Rongeurs
Étude de la pathogénicité rénale des anticorps anti-contactine 1 chez le Hamster
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
52 hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections répétées d'anticorps humains anti-contactine 1, des prélèvements de sang et d'urine et un isolement de quatre heures pour la collecte d'urine, avant prélèvement des reins et des nerfs, pour reproduire une maladie rénale auto-immune. Le porteur indique que les injections peuvent déclencher une atteinte rénale ou neurologique mimant la maladie humaine. Il justifie le choix du hamster par le fait qu'il exprime la contactine dans le rein, à la différence des souris, rats, lapins et cobayes testés, et qu'il est plus facile à élever que le porc.
Objectifs
La polyneuropathie démyélinisante chronique (PIDC) est une maladie auto-immune du système nerveux. Plusieurs cibles de ces anticorps dirigés contre soi ont été découvertes, parmi lesquelles des protéines présentes sur les neurones comme la contactine 1. La survenue concomitante chez certains patients d’une PIDC et d'une maladie auto-immune du rein (GEM : glomérulopathie extramembraneuse), dont l’évolution clinique est variable et peut aller jusqu’à la perte totale de la fonction rénale, est connue de longue date. Ces deux maladies concomitantes ont souvent été décrites mais leur lien n'a jamais été établi dans la bibliographie. Ainsi, la contactine 1 a été identifiée dans des petits amas de vaisseaux sanguins participant à la filtration rénale, puis la présence simultanée des anticorps anti-contactine dans le nerf et dans le rein a été mise en évidence. L’objectif principal de ce projet est de confirmer dans un modèle hamster l'implication des anticorps anti-contactine 1 dans cette maladie rénale via la reproduction de la maladie chez le Hamster mais aussi, à analyser les dysfonctionnements aux niveaux clinique et tissulaire provoqués par les anticorps anti-contactine humains afin de mieux connaitre cette maladie pour pouvoir ensuite adapter le diagnostic et les traitements de cette maladie chez l'homme.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de confirmer l'implication des anticorps anti-contactine et leur lien avec le développement d’une atteinte rénale induisant des modifications biochimiques et histologiques. Ce travail de recherche ouvrira de nouvelles perspectives thérapeutiques dans la prise en charge de la glomérulopathie extramembraneuse ainsi que dans le développement de tests de dépistage et d’évaluation de la maladie si le rôle pathogène des anticorps est confirmé et si leur concentration a une valeur pronostique.
Procédures
Les animaux seront impliqués dans deux procédures distinctes de sévérité modérée qui se dérouleront en plusieurs étapes et sur une durée de 11 jours pour la première procédure et 11 semaines pour la seconde. Concernant la première procédure, une injection d'anticorps dans la circulation sanguine des animaux aura lieu au tout début de l'expérimentation. Des prélèvements sanguin et urinaire auront lieu 3 fois sur la durée des 11 jours d'expérimentation afin de suivre la fonction rénale des animaux. Concernant la seconde procédure, 4 injections d'anticorps sont prévu sur une durée totale d'expérimentation de 11 semaines. Des prélèvements sanguins et urinaires seront réalisés en moyenne deux fois par semaine. Pour les prélèvement urinaires, les animaux seront isolés en moyenne deux fois par semaines pendant 4 heures afin de prélever leurs urines, cela pouvant provoquer du stress et de l'angoisse chez les animaux. Les animaux seront systématiquement anesthésiés avant chaque intervention afin de diminuer leur angoisse et leurs stress. Les injections et prélèvements réalisés ne dureront pas plus de 10 min. Au bout des 11 jours pour la première procédure ou 11 semaines pour la seconde, ou si les animaux montrent des signes de souffrance, les reins et nerfs seront prélevés dans le but d'étudier l'impact que les anticorps ont eu sur les hamsters. Ces prélèvement seront réalisés sous anesthésie et juste avant l'euthanasie des animaux.
Impact sur les animaux
Ppour les prélèvements sanguins les animaux seront anesthésiés donc ils auront un leger stress du à l'injection IP d'anesthésique. Pour les Hamsters ayant reçu des injections d'anticorps anti-contactine1, des nuisances liées à l'apparition d'une maladie rénale et/ou neurologique qui mime la pathologie humaine, peuvent apparaitre.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure puisque leurs organes sont nécessaires à l'étude de la pathogénicité des anticorps anti-contactine1.
Remplacement
L’objectif principal de cette étude est de démontrer que l’injection des anticorps anti-contactine1 humains induit chez le Hamster des altérations neurologiques et de la fonction des reins similaires à celles observées chez l’homme. Il n’existe pas de méthode alternative permettant d’atteindre cet objectif.
Réduction
52 animaux seront utilisés pendant 1 an pour cette étude. Le modèle hamster visant à recréer une maladie auto-immune rénale avec des injections d’anti-contactine1 étant unique, il est difficile de prévoir le juste nombre d’animaux nécessaire à cette étude. Le nombre d’animaux a été réduit en veillant toutefois à travailler sur un nombre suffisant pour obtenir une différence statistiquement significative entre les groupes en cas de comparaison. Ainsi, le nombre d’animaux par groupe a été fixé à 4 pour l'étude préliminaire visant à visant à confirmer que les immunoglobulines humaines contenant l’anticorps anti-contactine pourront se fixer sur les reins des hamsters et induire des dépôts immuns. Il y a deux groupe d'animaux pour cette analyse soit 8 animaux. Concernant la seconde partie de l'étude, si l'étude préliminaire est concluante, 4 animaux par groupe seront nécessaires, avec également deux groupes d'animaux, afin de déterminer les doses adéquate d'anticorps à injecter aux animaux. Enfin, 36 animaux seront nécessaire pour l'étude principale qui vise à induire la maladie cliniquement et à évaluer l’atteinte rénale. Les 36 animaux seront réparties dans 3 groupes de 12 animaux qui recevront des injections d'anticorps issues de patients ayant des pathologies nephrotiques et/ou neurologiques différentes.
Raffinement
Nous attachons une importance majeure sur les conditions d’hébergement et la qualité de vie des animaux. C’est pourquoi, une période d'acclimatation d'une semaine sera mise en place à l’arrivée des animaux. Ils seront hébergés en groupe afin de limiter leur stress. Pour les phases d'injections de substances et de prélèvements, une anesthésie sera réalisée afin de prévenir la souffrance et l’angoisse de l’animal. Lors des quelques gestes possiblement douloureux, un antidouleur sera administré à l’animal. Dans le but de préserver le bien-être des animaux, nous avons prévu de mettre en place des critères d’interruption des interventions expérimentales basées sur des paramètres mesurables non invasifs.
Choix des espèces
Nous avons préalablement recherché in vitro la contactine dans les reins des animaux utilisés en routine dans les animaleries souris, rats, lapins et cochons d’Inde mais aucun d’entre eux n’exprime la contactine dans le rein. Seul le Hamster et le porc expriment cette protéine dans leur reins. Notre choix s'est ensuite porté sur le modèle Hamster car plus facile à élever. Les animaux sont choisis au terme du post-sevrage à l'âge de 10-14 semaines, pour des raisons techniques (poids entre 100-120g), permettant des groupes homogènes.
Caractérisation comportementale du phénotype autistique des souris femelles déficientes en canaux sodiques
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Génétiquement modifiées et déficientes en canaux sodiques, les femelles passent treize tests comportementaux évaluant socialisation, motricité, mémoire, anxiété et sensibilité sensorielle, avec pose d'une puce électronique, pour caractériser un phénotype autistique propre aux femelles. Le porteur indique que ces tests, fondés sur l'exploration, sont peu stressants et de courte durée. Sur le remplacement, il décrit des études sur cultures de neurones menées en parallèle, mais affirme que la réponse comportementale ne peut être obtenue que sur animal vigile.
Objectifs
Les Troubles du Spectre Autistique représentent un ensemble de pathologies du développement cérébral touchant 1 enfant sur 160 dans le monde et 4 hommes pour 1 femme. Les symptômes sont répartis en 2 grandes catégories : apparition de déficits dans l'interaction et la communication sociale et des comportements moteurs inappropriés, répétitifs et stéréotypés. Ils apparaissent à partir de 3 ans et se prolongent chez l’adulte. Bien que de nombreuses causes aient été mises en évidence grâce aux études actuelles, l'explication des différences entre le nombre de cas chez les hommes et chez les femmes reste inexpliquée. Pour répondre à cela, l’utilisation de modèle animaux reste donc cruciale. Notre équipe étudie notamment l’influence d’une mutation identifiée chez les patients comme faisant partie des plus fréquemment retrouvées chez l'Homme dans un modèle de souris. Les souris mâles de ce modèle servent déjà à l'étude de l'autisme. Ce projet se déroulera sur 5 ans et propose d’identifier les anomalies comportementales présentes chez les souris femelles pour la première fois. Il permettra donc de mieux comprendre les différences de comportement liées à la même anomalie génétique selon le sexe. En effet, une meilleure compréhension de l'apparition de la pathologie chez les femmes permettra d'améliorer leurs traitements et la spécificité des critères de diagnostic. Nous étudierons l'équivalent chez la souris des comportements autistiques visibles chez les patients.
Bénéfices attendus
Ces résultats permettront de mieux comprendre les différences observées entre hommes et femmes souffrants de troubles autistiques, dûs à l'une des mutations les plus importantes dans la population. Nous nous intéressons à comment et pourquoi les femmes seraient mieux "protégées" contre l'autisme même si elles porte la même mutation que les hommes. L'identification de différences de comportement entre les sexes permettront d'adapter les critères de diagnostic et les traitements pour mieux prendre en charge les patientes, qui restent à ce jour moins efficacement ou plus tardivement diagnostiquées.
Procédures
Les animaux seront soumis à des tests évaluant leurs comportements sociaux, moteurs, leur mémoire et capacité d'apprentissage, leur sensibilité à des stimuli sensoriel, ainsi que leur anxiété. Ils participeront à 13 tests comportementaux dont la majorité seront réalisés sur une journée et d'autres dont la durée maximale sera de 5 jours consécutifs. Une partie des animaux portera une puce électronique servant à la fois à l'identification et à la réalisation du test comportemental.
Impact sur les animaux
Toutes les mesures seront prises pour éviter toute souffrance à l'animal. Nos tests comportementaux sont peu stressants car ils sont basés sur des comportements naturels d'exploration, leur permet de choisir d'effectuer l'exploration que s'ils en ont envie et sont de courte durée (de 3 à 30 min). L'implantation de puces électroniques chez une partie des animaux est une méthode autorisée pour l'identification des animaux et nous permet de plus d'obtenir des résultats dans un environnement naturel. Ces tests n'auront donc pas d'effet négatif majeur sur le bien être des animaux. Les seuls nuisances temporaires sont liées à un stress de contention ou lié à la lumière ambiante ou à la température bien qu'étant limités au minimum en terme de durée et d'intensité.
Devenir
A la fin des expérimentations, l'intégralité des animaux seront mis à mort pour cause de fin de procédure et d'impossibilité de les réutiliser dans d'autres projets.
Remplacement
Nous avons établi notre projet de recherche en tenant compte de la règle des 3R. Ainsi, afin de répondre au principe de remplacement, nous réaliserons, parallèlement aux expérimentations sur animal vigile, quand cela sera possible, des études sur culture de neurones ou tranches de cerveau. Cependant, les études fonctionnelles basées sur la réponse comportementale ne peuvent être réalisées que sur animal vigile. Les procédures ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent être remplacées par d’autres stratégies n’impliquant pas l’usage des rongeurs
Réduction
Le nombre est réduit à un minimum sans compromettre l’objectif du projet. Nous comparerons pour chaque test 2 groupes d'animaux : souris contrôles et mutantes. Nous avons choisi de réutiliser les mêmes animaux à l’âge jeune puis adulte dans un but de réduction. Nous avons calculé nos besoins en animaux via une méthode statistique adaptée. Un maximum de 25 animaux seront donc utilisés par groupe pour les procédures. Un total de 100 aniamux seront utlisés pour ce projet. Les femelles seront utilisés pour les tests et les souris mâles seront utilisées pour la reproduction et pour des expériences ex vivo.
