Rongeurs

180 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent deux injections intramusculaires d'un candidat vaccin peptidique contre la dengue sous anesthésie, ainsi qu'une à deux prises de sang par voie rétro-orbitale, avant d'être tuées pour prélèvement des organes. Le porteur indique qu'aucun signe clinique n'est attendu, le vaccin étant "faiblement immunogène", et que les mâles sont écartés pour éviter le stress lié à un dominant. Il conclut que la réponse immunitaire antivirale ne peut être reproduite in vitro.

Objectifs

La dengue ou « grippe tropicale » est une maladie virale transmise par piqûre de moustique. Chaque année, on rapporte 400 millions de cas de dengue dont 500 000 cas sont associés à des fièvres hémorragiques. A l’heure actuelle, il n’existe pas de vaccin efficace sur le marché. L’objectif de ce projet est d’évaluer la capacité d’un candidat vaccin à induire une réponse immunitaire protectrice de type cellulaire contre le virus de la dengue. Pour cela, des souris recevront deux injections intramusculaires du candidat vaccin (Une immunisation et un rappel 21 jours après). Trois adjuvants différents seront comparés afin de choisir celui permettant d’induire la meilleure réponse cellulaire. Les animaux seront mis à mort à 7 jours ou 28 jours post-rappel afin de permettre la mesure de la réponse cellulaire. Ce projet nécessite l’utilisation de 180 animaux.

Bénéfices attendus

A l’heure actuelle, il n’existe aucun vaccin permettant l’induction d’une protection efficace contre le virus de la dengue. Ce projet permettrat de démontrer l’efficacité d'un candidat vaccin à induire une réponse immunitaire cellulaire contre le virus de la dengue.

Procédures

2 injection intramusculaires ( 50 uL) à jours 0 et 21 sur animaux anesthésiés à l'isofluorane. 1 à 2 prélèvements sanguins (150 uL) par voie retro-orbitale sur animaux anesthésiés à l'isofluorane.

Impact sur les animaux

Le candidat vaccin est un vaccin de type peptidique, donc faiblement immunogènes. Ainsi, aucun signe clinique (fièvre, perte de poids…) n’est attendu suite à la vaccination. Les adjuvants sélectionnés sont des adjuvants de type liposomes, couramment utilisés pour l’évaluation de l’immunogénicité de candidats vaccin chez la souris. Les composants de ces adjuvants permettent l’induction d’une inflammation locale modérée au niveau du muscle et du ganglion drainant le muscle, nécessaire à l’initiation de la réponse immunitaire. Cependant, ces adjuvants sont très bien tolérés et aucune réaction locale ou systémique n’est observée après une ou deux injections.

Devenir

Mis à mort pour prélèvement des organes (mesure des paramètres immunologiques)

Remplacement

La réponse immunitaire antivirale est un phénomène biologique complexe faisant intervenir de multiples types cellulaires dans différentes localisations (muscle, ganglions drainants, rate …). La procédure ne peut donc être reproduite in vitro.

Réduction

Nous utiliserons 5 animaux par groupe expérimental, analysés individuellement. Un test de Mann-Whitney sera réalisé́ car la comparaison porte sur 2 groupes avec un faible nombre d’échantillons, et aucune hypothèse n'est présupposée. En considérant des différences de moyenne d'au moins 20% avec une déviation standard inférieure à 5% et un seuil minimal du risque alpha à 5%, un groupe de 5 animaux permet d’obtenir une puissance de test d'environ 0.8. Les expériences seront répétées une fois pour vérifier la reproductibilité́ et la validité des résultats (Giles, J. The trouble with replication. Nature 442, 344–347 (2006)). La procédure sera réalisée avec des femelles. En effet, les souris mâles sont à écarter dans les expériences longues (> 3 semaines) afin d’éviter le stress éventuel généré par la présence d'un mâle dominant dans la cage. Si aucune réponse CD8 n’est observée 7 jours après rappel, le projet s’arrêtera et la réponse à jour 28 ne sera pas évaluée.

