Rongeurs

Pour reproduire la maladie de Parkinson, 2 112 souris reçoivent des injections répétées d'une substance chimique neurotoxique, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Une partie est dépourvue d'une protéine par modification génétique. Le porteur affirme que cette substance n'affecte pas le bien-être des souris dans ses conditions, tout en listant prostration, dos voûté, poils ébouriffés et perte de poids parmi les signes de détresse surveillés. L'objectif reste de mieux comprendre la mort des neurones, sans retombée directe annoncée.

Objectifs

La maladie de Parkinson est aujourd’hui l’une des principales causes de troubles du mouvement, juste après les accidents vasculaires cérébraux. C’est aussi la maladie neurologique qui progresse le plus rapidement dans le monde. Elle touche le cerveau et perturbe le contrôle des mouvements. Les personnes atteintes peuvent présenter des tremblements, des gestes plus lents ou une raideur musculaire. Mais la maladie ne se limite pas aux problèmes moteurs : elle peut aussi affecter le sommeil, l’humeur et parfois la mémoire ou la concentration. La maladie de Parkinson est complexe et évolue avec le temps. Il est donc essentiel de mieux la comprendre pour pouvoir, à terme, améliorer les traitements. Notre projet de recherche consiste à développer un modèle expérimental de la maladie chez la souris en utilisant une substance chimique, qui a été associée à un risque accru de développer la maladie de Parkinson. Ce modèle nous permet de reproduire certains mécanismes de la maladie et d’étudier plus précisément la mort des cellules du cerveau, c’est-à-dire leur disparition progressive. Grâce à ces travaux, notre objectif est de mieux comprendre les mécanismes à l’origine de la maladie de Parkinson, afin d’ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre le rôle d’une protéine essentielle au bon fonctionnement du cerveau. En étudiant des animaux chez lesquels cette protéine est absente, nous cherchons à mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la maladie de Parkinson. Ces recherches permettront également de définir les meilleures conditions expérimentales pour étudier cette maladie en laboratoire, afin d’obtenir des résultats fiables et utiles pour la recherche biomédicale.

Procédures

Une partie des animaux subira 2 injections (100 microlitres / injection - 10 secondes) par semaine pendant 2 semaines. L'autre partie des animaux subira 2 injections (100 microlitres / injection - 10 secondes) par semaine pendant 3 semaines.

Impact sur les animaux

D'après les données de la littérature notre substance chimique n'affecte pas le bien-être animal dans les conditions expérimentales de notre étude. Néanmoins, les principaux signes de détresse sont une position recroquevillée, le dos voûté, les poils ébouriffés, les yeux fermés, une respiration accélérée et une perte de poids.

Devenir

A l'issue de cette procédure, tous les animaux seront mis à mort pour effectuer des analyses nécéssaires au projet scientifique.

Remplacement

L’étude de la maladie de Parkinson nécessite un organisme entier. Notre étude doit nécessairement se faire sur l’animal pour comprendre l'effet de notre substance chimique. Cependant nous menons en parallèle des études sur cellules.

Réduction

Les animaux sont élevés au sein de notre établissement utilisateur et l’élevage est dimensionné afin de limiter la production du nombre d’animaux au strict nécessaire pour leur utilisation dans les procédures. Nous utiliserons des tailles d’échantillons garantissant une puissance statistique suffisante tout en minimisant le nombre d'animaux utilisés dans le respect éthique de la règle des 3R (remplacement, réduction et raffinement). Le nombre de souris pour chaque procédure est déterminé avec un logiciel.

Raffinement

Les souris sont hébergées collectivement dans la zone de production de l’animalerie dans des cages comportant une maisonnette ainsi que de la ouate favorisant la nidification avec un cycle d’éclairage normal. Elles sont nourries et abreuvées ad libitum. Les animaux sont régulièrement manipulés et observés par les animaliers lors du change ou par les expérimentateurs. Selon les observations suivantes : perte de poids chez les animaux en croissance et les adultes, état du pelage, état de la litière, posture/mobilité et comportements indésirables, des moyens de raffinement seront utilisés pour réduire, éviter ou atténuer toute forme de souffrance. Compte tenu de la toxicité connue de la substance administrée, les animaux traités seront surveillés quotidiennment même si, d'après la littérature, le bien-être n'est pas affecté dans nos conditions.

Choix des espèces

La souris est un modèle de référence dans les études de la maladie de Parkinson, nous pouvons donc bénéficier d’un grand nombre de ressources et de données préliminaires existantes. Nous disposons d'une lignée murine dépourvue d'une protéine pour effectuer des analyses nécécessaires au projet scientifique et le traitement des animaux par la substance chimique sert de modèle de la maladie de Parkinson. Nous utiliserons des souris adultes de 3, 6, 9 et 12 mois pour développer le modèle.

Rendues obèses par un régime riche en graisses puis, pour une partie, opérées pour créer une plaie cutanée, 670 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes. Elles subissent des prélèvements sanguins répétés à la queue sans anesthésie et une excision de peau sous anesthésie, pour tester des molécules libératrices de monoxyde de carbone censées agir sur le poids et la cicatrisation. Les souris qui perdent plus de 15 % de leur poids en une semaine sont mises à mort. Le porteur indique avoir d'abord trié vingt composés sur des cellules en culture, ce qui n'a pas écarté le recours final à des centaines de souris.

Objectifs

Le monoxyde de carbone (CO) est un gaz produit par les cellules à de très faibles concentrations. Il a été démontré qu'il régule d'importants processus physiologiques chez les mammifères, y compris les humains. Plusieurs études ont mis en évidence les actions pharmacologiques polyvalentes du CO et les scientifiques ont donc commencé à exploiter ce gaz pour des applications thérapeutiques. Dans ce contexte, une nouvelle génération de composés capables de libérer du CO a été développée. Le grand avantage de ces composés est que la quantité de CO qu'ils libèrent peuvent être mieux contrôlés en comparaison au CO gazeux. En fait, dans des expériences utilisant des rongeurs, il a été rapporté que ces composés exerçaient des actions thérapeutiques prometteuses contre diverses maladies telles que l’infarctus du myocarde, l’inflammation et les dysfonctionnements métaboliques. Plus récemment, il a été publié que l'administration orale de ces composés qui libère du CO avec une très grande efficacité chez des souris nourries avec un régime riche en graisses mène à une réduction significative du gain de poids corporel associée à une amélioration de la glycémie et à une diminution de la résistance à l'insuline. Le présent projet consiste à utiliser le même modèle d'obésité pour tester l'effet de nouvelles molécules développés récemment et qui ciblent plus efficacement le tissu adipeux. L'objectif principal est d'évaluer l'action thérapeutique de ces nouvelles molécules chez les jeunes souris et les souris âgées, puis d'évaluer si le CO possède également un effet thérapeutique sur l'obésité au cours du vieillissement. De la même manière, seront étudiés les effets protecteurs de ces nouvelles molécules, mais aussi une nouvelle technique générant localement du gaz CO dans le traitement des plaies cutanées. En effet, il est bien connu que la cicatrisation cutanée est altérée dans les maladies affectées par un dysfonctionnement métabolique tel que le diabète.

Bénéfices attendus

Il s'agit d'un projet visant à tester les effets pharmacologiques de composés novateurs. Les résultats de cette étude nous fourniront des notions importantes sur le mécanisme d'action et l'applicabilité thérapeutique de ces molécules dans le contexte du dysfonctionnement métabolique et des plaies cutanées.

Procédures

Dans les modèles de régime riche en graisses, les animaux seront soumis à plusieurs reprises (0, 7 et 14 semanines) à un prélèvement de sang sans anesthésie (cela ne prend que 5 minutes) au niveau caudale, en tant qu'intervention invasive. Dans le modèle de plaie cutanée, les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale sous anesthésie pour retirer un morceau de peau afin de créer la plaie. Cette chirurgie est très rapide, modérément invasive et ne nécessite pas plus de 20 à 30 minutes.

Impact sur les animaux

Le modèle de régime riche en graisses est un modèle largement utilisé, il est sans douleur pour les animaux et n'implique pas de procédures invasives. Le degré de sévérité de la procédure de plaie de la peau, bien maîtrisée, est considéré de classe modérée. Cette procédure est réalisée sous anesthésie et les animaux se rétablissent complètement avec peu ou pas de douleur puisque la cicatrisation de la peau est très rapide. Concernant le prélèvement sanguin sans anesthésie, nous recueillerons un très faible volume et l’adéquation volume/méthode permet de respecter le bien-être animal.