Raffinement
Toutes les mesures de raffinement appropriées seront prises pour éviter toute souffrance ou inconfort à l’animal. Toutes les souris seront élevées dans un environnement enrichi (social et physique) et une manipulation régulière des animaux sera réalisée afin de réduire leur stress. Un suivi journalier permettra d’évaluer leur état de santé et ainsi d’intervenir rapidement par rapport aux points limites définis, par application d'une grille de critères (ex: Traitement antalgique, administration de solution saline pour maintenir l'hydratation, désinfection de plaie, changement de cage si agressivité, euthanasie). De plus, les protocoles expérimentaux choisis sont ceux induisant le moins de stress et d’inconfort aux animaux.
Choix des espèces
Nous utilisons un des rares modèles de souris génétiquement modifiées actuellement disponibles pour l'étude de notre mutation. Nous travaillerons sur des souris ayant une réduction de 50% de la production de notre protéine d'intérêt obtenues. Les tests utilisés ont été choisis par rapport à la littérature basée sur la même espèce. Les animaux seront utilisés à 2 stades de développement : Jeunes et Adultes. Les Troubles du Spectre Autistiques apparaissant chez l'enfant autour de 3 ans et se maintenant à l'âge adulte, ces deux phases sont à étudier pour comprendre l'apparition des comportements autistiques, leur développement ainsi que les possibles changements physiologiques ou pathologiques se mettant en place au cours du temps.
Exploration de l’intégrité de la Barrière Hémato-Encéphalique au cours de l’évolution de la Sclérose Latérale Amyotrophique dans un modèle murin transgénique de cette maladie par une approche combinée in vivo et in vitro
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
252 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Porteuses d'un modèle de sclérose latérale amyotrophique, elles développent une paralysie progressive et reçoivent des injections d'agents de contraste et d'un agent inflammatoire sous anesthésie, avec des tests moteurs et de l'imagerie, pour étudier la barrière protégeant le cerveau. Le porteur indique que la maladie provoque des troubles de la marche, une atrophie musculaire et un décès prématuré, et que l'agent inflammatoire comporte un risque de choc septique. Sur le remplacement, il affirme que les modèles cellulaires de cette barrière ne sont pas assez développés pour une pathologie comme la SLA.
Objectifs
Le principal objectif de ce projet est de caractériser l’intégrité de la barrière entre le sang et le tissu nerveux (Barrière Hémato-Encéphalique (BHE)) au cours de l’évolution de la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) chez un modèle murin transgénique de cette maladie portant une mutation dans un gène impliqué dans la maladie. Le second objectif est d’identifier des marqueurs circulants dans le sang et dans le liquide céphalo-rachidien (LCR) de l’intégrité de la BHE chez la souris. Les autres objectifs sont de valider de nouvelles techniques non-invasive d’exploration de l’intégrité de la BHE chez l’animal vivant, réduisant ainsi la nécessité de mettre à mort les animaux et permettant de compléter la caractérisation de ce modèle murin de SLA.
Bénéfices attendus
Nous souhaitons mettre en lumière l’implication de l’altération de la BHE dans la SLA. Les explorations innovantes prévues dans ce projet (principalement celles in vivo) n’ont jamais été réalisées dans la SLA, et particulièrement chez ce modèle murin, qui est peu décrit dans la littérature. Nous sommes convaincus que le ciblage de la protéine codée par le gène muté et l’amélioration des modes d’administration de médicaments sont tous deux cruciaux pour l’avancement des thérapies dans la SLA. La validation d’une technique d’évaluation de l’intégrité de la BHE par une méthode d’imagerie in vivo représenterait un réel progrès technologique pour nos projets futurs. Nous pourrons ainsi satisfaire à la régle des 3R avec une réduction du nombre d’animaux utilisés. Démontrer l’altération de la BHE comme mécanisme pathologique de la SLA pourrait inciter au développement de nouvelles molécules thérapeutiques visant à restaurer son intégrité. Les marqueurs circulants d’intégrité de la BHE identifiés chez la souris SLA seront évalués dans une cohorte humaine. Cette étude permettrait d’améliorer notre compréhension de la pathogénèse et du pronostic de la maladie. La recherche de ces marqueurs pourrait également aider à identifier des sous-groupes de patients chez qui les mécanismes de disruption de la BHE seraient différents, menant à une médecine personnalisée des patients avec l’adaptation des protocoles d’administration des médicaments. Il est également envisagé de poursuivre ces explorations chez l’homme à partir d’une autre collection d’échantillons biologiques.
Procédures
- Pesée lors de chaque manipulation (duree :
Impact sur les animaux
Les souris transgéniques SLA développent spontanément un phénotype neurodégénératif, avec des symptômes moteurs, des troubles de la marche, une perte de poids et une atrophie musculaire. Ce modèle développe également une dysfonction intestinale responsable d’un décès prématuré, qu’il est possible de prévenir par la mise en place d’une alimentation gélifiée. Les nuisances attendues liées aux actes expérimentaux réalisés sur les animaux sont les suivantes : - Puçage : • Direct: douleur associée à l’injection de la puce par un trocart, prévenue par anesthésie • Indirect: possibilité d'inconfort les premiers jours post-injection. - Injection d’un agent permettant d’induire un syndrome inflammatoire : • Direct : douleur associée à une injection • Indirect (effets de l’agent) : risque de choc septique avec défaillance d’organes à haute concentrations. Il a été choisi une concentration inférieure à celle pouvant induire une mortalité. Une surveillance rapprochée (toutes les 2h pendant 8 h) sera réalisée après l’injection. Durée : < 24 h - Injection d’un agent de contraste photoacoustique: • Direct : douleur prévenue par anesthésie • Indirect : produit non nocif - Injection des microbulles servant d’agent de contraste ultrasonore: • Direct : douleur prévenue par anesthésie • Indirect : produit non nocif - Injection d’un cocktail de molécules fluorescentes: • Direct : douleur prévenue par anesthésie • Indirect : aucun, euthanasie après injection - Anesthésie : • Direct : stress lié à la manipulation • Indirect : risque lié à l’agent : baisse de la température corporelle. Durée < 1 h - Test comportementaux, pesée : stress lié à la manipulation : sortie de la cage, marche forcée sur un cylindre, contrainte à tenir une grille puis à la lâcher pour le test d’agrippement.
Devenir
Euthanasie de tous les animaux car nécessité de prélever les organes afin d’observer la perméabilité au dextrans fluorescent et pour réaliser des analyses histologiques visant à caractériser la BHE.
Remplacement
Les modèles in vitro que nous utilisons pour nos projets sont inopérants dans une telle étude qui vise à étudier un organisme dans son ensemble : Les modèles de BHE cellulaires ne sont pour l’instant pas encore assez développés ni adaptés à l’évaluation d’une pathologie neurodégénérative telle que la SLA.
Réduction
Des analyses de faisabilité et de mises au point seront réalisées sur un faible nombre d’animaux (24 souris) afin d’éviter une utilisation excessive d’animaux liée à une non-maitrise de ces outils d’exploration in vivo de la BHE. Si les résultats de cette procédure sont satisfaisants, nous poursuivrons l’étude en comparant les souris mimant la SLA aux souris contrôles. Le nombre de 12 souris par groupe de souris SLA a été choisi : sur la base d’une analyse de la bibliographie portant sur un sujet similaire et utilisant un autre modèle de souris transgéniques que celui de ce projet et sur la prise en compte de la fragilité de cette souche de souris et de la variabilité du phénotype des souris transgéniques (début de symptômes, etc) et des tests comportementaux utilisés. Les souris contrôles présentant moins de variabilité phénotypique, un nombre de 6 souris par groupe a été retenu.
Raffinement
L’enrichissement dans les cages d’hébergement sera systématique : matériel de nidifications, objets de mastication, boite à œuf et/ou « igloo » en plastique ou autres objets conçus par le personnel de l’animalerie. Les souris transgénique SLA développant des troubles de la motilité intestinale liés au développement de la maladie, de la nourriture gélifiée sera également mise à disposition dès le stade présymptomatique afin de prévenir l’apparition de ce symptôme. Du fait des problèmes locomoteurs attendus chez ces animaux, un accès à l’eau et à la nourriture sera disponible à hauteur du sol pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés en groupe jusqu’à 5 animaux par cage. Hors expérimentation, les animaux seront surveillés quotidiennement par le personnel de l’animalier et les responsables du projet pendant l’intégralité de l’étude, voir plus régulièrement en cas de début de réactions négatives. Les souris seront sous anesthésie gazeuse lors de chaque expérimentation non comportementale afin de limiter le stress et la douleur. Les souris seront placées sur tapis chauffant (prévention de la baisse de température corporelle) et surveillées constamment durant les périodes d’anesthésie, y compris lors de la phase de réveil faite dans la cage d’hébergement pour limiter le stress. Nous mettrons une feuille d’essuie-tout dans la cage sur la litière pour poser les animaux après l’imagerie pour éviter que la litière colle sur la peau des animaux au niveau du site d’application du gel échographique (une légère couche résiduelle de gel peut être présente même après nettoyage de la peau). Une surveillance accrue (toutes les 2 heures pendant 8 heures) sera également réalisée après administration d’un agent provoquant une réaction inflammatoire aux 12 souris de la procédure de mise au point. La douleur des animaux sera évaluée et les points limites seront déterminés selon une grille de cotation, arbre décisionnel et critères d’arrêt de souffrance pour les souris contrôle, avec une deuxième grille adaptée aux souris SLA.
Choix des espèces
Il y a peu d’animaux modèle de la SLA, seul le modèle de souris transgénique utilisé ici possède les caractéristiques recherchées pour notre projet. C’est par ailleurs ce modèle qui est utilisé au cours de l’étude globale ayant fait l’objet du financement régional. Les modèles in vitro que nous utilisons pour d’autres projets sont inopérants pour notre étude qui vise à étudier un organisme dans son ensemble : Les modèles de BHE in vitro ne sont pour l’instant pas encore assez développés ni adaptés à l’évaluation d’une pathologie neurodégénérative telle que la SLA. Les souris seront reçues à leur 5ème semaine de vie. Ceci permettra d’effectuer les 1ères manipulations avant le début d’apparition des symptômes de la SLA. Ce stade de développement des animaux permettra d’intégrer des animaux dans nos groupes où la maladie est en phase pré-symptômatique.
Métabolisme du glycogène et stress du réticulum endoplasmique : impact sur la fonction musculaire
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Génétiquement modifiées, elles passent chaque semaine des tests moteurs pendant huit semaines, certaines étant soumises à une course forcée sur tapis roulant jusqu'à épuisement, avant une analyse des muscles sous anesthésie puis la mise à mort. Le porteur indique que la course jusqu'à épuisement génère un stress et de possibles douleurs musculaires. Sur le remplacement, il reconnaît que l'analyse des propriétés musculaires pourrait se faire ex vivo, procédé qu'il dit vouloir privilégier à l'avenir sans le retenir ici.