Raffinement

Une semaine d'acclimatation sera réalisée avant la mise en place de chaque expérience. A la réception, des groupes seront réalisés et maintenus tout au long de la procédure pour créer des groupes sociaux et éviter le stress dû à l'isolement. Tous les traitements/prélèvements sont administrés sous PSM II afin de prévenir tout risque d’infection opportuniste. Précautions particulières : - Immunisation par le candidat vaccin : Les injections intramusculaires sont réalisées sous brève anesthésie à l’isofluorane. Aucun signe clinique, local (douleur à la patte) ou systémique (fièvre, perte de poids…) n’est attendu suite à l’immunisation. Les animaux feront néanmoins l’objet d’une surveillance dans les minutes qui suivent l’injection, le lendemain, puis chaque semaine afin de s’assurer qu’aucun signe de souffrance ne soit observé. Une attention particulière sera portée au boitillement évocateur d’un douleur à la patte ayant reçue l’injection. Si une souris présente des signes de souffrance tel que le pelage hérissé, la prostration ou l'absence de réponse aux stimuli extérieurs, elle sera exclue de la procédure et immédiatement mise à mort par dislocation cervicale. - Prélèvements de sang : un collyre anesthésique est appliqué à l’œil avant la procédure pour réduire toute douleur. Les prélèvements de sang sont réalisés sous brève anesthésie à l’isofluorane. Dans le cas où l'œil montrerait des signes d'inflammation après l’injection, il sera soigné par l'application d'une pommade vétérinaire ophtalmique associant un corticostéroïde et un antibiotique (Framycétine).

Choix des espèces

Les éléments immunogènes du candidat vaccin sont capable d'être reconnu par le système immunitaire de la souris. Les souris seront âgées de 8-12 semaines au démarrage de l’expérience, le système immunitaire de ces animaux doit être complètement mature et non vieillissant.

192 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes subissent une électroporation in utero sous anesthésie, puis la moitié des mères et de leurs portées passent huit jours dans un air appauvri en oxygène, pour modéliser l'hypoxie de la grande prématurité. Le porteur indique une mortalité fœtale pouvant atteindre 10 % et des lésions cérébrales diffuses chez les souriceaux, qui sont ensuite tués pour prélèvement du cerveau. Il affirme que l'approche in vivo est "incontournable" car les modèles in vitro ne reconstituent pas la complexité des connexions nerveuses.

Objectifs

La grande prématurité résulte fréquemment en des périodes de manque d'oxygène (appelées périodes d'hypoxie) du fait notamment de l’immaturité des poumons, et aboutit donc à des perturbations profondes de la capacité du cerveau à utiliser et produire de l'énergie (on parle de capacité métabolique), et à des lésions diffuses du cerveau. Bien que le cerveau du nouveau-né présente une capacité à se réparer supérieure à celle du cerveau adulte, des études récentes suggèrent que cette réparation pourrait être imparfaite ou même inadaptée. Ainsi, la probabilité d’apparition de troubles cognitifs est très fortement augmentée à l'adolescence, chez les enfants grands prématurés par rapport à ceux nés à terme, possiblement du fait de la mise en place de réseaux neuronaux anormaux. Objectif du projet : Cette étude a pour but de tester comment les perturbations survenant autour de la naissance et notamment l’hypoxie périnatale entraîne une perturbation durable de l’activité métabolique cérébrale, et notamment de l’activité des mitochondries, qui sont les organelles responsables de l’essentiel de la production d’énergie cellulaire. Ces perturbations métaboliques entraîneraient à long terme des anomalies du développement des réseaux neuronaux qui peuvent expliquer la survenue plus tard dans la vie de troubles neurologiques variés. Ce projet utilisera un modèle murin de naissance très prématurée (hypoxie néonatale chronique), combiné à une méthode chirurgicale permettant d’exprimer des protéines fluorescentes dans des populations ciblées de neurones du cortex cérébral chez la souris. Il permettra de répondre en même temps à deux questions : - Quelles sont les conséquences de l’hypoxie périnatale sur le développement à long terme du cerveau - Est-ce que ces défauts sont associés à un défaut métabolique persistant dans ces neurones.

