Rongeurs

Mises à mort pour la plupart afin de prélever sang, organes lymphoïdes et pattes, 898 souris vont être utilisées dans des procédures classées en souffrance modérée pour étudier deux formes d'arthrite provoquée. Elles reçoivent jusqu'à vingt-et-une injections, une irradiation de quatre minutes, cinq prélèvements sanguins et six séances d'imagerie sous anesthésie, réparties entre trois établissements. Le développement de l'arthrite provoque des douleurs articulaires et une perte de mobilité, et le transport entre sites ajoute une source de stress. Une partie des animaux d'élevage porteurs du bon génotype est conservée pour entretenir les lignées.

Objectifs

Le projet se déroulera dans 3 établissements utilisateurs différents. La polyarthrite est une pathologie très fréquente et invalidante qui représente un enjeu de santé publique. Cette maladie auto-immune provoque une inflammation durable des articulations, ce qui peut endommager les os et le cartilage, entraînant des déformations irréversibles. Nous voulons étudier les mécanismes inflammatoires mis en jeu en modifiant leur expression dans deux modèles de souris d’arthrite induite.

Bénéfices attendus

Ce travail nous permettra de mieux comprendre les mécanismes pathogènes à l'origine de la maladie et pourrait ainsi contribuer au développement de thérapies efficaces.

Procédures

Le projet se déroulera dans 3 établissements utilisateurs : l'élévage dans l’établissement 1, le suivi clinique et traitement dans l’établissement 2, l’imagerie dans l’établissement 3. Les animaux vigiles seront soumis à : 1) contention et 2 injections d'une durée de 10 secondes ou injections 3 fois par semaine pendant 1 semaine ou 7 semaines, soit au final: respectivement 3 ou 21 injections d’une durée de 10 secondes; 2) une irradiation d’une durée de 4 min, une injection unique d'une durée de 40 secondes, un prélèvement sanguin de 15 sec (5 au total). Les animaux anesthésiés seront soumis à 2 injections d'une durée de 10 secondes et à un acte d'imagerie (au total 6 actes d'imagerie de 15 minutes)

Impact sur les animaux

L’irradiation va induire un stress et une faible perte de poids temporaire. Les injections vont induire du stress et une douleur légère de courte durée. Les prélèvements sanguins vont induire du stress. Le développement de l'arthrite va induire des douleurs au niveau des articulations, et une diminution de la mobilité. Les anesthésies gazeuses sont des actes stressants. Le transport des animaux entre les différents sites peut aussi être stressant pour les animaux.

Devenir

La majorité des souris seront mises à mort pour prélèvement de tissus spécifiques : sang, organes lymphoides et pattes afin de réaliser une évaluation approfondie de l’atteinte articulaire et inflammatoire par différentes techniques. Certains animaux de l'élevage avec le bon génotype seront conservés pour le maintien des lignées.

Remplacement

Bien que nous menions en parallèle des études de culture cellulaire pour tester nos hypothèses, le recours à l'animal est indispensable car la réponse inflammatoire et le développement de l’arthrite résultent d’interactions complexes entre plusieurs organes, qui ne peut être étudiée de façon complète que sur des animaux entiers.

Réduction

Un nombre minimum d'animaux nécessaires, déterminé par une analyse de puissance statistique, sera inclus dans chaque groupe. Les résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

. Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. les animaux feront l’objet d’une surveillance continue, pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques de souffrance ou de mal-être et des anti-douleurs pourront être administrés si nécessaire. L’imagerie sera réalisée sous anesthésie générale et permettra d’avoir un suivi longitudinal du développement inflammatoire et articulaire pour l'ensemble des animaux ainsi qu’une mise à mort de chaque animal au moment le plus informatif. Les souris seront transférées dans des cages de transport agrées, bords opaques, sans visibilité de l’extérieur.Tout au long de la procédure,

Choix des espèces

La souris développe des réactions immunitaires proches de celles observables chez l’homme. Les atteintes articulaires développées dans ces modèles induits sont similaires à celles observées chez l’homme. Les souris adultes seront âgées de 6 à 17 semaines pour évaluer l’efficacité thérapeutique des études.

3 164 souris et 3 172 rats vont être utilisés, chacun recevant un produit chimique ou pharmaceutique presque tous les jours pendant vingt-six à cent-quatre semaines, dans des procédures classées en souffrance modérée. Ces études de cancérogénèse cherchent à prédire si une substance provoque des tumeurs chez l'humain exposé sur de longues durées. Les animaux subissent jusqu'à une vingtaine d'interventions par semaine, prélèvements sanguins et passages en cage métabolique compris, et développent des masses tumorales surveillées jusqu'à la mise à mort finale pour analyse des organes. Le RNT affirme qu'il n'existe pas d'alternative in vitro et justifie la durée par l'exposition prolongée visée.