Objectifs
La « différenciation myogénique » correspond à la transformation des cellules souches musculaires en cellules matures. Ce processus, très finement régulé, permet le développement des muscles squelettiques au cours de la période embryonnaire ainsi que sa réparation en cas de lésion chez l’adulte. Le processus de différenciation myogénique s’accompagne d’un stress transitoire du réticulum endoplasmique (RE). Le RE est un lieu essentiel, à l’intérieur de la cellule, pour la synthèse de nouvelles protéines. Lorsque des protéines anormales s’accumulent dans le RE, la cellule est soumise à un stress et des adaptations se mettent en place : les cellules souches défectueuses sont éliminées de façon sélective et en conséquence la formation de cellules musculaires fonctionnelles se trouve améliorée. Ce mécanisme est essentiel au bon fonctionnement du muscle. On observe une dérégulation du stress du RE dans différentes pathologies du muscle squelettique, telles que les myopathies. Chez la souris, il a été montré que l'activation du stress du RE dans des cellules souches musculaires est associée à une accumulation de glycogène dans la cellule. Cette accumulation de glycogène est nécessaire à la survie des cellules souches lors du stress du RE. Elle dépend d’une protéine appelée Stbd1. De manière intéressante, des cellules souches musculaires qui ne possèdent pas cette protéine ne peuvent pas se transformer en cellules musculaires. Nous ignorons toutefois quelles sont les répercussions de l’absence de cette protéine sur la fonction motrice. Notre objectif est donc de caractériser l’impact de la déficience de la protéine Stbd1 sur la fonction et la performance musculaires dans un modèle de myopathie. L’étude sera réalisée sur un total de 72 souris (36 souris sauvages et 36 souris transgéniques) dans le respect du principe des « trois R » (remplacement, réduction, raffinement). L’une de nos priorités majeures sera de minimiser l'inconfort, le stress ou la douleur des animaux et de maintenir le nombre d'animaux utilisés dans les procédures expérimentales au minimum. Les interventions invasives seront menées dans les conditions appropriées d'anesthésie et toutes les mesures nécessaires seront prises pour minimiser la douleur pendant et après l’intervention. Dans le cas où la vie d'un animal devra être interrompue, cela sera effectué rapidement pour minimiser la douleur et dans le respect des pratiques acceptées.
Bénéfices attendus
Le projet a pour objectif d’avancer dans la compréhension du processus de différenciation myogénique ainsi que des mécanismes à l’origine de myopathies telles que la dystrophie musculaire de Duchenne ou la dystrophie myotonique de type 1.
Procédures
L’ensemble des tests réalisés pour l’évaluation de la fonction motrice sont réalisés sur des animaux vigiles ; l’ensemble des animaux (36 contrôles et 36 transgénique de chaque sexe, soit 144 animaux) seront soumis, une fois par semaine pendant 8 semaines, à des tests comportementaux permettant d’évaluer la fonction motrice (force, marche, coordination…). Ces tests sont sans douleur pour l’animal. A l’issue de ces tests, 24 animaux de chaque sexe (12 contrôles et 12 transgénique) seront soumis à un test d’endurance qui consiste à courir sur un tapis roulant jusqu’à épuisement, puis seront mis à mort par euthanasiant chimique. Différents muscles seront alors prélevés. Les autres souris (24 contrôles et 24 transgéniques de chaque sexe) seront consacrées à l’étude des propriétés musculaires. Cette partie sera réalisée sous anesthésie. La durée est estimée à 45 minutes par animal. A la fin, les animaux seront mis à mort par euthanasiant chimique et les muscles prélevés.
Impact sur les animaux
L’ensemble des tests réalisés pour l’évaluation de la fonction motrice peuvent générer un stress modéré dû à la manipulation et au changement d’environnement. La durée de cette étude est estimée à 1h au maximum. En outre, la course forcée sur tapis roulant sera effectuée jusqu'à épuisement de l'animal, ce qui génère un stress et de possibles douleurs musculaires. L’étude des propriétés musculaires peut générer de la douleur mais cet effet indésirable sera prévenu par l’utilisation d’une anesthésie gazeuse et analgésie chimique.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure afin de prélever les muscles pour une étude ultérieure. Cette étude musculaire est nécessaire évaluer les conséquences de l’invalidation du gène d’intérêt sur la structure du muscle, le nombre de cellules souches, ou encore l’accumulation de glycogène.
Remplacement
L'analyse comportementale nécessite d'être réalisée in vivo et ne peut être remplacée par des méthodes alternatives. L'analyse des propriétés musculaires pourrait être réalisée ex vivo. Cela nécessite un appareillage particulier, onéreux, et une longue période de tests. Des travaux préliminaires seront intégrés à cette étude, en parallèle de l’approche in vivo. Notre objectif est de privilégier cette alternative dans l'avenir.
Réduction
Le calcul du nombre d’animaux par groupe se base sur la nécessité d’avoir suffisamment d’animaux pour que l’analyse statistique soit possible entre les deux groupes. Les différentes interventions (étude du comportement, de la fonction contractile et prélèvement de muscles) seront réalisées successivement sur les mêmes animaux. Toutefois, en ce qui concerne l’analyse de la fonction contractile, l’étude des deux muscles d’intérêt ne pourra pas se faire sur les mêmes animaux. En effet, le maintien de la souris sous anesthésie profonde pendant 30 à 45 minutes pour l’étude du premier muscle peut potentiellement induire une variabilité qui nuirait à l’analyse des résultats.
Raffinement
Les souris bénéficieront d’une surveillance quotidienne et de pesées bi-hebdomadaires. L’enrichissement est effectué par ajout de carrés de coton dans la cage et d’un dôme.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les modèles animaux les plus couramment utilisés en recherche fondamentale ou appliquée chez les mammifères, notamment pour l’étude de pathologies humaines. Le laboratoire dispose du savoir-faire et des dispositifs expérimentaux nécessaires à l'étude de la fonction sensorimotrice chez les rongeurs. Les souris sont le modèle animal le plus couramment utilisées pour les knock out de gènes. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (entre 18 et 24 semaines).
Mise au point d’un modèle d’ischémie-reperfusion hépatique dans un contexte d’obésité nutritionnelle.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles suivent un régime gras de trois à six mois jusqu'à l'obésité, puis subissent une chirurgie abdominale de quatre-vingt-dix minutes avec pincement du pédicule du foie et des prélèvements de sang, pour mettre au point un modèle d'ischémie-reperfusion sur foie stéatosé. Le porteur indique que le régime réduit la mobilité et que la chirurgie provoque une perte de poids et une défaillance du foie plus ou moins transitoire. Sur le remplacement, il affirme que les modèles in vitro ne reproduisent pas un foie vascularisé et juge le recours à l'animal nécessaire.
Objectifs
La transplantation d’organe solide constitue le traitement curatif de choix des patients présentant des défaillances d’organe à un stade terminal. Malheureusement, les besoins augmentent plus vite que les organes disponibles et entraînent des pénuries de greffon, ce qui engendre des listes d’attente importantes. L’une des stratégies envisagées est l’élargissement des prélèvements chez des donneurs présentant des facteurs de comorbidité (association de plusieurs maladies) ; notamment des foies stéatosés atteints de stéato-hépatite non alcoolique (NASH), caractérisés par l’apparition de dépôts graisseux liée à un régime alimentaire trop riche en sucre et en graisse. Lors de la transplantation, des phénomènes liés à l’ischémie (défaut d’apport en nutriments et en oxygène) et aussi à la reperfusion (reprise du flux sanguin de l’organe chez le receveur) sont à l’origine de processus physiopathologiques qui vont contribuer aux lésions irréversibles du greffon. Dans le cas de la greffe de foie, la séquence d’ischémie-reperfusion peut entraîner des lésions sévères, à l’origine de dysfonctions du greffon et potentiellement du rejet de l'organe à plus ou moins long terme. L’utilisation de foies stéatosés pour augmenter le nombre d’organes transplantables doit être rigoureusement étudiée étant donné que les conséquences de la stéatose sur la qualité de la transplantation continuent à faire débat. Afin de répondre aux attentes cliniques, notre objectif est de mettre au point un modèle murin d’ischémie-reperfusion hépatique chez des souris atteintes de stéatose (obésité nutritionnelle) afin d’étudier les effets combinés de la stéatose et des lésions d’ischémie reperfusion. La première étape sera de définir les points limites de ce modèle en testant différentes durées de régime et de temps de reperfusion tout en évaluant l’impact sur les lésions d’ischémie-reperfusion hépatiques et la nuisance pour les animaux. La validation de ce modèle permettra ensuite d’établir la durée optimale de régime et de temps de reperfusion afin d’identifier les mécanismes immunitaires et métaboliques mis en jeu après ischémie-reperfusion d’un foie stéatosé et ainsi définir de nouvelles stratégies thérapeutiques pour prévenir les effets de l’ischémie-reperfusion en transplantation de foies stéatosés chez l’homme.
Bénéfices attendus
A court terme, la mise en place de ce modèle permettra d’étudier in vivo les effets combinés de la stéatose et d’une ischémie-reperfusion sur les fonctions hépatiques, ce qui n’est pas possible chez l’homme. A moyen terme, après la validation de ce modèle, nous pourrons identifier les mécanismes immunitaires et métaboliques mis en jeu après ischémie-reperfusion d’un foie stéatosé et ainsi définir de nouvelles stratégies thérapeutiques pour minimiser les lésions d’ischémie-reperfusion et améliorer la reprise de fonction. A long terme, ce projet vise à augmenter le pool de greffons disponibles à la transplantation chez l’homme.
Procédures
Régime riche en graisses et sucres durant 3 à 6 mois pour 144 souris. Pesée 1 fois par semaine pendant la durée du régime pour 288 souris (10s). Un jeûne de 4h avant tous les prélèvements sanguins. Prélèvements sanguins (8 maximum pour 32 animaux sinon entre 4 et 7 prélèvements pour 256 souris) sous anesthésie gazeuse d’une durée de 30s par prélèvement. Une procédure chirurgicale abdominale sous anesthésie gazeuse AVEC pincement du pédicule hépatique (durée de l'intervention : 90 min) pour 96 souris. Une procédure chirurgicale abdominale sous anesthésie gazeuse SANS pincement du pédicule hépatique (durée de l'intervention : 90 min) pour 96 souris.
Impact sur les animaux
Les animaux suivront un régime riche en sucres et graisses pendant 3, 4 ou 6 mois. Ce régime conduira à la prise de poids progressive des animaux tout au long du régime jusqu’à atteindre l’obésité. Les animaux obèses seront un peu moins mobiles mais sans conséquence sur l’accès à leur alimentation et eau de boisson et leur bien-être général. L’acte de pesée sur animal vigile pourra induire un léger stress très transitoire. Suite à l’anesthésie générale, l’effet attendu est un léger inconfort au réveil. Après la chirurgie abdominale, un stress transitoire peu intense, une mobilité réduite de quelques heures (due aux sutures abdominales) peuvent être observés. En post-opératoire, une perte de poids de quelques heures jusqu’à sept jours après la chirurgie pour les animaux obèses qui reprennent un régime normal peut également nuire à l’animal. L’autre effet indésirable attendu est une défaillance plus ou moins transitoire de la fonction hépatique dont l’impact principal sera la perte de poids.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure. Des prélèvements d’organes et tissus, incompatibles avec le maintien en vie des animaux, seront réalisés afin d’effectuer des analyses biochimiques, moléculaires et histologiques.