Bénéfices attendus

Ce projet a une double finalité, à la fois fondamentale et translationnelle (préclinique) : -Sur un plan translationnel, ce projet permettra de mieux prédire les conséquences à long terme de lésions cérébrales survenant tôt dans la vie (pendant la période périnatale). Les données issues de ce projet permettront également de comprendre quels sont les mécanismes qui font que la réparation cérébrale n’est pas totalement efficace, ce qui pourra conduire à l’identification d’indicateurs biologiques ou de pistes thérapeutiques ultérieures. -Sur un plan fondamental, ce projet pourra fournir des hypothèses de recherche et des pistes de mécanismes cellulaires pour les chercheurs travaillant sur l’étude du développement cérébral.

Procédures

Des femelles gestantes seront soumises une fois, à une procédure de chirurgie sous anesthésie et avec analgésie péri/post-opératoire, appelée électroporation in utero, d’une durée de 30 minutes Après la naissance, la moitié des animaux (femelles et portée) seront soumis pendant 8 jours à un environnement appauvri en oxygène Les prélèvements seront réalisés postmortem pour l’étude du cerveau par histologie. La mise à mort sera réalisée par une éthode dérogatoire seule à même de préserver les tissus cérébraux.

Impact sur les animaux

Pour les femelles : La procédure permettant l'expression de marqueurs fluorescents dans les neurones et mitochondries, implique une approche chirurgicale invasive avec réveil. Dans de rares cas, nous pouvons observer une difficulté de mise bas. Les infections sont en théorie possibles, mais en pratique jamais observées suite au respect des règles d’asepsie. Pour les souriceaux : Une mortalité foetale (estimée à 10 pour cent maximum des embryons sur lesquels la procédure est effectuée est constatée, bien qu’il soit difficile de déterminer si la résorption fétale résulte de l’élimination spontanée de fétus surnuméraires pendant la gestation, ou d’une mortalité liée à la procédure chirurgicale. La procédure n’a pas de conséquence sur le développement du souriceau. Une réduction périnatale de l'oxygène ambiant (hypoxie) entraîne un retard de croissance et des lésions cérébrales diffuses. Après la période de réduction de l'oxygène ambiant, les souriceaux rattrapent leur retard de croissance et les lésions cérébrales apparaissent réparées au niveau macroscopique. Des altérations à long terme de la connectivité cérébrale résultant de l’hypoxie périnatale peuvent en théorie entraîner des déficits cognitifs (défauts d’apprentissage, d’activité spontanée et de comportements sociaux) qui peuvent être détectés lors de tests de comportement mais sont généralement impossibles à détecter dans l’observation de comportements spontanés de souris élevées en cage.

Devenir

Les femelles ayant subi une procédure chirurgicale ne seront pas soumises à une nouvelle procédure pour raison éthique. Une réutilisation des femelles n'ayant pas subi de procédure chirurgicale sera envisagée, notamment comme souris allaitante pour les expériences suivantes. Une utilisation des souriceaux surnuméraires sera envisagée, notamment pour la collecte de tissus. Les souriceaux doivent être mis à mort pour la réalisation de prélèvements post mortem.

