Rongeurs
Fonction des myofibroblastes dans la transformation des adénomes du colon
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Pour étudier le rôle d'un type de cellules dans le passage d'un adénome au cancer du côlon, 300 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles développent des polypes intestinaux dont la multiplication peut provoquer perte de poids et déshydratation, suivis par échographie sous sédation. Les intestins sont prélevés après la mise à mort. Le porteur annonce un bénéfice thérapeutique "à long terme" pour le traitement du cancer du côlon, sans échéance.
Objectifs
Nous souhaitons comprendre le rôle des différents types de cellules dans la progression du cancer du côlon. Nous savons qu'un facteur est détectable dans un type de cellule spécialisé dans les tumeurs bénignes du côlon, mais pas dans les tissus sains. La présente étude vise à étudier la fonction de ce facteur dans ces cellules lors de la transition entre tissu normal et cancer. À cette fin, nous utiliserons des souris qui développent des tumeurs du côlon et chez lesquelles nous pouvons éliminer ce facteur. Ces études nous permettront de caractériser les fonctions de notre facteur d'intérêt dans ce type de cellules spécialisées de l'intestin, de clarifier son rôle dans la croissance du cancer du côlon et d'identifier de nouveaux mécanismes dans la tumorigenèse du côlon.
Bénéfices attendus
Dans l'ensemble, ces expériences permettront de déterminer les mécanismes dépendants du gène d'intérêt dans la progression du cancer de l'intestin. À long terme, ces données permettront de développer de nouvelles approches pour le traitement du cancer du côlon.
Procédures
Injection intrapéritonéale =6 (quelques secondes), injection sous-cutanée = 20 (quelques secondes), Mesures par ultrasons (30 minutes, réalisées sous sédation)
Impact sur les animaux
Les nuisances seront les injections intrapéritonéales et sous-cutanées (quelques secondes, douleur légère), les mesures échographiques (30 minutes), réalisées sous sédation (nuisances mineures) et, potentiellement, le développement tumoral. En effet, la prolifération des polypes (augmentation de leur nombre et de leur taille) peut entraîner l'apparition de symptômes cliniques (perte de poids et déshydratation) chez les animaux. Pour éviter cela, nous surveillons de près leur état clinique, leur administrons un régime alimentaire adapté et procédons à leur euthanasie avant que les symptômes cliniques ne s'aggravent.
Devenir
À la fin de l'examen final, les souris sont mises à mort, leurs intestins sont prélevés puis conservés en vue d'analyses (immuno)histochimiques et moléculaires ultérieures.
Remplacement
L'homéostasie et le remodelage au cours du développement du cancer sont des processus complexes. Bien qu'il existe des modèles de culture cellulaire in vitro, l'interaction entre différentes populations cellulaires ne peut être reproduite par une approche in vitro. Notre stratégie est bien conçue pour prendre en compte les objectifs de remplacement, car nous avons déjà validé toutes les analyses moléculaires dans des cultures cellulaires ou des systèmes purement biochimiques.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, le nombre d'animaux pour chaque expérience sera limité à celui nécessaire pour valider un effet significatif. Afin de minimiser le nombre de souris utilisées, et dans la mesure du possible, les échantillons prélevés sur les mêmes souris seront utilisés dans différents types d'analyses.
Raffinement
L'anesthésie et l'analgésie seront utilisées comme méthodes principales afin de minimiser autant que possible la souffrance potentielle des animaux. Les animaux seront élevés sans isolement, en groupes du même sexe, dans des conditions d'hébergement conformes aux exigences réglementaires (densité) et bénéficiant d'un enrichissement environnemental (abri, matériel de nidification) tout au long de la procédure. Un score clinique sera évalué chaque semaine et chaque jour dès que les premiers adénomes seront visibles à l'échographie. Une liste de points limites est établie. Lorsque ceux-ci sont atteints, les animaux seront mis à mort afin d'éviter toute souffrance.
Choix des espèces
L'homéostasie et le remodelage au cours de la tumorigenèse intestinale sont des processus complexes. Bien qu'il existe des modèles in vitro, l'interaction entre différentes populations cellulaires ne peut être reproduite par une approche in vitro. Après avoir déclenché la formation d'une tumeur du côlon, il est important de surveiller la transformation maligne d'un adénome dans son environnement. L'utilisation d'un modèle animal tel que la souris est donc essentielle en raison de ses similitudes génétiques et physiologiques avec l'être humain. Le choix d'animaux adultes se justifie par le fait que les adénomes et les cancers du côlon touchent principalement les adultes.
Développement d’un modèle murin de choc septique par ligature et perforation caecale (CLP) pour évaluer de nouvelles thérapies dans l’ACLF.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Tous tués à l'issue pour prélever sang et organes, 1 720 souris, dont 1 420 dans des procédures au niveau de souffrance le plus élevé, sont utilisées pour reproduire un choc septique. La maladie est provoquée par une opération qui ligature et perfore le cæcum, puis évolue vers une chute de température, une détresse respiratoire et, dans les cas les plus graves, une défaillance de plusieurs organes et la mort. Le résumé reconnaît que les souris "peuvent ressentir une souffrance parfois importante". Le porteur situe l'intérêt du projet dans la recherche de traitements contre une maladie responsable de nombreux décès humains.
Objectifs
Ce projet a pour but de mieux comprendre une maladie grave appelée choc septique, qui survient lors d’une infection et provoque un dérèglement important du corps. Pour cela, nous utilisons des souris et provoquons la maladie grâce à une petite opération réalisée sous anesthésie. Cela permet de reproduire la maladie et d’observer comment elle évolue. Les souris développent alors des signes similaires à ceux observés chez les patients, comme une baisse de la température du corps et une respiration plus rapide. À terme, ce travail permettra de tester de nouveaux traitements pour améliorer la prise en charge des personnes atteintes de cette maladie.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre comment cette maladie grave perturbe le fonctionnement du corps, et à trouver de nouvelles façons de la soigner. Nous étudions en particulier certaines substances qui peuvent agir à l’intérieur des cellules et aider l’organisme à mieux contrôler sa réaction face à l’infection. Ces substances pourraient notamment limiter l’emballement des défenses du corps et protéger des organes importants comme le cœur. Les résultats de cette étude pourraient ainsi permettre de découvrir de nouvelles pistes de traitement pour une maladie encore difficile à soigner et responsable de nombreux décès.
Procédures
Les animaux seront soumis à une chirurgie (afin de ligaturer et perforer le caecum) qui dure environ 20 minutes. Par la suite, ils seront soumis à des prélèvements sanguins terminaux, sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Cette méthode permet de reproduire chez la souris une maladie grave semblable à celle observée chez l’être humain. Les animaux peuvent alors montrer des signes de mal-être, comme une baisse de la température du corps, une respiration plus rapide, une perte de poids, moins d’activité et une grande fatigue. Cela signifie que les souris peuvent ressentir une souffrance parfois importante. La procédure comprend une petite opération réalisée sous anesthésie, mais elle peut entraîner des douleurs après l’intervention ainsi qu’un risque d’infection. Dans les cas les plus graves, la maladie peut s’aggraver, toucher plusieurs organes et entraîner la mort de l’animal.
Devenir
À la fin de l’étude, les animaux sont endormis de façon à ne pas ressentir de douleur, puis euthanasiés afin de pouvoir prélever du sang et différents organes. Ces prélèvements sont nécessaires pour réaliser les analyses qui permettent de mieux comprendre la maladie et d’évaluer l’efficacité des traitements testés. Ces examens ne peuvent pas être réalisés sur des animaux vivants, ce qui rend cette étape indispensable. Tout est mis en œuvre pour que cette fin se fasse dans les conditions les plus respectueuses et les moins douloureuses possible.
Remplacement
Le choc septique et certaines maladies graves du foie sont des maladies très complexes qui touchent plusieurs organes en même temps et provoquent des réactions importantes dans le corps. Aujourd’hui, il n’est pas possible de reproduire entièrement cette complexité en laboratoire avec des cellules ou des outils informatiques. Avant d’utiliser des animaux, les chercheurs testent d’abord les substances sur des méthodes sans animaux ou sur des cellules, afin de sélectionner les plus prometteuses et de limiter le nombre d’animaux utilisés. Malgré cela, l’utilisation d’animaux reste nécessaire pour ce type d’étude, car elle est la seule façon d’observer comment l’ensemble du corps réagit face à ces maladies.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est soigneusement calculé pour obtenir des résultats fiables tout en en utilisant le moins possible. Une première étape, réalisée avec peu de souris, permet de mettre au point la méthode avant de réaliser l’étude complète. Ensuite, seules les conditions vraiment utiles sont conservées, afin d’éviter de répéter inutilement les expériences. L’objectif est de recueillir un maximum d’informations avec chaque animal, tout en limitant leur nombre au strict nécessaire.
Raffinement
Toutes les manipulations sont réalisées dans des conditions propres pour éviter les infections. Les animaux sont endormis et reçoivent des traitements contre la douleur afin qu’ils ne souffrent pas pendant et après les interventions. Après l’opération, ils sont surveillés attentivement et vivent dans un environnement adapté avec des éléments pour se reposer et s’occuper, ce qui permet de réduire leur stress. Leur état de santé est vérifié chaque jour. Si un animal montre des signes de souffrance trop importants, l’expérience est arrêtée et une euthanasie est réalisée rapidement pour éviter toute douleur. Le personnel est spécialement formé, et tout est organisé pour limiter au maximum la douleur, le stress et l’inconfort des animaux.
Choix des espèces
La souris est utilisée dans ce projet car elle fonctionne de manière assez proche de l’être humain et est largement étudiée en recherche. La méthode employée pour reproduire la maladie est bien connue chez cette espèce, ce qui permet d’obtenir des résultats fiables. De plus, les substances testées ont déjà été étudiées chez la souris, ce qui renforce l’intérêt de ce choix. Dans certains cas, le rat pourra aussi être utilisé, notamment lorsque des prélèvements plus importants ou des mesures plus précises sont nécessaires. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes, un âge qui permet d’obtenir des résultats plus réguliers et comparables. Cela aide à limiter les variations entre les animaux et à réduire leur nombre tout en garantissant la qualité de l’étude.
Etude morpho-fonctionnelle des réseaux neuronaux chez l’animal vigil, non anesthésié, à l’aide d’approches d’imagerie in vivo
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Les souris nouveau-nées reçoivent une injection virale dans le cerveau, puis une fenêtre optique implantée dans le crâne pour observer leurs neurones pendant des semaines. 1 750 souris sont utilisées, dont 1 400 dans des procédures classées au niveau de souffrance le plus élevé, toutes tuées à l'issue. Le résumé présente ces observations comme réalisées chez l'animal éveillé, dans des conditions "proches du comportement naturel", quand sa propre grille prévoit de coter des vocalisations persistantes et des comportements d'automutilation. Le cerveau est prélevé après la mise à mort.