Remplacement
Un modèle in vitro de cellules hépatiques stéatosées réalisé au laboratoire nous permet d’avoir une première approche des mécanismes mis en jeu au niveau cellulaire. A ce jour, il existe des modèles in silico ou in vitro permettant de recréer un foie, cependant ces modèles sont très limités et ne permettent pas de reproduire la physiologie hépatique notamment associée à une modulation du métabolisme d’un foie vascularisé. En effet, les méthodes d’études in vitro ou in silico sont très limitées pour étudier l’ischémie-reperfusion hépatique car quatre éléments très importants sont absents dans les modèles in vitro ou in silico : 1) la complexité des populations cellulaires du foie, 2) l’architecture hépatique, qui organise les relations entre ces populations cellulaires, 3) la vascularisation, qui permet la circulation des cellules immunitaires et des molécules entre différentes zones 4) ainsi que les interactions avec les autres organes. Il est donc nécessaire d’évaluer de manière intégrative et systémique la mise en jeu des éléments immunitaires et métaboliques dans les lésions d’ischémie-reperfusion en utilisant un modèle animal.
Réduction
Le nombre d’animaux requis pour les analyses statistiques de la procédure découle d’une part d’un compromis entre les questions de minimisation et d’autre part d’un calcul de puissance pour définir le nombre d’animaux par groupe suffisant pour détecter des différences statistiques biologiques intra-groupes et intergroupes. Un total de 288 animaux maximum sera nécessaire pour la réalisation de ce projet de 5 ans. Les tissus prélevés chez les animaux seront placés dans une banque d’organes/tissus murins afin de mutualiser les échantillons.
Raffinement
Les animaux feront l’objet d’un suivi quotidien de leur état de santé (grille de suivi individuel), les conditions d’élevage et d’hébergement seront optimisées (enrichissement du milieu, hébergement en groupe). La répartition des souris en surpoids sera prise en compte pour le bien-être animal. Des points limites gradés avec un arbre décisionnel et des critères d’arrêt de la souffrance seront mis en place à chaque étape de la procédure en pré-, per- et post- opératoire avec des grilles de score. Les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie générale et locale en asepsie stricte. Toutes les procédures chirurgicales seront réalisées en asepsie stricte, sous anesthésie générale, et les animaux bénéficieront d’une analgésie adaptée en pré, per et post opératoire. De plus, elles seront réalisées par un personnel compétent et expérimenté, permettant ainsi de réduire l’angoisse des animaux et de contribuer à leur bien-être.
Choix des espèces
Le choix porté sur la souris repose sur les critères principaux suivants : 1) Le modèle d’ischémie-reperfusion chez la souris reflète les lésions physiopathologiques observées chez l’homme. Ce modèle est utilisé dans la littérature pour répondre à des questions pathologiques humaines. 2) Le modèle de régime obésogène et le modèle d’ischémie-reperfusion hépatique chez la souris, sont validés et adaptés pour répondre aux objectifs du projet. 3) La disponibilité dans cette espèce de l’ensemble des outils d’études biologiques (cytokines, protéines recombinantes, anticorps de détection). Les animaux seront âgés de 6 semaines au démarrage des régimes. Il est important de démarrer les régimes de façon précoce pour une meilleure installation de la pathologie. Les chirurgies pour ischémie-reperfusion seront réalisées sur animaux adultes à maturité (3 à 6 mois après démarrage des régimes).
Rôle du circuit méscorticolimbique dans les comportements liés à l’addiction à l’alcool
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 800 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent deux chirurgies cérébrales pour l'injection de virus et l'implantation d'une lentille d'imagerie, une consommation forcée d'alcool sur plusieurs semaines et une tâche d'auto-administration, pour étudier les circuits cérébraux de l'addiction. Le porteur indique que les rats ne développant pas de consommation excessive ou échouant à la tâche sont euthanasiés en cours de route, ce qui explique le grand nombre d'animaux engagés. Sur le remplacement, il affirme que ces effets ne peuvent être étudiés sur modèles cellulaires et que seuls des rats modifiés permettent de cibler les neurones visés.
Objectifs
L’alcoolo-dépendance est une maladie chronique et hautement récidivante en dépit des thérapies existantes puisque 70% des patients rechutent après 12 mois de prise en charge (plus de 90% après 4 ans). Le trouble de l’usage d’alcool (TUA) et toutes les conséquences liées à la consommation d'alcool représentent une charge importante pour la santé publique et les économies du monde entier, notamment en France et particulièrement dans notre région. À l'instar des autres dépendances aux drogues, le TUA est défini comme un syndrome pathologique caractérisé par une perte de contrôle et des envies incontrôlables (« craving »), la persistance de la consommation en dépit des conséquences (usage compulsif), un mal-être et des symptômes physiques à l’arrêt de la consommation (sevrage) et des rechutes qui peuvent survenir même après des années d'abstinence. C’est une maladie grave, complexe, fréquente et hautement invalidante qui est dévastatrice non seulement pour l’individu mais aussi pour l’entourage et la société. Pour identifier les cibles thérapeutiques qui amélioreront les options de traitement disponibles pour le TUA, il y a donc un besoin critique de comprendre les mécanismes neurobiologiques qui sous-tendent l'apparition, le maintien et la rechute de cette addiction à d'alcool.
Bénéfices attendus
Sur le plan scientifique, les données du présent projet offrent non seulement une meilleure compréhension des mécanismes neurobiologiques à la base de l’addiction à l’alcool, mais aussi ouvrent des possibilités en termes de nouveaux traitements cellulaires et génétiques de cette maladie. Ce projet scientifique est très ambitieux et très original car il va combiner des techniques de pointes avec l’utilisation des modèles animaux validés pour évaluer le développement d’addiction à l’alcool. Vu la pertinence et l’innovation du projet, les retombées seront importantes en termes de mise en place de techniques originales in vivo, chez l’animal vigile, ce qui n’est pas courant et mérite donc d’être souligné. Les résultats permettront aussi d’avoir des données en fonction du sexe, ce qui est important à l’heure actuelle car ce facteur est assez peu étudié dans les recherches du domaine. Le protocole est aussi original, dans le sens ou l’approche longitudinale va nous permettre d’obtenir des données aux différentes étapes des processus impliqués dans l’addiction et nous serons donc en mesure de proposer des interventions dans le champ de la prévention, avec l’idée d’intervenir précocement. Nous serons en mesure d’identifier des mécanismes dans des voies neuronales spécifiques et dans des types de neurones spécifiques et de démontrer que leur modulation permet de jouer sur la consommation d’alcool et sur certains critères de l’addiction. Cela avancera notre compréhension de comment les structures du circuit de récompense, impliquées dans l’évaluation de la récompense et le control cognitifs (système top-down), sont modifiées suite à l’exposition à l’alcool et comment ces régions cérébrales sont impliquées dans les comportements liés à l’addiction à l’alcool.
Procédures
Les animaux vont subir deux chirurgies espacées de 3 semaines dans le but d'injecter un virus dans différentes structures cérébrales en premier lieu, d'implanter une lentille d'imagerie et de placer une base crânienne d'un miniscope en deuxième lieu. La première chirurgie durera environ 30 minutes, tandis que la deuxième prendra environ une heure. Des prélèvements de sang pour évaluer l'alcoolémie seront réalisés à la lors des différentes étapes de la procédure 1 (début et à la fin de la procédure de la consommation volontaire et à la fin de l'apprentissage opérant d'alcool) et 2 (expériences visant à tester la compulsivité et de la rechute). Nous prévoyons de prélever entre 150 et 200 μL de sang veineux à chaque prélèvement, en respectant un intervalle d'au moins 2 semaines entre chaque prélèvement. Les rats seront anesthésiés pendant le prélèvement, ce qui prendra moins de 2 minutes.
Impact sur les animaux
Ces expériences doivent être réalisées avec des animaux placés individuellement dans des cages, ce qui peut entraîner un stress social chez notre modèle animal. D'expérience, les étapes de consommation volontaire d'alcool ne conduisent à aucune souffrance ou douleur chez nos animaux. Les phases qui vont faire subir aux rats une certaine douleur sont les procédures chirurgicales visant à injecter les vecteurs viraux et à implanter des lentilles intracrâniennes.
Devenir
Pour induire une forte consommation d'alcool chez les rats, une première étape de consommation volontaire intermittente est réalisée pendant environ 8 semaines. Les rats ont accès à deux bouteilles pendant 24 heures : une contenant de l'alcool à 20% v/v et une contenant de l'eau. Certains rats développent une consommation excessive d'alcool après environ 10 à 12 sessions, tandis que d'autres ne le font pas. Ceux qui ne développent pas une consommation excessive d'alcool sont euthanasiés, et des échantillons de tissus tels que le foie ou le cerveau peuvent être prélevés sur ces animaux pour des tests ultérieurs. Les rats qui réussissent la tâche d'auto-administration opérante d'alcool sont sélectionnés pour les chirurgies. Ceux qui ne parviennent pas à acquérir cette compétence sont également euthanasiés eet des échantillons de tissus peuvent être prélevés sur eux. À la fin de l'étude, les animaux tous les animaux seront anesthésiés.
Remplacement
Les conséquences de l’exposition répétée à l’alcool sur le circuit de la récompense ne peuvent pas être étudiés en utilisant des modèles cellulaires, qui par nature ne récapitulent pas la complexité de l’organisation cérébrale en réseaux neuronaux complexes. L’étude de ces effets nécessite donc l’analyse d’organismes vivants et entiers. De plus nous utiliserons des rats génétiquement modifiés permettant de cibler spécifiquement les différentes population neuronale dans nos régions d’intérêt dans le cadre de ce projet, ces modèles n’existent que chez Le rongeur.
Réduction
Pour les tests comportementaux, nous identifions le minimum d’animaux nécessaires pour un résultat statistiquement significatif, qui est déterminé en utilisant une « power analysis » basée sur nos résultats précédents, et un n = 30/groupe est généralement suffisant. Il est donc nécessaire de commencer avec un grand nombre d'animaux dans nos groupes. Si nous avons initialement 30 rats par groupe, nous perdrons ensuite environ 15 à 20 % des rats après la première étape d'acquisition de consommation volontaire excessive d'alcool, puis encore 15 à 20 % à la seconde étape d'acquisition de tâche opérante. Cela nous amènera à avoir une vingtaine de rats par groupe avant les tests de compulsivité. Théoriquement, nous aurons au maximum 5 à 6 rats qui développeront un comportement compulsif. Cela représente le nombre minimum nécessaire pour effectuer des tests statistiques. A noter donc qu’il est des fois nécessaires de répéter chaque expérience sur deux cohortes indépendantes, si le nombre de rats compulsif est inférieur à 5. Ces études se feront de manière longitudinale, afin de tester plusieurs paramètres (la consommation du type «binge »; perte de contrôle ; motivation ; consommation compulsive ; abstinence et rechute) chez le même animal afin de réduire au maximum le nombre de rats utilisés. Par ailleurs, les animaux sont surveillés quotidiennement.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont optimisées en fonction des comportements naturels des rongeurs : les rats sont hébergées en groupe sociaux de 2 animaux par cage (Sauf besoin expérimental), et chaque cage est enrichie avec un barreau à ronger et des papiers absorbants pour faire un nid. Enfin, les procédures invasives seront réalisées sous anesthésie (anesthésique profond et un anesthésique local autour du site de chirurgie) et les animaux recevront un traitement antidouleur. La température corporelle de l’animal sera maintenue grâce à un tapis chauffant thermostaté jusqu’au complet réveil de l’animal. Les animaux seront ensuite suivis et la souffrance sera évaluée. En plus des points limites spécifiques à chaque procédure, nous utiliserons une grille d’évaluation jusqu’à la mise à mort des animaux.
Choix des espèces
Le rat est l’animal le plus couramment utilisé dans les études d’auto-administration opérante d’alcool de part ses capacités d’apprentissage de la tâche opérante mais également pour son attrait naturel pour l’alcool. Les rats adultes seront agés de 8 semaines à leur arrivée au laboratoire pour une utilisation allant de quelques semaines à plusieurs mois.
