Rongeurs
Étude de faisabilité d’une stratégie de thérapie génique pour la maladie de Willebrand
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
737 souris vont être utilisées pour tester une thérapie génique contre la maladie de Willebrand, une maladie hémorragique, dont 50 opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil. Après une injection, elles subissent des prélèvements sanguins sous anesthésie puis un test d'hémostase terminal, incision ou section des vaisseaux de la queue, pouvant durer jusqu'à quarante minutes. Ce test mesure la capacité du sang à cesser de couler, avant un éventuel passage à l'humain. Le RNT affirme que la coagulation exige "absolument un organisme vivant entier" et qu'aucun test ne peut aujourd'hui éviter le recours à l'animal.
Objectifs
Les maladies hémorragiques familiales, telles que la maladie de Willebrand, restent assez méconnues. Ces maladies empêchent l’arrêt des saignements. Les traitements disponibles sont lourds (injections intraveineuses répétées) et pas toujours efficaces. Une approche par thérapie génique, avec une seule administration, pourrait donc représenter une avancée majeure dans la prise en charge de ces patients et améliorer beaucoup leur qualité de vie. Notre projet va consister à tester, chez un modèle de souris mimant la maladie de Willebrand humaine, l’efficacité de cette nouvelle approche thérapeutique à l’aide de tests bien standardisés.
Bénéfices attendus
A court terme, les résultats de cette étude doivent permettre d'établir la preuve de concept de l'efficacité de cette thérapie dans la maladie de Willebrand. A terme, ce projet devrait pouvoir servir de base pour la mise en place d'essais cliniques visant à déployer cette thérapie, moins lourde que les thérapies actuelles, chez les patients.
Procédures
Toutes les souris reçoivent une injection rapide (5-10 secondes) sur animal vigile. 1) Un groupe reçoit seul un prélèvement (20-30 secondes) sous anesthésie 3/5 jours après injection et est euthanasié. 2) Un groupe reçoit un prélèvement (10-20 secondes) sous anesthésie 3 jours après injection et, 2/5 jours après, un test d’hémostase terminal (incision ou section des vaisseaux de la queue) sous anesthésie (maximum 40 minutes). 3) Un groupe reçoit trois prélèvements (10-20 secondes) sous anesthésie toutes les quatre semaines, puis, un test d’hémostase terminal sous anesthésie (maximum 40 minutes) a 12 semaines. Toutes les souris sont euthanasiées par les méthodes règlementaire en fin d’expérience encore sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Stress léger lors de la préhension des animaux. Douleur légère et transitoire après les injections et après les prélèvements du sang.
Devenir
Les actes expérimentaux finaux sont sans réveil du fait de la collecte de quantités importantes de sang, indispensables pour nos recherches scientifiques.
Remplacement
Le système de la coagulation est complexe, nécessite absolument un organisme vivant entier pour pouvoir être reproduit de manière pertinente. Actuellement, il n'existe pas de tests adaptés qui pourraient éviter le recours à l'animal.
Réduction
Afin de déterminer le plus petit nombre d’animaux approprié pour le projet, nous avons réalisé une analyse mathématique de puissance. Les hypothèses sous-jacentes à nos calculs sont basées sur la littérature existante et sur notre expérience en utilisant ces modèles en prenant en compte les variabilités de chaque test.
Raffinement
Les procédures utilisées se feront dans le cadre adapté d'un hébergement agréé, respectant au maximum le bien-être des animaux avec un enrichissement du milieu (morceaux de bois à ronger, filaments de papier kraft pour faire un nid), en limitant la souffrance par le respect des méthodes anesthésiques. Les animaux ne sont jamais seuls dans les cages d’hébergement et ils ont un accès libre à la nourriture et à l'eau. L’ensemble des expériences sera effectué par une personne habilitée à expérimenter sur animaux et l'acte expérimental aura lieu principalement sous anesthésie et sans réveil. Au cours de ce projet, les opportunités de raffinement seront régulièrement ré-évaluées pour nous assurer de la mise en place rapide de tout nouveau développement technique qui interviendrait pendant la période du projet. Les souris sont sous observation quotidienne et la quantification des points limites, susceptibles d'entraîner une procédure d’euthanasie immédiate de l'animal, sont strictement appliquée.
Choix des espèces
Ce projet fait appel à un modèles murin des maladie hémorragique familiale permettant de tester un thérapie déjà utilisé chez les patients. Ces modèle ne manifestent pas des saignements spontanées. Les souris adultes, entre 8 et 30 semaines d’âge, des deux sexes seront utilisées.
Vers un vaccin anti-coxsackievirus B pour lutter contre le diabète de type 1
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Pour tester un vaccin peptidique contre les coxsackievirus, soupçonnés dans le diabète de type 1, 348 souris sont utilisées dans des procédures classées en souffrance modérée, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent trois injections sous la peau ou dans l'abdomen, puis des prélèvements de sang à la queue sous anesthésie locale pour mesurer les anticorps produits. Les effets attendus sont un stress de contention, des inflammations et des ulcérations aux points d'injection et des saignements aux sites de prélèvement. Le RNT conclut qu'aucun modèle in vitro ne peut évaluer une protection vaccinale et affirme la "nécessité" de recourir à la souris.
Objectifs
Les objectifs du projet consistent à induire la production d’anticorps contre les coxsackievirus B chez la souris à l’aide d’un peptide viral et déterminer si cette immunisation protège les animaux de l’infection virale.
Bénéfices attendus
La finalité du projet est de valider le choix d’un candidat vaccin contre les coxsackievirus B. Le projet s'inscrit dans la conception d'une stratégie de lutte originale à base de peptides qui induisent une immunité protectrice de l'hôte vis-à-vis des coxsackievirus B et des pathologies liées à ces virus et notamment le diabète de type 1.
Procédures
Les interventions seront des vaccinations et des prélèvements sanguins qui seront réalisées sous anesthésie gazeuse ou locale. Les vaccinations se feront sous forme de trois injections à J0, J21 et J35 par voie intrapéritonéale et/ou sous-cutanée (30 secondes par inoculation). De faibles quantités de sang seront prélevées au niveau de la queue à J34 et J49 (5 minutes environ par prélèvement) afin d'évaluer la présence d’anticorps chez les animaux immunisés. En fin de procédure, les animaux seront euthanasiés entre J55 et J60 sous anesthésie gazeuse afin de récupérer le sang et les organes (pancréas, coeur, rate, intestin).
Impact sur les animaux
Les procédures d’immunisation peuvent notamment conduire à un stress (contention de l’animal), gêne légère, douleur légère, et inflammation localisée/ulcération aux sites d’injections liés à des injections répétées par voie sous-cutanée d’antigènes et d’adjuvants. Par ailleurs, les prélèvements sanguins répétés à J34 et J49 au niveau de la queue sous anesthésie local peuvent induire un stress (contention de l’animal), saignements + perte de poids et/ou inflammations localisés aux sites de prélèvements.
Devenir
Le projet vise à déterminer si notre immunisation protège les animaux de l’infection virale. Pour le savoir, il faut évaluer la quantité d’anticorps produite dans le sang ainsi que la quantité de virus dans les organes (pancréas, coeur, rate, intestin). Une mise à mort de tous les animaux sera donc réalisée à la fin des procédures.
Remplacement
La production d’anticorps suivie de l’évaluation de la protection vis-à-vis d’une infection correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire d’un organisme vivant. Il n’existe pas de modèle in vitro ou de méthodes alternatives capables de répondre à cette problématique.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe est prévu pour avoir un effectif minimum permettant d’avoir des résultats significatifs. De plus, le protocole établi prend en compte le suivi régulier des animaux et des prélèvements répétés sur les mêmes animaux plutôt que sur plusieurs groupes distincts afin de recueillir un maximum d'informations, tout en limitant le nombre d’animaux à utiliser.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupes sociaux et les conditions d'hébergement seront améliorées (enrichissement, alimentation, soins) afin d'augmenter au mieux le bien-être animal. L’état général des animaux (évolution du poids, comportement, apparence) et les sites d’injection seront observés chaque jour afin d’arrêter si besoin l’expérimentation ou mettre en place une procédure ou un traitement pour réduire la souffrance et/ou la détresse des animaux. Les prélèvements sanguins se feront au niveau de la queue après désinfection et sous anesthésie locale ou gazeuse. Les volumes de sang prélevés seront faibles avec une période de récupération de deux semaines entre deux prélèvements afin de respecter la réglementation. Les injections et prélèvements ne pourront être réalisés que sur des sites sans hématome ni inflammation apparente, en utilisant des aiguilles stériles adaptées (à la taille de l’animal et à la voie d’inoculation) et à usage unique. Une désinfection/cicatrisation et une analgésie seront mises en place en cas d’inflammation localisée aux sites d’injections. En cas de souffrance/détresse sévère avérée, les animaux seront mis à mort immédiatement sous anesthésie générale gazeuse.
Choix des espèces
Les souris sont infectables par les coxsackievirus B (qui sont des virus des êtres humains). Les animaux seront utilisés à un âge entre 3 et 5 semaines car les souris jeunes sont davantage infectables par les entérovirus (et notamment les coxsackievirus B) contrairement aux souris plus âgées.
Evaluation de l’efficacité thérapeutique de nanoparticules lipidiques comme vecteur de thérapie génique dans un modèle murin de Glioblastome
- Recherche appliquée
- Cancers
Porteuses d'un glioblastome greffé directement dans le cerveau, 225 souris sont utilisées dans des procédures classées en souffrance modérée à sévère, 135 relevant du niveau sévère. La tumeur est induite par injection de cellules dans le cerveau sous anesthésie, puis des nanoparticules sont administrées par le nez pour tester une thérapie génique. Le RNT décrit des symptômes neurologiques, des céphalées et une perte de poids liés au développement de la tumeur. Toutes les souris sont tuées pour prélever les tissus et mesurer l'efficacité du traitement.
