Rongeurs

1 050 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur implante sous anesthésie une pompe diffusant de l'angiotensine II pendant quatre semaines, avec des administrations répétées de molécules candidates et des prélèvements sanguins, pour tester des composés censés freiner la fibrose rénale. Le porteur indique que l'hypertension provoquée peut évoluer vers une insuffisance rénale, avec polyurie et déshydratation, et que les reins sont prélevés après mise à mort. Il conclut que les tests sans animaux ne reflètent pas la complexité de l'organisme et que le modèle animal reste "indispensable".

Objectifs

La fibrose est un problème de santé publique affectant des millions de personnes à travers le monde. La fibrose n’est pas une maladie, mais elle se développe le plus souvent suite à un processus inflammatoire marqué. Elle se caractérise par le remplacement d’un tissu parenchymateux par du tissu connectif et la formation d’un tissu cicatriciel épaissi qui affecte de façon plus ou moins importante la fonction initiale de l’organe atteint. La fibrose peut impacter différents types de tissus parmi lesquels les poumons, le foie, le cœur ou encore les reins. Le vieillissement de la population et l’augmentation du nombre de patients atteints de diabètes ou d’hypertension entraînent une forte accélération de l’incidence des néphropathies menant à l’insuffisance rénale. Quelle qu’en soit l’origine, la majorité des atteintes rénales aboutissent au développement d’une fibrose tubulo-interstitielle dont la présence signe l’évolution vers la perte de la fonction rénale. La fibrose rénale représente le trait histologique commun des néphropathies associées à une insuffisance rénale chronique évolutive. Comprendre et lutter contre le développement de la fibrose représente ainsi un enjeu scientifique et médical de la plus grande importance. Il n’existe pas actuellement de médicament dont les effets anti-fibrosants soient clairement démontrés au niveau rénal chez l’homme. Ainsi le présent projet aura pour objectif d'évaluer l’efficacité préclinique de candidats médicaments susceptibles de lutter contre l’inflammation et la fibrose dans un modèle d’hypertension et de l'insuffisance/fibrose rénale induits par la perfusion d’angiotensine II chez la souris.

Bénéfices attendus

La fibrose rénale est un problème de santé publique. A l'heure actuelle il n'existe pas de traitements médicamenteux et les patients sont soignés par des thérapies lourdes que sont la dialyse et la transplantation. Ce projet permettra d'évaluer l’activité anti-fibrotique et/ou anti-inflammatoire de substances en développement qui pourraient trouver un intérêt dans le traitement de la fibrose rénale chez l’homme, réduisant ainsi les prises en charges lourdes utilisées actuellement.

Procédures

Les animaux sont anesthésiés transitoirement (la procédure ne dure que quelques minutes) pour être implantés avec un dispositif sous-cutané (pompe osmotique) permettant la perfusion d’une solution d’angiotensine II pendant 4 semaines. Les substances-test peuvent être administrées par bolus (la procédure ne dure que quelques secondes).. Les administrations peuvent être uniques ou le plus souvent répétées pendant plusieurs jours ou plusieurs semaines, et cela en fonction de l’objectif de l’étude. Pour les besoins de l'étude, des prélèvements de sang (nombre limité au strict minimum selon les besoins de l'étude) peuvent être réalisés sous anesthésie (la durée de la procédure de prélèvement est d’environ 30 secondes).

Impact sur les animaux

Dans ce type de procédure, il est attendu une hypertension artérielle évoluant à terme vers une insuffisance rénale. Les symptômes peuvent comprendre une polyurie et une déshydratation malgré une augmentation de la consommation d’eau. Les phases d’induction de l’anesthésie et de réveil peuvent être source de stress ou d’inconfort pour l’animal, tout comme les phases de contentions nécessaires aux administrations substances (antalgique en post-chirurgie, produit test).

Devenir

Dans la procédure, les animaux sont euthanasiés, le prélèvement des reins (pour analyses) ne permettant pas le réveil et le maintien en vie.

Remplacement

Dans le cadre du développement des médicaments testés, de nombreux tests ex vivo, in vitro et in silico, ont déjà eu lieu avant l'utilisation de l'animal. Ceux-ci constituent un point de départ permettant de générer des données préliminaires et d’effectuer un tri moléculaire pour ne retenir que les molécules présentant une certaine efficacité. Bien que ces tests permettent une réduction significative du nombre de substance à tester (et donc du nombre d’animaux), ils ne reflètent pas la complexité de l’environnement biologique et du système endocrinien chez l’Homme. De même, il n'est pas possible de prédire les effets secondaires des substances utilisées. Ainsi, les modèles d'animaux restent indispensables pour valider et optimiser de nouvelles thérapies pour leur utilisation en toute sécurité chez l'Homme.

Réduction

Les mesures de réduction s'intégrant à la règle des 3Rs vont consister à utiliser le plus petit nombre d’animaux possible pour chaque étude permettant d'obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte et d’éviter ainsi une répétition inutile des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet et la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif et éventuellement à un contrôle positif (substance de référence ou de comparaison) si cela s'avère pertinent. Les données de la littérature indiquent qu’un effectif de 8-12 animaux en standard par groupe (nombre d'animaux et groupes variables, selon l’objectif de l’étude) est généralement nécessaire pour atteindre une sensibilité correcte du test. Si à la suite des premiers essais, il est montrer (par une approche statistique) que les données permettent de diminuer le nombre d’animaux sans impacter la fiabilité des résultats, alors une décision sera prise en ce sens. Par ailleurs, en plus des organes cibles (reins) de ce modèle, des prélèvements terminaux peuvent être ajoutés en fin de procédure pour éviter une répétition inutile de l'étude.

