Rongeurs

140 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On leur injecte de la carragénine dans le genou pour déclencher une inflammation articulaire, avant d'administrer des traitements et de mesurer la douleur chaque jour, pour évaluer une nouvelle formulation antidouleur contre la goutte. Le porteur décrit un œdème, une douleur et une perte de mobilité de la patte, ainsi qu'un inconfort lié aux tests de douleur, tous les rats étant euthanasiés pour prélever les pattes. Il affirme qu'aucun procédé in vitro ou in silico ne permet d'évaluer cet effet antalgique.

Objectifs

La goutte est une pathologie articulaire fréquente qui touche plus de 17,5% des personnes âgées de plus de 75 ans. Cette affection est caractérisée par des dépôts de cristaux d’urate de sodium, de pyrophosphate de calcium ou de phosphate de calcium au sein des articulations. Ils peuvent être responsables d’inflammation articulaire aiguë récidivante. Cette inflammation est contrée par la colchicine ; mais celle-ci, utilisée par voie orale et systémique expose à des effets secondaires parfois mortels, en particulier chez des patients avec insuffisance rénale. Ainsi, il existe un réel besoin de traitement local efficace, et rapidement actif sur la douleur, qui est intense au cours d’un accès goutteux. Les études pré-cliniques sont menées principalement pour évaluer la capacité de nouveaux traitements à inhiber l’inflammation et de la destruction des articulations, et non à inhiber les paramètres de la douleur. La douleur est très rarement étudiée dans les modèles animaux d’arthrite, or c’est d’un intérêt clinique majeur pour les patients. Finalement notre objectif est de démontrer : (1) l’intérêt d’évaluer la douleur dans un modèle d’inflammation à la carraghénine, (2) l’intérêt d’une nouvelle formulation innovante utilisant une nouvelle technologie de délivrance de médicament, (3) d’établir l’effet sur la douleur de cette formulation, de la comparer et l’associer à un antalgique local.

Bénéfices attendus

La douleur dégrade très fortement la qualité de vie des patients atteints de maladie goutteuse. Dans cette maladie très inflammatoire qui altère progressivement les articulations, la douleur peut être associée à une inflammation en cours (douleur inflammatoire) ou peut survenir durant la phase chronique de la maladie, en dehors des poussées. La douleur est ressentie de façon variable par les patients au cours de la maladie. Les médicaments anti-inflammatoires sont efficaces sur l’inflammation et la douleur à condition d’être tolérés. Les médicaments actuels voient leur efficacité limitée, faute de pouvoir atteindre une concentration suffisante au sein de l'articulation inflammée. Localement, l'administration simultanée d’une préparation délivrant de façon lente et continue un anti-inflammatoire (M1) et un anesthésique local (M2), serait un progrès significatif dans la prise en charge des malades. Ce projet serait donc susceptible d’apporter la preuve de l’efficacité d’une telle approche sur la goutte et permettrait d’envisager un nouveau traitement efficace sur la douleur pour ces patients difficiles à soigner.

Procédures

Les animaux seront soumis à 2 injections intra-articulaires (Carraghénine, puis traitements) d'une durée de quelques secondes sous anesthésie gazeuse d'une durée de 3 min. Ils seront manipulés tous les jours pendant 3 jours pour les mesures de douleur et de score clinique, cette évaluation dure environ 30 min par rat. Le temps de maintien total des rats dans l'animalerie est de 2 semaines, adaptation et expérimentation incluses, puis les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire pour réaliser des prélevement d'organes et des analyses histologiques.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à des injections intra-articulaires dans le genou droit qui provoqueront un œdème, une douleur et une perte de mobilité transitoire de la patte injectée. Les tests d'évaluation de la douleur seront responsables d'un inconfort passager pour les rats (isolement pendant environ 15 minutes, stimulation des pattes jusqu'à la détection du seuil de douleur).

Devenir

Tous les animaux (150 rats) seront euthanasiés à l'issue de la procédure. Ceci permettra d'effectuer le prélèvement des pattes postérieures nécessaire à l'étude histologique complémentaire.

Remplacement

Les expériences in vivo dans ce projet sont indispensables car il n’existe pas de procédé in vitro ou in silico pour évaluer d’une part la délivrance de la drogue par un procédé nouveau utilisant des microparticules dans des conditions inflammatoires, d’autre part car l’originalité principale ici consiste à évaluer l’effet antalgique du procédé que nous étudions.

