser des mesures de paramètres biochimiques. Les différents prélèvements (sang + cerveau) sont effectués à la fin du test comportemental ; juste avant la mise à mort de l’animal. Selon les directives du donneur d’ordre les prélèvements de sang sont réalisés : 1) soit en intracardiaque, sous anesthésie générale, pour un prélèvement sanguin compris entre 0.5 ml à 1 ml maximum ; 2) soit par décapitation, sous anesthésie générale, avec une guillotine dans le cas d’une nécessité de prélèvement sanguin important (supérieur à 1 ml). A la suite, du prélèvement sanguin, le cerveau de l’animal est prélevé.

Impact sur les animaux

1- Le régime alimentaire et la mise en cage individuelle : Dans ce modèle, les animaux seront soumis à une restriction alimentaire tout au long de l’expérience afin que leur poids corporel soit maintenu à environ 85 % de leur poids corporel en alimentation libre. Cette restriction alimentaire est nécessaire pour maintenir un niveau de motivation constant tout au long de l'expérience. Ainsi, pour éviter tout risque d’agressivité des souris les unes envers les autres et pour contrôler l’évolution de leur poids; lors de leur arrivée, les souris sont placées en cage individuelle dans un environnement régulé (température, 22±1°C, cycle lumière/obscurité de 12:12 heures, lumière allumée à 7 heures) avec de l'eau en libre accès. Durant la période d’acclimatation qui dure entre 6 et 10 jours, les animaux sont manipulés tous les jours afin de limiter le stress dû à l’isolement. Par ailleurs, les animaux sont pesés chaque jour pour suivre l’évolution de leur poids et leur état sanitaire est évalué quotidiennement selon notre grille de surveillance. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l’expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort. 2- Administrations : Les administrations sont réalisées une seule fois par jour avant le test et chaque jour de test à partir de la « phase de test ». Le mode et le nombre d’administrations des solutions sont déterminés en fonction des caractéristiques pharmacologiques des produits. La voie orale (gavage) est généralement privilégiée pour administrer le ou les produits étudiés parce que c’est celle qui sera prescrite chez l’homme. Le cas échéant (produit destiné à être administré par d’autres voies chez l’homme, ou biodisponibilité nécessitant un autre mode d’administration) les voies intrapéritonéales, sous cutanée, intraveineuse ou intranasale peuvent être choisies. L’administration de nouveaux candidats médicaments peut entraîner certains effets indésirables tels que les crampes abdominales ou la sédation qui peuvent apparaître après administration. Ainsi pour vérifier une éventuelle toxicité et en limiter les risques, les animaux sont suivis après injection. L’état général des animaux est évalué selon notre grille de surveillance pour détecter des signes éventuels de douleurs. De ce fait, si un animal atteint, à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.

Devenir

Pour des mesures de paramètres biochimiques, les animaux seront soumis à la fin du test comportemental à un prélèvement de sang et de cerveau.

Remplacement

A ce jour, il n’existe pas de méthodes alternatives pour évaluer TDAH. Le recours à l’animal de laboratoire s’avère donc nécessaire.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables. Il correspond généralement à ce qui est classiquement utilisé en expérimentation animale. Les données sont présentées en moyenne ± SEM. La différence entre les groupes est évaluée à l'aide de tests paramétriques : t de Student et de l'analyse de la variance (ANOVA). Une valeur de p ≤ 0,05 est considérée comme statistiquement significative. NB : Les tests paramétriques sont utilisés en première intention car présentant une puissance statistique supérieure aux tests non paramétriques c’est-à-dire permettant la mise en évidence d’une différence avec des effectifs plus faibles.