Raffinement

Les mesures de raffinement s'intégrant à la régle des 3Rs vont consister en un suivi des points limites permettant l'euthanasie précoce de tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse. De plus, les animaux sont suivis par le vétérinaire et manipulés fréquemment par des techniciens préalablement formés et attentifs, prêts à agir lorsque les critères d'interruption prédéfinis sont atteints. Par ailleurs, et au quotidien, un enrichissement complet est fourni aux animaux, celui-ci inclut dans leur hébergement : litière, objets de nidification, objets à ronger ou à mastiquer, présence de congénères. Les animaux sont anesthésiés et analgésiés, le programme d’anesthésie et d’analgésie étant défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance.

Choix des espèces

Aujourd’hui encore, les rongeurs (souris) demeurent essentiels pour étudier les fibroses. Le modèle proposé dans ce projet est bien décrit dans la littérature scientifique . Les animaux seront utilisés à l'âge adulte, soit jeunes (il est notamment prévu de commencer les études autour de l'âge de 2-4 mois), soit agés (jusqu'à environ 18 mois) car l'apparition de la fibrose rénale dans ce modèle est décrite comme de plus en plus importantes avec l'âge.

60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent deux chirurgies rénales à une semaine d'intervalle pour induire une insuffisance rénale chronique avec calcifications vasculaires, ainsi que des prélèvements sanguins, pour étudier le rôle du phosphate dans ces calcifications. Le porteur admet une mortalité de 15 % au moment de la chirurgie et décrit une hypertension chez la plupart des souris opérées. Il qualifie le projet d'"indispensable" et affirme que seule l'expérimentation sur animal entier permet d'étudier cette maladie systémique.

Objectifs

Un taux élevé de phosphate (Pi) sérique est associé au développement de calcifications vasculaires (CV) chez les personnes atteintes d'insuffisance rénale chronique (IRC) et dans la population générale, et peut être une situation mortelle. En effet, l’IRC aboutit à une hyperphosphatémie qui déclenche la calcification de la paroi artérielle, ce qui entraîne une rigidification du système artériel et contribue au développement des maladies cardiovasculaires. Des études prospectives à grande échelle sur la population ont montré que la fonction rénale est inversement associée à la mortalité, les CV étant la principale cause de maladie cardiovasculaire chez les patients atteints d'IRC, et semble être un facteur prédictif important de la mortalité. Cependant, bien que le rôle des niveaux élevés de Pi dans le développement des CV est largement reconnu, son mode d'action est encore inconnu et ne peut donc pas être ciblé de manière appropriée. L'objectif global de ce projet de recherche est de découvrir les mécanismes d'action du phosphate qui entraînent le développement des CV dans le contexte de l'IRC, et d'identifier des cibles thérapeutiques putatives capables de contrecarrer ses effets délétères. Lors de la première étape de ce projet nous avons mis au point un modèle de souris présentant une insuffisance rénale chronique avec CV associées. Pour mieux comprendre le rôle du phosphate dans les CV, nous voulons déterminer si le phosphate modifie les propriétés des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) ou s’il permet la formation de cristaux directement dans le tissu. Nous étudierons l’impact fonctionnel de deux protéines connues pour jouer un rôle dans le transport et la détection du phosphate ainsi que dans la calcification.

Bénéfices attendus

Ce projet est indispensable pour comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires d’action du phosphate dans les calcifications vasculaires dans l’insuffisance rénale chronique. Les calcifications vasculaires sont un facteur de mortalité, il est donc nécessaire de comprendre ces mécanismes, qui pourront potentiellement servir de cibles thérapeutiques à l’issu de ce projet

Procédures

Deux chirurgies (durée : 25-30 min) à une semaine d'intervalle sont nécessaires pour induire l'IRC chez la souris. Deux prélèvements de 2-3 gouttes de sang, avant la chirurgie 1 (2-3 gouttes de sang à partir de la veine de la joue) et en fin de procédure expérimentale (prélèvement terminal sans réveil), seront réalisés.

Impact sur les animaux

Le microprélèvement sanguin réalisé une seule fois génère un stress et une douleur de classe légère. L’insuffisance rénale chronique induite par chirurgie est bien tolérée chez la souris. Les nuisances liées à cette chirurgie sont de classe modérée (les principales manifestations cliniques de l’insuffisance rénale chronique sont une hypertension artérielle qui survient chez 75 -80% des animaux néphrectomisés et une protéinurie).

Devenir

mise à mort pour prélèvements terminaux d'organes afin d'évaluer le degré d'IRC, l'apparition de calcifications vasculaires dans différents organes, réaliser des dosages hormonaux en lien avec l'homéostasie du phosphate.

Remplacement

S’agissant d’une maladie systémique (insuffisance rénale chronique), l’expérimentation sur animal entier est indispensable pour évaluer le rôle des différents organes impliqués dans cette pathologie

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire à cette étude (60 souris) a été calculé au plus juste et en prenant en compte les 15% de mortalité au moment de la chirurgie afin d’offrir la puissance statistique maximum.