Objectifs

Certaines pathologies chez l’homme nécessitent des traitements médicaux à long terme (6 mois ou plus). Les études de cancérogenèse chez le rongeur décrites dans ce projet ont été développées pour prédire le risque qu’un produit pharmaceutique/chimique induise des tumeurs chez l’homme lorsqu’il est exposé à ce produit sur de longues périodes. Elles sont réalisées lorsque les données in vitro de génotoxicité ne mettent pas en évidence un effet mutagène potentiel du composé ou lorsqu’il y a un doute sur l’effet cancérogène lié à la structure du produit à tester. Il n'existe pas d'alternative in vitro pour le moment. Ce projet se résume en l’administration répétée (souvent quotidiennement) d’un produit pharmaceutique/chimique chez le rongeur pendant une durée allant de 26 à 104 semaines. La voie d’administration est généralement celle utilisée chez l’homme (souvent orale). L’animal choisi est un mammifère rongeur, espèce recommandée dans les lignes directrices pour ce type d’étude car la durée de vie de cette espèce est compatible avec une exposition au produit sur une très longue période, permettant d'évaluer l'effet possible du produit sur l'apparition de tumeurs sur un animal âgé. A ces fins, environ une quarantaine d'organes et toutes les tumeurs observées sont examinées par un pathologiste expérimenté pour discriminer les tumeurs spontanées des tumeurs induites sur la base d'une comparaison avec les animaux contrôles, en utilisant des tests statistiques exigeant un nombre minimal d'animaux en fin d'étude, et les données historiques sont un support pour l’interprétation. Le nombre d’animaux utilisés dans le cadre de ce projet suite les recommandations des lignes directrices dans le but de détecter la survenue de tumeurs. Dans certaines situations, le design des études peut être soumis à l'examen d'autorités . Les effectifs retenus sont aussi recommandés pour garantir le succès des tests statistiques afin d’interpréter les résultats.

Bénéfices attendus

L’ensemble des études du projet vise à identifier les substances chimiques ou pharmaceutiques possédant un risque potentiel dans l’apparition de tumeurs en l’administrant sur la période la plus longue possible devant correspondre en général à la durée de vie de l’espèce. Ces études permettent l’évaluation du ratio bénéfice/risque de la substance pour la santé humaine. La conduite du projet est nécessaire pour les dossiers déposés auprès des autorités avant la mise sur le marché.

Procédures

Les animaux sont traités par différentes voies (principalement orale mais aussi injection sous cutanée, intranasale ou intraveineuse) de façon journalière ou hebdomadaire avec le produit d’intérêt. La durée de l’administration est généralement rapide (quelques secondes à quelques minutes). La durée des études varie de 26 à 104 semaines. Des prélèvements sanguins (sur animal vigile placé dans un tube de contention ou sous anesthésie) sont également possibles pour bilan hémato-biochimique par exemple ; ils sont réalisés à une fréquence et aux volumes conformes aux recommandations éthiques en vigueur. Tout prélèvement dépassant ces recommandations devra être justifié et fera l'objet d'une réévaluation en amont de chaque étude (balance bénéfice/ contrainte pour l'animal). La manipulation des animaux durant les interventions (intégrant la surveillance et la mesure des masses palpables) est généralement inférieure à 1 heure par animal par jour Jusqu’à une vingtaine d’interventions peuvent être réalisées par animal et par semaine. Une mise en diurèse en cage métabolique, n’excédant pas 16h est aussi possible.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus peuvent correspondre à l’apparition de tumeurs (identifiées par l’examen externe du vivant de l’animal de masses) peut provoquer un inconfort de l’animal. L’évolution, la location, la taille, le nombre de ces masses font partie d’une surveillance rapprochée des rongeurs impliqués dans les études de cancérogenèse et les critères de soins/d’euthanasie sont spécifiquement associés au respect de l’animal. En effet, ces masses peuvent gêner la contention, le déplacement de l’animal ou lui procurer une douleur). D’autres effets indésirables peuvent subvenir et découler d’effets pharmacologiques et/ou toxicologiques du produit administré, à l’inconfort, au stress et/ou à la douleur transitoire liés aux procédures de prélèvements, d’administrations répétées, la contention et/ou des effets systémiques comme la perte de poids et la baisse de consommation alimentaire. alimentaire, et apparition de tumeurs en cours d’étude)] qui peuvent être observés.

Devenir

Les études de cancérogenèse incluent une analyse histopathologique pour évaluer les potentiels effets toxiques sur les organes et tissus ; à ce titre les animaux seront euthanasiés en fin d’étude.

Remplacement

L’évaluation de la toxicité de futurs médicaments/produits chimiques qui vont être mis sur le marché/utilisés par l’Homme nécessite encore l’utilisation d’animaux, et ces études ne peuvent pas être réalisées in vitro. Il n’existe pas encore de méthode alternative in vitro pour mettre en évidence certains effets, en raison notamment de la complexité des organismes vivants.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe peut varier en fonction du design de l’étude: un ou deux sexes (souvent les 2), ajout d’animaux satellites, ajout d’une phase de réversibilité, euthanasie en cours d’étude, suivi de marqueurs spécifiques, comparaison avec des composés de référence, nombre de doses testées. Dans le cadre de ces études à objectif règlementaire, le nombre d’animaux est précisé dans les lignes directrices correspondantes et des recommandations sont publiées pour aider l’analyse statistique des tumeurs observées de façon optimale mais suffisant robuste pour garantir la solidité des interprétations et des conclusions finales qui visent à classer les produits testés carcinogènes ou pas. Une réglementation parue en 2022 indique la possibilité de soumettre aux autorités de tutelle une suggestion de ne mettre en place des études sur une seule espèce.