Raffinement

Nous portons une attention particulière au raffinement des conditions d’hébergement (enrichissement du milieu, soin aux animaux) et d’expérimentation (méthode de manipulation, durée du test), afin d’assurer à nos animaux des conditions de vie les meilleures possibles. Les animaux seront pesés et leur état général quotidiennement évalué selon notre grille de surveillance pour détecter des signes éventuels de douleurs. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Le répertoire comportemental des souris correspond aux domaines de recherche abordés, contrairement à des espèces présentant un système nerveux central moins développé. De plus, les rongeurs sont des modèles simples à élever et leur reproduction est relativement bien contrôlée. Dans le cas de ce projet, la proximité clinique entre le modèle de souris et la maladie humaine fait de celui-ci le modèle le plus fiable pour étudier l’effet des traitements sur cette maladie dans toute sa complexité. Les lignées utilisées sont : la souris C57Bl/6J, BTBR 3-7 semaines au moment du test. Etant donné que le TDAH affecte principalement les enfants/adolescents, il est pertinent d’étudier les psychostimulants/molécules candidats sur des animaux juvéniles.

1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une modification génétique, elles sont soumises à des tests comportementaux d'anxiété, de dépression et d'activité motrice, dont le test de la nage forcée où l'animal est placé dans un bécher d'eau. Le porteur indique que si une souris met la tête sous l'eau elle est aussitôt retirée, et qu'une souris atteignant un point limite est mise à mort immédiatement. Le projet cherche des effets comportementaux d'une modification génétique dont ce n'était pas la cible, le cerveau des souris étant prélevé en fin d'étude.

Objectifs

L'objectif du projet est d'étudier les changements comportementaux induits par une modification génétique sur l’anxiété, la dépression et l’activité motrice des animaux.

Bénéfices attendus

Ce projet permet de mettre en évidence des déficits ou améliorations comportementales suite à une modification génétique dans le domaine de l’anxiété, de la dépression et de l’activité motrice des animaux. Certaines modifications génétiques qui n’ont à l’origine pas ces cibles (ici : anxiété, dépression et activité locomotrice) peuvent quand même avoir des effets. Il est donc nécessaire d’étudier ces effets pour aider à la compréhension de mécanismes cellulaires et/ou neuronaux encore méconnus.

Procédures

A la fin de l’étude, juste avant la mise à mort, le cerveau de l’animal est prélevé. Cette procédure est réalisée sous anesthésie générale et elle dure en moyenne 15 minutes (dans sa totalité). Le prélèvement de cerveau est une demande fréquente dans les études de recherche préclinique. Cela permet de réaliser des mesures de paramètres biochimiques.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, il s'agit d'étudier les potentiels changements comportementaux induits par une modification génétique sur l’anxiété, la dépression et l’activité motrice des animaux. Les animaux reçoivent aucune administartion. Ils sont manipulés et pesés au moment des différents tests comportementaux. Au cours de l'étude, l’état général des animaux est quotidiennement évalué selon notre grille de surveillance. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort. Durant le test de la nage forcée, si la souris met la tête sous l’eau, elle est immédiatement retirée du bécher et placée dans une cage contenant un linge pendant 10 minutes pour retourner ensuite dans sa cage d’origine.

Devenir

Pour des mesures de paramètres biochimiques, les animaux seront soumis à la fin de l'étude à un prélèvement de cerveau, sous anesthésie générale.

Remplacement

A ce jour, il n’existe pas de méthode alternative permettant d’évaluer une modification du niveau d’anxiété, de dépression ou de déficit moteur, le recours à l’animal de laboratoire s’avère donc nécessaire.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables. Il correspond généralement à ce qui est classiquement utilisé en expérimentation animale. Les données sont présentées en moyenne ± SEM. La différence entre les groupes est évaluée à l'aide de tests paramétriques : t de Student et de l'analyse de la variance (ANOVA). Une valeur de p ≤ 0,05 est considérée comme statistiquement significative. NB : Les tests paramétriques sont utilisés en première intention car présentant une puissance statistique supérieure aux tests non paramétriques c’est-à-dire permettant la mise en évidence d’une différence avec des effectifs plus faibles. Ces analyses statistiques ont montré qu’un nombre de 12 animaux par groupe est nécessaire pour l’obtention de résultats fiables et reproductibles.