Raffinement

Le protocole chirurgical sera réalisé sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane offrant à la fois une bonne sécurité et un bon confort anesthésique. Un protocole d’analgésie et un système de surveillance des points limites adaptés permettra, de prévenir et de contrôler efficacement les douleurs post-opératoires. Si les points limites sont atteints, les animaux concernés seront mis à mort. Les conditions d'hébergement sont adaptées aux besoins des souris (hébergement par groupe de 5 souris maximum, température, enrichissement du milieu de vie avec du frisottis permettant aux souris de se fabriquer un nid)

Choix des espèces

Nous nous intéressons au rôle de deux protéines dans l’apparition des CV dans un contexte d’insuffisance rénale chronique. L’utilisation de souris génétiquement modifiées pour l'une de ces deux protéines permettra d'apporter des réponses importantes sur les mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeu dans les CV au cours de l'IRC. Parallèlement à ces travaux, des études réalisées en culture de cellules permettront également de préciser ces mécanismes à l'échelle cellulaire. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 18-20 semaines pour rester proche de la pathologie humaine.

870 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur leur est greffée sous la peau de la patte ou de la babine, puis irradiée sous anesthésie, pour comparer les effets de types de rayonnements sur les vaisseaux et l'immunité de la tumeur. Le porteur indique que la tumeur peut gêner l'alimentation ou le déplacement et provoquer des douleurs modérées, avec mise à mort dès l'atteinte d'un point limite. Il affirme qu'il n'existe pas d'alternative non animale pour étudier la réponse des cellules dans leur environnement tumoral.

Objectifs

La radiothérapie constitue l’un des trois piliers de l’arsenal thérapeutique contre les cancers. Elle est utilisée dans plus de la moitié des nouveaux cas de cancer, ce qui représente environ 200 000 patients en France chaque année. Pour augmenter les chances de guérison, les techniques de radiothérapie se sont améliorées et diversifiées depuis les premières thérapies qui ont vu le jour quelques mois seulement après la découverte des rayons X il y a plus d’un siècle. Aujourd’hui, la plupart des traitements utilisent des rayons X. Mais depuis quelques années, l’utilisation d’autres types de rayonnements permet un ciblage plus précis des tumeurs grâce à des propriétés physiques particulières. Les conséquences de ces rayonnements sur les tumeurs sont également différentes, mais assez mal connues d’un point de vue biologique. En se développant, les tumeurs acquièrent des vaisseaux sanguins qui leur permettent d’être irriguées et nourries, ce qui permet également au système immunitaire d’entrer en contact avec les cellules tumorales, considérées comme anormales, et de les combattre. Le système immunitaire constitue un système de défense essentiel contre les tumeurs, mais il peut être bloqué par les cellules tumorales. La radiothérapie peut détruire les nouveaux vaisseaux sanguins de la tumeur, et ainsi bloquer sa croissance, mais aussi permettre au système immunitaire de se mettre en place plus efficacement. Dans ce projet, nous proposons de comparer les effets cellulaires et moléculaires de trois types de rayonnements différents sur des tumeurs implantées puis irradiées chez la souris. Nous étudierons les effets de ces irradiations sur les cellules des vaisseaux sanguins et sur les cellules immunitaires de la tumeur implantée, et la façon dont les cellules des vaisseaux communiquent avec les cellules immunitaires pour favoriser leur venue dans la tumeur. L’étude présentée dans ce projet s’intéressera à l’une des trois modalités d’irradiation, la plus utilisée en radiothérapie, car les études des effets des autres rayonnements ne seront pas réalisées dans notre laboratoire mais dans d’autres établissements où ces types d’irradiation, qui nécessitent des installations spécifiques et complexes, sont possibles.

Bénéfices attendus

Pour ce qui concerne le projet dans sa globalité, les résultats obtenus permettront de préciser les conséquences de trois types de rayonnements utilisés en radiothérapie sur les vaisseaux sanguins et la réponse immunitaire au sein de la tumeur. De plus, cela permettra de proposer des solutions pour améliorer les protocoles qui combinent la radiothérapie, et l’immunothérapie, une thérapie en plein essor qui favorise la réponse immunitaire contre la tumeur et permet d’augmenter le pouvoir de la radiothérapie. En effet, les schémas actuels d’administration de l’immunothérapie, de même que le fractionnement associé, sont réalisés de façon empirique avec un faible niveau de preuve. Une meilleure compréhension de la réponse immunitaire conduira à l’amélioration de ces schémas de traitement.

Procédures

Des injections de cellules tumorales seront réalisées chez tous les animaux, soit au niveau de la patte soit au niveau de la babine. Les cellules tumorales seront injectées sous la peau dans les deux modèles. Les souris seront préalablement anesthésiées (moins de 5 minutes). Les animaux porteurs des tumeurs subiront des irradiations localisées au niveau des tumeurs. Pour cela, elles seront anesthésiées pendant le temps de l’irradiation qui dure environ 4 min.