Objectifs
En France, les glioblastomes (GBM) frappent plus de 2400 personnes par an. Cette maladie touche majoritairement les adultes (45-70 ans) mais aussi les très jeunes et est classifiée par l’OMS (Organisation Mondiale de la Santé) comme des tumeurs très agressives. Ces tumeurs sont caractérisées par une hétérogénéité intra- et inter- tumorale très élevée, avec des zones de mort cellulaire et une prolifération microvasculaire. La prise en charge thérapeutique de ces tumeurs se résume à un traitement chimio-thérapeutique concomitant à la radiothérapie. L’exérèse chirurgicale partielle ou totale de la tumeur, lorsqu’elle est réalisable, demeure un élément déterminant de cette prise en charge et montre un effet considérable sur la survie des patients. Toutefois, malgré l'agressivité de cette stratégie thérapeutique, la survie des patients est évaluée à environ 18 mois. Ce taux de survie s’explique par les caractéristiques propres aux GBM, notamment la forte hétérogénéité des cellules neuronales responsables de l’initiation tumorale et la mise en place de mécanismes de résistance. La caractérisation moléculaire des GBM, a mis en évidence l’implication de petites molécules (acides ribonucléiques) dans le maintien de la survie cellulaire de ces cellules tumorales. Cet état de l’art, a conduit au développement de nanoparticules lipidiques qui transportent et relarguent les agents thérapeutiques directement dans la zone tumorale. Ainsi, pour la suite du projet, l’efficacité thérapeutique de ces nanoparticules sera évaluée sur un modèle de souris de glioblastome afin de déterminer la transposabilité clinique du système.
Bénéfices attendus
Face à l'échec des thérapies actuelles contre le GBM, le développement de nouvelles voies d’administration est devenu une priorité. Notre approche repose sur des molécules thérapeutiques innovantes dont l'efficacité dépend d'un système de délivrance sophistiqué. Les nanoparticules lipidiques utilisées ici assurent une libération contrôlée et un ciblage spécifique, palliant ainsi les limites de diffusion de ces molécules. L'administration intranasale vient renforcer cette stratégie en offrant un accès direct au compartiment cérébral, assurant une efficacité thérapeutique maximale. Ce projet propose donc une solution intégrée et novatrice, susceptible de transformer l'arsenal thérapeutique contre les tumeurs cérébrales agressives.
Procédures
Les cellules tumorales seront injectées directement dans le cerveau de souris anesthésiées. La procédure est estimée à 15 min par souris. L’administration par le nez de nos nanoparticules se fera sur souris anesthésiées. On estime cette procédure à 3 min par souris. La contention, la pesée et les diverses anesthésies sont estimées à moins d’une minute par souris.
Impact sur les animaux
La contention des souris pour les injections des analgésiques et anesthésiant peut induire du stress chez la souris. La contention est estimée à moins d’une minute par souris. La greffe des cellules tumorales est une chirurgie qui peut induire des douleurs chez la souris. Le développement de la tumeur GBM induit le développement de symptômes neurologiques, des céphalées et une perte de poids chez la souris. L’administration intranasale répétée des nanoparticules peut induire une irritation des muqueuses nasales et est réalisée sous anesthésie générale légère.
Devenir
Après chaque procédure, toutes les souris seront mises à mort pour permettre le prélèvement des tissus nécessaires à l’analyse de l’induction de la pathologie mais aussi pour évaluer l’efficacité thérapeutique de nos nanoparticules.
Remplacement
Le développement de modèles cellulaires en 3 dimensions (type sphéroïdes, tumoroïdes et organoïdes) permet de remplacer une partie des études précliniques chez la souris en testant in vitro l’efficacité de l’utilisation d’agents thérapeutiques. Toutefois, ces systèmes comportent des limites et ne récapitulent pas toute la complexité de l’organe ce qui explique le recours à des animaux pour étudier les échanges cellulaires et moléculaires qui prennent place dans le cerveau où se développent les glioblastomes. De plus, pour réaliser l’étude de biodistribution, il est nécessaire de passer sur un modèle in vivo.
Réduction
Les effectifs d'animaux ont été calculés à partir d'outil statistique. De plus, à l'issue d'une procédure, si nous n'observons pas d'induction de la pathologie chez les souris, la suite du projet ne sera pas conduite. Ce raisonnement sera également appliqué à la fin des autres procédures.
Raffinement
Des visites journalières des souris seront effectuées pour détecter la souffrance, la douleur et le stress des animaux. Les animaux auront accès à de la nourriture humide en cas de perte de poids légère. Les souris seront observées quotidiennement pendant chaque pesée afin de détecter l’éventuelle apparition de signes de souffrance (points limites). Un traitement anti-douleur sera administré par voie sous-cutanée dès lors qu'un signe de souffrance est détecté. De plus les souris seront maintenues sur tapis chauffant après la chirurgie pour maintenir une température adaptée au réveil.
Choix des espèces
Le développement de thérapies à base de nanoparticules nécessite des études in vivo chez le petit animal, en complément des tests in vitro, pour évaluer leur devenir et efficacité. Les autorités imposent également ces données précliniques pour les nouveaux médicaments.. Enfin, l’utilisation des souris dépourvues de système immunitaire permet l’implantation des cellules tumorales humaines sans rejets de l’espèce. Des souris âgées entre 8 et 10 semaines seront utilisées pour toutes les procédures du projet. Nous savons que cette pathologie affecte majoritairement les adultes, c’est pourquoi nous choisissons de travailler sur des souris adultes. De plus, à ces âges, les animaux sont réceptifs à la prise de greffe.
Modèle préclinique de vaccination avec biopuces
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Gavées une fois avec des salmonelles vivantes, 696 souris sont utilisées pour tester un vaccin à base de biopuces, 120 d'entre elles dans des procédures classées en souffrance sévère. L'infection provoque perte de poids, pelage hérissé, prostration et anorexie, et le RNT signale qu'une mortalité aiguë peut survenir sans aucun signe clinique préalable. Le même document affirme par ailleurs que l'injection des biopuces n'induit aucun effet nuisible et est bien tolérée. Toutes les souris sont tuées pour prélever les tissus, l'écart restant net entre les procédures dites indolores et une infection qui peut tuer sans prévenir.
Objectifs
Les salmonelles sont des bactéries qui peuvent infecter les cellules de l’organisme et représentent un problème important de santé publique. Certaines formes provoquent des infections digestives généralement bénignes, mais dans certains cas, notamment chez les personnes fragiles (personnes âgées ou immunodéprimées), elles peuvent entraîner des infections graves pouvant être mortelles. La transmission se fait principalement par contact avec des animaux ou par la consommation d’aliments contaminés (viandes, œufs, produits laitiers). Il est donc important de développer de nouvelles stratégies pour mieux protéger les populations à risque, notamment par la vaccination. Dans ce projet, nous développons une approche vaccinale innovante basée sur des « biopuces ». Il s’agit de petits dispositifs en silicium capables de transporter des bactéries inactivées dans l’organisme. Ces biopuces, appelées ICARO (Intracellular Carriers Against Resistant microOrganisms), peuvent être internalisées par certaines cellules du système immunitaire. Elles permettraient ainsi de déclencher une réponse immunitaire efficace contre la bactérie, en particulier une réponse dite « cytotoxique », essentielle pour éliminer les cellules infectées. L’objectif est de démontrer que cette stratégie peut protéger les souris contre une infection par les salmonelles, constituant ainsi une première preuve de concept pour le développement de nouveaux vaccins.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera une preuve de concept de l'utilisation de biopuces en silicium chargées en agents pathogènes inactivés comme méthode de protection contre ces agents in vivo et potentiellement une solution vaccinale innovante. En effet, s’il existe une solution vaccinale disponible dans un cadre vétérinaire pour les poulets, aucun vaccin contre les salmonelles n’est disponible chez les mammifères. Or, comme indiqué plus haut, les souches de salmonelles non typhiques comme Salmonella enterica Typhimurium peuvent entrainer des infections systémiques chez les enfants, personnes âgées et patients immunodéprimés avec des taux de létalité élevés, rendant la recherche de nouvelles approches vaccinales telles que celle proposée dans ce projet indispensable.
Procédures
Les animaux ne seront pas soumis à des procédures chirurgicales. 1- Le gavage des souris Salmonella enterica Typhimurium sauvage sera effectué une seule fois sur des souris vigiles, pendant environ 1 minute. 2- L’injection des biopuces par différentes voies (10 secondes par injection) sera réalisée une à trois fois, à une semaine d’intervalle, sur des souris vigiles (injections intrapéritonéales), ou anesthésiées (injections intraveineuses par voie rétro-orbitale et injections intraplantaires). 3- Dans certaines expériences, nous préleverons du sang chez les souris immunisées ou infectées. Cela sera réalisé une fois par semaine dans le cadre du schéma d’immunisation, et une seule fois chez les souris infectées.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables de courte durée attendus (incluent le stress, un inconfort léger et la douleur modérée) sont les anesthésies à l'isoflurane nécessaires à l'injection des biopuces, aux prélèvements rétroorbitaux ainsi qu’aux injections intrapéritonéales et gavages sur des souris vigiles. Dans des études précédentes, nous avons démontré que l’injection de ces bioparticules n’induit aucun effet nuisible et est bien tolérée. Pour la procédure impliquant une infection par les salmonelles, les symptômes classiques de la maladie chez la souris, seront observés chaque jour dès le début de l’infection (signes extérieurs : perte de poids, pelage hirsute, yeux tirés larmoyants, posture voûtée, dos rond, prostration, anorexie). Une mortalité aiguë peut survenir sans signes cliniques dans les infections fulminantes chez les individus très sensibles.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure et les tissus d'intérêt prélevés en vue d'analyses.
Remplacement
Les analyses préalables effectuées in vitro sur des cellules primaires pertinentes permettent d’évaluer la cytotoxicité et la dose optimale de biopuces par cellule cible. Ces approches in vitro et ex vivo permettront de réduire de manière substantielle le nombre d’animaux nécessaires pour le projet. En revanche, la protection conférée par cette stratégie vaccinale innovante ne peut être évaluée que dans un modèle murin entier dont l’infection par Salmonella Typhimurium est connue pour reproduire les conditions d’infection systémique chez l’homme (recherche préclinique).
Réduction
Le projet est organisé de façon à réduire au strict nécessaire le nombre de tests et donc de souris utilisées. Le nombre estimé de souris nécessaires à ce projet (696) a été calculé à l'aide de méthodes statistiques validées () afin d’obtenir une puissance statistique. Ce calcul inclut la réalisation de mesures multiples par animal afin de réduire le nombre total de souris utilisées.
