Rongeurs

Soumises à une extraction puis à une réimplantation dentaire sous anesthésie, 40 souris seront toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Après l'intervention, elles peuvent souffrir d'une infection ou d'un saignement du site opératoire et éprouver des difficultés à se nourrir. Le maxillaire est prélevé quatre semaines plus tard, la mise à mort étant nécessaire à ces prélèvements. L'étude porte sur le rôle d'une protéine dans la régénération du ligament qui fixe la dent à l'os.

Objectifs

Le ligament parodontal est un tissu souple qui relie la dent à l’os de la mâchoire. Très fin (environ un quart de millimètre), il agit comme un véritable amortisseur et permet à la dent de résister aux forces exercées lors de la mastication. Grâce à un réseau de fibres et de cellules spécialisées, il joue un rôle essentiel dans le maintien de la dent et dans le renouvellement des tissus environnants, comme l’os et la surface de la racine dentaire. Il s’agit d’un tissu vivant, riche en nerfs et en vaisseaux sanguins, capable de s’adapter en permanence. Avec l’âge, les infections bactériennes ou certaines maladies chroniques inflammatoires, ce ligament s’amincit, se fragilise et perd progressivement ses fonctions. Cela peut conduire au déchaussement des dents. Dans certaines situations cliniques, notamment lors de la pose d’implants dentaires, ce ligament est totalement absent. Si les fibres et les cellules responsables de l’attachement de la dent et du renouvellement des tissus ont déjà été largement étudiées, les vaisseaux sanguins du ligament restent en revanche mal connus. Pourtant, ils sont indispensables à la vitalité du tissu : ils assurent l’apport de nutriments, le bon fonctionnement des nerfs, le renouvellement des cellules et le maintien de la structure du ligament. Il existe des molécules naturellement présentes dans ce tissu, qui jouent un rôle clé dans la formation et le maintien des vaisseaux sanguins. Lorsque ces molécules sont altérées, le ligament perd sa structure et sa capacité à fonctionner correctement. À partir de ces découvertes, nous avons développé une nouvelle molécule capable de stimuler la réparation des vaisseaux et de favoriser la régénération du tissu. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet réparateur de cette molécule sur la régénération du ligament parodontal. Pour cela, nous utiliserons un modèle expérimental chez la souris, basé sur l’extraction puis la réimplantation d’une dent. Les résultats obtenus avec cette nouvelle approche seront comparés à ceux d’un traitement de référence déjà utilisé en dentisterie, ainsi qu’à un support neutre servant de contrôle. Nous analyserons différents paramètres, tels que l’épaisseur du ligament, la dégradation de la racine dentaire ou la fusion anormale entre la dent et l’os. Des analyses microscopiques permettront également de suivre l’évolution du tissu pendant un mois et d’évaluer la qualité de sa régénération.

Bénéfices attendus

L’ambition du projet est d’exploiter des propriétés nouvelles mise en évidence pour une molécule recombinante pour améliorer les performances du ligament parodontal. Cela pourrait permettre une meilleure prise en charge des traumatismes dentaires, le développement d’implants dentaires bio-intégrés, l’optimisation des traitements orthodontiques et le traitement des maladies du ligament parodontal. De plus, le traitement utilisé actuellement est un produit d’origine animale dont le mode d’action est peu connu. Notre molécule recombinante pourrait remplacer ce produit pour réduire l’utilisation de produits d’origine animal.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale sous anesthésie avec extraction dentaire puis réimplantation avec ou sans la molécule d'intérêt. Cette intervention durera quelques minutes. Les analyses se feront 4 semaines après l'intervention chirurgicale.

Impact sur les animaux

Des douleurs d'intensités légères pourront être ressenties sur une durée limitée (quelques heures) lors des injections et après la chirurgie. Il y a également des risques d'infection ou de saignement du site opératoire au moment de l'extraction. Les souris pourront ensuite avoir des difficultés à se nourrir correctement.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés par du personnel formé afin que les prélèvements du maxillaire en vue des études histologiques prévues puissent être faits.