Réduction

Pour la réduction, le nombre d'animaux utilisés sera réduit au maximum afin de permettre des analyses statistiques solides. Le nombre de rats nécessaires pour cette étude de 150. La taille des groupes a été définie sur la base des études antérieures réalisées au laboratoire sur les modèles expérimentaux d'arthrite, y compris le modèle d'AIC. Nous avons également tenu également compte d'une possible perte d'animaux liée à la procédure expérimentale. Une étude préliminaire dans le genou est programmée. Elle constitue un point bloquant, pour ne pas utiliser plus d'animaux que nécessaire. A l'euthanasie, les pattes seront prélevées afin d’obtenir un maximum d’information complémentaires sur l'impact de l’arthrite et son traitement au niveau de l'articulation et limiter ainsi la répétition d'expériences.

Raffinement

Les rats seront hébergés dans des cages en plastique enrichies avec des tunnels et maintenus en groupes de 4 individus minimum afin de respecter leurs besoins sociaux. Une période d’adaptation est respectée avant le début de la procédure pour réduire le stress des animaux lié à leur transport. Des points limites destinés à limiter l'inconfort et la douleur des rats seront mis en place dans chaque expérience et tous les animaux seront pesés et leur comportement surveillé afin de veiller à leur bien-être. L’euthanasie se fera par une méthode réglementaire. Toutes les injections intra-articulaires se font sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane. Dès les premiers signes cliniques, des aliments sous forme de granulés seront placés directement dans la cage pour faciliter la prise de nourriture des rats.

Choix des espèces

Le rat a été choisi car c’est le plus petit animal chez qui il est fiable d’injecter des volumes bien définis, de l’ordre de 50 μl (moins devient problématique à préparer et à injecter) dans un site anatomique aussi précis qu’une articulation. Des rats de 250 à 300g seront utilisés, soit environ 6 à 7 semaines. Pour l’évaluation de la douleur posturale, des animaux plus gros ont tendance à s’appuyer avec leur corps et non leurs pattes sur le capteur et on perd donc l’information voulue.

500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Des souris receveuses sont irradiées puis greffées avec des cellules prélevées sur des souris donneuses tuées à cet effet, avant de recevoir des composés par de multiples voies sous anesthésie, pour tester des traitements de la maladie du greffon contre l'hôte. Le porteur décrit une perte de poids, des diarrhées, des lésions cutanées et une déshydratation, des points limites déclenchant la mise à mort, tous les animaux étant euthanasiés pour prélever organes et sang. Il affirme que les co-cultures in vitro ne modélisent pas cette maladie et que le modèle souris est "requis".

Objectifs

L’objectif de ce projet de recherche est d’identifier des composés chimiques ou biologiques pour le développement de nouveaux médicaments dans le traitement de la maladie du greffon contre l’hôte (Graft versus Host Disease, GvHD). La greffe de cellules souches sanguines est un traitement qui est proposé à des patients souffrant de cancers ou maladies du sang (leucémies, lymphomes etc…). Ce traitement consiste à injecter des cellules sanguines provenant d’un donneur sain au patient receveur dont la moelle osseuse a été partiellement ou totalement détruite. Ce transfert de cellules sanguines chez le patient receveur provoque dans 20 à 80 % des cas la maladie dite du greffon contre l’hôte (GVHD). Elle se caractérise par une réaction immunitaire des cellules du donneur envers les tissus du patient receveur. La GVHD se manifeste par deux phases distinctes appelées GVHD aigue et GVHD chronique. Lors de la GVHD aigue, les patients présentent une inflammation des muqueuses intestinales et cutanées. Ces symptômes sont également présents dans la GVHD chronique et sont alors associés à des atteintes au niveau musculaire et pulmonaire. A ce jour, il n’existe aucun traitement de la GVHD. Dans le but de modéliser cette pathologie incurable, des expériences chez le rongeur montrent que l’irradiation sublétale d’une souris recevant de la moelle osseuse provenant d’une souris donneuse provoque une réaction immunitaire caractéristique du développement de la GVHD. Les manifestations chez le rongeur sont très similaires à celles observées chez l’homme et démontrent de la pertinence de ce modèle.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’évaluer l’efficacité de nouveaux médicaments dans le traitement de la maladie du greffon contre l’hôte (Graft Versus Host Disease, GVHD), sur une période allant jusqu’à 3 mois.