Raffinement

Nous portons une attention particulière au raffinement des conditions d’hébergement (enrichissement du milieu, soin aux animaux) et d’expérimentation (méthode de manipulation, durée du test), afin d’assurer à nos animaux des conditions de vie les meilleures possibles. Les animaux seront pesés et leur état général quotidiennement évalué selon notre grille de surveillance pour détecter des signes éventuels de douleurs. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Le répertoire comportemental des souris correspond aux domaines de recherche abordés, contrairement à des espèces présentant un système nerveux central moins développé. De plus, les rongeurs sont des modèles simples à élever et leur reproduction est relativement bien contrôlée. Dans le cas de ce projet, la proximité clinique entre le modèle de souris et la maladie humaine fait de celui-ci le modèle le plus fiable pour étudier l’effet des traitements sur cette maladie dans toute sa complexité. Les lignées utilisées dans ce projet sont : IP3R1 (fl/fl) et C57BL6/J Entre 7 et 15 semaines au moment des tests. Le Sponsor souhaite comparer certains résultats obtenus précédemment sur ces animaux à ceux obtenus dans ce projet.

64 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur pose quatre biomatériaux sous la peau par chirurgie, avec un suivi au microscanner toutes les deux semaines pendant deux mois, pour tester un nouveau support destiné à la régénération osseuse. Le porteur n'attend comme seul effet indésirable qu'une réaction inflammatoire qu'il juge "peu probable". Le résumé décrit le réveil des rats après l'opération sans indiquer leur sort final, que le tableau du RNT classe pourtant comme une mise à mort, cohérente avec l'analyse des implants.

Objectifs

La consolidation des pertes de substance osseuses lors des reconstructions osseuses représente un problème majeur dans les domaines de la chirurgie orthopédique, de la traumatologie et de la chirurgie maxillo-faciale. Ces troubles peuvent nécessiter l’utilisation d’une greffe osseuse afin d'obtenir une consolidation osseuse. Bien que la greffe osseuse soit toujours considérée comme la référence pour les reconstructions osseuses, elle est associée à un taux important de complication au niveau du site de prelevement de la greffe. En outre, les quantités d'os disponibles pour un seul patient sont limitées. Par conséquent, les substituts osseux ayant une composition aussi proche que possible de celle de l'os natif offrent des alternatives intéressantes. Parmi eux, l'allogreffe ainsi que les céramiques représentent les substituts osseux les plus utilisés. Outre la greffe osseuse ou les substituts osseux, l'un des moyens les plus efficaces pour améliorer la formation et la reconstruction osseuses est la thérapie protéique, qui consiste en l'application locale de facteurs de croissance favorisant la production osseuse, tels que les protéines morphogéniques osseuses (BMP). Actuellement, la BMP-2 et la BMP-7 sont utilisées en pratique clinique et ont donné des résultats prometteurs. Ces BMP ont besoin d’un support afin d’être déposé sur le site chirurgical. Les supports utilisés aujourd’hui sont des éponges ou des pâtes de collagène. Néanmoins, la BMP a une faible faible affinité pour le collagène, ce qui nécessite des doses très importantes de BMP entrainant un risque de complication plus important et un coût beaucoup plus élevés. Dès lors, afin d'augmenter les applications cliniques de la BMP, il est indispensable de disposer de différents types de supports présentant une forte affinité pour le BMP. Le but de cette étude, est l’étude d’un nouveau support pour la BMP.