Objectifs
Cette plateforme permet d’étudier les circuits neuronaux chez la souris, de la naissance à l’âge adulte, grâce à des techniques d’imagerie réalisées chez des animaux éveillés et dans des conditions proches du comportement naturel. Selon les expériences, différentes méthodes sont employées afin d’observer le cerveau en profondeur ou chez des animaux libres de leurs mouvements. Les animaux subissent d’abord une intervention permettant d’installer un petit dispositif donnant accès au cerveau. Après une période de récupération, ils sont progressivement habitués aux conditions expérimentales. Les observations sont ensuite réalisées chez des animaux éveillés. Trois types de protocoles sont utilisés :1) observation de l’activité du cerveau chez les très jeunes animaux, 2) suivi de cette activité au cours du développement jusqu’à l’âge adulte, et 3) analyse du cerveau après la fin de l’expérimentation.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à développer et valider des méthodes fiables pour observer le fonctionnement du cerveau chez la souris éveillée, dans différentes conditions expérimentales, avec ou sans immobilisation de la tête. Sur le plan scientifique, ces méthodes permettront de mieux comprendre comment les neurones fonctionnent ensemble, dès les premières étapes du développement, et dans des situations plus proches du comportement naturel, notamment lorsque l’animal peut se déplacer librement. Sur le plan technique, ce projet permettra d’améliorer et de structurer les outils disponibles sur la plateforme, afin de les rendre plus accessibles et plus simples à utiliser pour les chercheurs, tout en respectant les exigences éthiques liées à l’expérimentation animale. Enfin, ce travail contribuera à garantir la qualité et la fiabilité des résultats scientifiques, ainsi qu’à former les utilisateurs aux bonnes pratiques expérimentales.
Procédures
Les animaux seront soumis à plusieurs étapes : identification et prélèvement pour génotypage, injection virale à la naissance, chirurgie pour l’implantation d’une fenêtre optique, sessions répétées d’imagerie chez l’animal éveillé, puis mise à mort suivie d’analyses du cerveau. À la naissance, les animaux sont brièvement manipulés pour identification, prélèvement et injection sous anesthésie adaptée, avant d’être replacés avec leur mère. Une chirurgie est ensuite réalisée sous anesthésie générale, avec prise en charge de la douleur, afin d’installer un dispositif permettant l’observation du cerveau. Après quelques jours de récupération, les animaux sont progressivement habitués au dispositif. Les séances d’imagerie sont réalisées chez l’animal éveillé, soit en position fixe, soit en déplacement libre, pour des durées limitées avec des périodes de repos. Une stimulation lumineuse peut être appliquée dans certains cas. En fin d’expérimentation, les animaux sont mis à mort sous anesthésie profonde, puis leur cerveau est prélevé pour analyses.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus chez les animaux sont principalement liés aux procédures chirurgicales, notamment les injections intracérébrales et l’implantation d’une fenêtre optique crânienne pour l’imagerie in vivo. Ces interventions peuvent entraîner une douleur ou un inconfort transitoire associé à l’incision cutanée, à la manipulation des tissus périphériques (crâne, dure-mère) et à la réaction inflammatoire locale. Après une injection intracérébrale, une gêne ou une sensibilité au niveau du site opératoire peut survenir durant les premières heures à 1–2 jours. Cette procédure est réalisée une seule fois par animal. L’implantation chronique d’une fenêtre optique constitue une intervention plus invasive, susceptible de provoquer une douleur post-opératoire modérée et une inflammation locale pouvant persister plusieurs jours (en général 2 à 5 jours). Cette chirurgie est également réalisée une seule fois par animal, mais l’implant reste en place sur le long terme. Dans certains cas, des effets indésirables peuvent inclure une perte de poids transitoire, une diminution temporaire de l’activité ou des signes de stress liés à la récupération post-chirurgicale ou au port du dispositif d’imagerie. De manière plus rare, des complications peuvent survenir, telles qu’une infection locale, un déplacement de l’implant ou une détérioration de l’état général.
Devenir
À l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés. La mise à mort est justifiée par le caractère invasif des procédures expérimentales et par la nécessité de réaliser des analyses post-mortem des tissus cérébraux afin de compléter les données obtenues in vivo. De plus, les dispositifs implantés et les interventions chirurgicales ne permettent pas une réutilisation des animaux dans d’autres procédures expérimentales sans risque de compromettre leur bien-être ou la validité scientifique des résultats.
Remplacement
Répondre à notre objectif nécessite de pouvoir étudier le cerveau vivant, éveillé et en comportement. En ce sens, seules des approches menées sur un modèle animal peuvent améliorer les connaissances fondamentales sur le cerveau, ciblées par notre projet et dont pourront bénéficier à terme les études menées chez l’homme. En effet, les méthodes alternatives comme les organoïdes cérébrales ne permettent pas d’étudier des réseaux neuronaux fonctionnellement connectés et matures, et nous ne possédons pas encore les connaissances suffisantes pour établir des modèles in silico de ces réseaux corticaux complexes. C’est d’ailleurs un des aspects clés de notre projet : nous visons à établir une description fonctionnelle précise de ces réseaux de neurones, en se concentrant sur les différents types cellulaires, avec l’espoir que dans le futur cela rende possible des modèles in silico de ce type.
Réduction
Nous nous engageons à limiter le nombre d’animaux utilisés en maximisant la quantité et la qualité des données obtenues par individu. L’utilisation de protocoles d’imagerie longitudinaux sur les mêmes animaux, la standardisation des procédures chirurgicales et le recours à des outils analytiques puissants (imagerie multiphotonique, systèmes miniaturisés) permettent de réduire le nombre d’animaux nécessaires tout en garantissant la robustesse statistique des résultats. Lorsque cela est compatible avec les objectifs scientifiques des projets, des animaux des deux sexes (mâles et femelles) seront inclus afin d’éviter toute discrimination de sexe et de permettre une meilleure représentativité des résultats. Enfin, la mutualisation des données entre projets, lorsque possible, et la formation des utilisateurs aux bonnes pratiques visent également à limiter les pertes expérimentales et les répétitions inutiles.
Raffinement
Le bien-être des animaux, qu’il s’agisse des souris gestantes ou de leur progéniture, sera rigoureusement suivi tout au long du protocole (croissance, état général, comportement). Une surveillance quotidienne sera assurée afin d’évaluer l’activité, l’aspect du pelage, l’alimentation ainsi que tout signe de douleur ou de stress. Des grilles de scores de souffrance seront utilisées pour permettre une prise en charge rapide et adaptée (cf annexe 1). Tout score de 3 attribué à l’un des paramètres (vocalisations persistantes, posture anormale, automutilation, perte de poids importante, absence de prise alimentaire, etc.) sera considéré comme un signe de souffrance sévère et entraînera systématiquement une action corrective immédiate. Ainsi, un animal présentant des vocalisations ou des comportements d’auto-mutilation ne sera en aucun cas considéré comme “normal”, mais fera l’objet d’une prise en charge renforcée et, si nécessaire, d’une consultation vétérinaire. Une attention particulière sera portée aux nouveau-nés et juvéniles lors des chirurgies afin de minimiser douleur et stress : anesthésie générale et locale adaptée, administration systématique d’analgésiques en péri- et post-opératoire, maintien thermique (tapis chauffant), conditions strictes d’asepsie, protection oculaire, réhydratation, et suivi post-opératoire renforcé, notamment lors de la réintégration des petits à la portée. En cas de dépassement des seuils définis, une analgésie supplémentaire sera administrée, par exemple buprénorphine (0,1 mg/kg, SC, toutes les 8–12 h si nécessaire), avec une réévaluation quotidienne. Si malgré ces mesures l’état de l’animal ne s’améliore pas rapidement, ou si plusieurs paramètres atteignent un score critique, des critères d’arrêt anticipé seront appliqués et l’animal sera euthanasié afin d’éviter toute souffrance prolongée. Les mères et leurs petits, opérés ou non, seront hébergés dans des armoires ventilées en environnement contrôlé, avec un enrichissement adapté (igloos, rouleaux de papier, matériaux de nidification) favorisant le comportement naturel. Les animaux plus âgés bénéficieront des mêmes conditions d’hébergement, avec un suivi quotidien.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est un modèle de référence en neurosciences, en raison de la complexité de son organisation cérébrale, de la disponibilité de nombreux outils génétiques, et de l’existence de nombreuses lignées transgéniques permettant un ciblage cellulaire précis via le système Cre-loxP. Ce modèle est particulièrement adapté aux approches d’imagerie fonctionnelle in vivo développées sur la plateforme. Les animaux seront utilisés à différents stades de développement, du stade néonatal (P0) à l’âge adulte, afin d’étudier à la fois la mise en place progressive des circuits neuronaux au cours du développement et le fonctionnement de réseaux matures. Cette diversité de stades est essentielle pour comprendre l’évolution des dynamiques neuronales au cours de la vie et répondre aux objectifs des projets menés sur la plateforme, notamment dans le contexte du développement normal ou de troubles neurodéveloppementaux.
Évaluation de l’effet d’un traitement pharmacologique sur l’activité de cellules du système immunitaire dans des modèles murins
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Gavées par une sonde pendant une dizaine de jours, puis soumises à des injections dans l'abdomen et dans la veine, 66 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Certaines, génétiquement modifiées, sont plus sensibles aux infections. Le projet teste une stratégie pour freiner l'activité de cellules immunitaires impliquées dans le rejet chronique de greffe. Les organes sont prélevés après la mise à mort, que le porteur situe comme une étape avant des modèles de transplantation plus complexes.
Objectifs
Après une transplantation d’organe, le système immunitaire du receveur peut reconnaître le greffon comme étranger et l’attaquer. Ce phénomène peut entraîner une dégradation progressive du greffon pouvant conduire à sa perte. Certaines cellules du système immunitaire participent à ce processus en détruisant des cellules du greffon dans certaines situations. Les traitements actuellement disponibles pour limiter ces mécanismes de rejet présentent des limites et peuvent entraîner des effets indésirables importants. De plus, certains mécanismes impliqués dans ce type de rejet ne disposent pas aujourd’hui de stratégie thérapeutique spécifique. Mieux comprendre comment moduler l’activité de ces cellules pourrait contribuer au développement de nouvelles approches visant à limiter le rejet de greffe. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet d’une stratégie expérimentale visant à réduire l’activation de certaines cellules du système immunitaire. L’étude permettra notamment de comparer deux modalités d’administration d’un composé afin d’identifier les conditions permettant d’obtenir l’effet biologique recherché. L’efficacité de cette approche sera évaluée dans un modèle murin permettant d’étudier la capacité de ces cellules à détruire des cellules cibles.