Procédures

Les souris receveuses seront irradiées chez l’éleveur si nécessaire, puis recevront une administration IV de cellules de souris donneuses (euthanasiées pour récupération de cellules immunitaires dans la rate et la moelle osseuse) ou de cellules immunitaires humaines. Afin d’évaluer l’efficacité de potentiels traitements, des composés chimiques ou biologiques seront administrés aux animaux par toutes les voies possibles : intranasale et intratrachéale, sous anesthésie générale d’environ une heure; intramusculaire et intradermique sous anesthésie générale d’environ une heure avec analgésie; orale sur animaux vigiles (acte bref d’une minute environ); sous cutanée et intrapéritonéale sur animal anesthésié ou vigile (acte bref d’une minute sur animal vigile, anesthésie d’environ une heure sinon); ou par minipompe ou implant (intraveineux, sous cutanée ou intrapéritonéale) posée lors d’une chirurgie sous anesthésie générale avec analgésie au préalable (chirurgie d’environ 15 minutes, anesthésie d’environ une heure). Les volumes administrés et fréquences d’administration respecteront les recommandations. La phase in vivo pourra durer jusqu’à 3 mois. Les effets de la mise en place de maladie du greffon contre l’hôte (perte de poids, lésions cutanées, diarrhées) seront suivis à l’aide d’une grille de scoring et des points limites adaptés à l’objectif de l’étude ont été mis en place. Des prélèvements de sang ou d’urine pourront être réalisés. Les prélèvements de sang sur animal vigile prendront environ deux minutes. Pour les prélèvements individuels d’urine et/ou de fèces, il pourra être nécessaire d’héberger individuellement les animaux en cages, sans enrichissement (max une heure). En fin de projet, les animaux seront euthanasiés pour récupération des tissus, organes, et du sang.

Impact sur les animaux

Du fait de la mise en place de la maladie du greffon contre l’hôte, les animaux pourront présenter des signes cliniques : perte de poids, douleur en particulier abdominale, diarrhée, déficit de toilettage (yeux collés, poil hérissé), une déshydratation, des dépilations, des déficits moteurs). Dans le cas d’administrations par injections ou dans le cas de prélèvements sanguins, ceux-ci génèreront une douleur limitée à celle d’une piqûre d’aiguille. Dans le cas d’intervention chirurgicale (pose de minipompe, implant), une douleur modérée transitoire pourrait être générée mais sera gérée par un traitement antalgique adéquat.

Devenir

Après la procédure, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de grands volumes de sang, nécessaires pour évaluer l’effet des composés testés.

Remplacement

Les molécules chimiques ou biologiques dont l’efficacité seront évaluées dans ce projet auront été si possible au préalable sélectionnées dans des tests in vitro (toxicité et efficacité cellulaire) afin d’éviter l’administration des composés présentant un mauvais index thérapeutique. Afin d’étudier les mécanismes de réaction immunitaires induite par la greffe allogénique, il existe des systèmes de co culture permettant d’évaluer une réponse immunitaire (production d’interleukine par exemple). Cependant, ces expériences ne permettent pas de modéliser la maladie du greffon contre l’hôte dont les caractéristiques sont multiples et dont l’expression varient dans les différents organes. C’est pour cette raison que l’utilisation de ce modèle murin est requis afin de développer et d’évaluer des nouvelles molécules ou stratégies thérapeutiques pour le traitement de la maladie du greffon contre l’hôte chez l’homme. Ces données sont insuffisantes pour prédire les effets in vivo des molécules. L’efficacité réelle devra donc être vérifiée chez le rongeur.

Réduction

Sur la base des expériences passées dans notre centre, le nombre minimum permettant d’obtenir une puissance statistique suffisante pour conclure a été déterminé : 10 animaux par groupe de receveur seront utilisés. Ce nombre pourra augmenter jusqu’à 15 si nécessaire pour obtenir une puissance statistique différente, compte tenu des analyses ex-vivo prévues et de leur variabilité. Dans le cas où la bioanalyse suite aux prélèvements nécessiterait un volume trop important de fluides, le nombre d’animaux devra être augmenté, jusqu’à au maximum 15 animaux par groupe. Concernant les souris donneuses le cas échéant, il est nécessaire d’inclure entre 1 donneuse pour 2 receveuses et 1 donneuse pour 20 receveuses selon les souches de souris concernées. Dans le cas de prélèvements terminaux à différents points de temps (collecte d’organes/tissus, ex collecte de peau à plusieurs points de temps), un groupe d’animaux devra être inclus pour chaque point de temps.