Bénéfices attendus

Cette étude va permettre de montrer que le film réticulé avec et sans BMP2 est biocompatible et n'est pas à l'origine de phénomènes locaux ou systémiques néfastes pour la santé du receveur et d'autre part que les tissus du receveur ne sont pas susceptibles d'altérer le matériau au détriment de ses qualités intrinsèques ou au risque de générer des produits de dégradation toxiques. Cette étude servira donc à prouver l'absence vraisemblable d'effet délétère du film et de la BMP2, et d'autre part, accumuler des données prédictives du comportement in vivo du matériau.

Procédures

1 seule procédure sera réalisée sur les 64 rats : - Mise en place de 4 implants en sous cutanés (4 incisions). Fermeture de la plaie à l’aide d’un surjet intradermique avec un monofilament 4-0 (polyglecaprone 25). L’intervention durera 15 minutes.

Impact sur les animaux

Les seules nuisances ou effets indésirables de cette étude sur les animaux seraient une réaction inflammatoire anormale ce qui semble peu probable au vu des tests préalables.

Devenir

A l’issue de l’intervention chirurgicale d’implantation, les rats seront reveillés dans une cage à induction chauffée et seront ensuite remis avec ses congénères une fois réveillé.

Remplacement

De nombreux modèles in vitro ont été mis en place pour étudier la dégradation d’un matériel. Cependant, les interactions matériel-hôtes sont importantes et nécessitent une étude in vivo. Les données manquantes sur les propriétés anti-inflammatoires, sur la biocompatibilité et la dégradation de matériel ne peuvent être menées que sur l’animal entier vivant : la réaction inflammatoire et hémodynamique sont des processus vivants et dynamiques, mettant en jeu des mécanismes complexes qui ne peuvent être reproduits in vitro. Lorsque les mécanismes biologiques entrent en jeu dans le processus inflammatoire de dégradation, on ne peut vérifier la biocompatibilité que dans un organisme vivant.

Réduction

Des études in vitro ont été menée au préalable afin de sélectionner les formulations d’implants les plus intéressantes à tester in vivo pour réduire au maximum le nombre de tests et le nombre d’animaux. De plus des études bibliographiques ont été menées afin de choisir au mieux le modèle animal et le matériaux contrôles. Afin de réduire le nombre d’animaux, les mêmes animaux seront utilisés pour l’étude de biocompatibilité et l’étude de biodégradation du film.

Raffinement

64 rats seront inclus dans l’étude. Tout le projet sera conduit dans des locaux agrées, avec du personnel dédié et expérimenté. Un protocole précis de prémédication, d’analgésie, d’anesthésie est mis en place. Les rats auront une période d’acclimatation d’au moins une semaine avant l’implantation. Ils seront hébergés dans une animalerie conventionnée, avec eau et alimentation ad libitum, dans des conditions de température et d’hygrométrie contrôlées, avec un cycle jour/nuit de 12h. L’injection d’hydrogel sera réalisé sous anesthésie générale avec analgésie préopératoire et post-opératoire par un vétérinaire. Les animaux seront observés quotidiennement : état général, alimentation, abreuvement, nettoyage, respiration, morbidité et mortalité. En cas d’animal considéré comme anormal, la personne en charge des observations : -manipulera l’animal pour confirmer ou infirmer cet état -Toutes anomalies cliniques seront signalées au vétérinaire pour un examen clinique complet si nécessaire. La douleur et le bien-être sont évalués selon des paramètres précis. En cas de signe de douleur importante, des antalgiques seront administrés jusqu’à disparition des signes. Si une souffrance et/ou une détresse de l’animal est mise en évidence, des mesures seront directement mise en place : fin de la procédure, traitement afin de soulager la souffrance. Les animaux seront hébergés en cage collective, dans un milieu enrichi avec des maisonnettes, de la paille, du coton et des bois à ronger. Différents enrichissements seront proposés en alternance pour introduire de la nouveauté.