Raffinement
Afin de limiter leur stress, les souris seront acclimatées à leur nouvel environnement pendant une semaine avant toute expérimentation. Les souris seront anesthésiées à l'isoflurane pour réaliser les injections des biopuces et les prélévements sanguins rétroorbitaux. Les injections intraplantaires seront réalisées sur le dessus de la patte pour éviter toute gêne lors de la marche. Lors des expériences d’injection des biopuces et d'infection par les salmonelles sur les animaux vaccinés ou non avec les biopuces, le poids et l’apparition des symptômes de la salmonellose seront suivis quotidiennement en fin de journée afin de respecter le cycle de sommeil de la souris. Lors des procédures de biodistribution des biopuces, d’optimisation de la cross-présentation antigénique et d’évaluation de l’immunogénicité (procédures de gravité légère), les animaux feront l’objet d’une surveillance régulière et le suivi sera réalisé selon une grille d’évaluation du bien-être adaptée, incluant notamment l’apparence générale, le comportement et la prise alimentaire. Une surveillance accrue et, si nécessaire, une prise en charge analgésique seront mises en place en cas d’altération de l’état général. Lors de la procédure d’infection par Salmonella (procédure de gravité sévère), les animaux seront suivis quotidiennement afin d’évaluer l’apparition de signes cliniques et l’évolution de la pathologie. Un score de souffrance sera utilisé pour le suivi du bien-être animal. Les critères d’arrêt immédiat incluent notamment une perte de poids supérieure à 20 %, l’apparition de signes cliniques sévères ou une altération marquée de l’état général, entraînant une euthanasie immédiate. Pour l’ensemble des procédures, en cas de dégradation de l’état des animaux, une surveillance renforcée sera mise en place (trois fois par jour) avec administration d’un analgésique (buprénorphine, voie sous-cutanée, 0,1 mg/kg en dose initiale, renouvelée à 0,05-0,1 mg/kg toutes les 6-8 h si nécessaire) et, si nécessaire, apport de nourriture adaptée et réhydratation sous-cutanée. La buprénorphine est utilisée à visée préventive ou curative selon les procédures. En cas de persistance de la souffrance malgré les mesures mises en place pendant plus de deux jours, une euthanasie sera réalisée afin d’éviter toute souffrance prolongée. Des critères d’arrêt indépendants du score, tels que définis dans la grille d’évaluation, s’appliquent à tout moment.
Choix des espèces
Le modèle murin est le modèle idéal pour effectuer les expérimentations prévues dans ce projet. Son infection orale par Salmonella enterica Typhimurium est en effet connue pour mimer une infection systémique par les salmonelles chez l’homme et est donc idéale pour tester l’efficacité vaccinale dans un modèle préclinique. Le modèle murin permet aussi d'étudier les réponses immunitaires spécifiques d'antigènes modèles utilisés dans le cadre de ce projet et d'analyser précisément les populations immunitaires et leur état d'activation grâce au grand nombre d'anticorps disponibles sur le marché pour cette espèce.
Évaluation des effets radio-protecteurs et pro-régénératifs de traitements sur le syndrome d’irradiation aiguë survenant après une exposition à doses fortes et modérées de rayonnements ionisants_MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Jusqu'à vingt-neuf gestes techniques en trente jours par animal : 1 413 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélever les organes les plus atteints, dont 765 dans des procédures classées en souffrance sévère. Elles reçoivent une irradiation du corps entier, des gavages, des prélèvements sanguins hebdomadaires et des injections, avec pour effets attendus perte de poids, anémie, prostration, déshydratation ou septicémie. Le scénario invoqué est celui d'un accident ou d'une attaque nucléaire exposant des populations humaines. L'effet radioprotecteur recherché reste à démontrer, quand l'irradiation et ses suites sont, elles, provoquées à coup sûr.
Objectifs
MODIFICATION – Le protocole 1 du projet a été modifié en supprimant l’étude de l’effet protecteur des molécules après une forte dose d’irradiation, remplacée par l’étude de leur effet curatif après une dose modérée. En effet, la majorité des individus irradiés se trouvera autour du point d’impact de l’accident, recevant ainsi une dose modérée, non létale, qu’il est donc important d’étudier. Le protocole 2 du projet intègre désormais l’étude d’un traitement du syndrome gastro-intestinal radio-induit (forte dose d’irradiation localisée) via l’administration de produits acellulaires (EV). Les individus exposés brièvement (quelques minutes) à une dose d’irradiation forte ou modérée (accident ou attaque nucléaire), vont souffrir d’un syndrome d’irradiation aiguë (SIA) engageant le pronostic vital. Les traitements curatifs actuels sont très invasifs (greffes de moelle osseuse) ou inexistants. Certains médicaments soulagent les symptômes (diarrhées et vomissements) ou préviennent les infections, sans améliorer significativement la survie. Nous proposons donc un projet pré-clinique chez la souris pour évaluer l’efficacité de nouveaux traitements contre le syndrome d’irradiation aiguë. Le SIA combine trois syndromes : hématopoïétique, gastro-intestinal et neurovasculaire. Ce projet se concentre sur les deux premiers. L’effet curatif sera mesuré par la capacité de deux tissus très radiosensibles, la moelle osseuse et l’intestin grêle, à se reconstituer plus ou moins rapidement après irradiation. Ces tissus se renouvellent constamment tout au long de la vie d’un individu et l’impact d’une irradiation sur leur fonctionnement est donc majeur pour la survie. En effet, la moelle osseuse contient les cellules souches hématopoïétiques responsables de la production et du renouvellement des cellules sanguines tout au long de la vie. De même, l’intestin grêle contient des cellules souches permettant le renouvellement tous les 4 à 5 jours des cellules intestinales maintenant une barrière imperméable empêchant le passage des bactéries du microbiote dans le sang. Préserver ces tissus est essentiel à la survie. Nous nous attendons à ce que l’administration de ces traitements après une irradiation ait un effet curatif en améliorant l’état général, mais également la survie des animaux. Le modèle rongeur est pertinent car il a été utilisé et validé dans de nombreuses études précliniques dans le cadre d’une irradiation.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de révéler si le traitement des animaux avec les molécules d’intérêt (composés chimiques ou produits acellulaires), administrées après irradiation, (1) améliore leur survie, (2) diminue les effets indésirables associés à l’irradiation, (3) permet une récupération plus rapide de l’état général des souris grâce à une accélération de la régénération des tissus lésés (moelle osseuse et intestin grêle). Des bénéfices sur la population humaine sont susceptibles de découler de ce projet, comme une prise en charge immédiate des personnes ayant été exposées à des doses d’irradiation ionisante fortes et modérées avec l’administration rapide d’un traitement permettant un meilleur pronostic vital et une meilleure récupération hématopoïétique et intestinale (exemple : après un accident ou une attaque nucléaire). Ce projet a donc un intérêt clinique majeur car les traitements curatifs actuels sont inexistants et/ou inapplicables à grande échelle. En effet, actuellement, - la prise en charge des patients souffrant d’une atteinte sévère du tissu hématopoïétique nécessite des traitements invasifs et coûteux, non généralisables à grande échelle (greffe de moelle osseuse) et présentant de nombreux inconvénients (recherche d’un donneur compatible, traitement immunosuppresseur à vie, risque de rejet). - la prise en charge des patients souffrant d’une atteinte gastro-intestinale sévère repose uniquement sur des traitements symptomatiques (antibiotiques, anti-diarrhéiques et antiémétiques). Il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement curatif.
Procédures
Dans l’étude du syndrome hématopoïétique induit après irradiation : Les gestes techniques sont listés ci-dessous : - 1 irradiation corps entier (durée < 10 minutes) - gavages (4 maximum d’une durée de 2 minutes) - des pesées régulières (tous les 1 à 2 jours) sur une durée de 30 jours (30 secondes) - prélèvements de sang 1 fois/semaine sur animal vigile sur une durée de 30 jours (4 maximum de 3 minutes), puis un prélèvement de sang, sous anesthésie (35 min en comptant l’effet de l’analgésie et de l’anesthésie). 1 à 2 injections (1 minute) en vigile pour tous les animaux Les souris subiront au maximum 29 gestes techniques sur 30 jours. Dans l’étude du syndrome gastro-intestinal induit après irradiation : Les gestes techniques sont listés ci-dessous : - 1 irradiation locale au niveau abdominal, sous anesthésie (durée < 10 minutes) - 1 gavage avec de l’eau ou avec la molécule à tester (2 minutes) ou 1 injection i sous anesthésie de produits acellulaires ou cellules Muse (durée < 10 minutes) - des pesées régulières (tous les 1 à 2 jours) sur une durée de 30 jours (16 x 30 secondes) - 1 gavage post-irradiation abdominale localisée (2 minutes) - 1 prélèvement de sang juste avant la mise à mort, sous anesthésie (35 min en comptant l’effet de l’analgésie et de l’anesthésie). - 2 injections sur animal vigile (2 x 1 minute). Les souris subiront au maximum 22 gestes techniques sur 30 jours.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont une perte de poids, une anémie, une prostration, de la déshydratation, ou une septicémie. Un stress est envisagé lors des pesées et au moment du gavage. Des douleurs ponctuelles sont possibles lors des prélèvements et/ou des injections.
Devenir
A différents temps après irradiation, les animaux traités ou non seront mis à mort afin de prélever les tissus et organes connus pour être très impactés par l’irradiation. Les analyses permettront d’évaluer l’efficacité du traitement sur ces tissus au cours du temps.
Remplacement
1)Pour l’étude de la survie des individus après irradiation, aucune alternative non animale ne peut être mise en place. 2)Dans l’analyse de la reconstitution hématopoïétique après irradiation, il n’est pas possible d’utiliser des alternatives comme par exemple des organoïdes ou des cultures cellulaires. En effet, les cellules souches de la moelle osseuse agissent de concert avec leur microenvironnement, constitué de plusieurs types cellulaires, pour permettre la reconstitution hématopoïétique après irradiation. L’étude sur l’animal corps entier est donc la seule approche possible pour une analyse physiologique des effets d’un traitement après irradiation depuis la cellule souche jusqu’aux cellules matures. 3)Dans l’étude du syndrome gastro-intestinal aigu, les organoïdes peuvent être une alternative dans le cadre d’une analyse moléculaire ciblée. Nous ne ferons pas ce type d’analyse dans ce projet. Notre but est de mesurer des paramètres physiologiques impliqués dans la restauration de la barrière intestinale après irradiation, ce qui nécessite une étude sur l’animal corps entier.