Raffinement

Les animaux seront pesés tous les jours et un scoring clinique sera effectué pour évaluer la perte de poids, les signes de douleur, les signes digestifs, les signes cutanés, la déshydratation et le comportement des animaux. La grille se scoring sera raffinée suite aux premières études. Dès l’apparition de pertes de poids sur certains animaux, de la nourriture sera placée au fond de toutes les cages ainsi que de la nourriture gélifiée. En cas de déshydratation constatée sur certains animaux, de l’eau gélifiée sera placée au fond de toutes les cages et les animaux concernés seront réhydratés une (déshydratation légère) ou deux fois (déshydratation modérée ou sévère) par jour par voie sous cutanée. Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité des modèles et des procédures est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Un score de 3 dans une catégorie constituera un point limite. Un score total égal à 13 ou supérieur sera un point limite. Les autres points limites concernant l’état général de l’animal sont listés en détail dans la procédure. Dans le cas où l’administration de composé nécessite une chirurgie (implants), une analgésie, un suivi adapté et des mesures post-chirurgicales sont mises en place pour prévenir la souffrance des animaux. Il ne sera possible de réaliser qu’une pose et un retrait d’implant maximum par animal.

Choix des espèces

De nombreuses études ont utilisé et démontré la modélisation de la maladie du greffon contre l’hôte sur les souris Tout comme pour l’espèce humaine, l’irradiation suivi d’une greffe de cellules donneuses induit une réaction immunologique chez la souris receveuse. Les manifestations de la maladie du greffon contre l’hôte sont proches de celles observés chez l’homme : altération du tractus intestinal, lésions cutanées, perte de poids, état général altéré. En raison de la similarité des symptômes présent tant chez l’homme que la souris, les futures études seront entreprises chez la souris. Seuls des animaux sevrés seront utilisés (jeunes adultes et adultes, 6 semaines minimum), tel que référencé dans la littérature. Des animaux mâles et femelles seront utilisés selon le produit à évaluer. Dans la plupart des cas, lorsque le sexe de l’animal n’a pas d’influence, ce seront des femelles qui seront utilisés car elles sont moins bagarreuses. Lorsque des volumes plus importants de sang à prélever seront requis et pour limiter le nombre d’animaux à utiliser, les males pourront être priorisés du fait de leur poids plus important à âge égal.

504 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont irradiées, greffées avec des cellules leucémiques, rendues septiques par ligature-ponction du caecum, puis traitées par chimiothérapie, avec prélèvements sanguins répétés et biopsies de moelle osseuse, pour étudier l'effet du sepsis sur la leucémie. Le porteur décrit des risques d'infections, d'hémorragies, de thromboses et de douleur, des points limites déclenchant la mise à mort, tous les animaux étant ensuite euthanasiés pour prélèvement d'organes. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la complexité de la moelle osseuse et du sepsis.

Objectifs

Le sepsis est un syndrome causé par une réponse excessive et inappropriée de l’organisme à une infection. Il peut devenir particulièrement grave et causer le dysfonctionnement de nombreux organes (reins, poumons, cœur, foie...). Le sepsis est la cause la plus importante de mortalité en réanimation, malgré les nombreux progrès de prise en charge réalisés au cours des dernières années. Au cours du sepsis, on observe un changement des cellules qui constituent la surface des vaisseaux (les cellules endothéliales), qui laissent passer plus facilement des substances à travers les vaisseaux et qui modifient leurs fonctions, ainsi que la production d’une grande quantité de molécules potentiellement nocives. Ceci va induire des modifications du système de défense de l’organisme, le système immunitaire, qui est très perturbé après le sepsis et devient incapable de fonctionner correctement. Les leucémies aiguës myéloïdes (LAM) sont un type de cancer du sang. Elles sont causées par la multiplication d'une cellule au sein de la moelle osseuse qui devrait normalement aider à produire des cellules sanguines saines. Cette cellule mutée ne fonctionne plus correctement et ne peut pas produire de cellules sanguines normales. Les LAM peuvent se développer soudainement ou être précédées par des maladies pré-leucémiques. Pendant ces maladies pré-leucémiques, les cellules sanguines commencent à se multiplier de manière anormale avant de se transformer en cellules cancéreuses. La chimiothérapie est le traitement de référence des LAM et si elle est efficace dans la majorité des cas, la résistance à ce traitement et les rechutes sont fréquentes. Dans le développement et la progression de la LAM, l'endroit où les cellules cancéreuses se développent est important. Cet endroit est appelé la niche ostéomédullaire. Le sepsis, par son effet sur les cellules endothéliales et le système immunitaire, perturbe cette niche ostéomédullaire et pourrait ainsi favoriser le développement des cellules cancéreuses. Si le sepsis est une complication très fréquente au cours des LAM, son impact sur l’évolution de cette maladie hématologique n’a jamais été étudié à ce jour. L’objectif principal de nos travaux de recherche est d’étudier le rôle du sepsis sur la niche ostéomédullaire, et donc l’importance des infections graves sur la progression de la LAM ou sur l’évolution d’une maladie pré-leucémique vers une LAM.