Prise alimentaire et inflammation chronique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
5 760 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales, des incisions répétées de la queue et des prélèvements de sang, et sont soumises à des régimes gras ou à un jeûne intermittent, pour étudier le lien entre alimentation et inflammation chronique. Le porteur indique que ces régimes peuvent provoquer une prise de poids, un diabète ou, pour le jeûne, une perte de poids prolongée, avec mise à mort dès qu'un point limite est atteint. Sur le remplacement, il décrit des travaux sur lignées cellulaires, mais affirme que la complexité d'un système "corps entier" rend le recours à l'animal "indispensable".
Objectifs
L'inflammation, processus naturel permettant d'éliminer des pathogènes tels que des bactéries ou des virus, peut dans certains cas s'installer à long terme. On parle alors d'inflammation chronique qui peut alors être causal pour de nombreuses affections tel que l'arthrite, le diabète ou encore le cancer. L'activation de l'immunité innée, responsables de la production de molècules inflammatoires, participe à l'installation et la persistance de l'inflammation chronique. La cause et les acteurs responsables de l’activation de ces voies inflammatoires sont souvent inconnus et les traitements ciblent la plupart du temps les symptômes et non les causes. Il existe donc un besoin urgent de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients présentant des pathologies inflammatoires. Les interventions diététiques ont déjà montré qu'elles pouvaient moduler l’inflammation chronique. Cependant les effets sont difficiles à quantifier sur les populations humaines car l’administration de régimes spécifiques et l'indentification des voies modulées sont complexifiés, notamment, par le fait que les patients suivent mal ou abandonnent. Ainsi une meilleure compréhension des effets des interventions diététiques dans des environnements contrôlés sont nécessaires. Ce projet permettra d’identifier des nouvelles cibles qui donnera le jour à de nouveaux traitements pour des groupes de populations et de patients donnés.
Bénéfices attendus
La prévalence des maladies inflammatoires chroniques dans les sociétés occidentales est estimée à 5-7%, pesant considérablement sur les systèmes de santé. Il est connu de façon empirique que certaines interventions alimentaires permettent d'améliorer certains symptômes des maladies chroniques inflammatoires. Cependant le mécanisme d'action et les acteurs impliqués sont peu ou pas connus. Il apparait donc nécessaire d’identifier ces cibles afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Ainsi, une meilleure compréhension du lien mécanistique entre la nutrition et l’inflammation pathologique est nécessaire. Notre projet permettra d’identifier de nouvelles cibles interconnectées entre métabolisme et inflammation, mesurant ainsi l’impact des interventions diététiques sur l'activation des voies inflammatoires. A terme, ce projet ouvrira la voie à l’identification de composés pharmacologiques ou régimes alimentaires susceptibles de cibler l’interconnexion entre ces différentes voies et d’améliorer les symptômes des maladies chroniques inflammatoires.
Procédures
Gestes techniques de cette demande sont les suivants : - injection en intrapéritonéal sur animal vigile (15 secondes) - incision caudale sur animal vigile (10 secondes) - prélèvement sanguin sur animal vigile (1 minute). Chaque animal subira 3 injections en intrapéritonéal à au moins 15 jours d’intervalles, 3 incisions caudales (première fois coupure puis retrait de la croute), prélévements sanguins toutes les 4 à 6 semaines selon la procédure (soit 3 ou 4 prélévements au total).
Impact sur les animaux
L’administration de régimes specifiques ou le jeûne intermittent sont susceptibles d’avoir des effets indésirables ou bénéfiques sur les animaux, notamment en fonction du génotype considéré. L’administration d’un régime gras, ou à façon avec des lipides particuliers, sont particulièrement susceptibles de mener à une prise de poids ainsi qu’à une inflammation chronique délétère. Cette prise de poids pourrait engendrer une activité réduite chez les souris et/ou un développement d'un diabète. De même, le jeûne intermittant pourrait engendrer une perte de poids sur des durées prolongées. Aucun effet délétère des régimes à façon n’est attendu. Les tests métaboliques, ainsi que la prise de température rectale, sont aussi des circonstances où un stress transitoire pourrait être ressenti par les individus. Toutes les mesures susceptibles de prévenir tout effet impactant le bien être des individus seront mise en œuvre durant la durée du projet. Les animaux seront sous surveillance quotidienne et pesés une fois par semaine sauf pour le jeûne intermittent où les animaux seront pesés tous les jours. Des points limites ont été établis afin de pouvoir surveiller au plus près les altérations dues aux procédures prévues dans le présent projet.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés.
Remplacement
Dans le cadre du remplacement, visant à réduire l’utilisation de modèles animaux dans les procédures expérimentales, nous avons déjà réalisé des expériences in vitro sur lignée cellulaire. Ceci a permis de mettre en évidence un lien entre les voies métaboliques et inflammatoires ciblées. Bien que ces modèles basés sur de la culture cellulaire et des approches de biochimie permettent d’étayer nos hypothèses, ils ne permettent pas de récapituler la complexité des mécanismes mis en œuvre dans un système intégré (corps entier) et prenant en compte la diversité des acteurs cellulaires présents au sein des tissus. Ainsi, pour mesurer l’impact tissulaire et systémique des voies étudiées et l’impact d’interventions diététiques, une approche sur modèle animal est indispensable.
Réduction
L’analyse des données par individu sera maximisée par la réalisation de tests métaboliques sur les mêmes groupes d’animaux. Les pesées, prises de température et autres analyses (prélèvement sanguins) peu invasives seront réalisées de façon longitudinale. Les prélèvements d’organes qui se feront post mortem, concerneront les organes métaboliques et les compartiments immunitaires majeurs.
Raffinement
Toutes les mesures susceptibles de prévenir tout effet impactant le bien être des individus seront mise en œuvre durant la durée du projet. Les animaux seront sous surveillance quotidienne et pesés une fois par semaine sauf pour le jeûne intermittent où les animaux seront pesés tous les jours. Une crème analgèsique sera utilisée afin de réduire la douleur lors des prélévements sanguins. Des points limites ont été établis afin de pouvoir surveiller au plus près les altérations dues aux procédures prévues dans le présent projet. Les animaux manifestant au moins un des points limites identifiés seront systématiquement euthanasiés.
Choix des espèces
Les modèles murins, sont les plus utilisés dans les procédures expériementales visant à étudier l’immunité et le métabolisme et en particulier l’impact de régimes alimentaires spécifiques sur les processus biologiques. La communauté scientifique bénéficie d’un large éventail de modèles génétiquement modifiés permettant l’obtention de résultats robustes et des comparaisons avec d’autres études préalables. Les besoins sociaux et biologiques des modèles murins sont bien connus et parfaitement maîtrisés, permettant de minimiser tout effet indésirable, douleur, souffrance ou tout dommage durable. Des souris de 7 à 12 semaines seront utilisées en début de manipulations expérimentales afin d’avoir des animaux adultes (d’âge mûr).
Amélioration d’un inhibiteur de la p38 mitogen-activated protein kinase sur un modèle de douleur inflammatoire
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
186 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur injecte de la capsaïcine pour provoquer une hypersensibilité douloureuse, puis on leur administre des composés par voie intrathécale et sous-cutanée sous anesthésie, avec des tests répétés de mesure de la douleur, pour améliorer un candidat médicament antidouleur. Le porteur indique qu'il lui est impossible de soulager la douleur de ces animaux pendant l'expérience, puisque c'est précisément l'objet de l'étude. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode alternative n'existe et que l'intégration de la douleur impose des études sur l'animal vivant.
Objectifs
Parmi une série de composés chimiques synthétisés par le laboratoire, nous avons identifié une molécule ayant un effet anti-allodynique à la fois très puissant et prolongé sur des modèles murins d’allodynie mécanique inflammatoire comme neuropathique. Nous voulons améliorer cet effet anti-allodynique via l’optimisation de la formule chimique du composé, pour ensuite comparer l’effet thérapeutique des nouveaux composés à notre référence. Ce projet vise a répondre à deux questions : 1. Détermination de l'effet dose du composé de référence sur l'hypersensibilité mécanique d'origine inflammatoire induite par la capsaïcine. 2. Les nouveaux composés ont-ils un effet sur l'hypersensibilité mécanique d'origine inflammatoire induite par la capsaïcine ?
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de déterminer si l'amélioration du composé améliore son effet anti-allodynique, afin d'en faire un candidat médicament pour traiter l'allodynie.
Procédures
Toutes les injections intrathécales (1 par animal d'environ 3min) et sous-cutanées (1 par animal d'environ 2min) seront pratiquées sous anesthésie générale. Les tests de mesure de la douleur en comportement sont réalisés 7 fois en 1h30.
Impact sur les animaux
Nous nous attendons au développement d’une hypersensibilité douloureuse. Cependant, puisque nous travaillons sur la douleur, il nous est impossible de soulager la douleur de ces animaux le temps de l’expérience. Les rats doivent pouvoir continuer à se mouvoir, se toiletter, exercer leurs gestes habituels. Une grille de score est mise en place afin d'évaluer le bien être des animaux au quotidien suite aux injections intratéchales et sous cutanées. Les résultats préliminaires obtenus au laboratoire ne montrent pas d'effets indésirables sur les animaux.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort car ils ne peuvent pas être utiliser dans d'autres procédures.
Remplacement
Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. Il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux aussi bien central que périphérique (fibres afférentes). Des études comportementales chez l’animal vivant sont donc nécessaires pour mettre en évidence l’installation d’une l’allodynie mécanique après injection de produit inflammatoire.
Réduction
Le nombre de 6 rats /groupe pour les études comportementales est d’après nos données antérieures au sein du laboratoire le minimum requis pour discriminer un effet statistique significatif. Les données sont traitées selon les données de la littérature. Pour chaque procédure, nous allons adapter notre approche statistique aux données obtenues afin d'obtenir des résultats statistiquement fiables et pertinents avec une puissance d’analyse d’au moins 70%. D’abord, un test de significativité sera réalisé afin de déterminer si les données suivent une distribution normale, puis un test d’égalité des variances avant de confronter les valeurs avec un test paramétrique. Dans le cas où le test de normalité soit significatif ou les variances ne puissent pas être considérées égales, nous allons donc utiliser des tests non paramétriques. La significativité sera définie pour une valeur de p≤0,05.
Raffinement
Préalablement à toutes études comportementales, les animaux sont (i) hébergés dans des cages à environnement enrichi dans notre animalerie, pendant une semaine, et (ii) soumis à des séances d’habituation, pendant 4 jours, afin de diminuer le stress lié au nouvel environnement et à la manipulation par l’expérimentateur. Pour les injections, systémiques, locales ou sous-cutanées, les rats sont préalablement anesthésiés. L’anesthésie adéquate des animaux est confirmée par l’absence de réflexe de retrait de la patte en réponse à un pincement de la patte postérieure. De plus, en cas d’injection d’un produit inflammatoire , le suivi post-opératoire, avec un examen minutieux de la zone d’injection, est poursuivi dans les jours suivants. L'état général de l'animal est surveillé tous les jours avec contrôle du poids. Les points limites des animaux sont identifées par une liste définie.
Choix des espèces
La souche Sprague-Dawley est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années. C’est par ailleurs un bon modèle pour les études comportementales. Les animaux utilisés seront des rats adultes, par comparaison avec les autres données de la littérature.