Remplacement

Les hypothèses de travail ont été au préalable validées dans des modèles in vitro et justifient à présent de confirmer par une approche in vivo, incontournable pour ce projet de recherche. En effet, les séquelles neurologiques observées suite à une oxygénation insufisante, dépendent de mécanismes complexes (interactions cellulaires, rôle de la réponse immunitaire, inflammation tissulaire) impossibles à reproduire in vitro d’où la nécessité d’un modèle animal pour étudier la pathologie. De plus les modèles in vitro ne permettent pas de reconstituer totalement la complexité des connections nerveuses entre régions du cerveau, qui est l’objet de ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux inclus dans l’étude a été calculé sur la base de notre expérience préalable. Certains animaux devront être exclus de l’analyse à postériori pour des raisons techniques (mauvaise qualité du marquage des neurones et des mitochondries qu'ils contiennent ou de préparation histologique). Les animaux seront traités deux à deux (deux femelles, soit deux portées, en parallèle : groupe expérimental et groupe témoin) et les portées seront analysés au fur et à mesure afin d’atteindre au plus vite le nombre d’animaux cible de l’étude, ce qui permettra de ne pas utiliser d’animaux inutilement. De plus l’étude est prévue sur 4 âges correspondant à 4 stades de développement distincts, mais nous commencerons par les âges J11 et J45 qui correspondent aux effets les plus forts attendus dans notre étude. Dans le cas où les résultats à ces âges invalideraient notre hypothèse (étude négative), nous arrêterions l’étude sans procéder à l’étude des autres âges. L’analyse des projections nerveuses sera réalisée sur des cohortes d’animaux des deux sexes, par un test statistique approprié. Cette analyse permettra de déterminer la part de la condition expérimentale (normoxie/hypoxie), du sexe, de l’environnement, et leur interaction, sur le phénotype observé. Nous tirerons par conséquent un maximum d’information des animaux inclus dans l’étude. La méthode d’échantillonnage utilisée permet non seulement un échantillonnage homogène de notre région d’intérêt, mais aussi l’utilisation des mêmes cerveaux pour des marquages immunohistochimiques variés, permettant de minimiser le nombre d’animaux nécessaire à ce projet. Enfin, un système de préservation de toutes les séries de coupes non utilisées a été mis en place pour optimiser sur le long terme l’utilisation du tissu tout en réduisant le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Ce projet repose sur des procédures maitrisées. L’approche chirurgicale sera réalisée selon les standards de la médecine vétérinaire (asepsie, anesthésie et analgésie). Un soin particulier sera porté à la récupération postopératoire, et à la limitation du stress autour de la période de la naissance, au moyen notamment d’un enrichissement varié stimulant la nidation. Les souriceaux entrant dans la procédure seront sélectionnés par l’observation transcranienne de la fluorescence au moyen d’une lampe LED. Un suivi journalier des souriceaux sera effectué afin de détecter immédiatement tout signe d’inconfort des animaux. Les femelles seront échangées tous les 2 jours entre les cages normoxiques et hypoxiques, afin de préserver la quantité et la qualité du lait qu’elles produisent pour nourrir leurs souriceaux, et de minimiser au maximum le stress conséquent à la procédure sur les animaux. Une méthode d’imagerie et d’analyse innovante sera utilisée pour tirer encore plus d’information par animal, en permettant d’observer les projections axonales dans l’ensemble des régions du cortex.

Choix des espèces

L’architecture du cerveau de la souris est très proche de l’architecture du cerveau humain dans sa structure et son fonctionnement. Le modèle murin est un modèle animal reconnu dans le cadre des études des pathologies neurodéveloppementales ainsi que dans le développement et le fonctionnement du cortex cérébral. Par ailleurs, les méthodes ont été établies dans cette espèce ce qui nous assure que le projet est faisable et permettra de répondre à la problématique scientifique. Les femelles gestantes seront des adultes entre 8 et 24 semaines, selon la disponibilité des animaux chez le fournisseur agréé. Les souriceaux seront utilisés aux âges suivants afin d'étudier les effets d'une réduction de l'oxygène ambiant à des étapes clés de la mise en place des réseaux de neurones du cerveau: -J(our après la naissance) 11, correspondant à la fin de la période de réduction de l'oxygène ambiant. -J21, correspondant à l’âge ou les connections nerveuses sont établies, mais où elles sont encore immatures -J45, correspondant à un âge où les connections nerveuses maturent. Cet âge est également pertinent car il correspond à la maturité sexuelle chez les souris (adolescence/jeune adulte), qui est un âge auquel plusieurs maladies neuropsychiatriques sont détectées (par exemple schizophrénie) -J90-J120, correspondant à un stade adulte et qui est également le stade où nous observons des déficits comportementaux.

1 008 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un cathéter est posé dans leur veine jugulaire pour qu'ils s'auto-administrent une drogue lors de dizaines de séances de six heures, certaines associant la prise à des chocs électriques sur les pattes pour mesurer jusqu'où ils la poursuivent. Le porteur qualifie ces chocs de "légers" et rappelle que l'animal peut à tout instant cesser de répondre, les rats étant tués pour analyses moléculaires. Il affirme que ce type d'étude de l'addiction ne peut être mené que sur un animal vivant aux réseaux neuronaux intacts.