Devenir

Comme nous avons besoin de collecter les organes pour une analyse fonctionnelle, génique et biochimique, tous les animaux seront mis à mort.

Remplacement

Avant de finaliser et d'optimiser les protocoles expérimentaux pour ce projet, nous avons initialement synthétisé et testé 20 composés pour déterminer leurs effets bénéfiques sur le métabolisme dans des adipocytes en culture remplaçant ainsi l'utilisation de milliers de souris. Tous les 20 composés avaient la capacité de libérer efficacement du CO et d'exercer un effet positif sur la respiration mitochondriale et la glycolyse mais seulement 4 composés sur 20 n'ont montré aucun effet cytotoxique aux concentrations utilisées précédemment pour des composés similaires. Ces tests in vitro nous ont permis de sélectionner les 4 meilleurs en fonction également de leur structure chimique diversifiée. Pour les études sur des souris nourries avec un régime riche en graisses, nous devons évaluer l'effet comparatif de nos composés sur des souris jeunes et âgées. Par conséquent, des souris de 8 semaines et des souris de 12 mois seront utilisées pour démarrer nos protocoles. Pour les études concernant le modèle de plaie cutanée, nous utiliserons également des souris de 8 semaines car nous devons évaluer l'effet sur de nouveaux composés et les comparer avec des données antérieures utilisant des souris au même stade de développement.

Réduction

Pour chacun des groupes étudiés (groupes contrôles vs groupes traités) dans les procédures (souris jeunes), nous utiliserons 10 souris, en raison de la variabilité entre les différents animaux, et ce afin d’obtenir des données significatives. Chaque protocole nécessite son propre contrôle. Nos résultats seront comparés à certains résultats de la littérature, ce qui contribuera à éviter la réitération de certains essais déjà réalisés avec d’autres molécules aux mêmes propriétés. Après collecte des résultats, nous analyserons les données avec des tests statistiques. Notez que la stratégie expérimentale implique l'administration par voie orale ou i.p. de différentes doses aux souris, suivi par le prélèvement de tissus. Et ce, dans le but d’effectuer des mesures de paramètres fonctionnels et biochimiques et de déterminer quelle voie d'administration et quelle dose fournit les effets thérapeutiques les plus efficaces. Pour les experiences sur des souris jeunes et âgées, nous avons besoin d'un minimum de 30 souris par groupe pour obtenir une puissance significative afin d’étudier la longévité et la survie de souris âgées.

Raffinement

En optimisant les protocoles expérimentaux, nous avons privilégié des approches peu invasives afin de minimiser la douleur, la souffrance et la détresse des animaux. Nous avons déjà montré que le régime riche en graisses pendant 14 semaines et le traitement avec l’une de nos molécules n’induisent ni stress ni impact sur leur santé. Si les animaux perdent plus de 15 % de leur poids en une semaine, nous procéderons à leur mise à mort. Pour le protocole de plaie cutanée, une mise à mort compassionnelle sera pratiquée en cas de surinfection ou de signes de détresse tels que : prostration, dos voûté, pelage terne et hérissé, refus de se nourrir ou de s’abreuver, et perte de poids >15 %. Nous avons limité le nombre de composés et de doses utilisées. Le logement et l’élevage tiendront compte du bien-être animal. Des anesthésiques appropriés, et si nécessaire des analgésiques, seront utilisés pour minimiser la douleur. Les souris seront logées par groupes de trois, avec nettoyage hebdomadaire des cages et accès à la nourriture et à l’eau ad libitum.

Choix des espèces

Le modèle de souris est un modèle largement utilisé pour étudier l’effet des régimes alimentaire riche en graisse (« High Fat Diet », HFD). De manière analogue, les modèles de cicatrisation de la peau chez la souris ont été établis et bien décrits dans la littérature. Les souris diabétiques et les souris avec un régime alimentaire riche (HFD) ont été largement utilisées pour déterminer l’effet des drogues et des réponses inflammatoires suite à des désordres métaboliques liés au diabète et á l’obésité. Le choix de cette espèce de souris se justifie par le fait que nous devons également comparer nos données avec les nombreuses études présentes dans la littérature utilisant exactement les mêmes modèles. Pour les études sur des souris nourries avec un régime riche en graisses, nous devons évaluer l'effet comparatif de nos composés sur des souris jeunes et âgées. Par conséquent, des souris de 8 semaines et des souris de 12 mois seront utilisées pour démarrer nos protocoles. Pour les études concernant le modèle de plaie cutanée, nous utiliserons également des souris de 8 semaines car nous devons évaluer l'effet sur de nouveaux composés et les comparer avec des données antérieures utilisant des souris au même stade de développement.

Les procédures se limitent à quelques injections brèves, mais elles concernent 2 016 souris, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Après leur mise à mort, neuf à quatorze organes sont prélevés sur chaque animal, des glandes mammaires et salivaires à la prostate ou au vagin. L'étude porte sur les cellules souches qui redeviennent multipotentes lors de la réparation des tissus, un mécanisme réactivé dans certains cancers. Le RNT fonde ce total de plus de 2 000 souris sur la seule littérature, sans autre justification de l'effectif.

Objectifs

Certaines cellules adultes peuvent, dans des contextes particuliers, retrouver des caractéristiques qu’elles n’avaient plus depuis le stade embryonnaire. C’est ce qu’on observe notamment dans le développement de certains cancers. L’une de ces caractéristiques est la multipotence, c’est-à-dire la capacité d’une cellule à se transformer en plusieurs types de cellules différents. Nous nous intéressons à plusieurs types de tissus glandulaires : les glandes mammaires, salivaires, lacrymales et prostatiques. Chez l’adulte, ces tissus sont composés de cellules spécialisées qui ne produisent qu’un seul type cellulaire. Mais lors de la réparation d’un tissu endommagé, certaines cellules retrouvent temporairement cette capacité à se diversifier. Or, dans les cancers de ces tissus, les cellules tumorales semblent réactiver ce programme de manière incontrôlée. Notre objectif est de mieux comprendre comment ces tissus se régénèrent après une blessure. En étudiant les mécanismes qui contrôlent le passage d’un état cellulaire flexible (multipotent) à un état plus stable et spécialisé, nous espérons identifier ce qui, lorsqu’il est déréglé, peut favoriser l’apparition ou la progression de tumeurs.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra d’étudier le comportement des cellules souches et leur état de différentiation pendant la régénération tissulaire dans les épithéliums stratifiés (à plusieurs couches) chez la souris. Nos résultats aideront à identifier les mécanismes régulant le destin des cellules souches. Ces mécanismes étant déstabilisés lors de la formation de tumeurs, nous pensons qu’à long terme nos recherches contribueront à une meilleure compréhension du processus tumoral dans les tissus épithéliaux étudiés.

Procédures

Les animaux recevront une ou un maximum de 5 injections (durée de chaque injection inférieure à 10 secondes) Maximum 1 injection/jour pendant 5 jours.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues lors de l’administration des traitements seront celles liées à l’injection elle-même (gène de courte durée). Suite à l’injection des traitements, une perte de poids, ou de la diarrhée pourraient être observés pendant quelques jours.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem

Remplacement

Au fil des années, beaucoup d'efforts ont été déployés pour développer des modèles 3D in vitro, comme les organoïdes, qui soient physiologiquement pertinents pour analyser le comportement dynamique des cellules souches au cours du développement et de la régénération tissulaire. Cependant, les cellules épithéliales modifient leur comportement lorsqu’elles sont cultivées in vitro sous forme d'organoïdes et détachées de leur niche tissulaire physiologique, ce qui nous empêche d'utiliser cette technique pour toutes les questions concernant le potentiel de différenciation des cellules souches De plus, les animaux seront essentiels pour suivre les cellules souches lors de la régénération tissulaire, étant donné qu’il n’existe actuellement aucun modèle in vitro qui puisse récapituler le processus global de régénération. L’absence de structure similaire aux épithéliums étudiés dans des modèles de vertébrés non mammifères rend l’utilisation de la souris nécessaire à notre étude.

Réduction

Le nombre de souris utilisées sera réduit au minimum possible. Pour réduire au minimum le nombre d’animaux et exploiter au mieux les prélèvements, des informations seront obtenues au niveau des organes, cellules et molécules à partir du même animal. Des schémas de reproduction des souris transgéniques seront réalisés afin d’obtenir efficacement les cohortes de souris avec le génotype souhaité. . Pour chaque souris 9 organes seront collectés (glande lacrymale, salivaire, épiderme, muqueuse orale, trachée, cornée, œsophage, thymus, vessie + 2 organes chez les mâles: prostate et urètre + 3 organes chez les femelles: glande mammaire, vagin, col de l’utérus. Le nombre d'animaux de notre étude est initialement fondé sur les données de la littérature.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions réglementaires. Pour l’injection des traitements, les animaux seront observés quotidiennement. En cas de diarrhée aigue, une solution de réhydratation sera apportée. Les signes de mal être ou de déshydratation ou de perte de poids visibles seront observés avec vigilance.