Remplacement

Ces expériences doivent être réalisées sur un modèle animal, car il n’est pas possible de reproduire en laboratoire toute la complexité d’un tissu vivant. Seules des études menées chez l’animal permettent d’observer des phénomènes essentiels comme la formation des vaisseaux sanguins et la cicatrisation, dans des conditions proches de celles du corps humain. Des tests en laboratoire ont déjà été réalisés pour mettre au point la molécule utilisée et définir la meilleure façon de l’employer. Toutefois, avant toute application chez l’humain, il est indispensable de passer par des études précliniques sur l’animal. Dans le cadre de ce projet, ces travaux seront menés chez le rongeur. Ces études permettent de vérifier si la molécule est efficace, si elle fonctionne correctement dans un organisme vivant et si elle favorise réellement la régénération du ligament qui maintient la dent. Les résultats obtenus chez l’animal constituent une étape clé avant toute évolution vers une application clinique.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé par un calcul de puissance statistique a priori. Des expérimentations in vitro ont déjà été menées sur cette nouvelle molécule pour déterminer la formulation optimale

Raffinement

Afin de limiter leur stress, une période d’adaptation est prévue pour les habituer progressivement aux déplacements vers la salle de chirurgie. Pendant l’intervention, les animaux seront endormis puis maintenus sous anesthésie de façon adaptée à la chirurgie réalisée dans la bouche. Des traitements contre la douleur seront administrés avant et après l’opération afin d’assurer leur confort. Un gel protecteur sera appliqué sur les yeux pendant l’intervention pour éviter toute sécheresse. À la fin de la chirurgie, une solution hydratante tiède sera administrée afin de prévenir la déshydratation. Le réveil se fera dans des conditions contrôlées, sur un support chauffant, et chaque animal sera placé temporairement dans une cage individuelle pour éviter tout risque lié au contact avec d’autres animaux encore éveillés. Une fois complètement réveillé, l’animal sera replacé dans sa cage habituelle. Après l’intervention, une alimentation molle sera proposée pour faciliter la prise de nourriture et éviter tout déplacement de la dent traitée. Une attention particulière sera également portée à une bonne hydratation. Les animaux seront surveillés quotidiennement pour veiller à ce que les points limites définis ne soient pas atteints. Une procédure précise de décisions sera mise en place par l'expérimentateur en collaboration avec le personnel de l'animalerie.

Choix des espèces

Le projet utilise un modèle murin déjà décrit. La molécule que nous voulons tester a déjà été utilisée dans le modèle de rétine postnatale de souris et s’est avéré fonctionnelle et sans effet délétère dans cette espèce. Les souris utilisées seront âgées de 4 semaines qui correspond à un âge ou le ligament parodontal est bien établi et fonctionnel.

12 700 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, l'un des plus gros effectifs du lot. Chaque animal subit une chirurgie cérébrale sous anesthésie, soit pour injecter une substance et implanter du matériel sur la tête, soit pour opérer des embryons chez des femelles gestantes, soit pour coudre une paupière et priver l'animal de la vue d'un œil. Une partie est ensuite entraînée à des tâches pendant des séances d'enregistrement de l'activité cérébrale. Les organes sont prélevés après la mise à mort, l'effectif de plus de douze mille souris restant sans justification dans le résumé.

Objectifs

Le cerveau est composé de nombreux types de neurones, organisés en réseaux qui remplissent différentes fonctions selon leur emplacement. Certaines zones du cerveau traitent les informations sensorielles de base, comme la vue ou le toucher, tandis que d’autres zones interviennent dans des tâches plus complexes, comme la réflexion ou la prise de décision. Cette organisation influence la façon dont le cerveau apprend et s’adapte, notamment pendant certaines périodes clés du développement. Dans notre projet, nous cherchons à comprendre comment différents types de neurones interagissent dans plusieurs régions du cerveau de la souris, en particulier quand l’animal perçoit son environnement ou réalise des tâches. Pour cela, nous utilisons des souris modifiées génétiquement permettant d’étudier différents types de neurones, et différentes techniques, comme l’injection de substances spécifiques, l’observation de l’activité cérébrale ou la manipulation de certains neurones. Ces méthodes nous permettront de voir comment les réseaux du cerveau changent et influencent le comportement. L’objectif final est de mieux comprendre comment la diversité des neurones et de leurs connexions contribue au fonctionnement du cerveau et à l’apparition de certaines maladies.