Bénéfices attendus
Le rejet chronique est une cause fréquente de perte de greffon après une transplantation d’organe. Malgré les traitements disponibles, certains mécanismes du système immunitaire impliqués dans ce rejet restent difficiles à contrôler. Ce projet vise à évaluer une stratégie expérimentale permettant de moduler l’activité de certaines cellules du système immunitaire impliquées dans ces phénomènes. L’étude permettra de déterminer si cette approche peut limiter la destruction de cellules cibles dans un modèle murin. Les résultats obtenus permettront de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le rejet de greffe et d’évaluer la pertinence de cette stratégie dans un contexte expérimental. Ces travaux constituent une étape préalable à l’évaluation de cette approche dans des modèles plus complexes de transplantation et pourraient, à plus long terme, contribuer au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à améliorer la survie des greffons chez les patients transplantés.
Procédures
Les animaux recevront un traitement administré par voie orale à l’aide d’une sonde de gavage. Cette administration sera réalisée soit quotidiennement, soit tous les deux jours selon les groupes expérimentaux, pendant une durée maximale d’environ dix jours. Une injection dans la cavité abdominale pourra être réalisée dans certains groupes afin de moduler l’activité de certaines cellules du système immunitaire. Une injection intraveineuse de cellules sera réalisée sous anesthésie gazeuse brève afin d’évaluer l’activité de certaines cellules du système immunitaire. Un prélèvement sanguin unique pourra être effectué sous anesthésie gazeuse au cours de l’étude. Chaque animal recevra au maximum une injection intraveineuse, une injection dans la cavité abdominale et un prélèvement sanguin au cours de l’expérimentation. À la fin de l’étude, tous les animaux recevront une injection dans la cavité abdominale d’un anesthésique général avant d’être mis à mort, afin de garantir l’absence de douleur lors des prélèvements finaux. La durée totale de participation d’un animal à l’étude est d’environ 10 à 11 jours.
Impact sur les animaux
L’administration du traitement par voie orale peut entraîner un stress lié à la manipulation ainsi qu’une gêne temporaire. Dans de rares cas, une mauvaise administration peut provoquer une irritation ou une difficulté à avaler. Les différentes injections réalisées au cours de l’étude, ainsi que le prélèvement sanguin, peuvent entraîner une gêne légère et transitoire au niveau du site d’injection, avec un risque faible de saignement ou d’irritation. Ces gestes sont réalisés sous anesthésie afin de limiter la douleur. Le traitement administré n’a pas montré de toxicité importante dans les études précédentes chez la souris. Toutefois, des effets modérés ne peuvent être exclus, tels qu’une baisse temporaire d’activité, une perte de poids ou des modifications du comportement. De manière générale, les effets indésirables attendus sont de faible intensité et de courte durée. Ils correspondent principalement à une gêne liée aux manipulations ou aux injections, pouvant durer de quelques minutes à quelques heures, et plus rarement jusqu’à 24 heures. Certaines souris utilisées dans ce projet présentent une sensibilité accrue aux infections. Elles feront donc l’objet d’une surveillance renforcée afin de détecter rapidement tout signe d’altération de leur état général.
Devenir
À l’issue des procédures expérimentales, les animaux seront mis à mort afin de permettre le prélèvement d’organes nécessaires aux analyses prévues dans le projet.
Remplacement
Des approches alternatives sans recours à l’animal ont été utilisées en amont du projet, notamment des modèles in vitro et à partir de cellules humaines, permettant d’évaluer l’effet d’un traitement sur l’activation de certaines cellules du système immunitaire. Cependant, ces modèles ne permettent pas de reproduire la complexité d’un organisme entier, en particulier les interactions entre les différentes cellules ni les effets liés à l’administration du traitement dans l’ensemble du corps. L’utilisation d’un modèle animal est donc nécessaire afin d’évaluer l’efficacité et la tolérance du traitement dans un contexte physiologique complet.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé à partir d’un calcul statistique préalable afin d’obtenir des résultats fiables tout en limitant le nombre d’animaux utilisés. Le nombre minimal a été fixé à 6 animaux par groupe. Plusieurs mesures sont mises en œuvre afin de réduire le nombre d’animaux : limitation du nombre de groupes au strict nécessaire, mise en place d’une stratégie progressive, avec une seconde procédure réalisée uniquement si la première ne permet pas d’obtenir un effet suffisant, répartition aléatoire des animaux entre les groupes, limitation des répétitions expérimentales au strict nécessaire.
Raffinement
Les animaux seront acclimatés pendant une durée minimale de 7 jours après leur arrivée afin de limiter le stress lié au transport et à leur nouvel environnement. Après chaque administration ou manipulation, une surveillance rapprochée sera réalisée afin de détecter rapidement tout signe de complication ou de détresse. En cas d’altération de l’état général (perte de poids, diminution de l’activité, difficulté d’accès à la nourriture), des mesures de soutien adaptées seront mises en place, telles que la mise à disposition de nourriture au sol, d’eau gélifiée ou d’aliments enrichis faciles d’accès. Certaines souris utilisées dans ce projet présentent une altération du système immunitaire pouvant les rendre plus sensibles aux infections. Elles sont hébergées dans des conditions sanitaires adaptées et feront l’objet d’une surveillance régulière de leur état général. Si un animal présente des signes de douleur, d’inconfort ou d’altération de son état de santé, une surveillance renforcée sera mise en place et, si nécessaire, il sera retiré de l’expérimentation. Des points limites seront définis afin d’éviter toute souffrance inutile. En cas de perte de poids importante, de détresse marquée ou d’altération persistante de l’état général, les animaux seront mis à mort de manière anticipée. Ces mesures permettent d’adapter la prise en charge des animaux en fonction de leur état afin de limiter au maximum la douleur, le stress et les nuisances tout au long de l’étude.
Choix des espèces
La souris est un modèle de référence largement utilisé pour l’étude du système immunitaire et des mécanismes impliqués dans le rejet de greffe. Les processus étudiés chez cette espèce présentent des similarités avec ceux observés chez l’humain. Ce modèle permet de mettre en œuvre des approches expérimentales reproductibles et d’utiliser des souches spécifiques adaptées aux objectifs du projet, notamment pour étudier l’activité de certaines cellules du système immunitaire dans un organisme entier. L’utilisation de la souris permet ainsi de répondre aux objectifs scientifiques du projet dans des conditions maîtrisées, avec un nombre limité d’animaux et un niveau de contrainte modéré. Des animaux adultes âgés de plus de 12 semaines seront utilisés. À ce stade, le système immunitaire est pleinement développé, ce qui est nécessaire pour étudier les mécanismes impliqués dans la destruction de cellules cibles. L’utilisation d’animaux adultes permet également de limiter la variabilité observée chez des animaux plus jeunes et d’améliorer la reproductibilité des résultats. Ce stade de développement est donc le plus adapté pour atteindre les objectifs du projet tout en limitant le nombre d’animaux utilisés.
Développement d’un vaccin contre Clostridioides difficile : étude de sa répartition et devenir dans l’organisme
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Jusqu'à sept administrations de produit et six anesthésies gazeuses pour l'imagerie par animal : 184 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue. Le projet suit la répartition dans l'organisme d'un vaccin expérimental contre Clostridioides difficile, une bactérie responsable de diarrhées graves, pour savoir où il se loge et combien de temps. Les administrations passent par plusieurs voies et chaque séance d'imagerie se fait sous anesthésie. Le porteur décrit le recours à l'animal comme "incontournable", faute de modèle reproduisant la réponse immunitaire complète.
Objectifs
La bactérie pathogène Clostridioides difficile est une cause fréquente de diarrhées graves, en particulier chez les personnes agées et les personnes hospitalisées. Ces infections peuvent récidiver après traitement et représenter un problème important pour la santé publique. Trouver de nouvelles façons de prévenir ces infections est donc essentiel. Parmi les stratégies de prévention les plus pertinentes se situe la vaccination. Ce projet a pour objectif d’étudier un nouveau type de vaccin qui utilise un véhicule pour délivrer le vaccin dans les cellules cibles. Nous cherchons à comprendre comment ce vaccin se répartit dans l’organisme et combien de temps il reste présent après son administration afin d’évaluer son efficacité et sa sécurité. Pour cela, des expériences sont réalisées chez la souris en utilisant une technique d’imagerie qui permet de suivre le vaccin sans avoir à intervenir de manière répétée sur les animaux. Les informations obtenues permettront d’améliorer la conception de futurs vaccins et de vérifier que cette approche est adaptée et sûre avant de poursuivre son développement. Ce travail pourrait, à terme, contribuer à réduire le nombre d’infections et leurs récidives chez les patients.
Bénéfices attendus
Le développement de nouvelles stratégies de prévention des infections à Clostridioides difficile représente un enjeu majeur de santé publique, compte tenu de leur fréquence, du risque de récidive et de leur impact en milieu hospitalier et communautaire. Une approche vaccinale efficace contribuerait à réduire l’incidence de ces infections, à limiter leur dissémination et à diminuer la charge sanitaire associée. De manière plus générale, cette étude contribuera à la validation préclinique de cette nouvelle technologie vaccinale, avec des perspectives d’application en santé humaine et animale. Les résultats obtenus seront directement exploitables dans le cadre du projet parallèle de développement d’un vaccin ciblant Clostridioides difficile.
Procédures
Les souris vigiles seront soumises à plusieurs administrations de produits par différentes voies. Un premier groupe de 40 souris recevra 7 administrations (4 administrations le jour 1 puis 1 administration par jour pendant 4 jours). Un deuxième groupe de 144 souris recevra 4 administrations (2 administrations le jour 1 et 1 administration par jour sur les 2 jours suivants). Chaque administration dure une dizaine de secondes. Les souris subiront 3 (144 souris) à 6 (40 souris) anesthésies gazeuses pour les mesures d’imagerie qui dureront entre 12 à 30 minutes et qui seront réparties sur 3 à 5 jours.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables attendus au cours de cette étude sont principalement liés aux manipulations de l’animal et aux différentes administrations réalisées chez l’animal soit par injections soit par voie orale. Ces administrations peuvent engendrer une douleur et une angoisse légère et transitoire. D’autre part, les souris seront anesthésiées par voie gazeuse ce qui peut entraîner ponctuellement un stress bref chez l’animal.
Devenir
En raison des administrations expérimentales réalisées et afin de permettre les analyses prévues en fin d’étude, l’ensemble des animaux sera euthanasié à l’issue du protocole.
Remplacement
La vaccination met en jeu une réponse immunitaire complexe qu’il est difficile de modéliser in vitro ou à l’aide de modèle informatique car elle fait intervenir différents acteurs cellulaires. Des tests préliminaires in vivo, réalisés avec ce nouveau vaccin ont montré une forte réaction immunitaire. Nous souhaitons désormais analyser plus finement sa répartition et son devenir dans l’organisme (dans quels tissus ou organes se répartit le vaccin et sur quelle durée). Le recours à l’animal est incontournable car il n’existe, à ce jour, aucun modèle autre qu’animal reproduisant la complexité des interactions ayant lieu au sein des systèmes vivants.