Choix des espèces

L'organisation générale, le développement et le fonctionnement glandes étudiées ici sont très similaires chez la souris et chez l’Homme. Le modèle souris est donc très utilisé dans la communauté scientifique afin d'étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires du développement normal du tissu ainsi que de la régénération. De la même manière, les évènements cancéreux survenant chez l’homme et chez la souris suivent les mêmes étapes dans les différentes glandes étudiées ; perte d’identité cellulaire, activation de traits embryonnaires, prolifération non contrôlée. Les animaux utilisés pour l’étude de la régénération tissulaire seront âgés de 8 à 16 semaines. Les glandes de ces animaux sont alors constituées de progéniteurs qui réactivent la multipotence après différents dommages cellulaires

90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Chacune subit deux chirurgies des reins à une semaine d'intervalle pour induire une maladie rénale chronique, puis un gavage quotidien pendant quatre semaines qui peut irriter l'œsophage. Le porteur juge le modèle animal "indispensable", aucune étude sur cellules ou chez l'humain ne pouvant selon lui explorer la fonction rénale. L'objectif reste d'évaluer trois molécules issues du tryptophane, un bénéfice pour les patients n'étant avancé qu'au conditionnel.

Objectifs

La maladie rénale chronique touche environ 3 millions de personnes en France. Elle correspond à un mauvais fonctionnement des reins, qui ne filtrent plus correctement le sang. Cela entraîne une accumulation de substances que l’organisme n’arrive plus à éliminer normalement. Certaines de ces substances peuvent devenir toxiques et participer aux complications associées à la maladie. Parmi ces substances, certaines proviennent de la transformation des protéines de l’alimentation, et en particulier d’un acide aminé appelé tryptophane. Des études récentes réalisées chez l’humain ont montré que certaines molécules issues de la dégradation du tryptophane sont associées à une aggravation de la maladie rénale chronique. En revanche, leur effet direct sur le fonctionnement des reins n’a jamais été étudié. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer l’effet de ces molécules, appelées molécules XANA, KYNA, AAN, sur les reins de souris. Le projet se déroulera en deux parties : 1/ Déterminer les doses auxquelles ces molécules peuvent être administrées. 2/ Évaluer l’effet de ces molécules chez des souris atteintes de maladie rénale chronique. Plusieurs paramètres seront analysés afin de mesurer leur impact sur le fonctionnement des reins et sur le métabolisme général.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre comment les molécules issues de la dégradation du tryptophane affectent la progression de la maladie rénale. Si ces molécules sont liées à une aggravation des problèmes rénaux, il serait possible d'utiliser des inhibiteurs pour réduire leur production. Cela pourrait offrir de nouvelles options de traitements pour ralentir la progression de la maladie chez les humains.

Procédures

Les 90 animaux seront identifiés une fois par une perforation de l’oreille (≈1 mm, 20 sec avec contention). Induction de la maladie rénale : – 1ère étude (modèle chirurgical) : 36 souris recevront une anesthésie gazeuse (15 min) + 1 locale à chaque chirurgie,

Impact sur les animaux

L’identification des animaux par une petite perforation de l’oreille peut provoquer une douleur légère et de très courte durée. Les deux opérations nécessaires dans le modèle chirurgical peuvent entraîner une douleur après l’intervention, du stress temporaire et un risque classique de complications liées à la chirurgie ou à l’anesthésie. Dans nos expériences précédentes, la mortalité associée à cette procédure était inférieure à 5 %, et survenait surtout dans les 24 à 48 h suivant la seconde chirurgie. Les molécules doivent être administrées par gavage, ce qui nécessite une contention quotidienne des animaux pendant 4 semaines (sauf samedi et dimanche). Cette manipulation peut être stressante, même si elle dure moins d’une minute. Les gavages répétés peuvent irriter l’œsophage et provoquer une douleur. Les mesures de composition corporelle nécessitent de placer brièvement la souris dans un petit tube pendant moins de deux minutes ; cela peut provoquer un stress léger. L’évaluation de la fonction du rein implique une courte anesthésie gazeuse pour l’injection du produit et la pose du capteur, puis le port du capteur pendant environ une heure. Cela peut entraîner un inconfort temporaire. La période de jeûne de six heures, indispensable pour étudier le métabolisme du glucose, peut générer un inconfort modéré. La petite prise de sang au niveau de la queue provoque une gêne brève et légère. Aucun comportement anormal n’a été observé lors de protocoles similaires dans notre laboratoire. Toutes les procédures sont réalisées par un personnel formé, avec une surveillance adaptée, afin de réduire au maximum la douleur et le stress des animaux.

Devenir

Les 90 animaux de ce projet seront mis à mort à l’issue du prélèvement sanguin terminal afin de collecter les tissus et répondre aux questions scientifiques.

Remplacement

Les mécanismes des molécules issues de la dégradation du tryptophane sont complexes et impliquent plusieurs organes. Ni la modélisation informatique ni les études in vitro ne permettent de répondre à cette question. Une étude chez l’Homme est impossible à ce stade, car il n’existe pas de moyens non invasifs pour étudier en détail la fonction rénale et le métabolisme. L’utilisation d’un modèle animal est donc actuellement indispensable pour évaluer l’impact de ces molécules sur la progression de la maladie rénale chronique.

Réduction

Les molécules étudiées dans ce projet n’ont jamais été testées dans le cadre de la maladie rénale chronique (MRC). Un nombre minimal de 12 souris a été choisi pour la première étude. Pour la seconde étude, le nombre de souris par groupe a été déterminé à l’aide d’un logiciel, sur la base de données issues de protocoles précédents utilisant des souris atteintes de MRC. Un effectif de 12 souris par groupe est nécessaire pour obtenir des résultats significatifs, tandis que 6 souris suffisent pour le groupe contrôle non malade. Un maximum de tissus sera collecté lors de la mise à mort et conservé afin de répondre à d’éventuelles nouvelles questions et d’éviter la répétition inutile des expériences. Ces échantillons pourront également être partagés avec d’autres équipes.

Raffinement

Toutes les manipulations seront réalisées par trois expérimentateurs expérimentés afin de garantir des gestes rapides et précis. Les animaux seront manipulés avec douceur, dans un environnement calme, et observés 7x/semaine. La prise alimentaire et hydrique sera mesurée 2x/semaine par cage, et le poids individuel suivi deux fois par semaine. Les chirurgies rénales seront réalisées par du personnel expérimenté. L’anesthésie générale sera adaptée au poids et surveillée en continu, complétée par une anesthésie locale. Des analgésiques seront administrés avant et après l’intervention. Au réveil, les animaux seront placés au chaud et surveillés jusqu’à récupération complète, puis feront l’objet d’un suivi post-opératoire renforcé. La planification en deux étapes réduit la sévérité de chaque chirurgie et permet une induction progressive de la maladie. L’administration des métabolites se fera par gavage, uniquement en semaine, afin de limiter le stress et l’irritation œsophagienne. Les animaux seront surveillés 5 jours/7. Pour la mesure de la fonction rénale, une anesthésie gazeuse légère et brève facilitera l’injection du produit et la pose du capteur ; un collyre anesthésique sera appliqué. Pendant l’enregistrement (≈60 min), les animaux resteront vigiles, dans leur cage, sous surveillance rapprochée. Pour la mesure de la composition corporelle, un apprentissage préalable sera effectué une fois, une semaine avant afin d’habituer les souris à entrer dans le tube de mesure. Cet entraînement vise à réduire le stress pendant la séance de mesure, qui dure moins de deux minutes. En fin d’étude, les animaux seront anesthésiés pour un prélèvement de sang, puis mis à mort par dislocation cervicale. Des points limites précis permettront une détection précoce de toute souffrance ou dégradation de l’état général.

Choix des espèces

Bien que la souris présente certaines différences par rapport à la physiologie humaine, elle constitue un excellent modèle pour étudier la maladie rénale et l’effet de molécules spécifiques. Sa physiologie est suffisamment proche de celle de l’humain pour reproduire les altérations de la fonction rénale observées chez les patients. Des souris âgées de 10-18 semaines seront utilisées. À cet âge, les animaux sont sortis de la phase de croissance ce qui garantit une meilleure homogénéité des réponses expérimentales. Les manifestations cliniques de la MRC induite à cet âge sont reproductibles et bien caractérisées.