Réduction
Les modèles de souris que nous utiliserons sont des lignées consanguines montrant moins de variabilité phénotypique intra-souche. Ainsi, des résultats significatifs seront obtenus en utilisant moins de souris par rapport au nombre qui serait nécessaire si l’on utilisait des lignées non consanguines. Ceci permet de réduire le nombre de souris. Nous avons également calculé le nombre d’animaux nécessaire et suffisant par groupe d’étude à l’aide de tests statistiques et en s’appuyant sur des résultats antérieurs. Avec le traitement proposé dans ce projet, nous avons évalué un bénéfice d’environ 20%. Nous devons donc inclure 8 souris par groupe irradié avec ou sans traitement. Pour les souris non irradiées, aucun effet n’est attendu : 3 souris par groupe seront suffisantes. Sur la base de références bibliographiques, nous avons estimé que l’inclusion de 5 souris par groupe (groupes traités par cellules Muse, groupes traités avec produits de sécrétion de Muse, et groupe irradié contrôle) avec n=3 est nécessaire pour l’analyse des courbes de survie, afin de mettre en évidence une différence statistiquement significative. Enfin, pour les études de cinétique, un effectif de 4 souris par groupe avec n=2 a été retenu, ce qui est suffisant pour détecter des variations biologiquement pertinentes tout en limitant le nombre d’animaux utilisés. Pour les souris non irradiées, aucun effet n’est attendu. Nous inclurons donc 3 souris dans ce groupe.
Raffinement
Les souris seront régulièrement pesées et observées . Nous utiliserons une grille de score pour évaluer leur état général et avons établi des points limites. Pour éviter une infection due à une diminution du système immunitaire, les cages seront placées, soit en portoirs ventilés, soit en portoir classique avec un couvercle filtrant. Les souris seront hébergées en groupe, avec enrichissement (coton, tunnels en carton). L'utilsation d'anesthésie et d'analgesie sera mise en place lors des procédures.
Choix des espèces
Les souris consanguines utilisées sont les mieux caractérisées en biomédecine et sont largement utilisées pour étudier le rôle d’un gène spécifique dans un organisme. Elles font l’objet d’un grand nombre d’étude pour analyser les effets biologiques des rayonnements ionisants et leur consanguinité réduit les effectifs utilisés car elles montrent moins de variabilité phénotypique. Ainsi, la puissance statistique est obtenue avec moins de souris par rapport au nombre qui serait nécessaire si l’on utilisait des lignées non consanguines. De plus, les syndromes d’irradiation que nous souhaitons étudier sont bien caractérisés chez ces souris . Tout ceci présente des avantages scientifiques et éthiques. Nous utiliserons des souris adultes de 9 à 16 semaines (une souris est considérée comme étant adulte à l’âge de 7 semaines). Une souris prépubère (moins de 7 semaines) a un environnement médullaire (nécessaire à la production des cellules sanguines et à la préservation des cellules souches) qui n’est pas définitif. Une souris de plus de 7 mois est considérée comme âgée d’un point de vue hématopoïétique. Ceci restreint notre choix à l’utilisation de jeunes souris adultes. Pour des raisons de reproductibilité des expériences, le poids et la taille des souris doivent être identiques entre les groupes, ce qui est le cas chez les jeunes adultes à l’âge choisi.
MODIFICATION : Formation « Application de procédures expérimentales chez le rongeur » à destination des étudiants de BUT 1 BMB et des professionnels / diplômés en formation continue.
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
Former des étudiants et des professionnels aux gestes de l'expérimentation animale mobilise 440 rats, utilisés dans des procédures classées en souffrance légère. Chaque animal sert de support d'entraînement à des injections et à des administrations orales répétées, avant d'être réutilisé d'une procédure à la suivante. Le RNT signale qu'une erreur d'anesthésie peut provoquer un œdème pulmonaire et une insuffisance respiratoire, et que la contention fait parfois vocaliser les rats. Les animaux sont tués à la fin pour une étude anatomique post-mortem, la chirurgie sur animal anesthésié n'étant pas permise aux apprenants.
Objectifs
MODIFICATION / Le projet a pour objectif de former les étudiants de Bachelor Universitaire de Technologie (BUT) aux fondamentaux de l’expérimentation animale, en les sensibilisant à la réglementation, à l’éthique et au bien-être animal, tout en leur permettant d’acquérir les gestes techniques de base nécessaires à leur insertion professionnelle. AJOUT : IL S’INSCRIT EGALEMENT DANS LE CADRE DE LA FORMATION D’APPLICATEUR DE PROCEDURES EXPERIMENTALES CHEZ LE RONGEUR, CONFORMEMENT AUX REFERENTIELS EN VIGUEUR. À CE TITRE, IL VISE AUSSI A FORMER UN PUBLIC DE PROFESSIONNELS OU DE STAGIAIRES EN FORMATION CONTINUE, AMENES A METTRE EN ŒUVRE DES PROCEDURES EXPERIMENTALES DANS UN CADRE REGLEMENTE. Deux types de procédures sont proposés. La première porte sur le suivi de l’animal anesthésié et la surveillance des paramètres physiologiques. La seconde concerne la manipulation de l’animal vigile (rat) et l’étude anatomique post-mortem : apprentissage de la préhension et de la contention, initiation aux principales voies d’administration et sensibilisation à l’impact du stress, dans le respect de la réglementation et des principes de raffinement et mise en œuvre de procédures d’euthanasie conformes à la réglementation, et observation anatomique permettant d’établir des liens avec l’anatomie comparée. Ainsi, ce projet propose une approche progressive et complète de l’expérimentation animale, intégrant réglementation, éthique et pratique, et préparant les APPRENANTS TANT EN FORMATION INITIALE QUE CONTINUE A LA MISE EN ŒUVRE DE PROCEDURES EXPERIMENTALES CHEZ L’ANIMAL DANS LE RESPECT DE LA REGLEMENTATION, LA CONNAISSANCE DES ACTEURS INSTITUTIONNELS IMPLIQUES (COMITE D’ETHIQUE, AUTORITE COMPETENTE, STRUCTURE DE BIEN-ETRE ANIMAL) ET L’APPLICATION DES PRINCIPES DES 3R.
Bénéfices attendus
MODIFICATION Les bénéfices attendus du projet concernent directement l’acquisition de compétences pratiques et la sensibilisation éthique des APPRENANTS, en lien étroit avec les activités réalisées en travaux pratiques. AJOUT : LEUR PERMETTANT DE VALIDER LA FORMATION APPLICATEUR DE PROCEDURES EXPERIMENTALES CHEZ LE RONGEUR. Au cours des séances sur rat vigile, les APPRENANTS découvrent d’abord le comportement normal de l’animal et apprennent à interagir de manière non stressante (tickling). Ils développent ensuite la capacité à réaliser une contention correcte et sécurisée, préalable indispensable à toute procédure expérimentale. L’apprentissage progressif des différentes voies d’administration (per os, sous-cutanée, intrapéritonéale) leur permet de s’exercer à des gestes techniques précis, de comprendre leurs indications respectives et d’acquérir l’assurance nécessaire à leur bonne réalisation. L’ultime séance, consacrée à l’induction de l’anesthésie, permet de valider ces apprentissages par une situation complète, en liant technicité du geste, suivi physiologique et vigilance sur le bien-être animal. Au cours des séances sur rat anesthésié, les APPRENANTS apprennent à surveiller et interpréter certains paramètres physiologiques sous anesthésie. Ils comprennent ainsi concrètement les enjeux du monitoring et de la profondeur anesthésique. AJOUT : UNE DEMONSTRATION DE PRELEVEMENT SANGUIN AU NIVEAU DE LA VEINE CAUDALE SUR UN RAT ANESTHESIE SERA EGALEMENT REALISEE. La phase post-mortem offre l’opportunité d’étudier l’anatomie topographique des grands appareils, renforçant les connaissances acquises en biologie animale et leur permettant d’établir des liens entre structure et fonction. Ces activités procurent un bénéfice pédagogique direct : elles ancrent les notions de réglementation, d’éthique et de bien-être animal dans une pratique concrète, tout en développant les compétences techniques qui seront attendues dans leur futur parcours professionnel. Les APPRENANTS ne se limitent pas à une approche théorique de l’expérimentation animale : ils acquièrent par l’expérience les gestes de base, la compréhension du rôle des différents acteurs, et une posture responsable vis-à-vis de l’utilisation de l’animal.
Procédures
- Procédure 1 : deux injections par animal - Durée totale d’injection : 30 secondes MODIFICATION : 1 prélèvement sur un des 2 animaux – durée totale :30 secondes - Procédure 2 : 1 administration orale répétée sur 3 séances différentes - Durée de l’administration : 5 secondes MODIFICATION : 6 injections réparties sur 3 séances différentes : Durée totale d’injection : 2,5 minutes
Impact sur les animaux
L’administration des substances nécessaire à l’anesthésie au début de la procédure peut conduire au développement d’un œdème pulmonaire à l’origine d’une insuffisance respiratoire. Une partie des manipulations se produiront sur animal vigile : un risque de stress léger peut être encouru lors de la préhension / contention rats, cela peut engendrer occasionnellement des vocalisations. Lors des phases d’apprentissage des méthodes d’administration : - Per os : gêne légère possible lors de l’introduction de la sonde. - Sous-cutanée et intrapéritonéale : douleur légère brève au point d’injection.
Devenir
Les animaux de la première procédure sont réutilisés dans la procédure suivante. Les animaux sont euthanasiés à la fin de la dernière procédure afin que l’étude anatomique soit réalisée post-mortem, évitant ainsi le recours à une chirurgie sur animal anesthésié, non autorisée pour les APPRENANTS.