Raffinement

L'état général des animaux est surveillé quotidiennement et un certain nombre de paramètres sont enregistrés et analysés régulièrement comme le poids corporel et consommation de nourriture et d’eau, température corporelle, signes cliniques, morbidité/mortalité. Plus spécifiquement, l’apparition de tumeurs est approchée par l’examen des masses palpables. Toute anomalie est signalée au Vétérinaire et au scientifique qui assure la conduite de l’étude. Si un ou plusieurs points limites sont atteints, identification d’infections bactériennes ou d’autres maladies pouvant interférer avec le protocole expérimental, que la douleur de l’animal ne peut être soulagée ou que l’inconfort ne peut pas être suffisamment limité à son minimum, la décision d'interrompre le traitement ou d'euthanasier l'animal sera prise. Des techniques de prélèvement sanguin sont utilisées selon les bonnes pratiques vétérinaires et procédures internes validées, quand elles sont compatibles avec les volumes de sang/fréquences de prélèvement. Les rongeurs sont hébergés en groupe et pour certaines substances ayant une action sur le système nerveux central, une période d'habituation aux doses peut être effectuée sur les animaux avant le démarrage de la période d’administration.

Choix des espèces

Le mammifère est choisi pour sa proximité avec les grandes fonctions physiologiques de l’Homme. Dans le cadre d’études de cancérogenèse, le rongeur en raison de sa longévité compatible avec un temps de développement / recherche des effets sur la durée de vie entière est retenu. C’est aussi une espèce dont la manipulation est pratique, communément utilisée en recherche biomédicale (recul sur les données propres à l’espèce publiées dans la littérature), et requise au plan réglementaire sur un plan international. Des animaux adultes et des deux sexes sont utilisés.  

Pour tester si une immunothérapie anticancéreuse agit mieux le matin, 430 souris sont utilisées dans des procédures classées en souffrance modérée, toutes mises à mort pour prélèvement. Une tumeur est greffée sous la peau, puis les animaux reçoivent le traitement, des séances d'échographie sous anesthésie tous les deux ou trois jours, un accès à la nourriture limité à huit heures par jour et trente minutes d'activité physique imposée trois fois par semaine. Le RNT décrit les douleurs possibles de la tumeur, pression sur les tissus, nécrose, posture voûtée, vocalisations. L'hypothèse de départ vient d'études rétrospectives et d'un essai déjà menés chez l'humain, que le modèle murin est censé conforter.

Objectifs

L’immunothérapie, un traitement qui stimule le système immunitaire pour combattre le cancer, pourrait être plus efficace si elle est administrée le matin plutôt que l’après-midi. Cette découverte, issue d’études rétrospectives et d’un essai clinique mené en Chine, s’explique par le rôle de notre "horloge circadienne", un mécanisme naturel qui régule de nombreux processus biologiques, comme le sommeil ou l’immunité, en fonction des cycles jour-nuit. Pour renforcer cette synchronisation, deux facteurs clés entrent en jeu : une alimentation limitée à des plages horaires précises (comme manger uniquement entre 8h et 18h) et la pratique régulière d’une activité physique. Les objectifs du projet sont triples : évaluer si une alimentation temporellement limitée améliore la réponse au traitement matinal, déterminer si cette approche permet d’étendre les bénéfices du traitement à d’autres moments de la journée en synchronisant les organes périphériques, et analyser si l’activité physique apporte un avantage supplémentaire. Pour étudier ces interactions complexes entre organes, nous utiliserons des souris, dont l’horloge circadienne et la réponse aux traitements sont comparables à celles des humains. Cette recherche ouvre des perspectives prometteuses car en optimisant l’heure d’administration des traitements et en les combinant avec l’alimentation et l’exercice, il pourrait être possible d’améliorer significativement leur efficacité pour les patients.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet vise à vérifier si, chez l’animal, on peut augmenter l’efficacité de l’immunothérapie contre le cancer en améliorant la synchronisation de l’horloge interne. Si cette hypothèse se confirme, à plus long terme, ces résultats pourraient servir de base pour concevoir de nouveaux essais cliniques chez l’humain. Ces essais combineraient l’immunothérapie avec des méthodes naturelles pour renforcer l’horloge circadienne, comme administrer le traitement le matin, limiter les horaires des repas ou pratiquer une activité physique régulière. Chacune de ces approches (traitement matinal, alimentation ciblée, exercice) a déjà prouvé ses bienfaits séparément. On pense donc que leur combinaison pourrait amplifier les effets positifs de l’immunothérapie classique, qui ne tient pas compte des horaires optimaux. En somme, ce projet pourrait conduire à modifier l’utilisation des immunothérapies en les rendant plus efficaces, simplement en adaptant leur administration au rythme naturel du corps.