Réduction
Une étude pilote nous permettra de définir les conditions expérimentales optimales d’imagerie dans le cadre de notre modèle. Nous privilégierons une étude longitudinale qui contribuera à réduire le nombre d’animaux utilisés, raffiner la procédure expérimentale et optimiser la quantité de données obtenues sur chaque animal. Puis dans un deuxième temps, nous allons étudier la répartition du vaccin dans différents organes dont le tube digestif. Le dimensionnement des groupes expérimentaux a été déterminé par une approche statistique qui permet de définir le juste nombre d’animaux à inclure dans l'étude afin de pouvoir exploiter les résultats de façon fiable. Les résultats seront analysés par une méthode statistique adaptée au traitement des petits échantillons
Raffinement
Les animaux sont acclimatés pendant une période d’au moins 7 jours dans des cages présentant de l’enrichissement. Une surveillance quotidienne de leur état général est réalisée, de leur réception à la fin de la procédure. Les animaux seront manipulés de façon à leur causer le moins de stress possible et l’imagerie se fera sous anesthésie générale gazeuse, permettant à la fois une perte de conscience contrôlée et réversible avec un réveil rapide. Des points limites sont définis et seront strictement appliqués en cas de souffrance avérée déterminée à partir de signes cliniques précis.
Choix des espèces
Les études de distribution nécessitent d’être effectuées dans un organisme vivant. Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car c’est une espèce animale très bien documentée dans la littérature et l’utilisation de lignées consanguines permet de réduire la variabilité inter individuelle. Le choix de la souris est aussi dicté, dans notre cas, par des résultats déjà existants in vivo dans cette espèce (essais préliminaires de vaccination). Les souris seront manipulées à l'âge adulte de de 6 ou 7 semaines (maturité sexuelle et du système immunitaire). Ce choix est motivé par la nécessité d'utiliser des animaux ayant atteints l'âge adulte, qui correspond à la classe d’âge de la population ciblée par la vaccination contre Clostridioides difficile.
Méthodes de prélèvements pour génotypage de rongeurs en condition d’élevage (MODIFICATION)
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
Rats : 3000
Produits par une unité qui fournit des modèles animaux à la demande des laboratoires, 143 000 souris et rats sont utilisés sur cinq ans, chacun soumis une fois à une biopsie de la queue pour génotypage, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les animaux qui portent le génotype recherché sont restitués aux équipes pour leurs expériences, les autres réutilisés ailleurs ou mis à mort. Le résumé décrit un élevage calibré pour produire un maximum d'animaux "utiles" et limiter les surnuméraires. Le nombre de 143 000 découle du volume de croisements lancés, sans calcul statistique à ce stade, que le porteur renvoie aux projets ultérieurs.
Objectifs
L'unité de service met, à disposition de la communauté scientifique, un ensemble de prestations liées à l’utilisation de modèles animaux à des fins scientifiques. Des modèles rongeurs sont générés, hébergés, développés et maintenus dans les locaux, pour les besoins de la communauté scientifique qui, pour réaliser sa recherche fondamentale et biomédicale, doit disposer de modèles précliniques permettant de comprendre diverses fonctions biologiques dans les pathologies humaines (maladies immunitaires, métaboliques, infectieuses inflammatoires, cancéreuses, etc). Tous les animaux en zone d’élevage, sont uniquement présents pour établir des animaux d'intérêts qui seront ensuite restitués aux unités utilisatrices pour entrer en phase expérimentale dans une animalerie d’expérimentation, dans un projet de recherche déposé par leur soin. L'utilisation de rongeurs génétiquement modifiés nécessite d'avoir recours à un génotypage et donc de réaliser une biopsie caudale. Le projet néccessite une modification car des rats doivent maintenant être génotypés.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet sont : 1) réaliser une identification permanente de qualité sur les rongeurs afin de les distinguer en fonction de leur génotype 2) réaliser une biopsie de qualité permettant un génotypage sans contamination croisée entre deux individus 3) identifier et récupérer une biopsie sur les rongeurs de manière à optimiser au maximum le bien-être animal 4) permettre aux utilisateurs des équipes de recherche de faire un suivi individuel des animaux en fonction de leur génotype. L’élevage de ces animaux est nécessaire dans le cadre de nombreux projets scientifiques préalablement validés qui permettront de répondre à des questions scientifiques précises et aux enjeux de santé/société (domaines de recherche : pathologies respiratoires, musculaires, du système nerveux, métaboliques, cardiovasculaires ou génétiques).
Procédures
Chaque animal sera soumis une seule fois dans sa vie à un prélèvement caudale pour génotypage. Ces actes ne durent que quelques secondes. Dans de rare cas, un reprélèvement à l'oreille pourra être réalisé et ne durera que quelques secondes. Dans de rares cas, un prélèvement sanguin d'un faible volume sera réalisé (1 seul fois dans la vie de l'animal, acte de quelques secondes). Ces actes sont réalisés sur animal vigil.
Impact sur les animaux
Lors de la contention, les animaux peuvent ressentir un stress de courte durée lors de leur manipulation ainsi que pour les parents. De la douleur légère de courte durée peut être ressentie lors des prélèvements pour génotypage (biopsie caudale et pavillon de l'oreille) et au point de prélèvement pour les prélèvements sanguin.
Devenir
Les animaux avec un génotype d'intérêt seront utilisés dans un projet de recherche autorisé par le ministère. Les autres animaux du mauvais génotype qui n'auront pas pu être utilisés dans d'autres projets seront euthanasiés par une méthode réglementaire adaptée à l'âge des animaux ainsi que les anciens reproducteurs. Les animaux passant dans les projets de recherche autorisés seront alors en utilisation continue. Les accouplements sont réalisés pour produire au maximum des animaux d'intérêt.
Remplacement
Actuellement il n'est pas possible de recréer in vitro la complexité d'un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu. Un organisme vivant est donc nécessaire pour mener à bien les divers projets scientifiques autorisés au sein de l'établissement. Le rongeur est le modèle le plus utilisé par les chercheurs pour étudier les fonctions biologiques et les pathologies.
Réduction
L'établissement d'élevage lance environ 700 cages de croisements de lignées par an pour lesquelles l'identification individuelle et le génotypage sont nécessaires. En considérant que chaque accouplement donne en moyenne 5 portées de 8 souriceaux/an, notre établissement générera environ 28 000 animaux qui devront être identifiés et génotypés par an. Dans l'établissement, 20 cages de croisements de rats par an pour lesquelles l'identification individuelle et lé génotypage sont nécessaires, seront lancés. En considérant qur chaque accouplement donne en moyenne 5 portées de 10 ratons, l'établissement générera 3000 rats. Le projet comprend donc 143 000 animaux sur 5 ans. Tous les animaux en zone d’élevage, sont uniquement présents pour établir des animaux d'intérêts qui seront ensuite restitués aux unités utilisatrices pour entrer en phase expérimentale dans une animalerie d’expérimentation, dans un projet de recherche déposé par leur soin. Les demandes d'accouplements sont donnés par les équipes de recherche via un logiciel de gestion de lignées afin d'accoupler les animaux des génotypes d'intérêt pour leurs projets de recherche. Le nombre d'accouplements lancés est systématiquement revu en fonction du nombre d'animaux déclarés dans les projets de recherche. Les animaux sans génotype d'intérêt seront réutilisés en priorité (projets d'autres équipes de recherche ou projet de tutorat). Une lignée peut être maintenue en entretien minimum uniquement avec la validation de la structure bien être animal (SBEA). Sans justificiation scientifique du maintien en élevage d'une lignée, la cryoconservation de sperme sera systématiquement proposée. Dans le cadre de ce projet d'élevage, il n'y a pas de tests statistiques ou de calcul de puissance mais cela sera systématiquement appliqué dans le cadre de l'utilisation continue des animaux au sein des projets de recherche qui découlent de ces élevages.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation avec un cycle jour nuit automatique : les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’isolement est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec un des enrichissements ci-après : carré de lanière kraft, carré de coton, batônnet en bois, rouleau en carton ou maisonnette. Les conditions de températures et d’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les animaux sont vérifiés quotidiennement. Une surveillance accrue sera réalisée lors des prélèvements de tissu pour génotypage : une compression de la zone d'incision sera effectuée pour stopper les petits saignements, le regroupement et la prise en charge des petits par la mère seront vérifiés. Des points limites suffisamment prédictifs ont été déterminés pour éviter tout inconfort ou souffrance des animaux.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les modèles les plus utilisés par les chercheurs pour étudier les fonctions biologiques et les pathologies. En effet, il existe de nombreux modèles génétiquement modifiés pour de très nombreuses pathologies humaines. Tous les souriceaux et les ratons, mâles et femelles, seront principalement identifiés et génotypés à partir de 7 jours de vie (plus l'animal est jeune, moins la nociception est développée). Pour certains projets de recherche, il est déconseillé d'utiliser de le tatouage car l'encre pourrait migrer dans différents tissus ou encore il est déconseillé de toucher aux phalanges des animaux. Dans ces conditions, l'identification après 15 jours de vie sera privilégiée.
Thérapie génique expérimentale pour le traitement de la myopathie congénitale liée à la myopalladine MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Pour mettre au point une thérapie génique contre une myopathie congénitale très rare, 116 souris porteuses de la mutation sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. Elles subissent des tests d'effort répétés jusqu'à l'âge de douze mois, des prélèvements de sang et une injection de vecteur viral ou de solution saline. Les muscles et les organes sont prélevés après la mise à mort pour mesurer l'effet du traitement. Le porteur situe le bénéfice pour les patients après la fin du projet, avec un passage attendu vers l'essai clinique, quand les atteintes portées aux souris sont immédiates.