Remplacement
L’utilisation d’animaux à des fins expérimentales demeure, à ce jour, indispensable dans le cadre de notre formation, conformément aux exigences définies dans le Programme Pédagogique National. En effet, celui-ci précise que les diplômés doivent être en capacité de « participer à des activités mettant en œuvre de l’expérimentation sur animaux de laboratoire », compétence essentielle à leur insertion professionnelle. Les secteurs dans lesquels les diplômés sont susceptibles d’évoluer (pharmacologie, physiologie pharmaceutique, toxicologie, biotechnologies, etc.) continuent de recourir à l’expérimentation animale dans un cadre strictement réglementé. La maîtrise des techniques in vivo, associée à une compréhension rigoureuse des protocoles expérimentaux, constitue donc un savoir-faire fondamental garantissant l’adéquation entre la formation et les attentes du milieu professionnel, qu’il soit académique ou industriel. Le projet présenté s’intègre donc dans une approche réfléchie et progressive de l’expérimentation animale, limitée aux apprentissages pour lesquels aucune alternative pédagogique équivalente ne permet actuellement de transmettre les compétences pratiques visées. DE PLUS, LE PROJET VISE AUSSI A FORMER UN PUBLIC DE PROFESSIONNELS OU DE STAGIAIRES EN FORMATION CONTINUE, AMENES A METTRE EN ŒUVRE DES PROCEDURES EXPERIMENTALES DANS UN CADRE REGLEMENTE. Ce projet propose donc une approche progressive et complète de l’expérimentation animale, intégrant réglementation, éthique et pratique. Elle prépare ainsi les APPRENANTS TANT EN FORMATION INITIALE QUE CONTINUE A LA MISE EN ŒUVRE DE PROCEDURES EXPERIMENTALES CHEZ L’ANIMAL DANS LE RESPECT DE LA REGLEMENTATION, LA CONNAISSANCE DES ACTEURS INSTITUTIONNELS IMPLIQUES (COMITE D’ETHIQUE, AUTORITE COMPETENTE, STRUCTURE DE BIEN-ETRE ANIMAL) ET L’APPLICATION DES PRINCIPES DES 3R.
Réduction
MODIFICATION / Nous limiterons le nombre de rats à 2 par groupe TP pour la première procédure, chaque groupe TP étant constitué de 14 APPRENANTS maximum. C’est un nombre minimum pour permettre une démonstration efficace. Pour la seconde procédure, nous utiliserons un rat par APPRENANT EN APPLIQUANT UN TAUX D’ENCADREMENT DE 1 ENCADRANT POUR 4 APPRENANTS et nous réutiliserons les rats de la procédure précédente). Ce nouveau projet permet de diminuer de 50 % le nombre d’animaux utilisés par rapport au précédent projet accepté.
Raffinement
Avant tout apprentissage pratique, les APPRENANTS bénéficient d’un enseignement théorique complet et spécifique dédié au bien-être animal, à l’éthique ainsi qu’à la réglementation en vigueur en matière d’expérimentation animale. Cet enseignement vise à sensibiliser les étudiants à leur responsabilité vis-à-vis de l’animal et à les former aux bonnes pratiques expérimentales. Chaque procédure expérimentale fait l’objet d’une séance préparatoire de Travaux Dirigés, au cours de laquelle les différentes étapes pratiques sont analysées à l’aide de supports vidéo et de documents pédagogiques. Cette préparation a pour objectif de garantir une prise en charge optimale de l’animal, en minimisant l’inconfort, le stress et la douleur, conformément au principe de Raffinement. Les animaux sont hébergés dans des conditions répondant pleinement à leurs besoins physiologiques et comportementaux : ils sont maintenus en groupes, dans un environnement enrichi, et font l’objet d’un suivi quotidien par le personnel compétent. Une période d’acclimatation d’au moins une semaine est systématiquement respectée après leur arrivée dans l’animalerie de l’établissement, avant toute manipulation. Sur le plan analgésique et anesthésique, une analgésie préventive est assurée 20 minutes avant l’induction de l’anesthésie. Durant chaque procédure, l’animal est placé sur un tapis chauffant afin de prévenir l’hypothermie, et un monitoring continu de la température corporelle est effectué. La profondeur anesthésique est rigoureusement surveillée tout au long de la séance par l’enseignant responsable, à l’aide de plusieurs critères : réflexe de retrait de la patte, mouvements des vibrisses, fréquence respiratoire. En cas de signes indiquant une diminution de la profondeur de l’anesthésie, un renforcement immédiat de l'anesthésie est effectué par l'enseignant afin de maintenir un niveau anesthésie stable et compatible avec la procédure. Des points limites sont préalablement définis pour l'ensemble des procédures permettant d'interrompre l'expérimentation dès l'apparition de signes dépassant les critères d'acceptabilité. L’ensemble de ces mesures vise à garantir une expérimentation respectueuse de l’animal, tout en assurant un apprentissage de qualité dans un cadre éthique et réglementé.
Choix des espèces
Les rats présentent des caractéristiques physiologiques et anatomiques qui permettent l’apprentissage plus aisé des diverses techniques d’administration et de l’étude anatomique. De plus, le rat est un animal docile parfaitement adapté à l’apprentissage par les étudiants des principales procédures pratiques. Enfin, le rat est une des espèces les plus couramment utilisées dans les laboratoires de recherche recrutant nos étudiants futurs techniciens. En effet, de très nombreux modèles expérimentaux animaux sont développés chez cette espèce. Il s’agira précisément de rats jeunes adultes : Les organes sont de taille suffisamment importante ce qui facilite les études anatomiques. La taille des animaux adultes rend également leur manipulation plus aisée par les étudiants.
Efficacité de nouveaux vaccins ARN dans l’allergie
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
Soumises à des injections, des inhalations sous anesthésie et une trachéotomie en fin de protocole, 6 480 souris vont être utilisées dans des procédures classées en souffrance modérée, toutes tuées à l'issue. Selon le modèle d'allergie, elles subissent un choc anaphylactique provoqué, avec chute de température corporelle et diarrhées, un gonflement des oreilles ou une dermatite induite par patch. Ces vaccins à ARN visent à prévenir ou réduire des symptômes allergiques que le RNT présente comme sans traitement efficace à long terme aujourd'hui. Le bénéfice reste une perspective, quand les chocs et inflammations infligés aux souris sont, eux, programmés.
Objectifs
La prévalence mondiale des pathologies allergiques est en perpétuelle augmentation à la fois dans les pays développés et en voie de développement. Par exemple, il est maintenant estimé qu’un tiers des français souffrent d’une ou plusieurs formes de pathologies allergiques, dont certaines peuvent s’avérer fatales (p.ex., certaines formes d’asthmes réfractaires aux corticoïdes ou encore des anaphylaxies induites par l’ingestion de fruits à coques). Il n’existe pas à l’heure actuelle de traitement permettant de prévenir les allergies ou de réduire les symptômes allergiques de manière efficace et sur le long terme. La pandémie de Covid-19 a permis de mettre en lumière l’efficacité, la modularité selon la cible thérapeutique, et la production rapide de vaccins à ARN. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de vaccins à ARN dans différents modèles d’allergies majeurs pour permettre de prévenir et de réduire les symptômes allergiques. Nous utiliserons des modèles d’asthme allergique, d’allergie alimentaire, d’anaphylaxie systémique et cutanée et de dermatite atopique.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à développer de nouveaux traitements à visée anti-allergique permettant de réduire les limitations des traitements actuels qui sont principalement symptomatiques, avec moins d’effets secondaires, de prévenir le risque de complications graves comme l’anaphylaxie. Ces traitements possèdent des modes de production facilités et permettraient une réduction des coûts de santé.
Procédures
Chaque injection se fera sur animal vigile et sous contention (20 sec), alors que les inhalations et injections à l'oreille se feront sous anesthésie gazeuse (induction/perte de conscience : 2min ; inhalation ou injection : 30 sec). Des prélèvements sanguins seront réalisés sur animal sous anesthésie gazeuse au minimum 1 fois par semaine avec alternance des sites de prélèvement (joue droite puis joue gauche ; induction/perte de conscience : 2min ; prélèvement : 30 sec).. Une trachéotomie sera réalisée sous anesthésie générale après vérification de la profondeur de la narcose et suppression de tout réflexe (10-15min), par du personnel diplomé en « chirurgie de l’animal de laboratoire », en fin de procédure expérimentale.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux sont en premiers liés à la douleur des aiguilles et à l’inconfort induits par les injections des traitements qui sont de courte durée (5 secondes). Des nuisances supplémentaires peuvent-être associées selon les modèles d’allergies. Le modèle d’allergie alimentaire peut induire un stress lors du gavage des animaux (20 secondes). Il peut aussi provoquer des diarrhées, des douleurs abdominales, la baisse rapide de température corporelle lors de l’induction du choc anaphylactique. Le gonflement des oreilles lié à l’allergie cutanée (anaphylaxie cutanée) peut provoquer une douleur (non quantifiable en l’absence de réactions observables de l’animal). L’application de patch pour induire une dermatite atopique peut géner l’animal et provoquer des démangeaisons.
Devenir
A la fin des procédures, tous les animaux seront mis à mort, afin de réaliser des prélèvements de sang et d’organes pour analyser les cellules et les tissus, notamment grâce à des techniques permettant d’identifier les différents types de cellules et d’observer leur organisation au sein des tissus (comme la cytométrie en flux ou l’histologie).
Remplacement
Bien que des expériences in vitro avec des cellules humaines ou d’animaux sont réalisées au laboratoire, celles-ci ne permettent pas de reproduire toutes les intéractions d’un organisme complet. Les maladies allergiques sont des maladies multifactorielles complexes dans lesquelles plusieurs organes du corps jouent un rôle important (épithélium, organes lymphoïdes secondaires, système vasculaire…). Ce projet est multidisciplinaire et vise à démontrer l’efficacité de différents vaccins à ARN dans le développement de différentes maladies allergiques, dans des modèles murins mimant les pathologies humaines. C’est pourquoi, l’utilisation d’animaux est primordiale afin d’étudier les mécanismes mis en jeu dans les différents modèles allergiques.
Réduction
L'expérience du porteur du projet dans l'analyse de ces divers modèles de pathologies et la présence des données préliminaires nous permet d'anticiper et d'optimiser le nombre d’animaux à analyser dans chaque modèle. Nous utiliserons 4 animaux contrôle versus 4 animaux allergiques de même âge et sexe pour chaque expérience. Pour une procédure, chaque souris sera son propre contrôle permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés (une oreille traité vs. une oreille contrôle). Les expériences seront répétées 3 fois de manière indépendante afin d’assurer la validité de nos résultats. En fonction du type d’expérience, du nombre d’échantillons analysés et de la distribution des valeurs, le test statistique le plus approprié sera utilisé.