Impact sur les animaux

Des effets indésirables chez les animaux seront occasionnés par l’injection des cellules tumorales et par la croissance des tumeurs. Des difficultés d’alimentation pour les souris avec une tumeur au niveau de la babine sont possibles, ainsi que des douleurs modérées. Pour le modèle de tumeur au niveau de la patte, la croissance de la tumeur peut engendrer une difficulté à se déplacer et des douleurs modérées. Pour ces raisons, Nous avons mis en place des stratégies d'expérimentation et d'observation nous permettant de déterminer des points limites suffisamment précoces afin de limiter la douleur au maximum. A cette fin, les animaux seront surveillés quotidiennement.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures expérimentales afin de réaliser les prélèvements de tissus et tumeurs pour analyses ultérieures.

Remplacement

Dans sa globalité, ce projet a pour but d’identifier les réponses de cellules des vaisseaux exposées à trois types de rayonnements utilisés en radiothérapie à l’aide d’expérimentations in vitro. Les données obtenues seront étudiées dans deux modèles précliniques de souris greffées avec différentes tumeurs des voies aérodigestives supérieures (VADS) qui seront irradiées avec les trois types rayonnements. Dans ce projet, les modèles animaux permettront d’étudier les relations entre les différentes cellules (tumorales, immunitaires et endothéliales) au sein d’une tumeur qui s’est implantée et développée dans un organisme vivant. Ainsi, ce projet défrichera les questions posées par les expériences réalisées in vitro, ce qui permet d’envisager une expérimentation animale plus ciblée, mais nécessaire. Il n’existe en effet pas d’alternative non animale à ce jour concernant l’étude de la réponse moléculaire des cellules endothéliales et des cellules immunitaires dans leur environnement tumoral, ce qui justifie l’utilisation d’animaux vivants dans cette étude.

Réduction

Les modèles animaux d’expérimentation pour l’étude des tumeurs implantées présentent un certain taux d’échec de prise de greffe et sont d’autre part influencés par la physiologie des animaux, ce dont nous devons tenir compte pour établir les effectifs de souris par groupe. La tumeur d’un même animal sera partagée en trois parties afin de réaliser trois types d’analyses différentes ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux total pour cette étude. Selon les analyses réalisées des groupes de 20 ou de 30 animaux seront nécessaires afin d'assurer une puissance statistique suffisante.

Raffinement

Nous avons mis en place des stratégies d'expérimentation et d'observation afin de réduire au maximum les conséquences des procédures sur les animaux. Les souris seront hébergées en groupe. De plus, l'environnement des animaux sera enrichi en permanence par du coton et des niches en carton afin de diminuer leur angoisse et favoriser leur bien-être. Les animaux seront pesés régulièrement pour évaluer leur état de santé. Les points limites seront strictement appliqués. Le développement de la tumeur ainsi que les signes de toxicité (perte de poids, prostration) seront évalués 3 fois par semaine et l’euthanasie des souris sera nécessaire dès qu’un point limite sera atteint.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale de référence pour les études de biologie des rayonnements. Elle est parmi les plus utilisées pour étudier les réponses immunitaires pendant le développement tumoral. Les outils de biologie sont très développés chez la souris, ce qui permet des études poussées. La physiologie et la génétique de la souris sont de mieux en mieux connues et de nombreuses études ont déjà validé des découvertes faites chez cette espèce en les appliquant pendant des essais cliniques, ce qui promeut et facilite le transfert des résultats obtenus vers des applications cliniques. Les souris seront âgées de 8 à 10 semaines, âge auquel les souris sont suffisamment matures pour ce type d’étude.

32 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections quotidiennes pendant quarante-deux jours, des prélèvements sanguins hebdomadaires et des tests de tolérance au glucose et à l'insuline, pour étudier une molécule contre le diabète et l'obésité. Le porteur précise que l'étude porte d'abord sur des animaux sains, une étude sur animaux diabétiques pouvant suivre, et attend un ralentissement de la prise de poids. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ne peut remplacer l'étude du métabolisme in vivo, et les tue pour prélever tissu adipeux et pancréas.

Objectifs

Le projet a pour but d’étudier une nouvelle stratégie thérapeutique dans le traitement des pathologies comme l'obésité ou le diabète de type 2. Actuellement, les enjeux actuels de la prise en charge de ces maladies sont de trouver de nouveaux traitements pouvant agir sur la perte de poids et sur le contrôle glycémique. De nombreuses études se sont penchées sur la régulation des hormones secretée par l'estomac qui stimulent la sécrétion d'insuline après le repas. Le traitement qui sera étudié peut augmenter la secretion d'insuline après le repas en augmentant la sensibilité à ces hormones secretées par l'estomac. L’objectif de notre étude est d'étudier ce nouveau traitement en vue de l'utiliser comme un traitement du diabète ou de l'obésité.

Bénéfices attendus

Ce travail permettra d’étudier dans un premier temps les effets de ce nouveau traitement sur la glycémie, le poids et différents marqueurs des maladies métaboliques comme le diabète et l'obésité. Au décours de cette première étude sur des animaux sains, une étude similaire sur des animaux diabètique pourra être réalisée. Ainsi l'ensemble de ce travail pourrait ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques dans les maladies métaboliques telles que le diabète et l'obésité.