Objectifs
Les myopathies congénitales constituent un groupe hétérogène de troubles neuromusculaires héréditaires dont les symptômes sont une faiblesse musculaire et des déformations squelettiques, ayant pour certaines un fort impact sur la survie et la qualité de vie des patients. Ce projet vise à combler une lacune majeure dans le traitement d'une myopathie congénitale très rare liée à des mutations du gène mypn engendrant un défaut de production de la protéine myopalladine (MYPN-CM, MYPN-associated congenital myopathy). Les mutations dans ce gène mypn entraînent une absence totale ou une diminution de la quantité de protéine MYPN fonctionnelle specifiquement dans les muscles, altérant l’intégrité du tissu musculaire cardiaque et squelettique, à l’origine de myopathies congénitales rares diagnostiquées généralement dès la naissance ou durant l’enfance. Le but du projet présenté pour une durée de 5 ans vise à caractériser plus précisément l'une de ces myopathies congénitales et de mettre au point une thérapie génique pour traiter cette maladie encore incurable, en rétablissant l’expression de la myopalladine manquante. Dans ce but, un modèle de souris déficient pour cette protéine MYPN (souris MKO) sera utilisé, reproduisant les caractéristiques de la maladie humaine du point de vue clinique. Un premier objectif de l'étude est de caractériser les souris MKO à différents âges afin de mieux comprendre l'évolution de la maladie dans ce modèle. Cette première étude permettra également d'établir les paramètres à évaluer lors de la thérapie génique expérimentale qui constitue le deuxième objectif. Les différents paramètres seront analysés avant et après administration d'un traitement permettant une expression de la protéine MYPN chez les souris MKO, afin de déterminer les bénéfices thérapeutiques de ce traitement, mais également d’écarter tout potentiel effet indésirable sur les autres organes.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à répondre à un besoin médical non satisfait en fournissant une approche de traitement novatrice pour la MYPN-CM qui consiste en une approche de thérapie génique. Ce projet devrait produire un bénéfice à court terme avec la caractérisation en profondeur du modèle de souris déficient pour la proteine MYPN (modèle MKO) qui pourra ensuite être comparé à la trajectoire de la maladie chez l’humain. Cela permettra de caractériser la maladie et de mieux comprendre son évolution au fil du temps. Le bénéfice à long terme sera obtenu après l’achèvement du projet grâce auquel il est attendu une rapide évolution vers une phase pré-clinique puis clinique pour la thérapie génique de la MYPN-CM.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à une étude de leur force/résistance musculaire par 4 tests non invasifs de courte durée. Chaque test sera réalisé à différents âges des souris 1.5, 3, 6, 9 et 12 mois. Certaines souris seront également soumises à deux prélèvements sanguins au niveau de la veine de la queue et une unique injection intraveineuse de vecteur viral ou solution saline sous anesthésie générale + anesthésie locale, ne dépassant pas 10 min afin d'éviter stress et douleur. Certaines souris ne recevront que deux injections intramusculaires (une dans chaque patte arrière, solution saline ou traitement).
Impact sur les animaux
Dans les conditions de vie courante en cage, les souris MKO sont de plus petites tailles mais ont une longevité comparable aux souris sauvages et du fait d'une activité réduite elles ne semblent pas génées par l'absence de myopalladine. La réalisation des tests fonctionnels d'effort peut engendrer un léger stress, un essoufflement et une faiblesse musculaire. L’injection des vecteurs viraux par voie intramusculaire ou systémique peut engendrer une légère douleur jusqu’à quelques heures après l’injection qui sera prise en charge par un traitement antalgique.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, toutes les souris seront mises à mort afin de pouvoir procéder à une caractérisation moléculaire et histologique de différents tissus. Selon les procédures, les muscles et/ou plusieurs organes d’intérêt seront prélevés afin de vérifier les bénéfices et éventuels effets indésirables sur d'autres organes (foie, cœur, rate, etc…) que ceux ciblés par la thérapie (les muscles).
Remplacement
En amont de l'étude expérimentale chez les souris MKO déficientes en myopalladine, le traitement développé sera d’abord testés sur des cellules musculaires in vitro, ce qui permettra de valider leur efficacité avant l’injection chez l’animal, et ainsi réduira le nombre d’animaux utilisés dans ce projet. Du fait de la visée thérapeutique de ce projet, il est cependant essentiel de réaliser des tests pré-cliniques dans le modèle animal afin de vérifier l'expression de la myopalladine in vivo suite à l'injection du traitement, et ceci sans effets secondaires tels qu'une réaction inflammlatoire violente ou toxique pour l'organisme, toutes deux malheureusment déjà observées dans d'autres thérapies géniques. A ce titre, il est nécessaire de tester l'efficacité de la thérapie génique in vivo, dans un organisme entier dont l’ensemble des organes est en interrelation constante afin de vérifier le tropisme et l'innocuité du traitement.
Réduction
Pour la caractérisation clinique (force et endurance), les mêmes animaux seront utilisés à différents âges (1.5, 3, 6, 9 et 12 mois), ce qui permet de réduire le nombre de souris utilisées. Ces souris seront ensuite mises à mort afin de prélever tous les muscles qui serviront pour plusieurs analyses. Pour les analyses histologiques et moléculaires à 1.5, 3, 6, 9 et 12 mois d’autres souris, seront mises à mort hors procédure pour prélèvement d'organes uniquement. Le modèle MKO n’a fait l’objet que d’une seule publication et les auteurs se sont principalement concentrés sur les défauts cardiaques du modèle et n’ont pas caractérisé en profondeur le phénotype musculaire, ce que nous souhaitons faire. Cette myopathie est extrêmement rare chez l’homme et n’est donc que très mal caractérisée également. La faiblesse musculaire est par ailleurs légère comparée à d’autres myopathies telle que la dystrophie musculaire de Duchenne ou même celle de Becker. Les marqueurs conventionnels utilisés comme la phosphocréatine kinase ne sont pas appropriés pour comparer les animaux sauvages et les MKO, c’est pourquoi nous souhaitons conduire cette étude. Pour déterminer le nombre d’animaux nécessaire, nous nous sommes donc basés sur notre expérience avec d’autres modèles de myopathie notamment les rats DMD traités avec des candidats médicaments (thérapie génique ou pharmacologique). Dans ce modèle, il a été calculé par une approche statistique que 8 rats seraient nécessaires afin d'obtenir in fine des valeurs en nombre suffisant pour confirmer ou infirmer un effet majeur de la thérapie sur l'évolution de la maladie. Il se trouve que ce nombre est également celui utilisé dans la première étude de ce modèle, c'est pourquoi nous avons choisi ce même nombre de souris par condition pour cette étude. Enfin, en travaillant par étape, cela nous permettra d’appréhender et d’optimiser les expérimentations au fur et à mesure afin de réduire au mieux le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux sont dans des cages ventilées dans des zones dont la température et l’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les souris ont en permanence accès à l’eau et à la nourriture et ne sont jamais isolées, elles restent avec leurs congénères et sont uniquement séparées par sexe afin d’éviter les accouplements non contrôlés. Les souris sont dans un environnement avec un cycle d’éclairage de 12h par jour. Les animaliers sont formés à procéder à l’amélioration des conditions d’hébergement par ajout de papier et d’abris en carton dans les cages. Les animaux sont régulièrement surveillés et manipulés par du personnel qualifié afin de s’habituer à l’homme et éviter tout stress lors des procédures animales. Les méthodes expérimentales ont été choisies pour éviter au maximum les douleurs lors des interventions sur les animaux. Les tests cliniques ne sont pas douloureux et ne correspondent qu’à des exercices physiques, et les injections des vecteurs dans le muscle ou dans les veines se feront sous anesthésie et n'entraîneront qu’une très légère douleur. Après chaque injection, les souris seront surveillées (signes de détresse, comportement, poids corporel, prise de nourriture) et en cas de signes de douleur, un anti-douleur sera administré pendant 24h. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleurs chez les animaux.
Choix des espèces
La souris MKO présente des similarités cliniques et histologiques avec les patients MYPN-CM que nous souhaitons caractériser plus en profondeur. La courte durée de gestation chez la souris est compatible avec la durée des expériences proposées, particulièrement pour la caractérisation des souris à 12 mois. Les approches de thérapie génique expérimentale sont facilement réalisables sur ce petit modèle, et sont essentielles avant de passer à une étude pré-clinique chez un modèle animal plus gros comme le chien, puis à une étude clinique chez l’homme. Les caractérisations phénotypiques se feront à partir de 1.5 mois, âge qui correspond au début de la puberté chez l’homme. En effet, nous savons que les phénotypes apparaissent à la naissance ou durant l’enfance. Ensuite, la maladie est progressive et à 3 mois, les souris MKO commencent à montrer une faiblesse musculaire. La caractérisation phénotypique se poursuivra entre 3 mois, âge correspondant au jeune adulte dont les muscles sont complètement formés, et 12 mois, âge adulte avancé chez l’homme. Cette stratégie permettra d’établir une trajectoire précise de la maladie au fil du temps, ce qui aidera à mieux comprendre l’évolution de la maladie chez l’homme. Puis ce modèle servira à évaluer les effets bénéfiques du traitement lorsque celui-ci est administré (1) avant l'apparition des symptômes (6 semaines) pour voir s’il est possible d’empêcher ou retarder l’apparition de la maladie ; et (2) après l'apparition des symptômes de la maladie (6 mois), pour voir s’il est possible de ralentir voir d’arrêter la progression de la maladie ou d’en promouvoir le décours.
Prélèvement des tissus pour la caractérisation génétique de souris génétiquement modifiées et gestion de lignées à phénotype dommageable.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système urogénital
200 000 souris pour un seul acte de quelques secondes chacune, la coupe d'un bout d'oreille ou de queue, un prélèvement de sang ou d'un orteil pour lire leur génotype. Ces procédures relèvent d'un niveau de souffrance déclaré léger pour 187 500 d'entre elles et modéré pour 12 500. Les souris qui portent le génotype recherché rejoignent d'autres projets ou l'élevage, les autres sont mises à mort. Le projet couvre des lignées dites à "phénotype dommageable", modifiées pour développer des anomalies, sans que le résumé précise lesquelles.
Objectifs
Dans le cadre des projets utilisant des animaux à fins scientifiques (soumis indépendamment des demandes d’autorisation de projet), des modèles animaux génétiquement modifiés sont développés et élevés. Dans ce but, il est important de détecter et gérer les pathologies induites par les mutations de ces modèles et de bien caractériser génétiquement les animaux produits. L’ensemble permet un élevage adapté pour constituer les lots expérimentaux et maintenir une production régulière et optimisée aux besoins des projets de recherche.
Bénéfices attendus
Ce projet permet d'optimiser la gestion des élevages d’animaux génétiquement modifiés utilisés dans des projets de recherche dont l’objectif est la compréhension ou le traitement de maladies humaines.
Procédures
Prélèvements sur souris vigiles : Soit Un prélèvement de petit bout de tissu à l’oreille ou à la queue (3mm maximum) Soit un prélèvement de sang (50 à 100ul) Soit un prélèvement de phalange- Dans les 3 cas, moins de 10 secondes.
Impact sur les animaux
Les nuisances lors d'un prélèvement de tissus pour le génotypage sont essentiellement du stress léger lors de la contention et de la douleur légère à modérée lors de la coupe du tissu.
Devenir
Les animaux du génotype d'intérêt sont utilisés dans les projets expérimentaux du laboratoire ou gardés en vie pour renouveler les reproducteurs nécessaires à l'entretien des colonies. Les animaux qui n'ont pas le génotype d'intérêt sont mis à mort.
Remplacement
Ce projet est nécessaire pour la production et la mise à disposition d’animaux modèles génétiquement altérés pour des projets scientifiques. Bien que les chercheurs développent leurs hypothèses sur des systèmes alternatifs (moléculaires et cellulaires), le recours à l’animal dans son ensemble est indispensable. L'étude de mécanismes ou pathologies complexes qui font intervenir plusieurs grands systèmes biologiques entre eux nécessitent et justifient le recours à l'animal et la détermination du génotype des animaux ne peut être réalisé sans prélèvement de tissus.