Procédures

Implantation de cellules tumorales : 1 injection (la tumeur se développe pendant 15 jours ensuite). Traitement antitumoral : 1 injection au jour 5. Anesthésie : tous 2 ou 3 jours à partir du jour 6. Echographie : tous 2 ou 3 jours à partir du jour 6. Accès à la nourriture pendant 8 heures : chaque jour pendant 15 jours. Activité physique : 30 minutes 3 fois par semaine pendant 15 jours.

Impact sur les animaux

Quand une tumeur se développe sous la peau, elle peut provoquer des effets indésirables tant au niveau local qu’à l’échelle de l’organisme entier. Localement, la tumeur peut exercer une pression sur les tissus environnants, entraînant des douleurs, des inflammations, voire une nécrose (dégénérescence des tissus). À un niveau plus général, elle peut causer des douleurs diffuses, des troubles métaboliques, une perte de poids, une réduction de la mobilité et un état de stress. Chez un animal porteur d’une telle tumeur, ces douleurs peuvent se traduire par des comportements agressifs, des vocalisations, un manque de soin personnel et une posture voûtée. L'alimentation limitée temporellement et l'activité physique améliorent la santé métabolique.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever des échantillons nécessaires au projet.

Remplacement

Pour étudier l’effet combiné de l’heure d’administration de l’immunothérapie, d’une alimentation limitée à des horaires précis et de l’activité physique, il est impossible de se contenter d’expériences en laboratoire (in vitro) ou de simulations numériques. En effet, ces trois facteurs interagissent de manière complexe et impliquent des mécanismes qui ne peuvent être observés que chez un organisme vivant (in vivo) : ils font intervenir plusieurs types de cellules immunitaires, les effets métaboliques de l’alimentation, les impacts globaux de l’exercice physique sur le corps, ainsi que la synchronisation de multiples horloges biologiques internes, présentes dans différents organes. C’est pourquoi on utilise un modèle animal déjà éprouvé dans des études similaires. En parallèle, nous travaillons avec des mathématiciens et informaticiens à la création d’un modèle numérique de l’horloge circadienne. L’objectif est de disposer, à terme, d’outils de simulation performants. Pour affiner ces modèles, nous nous appuyons sur des données expérimentales déjà collectées dans des projets antérieurs, ainsi que sur celles obtenues dans le cadre de cette étude. L’approche adoptée est donc double : réutiliser au maximum les connaissances existantes pour éviter de répéter des expériences déjà réalisées, et préparer le terrain pour des simulations futures en intégrant les nouveaux résultats dans des modèles mathématiques. Cela permettra, à long terme, de mieux comprendre et optimiser ces traitements combinés.

Réduction

L'objectif de réduction est abordé selon plusieurs approches complémentaires. Afin de n'utiliser que le strict minimum d'animaux nécessaire, des calculs statistiques sont réalisés pour définir l’effectif nécessaire pour chaque condition expérimentale. Nous utilisons une méthode statistique d'analyse des rythmes biologiques qui ne nécessite que 4 horaires de traitement. Plusieurs prélèvements d'organes et de tissus seront réalisés post-mortem afin d'éviter le recours à des animaux supplémentaires pour les analyses histologiques et moléculaires ultérieures.

Raffinement

Les souris vivront en groupe de 3 ou 4 dans un espace adapté, avec des jouets et des cachettes pour leur bien-être. Avant les expériences, elles s’habitueront aux manipulations et au matériel (tapis roulant, distributeur de nourriture). Les cellules cancéreuses leur seront injectées en fin de journée, un moment où la croissance des tumeurs est moins rapide. Leur poids sera vérifié trois fois par semaine, et une équipe surveillera leur état, même le week-end. Un complément alimentaire sous forme de gel pourra être donné aux souris pour améliorer leur état de santé. Aucun anti-inflammatoire ne sera utilisé, car cela pourrait fausser les résultats. En revanche, si une souris perd plus de 10 % de son poids, montre des signes de souffrance (pelage négligé, blessures, apathie) ou développe une tumeur trop grosse ou abîmée, elle sera euthanasiée. La croissance des tumeurs sera suivie par échographie sous anesthésie douce. Pour l’exercice, on privilégiera des encouragements tactiles plutôt que des chocs électriques, afin d’éviter tout stress.