Bénéfices attendus

Les infections graves (responsables de sepsis), sont des complications fréquentes de la LAM. L’impact du sepsis sur l’évolution de cette maladie hématologique n’a jamais été étudié à ce jour. La compréhension des mécanismes impliqués permettrait de développer des médicaments ciblant l’interaction entre cellules leucémiques et les tissus impactés par le sepsis. De plus, comprendre l’effet des infections aigues sur les cellules leucémiques, et leur environnement est essentiel dans la compréhension de la LAM et de sa réponse au traitement, et pourrait ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques dans la gestion des patients septiques ayant une LAM.

Procédures

Afin d’étudier le rôle des cellules leucémiques sur les défaillances d’organes observées au cours du sepsis, nous utiliserons 3 modèles murins de cancer du sang. Dans deux de ces modèles, nous induirons la maladie par une seule injection (durée 1 min sur souris éveillée) de cellules cancéreuses dans la veine de la queue de souris préalablement irradiées (étape de quelques minutes, non douloureuse, pendant laquelle l'exposition aux RX permet d'éliminer les cellules de la moelle osseuse et facilitant la prise de greffe des cellules injectées). Le 3ème modèle est un modèle de souris avec une modification génétique dans les cellules à l’origine des cellules du sang, qui n’entraine aucun symptôme mais qui peut évoluer au cours du temps en leucémie. Les 3 modèles, qui ont des délais d’évolution vers une leucémie différents, nous permettrons d’évaluer quand le sepsis exerce le plus d’influence sur la maladie hématologique. Nous induirons alors le sepsis (infection abdominale par chirurgie du tube digestif) dans ces différents modèles (procédure chirurgicale de 10 min sous anesthésie générale et analgésie) en réalisant une ligature et ponction d’une partie du tube digestif au niveau du caecum (partie terminale de l’intestin en forme de sac au départ du gros intestin). Les antibiotiques sont utilisés pour traiter l’infection et le sepsis causés par la procédure, en simulant ce qui est fait chez l’homme. Les antibiotiques seront administrés dans l'abdomen (injection intra-péritonéale, i.p.) 2 fois par jour pendant 72h. L’analgésie sera réalisée en ip 2 fois par jour pour au moins 72 h et l’hydratation sera réalisée en ip 2 fois par jour pour les 3 premiers jours. Un traitement de chimiothérapie sera également administré à certaines souris (injection dans la cavité abdominale, une fois par jour, d'une durée de 15s). Le suivi du développement des pathologies sera réalisé par prélèvement sanguins toutes les 2 semaines (sur souris éveillée, d'une durée de 30s) et par biopsie de la moelle osseuse (à jour 8 et 15 post-sepsis; sous anesthésie et analgésie, durée: 2 min). Nous réaliserons également un suivi par imagerie afin de visualiser comment les cellules leucémiques pénètrent dans les organes et l’interaction entre les cellules leucémiques et les cellules qui bordent les vaisseaux sanguins. Cette procédure se réalise sous anesthésie générale et analgésie et dure 30 min par souris. Elle sera réalisée 1 seule fois.

Impact sur les animaux

La procédure d’irradiation sous-létale des animaux nécessaire pour la transplantation de la leucémie ou de la maladie hématologique pré-leucémique peut rendre les animaux plus susceptibles aux infections, diarrhées et déshydratation. Les souris avec une leucémie ont un risque de diminution de leurs globules blancs ou de leurs plaquettes sanguines et en conséquence, un risque accru d’infections, ainsi que d’hémorragies. Les souris du modèle 3 sont exposées à un risque de thromboses (caillots sanguins) et de saignements. La procédure de ligature et ponction du caecum a pour but de rendre les souris septiques, elle entraine donc une infection et elle peut aussi causer déshydratation, altération de l’état général et douleurs. La chimiothérapie, traitement standard des leucémies, peut causer des diarrhées, de cytopénies (réduction des globules blancs, globules rouges et plaquettes) et sur l’état général des souris (perte de poids, modifications du pelage, réduction de l’activité spontanée etc). Les prélèvements sanguins répétés et les biopsies de moelle osseuse peuvent représenter un risque hémorragique. La biopsie de la moelle osseuse peut aussi causer de la douleur qui se prolonge quelques heures après la procédure. S’agissant d’une procédure chirurgicale, il est possible d’avoir une inflammation au niveau de la suture, ainsi qu’une éventuelle infection avec retard de cicatrisation.