Bénéfices attendus

Au niveau scientifique ce projet pourrait permettre d’obtenir des connaissances fondamentales sur les fonctions cérébrales et par conséquent aider à comprendre les mécanismes sous-jacents à certains troubles neurologiques et psychiatriques. A plus long terme ce projet pourrait donc contribuer à identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques pour ces pathologies et par conséquent améliorer la prise en charge des patients.

Procédures

Tous les animaux auront une chirurgie réalisée sous anesthésie générale et analgésie adaptée (une fois, durée 1h maximum). Les chirurgies consisteront soit à injecter une substance au niveau du cerveau pour induire des modifications génétiques puis implanter du matériel sur la tête de l’animal, soit à opérer des femelles gestantes pour réaliser ces mêmes injections chez leurs embryons, soit à induire une déprivation sensorielle par la fermeture d’un œil. Une partie des animaux ayant reçu l’injection participeront ensuite à des expériences d’enregistrement de l’activité cérébrale. Pour cela ils seront entrainés à raison de 3 séances par jour pendant 1 semaine en augmentant progressivement le temps de chaque séance (de quelques minutes à 1h). Ils réaliseront ensuite soit 1 séance unique de 2.5h (procédure 4) soit 1 séance d’enregistrement de 45 minutes par jour, avec 4 séances par semaine, pendant 2 mois maximum (procédure 3). Les animaux faisant la séance unique devront être anesthésiés avant les enregistrements pour mettre en place le dispositif d’enregistrement nécessaire pour enregistrer l’activité cérébrale (une fois, sous anesthésie générale, durée inférieure à 15 minutes). Une autre partie des animaux ayant reçu l’injection participera à 4 tests comportementaux vigiles répartis sur 8 semaines maximum. Le premier test permettra d’évaluer l’attrait de la souris pour la nouveauté (1 session de 10 minutes par jour pendant 4 jours). Le deuxième permettra d’évaluer la peur innée (1 session de 30 minutes maximum). Le troisième permettra d’évaluer les capacités visuelles des animaux (3 sessions de 15 minutes maximum, max 3 jours). Le quatrième permettra d’évaluer la perception de la profondeur et les réponses comportementales liées à la peur des hauteurs, un comportement inné chez les rongeurs (1 sessions de 5 minutes maximum, une fois). Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire. Une partie d’entre eux sera euthanasiée au cours d’une chirurgie sous anesthésie générale et analgésie adaptée.

Impact sur les animaux

Les chirurgies seront associées à un risque de douleurs post-opératoire. Il existe un risque de légers saignements au cours de la chirurgie. Il est possible que les heures suivant la chirurgie, l'animal présente des signes d'activité spontanée réduite. Les chirurgies réalisées sur les souriceaux impliqueront également un risque de rejet par leur mère. La ligature des paupières générera une gêne et un inconfort pour les animaux en post-opératoire. L’anesthésie générale mise en place pour les chirurgies engendrera un risque d’hypothermie, de sécheresse oculaire et de dépression cardiorespiratoire. L’implantation de matériel sur la tête des animaux pourra générer une gêne et un inconfort dus à l’encombrement spatial qu’il représente. Les tests comportementaux impliqueront un stress pour les animaux en lien avec le changement d’environnement, les tests comportementaux en eux-mêmes et la nécessité d’avoir la tête fixée pour une partie des tests. De manière générale la manipulation des animaux peut engendrer un stress.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin d’expérience soit pour réaliser des prélèvements et analyses post-mortem pour répondre à notre question scientifique, soit parce qu’il ne sera pas possible de les réutiliser en raison des manipulations génétiques déjà réalisées.