Procédures

- A l’âge de 8 semaines, les animaux seront divisés en deux sous-groupes : "Traitement" et "Placebo". Les animaux traités recevront le traitement 7 jours sur 7. Le groupe placebo recevra un soluté salé isotonique. Ces traitements seront administrés par injection pendant 42 jours. - Le poids des animaux sera relevé et un prélèvement biologique sera réalisé tous les 7 jours. - Avant l’arrêt du traitement, un test de tolérance glucidique et un test de sensibilité à l’insuline espacés de 72h incluant différents prélèvements toutes les 15 minutes pendant 120 seront réalisés. - Les paramètres morphologiques métaboliques seront étudiés dans des cages métaboliques dont l’objectif est d’étudier la prise d’eau de et de nourriture, ainsi que le dépense énergétique des animaux.

Impact sur les animaux

L'administration du traitement et les prises de sang pourront être source de douleur au moment de l'injection qui sera prevenu par l'utilisation d'une anesthésie locale avant les injections et avant les prises de sang. Une prise de poids en fonction de l'âge moins importante pourra être observée dans le groupe recevant le traitement (nous estimons cette différence entre 10 et 20 % par rapport à un animal recevant un placebo).

Devenir

A l’issu de ces deux procédures, les animaux seront euthanasiés afin d’étudier les conséquences de l’administration du traitement sur les tissus cibles de ce traitement tel que le tissu adipeux et le pancréas.

Remplacement

L’utilisation de modèles animaux dans l’étude du métabolisme est nécessaire pour reproduire au mieux le métabolisme humain. Il n'existe à ce jour aucune méthode alternative ou substitutive qui permette un remplacement in vitro et l’étude de nouvelles stratégies thérapeutiques doit nécessairement être faite in vivo. Le métabolisme et l’homéostasie glucidique représentent des systèmes intégrés qui ne peuvent être étudié uniquement in vitro : en effet, l’utilisation d’animaux permettra d’étudier de manière simultanée les conséquences de l’inhibition de KDM1A sur différents tissus essentiels à l’homéostasie métabolique comme le pancréas, le tissu adipeux, et le foie.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé en utilisant un test statistique utilisant les études de faisabilité du traitement afin de garantir l'observation d'un effet du traitement. Grâce à ce test, nous obtenons n = 16 animaux par groupe. Les animaux seront suivis de manière longitudinale et les mesures répétées au cours du temps permettant de diminuer le nombre d'animaux à inclure.

Raffinement

La prise de poids des animaux et les prélèvements biologiques qui auront lieu tous les 7 jours seront réalisés simultanément pour limiter au maximum le stress des animaux. La tolérance des animaux sera évaluée quotidiennement. Les injections et les prelevements seront précédés d'une anesthesie locale afin de diminuer au maximum la douleur pouvant être engendrée par la procédure. Les cages sont pourvues de tubes ainsi que du coton de nidation et des bâtonnets de bois raffinant ainsi les conditions de vie des animaux.

Choix des espèces

Nous utiliserons des rats Wistar Han largement disponibles et dont le métabolisme se rapproche du métabolisme humain. Ces animaux representent un modèle d'étude polyvalent. Les procédures seront débutées à l’âge de 8 semaines (âge adulte des animaux).

1 200 animaux non-humains, 400 rats, 400 cobayes et 400 lapins, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent sous anesthésie des injections de produits de comblement sous la peau, dans le derme ou le muscle, suivies de séances répétées de scanner et d'imagerie optique, pour évaluer des dispositifs injectables destinés à la médecine esthétique et reconstructrice. Le porteur justifie l'étude par la progression du marché de la chirurgie esthétique et la recherche de produits "plus performants et plus persistants". Il affirme qu'il n'existe pas de méthode fiable sans animaux pour modéliser un produit injecté, et les tue pour analyser les sites d'injection.

Objectifs

Le marché mondial de la chirurgie reconstructrice ne cesse de progresser ces dernières années. Selon l’Observatoire Mondial du Marché et de la Profession, ce marché a bondi de 10% en un an, en 2012. En France, les technologies non chirurgicales, à base de produits injectables progressent, au point que ces interventions dominent aujourd’hui ce marché (correction des cicatrices d'acné, restauration et correction des signes de perte de graisse faciale (lipoatrophie) chez les personnes atteintes du VIH, ...). Certains produits de comblement se résorbent naturellement avec le temps nécessitant pour les patients de répéter les injections, il est donc nécessaire d'améliorer la persistance de ces produits. La recherche de nouveaux produits, performants et sains pour le patient, est donc plus que jamais nécessaire. Ce projet a pour objectif de tester et évaluer des dispositifs médicaux injectables de comblement sur différents modèles animaux. Il comporte plusieurs protocoles visant à évaluer leur comportement (persistance et potentielles réactions locales de type inflammatoire) après injections sous la peau, sous le derme, sous le muscle ou dans le muscle chez les rongeurs ou le lapin. Lors de ce projet, l’imagerie médicale sera utilisée afin de suivre l’évolution (volume et forme) des produits injectés au cours du temps. Un effet inflammatoire des produits pourra également être mis en évidence, notamment par imagerie optique (bioluminescence/fluorescence) ou par analyse histologique.