Pour savoir si la chaleur aggrave la toxicité d'une mycotoxine présente dans près de la moitié des céréales, 96 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Elles sont exposées quatre semaines à cette toxine par l'alimentation et placées dans une armoire chauffée à 32-35 °C, avec des mesures de glycémie après douze heures de jeûne. Le RNT décrit une baisse de poids, une respiration accélérée et une activité réduite sous l'effet combiné de la chaleur et du contaminant. La mise à mort sert à prélever le foie et l'intestin pour comparer les réponses des mâles et des femelles.

Objectifs

Tout au long de sa vie, l’Homme est exposé à un large éventail de contaminants alimentaires d'origines diverses. Les mycotoxines sont produites par certaines moisissures et sont les contaminants naturels les plus fréquents présents dans nos assiettes. La mycotoxine étudiée se retrouve dans près de 50 % des céréales et environ 80 % des individus y sont exposés. Le changement climatique qui implique une hausse des températures, bouscule le rythme naturel des cultures et modifie les périodes où les champignons peuvent les infecter, ce qui peut, selon les régions, augmenter ou réduire la présence de cette mycotoxine. Elle perturbe le fonctionnement de l'intestin notamment en provoquant une inflammation qui pourrait jouer un rôle dans l'apparition et la gravité des maladies inflammatoires de l'intestin. Le corps garde normalement une température assez stable, même si elle peut un peu varier. Quand il fait très chaud, il subit un stress thermique: cela perturbe son fonctionnement interne et modifie l’activité de nombreuses cellules. Pour se protéger, l’organisme déclenche une réaction de défense, qui se traduit par une hausse de la température corporelle, une plus forte sollicitation du cœur et une utilisation accrue du sucre comme source d’énergie. Même si plusieurs études montrent que le changement climatique peut faire varier la présence de cette toxine, aucune ne s’est encore penchée sur la façon dont elle pourrait devenir plus ou moins dangereuse pour les organismes vivants. L’objectif de ce projet est d’étudier les effets de cette toxine dans un contexte de forte chaleur et de caractériser ces effets sur différents paramètres physiologiques au niveau du foie et de l’intestin. Nous chercherons à vérifier l'hypothèse que, dans des conditions réalistes d’exposition, ces effets seront différents entre les mâles et les femelles.

Bénéfices attendus

Certains consommateurs sont quotidiennement exposés à des aliments contaminés par la mycotoxine étudiée présente dans les aliments à base de farine de blé, de maïs, etc. Dans le cadre de ce projet, nous évaluerons in vivo chez la souris si l’exposition chronique à la chaleur potentialise les effets de cette mycotoxine. Les données expérimentales permettront d’évaluer l’impact d’une exposition combinée à la chaleur et à la mycotoxine sur le métabolisme général, ainsi que sur la santé digestive et hépatique. Les résultats attendus de ce projet présentent un enjeu important pour la santé publique, compte tenu de l’exposition chronique des consommateurs à cette toxine et de l’augmentation continue des températures associées au réchauffement climatique. Si les hypothèses sont confirmées, les données produites feront l’objet de publications scientifiques et pourront être prises en compte dans l’évaluation du risque d’exposition chez l’Homme.

Procédures

L’objectif de ce projet est d’étudier l’exposition chronique à une mycotoxine lors d’un stress thermique. Les animaux seront exposés à la mycotoxine via l’alimentation pendant 4 semaines et/ou à une chaleur plus élevée que lors d’un hébergement standard (20-24°C) dans une armoire chauffante entre 32-35°C. Les animaux seront pesés une fois par semaine, ce geste dure 15 secondes. Une mesure de la glycémie et de la cétonémie sera réalisée 2 fois au cours de la procédure après 1 et 4 semaines d’exposition. Pour cela, les animaux sont mis à jeun pendant 12h, puis une goutte de sang sera prélevée. Ce prélèvement ne nécessite pas de contention mais uniquement une prise en main de la queue et prend moins de 5 secondes. A la fin de la procédure, un prélèvement de sang sera effectué puis les animaux seront euthanasiés et des organes prélevés pour analyses.

Impact sur les animaux

La consommation d’un aliment contaminé par la mycotoxine peut entrainer une réduction de la prise de poids des animaux. L’exposition à une température ambiante de 32-25°C est susceptible d’induire une augmentation de la fréquence respiratoire, une diminution de l’activité locomotrice, une modification de la prise alimentaire ainsi qu’une augmentation de la consommation d’eau. Une légère perte de poids transitoire lors des 2 premiers jours ou des modifications du comportement peuvent également être observées. Les prélèvements sanguins peuvent entraîner un stress des animaux lié à la contention (15s) et une douleur ponctuelle liée à la piqure de l’aiguille.

Devenir

A l’issue de la procédure tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever des organes destinés à être analysés pour répondre à la question scientifique.

Remplacement

Des études précédentes ont permis de montrer que la mycotoxine étudiée entraîne des perturbations intestinales et hépatiques, tandis que l’exposition à la chaleur induit un stress thermique pouvant altérer le métabolisme du foie. . En effet, des tests in vitro sur cellules ont déjà été réalisé par le laboratoire pour étudier les effets des mycotoxines. Cependant ces modèles présentent des limites car ils ne reproduisent pas la complexité d’un organisme entier avec les interactions entre organes, ne permettent pas d’évaluer correctement la métabolisation des mycotoxines et ne reflètent pas les effets globaux ou à plus long terme. Lorsqu’elle est ingérée par un organisme vivant, son devenir et ses effets dépendent notamment de son absorption intestinale et de sa métabolisation, processus qui peuvent être perturbés par un stress thermique. Ce projet nécessite donc l’utilisation d’animaux de laboratoire pour étudier les conséquences d’une exposition alimentaire à la mycotoxine dans un environnement plus chaud sur un organisme entier, impliquant l’interaction de différents tissus (foie, tissu adipeux, intestin, cerveau, muscle) et les réponses physiologiques globales du aux adaptations de l’organisme. Il est impossible de reproduire ces interactions complexes en utilisant uniquement des méthodes alternatives, telles que des cultures cellulaires.

Réduction

Le nombre d'animaux pour ce projet est défini pour permettre d'une part de répondre aux questions scientifiques et d'autre part de respecter la réduction du nombre d'animaux au maximum. Le nombre d'animaux a été limité au maximum (n=12 animaux/groupe). Cet effectif a été déterminé en utilisant des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Lors du suivi quotidien des animaux, nous serons attentifs à d'éventuels signes de souffrance et nous utiliserons une grille d'évaluation de leur état général portant sur l’apparence générale, le comportement, les signes cliniques et l’alimentation. Le cumul du score de chacun de ces critères permettra de décider d’un éventuel arrêt de la procédure. Les souris seront hébergées en groupe pour respecter leurs comportements sociaux et un enrichissement de type abri en inox ou un élément de nidification sera ajouté dans la cage. Une habituation à la préhension par l'expérimentateur sera réalisée avant le début de l'expérimentation pour diminuer ce stress.

Choix des espèces

Les lignées de souris sont largement utilisées dans la recherche sur le métabolisme. Il est connu que la lignée utilisée dans cette étude développe des maladies hépatiques. La souris présente des similitudes avec l’espèce humaine pour ce qui est des maladies et de leurs effets sur le corps. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte car nous avons besoin d’avoir un tractus digestif et un système immunitaire mature. Les souris sont adultes à partir de 8 semaines.

Les souris qui perdent 20 % de leur poids sont mises à mort. 1 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Elles sont infectées par la tuberculose au moyen d'un aérosol, puis reçoivent des composés par gavage cinq jours par semaine pendant quatre à huit semaines, l'infection pouvant provoquer une parésie et une perte de poids. Le projet teste de nouvelles molécules avant un éventuel essai clinique, et le porteur revendique un "besoin de générer un maximum de données" pour de "meilleures armes" contre la maladie.