Choix des espèces

Le rat est un modèle couramment utilisé pour évaluer l'inflammation et pour étudier le délai de dégradation et l'effet de différentes modalités de traitement. L’évaluation de la dégradation au contact du tissu hôte est primordial dans l’étude des biomatériaux. Cette évaluation a été traditionnellement réalisée dans des modèles d'implantations sous-cutanées, intrapéritonéales et intramusculaires chez les rongeurs (souris et rats). Les modèles murins sous-cutanés, intramusculaires et intrapéritonéaux sont des outils utiles pour évaluer l'effet des médiateurs anti-inflammatoires et inflammatoires. Quelle que soit l'application finale prévue des biomatériaux, les modèles d'implantation sous-cutanée et intramusculaire offrent des informations sur l'effet direct du biomatériau au niveau du site d'implantation. L'application clinique finale étant une implantation osseuse, l'implantation sous cutanée est choisie. Les implants seront insérés dans le tissu sous cutané de rats adultes, conformément aux dispositions de la norme ISO 10993-2. Pour plusieurs de ces raisons, nous avons choisi d'utiliser des rats comme modèle pour réaliser l'étude de dégradation et de biocompatibilité du film enrichi en BMP-2.

1 425 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur greffe des lignées de cellules cancéreuses puis on leur injecte deux fois par semaine des anticorps, des inhibiteurs immunitaires ou des chimiothérapies, pour tester une thérapie ciblée contre les cancers de la cavité orale. Le porteur indique que le développement tumoral altère la prise alimentaire des animaux. Il revendique un "avantage éthique" à faire pousser les tumeurs sous la peau plutôt que dans la bouche, ce qui facilite le suivi, toutes les souris étant tuées en fin d'expérience.

Objectifs

Les cancers de la cavité orale et du pharynx sont un problème de santé publique puisqu'ils se situent au 5eme rang les cancers les plus fréquents chez l'homme avec 20000 nouveaux cas pour l'année 2018 en France. Les principaux facteurs de risque sont le tabac et l'alcool. Le cancer de la cavité orale peut se développer à partir de lésions orales pre-malignes dont la plus fréquente est la leucoplasie orale. Cependant, nous n’avons pas aujourd’hui assez de connaissances pour prédire quelles lésions vont se transformer en cancer et nous ne disposons pas de traitement pour prévenir/empêcher cette transformation cancéreuse. L'objectif notre projet est d’étudier l’effet d’une thérapie ciblée seule ou en association avec des inhibiteurs de point de contrôle sur le développement des cancers de la cavité orale dans des modèles murins. Ceprojet se déroulera selon quatre procédures.

Bénéfices attendus

Les travaux présentés dans ce projet permettront une meilleure compréhension du fonctionnement d’un candidat médicament anctuellement en essai clinique. Ils permettront également de mieux définir le profil des patients éligibles au traitement et susceptibles d’y répondre. Les modèles générés à partir des différentes lignées cellulaires seront également à la disposition de la communauté scientifique. Même s’ils sont complémentaires du modèle originel 4-NQO (évaluation de l’initiation tumorale et de la progression vs croissance tumorale), Ils présentent un avantage éthique par la possibilité de réaliser certains tests in vitro préalables à des investigations chez l’animal et les tumeurs se développent de manière visible en sous-cutané (non dans la cavité buccale), ce qui permet un meilleur suivi des affections potentielles des animaux.

Procédures

Injections intrapéritonéales d'anticorps ciblés (2 injections par semaine sur toute la durée du suivi tumoral) et/ou inhibiteurs de point de contrôle (selon 3 injections espacées de 4 jours) ou Chimiothérapies (une injection par semaine sur toute la durée du suivi tumoral). Injection sous-cutannées de lignées cellulaires (une seule fois). Toutes les injections sont réalisées dans un volume de 100μL qsp. PBS.

Impact sur les animaux

Altération de la prise alimentaire due au développement tumoral dans la cavité bucale.

Devenir

Tous les animaux sont porteurs de tumeurs, ils seront donc mis à mort en fin de procédure expérimentale.