Bénéfices attendus

Ce projet contribuera à la mise sur le marché de nouveaux produits dans le but de proposer des produits plus performant et plus persistant.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés (anesthésie volatile ou fixe) afin de réaliser l'injection ou les injections en sous-cutané, en intradermique, en intramusculaire et/ou en sous musculaire en respectant les volumes d'injections recommandés. Ces injections seront réalisés en maximum 10 minutes (anesthésie comprise). Des examens scanners ou d’imagerie optique seront également réalisés sous anesthésie générale. Un examen scanner dure jusqu’à 20 minutes et les examens d'imagerie optique en moyenne 5 minutes (anesthésie comprise). La fréquence des examens d'imagerie optique sera de : -maximum 10 acquisitions par jour le premier jour puis, - maximum 3 acquisitions par jour pendant les 3 jours suivants puis, - maximum 1 acquisition par jour jusqu’au 10ème jour puis, - maximum 2 acquisitions par semaine jusqu’à la fin de l’étude. La fréquence des examens scanners sera de : -maximum 3 acquisitions par jour le premier jour puis, - maximum 1 acquisitions par jour pendant les 15 jours suivants puis, - maximum 1 acquisition par semaine pendant les 2 premiers mois puis, - maximum 1 acquisition par mois jusqu’à la fin de l’étude.

Impact sur les animaux

Les animaux seront manipulés régulièrement pour la réalisation des différents actes techniques: injection des produits, réalisation des acquisitions d'imagerie et suivi clinique avec pesée. Les injections des produits et la réalisation des acquisitions d'imagerie seront réalisés sous anesthésie. Ces manipulations bien que réalisé avec le plus grand soin par du personnel formé sont susceptibles d'induire un stress.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin du protocole. Les sites d'injection pourront être prélevés après mise à mort de l’animal afin de réaliser des analyses histologiques.

Remplacement

Afin de répondre aux objectifs de ce projet, le recours à l’expérimentation animale est nécessaire car il n’existe pas à l’heure actuelle de méthode alternative permettant de modéliser de manière fiable le comportement de produits injectés dans un organisme entier vivant. Ce comportement dépend de très nombreux facteurs tels que la zone d’injection, les tissus environnants, l’activité de l’animal, etc.

Réduction

Le suivi de la persistance (volume et forme) des produits injectés sera réalisé par imagerie médicale sur les mêmes animaux au cours du temps. Cette méthode d'analyse permet de conserver les animaux tout au long de l'étude et donc de diminuer le nombre d'animaux impliqué dans chaque procédure. Afin d'obtenir des résultats statistiquement exploitables permettant d'étudier la performance et/ou la persistance du produit au cours du temps (à court/moyen et long terme), des groupes de minimum 6 sites d'injection seront constitués (en fonction de l'espèce plusieurs sites d'injection peuvent être réalisés sur un même animal réduisant également le nombre d'animaux à utiliser : par exemple 8 sites intradermiques pourront être réalisé sur 1 lapin).

Raffinement

Une période d'acclimatation de 2 jours minimum sera respectée pour les rongeurs et de minimum 4 jours pour les lapins. Les rongeurs seront hébergés en cage et les lapins en parc de manière collective durant toute la durée de l'étude (sauf exception en cas de bagarre ou blessure) avec des enrichissements appropriés en fonction de l'espèce (abris, matériel de nidation, bois à ronger, balles, ...). Au cours de l'étude les animaux seront observés quotidiennement afin de détecter tout signe clinique anormal et ainsi prendre le plus rapidement possible, les mesures nécessaires : mesure de soutien (désinfection de plaies, isolement, réchauffement, etc…) ou la mise à mort des animaux ayant un état clinique jugé moribond. Le poids des animaux sera contrôlé régulièrement tout au long de l'étude et un suivi clinique approfondi pourra être réalisé afin de détecter les signes suivants: signes cliniques généraux = comportement général de l’animal pour déceler une éventuelle apathie, la réponse à la stimulation, l’état de son pelage (soyeux ou en piloérection), présence d’écoulement nasaux et oculaires, difficultés respiratoires ou en lien avec l’administration de produit = inflammation, lésion, nécrose du site d’injection. Toute anomalie clinique sera rapportée au vétérinaire responsable du suivi. Les signes cliniques observés seront pris en charge (injection de fluides, analgésiques, antibiotiques, etc…) dans la mesure où les actions n’interfèrent pas avec les produits injectés (en fonction des connaissances des produits).

Choix des espèces

Les rongeurs ont été choisis afin de tester les différentes techniques d’injections et de comparer les modèles entre-eux. L’espèce sera choisie en fonction du type d’injection (volume, fréquence, localisation, etc.) et d’imagerie : - Le cobaye est aujourd’hui une espèce référence en terme d’injection intradermique, tandis que le rat sera privilégié pour les injections sous-cutanées (volumes injectables plus importants que chez la souris, permettant un suivi en imagerie médicale). - Le lapin a quant à lui été choisi afin de tester des volumes plus importants et ainsi mimer les volumes d’injections les plus importants réalisés chez l’humain. Les rats et les cobayes seront utilisés au stade de jeune adulte (environ 7 semaines). Les lapins pourront être utilisés à partir de 10 semaines. Le stade de développement jeune adulte est celui habituellement utilisé (pas de contrainte spécifique lié à l’âge - animaux avec un système immunitaire mature).