Impact de la dynamique mitochondriale sur une infection bactérienne à Escherichia coli
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Génétiquement modifiées, elles reçoivent des injections intrapéritonéales ou une injection intraveineuse de bactéries Escherichia coli, avec prélèvements de sang, avant mise à mort pour récupérer leurs cellules immunitaires, afin d'étudier le rôle d'un gène dans l'inflammation liée à l'infection. Le porteur indique attendre une inflammation systémique accompagnée de douleurs légères à modérées environ une semaine après l'injection. Sur le remplacement, il décrit des résultats obtenus in vitro sur cultures de cellules, mais juge la vérification in vivo chez la souris nécessaire.
Objectifs
Les maladies infectieuses représentent un enjeu majeur en santé publique. Nous choisissons d’étudier l’impact d’une infection à Escherichia coli (E.coli), une bactérie connue pour augmenter la sévérité de l’infection et engendrer des septicémies dans le cas où l’infection est mal traitée, traitée tardivement ou en cas de résistance aux antibiotiques. Sans traitement, la plupart des personnes qui souffrent de septicémie meurent. L’infection à E.Coli peut également induire d’autres conséquences moins graves tels que des infections urinaires ou des péritonites, constituant un état inflammatoire souvent non traité malgré l’utilisation d’antibiotique limitant le développement des bactéries mais pas les conséquences de l’infection. Il est donc nécessaire de mettre au point des traitements innovants pour lutter contre l’inflammation successives à l’infection. Pour cela, une meilleure connaissance du dialogue entre les bactéries et l’hôte qu’elles infectent est indispensable pour l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour une meilleure prévention et prise en charge. Nous avons récemment identifié un gène d’intérêt impliqué dans la dynamique jouer un rôle anti-inflammatoires dans des macrophages murins pour lesquels ce gène a été invalidé. Notre projet vise confirmer ces résultats dans un modèle de souris chez lesquelles la fonction de notre gène d’intérêt a été sélectivement supprimé dans les cellules immunitaires.
Bénéfices attendus
Nous voulons étudier l'impact de la déficience de notre gène d’intérêt sur la dynamique infectieuse des cellules immunitaires et son lien avec les conséquences inflammatoires de l’infection bactérienne à Escherichia coli sur les organes de la souris. Ce travail pourrait permettre d’identifier de nouveaux mécanismes impliqués dans l’inflammation induite par l’infection à Escherichia coli et ainsi d’identifier un nouvel acteur participant aux conséquences pathologiques de cette infection (i.e, septicémie, infections urinaires, diarrhées ou péritonites) afin d’en limiter les effets
Procédures
Par animal, sur 120 animaux : une contention (10 secondes) afin de réaliser une injection intrapéritonéale. Les animaux seront ensuite euthanasiés 48h post-injection afin de procéder au lavage péritonéal afin de récupérer les cellules immunitaires. Par animal, sur 120 animaux : une contention (30 secondes) par animal afin de réaliser une injection intraveineuse de bactéries. Par la suite, deux contentions (1 minute) afin de réaliser les prélèvements sanguins aux temps 6h et 24h.
Impact sur les animaux
Les nuisances expérimentales prévues sur les animaux sont celles liées : à leur manipulations/contentions qui peuvent générer du stress ou de l’anxiété ; aux douleurs légères causées par les injections intrapéritonéales ; aux douleurs légères causées par les injections intraveineuses et les prélèvement sanguins. Aucun effet adverse n'est attendu pendant le croisement des souris, puisque qu’aucun phénotype n'est dommageable. Des signes pathologiques accompagnées de douleurs légères à modérées sont généralement attendus beaucoup plus tard (i.e, après une semaine) correspondant à une inflammation systémique.
Devenir
L‘ensemble des animaux des deux procédures seront euthanasiés afin de pouvoir prélever les cellules immunitaires et certains organes pour quantification et analyses et pour la réalisation d‘expérimentations moléculaires et cellulaires in- vitro.
Remplacement
L’absence d’un gène d’intérêt impliqué dans la dynamique infectieuse des cellules immunitaires a récemment été identifié dans un modèle d’invertébrés suggérant un rôle anti-inflammatoires en réponse à une infection bactérienne. Des expériences réalisées in vitro ont confirmé le rôle anti-inflammatoire de ce gène d’intérêt lors de la stimulation de cultures de cellules immunitaires de souris qui démontrent une meilleure capacité d’élimination des bactéries. Ces expérience suggèrent que l’invalidation du gène d’intérêt identifié pourrait permettre de lutter contre les conséquences pathologiques d’une infection bactérienne. Il convient maintenant de vérifier ces données in vivo chez la souris dans un contexte d’infection bactérienne intégrant les interactions multi-organes.
Réduction
Notre approche statistique garantit l’obtention de résultats exploitables avec le plus petit nombre d’animaux possible grâce à l’expertise et aux précèdent résultats de l’équipe infectieux du centre. Pour obtenir une puissance statistique suffisante par un test ANOVA ou de Student bilatérale entre les groupes, nous avons déterminé que 15 souris par groupe et par sexe seraient nécessaires ; cette estimation a été calculée grâce à un logiciel de biostatistique.
Raffinement
Pour répondre au raffinement, l'hébergement sera réalisé dans des locaux appropriés avec un enrichissement systématique et les personnes réalisant les différentes procédures respecteront les règles éthiques lors des manipulations et sacrifices des animaux. La surveillance quotidienne des animaux par les animaliers et nos surveillances régulières nous permettront d'identifier précocement tout signe de stress ou de souffrance afin d'appliquer les points limites en particulier lors des deux procédures sur des temps courts (24h-72h). Cinq paramètres seront étudiés : perte de poids mesurée au moment de chaque injection et/ou prélèvements, apparence physique, comportement, comportement dû à l’injection et/ou au prélèvement et état des sites d’injection et de prélèvement lors de cette procédure. La perte de poids sera mesurée toutes les 48h par rapport au poids de la souris avant injection. Concernant les points limites, un niveau trop élevé de douleur, par rapport aux scores, conduira à l’euthanasie de l’animal. Dans le cas où des signes de mal-être ne nécessitant pas d'euthanasie s’accumulent, tels qu’une perte de poids >20% (par rapport au poids initial), des égratignures, une agitation et des irritations cutanées, une prise en charge de chaque point individuellement sera réalisé (telle que la désinfection avec de la vétédine) et les souris seront suivies régulièrement sur 24h pour déterminer si leur état est temporaire ou les prémices d’un score supérieur.
Choix des espèces
Nous avons choisi le modèle souris car : 1) c’est un modèle largement reconnu dans la communauté scientifique pour sa pertinence dans l’analyse des réponses inflammatoires aux infection bactériennes 2) Les techniques de modifications génétiques ciblées disponibles chez la souris permettent de mettre en évidence l'implication de certains gènes dans des mécanisme physiopathologiques au sein de population cellulaire spécifiques. Les animaux utilisés seront des animaux adultes de 8 à 20 semaines dont le système immunitaire est mature.
Evaluation de l’effet thérapeutique de nouveaux traitements dans des modèles de sclérodermie chez la souris ou le rat.
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
Rats : 3120
12 480 souris et 3 120 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. On leur induit une fibrose de la peau et des poumons, avec pose chirurgicale de pompes, injections intradermiques et administrations intranasales ou oropharyngées, pour cribler l'efficacité de nouvelles molécules contre la sclérodermie. Le porteur indique que la fibrose se développe sans autre effet indésirable attendu et fixe la mise à mort à un score de souffrance déterminé. Sur le remplacement, il affirme qu'il est "indispensable" d'examiner l'"animal entier" et que ces essais ne peuvent être reproduits sur cellules, pour un total de 15 600 animaux.
Objectifs
La sclérodermie systémique (SSc, systemic sclerosis) est une maladie systémique du tissu conjonctif. Elle est caractérisée par des lésions de fibrose cutanée et/ou viscérale, une atteinte microvasculaire et une réponse immunitaire activée et dérégulée. La SSc est une pathologie rare, sa prévalence varie de 30 à 240 cas par million d’habitants. Cette maladie touche essentiellement les femmes (4 femmes pour 1 homme environ), et se déclare généralement entre 45 et 60 ans. La SSc est associée à une surmortalité significative. Le pronostic dépend essentiellement de la survenue d’atteintes viscérales et plus particulièrement d’une pneumopathie infiltrante diffuse (PID) parfois sévère, d’une hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) ou d’une atteinte cardiaque primitive, qui représentent les 3 premières causes de mortalité au cours de la SSc. C’est une maladie multifactorielle qui implique des facteurs environnementaux et un fond génétique de susceptibilité. Actuellement, aucun traitement curatif n’est disponible sur le marché mais une prise en charge adaptée permet seulement d’atténuer les symptômes. Il est donc nécessaire de trouver de nouvelles molécules efficaces. C’est dans ce contexte que s’inscrit ce projet, le but étant d’étudier l’effet de nouveaux traitements potentiels contre la sclérodermie. Le projet inclus un screening de nouvelles molécules, une étude si besoin de leur mécanisme d’action et évaluation des meilleurs candidats avant une éventuelle utilisation en clinique. Ainsi, ces études permettront de trouver potentiellement un médicament contre la sclérodermie. Dans le cadre de nos programmes de maturation, nous développons au stade pré-clinique des nouvelles molécules pharmaceutiques ou des molécules en repositionnement. Pour chaque nouvelle molécule intégrée dans notre pipeline, des études de toxicologie (in vitro et/ou in vivo), de pharmacocinétique et d’efficacité seront entreprises. Cette demande d’éthique concerne les études d’efficacité dans le contexte de l’sclérodermie avec la mise en place de différents modèles animaux de fibrose cutanée et pulmonaire chez la souris ou le rat. L’objectif est d’étudier l’effet de nouveaux traitements potentiels ou de molécules en repositionnement sur la fibrose et l’inflammation dans des modèles animaux mimant les symptômes de la sclérodermie diffusée chez l’homme.
Bénéfices attendus
Ce projet en général se focalise sur l’étude et la validation, dans un contexte physiopathologique pertinent, de l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques ou de molécules déjà approuvées pour une autre indication pouvant avoir un effet dans des maladie chronique fibrotiques. Les retombées attendues incluent le screening in vivo de molécules efficaces, l’étude si besoin de leur mécanisme d’action et l’évaluation des meilleurs candidats avant une éventuelle utilisation en clinique chez l’homme. Ainsi, nos études permettront de trouver potentiellement des médicaments dont les effets seraient supérieurs aux molécules de référence déjà existantes, qui soulageraient à la fois les symptômes de la fibrose et l’inflammation.
Procédures
Tous les animaux de la procédure 6 (sauf le groupe 1, opéré à blanc) subiront une chirurgie pour incorporer les pompes osmotiques. La chirurgie de 20-45minutes aura lieu au jour 0 sur animal anesthésié et analgésié. Tous les animaux de la procédure 1et 2 subiront des injections intradermiques, les animaux de la procédure 3 et 4 subiront des administrations intranasale et oropharyngée (sauf le groupe 1, sérum physiologique) et les animaux de la procédure 5 sauf le groupe 1, avec du véhicule) subiront des injections sous-cutanées et intramusculaires. Les traitements pourront être administrés avant, pendant ou après l'induction du modèle. Selon la molécule, la voie d'administration pourra être par voie intra-veineuse, intra-péritonéale, sous la peau, par voie orale (sur animal vigile). Tous les animaux recevront un véhicule, un traitement à tester ou une molécule de référence. Le nombre d'administration dépendra de la molécule et de la voie d'administration considérée. Cela pourra être une fois par semaine jusqu'à une à deux fois par jour. En amont des études in vivo, la toxicité potentielle des molécules testées et du véhicule aura été testée in vitro. Dans le cas où les molécules d’intérêt ne sont pas des molécules déjà sur le marché pour d’autres indications, des études de toxicologie in vivo pourront être entreprises afin de travailler avec des doses non toxiques.