Remplacement

Le modèle 4-NQO est un modèle intégré qui récapitule les phases précoces du développement cancéreux. La présence de tous les acteurs micro-environnementaux est nécessaire à la compréhension des mécanismes biologiques qui impliquent notre cible thérapeutique dans la procédure 1. Il n'existe pas de modèles d'étude in silico ou in vitro permettant l'évaluation de l'efficacité des inhibiteurs de point de contrôle car ils nécessitent la présence d'un système immunitaire fonctionnel (procédure 3). Des expériences in vitro seront menées sur les lignées générées en procédure 2 pour déterminer la sensibilité des cellules aux agents de chimio thérapie. Ces résultats conditionneront le maintien ou non des bras de traitement avec ces agents dans la procédure 4 et peuvent conduire à une réduction.

Réduction

Nous avons calculé le nombre minimal de souris à inclure, en prenant en compte notre expérience, les études déjà publiées utilisant ce modèle ainsi que pour de disposer de suffisamment de matériel biologique pour rendre nos résultats interprétables. Pour la procédure 1) D'après notre expérience (75% de tumeur semaine S32), nos objectifs (réduction 30% tumeurs observées avec le traitement), le nombre de souris nécessaires est 30/groupe. Procédure 2) Un nombre de 5 souris est suffisant pour évaluer la prise de greffe des différentes lignées cellulaires. Pour les procédures 3 et 4) D'après notre expérience la variabilité des modèles de greffes syngéniques traitées avec ces composés ne permet pas de voir l'effet de ces drogues seules ou en combinaison au-dessous d'un effectif de 12 souris. Compte tenu des aléas de prise tumorales combinés au fait que nous ne connaissons pas encore l'efficacité de prise de ces modèles, nous envisageons des groupes de 15 souris. Une réduction a été opérée dans la procédure 3 en mutualisant les bras contrôle pour plusieurs lignes de traitement. Une réduction sera opérée dans la procédure 2 sur la base des réponses aux chimiothérapies observées in vitro.

Raffinement

Tout au long de notre expérience, le suivi rigoureux des animaux permettra la recherche de tout signe de souffrance. Dans la procédure 1, les tumeurs se développant dans la cavité buccale, nous prêterons un soin particulier à la prise alimentaire des animaux. Le poids des animaux sera évalué 2 fois par semaine. En cas de perte de poids, des aliments liquides/semi-solides seront mis à disposition dans les cages. En cas de signe de morbidité trop importante, ceci conduira à l'arrêt anticipe de la procédure. Dans les procédures 2 à 4, le volume tumoral sera évalué 2 à 3 fois par semaine avec un pied à coulisse. Le poids des animaux sera évalué 1 fois par semaine. Pour l’ensemble des procédures, les signes de souffrance (prostration, propreté, cachexie, isolement social) seront sur veillés à chaque mesure tumorale ou pesée soit 2 à 3 fois par semaine plus les visites de l’animalerie pour le change et les surveillances de week-end.

Choix des espèces

Certaines de ces molécules sont des anticorps dirigés contre les molécules de souris. Par conséquent, les modèles de souris immunocompétentes tels que les souris C57b6 sont nécessaires à la réalisation de cette étude. Le modèle de carcinogenèse par 4-NQO est un modèle immunocompétent établi dans la littérature et représentatif des conditions humaines (similitudes de mécanismes physiopathologiques et moléculaires), et est le plus utilise pour tester des agents thérapeutiques de chimio prévention. Il a récemment été utilisé pour tester l’effet d'une immunothérapie sur la prévention de progression maligne des lésions prémalignes. Nous l’avons également déjà utilisé dans le cadre d’une précédente étude. Par ailleurs, dans les conditions du projet, il s’agit d’une espèce de laboratoire usuelle et dont le génome a été complètement séquencé. Les expérimentations seront effectuées sur des souris adultes (âge supérieur à 7 semaines) conformément au modèle établi.