Objectifs

Le modèle souris continue de jouer un rôle essentiel dans la sélection in vivo de molécules comme traitement ou encore vaccins avant leur passage en essais cliniques. Le projet européen, dans lequel nous sommes partenaires, est engagé dans le développement de nouvelles molécules anti-tuberculeuses. Ce projet, qui ne compte pas moins de 30 partenaires de 13 pays différents, a pour ambition d’accélérer les processus qui conduiront à la sélection de nouveaux composés et nouvelles combinaisons efficaces comme traitement contre la tuberculose avant leur entrée en phase clinique. Les nouvelles molécules sont synthétisées par des groupes pharmaceutiques partenaires, sont testées par une partie du consortium en charge des expériences in vitro et les plus prometteuses (seule ou en combinaison) passent ensuite à l’étape in vivo pour évaluer leur véritable potentiel sur un organisme vivant. Nous intervenons, avec d’autres groupes, d’autres modèles, à ce niveau-là. Notre participation à ce projet permettra de générer in vivo des données pharmacocinétiques et pharmacodynamiques chez le modèle murin pour un nombre limité de molécules savamment sélectionnées ; données qui, analysées et intégrées à l’ensemble de celles générées par le consortium, participeront donc à l’optimisation et au développement de nouveaux médicaments anti-tuberculeux, à valider ou non leur passage en phase clinique.

Bénéfices attendus

Les données générées par nos expériences combinées à celles des divers partenaires rendront compte de l’efficacité de nouveaux composés contre l’agent pathogène de la tuberculose, dont certains, telle est l’ambition de ce projet, pourront passer en phase clinique. A cela, l’apport de nouvelles technologies, l’apport de nombreuses données inédites pour caractériser la tuberculose et son évolution in vivo (imagerie, biomarqueurs…) seront un support essentiel pour le développent de meilleures armes pour lutter contre cette maladie qui demeure un enjeu majeur de santé publique au niveau mondial.

Procédures

1. L'infection des souris est effectuée par une exposition à un aérosol. Une seule exposition d’une vingtaine de minutes en début d’expérience. 2. Lors du traitement, les composés sont administrés par gavage 5 jours maximum par semaine pendant 4 à 8 semaines. Le geste technique en lui-même ne prend que quelques secondes. 3. Des prélèvements sanguins de très faible volume seront effectués. Il y aura au maximum 2 prélèvements – à plusieurs heures d’intervalle – sur un nombre restreint de souris sélectionnées. Il s’agit d’un acte rapide de quelques secondes. 4. Des prélèvements de sang seront effectués sur animaux anesthésiés juste avant leur mise à mort prévue pour le prélèvement des organes. Une fois les animaux anesthésiés, le geste technique ne prend pas plus d’1 minute.

Impact sur les animaux

Sur la base de nos expériences, l’apparition de signes cliniques (déambulation perturbée due à un début de parésie et piloérection) plusieurs semaines après une infection avec des bacilles tuberculeux est précurseur d’une perte de poids qui a terme peut conduite à la mort des animaux. Habituellement à partir de leur apparition, un suivi strict du poids d’abord 2 fois par semaine puis à fréquence plus importante selon la cinétique de la perte de poids est effectué. Dans le cas d’une parésie importante, qui pourrait rendre l’accès à la nourriture difficile, des aliments et du diet gel seront déposés dans le fond de la cage pour en faciliter l’accessibilité. La perte de 20 % du poids sera considérée comme point limite et les animaux concernés seront mis à mort (le poids référence étant le poids le plus élevé atteint par l’animal juste avant que ne débute la perte de poids). Dans le cas présent, et du fait d’un besoin de générer un maximum de données relatives aux expérimentations, les animaux identifiés par un marquage aux oreilles seront pesés une fois par semaine avec pour premier point celui correspondant au jour de l’infection. A noter que la probabilité de voir l’apparition de signes cliniques sera fortement diminuée pour les groupes d’animaux traités avec une molécule anti-tuberculeuse. Une attention particulière sera portée sur le groupe témoin non-traité avec toujours pour point limite la perte de 20 % du poids.

Devenir

Tous les animaux au cours de la procédure doivent être mis à mort pour prélever les organes cibles (poumons et rate) pour déterminer les charges bactériennes.

Remplacement

Cet important projet comprend de nombreuses études in vitro pour évaluer, entre autres, l’efficacité́ bactéricide des composés (exemple : via l’infection de lignée cellulaire). Néanmoins elles permettront de ne répondre qu’à une partie de la problématique. Ces modèles ne permettent pas d’identifier et donc de caractériser, de façon biologiquement pertinente, tout ce qui concourt, par exemple, à la colonisation du poumon et à l’établissement plus ou moins durable des bactéries. En d’autres termes le recours aux souris, chez qui le développement de la maladie est assez proche de l’homme de par notamment les réponses immunitaires à l’infection ou encore la formation de granulomes au niveau des poumons plus ou moins importants selon la virulence de la souche, permet de reproduire les processus rendant compte de ce qui sous-tend les premières phases du parasitisme – colonisation, persistance ...- des différentes populations des bacilles tuberculeux et rend compte de manière plus approfondie des phénotypes complexes d’une interaction hôte-pathogène. Les essais pré-cliniques de nouveaux médicaments antituberculeux reposent entièrement sur la combinaison des méthodologies in vitro avec ces approches in vivo (comprendre la réponse d’un organisme vivant « entier » à un traitement) avant un éventuel passage en phase clinique.

Réduction

Au sein de ce projet, une équipe de statisticiens spécialisés dans les études pré-cliniques a pour rôle de concevoir avec les expérimentateurs les designs expérimentaux en trouvant le meilleur équilibre entre les capacités (techniques et d’hébergement) des différentes équipes et la pertinence des données à générer pour répondre au mieux aux problématiques posées. Et ce, avec toujours en tête, la réduction au minimum du nombre d’animaux nécessaire. Exemples : .pour le groupe témoin traité avec une molécule dont l’efficacité est connue et très bien documentée, seul un nombre limité d’animaux seront mis à mort et uniquement en un seul point de cinétique. La charge bactérienne alors estimée en UFC par rapport à celle avant traitement donneront une tendance sur l’efficacité de la réponse qui sera comparée aux multitudes de données pour ce composé déjà existantes et qui permettront d’établir la cinétique sans avoir eu à utiliser des animaux pour des points de cinétique intermédiaires. .pour une étude avec un nouveau composé et donc avec peu voire pas de donnée de disponible, plus d’animaux seront nécessaires pour décrire la réponse au traitement au cours du temps. Néanmoins, nous ne cesserons d’optimiser au minimum le nombre d’animaux requis. Il peut être envisagé d’avoir 5 animaux pour seulement 1 ou 2 points clefs de la cinétique, comme 4 semaines et 8 semaines – dans le cas d’un traitement de 8 semaines – et ainsi obtenir des données statistiquement robustes sur ces points charnières. Ensuite sur des points intermédiaires comme à 1 semaine, 3 semaines ou 5 semaines après le début de traitement, ne mettre à mort « que » 2 animaux serait suffisant pour estimer la cinétique de la réponse. A nouveau, tout ceci repose sur l’étroite collaboration mise en place avec ces spécialistes de la modélisation informatique d’essais pré-cliniques qui analyseront l’ensemble des résultats du consortium. La procédure expérimentale ne cessera d’être optimisée, notamment en termes de nombre de points d’observation / nombre d’animaux par points au cours du traitement ou encore sur la durée entre l’ingestion des composés et le prélèvement de sang périphérique, avec toujours cette considération à minimiser les contraintes de manipulations et réduire au minimum le nombre d’animaux pour l’obtention de données utiles. A noter qu’il a été délibérément choisi que ce soient les mêmes animaux qui serviront à l’obtention des données pharmacocinétiques et des données pharmacodynamiques.

Raffinement

Des observations régulières des animaux sont effectuées tout au long de l’expérience : d’une part lors de la pesée hebdomadaire depuis l’infection jusqu’au début du traitement puis au cours des administrations quotidiennes des composés. De manière plus précise, nous serons sensibles à l’apparition du moindre signe clinique telles la parésie et la piloérection qui sont précurseurs, sur la base de nos expériences, d’une perte de poids. Dès apparition de ces signes cliniques, un suivi strict du poids à une fréquence plus importante selon la cinétique de la perte de poids est effectué (de 2 fois par semaine à tous les jours jusqu’à 2 fois par jour, l’animal étant mis à mort en fin de journée s’il est estimé que le point limite sera atteint avant la pesée du lendemain matin). Dans le cas d’une parésie importante, qui pourrait rendre l’accès à la nourriture difficile, des aliments et du diet gel seront déposés dans le fond de la cage pour en faciliter l’accessibilité. La perte de 20 % du poids sera considéré comme point limite et l’animal concerné sera mis à mort (le poids référence étant le poids le plus élevé atteint par l’animal juste avant que ne débute la perte de poids). Il est à noter également que les animaux ne sont jamais privés de nourriture et de boisson. Pendant la durée de l’expérience, ils restent dans leur environnement habituel.