Choix des espèces

1 - La souris est un modèle scientifiquement pertinent (modèle préclinique adapté à la cancérologie, son système circadien est très conservé par rapport à l'humain, les effets bénéfiques des protocoles d'alimentation limitée temporellement et d'activité physique en termes de santé métabolique ont déjà été documentés par des études antérieures). 2 - Les protocoles d'implantation sous-cutanée de cellules tumorales chez la souris sont largement éprouvés et robustes. 3 - Dans le cadre de la poursuite du projet, nous pourrions être amener à l'avenir à utiliser des modèles génétiquement modifiés disponibes uniquement chez la souris. Des souris adultes d'un âge compris entre 8 et 12 semaines seront utilisées. Cet âge garantit un système immunitaire pleinement mature et permet d'avoir une taille et un poids des animaux suffisant pour limiter les effets indésirables de la tumeur lorsqu'elle grossit. Cet âge a aussi été utilisé dans d'autres expériences similaires avec lesquelles nous souhaitons faire des comparaisons.

Une tumeur est implantée sous la peau, puis jusqu'à cinq injections d'anticorps dans la veine de la queue : 48 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. La croissance tumorale peut gêner leurs déplacements et les injections répétées risquent d'irriter ou de nécroser la veine. Le projet cherche une dose d'immunothérapie volontairement sous-optimale, à combiner ensuite avec des ultrasons. Les tumeurs sont prélevées après la mise à mort.

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans une étude globale qui vise à potentialiser l’effet de l’immunothérapie par les ultrasons par recrutement du système immunitaire et par action sur le microenvironnement tumorale. Les modèles de cancers choisis sont le mélanome car il est sensible à l’immunothérapie et le cancer du sein triple négatif car il est peu sensible à l’immunothérapie. Le mélanome est un cancer de la peau agressif qui touche environ 330 000 nouvelles personnes chaque année dans le monde, avec une incidence en hausse constante. Le cancer du sein triple négatif, une forme particulièrement agressive et difficile à traiter, représente environ 10 à 15 % des cancers du sein, soit environ 225 000 nouveaux cas par an dans le monde. Nous allons viser un dosage de l’immunothérapie pour obtenir un effet partiel à optimiser avec un traitement complémentaire, représenté dans notre étude globale par les ultrasons. Le but de ce projet est de déterminer une dose d’immunothérapie sous-optimale pour le mélanome et le cancer du sein, permettant d’observer une réponse immunitaire partielle dans la tumeur.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine, à long terme. Ce projet permettra par la suite d'utiliser ces modèles pour tester des combinaisons d'immunothérapie et d'ultrasons. En cas de succès, ce serait une réelle avancée en termes de prise en charge des patients atteints de mélanome, et de cancer du sein triple négatif. Ce projet permettra de mettre au point des modèles qui pourront être utilisés pour d’autres projets. La combinaison des traitements en clinique permettra de réduire les effets secondaires engendrés par l’immunothérapie et pourrait être appliquée dans d’autres types de cancers.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés pour une injection sous la peau de cellules tumorales (3 minutes). Les animaux seront manipulés 3 fois par semaine pour les peser et pour observer la pousse tumorale et ils recevront jusqu’à 5 injections intraveineuses.

Impact sur les animaux

Une injection de cellules en sous cutané entraînant une croissance de tumeur peut entraîner une gêne à la locomotion. Le suivi tumoral au pied à coulisse sera réalisé sur les animaux en contention et donc générera du stress et éventuellement une douleur au niveau de la tumeur. Les injections intraveineuses répétées d’anticorps via la veine caudale, associées à des contentions successives, peuvent également induire du stress, des douleurs locales au point d’injection ainsi qu’un risque d’irritation ou de nécrose de la veine. Avec l’injection d’anticorps, un risque de GVHD est possible (réaction immunitaire), pouvant entraîner des douleurs ou crampes abdominales, et diarrhées.

Devenir

Les animaux seront mis à mort car les mesures réalisées pour ce projet seront faites sur les tumeurs prélevés après la mise à mort de l’animal pour vérifier que l’immunothérapie génère une réponse immunitaire.

Remplacement

Afin d’établir et d’affiner toute l’étude globale, nous nous sommes basés sur plusieurs informations qui ont été données via des études sur des cultures de cellules 3D. En effet dans le but d’avoir des paramètres optimaux pour la finalité de notre étude, c’est-à-dire, combiner nos traitements, il est intéressant de savoir que l’élasticité est augmentée après traitement par ultrasons. Cependant, les interactions entre le système immunitaire et la tumeur sont complexes et impactées par différents organes lymphoïdes (la rate, les ganglions), ainsi que par différents paramètres de la tumeur (structure cellulaire, rigidité). L’étude de l’efficacité de l’immunothérapie ne peut se faire qu’au niveau de la tumeur dans son micro-environnement et avec ses interactions avec l’organisme entier.

Réduction

Les effectifs des groupes ont été calculés avec des outils statistiques.

Raffinement

Une anesthésie sera mise en œuvre lors de la procédure qui le nécessite. Un traitement anti-douleur sera administré si nécessaire. Les animaux seront placés sur litière en cellulose afin de limiter les risques d’ulcération, d’irritation ou de nécrose tumorale. Des points limites stricts et spécifiques au projet sont définis afin de permettre un arrêt précoce de la procédure en cas d’atteinte au bien-être animal.