Objectifs

L’addiction est une maladie comportementale et psychiatrique chronique pour laquelle il n’existe pas de traitements efficaces et qui apparaît chez certains consommateurs de substances d’abus. Afin de trouver des stratégies thérapeutiques efficaces, il est nécessaire de mieux comprendre les mécanismes responsables de l’apparition de cette pathologie. Pour cela, ont été développés chez les rongeurs, des modèles d’addiction, qui miment les critères de diagnostics de l’addiction chez l’Homme, comme, par exemple, leur incapacité à limiter la recherche ou la prise de drogue malgré des effets désagréables. Ce projet a pour but de mimer et caractériser cette difficulté à contrôler la consommation de drogues malgré les conséquences négatives associées à cette dernière. Dans un modèle d’addiction chez le rat, nous nous focaliserons sur la capacité individuelle des rats à contrôler leur prise de drogue quand celle-ci est associée à des effets désagréables. Pour étudier cette vulnérabilité individuelle, nous utiliserons une approche qui permet de déterminer l’effet désagréable maximal qu’un rat est prêt à recevoir pour obtenir des injections de drogue et ainsi déterminer un seuil de vulnérabilité à développer une addiction pour chaque rat. Ce modèle servira donc à distinguer les animaux développant une addiction des animaux capables de contrôler leurs prises de drogues. Ce projet pourrait apporter une explication au fait que parmi tous les utilisateurs de drogues, seule une proportion devient addict, et perd le contrôle de sa consommation et de rechercher les mécanismes neurobiologiques impliqués. Ce projet vise à caractériser la distribution du comportement compulsif vis à vis de la drogue au niveau d’une population de rats et les informations obtenues seront utilisées dans le futur pour raffiner les prochaines expériences utilisant le même modèle.

Bénéfices attendus

Cette approche a plusieurs bénéfices. Notre procédure présente 2 avantages par rapport aux procédures traditionnelles : 1) elle « s’auto-ajuste », c’est à dire que l’intensité des conséquences gênantes de la prise de drogue s’adapte au comportement individuel de l’animal avec la possibilité d'arrêter la prise de drogue à des niveaux de stress très faible et éviter ainsi des stress de durée plus importante. Au contraire, les procédures traditionnelles imposent un niveau de sanction fixe qui est souvent plus élevé de ce que les rats auraient supportés s’ils avaient le choix. 2) elle permet de mesurer finement la résistance à la sanction en une seule session en déterminant le niveau maximal de sanction qu’un animal est prêt à supporter pour recevoir de nouvelles doses de drogue. En effet, les procédures traditionnelles imposent un niveau de sanction fixe qui permet une distinction entre les rats résistants et vulnérables à la punition. D’un point de vue plus général, les 2 variations de paramètres proposées nous permettent de se rapprocher de ce que l’on peut observer dans l’addiction chez l’Homme. En effet, l’utilisation d’un délai entre la prise de drogue et la punition (paramètre 2) nous permet de mimer le fait que, chez l’Homme, la conséquence négative n’est pas instantanée et arrive plutôt de façon décalée temporellement après la prise de drogue. L’autre paramètre (1), donne la possibilité de distinguer la recherche et la prise de drogue et nous permettra de caractériser plus facilement les différents mécanismes motivationnels sous-jacents à la persistance de la recherche et de la prise malgré des conséquences désagréables. La découverte des mécanismes neurobiologiques impliqués dans nos effets pourrait aider à une meilleure prise en charge de ces pathologies, tenant compte de la vulnérabilité / résistance individuelle aux effets désagréables associées à la prise de drogues.

Procédures

Tous les rats seront soumis à une chirurgie d’implantation de cathéter dans la veine jugulaire sous anesthésie générale de 15 minutes pour pouvoir s’auto-administrer les drogues. Ils suivront ensuite tous des sessions d’entrainement d’auto-administration sans sanction pour développer un comportement de prise de drogue stable (15 sessions, 1 session par jour), 6h/ jour. Une fois le comportement opérant de prise acquis et stable, tous les animaux suivront des sessions d’auto-administration sans et avec sanction (6h maximum / session, 1 session / jour), 50 sessions. Ils suivront également des sessions d’auto-administration pour déterminer le niveau individuel de motivation de l’animal qui est le niveau de réponse maximale fournit par l’animal pour obtenir la drogue (1 session par semaine, 6h maximum / session), 10 sessions.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues pour cette procédure sont : - cathéter : gène, risque d'infection ou de démangeaisons - auto-administration : La prise de drogue chronique (bien que volontaire) peut causer un stress modéré chez certains individus, ce qui est attendu car, comme chez l’Homme, un état « addict » chez le rat peut être associé à un état émotionnel négatif. - sanction / stress : Les stress délivrés lors des phases de sanction sont de légers stress au niveau des pattes des rats (sur la grille du sol des cages). Les stress utilisés ne sont pas d’intensité et/ou durée telle d’induire des conséquences négatives durables, les animaux pourront à chaque instant éviter le stress induit (et diminuer son intensité) en renonçant à répondre pour obtenir la drogue.