Réduction
La production des souris génétiquement altérées est basée et réduite au stict besoins expérimentaux établis de façon statistique. L’enjeu et l’objectif majeur d’une réduction consistent à optimiser les élevages et à limiter la surproduction d’animaux non utilisés dans les projets scientifiques. Nous utilisons des schémas d’accouplement optimisés pour produire un maximum d’animaux « utiles » (lignées avec plusieurs modifications génétiques). Quand cela est possible nous utilisons des schémas d’accouplement ne nécessitant pas de génotypage. Les élevages des lignées non utilisées sont arrêtées (cryoconservation). Les chercheurs donnent des consignes lorsqu'il n'est pas nécessaire de prélever du tissu des souris. Nous cherchons au maximum à optimiser les schémas d’accouplements (mutations portées par les parents) pour réduire le génotypage ou éviter l’apparition d’un phénotype dommageable. Il est compliqué d’apprécier l’impact de ces mesures sur la réduction mais il est aisé de comprendre qu’elles concourent toutes à l’optimisation de la production aux seuls animaux qui seront utilisés dans les projets scientifiques ou en gestion de colonies et donc de réduire le nombre d’animaux à génotyper ou exprimant le phénotype dommageable.
Raffinement
Les techniques de prélèvement de tissus pour le génotypage sont effectuées par des zootechniciens expérimentés dont le geste est précis. Les biopsies sont effectuées rapidement et précisément effectuée avec un matériel désinfecté et adapté pour réduire le temps et l'intensité de la douleur. Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi et des points limites (activité, aspect physique, cicatrisation..) ont été mis en place pour détecter toute souffrance éventuelle et y remédier. Pour les lignées à phénotypes dommageables, la stratégie de raffinement est de mettre en place le plus tôt possible une procédure de surveillance de l’apparition des nuisances et si besoin des conditions d’hébergement adaptées, une DAP spécifique (d’élevage ou avec l’expérimentation) sera soumise à évaluation.
Choix des espèces
La souris est un modèle trés développé pour la compréhension des pathologies humaines. Ce modèle présente de nombreuses similitudes dans les processus biologiques avec l’Homme. De plus son temps de génération est court et son élevage simple. Les biopsies de queue ou d'oreille seront faites sur des souris à partir de 10 jours d'âge jusqu'à 4 semaines. La phalangectomie sera effectuée de 5,5j à 10 jours d'âge. Les prélèvements de sang seront effectués sur des souris de 15 jours d'âge jusqu'à 4 semaines. Cela permet d'obtenir le génotype rapidement et de ne sélectionner au sevrage que les animaux d'intérêt.
Caractérisation moléculaire de la maladie induite par différents agrégats d’alpha-synucléine humaine dans un modèle murin de la maladie de Parkinson
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Les souris qui montrent les premiers signes moteurs, une démarche saccadée, sont mises à mort avant que la paralysie ne les empêche de se nourrir. 312 souris génétiquement modifiées sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune reçoit dans le cerveau, par chirurgie sous anesthésie, une inoculation d'agrégats d'alpha-synucléine humaine qui reproduit une forme de maladie de Parkinson ou d'atrophie multisystématisée et conduit à la paralysie. Le porteur indique comparer douze formes de la protéine agrégée pour relier leur structure à la sévérité de la maladie, la mise à mort servant à prélever et analyser le cerveau.
Objectifs
L’alpha-synucléine est la protéine majoritaire dans les lésions du cerveau des patients atteints de maladie de Parkinson ou d’atrophie multisystématisée, où elle se présente sous une forme agrégée. De structures différentes selon les maladies, ces agrégats sont associés à une gravité particulière dans le cas de l’atrophie multisystématisée, rendant les patients rapidement dépendants d’un fauteuil roulant et avec une survie inférieure à 10 ans. Le projet vise à disposer d’échantillons cérébraux de souris modifiées génétiquement, avec des lésions bien identifiées et caractérisées, afin de pouvoir analyser à très haute résolution la structure spatiale de la protéine alpha-synucléine formée lors de l’apparition de la maladie induite par un panel de différents agrégats d’alpha-synucléine inoculés à la souris. Le but est de mieux comprendre les relations entre structures moléculaires de la protéine et sévérité de la maladie.
Bénéfices attendus
Le projet vise à mieux connaître les relations entre les structures moléculaires pathologiques de l’alpha-synucléine agrégée et les maladies associées à cette agrégation, par la description approfondie des lésions et de la structure à l’échelle atomique de la protéine pathologique. Il s‘agit en particulier de mieux comprendre pourquoi l’atrophie multisystématisée présente, parmi les différentes maladies associées à cette même protéine, une gravité particulière aboutissant en quelques années seulement à la mort des patients.
Procédures
Les souris font l’objet d’une inoculation par stéréotaxie dans le cerveau de jeunes souris modifiées génétiquement à l'âge de 6-8 semaines, réalisée sous anesthésie générale et locale chez les 312 animaux prévus dans l’étude. L’intervention chirugicale dure 30 à 45 minutes. Aucun prélèvement n’est réalisé du vivant de l’animal.
Impact sur les animaux
Les animaux font l’objet d’une inoculation réalisée sous anesthésie générale et locale. Ces inoculations peuvent induire de faibles pertes de poids et un faible risque d’infection au site d’incision chez les souris. Réalisées afin de reproduire la maladie humaine, ceci entraîne l’apparition précoce des premiers signes cliniques moteurs qui se manifestent par une démarche saccadée de l’animal. La confirmation de ces premiers signes cliniques détermine la décision de mise à mort des animaux selon une grille de scoring, avant la survenue d’une paralysie du train postérieur qui empêcherait l’animal de se nourrir et boire à volonté.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin du protocole d’expérimentation. En effet, l’expression d’une forme mutée de l’alpha-synucléine humaine chez les souris modifiées génétiquement utilisées dans ce projet conduit irrémédiablement à une paralysie, survenant plus précocément suite à l’inoculation d’alpha-synucléine sous forme agrégée. Leur mise à mort est ainsi réalisée dès l’apparition des premiers signes cliniques, permettant de leur éviter des souffrances ultérieures.
Remplacement
Le projet ne peut être réalisé qu’in vivo, visant à évaluer le délai d’apparition de signes cliniques neurologiques et la pathologie cérébrale, ainsi que la structure de la protéine qui s’accumule dans le cerveau lors de la maladie. Il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative permettant de remplacer l’expérimentation animale.
Réduction
Les 12 groupes expérimentaux, correspondant à 12 formes d’alpha-synucléine agrégée différentes, sont constitués chacun de 26 souris adultes, mâles et femelles. Dans chaque groupe expérimental 14 souris sont prévues afin de disposer du nombre d’animaux nécessaire et suffisant aux travaux de caractérisation fondés sur l’examen de la durée d’incubation, des lésions et des caractéristiques biochimiques de la protéine présente dans le cerveau. Les 12 autres souris sont prévues pour extraire et purifier cette protéine afin d’étudier sa structure spatiale à très haute résolution.
Raffinement
Les inoculations dans le cerveau sont réalisées sous anesthésies générale et locale, après administration d’un antalgique, afin de limiter la douleur. Les animaux sont maintenus sur tapis chauffant pour lutter contre l’hypothermie. Les animaux sont hébergés en cages ventilées par groupes de 5 mâles ou 5 femelles, suivis quotidiennement, et les enrichissements présents dans la cage, comme les cachettes et les éléments de nidification, sont doublés en cas de conflits dans la cage. L’expérience des zootechniciens permet de repérer rapidement les souris qui présentent les premiers signes de déficits moteurs, se traduisant par une démarche saccadée et un déséquilibre, selon une grille de score adaptée à ce modèle de souris. Ceci permet d’éviter que ces troubles évoluent vers une paralysie du train postérieur qui entraînerait des difficultés d’alimentation et un mal-être chez la souris.
Choix des espèces
Le projet prévoit des inoculations dans le cerveau chez des souris âgées de 6-8 semaines, dans lesquelles l’expression d’alpha-synucléine humaine permet les comparaisons des durées de survie et des caractéristiques de la maladie. Seule cette lignée de souris particulière permet aujourd’hui à la fois la reproduction d‘une diversité des pathologies et de leurs sévérités, telle qu’elle existe chez l’homme, et une analyse structurale de la protéine en cause.
Entretien d’une lignée transgénique de souris pour l’obtention d’une population spécifique de lymphocytes T monoclonaux
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Génétiquement modifiées pour porter des lymphocytes T reconnaissant une cible unique, 600 souris de la lignée P14 sont utilisées sur un an dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque souris subit au sevrage une ponction de sang à la joue pour vérifier qu'elle porte bien le transgène. Les souris qui ne l'ont pas sont mises à mort sans autre usage, les autres élevées puis tuées à leur tour pour prélever leur rate et étudier in vitro l'effet d'une enzyme immunosuppressive sur les lymphocytes T. Le porteur affirme qu'aucune méthode sans animaux ne fournit ces populations de lymphocytes spécifiques et présente cet élevage comme une façon de "réduire" le recours à l'animal.
Objectifs
Ce projet a pour but de maintenir une colonie de souris génétiquement modifiées appelées P14. Ces souris possèdent des cellules du système immunitaire spécialement programmées pour reconnaître une seule cible précise. On parle alors d’une population de cellules « monoclonale », c’est-à-dire toutes identiques dans leur fonctionnement. Pour s’assurer que ces caractéristiques sont bien présentes, un petit prélèvement unique sanguin est réalisé chez les souris après le sevrage. Les analyses permettent de vérifier que les souris portent toujours cette modification génétique et de distinguer celles qui l’ont conservée de celles qui l’ont perdue. Dans d’autres expériences, les cellules immunitaires prélevées sur ces souris après leur mise à mort seront étudiées en laboratoire. L’objectif est d’évaluer comment une enzyme ayant un effet immunosuppresseur influence l’activation des cellules immunitaires, leur spécialisation et leur éventuel épuisement. L’utilisation de ces souris génétiquement modifiées permet d’obtenir des résultats fiables tout en évitant des expériences plus lourdes sur animaux vivants. Cette approche contribue ainsi à réduire le nombre d’animaux utilisés, conformément au principe des « 3R » (Remplacer, Réduire, Raffiner), qui vise à limiter autant que possible l’expérimentation animale
Bénéfices attendus
Avec ces prélèvements nous pourrons identifier les vrais animaux transgéniques utilisables dans nos expériences. L’utilisation de cette souris transgénique P14 dans des expériences ex vivo et in vitro permettra d’obtenir des données pertinentes tout en limitant le recours à des expérimentations in vivo plus complexes et douloureuses pour les animaux, contribuant ainsi à la réduction du nombre d’animaux utilisés par nos projets conformément au principe des 3R.
Procédures
Un seul prélèvement d'une durée de maximum 10 secondes, par ponction de la veine sous-mandibulaire au moment du sevrage, est prévu.