Choix des espèces

Le modèle souris continue de jouer un rôle essentiel dans la recherche in vivo de nouveaux traitements anti-tuberculeux. Le développement de la maladie est assez proche de l’homme de par notamment les réponses immunitaires à l’infection tuberculeuse ou encore la formation de granulomes au niveau des poumons. Pour ce projet nous utiliserons des souris commerciales immunocompétentes C57BL/6 et BALB/c pour lesquelles de nombreuses données bibliographiques d’études pré-cliniques existent. Nous serons également amenés à utiliser un modèle de souris dont l’intérêt est grandissant depuis quelques années : la souris C3HeB/FeJ dite « Kramnik ». Il s’agit d’un modèle plus susceptible à l’agent pathogène Mycobacterium tuberculosis pouvant induire des lésions nécrotiques et reflétant au final plus fidèlement la stratification et la pathogénèse de la tuberculose chez l’homme. Nos travaux sont effectués sur des animaux adultes car nous avons besoin d’organisme mature en particulier sur le plan immunitaire.

Soumises à une batterie de tests moteurs et cognitifs, labyrinthe, force de préhension, suspension et tapis roulant, 120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. La mise à mort suit un prélèvement sanguin terminal d'un volume incompatible avec la survie, complété par le prélèvement d'organes. L'étude porte sur le rôle des plaquettes sanguines au cours du vieillissement, sur des souris de 6, 12 et 18 mois. Le RNT évoque des stimulations électriques pour forcer la marche sur le tapis tout en les qualifiant ailleurs de douces et non douloureuses, sans trancher.

Objectifs

Les maladies du cœur et des vaisseaux sanguins, dans lesquelles les plaquettes jouent un rôle important, sont très fréquentes chez les personnes âgées. Pourtant, nos connaissances sur le fonctionnement des plaquettes avec l’âge restent limitées. La plupart des données disponibles proviennent d’études menées chez des adultes d’âge moyen, et leurs résultats sont souvent simplement appliqués aux personnes âgées. Or, chez les personnes plus âgées, le contexte est très différent : elles présentent souvent plusieurs maladies chroniques et prennent de nombreux traitements, qui peuvent modifier le fonctionnement des plaquettes sans que l’on en comprenne bien les effets. Il est donc essentiel de mieux comprendre comment les plaquettes se dérèglent au cours du vieillissement et d’identifier de nouveaux moyens de les surveiller ou de les cibler. Ces recherches pourraient aider à mieux prévenir les complications plaquettaires chez les personnes âgées et à améliorer leur prise en charge médicale.

Bénéfices attendus

Ces résultats devraient permettre de mieux appréhender le rôle des plaquettes sanguines lors du vieillissement. Ces résultats apporteront donc des informations à la fois fondamentales dans la connaissance de la physiopathologie du vieillissement et aideront à évaluer l’intérêt thérapeutique de cibler les plaquettes pour un vieillissement en bonne santé.

Procédures

Les animaux seront évalués à l’aide d’une série de tests comportementaux et moteurs couramment utilisés en recherche, répartis sur quatre jours consécutifs, et réalisés sur animaux vigiles, dans des conditions contrôlées et avec une surveillance constante. • Fonctions cognitives (mémoire spatiale à court terme) Les capacités d’exploration et de mémoire spatiale sont évaluées dans un dispositif de type labyrinthe, dans lequel chaque animal se déplace librement pendant environ 8 minutes. • Fonction motrice – force de préhension La force des membres est mesurée à l’aide d’un dispositif standardisé, au cours de trois essais courts espacés d’une heure. La durée de chaque essai est limitée, pour un temps total d’environ 5 minutes par mesure. • Coordination et équilibre La coordination motrice est évaluée par un test de suspension sur câble, réalisé au-dessus d’une surface amortissante afin de prévenir tout risque de blessure. Le temps de maintien est mesuré avec une durée maximale limitée et trois essais espacés d’une heure. • Activité locomotrice et comportement exploratoire L’activité spontanée est observée pendant 10 minutes dans une arène dédiée, permettant à l’animal d’explorer librement l’environnement. • Endurance physique Les capacités d’endurance sont évaluées à l’aide d’un tapis roulant automatisé, avec une augmentation progressive de l’effort. La durée du test est adaptée aux capacités individuelles des animaux. Les encouragements à la marche reposent exclusivement sur des stimulations douces et non douloureuses, calibrées au niveau minimal nécessaire, et le test est interrompu dès l’apparition de signes de fatigue. Afin de limiter la fatigue globale et les interactions entre les différentes évaluations, les tests de mémoire spatiale, de force de préhension et de coordination motrice sont réalisés à des jours distincts, tandis que les évaluations de coordination motrice et d’endurance sont regroupées le même jour. Dans le cadre du protocole, les animaux pourront également faire l’objet de procédures de courte durée, incluant des injections d’environ 15 secondes, un prélèvement sanguin périphérique réalisé jusqu’à l’obtention de l’hémostase, ainsi qu’un prélèvement sanguin terminal de 1 à 2 minutes, effectué sur animal anesthésié.

Impact sur les animaux

Les tests expérimentaux utilisés pour cette étude génèrent un certain niveau de stress : préhension de une à cinq minutes lors de la mise en place des animaux dans les dispositifs de comportement ainsi que des stimulations électriques.

Devenir

La mise à mort de tous les animaux fait suite au prélèvement sanguin terminal de grand volume nécessaire à la caractérisation des plaquettes (volume incompatible avec la survie de l'animal) et est nécessaire pour le prélèvement d'organes.

Remplacement

Dans ce projet, nous utilisons des souris pour mieux comprendre comment les plaquettes sanguines agissent lorsque l’on vieillit. Les plaquettes sont de très petits éléments du sang qui servent à arrêter les saignements, mais qui jouent aussi un rôle important dans certaines maladies fréquentes chez les personnes âgées, comme les maladies du cœur et des vaisseaux. D’autres animaux utilisés en recherche, comme la mouche ou le poisson zèbre, ne conviennent pas pour cette étude, car leur sang fonctionne d’une manière très différente de celui des humains. Les cellules qui remplacent les plaquettes chez ces espèces ne se comportent pas de la même façon, ce qui ne permet pas de faire des parallèles fiables avec la santé humaine. En revanche, les plaquettes des souris fonctionnent presque comme celles des humains. C’est pourquoi les souris sont le meilleur modèle pour étudier l’impact du vieillissement sur les plaquettes sanguines. Ces recherches permettront de mieux comprendre certaines maladies liées à l’âge et, à terme, d’aider à mieux les prévenir afin de favoriser un vieillissement en meilleure santé.

Réduction

Plusieurs résultats seront obtenus à partir d’un seul animal. Nous limiterons aux seules expériences considérées comme absolument indispensables. Le nombre de souris utilisées sera réduit au minimum sur la base des études précédentes déjà réalisées au laboratoire et d’analyses statistiques permettant d’obtenir des résultats fiables. Les paramètres mesurés seront analysés à l’aide d’une analyse de variance.

Raffinement

Les tests expérimentaux utilisés pour cette étude génèrent peu de stress (préhension lors de la mise en place des animaux dans les dispositifs de comportement). Une habituation aux gestes de manipulation sera effectuée avant chaque lot de tests pendant 5 minutes par souris pendant 3 jours avant le début des tests pour limiter le stress généré par l’expérimentateur. Les animaux seront également acclimatés à la salle d’expérimentation pendant la phase d’habituation. Des éléments d’enrichissement seront mis en place dans la cage d’hébergement afin d’assurer leur bien-être et réduire le stress : animaux placés en groupe dans les cages et papier pour faire un nid. Si l’animal présente des signes de détresse ou une agressivité inhabituelle ou une prostration, l’animal sera placé en surveillance rapprochée. Des mesures de renforcement de l’enrichissement peuvent être mis en place comme la nourriture liquide, nidification supplémentaire. Si les signes persistent ou s’aggravent, l’animal sera temporairement exclu de l’étude et recevra si nécessaire des soins adaptés. Si l’animal présentent des signes cliniques critiques ou irréversibles comme l’apathie, une perte de poids inhabituel, difficultés de déplacements, alors l’animal sera mis à mort. Toutes les procédures utilisent des analgésiques/anesthésiants locaux ou généraux.