Devenir

Tous les animaux, à l’issue de tous les tests d’auto-administration avec et sans sanction, seront mis à mort afin de procéder à des analyses moléculaires.

Remplacement

Ce type de recherche, visant à comprendre les bases d'une maladie psychiatrique telle que l’addiction aux drogues, peut-être uniquement menée sur un animal vivant. En effet, l’étude de cette pathologie comportementale et psychiatrique nécessite la présence de réseaux neuronaux intacts et fonctionnels qui sont uniquement accessibles dans des modèles d’animaux intègres et donc vivants. Il n’est donc pas envisageable d’utiliser des méthodes de substitution à l’animal entier.

Réduction

Des études statistiques nous ont permis de définir les effectifs nécessaires à la réalisation de ce projet de façon à mettre en évidence des différences significatives tout en limitant au maximum le nombre d’animaux utilisés. Nous minimiserons le nombre d'animaux utilisés par des méthodes expérimentales validées et reproductibles et en ayant recours à des analyses statistiques de type ANOVA et un calcul de puissance qui permet de calculer le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Ainsi, le nombre d'animaux nécessaires par groupe sera de 12. Nous estimons un ajout de 2 animaux par groupe dus aux pertes liées à la compléxité du geste des procédures chirurgicales (lors de l’insertion du cathéter dans la veine, la veine peut céder) ou liées à la durée du projet avec le risque que le catheter se bouche sur la longueur de la période d’auto-administration. Ainsi 14 animaux par groupe, seront nécessaires à notre étude. Avec 18 lots (9 lots mâles et 9 lots femelles) soit 1008 animaux au maximum.

Raffinement

Nous avons planifié ce projet en gardant à l'esprit la nécessité de réduire, sinon de soulager l'inconfort, la douleur, la détresse ou l'angoisse des animaux, et dans le but d'obtenir plus d'informations pertinentes à moindre coût en terme de "mal être" animal. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape par une surveillance régulière des animaux selon une grille de suivi de bien-être animal. En cas d’apparition de signes de mal-être, et suivants des points limites établis, une prise en charge adaptée sera appliquée et un traitement antalgique sera mis en place si nécessaire. Le bien-être animal est également assuré par l’apport d’enrichissement spécifique aux rongeurs dans le milieu (tunnels, stick de bois (pour répondre à leur besoin naturel de ronger) et le recours à l’anesthésie générale, additionnée d’une anesthésie locale en présence d’antalgiques, pendant laquelle l’animal sera placé sur un tapis chauffant pour assurer le maintien de sa température corporelle. Dès leur arrivée à l’animalerie, les animaux seront hébergés à deux par cage en conditions normales (température et humidité contrôlées, cages ventilées) et accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Les procédures débuteront après une période d’acclimatation de 10 jours minimum. Les manipulations sont réalisées par des expérimentateurs expérimentés et compétents.

Choix des espèces

Le rat est, avec la souris, l’animal le plus utilisé pour l’étude de l’addiction dans les modèles animaux car les rats ont des réponses aux drogues qui sont similaires à celles de l’Homme et ils s’auto-administrent toutes les drogues abusées par l’Homme de façon spontanée. Nous utiliserons des rats de la lignée « Sprague-Dawley ». Il s’agit de rats « outbred », c’est à dire avec un niveau de consanguinité limité ce qui permet une variabilité génétique majeure entre les individus. Les rats Sprague-Dawley sont les plus utilisés dans le domaine biomédical. Dans cette étude, nous utiliserons des rats « jeunes adultes » de 7-8 semaines au début du projet (qui durera environ 5 mois) afin de limiter le risque de variabilité qui pourrait être lié à l’utilisation de rats en phase d’adolescence (juvéniles).