Impact sur les animaux
Stress lié aux manipulations. Les animaux doivent être contenus pour le prélèvement effectué par le personnel de l'animalerie qui est formé et rapide dans l'acte
Devenir
Tous les animaux porteurs du transgène seront élevés dans l’animalerie. Tout animal ne présentant pas le transgène sera mis à mort. Aucun prélèvement sera effectué sur les animaux mis à mort car ne portant pas le gène d’intérêt.
Remplacement
Les lymphocytes T issus de ces souris P14 permettront de tester in vitro nos hypothèses sur l’effet d’IL4I1 sur l’activation lymphocytaire et diminuer le nombre d’expériences in vivo chez l’animal.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet sera strictement limité au minimum nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques. L’utilisation de souris transgéniques P14 permet d’obtenir une population de lymphocytes T homogène et spécifique d’un antigène unique, réduisant la variabilité expérimentale et, par conséquent, le nombre d’animaux requis pour obtenir des résultats interprétables. Les analyses principales seront réalisées in vitro à partir de cellules isolées après mise à mort, ce qui permet de limiter le recours à des expérimentations in vivo répétées ou de longue durée. Par ailleurs, la vérification du statut transgénique par un prélèvement sanguin unique au moment du sevrage permet d’optimiser la sélection des animaux nécessaires aux expériences, évitant ainsi l’utilisation d’animaux non conformes au phénotype requis. Pour nos expérimentations nous avons besoin de 15-20 souris femelles P14 par mois, qui seront utilisées après mise à mort pour prélever des cellules de la rate à utiliser in vitro. Sur la base de l’expérience que nous avons sur cette lignée, il nous faudra tester 50 souris par mois. Donc pour une période de 1 an, le total de l’expérimentation représente 600 animaux.
Raffinement
L’hébergement se fait dans les conditions habituelles de l’animalerie : cinq souris sont hébergées par cage et un enrichissement du milieu est effectué par l’utilisation de Nestlets, d’un smart home ainsi que de Bed-r'nest, des outils qui améliorent le bien-être des animaux. Les Nestlets sont des petits morceaux de matériau qui permettent aux souris de construire des nids et de suivre leurs instincts naturels. Le Smart Home contrôle automatiquement la température, la lumière et l’activité dans la cage pour maintenir un environnement stable. Pour finir, le Bedr’nest offre un espace douillet où les animaux peuvent se reposer et se sentir en sécurité. Ensemble, ces dispositifs rendent les conditions plus confortables et moins stressantes pour les souris. Les animaux élevés dans notre animalerie seront manipulés par du personnel expert de l’équipe pour éviter/limiter tout stress.
Choix des espèces
Les souris transgéniques P14 possèdent des lymphocytes T reconnaissant spécifiquement l’antigène GP33. Après mise à mort sans procédure préalable, les lymphocytes T seront isolés à partir de la rate afin de réaliser des expérimentations in vitro. Le modèle P14, exprimant un récepteur T transgénique, est particulièrement pertinent pour étudier les effets de l’enzyme immunosuppressive IL4I1 sur l’activation, la différenciation et l’épuisement des lymphocytes T. Aucune méthode alternative ne permet actuellement d’obtenir des populations lymphocytes T spécifiques d’un antigène unique. Les animaux seront testés une seule fois au moment du sevrage (environ 3 semaines).
Étude du rôle d’une protéine impliquée dans la croissance cellulaire dans le développement du cancer du côlon
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Issues d'un élevage qui met à mort les petits ne portant pas le bon génotype, 3 098 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie reçoit un aimant implanté sous la peau du dos et une injection de nanoparticules magnétiques, avant un suivi par colonoscopie sous anesthésie. Le génotypage se fait par biopsie de l'oreille sur animal vigile. Les tissus sont prélevés après la mise à mort, l'étude portant sur une protéine liée à la croissance des cellules du cancer du côlon.
Objectifs
Le cancer colorectal est le troisième cancer le plus fréquent et la quatrième cause de mortalité liée au cancer dans le monde. Il résulte d’une accumulation d’anomalies moléculaires perturbant les mécanismes normaux de contrôle de la croissance et de la survie des cellules intestinales. Bien que les traitements actuels aient permis d’améliorer la prise en charge des patients, une récidive survient encore chez environ 50% d’entre eux. Les mécanismes responsables de cette rechute restent en partie inconnus et doivent être élucidés afin de réduire le risque de progression tumorale et de mortalité. Ces dernières années, des facteurs mécaniques tels que l’augmentation de la rigidité tissulaire, les modifications du flux sanguin et la pression due à la croissance tumorale, ont été proposés comme éléments favorisant la progression du cancer. Dans ce contexte, la protéine d’intérêt, présente à la surface des cellules, agit comme un récepteur capable de capter ces signaux de l’environnement et de déclencher à l’intérieur de la cellule des mécanismes contrôlant sa croissance et sa survie. Elle pourrait ainsi fonctionner comme un capteur mécanique, transformant les forces physiques exercées sur les cellules en signaux biologiques qui activent des gènes impliqués dans l’aggravation du cancer. Dans certains cancers, des anomalies (comme de mutations ou une activité trop élevée) ont été décrites . Toutefois, son rôle précis dans le développement et la progression du cancer colorectal reste insuffisamment caractérisé. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre comment des forces physiques exercées sur les cellules peuvent favoriser l’apparition et la progression des cancers. Nous étudierons plus particulièrement le rôle de notre protéine dans les processus conduisant à la transformation tumorale des cellules du côlon. Pour cela, nous analyserons sa présence et son activité dans les cellules, ainsi que ses effets sur leur comportement, comme leur multiplication, leur survie et leur capacité à envahir les tissus voisins. Une meilleure compréhension de ces mécanismes pourrait permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et contribuer à l’amélioration des stratégies de prise en charge des patients atteints de cancer colorectal.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet permettront, à court terme, d’approfondir les connaissances sur les mécanismes impliqués dans le développement tumoral et la formation de métastases dans le cancer du côlon chez la souris. Ce travail explore un axe encore peu étudié, à l’interface entre la physique et la biologie, en analysant l’impact des contraintes mécaniques sur les processus biochimiques et cellulaires impliqués dans la progression tumorale. À plus long terme, ces connaissances pourraient être transposables au cancer colorectal humain, compte tenu de la forte conservation des mécanismes moléculaires impliqués dans la formation des tumeurs entre la souris et l’homme. Par ailleurs, des données disponibles suggèrent une activation anormale de la protéine étudiée dans plusieurs autres tumeurs solides humaines, ce qui pourrait élargir la portée des résultats obtenus au-delà du cancer du côlon. Enfin, une meilleure compréhension des mécanismes reliant contraintes mécaniques (comme les pressions exercées dans l’intestin par le passage des aliments, appelé bol alimentaire, ou par la croissance d’une tumeur qui pousse sur les tissus environnants) et progression tumorale pourrait contribuer à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles. Ces travaux pourraient donc participer au développement de stratégies visant à limiter les effets favorisant le cancer associés à la pression mécanique exercée par la croissance tumorale, notamment la formation de métastases, l’échappement au système immunitaire, la résistance aux traitements et la récidive.
Procédures
Dans un premier temps, une biopsie d’oreille sera réalisée sur les animaux vigiles (durée du geste inf à 10 sec) puis les souris seront réparties en deux groupes. Le groupe contrôle ne fera l’objet d’aucune intervention chirurgicale. L’autre groupe subira une intervention chirurgicale consistant en l’implantation sous-cutanée d’un aimant dans le dos, suivie d’une injection intraveineuse de nanoparticules magnétiques (administrée une seule fois au cours de l’expérience). La chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale et ne dépassera pas 15 minutes. Ensuite, chaque groupe sera subdivisé en deux sous-groupes. L’un des groupes recevra une injection (une fois; durée du geste < 10 secondes). L’autre groupe ne recevra pas cette injection. Une partie des souris sera ensuite suivie par imagerie (colonoscopie) sous anesthésie, à raison d’une fois par semaine pendant 4 semaines. La durée de chaque procédure sera inférieure à 20 minutes par animal. À des temps prédéterminés (30 minutes, 4 heures, 5 jours ou 1 mois), les animaux seront mis à mort afin de prélever des échantillons du côlon et de l’intestin.
Impact sur les animaux
Le génotypage par biopsie d’oreille peut provoquer une douleur légère et de très courte durée, comparable à une petite piqûre, ainsi qu’un léger stress lié à la manipulation. Une petite plaie peut apparaître à l’endroit du prélèvement, avec un faible saignement. Ces effets sont transitoires. Les effets indésirables attendus suite à l’injection de particules magnétiques et à l’implantation d’un petit aimant sous la peau sont une douleur transitoire liée à la piqûre et à l’incision. La contrainte mécanique appliquée ne devrait pas induire de douleur persistante en dehors de la phase post-opératoire immédiate. L’injection de traitement est susceptible d’entraîner une gêne transitoire liée à la piqûre de courte durée et entrainer une perte de poids. Le développement tumoral attendu au niveau de l’intestin et du côlon pourra être associé à des signes cliniques tels qu’une perte de poids, des difficultés à d’alimenter, une déshydratation, des saignements, des diarrhées, prolapsus ou des douleurs d’intensité moyenne Le temps maximal prévu pour les expériences sera de 1 mois.
Devenir
Les animaux inclus dans les procédures expérimentales sont mis à mort à l’issue des expériences afin de permettre la réalisation d’analyses post-mortem nécessaires à l’atteinte des objectifs scientifiques. Les animaux issus de l’élevage ne présentant pas le génotype d’intérêt pour le projet ne peuvent être inclus dans les procédures expérimentales et sont donc également mis à mort conformément à la réglementation en vigueur.
Remplacement
Le projet vise à étudier l’influence des contraintes mécaniques sur les processus d’initiation et de progression tumorale du côlon, ainsi que leurs implications thérapeutiques potentielles. Ces processus reposent sur des interactions complexes entre cellules tumorales, microenvironnement tissulaire, vascularisation, système immunitaire et contraintes physiques, qui ne peuvent être intégralement reproduites par des modèles in vitro. En amont du projet, des approches alternatives ont été mises en œuvre, notamment l’analyse de données cliniques issues de patients. Des expérimentations ont également été conduites sur deux modèles alternatifs (Drosophile et anémone). Ces travaux ont permis d’obtenir des informations essentielles et de valider les hypothèses expérimentales. Cependant, ces systèmes ne permettent pas de reproduire l’architecture tissulaire intégrée, la dynamique des contraintes mécaniques in vivo, ni les interactions indispensables à l’étude de la progression tumorale dans un organisme entier. Dans ce contexte, l’utilisation de la souris, y compris de lignées transgéniques adaptées à la question scientifique posée, apparaît indispensable pour répondre aux objectifs du projet dans un environnement physiopathologique pertinent.