Choix des espèces

La souris est la plus petite espèce qui développe des tumeurs suffisamment grosses pour être traitées par ultrasons. Nous avons choisi des souris âgées de 6 semaines au moment de l’implantation du modèle, car d’une part la prise tumorale est meilleure sur les individus jeunes, ce qui permet de diminuer le nombre d’animaux à utiliser. D’autre part, le traitement débutera entre 8-9 semaines, 8 semaines étant l’âge auquel leur système immunitaire est mature.

Pour suivre où se répartissent deux candidats médicaments contre la mucoviscidose, 1 562 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune reçoit une ou plusieurs administrations sous anesthésie, par voie intraveineuse, nasale, trachéale ou sous la peau, avant d'être tuée entre un et sept jours plus tard pour prélever ses organes. Le projet vise à choisir la dose et la voie d'administration avant d'éventuels essais chez l'humain. Le résumé ne détaille pas comment l'effectif de 1 562 a été fixé.

Objectifs

La mucoviscidose est une maladie génétique rare. Elle apparaît lorsqu’un gène chargé de garder le mucus fluide ne fonctionne pas correctement. Le mucus devient alors épais et collant, surtout dans les poumons et le système digestif, ce qui favorise les infections et abîme progressivement les organes. Aujourd’hui, les personnes atteintes vivent en moyenne 40 à 50 ans. Un traitement existe et aide beaucoup de patients, mais il n’est pas parfait : il peut provoquer des effets secondaires et il est très coûteux. C’est pourquoi il est important de trouver de nouvelles solutions thérapeutiques. Dans ce projet, nous cherchons à développer de nouvelles approches thérapeutiques. Dans cette optique, nous cherchons à comprendre comment administrer au mieux deux nouveaux candidats médicaments afin d’étudier leurs répartitions dans le corps de la souris. En même temps, nous pourrions également montrer que les doses administrées ne provoquent pas d’effets indésirables. Cela nous permettra de choisir la bonne dose, la meilleure manière de les administrer et de préparer les étapes suivantes, comme les tests de sécurité, avant de pouvoir envisager des essais chez l’humain.

Bénéfices attendus

Cette étude va aider les chercheurs à mieux comprendre comment les nouvelles molécules thérapeutiques se répartissent dans les organes chez la souris, selon la manière dont elles sont administrées, la dose utilisée ou leur composition. L’objectif est de trouver la meilleure combinaison pour que ces molécules restent actives pendant une semaine dans les poumons et le système digestif. Si cela fonctionne, cela permettra de réduire la fréquence des traitements : les patients pourraient recevoir ces médicaments une à deux fois par semaine, au lieu de tous les jours comme c’est le cas avec le traitement actuel.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés pour recevoir une dose unique ou des doses multiples (tous les 2 jours) administrées par voie intraveineuse, intrapéritonéale, sous-cutanée, intranasale ou intratrachéale. Puis, à la fin du protocole, les animaux seront mis à mort à J+1, J+2, J+3, J+4 ou J+7.

Impact sur les animaux

Les injections peuvent provoquer une douleur légère et passagère, un stress transitoire, une gêne locale ou respiratoire selon la voie d’administration, sans effet durable.

Devenir

Afin de caractériser l’effet de nos traitements, notamment leur devenir dans l’organisme, nous devons récupérer en fin d’expérience les organes des animaux traités et non traités. Cela nécessite l’euthanasie de l’ensemble des animaux du projet. L’étude du devenir des traitements dans les organes est indispensable pour évaluer leur accumulation et pour définir les doses et le nombre d’administrations. La collecte du sang total sera également effectuée afin d’obtenir plus d’informations sur le traitement utilisé (selon les 3R) et d’analyser en parallèle si le traitement active les cytokines (réponse inflammatoire).

Remplacement

Dans le cadre de ce projet, il n’existe actuellement aucune méthode alternative permettant de reproduire de façon fiable la complexité d’un organisme entier pour étudier la distribution d’un médicament dans les organes. Les modèles cellulaires, les organoïdes ou les simulations informatiques ne permettent ni d’évaluer la circulation systémique, ni de mesurer la répartition précise d’une molécule dans les tissus, ni d’anticiper son élimination. L’utilisation de l’animal est donc indispensable pour obtenir des données biologiquement pertinentes. Avant d’en arriver à cette étape, toutes les alternatives non animales ont été exploitées, notamment des études in vitro et des analyses prédictives, afin de réduire au maximum le recours aux animaux.

Réduction

Pour limiter le nombre d’animaux utilisés, chaque souris sera exploitée au maximum en réalisant plusieurs mesures sur les mêmes individus (analyses de sang, imagerie, prélèvements d’organes). Les groupes expérimentaux sont volontairement restreints au strict minimum permettant d’obtenir des résultats fiables grâce à un calcul préalable de puissance statistique. L’utilisation d’un seul groupe contrôle par procédure, rendu possible par la stabilité de la fluorescence basale quel que soit le mode d’administration ou le temps post‑traitement, évite la création de contrôles supplémentaires. Enfin, l’ensemble du protocole a été conçu pour réduire toute redondance expérimentale, en regroupant les analyses et en évitant tout doublon inutile.