Devenir

Tous les animaux inclus dans ce projet seront euthanasiés à l’issu de chaque procédure et les différents organes liés au système immunitaire seront prélevés pour analyse.

Remplacement

Il n'existe actuellement pas de modèle in vitro pertinent pour l'étude de l’interaction entre sepsis et LAM, ni pour l’étude de la transformation des maladies pré-leucémiques dans un contexte septique. La niche où les cellules leucémiques se forment est caractérisée par un environnement très complexe, au sein duquel différentes cellules interagissent et impactent la survie des cellules leucémiques. Certaines molécules libérées en grande quantité dans le plasma au cours du sepsis agissent sur le développement des cellules leucémiques. De plus, les contraintes mécaniques auxquelles la niche est exposée et les niveaux d’oxygénation différents au sein de la moelle osseuse, ont un impact important sur l’évolution des cellules leucémiques. Pour le moment, nous n’avons pas la capacité de reproduire cette complexité in vitro. D’autre part, la reproduction d’un sepsis in vitro n’est pas possible. Les modifications du système immunitaire et l’invasion des tissus par les acteurs de l’inflammation, ainsi que la défaillance des différents organes pendant un sepsis ne peuvent pas être représentés de façon complète et exhaustive sans le recours à un modèle animal.

Réduction

Afin de réduire au minimum le nombre d’animaux et d’éviter la répétition inutile de procédures expérimentales (prélèvement d’organes et biopsies de la moelle osseuse), plusieurs analyses différentes seront réalisées sur les mêmes animaux. Nous utiliserons des tests statistiques appropriés pour étudier la significativité des résultats obtenus en utilisant le moins d’animaux possible. Si la significativité est rapidement atteinte, une diminution du nombre de souris nécessaires sera donc obtenue.

Raffinement

Les souris auront des conditions d’hébergement adéquates au sein de l’animalerie, avec portoir ventilé et des éléments d’enrichissement adaptés (papier kraft et buchette en bois). Les souris auront accès illimité aux boissons et aux croquettes. Les souris du modèle 3 sont caractérisées par une viscosité sanguine élevée et un risque de thrombose et de souffrance. Pour éviter ces phénomènes, des saignées (prélèvements de sang) suivies par l’injection de sérum physiologique en intrapéritonéal seront réalisées de façon systématique. Les souris seront observées après le traitement par chimiothérapie et réhydratées ou traités par des antidouleurs si nécessaire. Après toutes procédures douloureuses et toutes procédures chirurgicales, une analgésie sera mise en place. Les souris septiques, recevront l’administration d’une antibiothérapie à large spectre après l’induction du sepsis et l’hydratation, ainsi que l’analgésie per et post-procédure. Les souris leucémiques seront surveillées au moins quotidiennement et un suivi clinique sera réalisé au minimum 2 fois par semaine à l’aide d’un score (grille de signes cliniques prenant en compte l’apparence physique, le comportement des animaux, la respiration et l’aspect de la cicatrice), dans les 3 modèles. Les souris seront traitées par antidouleurs si des signes de douleurs sont détectés (comme démangeaisons ou grattage important, déplacement anormal, respiration anormale), réhydratation et avec des antibiotiques. Nous avons défini des points limites faisant office de critères d’arrêt conduisant à l’euthanasie des animaux, lorsqu’ils sont atteints.

Choix des espèces

La souris est un petit mammifère, dont la génétique et le comportement sont parfaitement connus. La souris est aussi l’animal le plus utilisé dans les modèles de leucémie et de sepsis. Les souris sont à l’origine d’un grand nombre de connaissances concernant la réponse immunitaire de l’hôte à l’infection. En effet, elles partagent un grand nombre de similitudes avec l’homme, notamment concernant l’évolution du sepsis et du choc septique, ainsi que de la leucémie. Aussi, la souris et l’homme partagent 99% de leurs gènes. Dans l'ensemble du projet, nous utiliserons des souris adultes car la pathologie étudiée apparaît chez l'Homme adulte.

105 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une ligature-ponction du caecum pour déclencher une septicémie, puis la pose d'une pompe osmotique et des échocardiographies sous anesthésie, pour étudier le rôle des cellules immunitaires dans la réparation du cœur et des reins. Le porteur indique une douleur postopératoire, une perte de poids de 10 à 15 % et une baisse d'activité, tous les animaux étant euthanasiés pour prélever les organes. Il affirme que le recours à l'animal est "nécessaire", les modèles in vitro ne reproduisant pas l'interaction entre organes, et n'utilise que des mâles.