Remplacement

Il n’existe pas d’alternative à l’utilisation d’animaux pour ces expériences, car aucun modèle artificiel ne permet de reproduire fidèlement le fonctionnement réel du cerveau. Notre objectif étant de comprendre comment différents types de neurones interagissent dans plusieurs régions du cerveau, il est essentiel d’observer directement ces circuits dans un cerveau intact. Les cellules cultivées en laboratoire ne reflètent pas avec précision la complexité des connexions entre neurones. Il n'existe aucune lignée cellulaire qui récapitule avec précision la physiologie des neurones des animaux, et comme nos expériences étudient les interconnexions entre les neurones qui se produisent dans le cerveau intact il est donc nécessaire d’avoir recours à un animal vivant pour les réaliser. De plus, il n'existe aucun modèle remplaçant l'utilisation d'animaux qui permettrait d'étudier les propriétés du réseau dans le cerveau entier d’un animal vigile.

Réduction

Le nombre total d'animaux impliqués dans ce projet (12 700) est calculé en tenant compte des mesures de réduction. Notre choix des effectifs par groupe est basé sur des études précédentes et est cohérent avec ceux généralement employés dans le domaine. La taille de chaque groupe sera déterminée par l'utilisation de tests statistiques appropriés, y compris le calcul de puissance. La taille réelle de l'échantillon, et donc la signification statistique, dépendra de la variabilité de la lecture biologique. Il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce, avec accès à l’eau et à la nourriture en illimité et un enrichissement environnemental adapté. Ils seront observés quotidiennement, en cas d’anomalie celle-ci sera déclarée à la structure chargée du bien-être animal, au vétérinaire et à l’équipe de recherche pour mettre en place une prise en charge adaptée pour l’animal. Les procédures chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale avec une analgésie adaptée. La gestion du risque d’hypothermie est assurée par l’utilisation d’un tapis chauffant thermorégulé et de chambres d’induction et de réveil chauffées. Un gel de protection oculaire sera appliqué sur les yeux des animaux anesthésiés pour éviter toute sécheresse oculaire. Le réveil des animaux sera surveillé et un suivi post-opératoire renforcé est réalisé pendant 3 jours, tous les animaux seront examinés quotidiennement. Concernant la chirurgie impliquant des souriceaux nous vérifierons de manière spécifique la bonne reprise en charge des petits par leur mère. Des points limites sont définis et respectés de manière à éviter toute souffrance des animaux. Pendant les 24h minimums suivants la chirurgie les animaux auront accès à de l’eau gélifiée et de la nourriture directement dans le fond de la cage pour faciliter leur récupération. Les animaux impliqués dans les tests comportementaux ou les enregistrements cérébraux post-chirurgie bénéficieront d’une période de récupération de 4 jours minimum avant tout autre geste. Pour les tests comportementaux et sessions d’enregistrements les animaux auront une période d’habituation aux tests et à l’environnement de test. Ils auront également des périodes de repos entre les différents tests comportementaux. L’euthanasie médicamenteuse s’effectuera après une sédation de l’animal pour réduire le stress et la douleur qu’elle pourrait générer.

Choix des espèces

Les propriétés de base des microcircuits neuronaux chez la souris sont similaires à celles d’autres mammifères. Actuellement, seuls les modèles murins nous permettent de visualiser les types de neurones que nous voulons étudier. Le développement du cerveau des souris est très bien caractérisé, ce qui facilite les études anatomiques et fonctionnelles. Les approches expérimentales multiples réalisées chez la souris permettent une analyse complète allant du comportement jusqu’à l’activité d’un seul neurone. Les souris peuvent être génétiquement modifiées facilement (bonne connaissance de leur patrimoine génétique et outils disponibles pour le modifier) révélant ainsi la fonction de gènes spécifiques. Ainsi, dans ce projet nous pourrons utiliser plusieurs lignées de souris génétiquement modifiées nous permettant d’étudier différentes cellules spécifiques et leurs interactions. Une partie des procédures nécessitent des interventions chirurgicales qui ne peuvent être pratiquées que sur des animaux adultes, nous utiliserons donc dans ce cas des animaux de plus de 30 jours, ou de plus de 60 jours pour le cas des femelles devant être gestantes donc sexuellement matures. Nous réaliserons également nos injections pour l’induction de modification génétique sur des embryons ou des souriceaux (3 jours) afin de garantir une large diffusion de la modification dans le cerveau. Cela permet d’assurer une expression uniforme et une couverture optimale des régions cérébrales ciblées pour nos études fonctionnelles et anatomiques.