Choix des espèces

Dans ce projet, nous utilisons des souris pour mieux comprendre le rôle des plaquettes sanguines lors du vieillissement. D’autres modèles animaux, comme la mouche (drosophile) ou le poisson zèbre, ne sont pas adaptés à cette étude, car leur système sanguin est très différent de celui de l’être humain. Chez ces espèces, les cellules équivalentes aux plaquettes n’ont ni la même structure ni les mêmes fonctions, ce qui empêche de tirer des conclusions pertinentes pour la santé humaine. En revanche, les plaquettes des souris sont très proches de celles de l’Homme, tant par leur mode de formation que par leur fonctionnement. C’est pourquoi le modèle murin est aujourd’hui le plus approprié pour étudier comment le vieillissement modifie l’action des plaquettes et comment ces changements peuvent influencer la santé, notamment le risque de maladies liées à l’âge. Pour étudier la fragilité et les processus de vieillissement, des souris de 6, 12 et 18 mois seront utilisées

Hébergées seules pendant environ quatre mois pour protéger leurs implants, 197 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Elles subissent une chirurgie cérébrale de quatre heures, l'implantation de fibres optiques et d'électrodes, puis des tâches de navigation dont un labyrinthe aquatique, sous restriction alimentaire pour les motiver. Le RNT reconnaît que l'isolement contrarie une espèce qui vit normalement en groupe et que la nage induit stress et légère hypothermie. La mise à mort permet d'analyser leur cerveau et de vérifier la position des dispositifs implantés.

Objectifs

Le cervelet a été classiquement considéré comme une structure impliquée dans le contrôle, la synchronisation et l'apprentissage des habiletés motrices. Cependant, un ensemble de preuves récentes ont également mis en évidence son rôle dans les processus cognitifs par ses interconnexions avec les régions du cerveau impliquées dans la cognition, notamment l'hippocampe. L'hippocampe est consideré comme le siége de la navigation, une fonction fondamentale qui permet aux individus de se repérer dans l'environnement et de la mémoire spatiale, la composante de la mémoire responsable de l'enregistrement des informations sur notre environnement et notre orientation. Des études menées sur des souris ont révélé que le cervelet est crucial pour l'activité neuronale de l'hippocampe et l'efficacité des comportements de navigation. Cependant, les voies reliant le cervelet à l'hippocampe et les mécanismes sous-jacents restent inconnues. Notre projet vise à caractériser les projections cérébelleuses vers l'hippocampe, tant sur le plan anatomique que physiologique, chez des souris au comportement libre. Nous sollicitons une demande de modification car compte-tenu des premiers résultats obtenus, nous souhaitons réaliser un test comportementale complémentaire sans modification du nombre total d’animaux.

Bénéfices attendus

Les fonctions cognitives, telles que la navigation et la mémoire spatiale, sont des processus complexes qui impliquent l'intégration d'informations provenant de différentes régions du cerveau. L'étude des connexions entre ces régions permet d’appréhender non seulement les bases neuronales de ces processus, mais contribue également aux domaines plus vastes des neurosciences et de la psychologie cognitive. Elle fournit une base pour développer et tester des théories sur la façon dont le cerveau traite les informations et décide du comportement. La navigation et la mémoire spatiale sont souvent altérées dans divers troubles neurologiques et psychologiques, tels que la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson et la schizophrénie. Comprendre les circuits neuronaux en conditions normales, peut aider à détecter et à comprendre les altérations et les dysfonctionnements cérébraux qui surviennent dans ces conditions pathologiques. En étudiant les interactions entre le cervelet et l’hippocampe, ce projet permettra donc de mieux comprendre le réseau cérébral qui soutient la navigation et la mémoire spatiale en conditions normales, avec des applications potentielles dans les pathologies associées.

Procédures

Dans cette étude, trois groupes d’animaux seront soumis à des interventions distinctes. Premier groupe: Les animaux subiront une chirurgie cérébrale comprenant une injection de solution, réalisée sous anesthésie générale et analgésie. La durée maximale de cette intervention est de 4 heures. Après un délai maximal d’un mois, les animaux seront de nouveau anesthésiés puis euthanasiés au cours d’une procédure chirurgicale, sans réveil intermédiaire, afin d’éviter toute souffrance en fin d’expérience. Deuxième groupe – MODIFICATION: Les animaux subiront une chirurgie cérébrale avec injection de solution et implantation de dispositifs, sous anesthésie et analgésie, pour une durée maximale de 4 heures. Après une période de récupération d’une semaine, ils participeront à des séances d’exploration comportementale dans une arène, à l’état éveillé, pendant 60 minutes maximum par jour durant deux semaines. Des tests comportementaux seront ensuite réalisés pendant 120 minutes maximum par jour sur une période de trois mois. Ces tests incluront l’observation du comportement, l’enregistrement de l’activité cérébrale et l’utilisation de l’optogénétique, permettant la stimulation ciblée de zones cérébrales par la lumière. Une légère restriction alimentaire sera appliquée certains jours afin de motiver l’exploration de l’environnement. À la fin de l’étude, les animaux seront euthanasiés sous anesthésie lors d’une procédure chirurgicale, sans réveil. Troisième groupe: Les animaux subiront une chirurgie cérébrale avec injection de solution et implantation de dispositifs, sous anesthésie et analgésie, d’une durée maximale de 4 heures. Après une semaine de récupération, ils participeront à une expérience de navigation impliquant un labyrinthe aquatique. Ils passeront environ 15 minutes par jour dans l’eau pendant 15 jours, avec des sessions de nage limitées à 2 minutes maximum, entrecoupées de périodes de séchage et de repos. Cette expérience inclut l’utilisation de l’optogénétique. À l’issue de l’étude, les animaux seront euthanasiés sous anesthésie lors d’une procédure chirurgicale, sans réveil, selon la même méthode que pour les autres groupes.

Impact sur les animaux

Dans cette étude, certains effets indésirables peuvent survenir pour les animaux à différents moments du processus : Premièrement, les effets liés aux chirurgies : Les interventions chirurgicales, comme celles réalisées au niveau du cerveau, peuvent provoquer des effets indésirables tels que la perte de poids, une baisse de la température corporelle, de la déshydratation, ainsi que des douleurs ou un inconfort. Deuxièmement, le stress dû à l'hébergement en cage individuelle : Après les chirurgies, les animaux seront hébergés dans des cages individuelles pour protéger les implants fragiles placés lors des chirurgies. Bien que ces cages permettent des contacts visuels, auditifs et olfactifs entre eux, les souris sont des animaux qui vivent habituellement en groupe. Cette séparation peut donc provoquer un certain stress ou de l'angoisse, car elles se retrouvent privées de la compagnie de leurs congénères. Troisièmement, les expériences comportementales : Les animaux sont motivés soit par une récompense alimentaire, associée à une légère restriction alimentaire avant certaines séances, soit par la recherche d’une plateforme dans des expériences aquatiques. Ces situations peuvent induire un stress temporaire ou de l’anxiété. MODIFICATION certains animaux réaliseront une tache comportementale aquatique qui peux provoquer un stress et une légère hypothermie.

Devenir

L’ensemble des animaux sera euthanasié à l’issue des procédures. Des prélèvements seront réalisés après la mort afin d’analyser le cerveau. Ces analyses permettront d’identifier les connexions cérébrales étudiées, de vérifier la position des dispositifs implantés (fibres optiques et électrodes) et de réaliser des analyses biologiques complémentaires (notamment immunologiques).

Remplacement

L’étude des bases neurales qui sous-tendent les capacités de navigation requiert de manière indispensable l’utilisation d’animaux capables de telles performances de manière à en étudier les mécanismes sous-jacents. Étant donné que les études in vitro et les animaux invertébrés ne permettent pas l'investigation de comportements complexes, le rongeur demeure donc l'espèce la plus appropriée. La souris est un animal explorateur, ce qui se prête parfaitement à notre sujet de recherche. Ainsi, des travaux précédents de l’équipe ont montré la validité de ce modele animal dans l’étude de la navigation spatiale.

Réduction

Le projet impliquera un total de 197 animaux. Ce nombre est inspiré du nombre d’animaux utilisé dans des travaux précédents de l’équipe et réduit au maximum pour nous permettre de générer des données statistiques solides. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Ce projet utilisera des implants permettant des enregistrements électrophysiologiques simultanés d'une grande population de neurones localisés dans différentes structures cérébrales, permettant de collecter des données en plus grande quantité par souris, réduisant ainsi le nombre total d'animaux requis. L’analyse des données électrophysiologiques et comportementales s’effectuera avec des tests statistiques en ajustant des modèles à effets mixtes généralisés avec des effets aléatoires imbriqués pour tenir compte de la variabilité entre les souris ou les sessions au sein des souris.