Raffinement
Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE. Un enrichissement (frisures de papier (sizzlenest), igloos, ou bâtonnets en bois destinés au rongement...) sera introduit dans l’hébergement des animaux. Les animaux seront suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de point limite à savoir prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, pilo-érection et/ou grimace, présence de blessure, … . Si un animal présentait un point limite, il serait immédiatement mis à mort.
Choix des espèces
La souris représente le modèle animal le plus utilisé pour étudier les maladies humaines. En effet, l’élevage de souris est très productif et nécessite peu de place. Les connaissances et avancées technologiques actuelles permettent de disposer de nombreux modèles sophistiqués. D’ailleurs, la majorité des animaux transgéniques nécessaires à la réalisation de ce projet sont uniquement disponible chez la souris. Enfin, la physiologie des différents organes chez la souris présente de nombreuses similarités avec celle des organes humains, ce qui permet l’induction de modèles mimant les maladies humaines observées chez les patients. Pour la majorité des expériences, les animaux seront utilisés entre 7 et 12 semaines, car leur système immunitaire est suffisamment développé pour fonctionner de manière comparable à celui d’un adulte, ce qui permet d’obtenir des résultats fiables et pertinents.
Génotypage en vue de l’obtention d’une lignée simple transgénique
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Tuées si leur génotype n'a pas d'intérêt, gardées pour la reproduction sinon, 80 souris sont utilisées dans des procédures classées en souffrance légère. Le seul acte est un prélèvement de poil sous anesthésie de courte durée, répété sur les souriceaux jusqu'à ce que la lignée transgénique soit établie. Le RNT prévoit un suivi clinique pour détecter un éventuel effet inattendu de la modification génétique. L'opération relève de la gestion d'élevage, produire et trier des animaux modifiés, plus que d'une expérience à proprement parler.
Objectifs
Génotyper les animaux de génotype(s) inconnu(s) suite à des croisements en vue d'établir une lignée simple transgénique
Bénéfices attendus
Différencier les souris homozygotes mutantes, homozygotes non mutante et hétérozygotes pour la mutation. Ceci permettra de sélectionner uniquement les souris de génotypes d'intérêts.
Procédures
Prélèvement de poil sous anesthésie: L’induction dure environ 1 à 2 minutes, le maintien le temps du prélèvement 1 à 3 minutes, et le réveil intervient généralement en 2 à 5 minutes. La durée totale de la procédure, incluant l’anesthésie et le réveil, est en moyenne de 5 à 10 minutes. Tous les animaux F1 seront concernés jusqu'à ce que la lignée soit établie.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont principalement liées aux manipulations (ex:génotypage), et restent légères. Aucun effet indésirable majeur n'est prévu du fait de la modification génétique, mais un suivi clinique sera mis en place pour détecter tout phénotype innatendu. Des mesures seront prises si des signes de souffrance ou de gêne apparaissent, en accord avec les critères d'arrêt définis.
Devenir
Les souris de génotypes qui ne sont pas d'intérêts (hétérozygotes) seront mise à mort ou utilisées pour de la mise au point dans le cadre des projets de recherches. Les autres souris ( mutante et non mutante/sauvage) serviront à la reproduction ou à l'expérimentation.
Remplacement
Le génotypage est indispensable pour différencier les génotypes d'intérêts et établir les lignées. Le prélèvement de poil sera privéliégié dès que c'est possible, lorsque la mise au point du protocole de génotypage sera terminé.
Réduction
Le nombre d'individu à été calculé au minima pour permettre la création de la lignée sans devoir épuisée les géniteurs (si effectif trop petit, plus de portée par géniteur) ni surproduire (si nombre trop important).
Raffinement
L'enrichissement sera adapté aux besoins de cette nouvelle lignée. Des tests d'enrichissement nous permettra d'établir le choix préférentiel de la lignée et donc de respecter ses besoins et préférences. Le prélèvement de poil sera utilisé au détriment de la biospie, dès que la mise au point du protocole de génotypage sera terminé.
Choix des espèces
La souris permet la modification aisée du patrimoine génétique avec une facilitée et une rapidité de reproduction. Reproduction à partir de souches déjà établies au laboratoire. Les animaux seront génotypés à partir de 4 semaines de vie
Validation de biothérapie contre une parasitose intestinale chez la souris.
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Les souris chez qui la sonde de gavage part dans la trachée sont mises à mort sur-le-champ. 260 souris sont utilisées dans des procédures classées en souffrance modérée, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes. Elles sont infectées par le parasite Giardia puis gavées chaque jour pendant douze jours au maximum, pour tester un traitement à base de probiotiques. Le RNT décrit l'infection comme asymptomatique et spontanément résolutive, l'essentiel des atteintes venant alors des gavages répétés eux-mêmes.
Objectifs
Giardia intestinalis est un parasite de l’intestin de nombreuses espèces de mammifères dont l’Homme. Il est à l’origine d’infections intestinales souvent chroniques se traduisant par des diarrhées et parfois des signes de malabsorption. Le nombre croissant de cas de giardiose liés à la contamination de l’eau potable, aux effets secondaires des traitements, ainsi qu’à l’émergence de souches résistantes aux médicaments, fait de la giardiose un sujet d’actualité de plus en plus préoccupant qui nécessite le développement de traitements alternatifs. Il est établi que la microflore intestinale et certains probiotiques, tels que les bactéries Lactobacillus johnsonii, jouent un rôle important dans la protection contre cette parasitose. Des résultats obtenus in vitro et in vivo montrent que ces bactéries agissent en produisant des composés toxiques pour le parasite, permettant de réduire les signes de la maladie. Une souche de L. johnsonii a également fait l’objet d’un essai clinique chez le chiot, au cours duquel ses propriétés anti-Giardia ont pu être confirmées. À partir de ces résultats encourageants, cinq nouvelles souches de probiotiques présentant des propriétés anti-Giardia augmentées comparativement à la souche d’origine in vitro ont été obtenues au laboratoire. Afin de déterminer quelle souche sera utilisée chez l’espèce hôte cible (le chien), et afin d’étudier in situ dans l’intestin les mécanismes à l’origine de ces effets, il est nécessaire de valider les résultats obtenus in vitro par des essais in vivo d’infection à Giardia sur des modèles rongeurs. L’objectif est de proposer une méthode de lutte novatrice de la giardiose chez le chien fondé sur la biothérapie.
Bénéfices attendus
La majorité des traitements humains ou vétérinaires actuels reposent sur l’emploi d’antibiotiques, qui provoquent d’importants effets secondaires et sont de moins en moins efficaces en raison de l’émergence de souches résistantes. Ce contexte préoccupant impose le développement de traitements alternatifs innovants, ainsi que des avancées majeures dans la compréhension des interactions hôte/Giardia/microbiote, qui constituent la base de nombreuses thérapies nouvelles. Giardia est un parasite présentant une prévalence importante pour l’élevage en Europe et dans le monde. La diminution de l’utilisation des antibiotiques dans les traitements des animaux constitue un enjeu majeur compte tenu de l’apparition de nombreuses souches résistantes. Le développement de traitements alternatifs est donc essentiel, en particulier dans ce secteur. La réduction des souches résistantes aux antibiotiques ainsi que la diminution des résidus d’antibiotiques dans l’alimentation humaine et animale sont au cœur des enjeux sociétaux et environnementaux actuels et futurs. Ce projet permettra, à court terme, le développement et la mise sur le marché vétérinaire de probiotiques anti-Giardia, puis à plus long terme une application potentielle chez l’Homme. Il contribuera à élargir l’éventail thérapeutique, à améliorer la prise en charge et le traitement de la maladie, et in fine à améliorer la qualité de vie des individus concernés. Il permettra également de faire progresser les connaissances fondamentales relatives à l’application de souches probiotiques produisant des BSH, notamment dans leur action synergique avec le microbiote. Le microbiote est au centre de découvertes majeures en médecine vétérinaire et humaine depuis plus de 20 ans. Ce projet vise à en comprendre les mécanismes clés, ouvrant ainsi la voie à l’identification de nouveaux axes de recherche fondamentaux et appliqués.
Procédures
Au cours des études et pour l’ensemble des animaux rentrant en procédures, les interventions seront : - Pesée et gavage oesogastrique quotidiens pendant 12 jours maximum (5 min maximum par animal) - Deux gavages oesogastriques quotidiens espacés d’une demi-journée : 1 fois - Mise à mort
Impact sur les animaux
L’infection à Giardia duodenalis est asymptomatique et auto-résolutive en une dizaine de jours chez la souris. Les potentiels effets indésirables seront les erreurs de gavage (fausse route avec passage de la sonde dans la trachée, détectable par présence de sang sur la sonde). Dans ce cas les animaux concernés seront mis à mort immédiatement.
Devenir
A l’issue de l’ensemble des procédures, les animaux seront mis à mort afin de procéder au prélèvement des différents organes nécessaires à la quantification de la giardiose et aux traitements des données expérimentales.
Remplacement
L’utilisation d’animaux est nécessaire pour confirmer les observations faites in vitro. En effet, le test in vitro ne permet d’apprécier que l’efficacité du surnageant de culture bactérienne sur Giardia. Il est donc nécessaire de vérifier l’efficacité de ces stratégies thérapeutiques dans des conditions physiologiques. De plus, il n’existe pas de modèle in vitro envisageable qui permet l’étude des interactions hôte/Giardia/microbiote. L’ensemble des souches de probiotiques qui seront administrées in vivo auront fait l’objet d’études préliminaires in vitro et seront le fruit d’une première sélection visant à ne garder que les souches ayant un réel intérêt anti-Giardia. Des tests en laboratoire auront d’abord été effectués afin d’évaluer l’efficacité des différentes souches et de ne retenir que les plus prometteuses avant les essais in vivo. Pour chaque formulation, des études de faisabilité, de stabilité de l’activité sont réalisées. Ainsi les formulations qui seront étudiées in vivo seront également issues d’un processus de sélection afin de limiter le nombre de groupes et donc le nombre d’animaux entrant dans cette étude.