Objectifs

Le sepsis est défini comme une infection grave caractérisée par une dysfonction multiple d’organes pouvant conduire au décès du patient. Touchant près de 50 millions de personnes chaque année dans le monde, le sepsis est un problème majeur de santé publique. Lors d’un sepsis, le système immunitaire est complètement déréglé, et conduit les patients à un état d’immunodépression, c’est-à-dire à une incapacité du corps à combattre une infection. Cet état d’immunodépression induit à long terme à de graves dysfonctions d’organes telles qu'une insuffisance cardiaque ou une insuffisance rénale. Notre projet a pour but d’évaluer le rôle des cellules immunitaires dans la réparation rénale et cardiaque après un sepsis. Notre hypothèse est qu’après un sepsis, les cellules immunitaires dans les organes tels que le cœur et les reins, se réorganisent dans le temps et l’espace contribuant à l’installation d'une insuffisance cardiaque et rénale. Moduler l’organisation de ces cellules dans les tissus pourrait alors permettre d’améliorer les défaillances cardiaques et rénales induites par un sepsis.

Bénéfices attendus

La plupart des avancées récentes dans le traitement des infections graves se sont focalisées sur le traitement de la source infectieuse plus que le contrôle de la réponse immunitaire. A l'heure actuelle, on observe un surrisque de maladies cardiovasculaires, d'insuffisance rénale et de cancer chez les patients qui survivent à une infection grave (pneumonie, infection urinaire, infection abdominale). Mieux comprendre le role du systeme immunitaire dans le développement des complications à long terme qui succèdent à l'infection pourrait permettre de dégager de nouvelles thérapeutiques et un meilleur suivi de ces patients.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale de ligature ponction caecale sous anesthésie (durée 10 minutes) suivit 14 jours après d'une deuxième chirurgie pour la pose d'une pompe osmotique sous anesthésie (durée 5 minutes). Ceci est combiné à une échocardiographie sous anesthésie avant les chirurgies et au moment de l’euthanasie de l’animal (3 fois 10 min) ainsi qu'à une mesure de la pression artérielle sur animal vigile chaque jour pendant 5 jours avant la première chirurgie pour habituer l’animal, puis au moment de la deuxième chirurgie et 7 jours, 14 jours et 28 jours après la deuxième chirurgie (9 fois 10 minutes).

Impact sur les animaux

Les procédures chirurgicales s'accompagnent de douleurs au niveau du site opératoire, un traitement antalgique sera administré durant les 24 premières heures à tous les spécimens, possiblement réitéré à plusieurs reprises en cas de persistance de signes d'inconfort. La perte de poids est une complication attendue suite à la chirurgie, celle-ci n'excède pas 10-15% du poids corporel, et régresse en quelques jours. La diminution de l'activité est également attendue et habituelle (composante du comportement maladie) et n'excède pas 5 à 7 jours. Ces affirmations font suite à une étude antérieure réalisée dans notre laboratoire montrant un retour au poids avant chirurgie et un activité normale des animaux entre 5 et 7 jours après ligature et ponction ceacale. L’échocardiographie est réalisée sous anesthésie et n’induit pas de nuisance spécifique. La mesure de la pression artérielle peut induire un stress à l’animal du fait de la contention, ce stress sera atténué par une habituation des animaux à ce type de procédure préalablement à la chirurgie.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés afin de prelever les différents organes à analyser (rate, rein, coeur, moelle osseuse, sang).

Remplacement

Le recours à l'expérimentation animale est nécessaire pour ce projet car il n’existe pour l’heure aucune autre technique que l’expérimentation in vivo pour réaliser les procédures expérimentales prévues dans ce projet. Les modèles in vitro, ex vivo ou in silico ne permetent pas de reproduire actuellement les organes complexes et surtout leur interaction et leur effet sur le corps entier. Le modèle murin a été retenu pour sa proximité avec les situations cliniques humaines, il est régulièrement cité en référence dans les publications relatives à l’insuffisance rénale aigüe et maitrisé par les équipes scientifiques du laboratoire.

Réduction

Grâce à des analyses statistiques, les groupes expérimentaux ont été conçus de façon à réduire à son minimum le nombre d’animaux utilisés. Nous optimiserons nos expériences en réalisant le plus grand nombre possible d'analyses et de prélèvements d’organes sur un même animal.