1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nourries d'un régime gras, elles reçoivent des injections répétées induisant fibrose puis cancer du foie, avec des prélèvements sanguins, pour évaluer le rôle de deux protéines dans les complications hépatiques de l'obésité. Le porteur résume les retombées en une phrase, la validation des "effets thérapeutiques du ciblage de ces acteurs". Il affirme qu'"il n'y a aucun modèle non animal pouvant être utilisé" et conserve les organes pour tirer un maximum de données de chaque souris.

Objectifs

L’obésité augmente le risque de développer un diabète de type 2 et des maladies cardiovasculaires mais s‘accompagne également de complications hépatiques. Ces complications sont fréquentes mais sous estimées, en raison de leur évolution « silencieuse ». Ces altérations hépatiques vont d’un simple foie gras pouvant progresser jusqu’au cancer du foie. Plusieurs facteurs ont été déjà identifiés (diabète, inflammation, modification du microbiote intestinal). Cependant, aucun traitement pharmacologique n’est encore disponible et une meilleure compréhension de l'évolution de ces complications est nécessaire pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Notre équipe de recherche s’intéresse à 2 acteurs clefs impliqués dans le développement de ces maladies. Ces acteurs peuvent agir de pair favorisant le développement de ces maladies chroniques du foie. Pour une meilleure compréhension de leurs rôles, nous évaluerons sur des animaux, l’impact potentiellement bénéfique de leur absence sur le développement et la progression de ces maladies du foie.

Bénéfices attendus

Ces études précliniques valideront les effets thérapeutiques du ciblage de ces acteurs dans les maladies chroniques du foie .

Procédures

En fonction des procédures, les animaux seront soumis à deux prélèvements sanguins maximum. Les animaux nourris avec une alimentation riche en graisses seront prélevés deux fois, en milieu et en fin de régime. Ces prélèvements ne dureront pas plus d'une minute maximum. Des injections seront également effectuées pour étudier le développement de la cicatrisation hépatique. Pour la procédure 2 : les souris recevront une injection 2 fois par semaine pendant 6 semaines à partir de 7-8 semaines d’âge. Pour la procédure 3 : une unique injection sera réalisée sur les souris mâles âgés de 2 semaines.

Impact sur les animaux

Les nuisances sont les contentions, les prises de poids régulières ainsi que les injections en fonction des procédures. Les effets indésirables attendus pourraient être principalement une faible inflammation locale au site d’injection.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Nous utiliserons pour chaque procédure un nombre minimum d'animaux qui nous permet de réaliser des études statistiques robustes et pertinentes.

Remplacement

Pour répondre à l’exigence de remplacement, certains aspects du projet seront réalisés sur des cellules. Cependant, il est nécessaire de réaliser des études précliniques car les études sur cellules ne permettent pas de reproduire la maladie humaine. Ainsi, il n'y a aucun modèle non animal pouvant être utilisé pour ces études.

Réduction

Chaque procédure utilise un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes et exploitables. Les expériences seront reproduites pour confirmer la significativité statistique. Les organes obtenus à partir des souris seront conservés et stockés pour des analyses ultérieures afin d'enregistrer autant de paramètres que possible à partir d'une seule souris.

Raffinement

Pour répondre au raffinement, l'hébergement sera réalisé dans des locaux appropriés avec un enrichissement systématique et les personnes réalisant les différentes procédures respecteront les règles éthiques lors des manipulations et mises à mort des animaux. La surveillance quotidienne des animaux par les animaliers et nos surveillances régulières (grille d’observation) nous permettront d'identifier précocément tout signe de stress ou de souffrance afin d'appliquer les points limites.

Choix des espèces

La souris est une espèce très utilisée et pertinente pour étudier ces maladies. C’est une espèce facile à utiliser grâce à sa natalité importante. Notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriés à cette espèce. La maladie développée par la souris récapitule les symptômes et les caractéristiques de la maladie chez homme. Pour la procédure 1, la mise sous régime riche en graisse débutera lorsque les souris auront 8-10 semaines d’âge. En effet, un tel régime induit une prise de poids importante et peut durer jusqu’à 32 semaines, d’où la nécessité d’avoir des animaux relativement jeunes. Cette procédure permet d’analyser la progression des maladies chroniques du foie dans un contexte d’obésité et de résistance à l’insuline. Pour la procédure 2, le traitement chimique induisant la fibrose hépatique débutera à environ 7-8 semaines d’âge. Cette procedure permettra d’étudier les mécanismes moléculaires associés à la fibrose hépatique. Pour la procédure 3, l’injection du réactif induisant le cancer hépatique sera effectuée à environ 2 semaines d’âge (âge approprié pour cette procédure) et la mise sous régime riche en graisse sera effectuée à environ 7-8 semaines d’âge (animaux relativement jeunes). Cette procédure permettra d’étudier les stades le plus avancés de la maladie dans un contexte d’obésité et de résistance à l’insuline.

646 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une molécule par voie intraveineuse sous anesthésie ou par voie orale, certaines subissant cinq anesthésies en vingt-quatre heures pour de l'imagerie, l'étude portant aussi sur des femelles gestantes ou allaitantes, leurs embryons et leurs souriceaux. Le porteur décrit une molécule "très peu toxique" utilisée comme complément alimentaire et vise à préciser ses doses avant une éventuelle application à l'homme. Il affirme que l'analyse de la distribution d'une molécule doit "nécessairement" être réalisée in vivo, et les tue pour la doser dans leurs organes.