Raffinement

Toutes les procédures sont conçues pour limiter au maximum le stress, la douleur et l’inconfort des animaux. Les souris sont hébergées dans un environnement contrôlé et enrichi (matériaux à ronger, abris, papier), favorisant l’expression de comportements naturels. Les manipulations sont réalisées par du personnel formé, en douceur et avec le moins de contention possible. Lors des procédures, une anesthésie adaptée est systématiquement utilisée, et un analgésique est administré si un signe de douleur apparaît. Les animaux sont surveillés quotidiennement à l’aide de grilles d’évaluation permettant de repérer rapidement tout signe de détresse. Si un seuil critique est atteint, des critères d’arrêt humanitaires sont appliqués pour éviter toute souffrance prolongée.

Choix des espèces

La souris a été choisie car il s’agit de l’espèce la plus couramment utilisée et la mieux adaptée pour étudier la répartition d’un médicament dans l’organisme. Son métabolisme, la structure de ses organes et sa réponse aux traitements sont bien connus, ce qui permet d’obtenir des résultats fiables et comparables à d’autres études précliniques. Les animaux utilisés seront des souris jeunes adultes (environ 8 semaines), un stade auquel leurs organes et systèmes physiologiques sont pleinement développés et fonctionnels. Ce choix garantit que la distribution du médicament reflète correctement celle observée dans un organisme mature, tout en évitant les variations importantes liées à la croissance ou au vieillissement. Les souris seront utilisées après une semaine d’acclimatation pour réduire le stress et assurer des conditions expérimentales stables.

Injectées d'un composé bactérien qui provoque une inflammation généralisée, puis soumises à des tests de mesure du seuil de douleur, 440 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. L'inflammation induit fièvre, perte de poids et sensibilité accrue à la douleur. Le projet étudie comment cette inflammation dégrade la morphine et des neurotransmetteurs dans le cerveau. Le liquide céphalorachidien et les tissus cérébraux sont prélevés sous anesthésie, suivis d'une injection qui tue l'animal.

Objectifs

Le sepsis, résultant d’une inflammation généralisée induite par un pathogène, est à l'origine de 20% des décès mondiaux (11 millions en 2020 selon l’Organisation Mondial de la Santé). Dans 70% des cas cette pathologie entraine de nombreux problèmes neurologiques potentiellement associé à une forte dégradation de certains neurotransmetteurs dans le cerveau. Lors d’un sepsis, l’organisme réagit en augmentant l’expression des enzymes de dégradation des neurotransmetteurs (qui subissent une dégradation similaire à la morphine). Notre but est d’étudier la dégradation des neurotransmetteurs et de la morphine (qui représente un traceur de la dégradation) dans un modèle d’inflammation généralisée chez la souris. Nous voulons également déterminer si l’inhibition d’une voie intracellulaire peut restaurer des niveaux normaux de neurotransmetteurs et ainsi faciliter la guérison. MODIFICATION- Nous avons montré qu’un inhibiteur d’une voie intracellulaire diminue de 90% la dégradation de la morphine dans un modèle de culture cellulaire. Cependant, le produit de dégradation de la morphine se retrouve piégée dans les cellules. Chez la souris, l’administration de cet inhibiteur améliore considérablement l’effet analgésique d’une faible dose de morphine dans un modèle d’inflammation généralisée induit par un composé pathogène bactérien. Un de nos buts est d’étudier la dégradation de la morphine et des neurotransmetteurs dans le liquide céphalorachidien dans notre modèle inflammatoire traité ou non avec l’inhibiteur de la dégradation.

Bénéfices attendus

Notre but est de définir si une inflammation généralisée induite par un composé pathogène bactérien provoque une dégradation accrue de la morphine et donc une diminution de ses effets antidouleurs. Par ailleurs, nous voulons identifier les neurotransmetteurs également dégradées et déterminer si l’inhibition d’une voie intracellulaire spécifique ou une délétion génétique peut être bénéfique lors d’une inflammation généralisée. Une telle démonstration permettrait d’envisager de nouveaux traitements contre les conséquences de la neuroinflammation induite par le sepsis. Ces travaux détermineront quels neurotransmetteurs sont plus dégradées et si l’utilisation d’un inhibiteur de la dégradation peut normaliser leurs taux et une favoriser une guérison. -MODIFICATION- Ce projet a aussi pour but de vérifier que le l’inhibiteur provoque une séquestration des molécules dégradées dans les cellules empêchant son élimination du cerveau. Les prélèvements de liquide céphalorachidien permettront d’étudier l’effet de l’inhibiteur sur la dégradation de morphine et de neurotransmetteur ainsi que leur élimination cérébrale.