Réduction
Les résultats obtenus dans nos projets précédents nous ont permis de réduire et d’ajuster le nombre minimum de souris nécessaire pour obtenir de résultats statistiquement fiables. Le nombre de souris prévu dans ce projet a été donné comme un nombre maximum mais pourra être réduit en fonction des résultats obtenus à chaque étape, permettant de cibler les meilleures conditions d’analyse. Nous affinerons constamment notre technique chirurgicale et nos routines de soins postopératoires afin de garantir que seul le nombre minimum de souris strictement nécessaire sera utilisé. Les effectifs seront déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Toutes les souris feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel formé, et les procédures expérimentales seront réalisées de manière à prévenir et minimiser toute douleur, détresse ou souffrance. Un protocole analgésique adapté sera systématiquement mis en place pour toute procédure chirurgicale, incluant anesthésie, analgésie, anti-inflammatoires et soins pré- et post-opératoires appropriés. Un suivi sera assuré pendant la période post-chirurgicale afin de contrôler la récupération et le processus de cicatrisation. Toutes les mesures possibles seront mises en place pour que les animaux soumis à cette procédure expérimentale avec un maintien permanent de l’aimant ne se trouvent pas isolés dans des cages individuelles pendant tout le reste de la procédure (pour éviter des possibles dommages occasionnés par l’attirance des aimants entre eux) en utilisant des animaux de compagnie sans aimant. En complément de la surveillance quotidienne, un examen clinique approfondi sera réalisé au minimum trois fois par semaine tout au long de l’expérimentation afin de s'assurer du bon état clinique des animaux. Des soins de support adaptés (hydratation, enrichissement alimentaire, mesures de confort, etc.) seront mis en place si nécessaire. Une grille de score sera appliquée pour contrôler le bien-être des animaux de façon objective à toutes les étapes du projet proposé et sera utilisée afin d’arrêter l’expérimentation dès atteinte de point-limites.
Choix des espèces
L’utilisation des souris transgéniques constitue un modèle pertinent et largement validé pour l’étude des mécanismes de cancérogenèse colorectale. Les lignées disponibles permettent de reproduire de manière contrôlée des altérations génétiques et des processus physiopathologiques proches de ceux observés chez l’homme. Ce projet nécessite un modèle in vivo intégrant l’architecture tissulaire du côlon, les contraintes mécaniques locales, les interactions avec le microenvironnement tumoral, la vascularisation et le système immunitaire. À ce jour, la souris représente l’organisme le plus adapté pour étudier conjointement ces dimensions dans un contexte expérimental maîtrisé. Par ailleurs, la souris constitue le modèle de référence en cancérogenèse colorectale préclinique. Elle bénéficie d’outils génétiques étendus, d’un recul bibliographique important et d’une bonne caractérisation des réponses aux agents thérapeutiques, facilitant ainsi la transposition des résultats vers la recherche clinique. Les souris utilisées dans ce projet seront des adultes âgés de 3 à 8 mois. Cet âge est choisi afin d’éviter l’apparition spontanée de tumeurs liées à leur modification génétique, qui surviennent généralement à partir d’un an.
Implication du tronc cérébral dans la modulation de la douleur chronique neuropathique et nociplastique.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour étudier une région du tronc cérébral impliquée dans la douleur chronique, 528 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Une partie subit une chirurgie qui induit une douleur neuropathique, une autre des injections provoquant un modèle de fibromyalgie, et une chirurgie stéréotaxique d'environ une heure trente cible des neurones précis. Le résumé insiste sur l'analgésie et le suivi mis en place, tout en décrivant des modèles conçus pour maintenir une hypersensibilité douloureuse. Les tissus cérébraux sont prélevés après la mise à mort, une étape que le porteur juge "indispensable" pour vérifier le ciblage.
Objectifs
La douleur chronique touche des millions de personnes dans le monde et altère profondément la qualité de vie. Elle s'accompagne fréquemment de comorbidités invalidantes tels qu’une fatigue excessive et des troubles de l’humeur (anxiété, dépression) contribuant à une aggravation du tableau clinique. Malgré son impact considérable, les mécanismes cérébraux impliqués dans l'installation et le maintien de ces états douloureux persistants restent insuffisamment compris, et les traitements disponibles demeurent souvent inefficaces. Ce projet s'intéresse à une région du tronc cérébral impliquées dans le traitement des expériences aversives et la régulation de l'humeur via un contrôle inhibiteur sur les circuits dopaminergiques du cerveau. Des travaux récents suggèrent que cette région s'active en réponse à la douleur et que réduire son activité pourrait atténuer certaines réponses douloureuses. Cependant, son rôle dans la douleur chronique reste peu étudié. Afin de mieux comprendre le rôle de cette région, nous avons choisi d'explorer deux grandes formes de douleur chronique aux mécanismes distincts : la douleur neuropathique, causée par une lésion du système nerveux (comme dans certaines douleurs post-traumatiques ou post-chirurgicales), et la fibromyalgie, une maladie caractérisée par une douleur diffuse et persistante sans lésion identifiable, pour laquelle les options thérapeutiques sont aujourd'hui particulièrement limitées. Nous cherchons à déterminer si diminuer l'activité de cette région peut atténuer certaines manifestations de ces douleurs chroniques, telles que l'hypersensibilité à la douleur et les altérations émotionnelles associées. Pour cela, nous utilisons des souris génétiquement modifiées permettant de cibler et de réduire temporairement l'activité des neurones de cette région, puis nous évaluons l'impact de cette manipulation à l'aide de différents tests comportementaux utilisés pour étudier les symptômes liés à la douleur chronique. Ces travaux apporteront des données inédites sur l'implication de cette structure cérébrale dans différentes formes de douleur chronique. Si son implication dans ces processus est confirmée, cette région pourrait représenter une cible thérapeutique nouvelle et prometteuse pour des pathologies encore trop souvent insuffisamment soulagées.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera des données causales et spécifiques sur le rôle d'une région du tronc cérébral dans la douleur chronique. En combinant des modèles de douleur neuropathique et de fibromyalgie avec une approche permettant d'agir de façon ciblée sur les neurones de cette région, ces travaux permettront de déterminer si inactiver cette structure contribue à réduire l'hypersensibilité à la douleur, la fatigue et les troubles émotionnels associés. Sur le plan translationnel, si l'implication de cette région est confirmée, elle pourrait représenter une cible thérapeutique nouvelle pour des pathologies encore insuffisamment traitées.
Procédures
Une partie des animaux subira une courte intervention chirurgicale sous anesthésie générale (environ 30 minutes) permettant d'induire un modèle de douleur neuropathique. Une autre partie recevra des injections (durée :
Impact sur les animaux
Les interventions chirurgicales peuvent entraîner une gêne passagère et une légère perte de poids, généralement résorbées en quelques jours. Les animaux bénéficient d'une analgésie adaptée et d'un suivi attentif jusqu'à récupération complète. Les modèles utilisés induisent une hypersensibilité à certaines stimulations, reflétant les symptômes étudiés. Les animaux conservent leur mobilité et leur accès libre à la nourriture et à l'eau. Les manipulations peuvent générer un léger stress, limité par une habituation progressive des animaux à l'expérimentateur et à l'environnement de test avant le début des expériences. Les effets liés aux manipulations et aux chirurgies sont modérés et transitoires. Les phénotypes douloureux induits, bien que persistants par nature, restent d'intensité modérée et font l'objet d'une surveillance quotidienne.
Devenir
À l'issue des expériences, les animaux sont euthanasiés sous anesthésie profonde afin de permettre le prélèvement et l'analyse des tissus cérébraux. Cette étape est indispensable pour vérifier que la région du tronc cérébral ciblée a bien été atteinte lors de la chirurgie stéréotaxique.
Remplacement
Les objectifs de ce projet nécessitent d'étudier simultanément la sensibilité à la douleur, les performances motrices, la fatigue et les comportements émotionnels dans un organisme vivant et vigile. Ces dimensions ne peuvent pas être reproduites par des approches in vitro ou in silico, qui ne permettent pas de rendre compte de l'intégration de ces différentes composantes par un système nerveux central intact. Par ailleurs, la région cérébrale étudiée n'a été identifiée et caractérisée que chez les mammifères, ce qui ne permet pas d'utiliser des organismes non-mammifères. L'utilisation de la souris est en outre indispensable car elle permet, grâce à une lignée transgénique spécifique, de cibler sélectivement les neurones de cette région (ce qui n'est pas réalisable avec d'autres espèces à ce jour).
Réduction
Les expériences sont conçues de façon à utiliser le nombre minimal d'animaux nécessaire. Ce nombre a été calculé au plus juste en s'appuyant sur les données disponibles dans la littérature scientifique et sur des méthodes statistiques reconnues, tout en tenant compte des variations naturelles entre individus. Afin d'éviter toute expérience inutile, une phase préliminaire permet d'identifier les tests et les moments les plus pertinents avant de réaliser les expériences principales, limitant ainsi le nombre total de manipulations. Enfin, les expériences sont réalisées par petites séries successives, avec des bilans réguliers permettant d'arrêter dès que les résultats obtenus sont suffisants (sans nécessairement utiliser le nombre maximal d'animaux prévu.
Raffinement
Les souris sont hébergées en petits groupes dans des cages enrichies, contenant des tunnels, du coton, des bâtonnets à ronger et du matériel de nidification, afin qu'elles puissent se reposer, explorer et exprimer des comportements naturels. Avant toute expérience, les animaux sont habitués progressivement à l'expérimentateur, aux salles et aux dispositifs de test, afin de réduire le stress pouvant être associé à un environnement nouveau ou aux manipulations. Les interventions chirurgicales sont réalisées sous anesthésie et analgésie, et l'état de chaque animal est surveillé attentivement après l'intervention pour vérifier sa bonne récupération. Une alimentation enrichie est mise à disposition durant cette période. Les sessions expérimentales sont courtes et espacées de périodes de repos afin d'éviter la fatigue. Des seuils limites stricts sont appliqués lors des tests impliquant des stimulations afin d'éviter toute exposition excessive. Des points limites sont définis pour chaque procédure afin de garantir le bien-être des animaux : tout animal les atteignant ou présentant des signes de détresse fait l'objet d'une interruption immédiate des expériences et d'une prise en charge vétérinaire. L'état général de chaque animal est surveillé quotidiennement tout au long du projet. Toute nouvelle méthode validée permettant d'améliorer le confort des animaux ou de réduire la douleur sera intégrée au projet dès qu'elle sera disponible.
Choix des espèces
Le protocole requiert des souris génétiquement modifiées permettant de cibler spécifiquement les neurones de la zone étudiée ; cette ressource n’existe pas de façon équivalente dans d’autres espèces utilisables. Les études exigent des systèmes nerveux matures : les animaux seront adultes (en général ≥ 8 semaines en début de procédure, et ≤ 12 mois en fin de procédure), afin d’éviter les effets liés au développement ou au vieillissement.