Raffinement

À leur arrivée dans l’animalerie les animaux ont une periode d’adaptation d’au moins 5 jours. Ils sont ensuite manipulés et surveillés quotidiennement par les mêmes experimentateurs et les procédures nécessaires seront mises en place pour garantir leur bien-être (Grille de scoring). Les souris subissant une chirurgie seront anesthésiées par inhalation d’un gaz anesthesiant et receveront une injection d'analgésique et d'un anesthésique local au lieu de l’incision chirurgicale. De plus, un anesthésique local sous forme de créme est appliqué au niveau des oreilles où les barres sont fixées. Les souris sont placées sur un tapis chauffant et une solution physiologique est injectée au debut et à la fin de l’intervention afin d’éviter une hypothermie et une déshydratation. Afin d’éliminer tout risque d’inflammation et de douleur post opératoire, les souris recevront à la fin de la chirurgie et pendant 48 heures une injection d’anti-inflammatoire non stéroïdien. Pour éviter tout risque de déterioration de l'implant des souris par leurs congénères après la chirurgie les animaux seront isolés pendant environ 4 mois. Néanmoins pendant cette période un nid végétal ainsi qu’un jouet d'exploration (cube, tunnel ou abri) est placé dans chacune des cages de manière à offrir aux animaux plus d’enrichissement. De plus, les cages utilisées sont transparentes, fermées par une grille et placées les unes à côté des autres dans la pièce de stabulation. Ainsi les informations visuelles, auditives et les odeurs peuvent circuler entre les souris. Pour obtenir un comportement optimal, nous régulons la quantité de nourriture disponible pour les animaux durant les jours d’enregistrement (environ 3 mois) afin qu’ils soient plus motivés pour trouver les miettes de céréales au chocolat qui sont disposées aléatoirement dans l’environnement. Nous diminuons donc la quantité de nourriture d’ad libitum à quelques grammes afin de provoquer une légère perte de poids. Les souris sont pesées chaque jour et nous surveillons que leur perte de poids ne soit pas excessive. Pendant le weekend les souris ont de la nourriture ad libitum ce qui leur permet de retrouver leur poids de référence.AJOUT: Pour les tests de comportement aquatique, des mesures de raffinement supplémentaires sont mises en place : durée limitée des essais, séchage et repos entre chaque session, et surveillance continue pour minimiser stress et hypothermie.

Choix des espèces

La souris est le modèle traditionnellement utilisé au laboratoire. Nous disposons donc de tout le matériel réglementaire et nécessaire à son hébergement. Il s’agit d’un mammifère explorateur, qui est le plus susceptible de fournir des résultats satisfaisants en termes de performance de navigation qui est notre sujet de recherche. L'équipe a développé de nombreux tests de comportement pour cet animal au cours de travaux antérieurs, parmi lesquels ceux qui servent de fondement à nos hypothèses de travail. Le projet porte sur l'étude des réseaux neuronaux à l'âge adulte. Comme les procédures d'enregistrement électrophysiologique combinées à l'optogénétique prennent plusieurs semaines, elles ne peuvent être effectuées que sur un cerveau dont le développement est stable. Nous utiliserons des souris âgées de 3 à 8 mois maximum.

Des seuils d'alerte déclenchent le retrait de l'étude et la mise à mort des animaux qui se dégradent trop. 64 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Dès le sevrage, elles reçoivent un régime pauvre en protéines pendant une à cinq semaines pour reproduire une malnutrition infantile, avec trois injections et un retard de croissance attendu. Le projet, présenté comme pilote, cherche à décrire comment ce régime modifie la multiplication des cellules de l'intestin, en comparant mâles et femelles.

Objectifs

La malnutrition chez l’enfant est un problème majeur dans le monde. Elle peut provoquer des troubles durables de la croissance, de la gestion de l’énergie et du développement. Des études récentes montrent que les garçons semblent plus touchés que les filles. L’intestin, qui absorbe les nutriments et joue un rôle central dans de nombreux processus du corps, est au cœur de cette problématique. Pourtant, on connaît encore mal la façon dont il réagit à une alimentation pauvre en protéines. Nos premiers résultats suggèrent que ce type de régime pourrait altérer le développement des cellules qui contribuent à l’absorption des nutriments. Le but de ce projet est de mieux comprendre comment un régime pauvre en protéines influence le fonctionnement de l’intestin, essentiel à la digestion et à la communication entre les organes. Nous utiliserons une procédure pilote qui guidera le protocole pour la procédure complète, l’idée étant de comprendre à quel rythme les cellules intestinales se divisent en fonction du régime, celui-ci étant un indicateur important de la santé du système digestif. Ce projet aidera à mieux comprendre l’effet de l’alimentation sur l’intestin, en tenant compte des différences entre sexes.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre comment le fonctionnement intestinal est affecté par la malnutrition protéique juvénile, en tenant compte du sexe. Cette description de la multiplication des cellules dans l’intestin permettra à terme d’éclairer de nouvelles pistes de prévention ou d’intervention en santé humaine, où les enfants en malnutrition sont généralement sujets à des symptômes intestinaux associé à un mauvais fonctionnement intestinal (comme le transit).

Procédures

64 souris seront utilisées dans le projet. Tous les animaux seront nourris soit avec un régime contrôle, soit avec un régime pauvre en protéines (modèle de malnutrition infantile) pendant 1 ou 5 semaines. Chaque animal sera injecté avec 3 produits différent (30 secondes / injection) : un jour et demi avant, un jour avant, et juste avant la fin de la procédure. A 28 jours, 36 souris seront anesthésiées (3 minutes). A 56 jours, 28 souris seront anesthésiées (3 minutes).

Impact sur les animaux

Les trois injections de produits peuvent entraîner un gonflement ou un oedème, dont l’apparition sera surveillée après la procédure. Le régime faible en protéines a pour conséquence un retard de croissance en taille.

Devenir

L'ensemble des animaux mis en procédure seront mis à mort en vue du prélèvement des organes d’intérêt.

Remplacement

Pour comprendre comment le corps réagit à différents types d’alimentation, en particulier en cas de manque de protéines, il est nécessaire d’étudier l’organisme dans son ensemble. Aucun modèle en laboratoire (sans animal) ne permet aujourd’hui de reproduire la complexité du corps humain, où plusieurs organes communiquent entre eux et influencent ensemble l’état nutritionnel. C’est pour cette raison que l’utilisation d’animaux est indispensable dans ce projet. La souris a été choisie car elle représente un bon modèle pour étudier les effets d’une alimentation pauvre en protéines dans des conditions proches de la physiologie humaine. L’objectif est de mieux comprendre ce qui se passe dans l’intestin. Ce type d’étude ne peut pas être réalisé chez l’humain.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été limité autant que possible tout en permettant d’obtenir des résultats fiables. Nous avons choisi d’inclure 7 animaux par groupe, sur la base d’un calcul statistique garantissant la solidité des conclusions. Ce calcul s’appuie sur des données que nous avons déjà pour la mesure de la prolifération chez les souris adulte. La mesure de plusieurs paramètres sur chaque souris permet d’éviter la multiplication des cohortes. Les analyses prévues permettront de comparer les effets du régime alimentaire et du sexe.

Raffinement

L’étude commencera uniquement avec des animaux suffisamment développés, pesant plus de 7 g au moment du sevrage. La nourriture sera mise à portée des plus jeunes pour qu’ils puissent y accéder facilement. Des seuils d’alerte seront définis à l’avance : si un animal les atteint, il sera retiré immédiatement de l’étude pour éviter toute souffrance. Le régime pauvre en protéines et les méthodes utilisées sont déjà bien maîtrisés au laboratoire et ne provoquent pas de signes de souffrance.

Choix des espèces

La souris, un animal omnivore comme l’humain, est couramment utilisée pour les recherches en nutrition. Son microbiote est bien connu et de nombreux outils scientifiques existent déjà, ce qui en fait un modèle préclinique idéal pour étudier le fonctionnement de l’intestin lors de changements alimentaires. Les animaux seront suivis pendant 1 ou 5 semaines après le sevrage, c’est-à-dire de 3 à 8 semaines d’âge. Le but du projet est de comprendre comment un manque de protéines dans l’alimentation influence l’intestin durant la période juvénile. Il est important de commencer l’étude dès le sevrage, car l’intestin joue un rôle essentiel dans l’absorption des nutriments dès les premiers stades de la vie et peut ainsi influencer de nombreux aspects du développement, comme la croissance.