Impact sur les animaux
Du fait de l'induction des modèles, les animaux vont développer de la fibrose cutanée et pulmonaire, et l’inflammation sans autre effet indésirable attendu. Nous n’attendons pas de nuisance liée à l’administration des traitements (doses non toxiques).
Devenir
Euthanasie pour récupérer différents organes, dont les articulations, pour analyses histologiques ou autre.
Remplacement
L’étude de l’efficacité de nouvelles molécules pouvant agir sur la fibrose et l’inflammation implique de disposer de modèles animaux adéquats mimant au mieux la pathologie humaine. Bien que des expériences in vitro seront réalisées en amont, l’espèce rat ou souris à travers nos différents modèles reproduisent au mieux la pathophysiologie de fibrose humaine. Nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Pour vérifier et déterminer l’effet d’un traitement sur la réponse à la fibrose et l’inflammation et structure des organes viscéraux, il est essentiel d’examiner l’animal entier. Il est indispensable car ne peut être reproduit en cellule.
Réduction
Pour nos expérimentations, nous avons prévu le nombre nécessaire et suffisant d’animaux, pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats et pour avoir le nombre de contrôles internes suffisant, afin de pouvoir conclure sur l’efficacité du traitement. Le traitement des données entrainera la comparaison de 7 groupes de 6-12 animaux pour chaque étude. Une analyse statistique appropriée sera réalisée par un test non paramétrique (Mann Whitney test) ou une analyse de variance (ANOVA).
Raffinement
Toutes les procédures induisant une douleur seront réalisées sous anesthésie (chirurgie, administrations oropharyngée) durant toute la procédure expérimentale afin de maitriser et limiter la douleur et la souffrance des animaux. L’anesthésie sera induite par induction à l’isoflurane (et maintien au masque). Les procédures de chirurgie seront effectuées par une personne habilitée et formée. Toutefois, pour les modèles d’induction de fibrose pulmonaire par la chirurgie, les animaux recevront un analgésique sera administré en phase pré- et post-opératoire. Les animaux seront également sous surveillance rapprochée. Les animaux seront suivis quotidiennement pendant les 10-15 premiers jours qui suivent l’induction puis de façon bi-hebdomadaire ensuite pour pouvoir identifier les signes de souffrance caractérisés par le comportement du rat ou de la souris : les changements physiques (pelage, peau, yeux…), la mobilité, l’alimentation, l’agressivité, le poids du corps (mesuré 2 fois par semaine) limité à une perte de 20% maximum par rapport au poids initial, la consistance des fèces et la réponse respiratoire. Nous avons mis en place un tableau de suivi qui permet de définir les points limites adaptés Si le score total d’un animal, toutes catégories confondues, au cours de l’étude est >6 ou bien si le score dans une seule catégorie est 3, l’animal est euthanasié pour raisons éthiques.
Choix des espèces
La souris et le rat sont des modèles d’étude très développés et caractérisés, de par leurs tailles et leurs spécificités. Ce sont des espèces communément utilisées pour les études de fibrose cutanée et pulmonaire en accord avec les recommandations internationales et la littérature. Notamment la souche de souris C57Bl/6 est un modèle de laboratoire bien connu avec suffisamment de données historiques. Cependant, il est envisageable d’utiliser d’autres souches de souris comme les BALB/C ou des rats comme la souche de rat Sprague Dawley qui est également un modèle de laboratoire bien connus. Chez la souris, la souche C57Bl/6 représente la souche de choix pour ces études mais d’autres souches pourront également être utilisées dépendant de leurs susceptibilités à l’induction de la pathologie en fonction du modèle Le choix de l’espèce utilisée dépendra en particulier des objectifs et besoins de l’étude. Si une molécule s’avère efficace dans une espèce, celle-ci pourra être éventuellement testée dans l’autre espèce afin de montrer une efficacité espèces indépendante. Les rats ou souris seront âgés de 6-19 semaines au début de l’étude selon le type ou le stade de progression de la maladie sur des patients atteints de sclérodermie (Sclérodermie juvénile ou sclérodermie sur des patients adultes).
Comparaison de l’efficacité de plusieurs vecteurs AAV en fonction de la voie d’administration dans le cadre de la mise en place d’une approche de thérapie génique dans un modèle murin de la maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles nerveux
482 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Modèles de la maladie d'Alzheimer, elles reçoivent une injection de vecteurs viraux par voie intraveineuse ou directement dans le cerveau par stéréotaxie sous anesthésie prolongée, passent des tests de mémoire, puis subissent des prélèvements de sang et de liquide céphalorachidien avant mise à mort. Le porteur indique des risques de saignement lors de la craniotomie, de traumatisme lié à l'aiguille dans le cerveau et d'infection oculaire après injection rétro-orbitaire. La retombée annoncée, remplacer l'injection intracérébrale par une voie intraveineuse chez les patients, reste renvoyée aux étapes précliniques à venir.
Objectifs
A l’heure actuelle, aucun traitement ne permet de stopper ou ralentir les maladies neurodégénératives. Notre objectif est de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le cadre de la thérapie génique, consistant à introduire du matériel génétique (ADN) dans des cellules du cerveau afin de limiter la progression de la maladie. Cette approche s’est révélée efficace dans un modèle de souris de la maladie d'Alzheimer (MA). Des preuves de concepts ont été établies par des injections intracérébrales (directement dans le cerveau) d’un virus modifié permettant de délivrer l’ADN au coeur même des cellules. Notre but étant de développer ces applications en clinique, l’administration intracérébrale peut induire des risques additionnels dans un cerveau déjà en dégénérescence et atrophié par la maladie chez les patients. Dans ce projet nous avons développé des nouveaux virus modifiés de façon à les rendre plus efficaces à passer la barrière protégeant le cerveau (la barrière hématoencéphalique) après une injection intraveineuse et ainsi permettre d’atteindre les cellules du cerveau. Le but est de prévenir une approche invasive d'injection intracérébrale en la remplaçant par une injection intraveineuse chez un modèle de souris de la maladie MA. Notre objectif est donc de comparer l’efficacité thérapeutique de virus administrés soit par une injection intraveineuse, soit par une injection intracérébrale. L’objectif final est de poursuivre toutes les étapes précliniques permettant de proposer cette approche thérapeutique chez les patients atteints de la MA..
Bénéfices attendus
Le bénéfice recherché est de remplacer la voie intracérébrale (connue pour être efficace chez la souris) par l’administration intraveineuse de vecteurs AAV (virus adeno-associé) induisant l'expression de la protéine X, afin de pouvoir l’appliquer à l’Homme, et plus précisément chez les patients atteints de maladies neurodégénératives.
Procédures
Les animaux modèles de la maladie d’Alzheimer avec signes cliniques dommageables seront utilisés. Les couples reproducteurs commerciaux seront utilisés. Les animaux seront injectés une seule fois : soit par voie intraveineuse (5 minutes d’anesthésie gazeuse), ou par voie intracérébrale (70 minutes sous anesthésie gazeuse après injection d'un anti-douleur, injection stéréotaxique). Deux tests comportementaux permettent de mesurer l’alternance spontanée, l’apprentissage et la mémoire des souris (selon le test, 1 session d’une journée ou des sessions d’entraînement de 4 à 8 jours avec un test effectué en une journée juste après la session d’entraînement ou jusqu’à 72h après) seront effectués afin d’évaluer les déficits cognitifs. Puis le jour d'euthanasie, un prélèvement du liquide céphalo-rachidien (20 minutes sous anesthésie) et sanguin (1 minute) sera réalisé sous anesthésie avant d'appliquer une méthode d'euthanasie réglementaire (après injection d’un anti-douleur). Plusieurs injections sous-cutanées d’analgésiques (anti-douleur) seront effectuées lorsque nécessaire.
Impact sur les animaux
Parmi les effets indésirable s attendus sur les animaux nous pouvons noter les éléments suivants : 1) Une douleur peut survenir lors la mise en barre d’oreille des animaux, 2) Un risque de saignement peut avoir lieu au moment de la craniotomie. 3) Un risque de traumatisme mécanique locale relativement faible peut être également être observé suite l’injection de l’aiguille dans le cerveau des souris. 4) Un risque anesthésique pouvant entrainer des séquelles chez l’animal. 5) Un risque d’infection oculaire peut-être observé après les injections intra-veineuses en retro orbitale. 6) Une perte de poids dûe à l’injection d'AAV (virus adeno-associé) pourrait être observée (5 à 7% du poids de référence total de l’animal, selon nos précédentes études),7) le stress engendré par les test comportementaux et un risque d’hypothermie.
Devenir
Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem, impliquant donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux. Ceux-ci seront euthanasiés à la fin des actes prévus que ce soit à l’issu des procédures (avec prélèvement pour analyse) ou pour l’élevage (à la fin de la période reproductive, sans prélèvement).
Remplacement
Remplacement: Le recours aux modèles animaux est essentiel, car aucun type de culture cellulaire ou système synthétique ne permet à ce jour de reproduire la complexité architecturale des cellules du cerveau en particulier leurs interactions structurelles et fonctionnelles. Les animaux utilisés dans le cadre de ce projet sont nés et élevés en captivité dans des élevages agrées.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est optimisé pour obtenir des résultats statistiquement pertinents. Leur nombre (482) a été restreint au minimum indispensable de façon à obtenir des données nécessaires pour valider l’efficacité d’une stratégie thérapeutique innovante qui peut être considérée comme cible dans plusieurs maladies neurodégénératives.
Raffinement
Les protocoles d’anesthésie et d’analgésie ont été définis et validés par une équipe vétérinaire. De plus, en cas d’observation de la moindre douleur, les souris recevront un traitement analgésique et si cette douleur devait persister, les animaux seraient euthanasiés pour éviter toute souffrance. La douleur/souffrance des rongeurs utilisés dans cette étude sera diminuée par l’injection locale d’anesthésique et par protocole analgésique pour les procédures chirurgicales. L’expérimentateur surveille la respiration de la souris et adapte si besoin l’analgésie et le dosage de l’anesthésique. Les animaux reçoivent un traitement analgésique approprié selon le geste chirurgical. Un gel ophtalmique sera appliqué immédiatement après l'injection sur les yeux de l'animal. Une surveillance particulière de l’oeil sera faite en post opératoire pour vérifier l’absence d’infection oculaire. L'applicateur est formé au geste d'injection intraveineuse. L’anesthésie générale sera assurée par une anesthésie gazeuse. Le respect des points limites en élevage/utilisation, et le suivi quotidien des animaux hébergés en groupe contribuent au bien-être des animaux. Le suivi est renforcé la semaine suivant la chirurgie puis celui-ci est ensuite allégé a 1 fois par semaine sauf à l’approche de points limites qui auront été définis préalablement. De plus, les tests comportementaux étant réalisés de façon hebdomadaire sur plusieurs jours, favorisent un suivi renforcé et une habituation des souris à la salle et à l’utilisateur. Un environnement enrichi constitué d’un nestlet pour la fabrication du nid et d'un igloo sera ajouté dans chaque cage. Les animaux seront hébergés en groupe.
Choix des espèces
Afin de tester différentes approches thérapeutiques pour traiter les différentes maladies neurodégénératives, il est nécessaire de disposer d'animaux modèle. A ce jour, seules les souris transgéniques pour la maladie d'Alzheimer permettent de mimer fidèlement la pathologie. C’est pourquoi nous les utilisons dans des études d’efficacité de nouvelles cibles thérapeutiques, comme l'évaluation de la surexpression de la protéine X. Dans ce projet des animaux adultes (entre 6 et 12 mois) seront utilisés. Chez ce modèle murin, les défauts neuropathologiques apparaissent dès 4-6 mois puis ces défauts progressent ensuite de manière exponentielle. Nous réaliserons les injections intracérébrales ou intraveineuses chez les souris adultes afin de comparer les effets du traitement sur la neuropathologie et le comportement en fonction des deux voies d’administration.