Greffées chirurgicalement de cellules cancéreuses directement dans le pancréas, 432 souris seront toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. La tumeur peut se disséminer dans l'abdomen et provoquer une ascite ainsi qu'une dégradation de l'état général. Chaque animal reçoit ensuite plusieurs traitements, une chimiothérapie puis jusqu'à six injections d'immunothérapie. Les tumeurs sont prélevées après la mise à mort, l'étude portant sur la fibrose qui bloque l'accès des cellules immunitaires à la tumeur.

Objectifs

Le cancer du pancréas fait partie des cancers les plus fréquents et les plus meurtriers. Son traitement repose sur l’utilisation de chimiothérapies, qui malheureusement ne conduisent que rarement à une rémission totale du patient, en particulier dans les cas de cancers avancés. Il a été montré que le système immunitaire jouait un rôle important dans la réponse aux traitements par chimiothérapie. Ainsi, l’immunothérapie a été associée à la chimiothérapie afin d’augmenter son efficacité dans de nombreux cancers. Le cancer du pancréas est un cancer typiquement très riche en fibrose qui bloque l’accès des cellules immunitaires à la tumeur, contribuant à la résistance au traitement. Il apparait donc important d’étudier les mécanismes responsables de cette fibrose. Le but du projet est d’évaluer les effets du blocage de la fibrose sur l’efficacité antitumorale des chimio-immunothérapies, dans un modèle de cancer chez la souris. Cette étude nous permettra également de comprendre les mécanismes de résistance aux traitements actuellement utilisés en clinique.

Bénéfices attendus

Les traitements combinant chimiothérapie et immunothérapie ont montré une réelle efficacité pour de nombreux cancers. En ce qui concerne le cancer du pancréas ces traitements sont totalement inefficaces chez l’Homme. L’intérêt de ce travail est donc de mieux comprendre les mécanismes responsables de cette résistance dans les tumeurs générées dans le pancréas. Notre travail précédent sur des tumeurs du pancréas générées en sous-cutané montre un réel impact de cette voie sur la réponse à la chimio-immunothérapie. Mais ces résultats doivent être confirmés sur des tumeurs localisées au sein de l’organe, pour être plus proche de la maladie chez l’Homme. Ainsi, comparer ce modèle nous permettra de savoir si nous pouvons continuer à utiliser le modèle sous-cutané (moins invasif pour la souris) ou en cas de discordance de résultats, nous devons utiliser seulement le modèle intra-pancréatique (plus représentatif de la réalité). Cela nous permettrait à l’avenir de ne plus réaliser des expériences inutiles sur le modèle sous-cutané. L’identification du rôle de l’inflammation dans la résistance aux traitements aura des avantages à court terme, comme la validation (ou non) de nos résultats précédents et à long terme en confirmant l’intérêt de trouver et tester des molécules bloquant cette voie chez la souris (futur projet) puis chez l’Homme.

Procédures

3 interventions : - Implantation chirurgicale de cellules de cancer du pancréas murines dans le pancréas : - Geste réalisé sous anesthésie - Une seule implantation chirurgicale par animal - Durée : 15 minutes - Nombre de souris : 432 souris - Traitements par chimiothérapie ou solution contrôle : - Geste réalisé sur animal vigile - Une seule injection par animal - Durée : 1 minute - Nombre de souris : 432 souris - Traitements par immunothérapies, agoniste RXR ou solution contrôle : - Geste réalisé sur animal vigil - 6 injections par animal - Durée : 1 minute - Nombre de souris : 432 souris - Injection des traitements anti-douleurs : - Geste réalisé sur animal vigil - Une seule injection par animal - Durée : 1 minute - Nombre de souris : 432 souris - Injection des traitements anti-inflammatoire : - Geste réalisé sur animal vigil - Quatre injections par animal - Durée : 1 minute - Nombre de souris : 432 souris

Impact sur les animaux

- Injection de cellules tumorales dans le pancréas : croissance d’une masse tumorale intra-abdominale. Possible dissémination de la maladie au niveau du péritoine avec apparition d’ascite. -Possible altération de l’état général du fait de la pathologie cancéreuse induite. - Éventuels effets secondaires des traitements anti-cancéreux : les chimiothérapies utilisées ont déjà fait l’objet de recherches sur l’animal, il n’est pas attendu d’effet secondaire important. - Possibles complications au niveau du site opératoire et de la cicatrice : infection, plaie, douleur.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever les tumeurs et réaliser des expériences.