Objectifs

Chaque jour, le cerveau humain utilise 20% de l’énergie apportée par l'alimentation. Ce besoin énergétique est encore plus important chez l’enfant, ce qui rend le cerveau particulièrement sensible aux perturbations énergétiques survenant pendant le développement embryonnaire et l’enfance, et qui peuvent causer des pathologies du neurodéveloppement telles qu’épilepsie ou retard mental, dont la prévalence est estimée à une naissance sur 100 dans les pays industrialisés. L’objectif de ce projet est d’étudier une molécule d'intérêt thérapeutique qui promeut la production d’énergie cérébrale. C’est une molécule très peu toxique, utilisée comme complément alimentaire, et qui a montré son intérêt chez la souris dans des modèles de troubles neuropsychiatriques (dépression). Nous avons observé son efficacité dans des modèles de pathologie du développement neuronal, quand elle est donnée à des femelles gestantes ou allaitantes. Cependant, nous ne savons pas encore si la molécule agit directement sur l'embryon/le souriceau, ou a un effet bénéfique chez la mère qui bénéficie indirectement à l'embryon. D’autre part, nous ne savons pas quand la molécule doit être administrée pour agir au mieux. Pour répondre à ces questions, il est nécessaire de conduire une étude dite de pharmacocinétique qui permettra de connaitre la vitesse d’absorption, de transformation et d’élimination de cette molécule, ainsi que sa distribution dans les différents tissus et notamment le passage chez l’embryon ou dans le lait. A notre connaissance ces données ne figurent pas dans la littérature

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre le mécanisme d’action de la molécule d'intérêt et d’affiner ses conditions d’utilisation dans des études de neurodéveloppement. Cela permettra de confirmer l’intérêt thérapeutique potentiel de cette molécule pour des maladies du neurodéveloppement, ainsi que de déterminer avec plus de précision les doses et voies d’administration. Ces données renseigneront les futures études sur cette molécule avant une éventuelle proposition d’application à l’homme.

Procédures

Administration de la molécule d'intérêt, sous anesthésie par voie intraveineuse (1 seule fois), ou sur animaux vigiles (sans anesthésie) par voie orale (1 seule fois). Une partie des animaux subira des anesthésies répétées (5 anesthésies sur 24 heures) pour de l’imagerie. Les animaux seront placés en hébergement individuel après administration de la molécule d’intérêt, pour un maximum de 24 heures. Les animaux seront mis à mort en fin de procédure, selon une cinétique après l'administration de la molécule d'intérêt et au plus tard 24 heures après le début de la procédure.

Impact sur les animaux

Les animaux ne suburont pas d'effet secondaire lié à l'injection de la molécule. Un risque de réaction allergique ou de fausse route est en théorie possible suite à l'injection bien que jamais constaté en pratique. L'anesthésie répétée chez certains animaux peut engendrer un stress lié aux manipulations répétées et un changement du comportement (prostration, perte d'appétit). L'isolement de moins de 24 heures, nécessaire chez certains animaux, peut entraîner un stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour des prélèvements d'organe permettant le dosage de la molécule d'intérêt

Remplacement

La preuve de l’efficacité de la molécule d'intérêt a été obtenue dans un premier temps in vitro. L’analyse de la distribution d’une molécule implique tout l’organisme (absorption intestinale, distribution sanguine, captage par les différents organes) et doit nécessairement être réalisée in vivo. Dans la mesure du possible les paramètres de l'expérience sont basés sur l’analyse de la littérature et notamment de la cinétique d’élimination de molécules similaires.

Réduction

L’étude sera conduite sur des groupes d’animaux réduits au minimum de façon à obtenir une information biologique pertinente. Des mesures de la répartition de la molécule dans les différents organes seront réalisées sur des lots de trois animaux, qui est le minimum permettant de faire une analyse statistique. En parallèle, un suivi longitudinal qui n’entraînera pas d’analyse statistique, sera réalisé sur deux animaux par condition pour confirmer que les résultats sont reproductibles.

Raffinement

Les animaux auront un temps d’acclimatation de 7 jours avant l’étude pour limiter le stress lié au nouvel environnement. Pour chaque groupe d'animaux, deux semaines sépareront les groupes expérimentaux, permettant d’analyser rapidement les résultats et d’adapter les paramètres de l’expérience d'un groupe à l'autre. Des points limite, adaptés et prédictifs, ont été définis pour limiter les souffrances que pourraient subir les animaux.

Choix des espèces

Notre étude précédente démontrant l’efficacité de la molécule d'intérêt sur des modèles de troubles autistiques a été réalisée chez la souris. Conduire l’étude de la biodistribution de la molécule d'intérêt chez la souris permettra d’éclairer les mécanismes qui ont abouti à ce résultat positif lors de la première étude, et de guider des études ultérieures en raffinant les doses employées ou le moment auquel le traitement doit être administré. Procédure 1 : animaux adultes. Dans cette procédure l’objectif est d’obtenir des paramètres de base avant d'étudier l'effet de la molécule d'intérêt chez des femelles reproductrices (procédure 2). Procédure 2 : animaux adultes (femelles gestantes et allaitantes) et embryons de 15j (E15)/souriceaux de 5 jours (P5). Ces stades correspondent à des étapes clés du développement cortical.