Etude de l’influence des maladies parodontales sur les pathologies neurodégénératives dans des modèles expérimentaux de Maladie d’Alzheimer, tauopathies et d’inflammation systémique liée à l’HLA-B27
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Rats : 600
1 032 souris et 600 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur induit une parodontite par ligature ou injections répétées dans la gencive, certains subissant une chirurgie stéréotaxique avec injections intracérébrales, un hébergement isolé en cage métabolique et des prélèvements de sang et de liquide céphalorachidien, pour tester le lien entre infection buccale et maladies neurodégénératives. Le porteur indique n'attendre qu'un inconfort léger et des saignements gingivaux, sans effet secondaire notable. Sur le remplacement, il affirme que l'usage d'animaux vivants revêt un caractère de "stricte nécessité" et que ces évaluations ne peuvent se faire sans modèle animal.
Objectifs
Les maladies neurodégénératives regroupent un ensemble de pathologies affectant le système nerveux, dont la plus prévalente est la maladie d’Alzheimer (MA) faisant partie des tauopathies. Dans les tauopathies, la protéine Tau est hyperphosphorylée et présente un repliement anormal, provoquant une perte de sa fonction physiologique et un gain de fonction toxique. La protéine Tau anormale est délocalisée vers le soma puis les dendrites où elle s’accumule, générant une dysfonction synaptique. Ces dernières années, est apparue l’hypothèse qu’une inflammation, progressive et auto-entretenue, du système nerveux central (SNC), peut constituer un terrain favorable à une neurodégénérescence. Les infections périphériques, en agissant sur les processus neuro-inflammatoires, contribueraient au déclenchement et/ou à l’évolution péjorative de ces pathologies. Les parodontites, pathologies buccales infectieuses figurant parmi les affections humaines les plus fréquentes, sont caractérisées par des lésions inflammatoires chroniques des tissus de soutien des dents. Elles sont reconnues comme associées à la progression négatives de diverses pathologies systémiques dont les pathologies neurodégénératives. Cependant le schéma spatio-temporel pouvant lier tauopathies et pathologie infectieuse/inflammatoire périphérique comme la parodontite est encore mal connu. Dans ce contexte général, notre projet vise a investiguer de manière large le schéma spatio-temporel liant infections et inflammation périphériques, neuroinflammation et tauopathie pour mieux définir dans quelle mesure l’immunité innée/adaptative dans le système nerveux central (SNC) mais également les processus immunitaires périphériques sont impliqués dans le développement de la tauopathie. Notre hypothèse est que les infections et/ou inflammations périphériques aggravent voire induisent les signes biologiques et cliniques des tauopathies.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont l’obtention de données satisfaisantes permettant : - D’identifier les conséquences d’une infection périphérique buccale ou d’une inflammation systémique sur l’initiation ou la progression des tauopathies. - D’élucider des voies mécanistiques liant les tauopathies et les parodontites afin de mettre en évidence des cibles thérapeutiques ou des marqueurs diagnostiques. En effet, l’induction d’une parodontite expérimentale sur un terrain avéré de prédisposition à une pathologie neurodégénérative permettra de vérifier le rôle potentiel de la parodontite dans l’exacerbation, l’entretien voire le déclenchement de la neuroinflammation et de la neurodégénérescence chez un individu susceptible. Si la parodontite est un facteur aggravant les tauopathies, alors cliniquement les patients atteints de tauopathies devraient bénéficier d’un examen parodontal et d’une prise en charge parodontale en cas de pathologie détectée. Les données que nous obtiendrons avec ce projet sont importantes pour améliorer à moyen terme la prise en charge globale des patients atteints de tauopathies dont la maladie d’Alzheimer et à long terme la santé orale de ces patients. D’autre part, l’induction d’une parodontite expérimentale chez un animal sans prédisposition permettra de vérifier le rôle potentiel de la parodontite dans l’induction de la neuroinflammation et de la neurodégénérescence. Si ce rôle est vérifié, alors cliniquement les patients atteints de parodontite pourrait faire l’objet de dépistage de troubles cognitifs de manière préventive. Il serait alors interessant de pousser la recherche vers des études cliniques en fonction des stades et grades de la parodontite pour déterminer si une catégorie de patient atteint de parodontite serait plus à risque (parodontite sévère de stade III ou IV, à progression rapide grade C par exemple). Compte tenu de la charge mondiale des troubles du déclin cognitif due aux changements démographiques, la recherche et l’identification de facteurs de risque potentiellement modifiables de tauopathies comme proposé dans notre projet fait partie intégrante des efforts de recherche multidisciplinaires. De plus, l’emploi de différents modèles dans notre projet, devrait permettre d’identifier le modèle le plus optimal pour l’analyse des mécanismes et du schéma spatio-temporel des liens entre pathologies neurodégénératives et parodontite et donc raffiner la modélisation pour les études futures.
Procédures
Ce projet comporte 2 procédures chirurgicales (induction de la parodontite, injection par stéréotaxie). L’induction de la parodontite se fera par 2 techniques différentes, l’une nécessitant une seule intervention et un suivi pendant 4 semaines, l’autre nécessitant des injections répétées trois fois par semaine pendant 24 jours. L’emploi de ces deux techniques permet de reproduire des aspects différents de la parodontite (évolution lente ou évolution rapide) pour des groupes d’animaux différents. Pendant cette période, 540 rongeurs bénéficieront d’un suivi à l’aide de cages métaboliques où les animaux seront hébergés seuls afin de déterminer leur balance énergétique. Pour ces deux techniques il sera attendu 10 jours avant de placer les animaux dans les cages métaboliques et une période d’acclimatation d’au moins 48 heures avec de la litière identique à leur cage d’hébergement et dans un espace suffisant au regard de leur poids. La stéréotaxie sera effectuée une seule fois avec pose de canule permettant des injections intracérébrales une fois par jour pendant 6 jours. L’intégralité des animaux seront suivis d’un point de vue comportemental ayant pour objectif de tester les capacités cognitives des animaux. Au cours des deux procédures, des prélèvements sanguins seront effectués une fois par semaine et juste avant la mise à mort sur animaux vigiles pour lesquels la douleur sera prévenue par application d’un anesthésique local. Au cours de la procédure faisant appel à la stéréotaxie, du liquide céphalo-rachidien sera prélevé une fois sur les animaux anesthésiés, avant leur mise à mort.
Impact sur les animaux
Les procédures chirugicales (induction de parodontite, perfusion ou stéréotaxie) seront réalisées sous anesthésie et analgésie. Le suivi post-opératoire sera réalisé par du personnel formé au bien-être animal. Les procédures comme la stéréotaxie ou la pose de perfusion sont des procédures courantes dans le laboratoire. Les conséquences attendues sont minimes sur le bien-être animal. Aucun effet secondaire n'est attendu sur les animaux du fait de l’induction de la parodontite. Les procédures exécutées ne provoqueront qu'un inconfort léger (pose d'une ligature à la base d'une dent, et injections dans la gencive). Une absence de perte de poids consécutive à la pose de ligature est attendue comme dans une étude précédente. Les injections au niveau gingival peuvent entrainer des saignements au point d’injection sans nuisance sur le comportement de l’animal. Les injections seront effectuées de manière lente pour éviter l’apparition de grosseurs/nodules au niveau de la gencive. Dans le cas où certains animaux rencontreraient tout de même des difficultés à l’alimentation, de la nourriture en gel sera mise en place.
Devenir
A l'issue des procédures (P1) et (P2), tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour permettre des analyses des tissus parodontaux et cérébraux.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’évaluer différents aspects de la physiopathologie des tauopathies en lien avec les performances cognitives et des pathologies induites au niveau périphérique. L'utilisation d'animaux vivants revêt donc un caractère de stricte nécessité. En effet, nos travaux visent à mettre en lien les atteintes périphériques infectieuses et inflammatoires avec des altérations comportementales, histologiques, biochimiques et moléculaires neuronaux et d’en étudier les facteurs modulateurs au cours du vieillissement. Cela nécessite donc le développement d’approches neurobiologiques intégrées. De plus les modèles expérimentaux sont largement utilisés pour vérifier les hypothèses biologiques de la relation entre la parodontite et d’autres maladies systémiques pour permettre le contrôle de facteurs étiologiques supposés. Ces évaluations particulières ne peuvent pas être réalisées en utilisant des alternatives aux modèles animaux.
Réduction
Le nombre total d’animaux concernant les procédures de notre protocole sur les 5 ans à venir est donc estimé à 1632 (1032 souris et 600 rats). Cette utilisation maximise les données obtenues de chaque animal, ce qui peut limiter ou éviter l'utilisation subséquente d'animaux supplémentaires, et ce, sans pour autant compromettre le bien-être animal. Pour chacun des groupes constitués, le nombre d'animaux a été réduit au maximum tout en permettant l'obtention de résultats satisfaisant (différences statistiquement observables). Pour limiter le nombre d’animaux, une réutilisation des animaux des animaleries employés pour la formation sera effectuée pour la mise au point des modèles de parodontite. Un calcul du nombre d’animaux total nécessaire par groupe a été effectué pour respecter le principe des 3R. De plus les animaux seront utilisés pour plusieurs interventions au sein des procédures expérimentales afin de réduire leur nombre. Pour l’étude statistique, une comparaison des groupes d’animaux deux à deux entre les animaux contrôles et les animaux tests sera effectuée.
Raffinement
Les animaux seront observés tous les jours, et pesés au moins 1 fois par semaine, par du personnel spécialement formé. Durant l'étude, tout sera mis en œuvre pour minimiser le stress auquel les animaux sont soumis. Les animaux seront hébergés en groupe, et des éléments d'enrichissement du milieu seront mis à disposition: blocs à ronger pour les rats, coton pour la confection de nids... Les animaux seront suivis précisément pour chaque protocole, pour lesquels des points limites adaptés ont été définis. Toute souffrance, angoisse ou comportement inhabituel sera pris en charge par des approches appropriées. Les procédures expérimentales de chirurgies seront réalisées, après une prémédication analgésique, sous anesthésie générale par voie intrapéritonéale. En cas de douleur, un analgésique complémentaire sera administré. Les animaux présentant un des points limites spécifiés pour chaque approche expérimentale seront sacrifiés dans une salle dédiée; le tout en lien avec le responsable du bien être animal.
Choix des espèces
Ces espèces sont utilisées parce que rats et souris peuvent être évalués par des méthodes comportementales et être génétiquement modifiés par injections de vecteurs viraux ou transgénèse. Les souris transgéniques utilisées dans notre protocole reproduisent un certain nombre d’altérations retrouvées dans la Maladie d’Alzheimer et les tauopathies (lésions amyloïdes : APP/PS1dE9, APPP KI, hyperphosphorylation/troncation, agrégation/altération d’épissage/perte de fonction de la protéine Tau : THY-Tau22, THY-Tau30, TauKO, Tau-KI, MiniTau. Le parodonte des rongeurs et notamment du rat est assez similaire à celui de l'homme notamment d’un point de vue anatomique dans la région molaire. L’avantage de ce modèle animal est aussi de pouvoir mener une étude sur des groupes homogènes et alors minimiser les effets de la variabilité biologique. Dans la plupart des expérimentations, les souris et les rats seront utilisées à l’âge adulte : entre 2 mois à 12 mois.