Réduction
Pour le modèle de souris âgés de 3 semaines, une publication récente a démontré qu’un effectif de 10 souris par groupe étaient suffisants. Aussi, le choix d’un effectif de 10 souris par groupe repose sur des modèles précédemment publiés, dans lesquels des groupes de 10 animaux ont été utilisés pour évaluer la charge parasitaire et les réponses immunitaires en réponse à un traitement. Le nombre d’animaux inclus dans cette étude a été déterminé en amont à l’aide d’outils méthodologiques reconnus, afin de garantir un équilibre entre la robustesse scientifique des résultats et le respect du principe de réduction du nombre d’animaux utilisés. Chaque expérience comprendra quatre groupes distincts, avec un effectif équilibré entre les groupes, pour un total de 40 individus. L’organisation des animaux (notamment leur répartition par cage) a été prise en compte afin de limiter les biais potentiels liés aux conditions d’hébergement. Cette précaution permet d’assurer une interprétation rigoureuse des résultats. Les données recueillies feront l’objet d’analyses statistiques adaptées à leur nature et à leur distribution, conformément aux standards méthodologiques en vigueur.
Raffinement
Un suivi quotidien du bien-être des animaux sera assuré à l’aide d’un cahier de suivi renseigné chaque jour par des animaliers et les expérimentateurs. Les points limites, fondés sur des critères objectifs et facilement mesurables, tels que la perte ou l’absence de gain de poids entre deux prises, les troubles de mobilité et la posture des animaux, permettront de détecter précocement toute altération de l’état général et d’éviter aux animaux l’apparition d’une souffrance inutile. Les gavages œsogastriques seront réalisés par des expérimentateurs formés et entraînés, conformément à une procédure dédiée, ce qui contribuera au raffinement de l’ensemble des manipulations prévues dans le projet. Un enrichissement du milieu d’hébergement sera également mis en place afin d’améliorer le confort des souris, notamment par l’ajout de maisons, de roues, de tubes transparents, de cellulose déchiquetée et de bâtons à ronger
Choix des espèces
Deux espèces de Rongeurs sont habituellement utilisées pour les études expérimentales de la giardiose : la souris et la gerbille de Mongolie qui est beaucoup plus difficile à manipuler et très sensible au stress et qui n’est utilisée que lorsque le modèle souris ne peut pas être utilisé notamment pour étudier la giardiose chronique. Deux espèces de Rongeurs sont utilisées pour les études expérimentales de la giardiose : la souris et la gerbille de Mongolie qui est beaucoup plus difficile à manipuler et très sensible au stress et qui n’est utilisée que lorsque le modèle souris ne peut pas être utilisé notamment pour étudier la giardiose chronique. Les modèles souris sont des modèles reproductibles. Ils correspondent aux modèles les plus utilisés pour tester des traitements contre la giardiose. L’infection par Giardia n’est possible que chez le souriceau avant sevrage et jusqu’à l’âge de 4 semaines. Après cet âge, l’infection est inconstante ou nécessite un traitement préalable des animaux (immunosuppression ou antibiothérapie pour détruire la flore digestive). La variabilité de l’infection est plus faible avant sevrage.
Génération et validation de souris génétiquement modifiées par techniques de transgénèse
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles immunitaires
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système immunitaire
Générées pour créer des lignées transgéniques, 26 300 souris vont être utilisées dans des procédures classées en souffrance légère à modérée. Les femelles donneuses reçoivent des injections d'hormones, les receveuses une chirurgie de réimplantation d'embryons sous anesthésie, et les souriceaux de moins de huit jours sont identifiés par prélèvement de phalanges. Ce nombre, le plus élevé du lot, tient à la production en série d'animaux génétiquement modifiés. Les femelles fécondées sont tuées, les souris transgéniques transférées vers des partenaires et les non fécondées réutilisées pour de la formation.
Objectifs
Génération de souris génétiquement modifiées par des différentes techniques de transgénèse additive ou ciblée et validation génotypique
Bénéfices attendus
Les projets de transgénèse de cette demande vont contribuer à l’élargissement des connaissances scientifiques à partir de résultats ciblés liées aux différents modèles souris créés pour une vaste variété de sujets de recherche dans multiple domaines (immunologie, cancérologie, audition, développement, infectiologie, etc.). Les modèles murins de nouvelle création, seuls ou en combination avec d’autres déjà existants contribueront ainsi au progrès de la recherche fondamentale et/ou appliquée
Procédures
-Pour les femelles donneuses : injection d’hormones 2 fois à 46 heures d’intervalle. Durée 1-2 minutes -Pour les femelles receveuses, chirurgie bilatérale de réimplantation avec anesthésie chimique/gazeuse avec analgésie complémentaire. Intervention: 1 fois, 15 minutes d’intervention/femelle -Pour les animaux nés des femelles receveuses/accouplements, Identification des souriceaux par prélèvement de phalanges distales
Impact sur les animaux
-Douleur et inconfort légers de courte durée (1 min) liés à l’injection des hormones. -Douleur et inconfort modérés de durée de 3 jours, liés à la chirurgie. -Douleur et inconfort léger de courte durée liée à l’introduction de la aiguille (quelques sec-quelques min) liés à un putatif prélèvement sanguin (le cas échéant)
Devenir
-Toutes les femelles qui ont été fécondées devront être mises à mort (au moment du prélèvement d’embryons ou du sevrage des souriceaux). -Les souris mâles et femelles transgéniques positives identifiés seront utilisées pour la suite de l’établissement des modèles de souris génétiquement modifiée chez nos partenaires -Les souris mâles et femelles non fécondées peuvent être re-utilisés dans le cadre de formations sur animaux
Remplacement
Malgré le développement actuel croissant de différents modèles ex vivo incluant des modèles organoïdes, le modèle souris continue à être essentiel en recherche afin d’avoir accès à toutes les régulations dans le cadre de l’organisme entier. L’intérêt et besoin de recourir à l’utilisation de lignées de souris génétiquement modifiées dans les projets scientifiques de nos collaborateurs est évalué et justifié dans le cadre de chacun des projets autorisés. Toutefois, nous avons réussi à remplacer un nombre important de nos femelles grâce à des embryons fertilisés congelés commerciaux capables de remplacer les embryons frais avec efficacité pour leur modification par transgénèse. Ainsi des embryons frais seront seulement nécessaires en cas de superovulation de souris génétiquement altérées précédemment et/ou fonds génétiques particuliers.
Réduction
-Le nombre de souris femelles donneuses vient principalement de notre longue expérience et est dépendant principalement du fonds génétique des embryons à modifier et du type de manipulation. Pour chaque fonds génétique de femelles donneuses, nous essayons d’optimiser l’âge et les conditions de d’injection afin d’obtenir un maximum d’embryons par femelle et réduire ainsi le nombre de femelles donneuses. -La technique montre une viabilité plus élevée des embryons modifiés et permet une réduction des femelles donneuses requises. -Le nombre de souris receveuses à réimplanter est en fonction du nombre d’embryons qui auront survécu à la manipulation. -Pour chaque transgène ou chaque clone de cellules injecter, nous arrêtons les séries de manipulation dès que nous arrivons dans un premier temps à une dizaine de femelles réimplantées. Nous attendons ensuite la naissance des souriceaux afin de décider, à partir du nombre de petits obtenu, de la reprise ou pas de nouvelles séries de micromanipulation. Ce qui nous permet encore de réduire le nombre de femelles donneuses et receveuses utilisées. -Le fonds génétique choisi pour les femelles receveuses (excellentes mères et capables de donner naissance à de grandes portées de nouveau-nés) permet aussi d’optimiser le nombre de femelles mères-porteuses utilisées par rapport à l’utilisation d’un autre fonds génétique moins « efficace » -Le renouvellement de la batterie de mâles reproducteurs et vasectomisés environ chaque 6-9 mois permet d’améliorer leur performance quant aux capacités d’accouplement et de fécondation permettant à son tour d’optimiser le nombre de femelles donneuses et receveuses et réduire son nombre.
Raffinement
Le souris injectées et les femelles ayant subi la chirurgie seront surveillées quotidiennement. Les femelles receveuses reçoivent un traitement antalgique avant et après l'acte chirurgical et sont surveillées soigneusement pour assurer la bonne cicatrisation pendant au moins les 5 premiers jours après-chirurgie. Nous serons toujours particulièrement attentifs à tout signe de détresse (signes cli-niques externes, prostration, poils hérissés évaluation du Body Condition Score-BCS) afin de réduire/éliminer la souffrance des animaux transgéniques fondateurs et leurs descendants. En cas de souffrance et avant la mise à mort au plus tard au bout de 24h après con-firmation des signes cliniques externes, nous aurons recours au besoin de la nourriture humidifiée / gel hydrique, la réhydratation sous-cutanée ou le chauffage des animaux si hypothermie associée.
Choix des espèces
La souris est un mammifère de petite taille à reproduction rapide qui montre 90% d’homologie avec le génome humain, d’où l’intérêt majeur de la création de souris gé-nétiquement modifiées pour la découverte de mécanismes globaux en recherche fon-damentale ainsi que pour la modélisation de maladies humaines. La pertinence du choix de la souris pour ces projets est justifiée dans les projets scientifiques des parte-naires demandeurs. -Les mâles et femelles reproducteurs sont des adultes matures sexuellement (2-12 mois), les femelles receveuses sont des adultes (matures sexuellement, âgées de 8-12 semaines). -Les femelles donneuses d’embryons sont des jeunes, généralement prépubères âgées de 3-4 semaines, pour bien répondre au traitement hormonal de superovulation (âge dépendant du fonds génétique). -Les souris transgéniques positives seront des jeunes remises aux entités de recherche peu de temps après le sevrage une fois caractérisés génétiquement (pour avancement du projet)
Déterminer le rôle des cellules T de souris dans la protection vaccinale avec un vaccin candidat contre le virus du Nil Occidental EU2/2
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Moins de trente minutes exposées aux piqûres de moustiques infectés par le virus du Nil occidental, sous anesthésie : 602 souris sont utilisées dans des procédures classées en souffrance légère à modérée, toutes tuées à l'issue. Certaines sont vaccinées puis anesthésiées pour prélever les cellules immunitaires de leur rate, d'autres reçoivent ces cellules avant l'exposition aux moustiques, avec un suivi des symptômes sur quatorze jours. Le projet vise à soutenir une demande d'essai clinique pour un vaccin candidat. Les souris servant à produire les cellules immunitaires sont tuées pour en récupérer la rate, les autres à la fin des procédures d'infection.