Raffinement

Les gestes chirurgicaux sont maîtrisés par le personnel de l’étude permettant ainsi une manipulation plus aisée conduisant à un réveil et à une récupération plus rapide en post-opératoire. Pour limiter au maximum les nuisances sur le bien-être des animaux lors des procédures expérimentales, les mesures suivantes seront prises : Injection intrapéritonéale d'anesthésiques; administration systématique d'antalgique par voie intra péritonéale à h6 post-chirurgie pour tous les animaux; surveillance 2 fois/jour pendant les 3 premiers jours après chirurgie et administration à h24, h36, h48 chez les animaux montrant des signes de mal-être voire euthanasiés si le traitement est sans effet au-delà puis surveillances chaque jour par le personnel de l'animalerie pendant toute la durée du protocole.

Choix des espèces

Le modèle murin présente de nombreux avantages pour notre projet de recherches. Outre sa petite taille et son hébergement aisé, le modèle de sepsis comporte de nombreuses similitudes par rapport à un sepsis polymicrobien abdominal chez l’Homme. L'utilisation du modèle murin pour l'étude de la réponse immunologique au sepsis est le modèle le plus couramment utilisé. Par ailleurs, les souris utilisées pour les procédures expérimentales auront le fonds génétique le plus utilisé pour les modèles transgéniques. Nous utiliserons des souris mâles jeunes adultes de 4 à 8 semaines environ afin de permettre une récupération optimale. Le stade de développement des animaux correspond à de jeunes adultes afin de mimer au mieux les conditions de pathologies chez l'Homme. Seuls des mâles seront utilisés dans ce protocole car les femelles présentent une protection relative au sepsis liée aux oestrogènes.

800 souris et 400 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On leur injecte des cellules tumorales dans la veine de la queue, puis on administre des traitements et de la radiothérapie, avec imagerie et prélèvements sanguins sous anesthésie, pour évaluer des candidats médicaments contre le cancer du poumon. Le porteur reconnaît que les tumeurs peuvent provoquer nécrose, cachexie et perte de poids et que la radiothérapie entraîne diarrhées et saignements, les animaux étant euthanasiés pour prélèvement d'organes. Il décrit objectifs et bénéfices en une phrase chacun et affirme que l'animal constitue un "passage obligatoire" faute de méthode de substitution.

Objectifs

Le projet consiste à évaluer les effets anti-tumoraux de différentes nouveaux traitements dans des modèles de cancer du poumon.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont la découverte de nouveaux médicaments pour traiter les cancers du poumons.

Procédures

Les animaux recevront 1 injection de cellules tumorales par injection intraveineuse au niveau de la queue (durée estimé à 1 min). Application / Administrations des traitements (moins de 2min pour les injections et environ 5 min pour la radiothérapie). En cas de prélèvement de sang (moins de 2min) ceux-ci seront réalisés sous anesthésie et limités à 1 par semaine et à un volume inférieur à 10 %. Un suivi par imagerie pourra être réalisé sous anesthésie comme par exemple par Bioluminescence (durée moyenne < 10 min) ou encore par IRM (durée moyenne = 30 min).

Impact sur les animaux

Stress lié à l’anesthésies par agent chimique en inhalation et/ou injection lors des administrations / imageries. Stress lié à la contention pour l'implantation de cellules tumorales dans la veine caudale et lors des suivis clinique. Le développement de tumeurs chez la souris pourra à terme être associé à des effets délétères (ex: présence d'une tumeur associé ou non à de la nécrose, cachexie, perte de poids). Traitements par différentes voies d'administration (douleur équivalente à la piqure d’une aiguille) - De même, l’utilisation de traitement novateur pour lesquels par définition nous ne connaissons pas tous les effets, pourront également induire des effets délétères. Les effets de la radiothérapie, notamment sur les aspects digestifs (diarhée, saignement).

Devenir

Euthanasie des animaux pour réaliser des prélèvements d’organe/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal. Euthanasie des animaux suite aux effets indésirables provoqués le développement de la tumeur ou encore par le produit / modèle chez les animaux.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez la souris ou le rat car il n’existe pas de méthode de substitution pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur les cancers pulmonaires. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, la souris et le rats sont les espèces les plus adaptées à ce type d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques (test de comparaison entre les différents traitements).

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • des conditions d'hébergements garantissant la non-contamination des animaux immunodéficients, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • Le suivi des signes cliniques et la détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse.

Choix des espèces

Les rats et les souris font parties des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées notamment pour évaluer l’efficacité de traitements anti-tumoraux, de par leurs facilités d’entretien, de stabulation, de manipulation, et leurs similitudes physiologiques avec l’espèce humaine. Animaux adultes (à partir de 6 semaines). Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement. En effet le cancer du poumon atteint le plus souvent les personnes de 50 ans et plus; en 2007, 95,5 % des nouveaux cas ont été diagnostiqués chez les personnes de ce groupe d'âge.