Procédures

16 groupes de souris subiront des injections de substances sur animal vigile (30sec) et 8 groupes auront des tests de mesure du seuil de douleur (25sec) et 4 groupes d’animaux auront un test de comportement locomoteur (10min). Les 16 groupes auront une chirurgie terminale sur animal anesthésié (10min). Modification : un prélèvement sur animal anesthésié d'une durée de 10 minutes.

Impact sur les animaux

Notre modèle d’’injection de composé pathogène bactérien chez la souris induit une inflammation aiguë (protocole d'une durée de 48h). Elle peut être associée à une fièvre et une perte de poids transitoires chez les animaux. Par ailleurs, ce composé pathogène ne provoque pas de douleur mais induit une sensibilité accrue à la douleur. Il peut également induire une diminution de l'activité locomotrice et des diarrhées. - MODIFICATION - Les injections induiront un stress léger lié à la contention, ainsi qu'une douleur aigue liée à la piqure.

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour obtenir des fluides biologiques et des tissues cérébraux à analyser en spectrométrie de masse .

Remplacement

Nos études utilisant des cultures cellulaires ont montré qu’une stimulation avec un composé pathogène bactérien augmentait la dégradation de la morphine et qu’un inhibiteur spécifique abolissait cette augmentation. Cependant, les cultures cellulaires ne reflètent pas la complexité du cerveau qui comporte de nombreux types cellulaires qui interagissent. Il en est de même pour les cultures organotypiques. Chez la souris, l’injection d’un composé pathogène bactérien induit une neuroinflammation ponctuelle qui provoque une diminution de l’activité motrice, ainsi qu’une sensibilité plus forte au stimulation thermiques, deux paramètres qui ne peuvent pas se mesurer sur des cellules en culture ou des cultures organotypiques. Le but du projet est de montrer que, chez la souris, l’augmentation des enzymes de dégradation diminue les quantités de morphine et de certains neurotransmetteurs en conditions inflammatoires. Ainsi, nos études nécessitent des animaux car (1) les modèles cellulaires ou organotypiques ne permettent pas de caractériser l’action d’un composé sur douleur et/ou la locomotion. (2) les cultures cellulaires et organotypiques ne permettent pas de modéliser la dégradation de la morphine et des neurotransmetteurs dans le cerveau entier.

Réduction

440 animaux (160 souris mâles et 160 souris femelles C57BL/6J + 60 souris mâles et 60 souris femelles mutantes) sont nécessaires aux études statistiques. En effet, nos études antérieures ont montré que des effectifs de 10 animaux par groupe sont nécessaires pour observer l’effet d’un traitement analgésique. De plus, un effectif de 10 nous permet d’écarter un animal en cours de procédure (suite à des blessures consécutives à des bagarres ou d’un problème technique) sans impacter la robustesse de l’étude. Si ces éléments ne sont pas anticipés, une nouvelle étude avec tous les groupes contrôles devra être rajoutés ce qui va à l’encontre du principe de réduction du nombre d’animaux. Les expériences sont réalisées en plusieurs lots avec un maximum de 40 animaux répartis sur les différentes conditions. MODIFICATION- un groupe de 80 animaux a été rajouter pour réaliser les études sur le liquide céphalorachidien.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages enrichies avec des objets (tunnel transparent pour la manipulation, frisure et carrés de coton pour favoriser le comportement de nidation, bâtons de bois à ronger) pour réduire leur stress et stimuler leur interaction sociale. Avant chaque procédure expérimentale, une phase d'habituation à l'expérimentateur et au test (i.e., pièce et ambiance sonore du test, matériel utilisé lors du test) est réalisée durant 14 jours. Par ailleurs, des indicateurs du bien-être des animaux ont été établies pour chacune des procédures réalisées et des points limites ont ete etablis pour soustraire l'animal a la souffrance. MODIFICATION - Les prélèvements de liquide cephalorachidien seront effectuées sous anesthésie générale. Les souris recevront, en fin de prélèvement, une injection entrainant leur mort. Tout au long de l’étude, une formation continue en expérimentation animale ainsi que le suivi constant de la littérature permettent d'intégrer tout nouvel élément contribuant au bien-être animal.

Choix des espèces

Dans notre cas, l’utilisation du modèle de la souris permet une comparaison avec les autres études précédemment effectuées. En effet, 70% des études portant sur l’analgésie aux opiacés et les modèles inflammatoires induit par le LPS sont réalisées chez la souris. Par ailleurs, l’utilisation de la souris est cohérente avec nos derniers travaux sur l’effet de la morphine et de son métabolisme ainsi que sur les résultats préliminaires obtenus sur le modèle de douleur neuropathique. Nous nous sommes focalisé sur cette espèce car c’est le prérequis avant une application des hypothèses chez l’homme qui possède des voies métaboliques similaires. Le modèle de souris jeune adulte reste la référence dans les études précliniques. Ces études seront réalisées sur des souris mâles et femelles âgées de 10 semaines afin d’avoir des animaux qui sont physiologiquement matures. D’autre part, la mise en place du SNC et du système opioïde est uniquement mature chez l’adulte.