Objectifs
Le projet de recherche permettra de soutenir une demande d’essais cliniques pour un candidat vaccin contre le virus du Nil Occidental. C'est un virus transmis par les moustiques. Il circule surtout chez les oiseaux, qui servent de réservoir naturel. Chez l’être humain, la plupart des infections ne provoquent aucun symptôme (environ 80 % des cas). Cependant, environ 20 % des personnes peuvent avoir de la fièvre et se sentir mal pendant quelques jours. Dans moins de 1 % des cas, le virus peut toucher le système nerveux et provoquer des complications plus graves, comme des inflammations du cerveau ou des méninges, voire une paralysie soudaine ou encore la mort. Ces formes graves sont plus fréquentes chez les personnes âgées ou celles dont le système immunitaire est affaibli. Il est présent dans de nombreuses régions du monde dont l’Europe. Il n’existe actuellement pas de vaccin contre cette maladie et le vaccin candidat que nous proposons pourra répondre à un besoin en santé publique mondiale. La cible du vaccin candidat a été identifiée et correspond à un composé présent dans la salive du moustique. L’équipe de recherche a déjà démontré que l’immunisation contre ce composé protège contre l’infection par le virus de la fièvre du Nil Occidental. Pour soutenir le développement vaccinal, le projet décrit ici a pour objectif de déterminer si la protection vaccinale est liée aux cellules immunitaires ou à d'autres acteurs de l'immunité. Le projet se déroule dans deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Le bénéfice à court terme est la compréhension des mécanismes cellulaires de protection du vaccin candidat. A long terme, les résultats soutiendront le développement d’un vaccin contre ce virus transmis par les moustiques. Le vaccin qui découlera de ce projet a le potentiel de sauver la vie de milliers de personnes chaque année et d’atténuer le fardeau sanitaire, social et économique de cette maladie transmise par les moustiques.
Procédures
Dans un premier temps, nous évaluerons la fonction des cellules immunitaires dans la protection vaccinale. Nous vaccinerons des souris en les injectant à deux reprises avec le candidat vaccin. Les injections dureront quelques minutes. Deux semaines après la dernière injection, les souris seront anesthésiées pour prélever les cellules immunitaires de la rate, puis euthanasiées. Dans des souris non immunisées, nous injecterons les cellules immunitaires isolées puis les exposeront à la piqûre de moustiques infectés par le virus de la fièvre du Nil Occidental. L’exposition aux moustiques, sous anesthésie, durera moins de 30 minutes. Nous effectuerons ensuite un seul prélèvement sanguin pour vérifier l’infection et évaluerons les symptômes pendant 14 jours. Dans un deuxième temps, nous testerons si ces cellules immunitaires injectées sont recrutées au niveau de la peau suite à la piqûre de moustiques infectés. Toutes les expériences d'infection seront réalisées dans l'EU1, alors que le reste des expériences sera conduit dans l'EU2.
Impact sur les animaux
Douleur passagère au niveau du site d’injection lors de l’administration du vaccin candidat et des anesthésiques, ainsi que lors des prélèvements sanguins. La piqûre de moustique se fera sous anesthésie donc sans douleur. Une faible irritation peut être attendue aux points de piqûres des moustiques. Les troubles liés à l’infection par le virus peuvent inclure des modifications de l’apparence, de l’alimentation et du comportement. Les souris seront surveillées quotidiennement pour évaluer leurs éventuels symptômes.
Devenir
Les animaux utilisés pour la production de cellules immunitaires seront euthanasiés afin de permettre la collecte de leur rate. Tous les animaux infectés seront euthanasiés à la fin des procédures, conformément à l’obligation légale.
Remplacement
Dans notre cas, le modèle animal est incontournable. A ce jour, aucun modèle autre que le modèle animal ne permet d’évaluer la réponse immunitaire à un vaccin et la protection contre une infection par exposition à une piqûre de moustique infecté. Néanmoins, nous avons généré les données préliminaires nécessaires pour supporter notre hypothèse sur des modèles cellulaires. Ces travaux antérieurs nous on permit d’identifier notre vaccin candidat.
Réduction
Afin de réduire le nombre de souris, nous avons calculé le nombre limite nécessaire pour obtenir des résultats significatifs. Des travaux préliminaires ont été réalisés pour calculer ce nombre au plus juste.
Raffinement
Les souris auront un temps d’acclimatation (5 jours) avec visite quotidienne pour limiter le stress lié à la manipulation. Les souris seront hébergées de 3 à 5 individus/cage avec de la litière et des enrichissements variés, tels que des tunnels en carton, des abris en carton et en bois, des copeaux de carton pour fabriquer un nid et du carton rigide à ronger. Elles seront anesthésiées durant l’exposition aux moustiques pour limiter la gêne de la piqûre. Une grille de score évaluant l'état général des souris sera quotidiennement suivie. Cette grille permet d’observer différents signes de bien-être ou de malaise (comme l’apparence, l’activité, le comportement ou la perte de poids). Nous avons défini des seuils à ne pas dépasser pour garantir la santé et le bien-être des animaux. Si l’un de ces seuils est atteint, l’expérience sera immédiatement arrêtée afin d’éviter toute souffrance inutile. L’évaluation quotidienne sera effectuée par les responsables de la mise en oeuvre générale du projet dans l’EU. Pour une note supérieure à 4, nous considérerons l’injection de 0.05 mg/kg de buprénorphine en S/C de 3 à 4 fois par jour. A partir de 8, la surveillance sera renforcée et nous considèrerons l’euthanasie. Une note supérieure ou égale à 12 est le point limite. Si ce point limite est atteint, une révision du protocole expérimental sera effectuée.
Choix des espèces
Nous allons utiliser des souris avec lesquelles nous avons développé et évalué la stratégie vaccinale. Nous continuerons à documenter la protection conférée par notre vaccin candidat sur souris avant de tester le vaccin candidat sur des animaux plus grands pour soutenir une demande d’essais cliniques. Nous allons utiliser des souris adultes de 6-8 semaines car elles ont un système immunitaire mature permettant une réponse immunitaire adéquate. Leur taille permet aussi la piqûre simultanée par plusieurs moustiques, nécessaire pour maximiser l’effet de l’infection.
Mécanismes inflammatoires impliqués dans deux modèles d’arthrite induite chez la souris 1/3
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Soumises à une irradiation de quatre minutes puis à des injections répétées, jusqu'à vingt-et-une par animal, 898 souris vont être utilisées dans des procédures classées en souffrance modérée. Ce volet d'un projet mené sur trois établissements provoque deux formes d'arthrite pour en étudier les mécanismes inflammatoires. Les atteintes attendues sont des douleurs articulaires, une baisse de mobilité et un stress lié aux manipulations, à l'imagerie et aux transports entre sites. La plupart des souris sont tuées pour prélever sang, organes lymphoïdes et pattes, quelques reproducteurs au bon génotype étant gardés pour les lignées.
Objectifs
La polyarthrite est une pathologie très fréquente et invalidante qui représente un enjeu de santé publique. Cette maladie auto-immune provoque une inflammation durable des articulations, ce qui peut endommager les os et le cartilage, entraînant des déformations irréversibles. Nous voulons étudier les mécanismes inflammatoires mis en jeu en modifiant leur expression dans deux modèles de souris d’arthrite induite. Ce projet se déroulera dans 3 EU différents.
Bénéfices attendus
Ce travail nous permettra de mieux comprendre les mécanismes pathogènes à l'origine de la maladie et pourrait ainsi contribuer au développement de thérapies efficaces.
Procédures
Le projet se déroulera dans 3 établissements utilisateurs : l'élévage dans l’établissement 1, le suivi clinique et traitement dans l’établissement 2, l’imagerie dans l’établissement 3. Les animaux vigiles seront soumis à : 1) contention et 2 injections d'une durée de 10 secondes ou injections 3 fois par semaine pendant 1 semaine ou 7 semaines, soit au final: respectivement 3 ou 21 injections d’une durée de 10 secondes; 2) une irradiation d’une durée de 4 min, une injection unique d'une durée de 40 secondes, un prélèvement sanguin de 15 sec (5 au total). Les animaux anesthésiés seront soumis à 2 injections d'une durée de 10 secondes et à un acte d'imagerie (au total 6 actes d'imagerie de 15 minutes)
Impact sur les animaux
L’irradiation va induire un stress et une faible perte de poids temporaire. Les injections vont induire du stress et une douleur légère de courte durée. Les prélèvements sanguins vont induire du stress. Le développement de l'arthrite va induire des douleurs au niveau des articulations, et une diminution de la mobilité. Les anesthésies gazeuses sont des actes stressants. Le transport des animaux entre les différents sites peut aussi être stressant pour les animaux.
Devenir
La majorité des souris seront mises à mort pour prélèvement de tissus spécifiques : sang, organes lymphoides et pattes afin de réaliser une évaluation approfondie de l’atteinte articulaire et inflammatoire par différentes techniques. Certains animaux de l'élevage avec le bon génotype seront conservés pour le maintien des lignées.
Remplacement
Bien que nous menions en parallèle des études de culture cellulaire pour tester nos hypothèses, le recours à l'animal est indispensable car la réponse inflammatoire et le développement de l’arthrite résultent d’interactions complexes entre plusieurs organes, qui ne peut être étudiée de façon complète que sur des animaux entiers.
Réduction
Un nombre minimum d'animaux nécessaires, déterminé par une analyse de puissance statistique, sera inclus dans chaque groupe. Les résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
. Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. les animaux feront l’objet d’une surveillance continue, pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques de souffrance ou de mal-être et des anti-douleurs pourront être administrés si nécessaire. L’imagerie sera réalisée sous anesthésie générale et permettra d’avoir un suivi longitudinal du développement inflammatoire et articulaire pour l'ensemble des animaux ainsi qu’une mise à mort de chaque animal au moment le plus informatif. Les souris seront transférées dans des cages de transport agrées, bords opaques, sans visibilité de l’extérieur.Tout au long de la procédure,
Choix des espèces
La souris développe des réactions immunitaires proches de celles observables chez l’homme. Les atteintes articulaires développées dans ces modèles induits sont similaires à celles observées chez l’homme. Les souris adultes seront âgées de 6 à 17 semaines pour évaluer l’efficacité thérapeutique des études.