1 800 rats vont être utilisés, la quasi-totalité tués à l'issue et vingt réutilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des antibiotiques puis des gavages quotidiens de probiotiques pendant six semaines, avec des prélèvements de sang sous anesthésie, pour tester des produits censés limiter les effets digestifs des antibiotiques. Le porteur indique que les antibiotiques peuvent provoquer perte de poids et diarrhées et que les gavages répétés génèrent stress et irritations, le tube digestif étant prélevé après mise à mort. Il affirme que la physiopathologie digestive ne peut pas être reconstituée hors de l'animal vivant.

Objectifs

En clinique, il existe différents effets secondaires induits par un traitement antibiotique : par exemple, une diarrhée survient chez 10 à 25% de patients traités avec l’association amoxicilline/acide clavulanique qui est très largement prescrite dans le monde. 5 à 10% des patients traités à l’ampicilline ont également des diarrhées. Il existe d’autres effets secondaires comme les crampes abdominales, une fièvre ou une leucocytose. Un traitement antibiotique peut également provoquer un risque accru d’infection par des organismes pathogènes. Les probiotiques sont des micro-organismes vivants qui peuvent avoir un effet protecteur sur les effets délétères induits pas les antibiotiques. Ce projet a pour but d’étudier les effets protecteurs de molécules probiotiques sur les effets secondaires gastro-intestinaux induits par différents antibiotiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’évaluer l’efficacité de produits sur les effets secondaires induits par l’utilisation d’antibiotiques sur certains paramètres physiologiques (prise alimentaire, consistance des fèces, altération de la barrière intestinale) et sur la composition du microbiote et du métabolome intestinal. Ces données permettront de supporter le développement ou l’utilisation de produits pour limiter les effets secondaires de l’usage d’antibiotiques.

Procédures

Certains traitements nécessiteront des gavages quotidiens sur animaux vigiles. Ceux-ci seront effectués par du personnel expérimenté pour limiter le stress de l'animal et avec des sondes souples pour limiter les irritations et auront lieu pendant 6 semaines maximum. Certains paramètres mesurés nécessitent un prélèvement sanguin. L'animal sera anesthésié avant celui-ci. Le prélèvement sanguin aura lieu au maximum une fois par semaine avec une semaine de récupération entre chaque prélèvement minimum et au maximum pendant 4 semaines.

Impact sur les animaux

L’administration d’antibiotiques peut entrainer une perte de poids et des diarrhées. Les rats seront observés attentivement pour respecter les points limites. L’administration répétée par gavage peut générer du stress et entrainer des irritations. Les traitements seront effectués par une personne expérimentée afin de limiter l'angoisse des animaux au maximum et à l’aide de sondes souples pour limiter les irritations.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin d'expérience car leur tractus digestif doit être prélevé pour des études histologiques. Dans la phase de mise au point certains animaux n'ayant pas reçu d'antibiotiques pourront être réutilisés.

Remplacement

La physiopathologie du tractus digestif est complexe et ne peut pas être reconstituée dans des modèles non in-vivo.

Réduction

La variabilité des réponses aux effets d’un traitement antibiotique justifie une taille de groupe de minimum 12 animaux par condition expérimentale. Un effectif inférieur expose à un risque de devoir reproduire les procédures pour valider statistiquement la solidité des résultats obtenus.

Raffinement

Les rats seront hébergés à plusieurs afin de maintenir leur socialisation et dans des cages enrichies avec des tunnels pour qu’ils puissent s’abriter. Ils seront suivis quotidiennement et des points limites sont mis en place pour éviter la souffrance.

Choix des espèces

Après une étude de la littérature scientifique, les rongeurs jeunes adultes sont des modèles fréquemment décrits. Eventuellement, si les résultats de la première partie du projet ne sont pas concluants, des adultes plus âgés pourront être utilisés. Le rat a été choisi car les quantités de fèces qu'il génère sont plus importantes que chez les souris, ce qui permet de limiter le nombre d'animaux utilisés.