Remplacement

Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, pour être prédictifs, l’évaluation de l’efficacité ou de l’échec de nouvelles combinaisons thérapeutiques en oncologie doit être réalisée sur les organismes vivants. Nous réalisons à ces fins des études translationnelles sur des modèles d‘animaux greffés avec des cellules tumorales.

Réduction

- Les expériences seront réalisées sur des petits effectifs ce qui permet donc de réduire le nombre d’animaux de l’étude. De plus, une étape de faisabilité pour évaluer la pertinence des modèles a déjà été réalisée dans le laboratoire. - Les expériences visant à étudier la taille des tumeurs et les infiltrats immunitaires seront réalisées sur les mêmes souris. - Les différents modèles utilisés dans ce projet sont nécessaires. En effet, selon les mutations intrinsèques des cellules cancéreuses utilisées, le microenvironnement tumoral sera différent et affectera par conséquent la réponse aux traitements.

Raffinement

Les animaux seront habitués aux techniques de préhension. Les animaux sont suivis au minimum 3 fois par semaine par des techniciens responsables d’études et quotidiennement par les personnels animaliers. Une anesthésie générale gazeuse sera réalisée avant chaque greffe et entretenue tout au long de la procédure, avec contrôle de l’absence de réflexe de la patte et surveillance de la fréquence respiratoire et protection de la cornée avec un collyre ophtalmique. Pour l’analgésie, des anti-inflammatoires seront administrés en sous-cutanée en pré-opératoire à distance du site opératoire et prolongé pendant 48h après l’opération, ainsi que des anesthésiques locaux au niveau du site opératoire. La surveillance post-interventionnelle sera réalisée 2 fois par jour durant les 3 premiers jours, puis quotidiennement pendant 2 jours et enfin espacée à 3 fois par semaine. L’apparition des points limites sera quotidiennement recherchée.

Choix des espèces

Les souris présentent des caractéristiques physiologiques qui permettent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Diverses souches de souris sont disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux, indispensables à la recherche préclinique en immuno-oncologie. De plus, l’existence de souris génétiquement modifiées renforce le choix de cette espèce. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 8 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature et un poids corporel > 20g.

Pour valider un système d'imagerie censé suivre les tumeurs sans les injections de substrat qu'exigent les appareils commerciaux, 120 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chaque animal reçoit une greffe de cellules tumorales, puis passe sous imagerie sous anesthésie deux fois par semaine pendant six semaines au maximum. Le porteur met en avant l'intérêt technique et le "coût d'achat élevé" des systèmes existants. Les tumeurs et les ganglions sont prélevés après la mise à mort, au plus tard quarante-deux jours après la greffe.

Objectifs

L’imagerie par bioluminescence in vivo est un outil utilisé en cancérologie préclinique permettant le suivi longitudinal non invasif de la croissance tumorale, de la dissémination métastatique et de la réponse thérapeutique. Les systèmes commerciaux actuels reposent sur des luciférases nécessitant des injections répétées de substrats exogènes, générant des problèmes d'utilisation et un coût d'achat élevé. Notre nouveau système de bioluminescence est optimisé pour être autonome permettant un suivi continu de la croissance tumorale sans injection de substrat. Cette technologie a déjà été validée in vitro dans des lignées cellulaires humaines et murines. Le projet vise à développer et valider, chez la souris, ce nouveau système de bioluminescence autonome. L’objectif de ce projet est de démontrer que ce nouveau système de bioluminescence produit un signal lumineux suffisamment intense pour permettre la détection fiable des tumeurs in vivo en sous-cutané, tout en vérifiant que les tumeurs rendues luminescentes conservent les mêmes caractéristiques biologiques que les tumeurs d’origine (croissance, agressivité).

Bénéfices attendus

Ce projet constitue une preuve de concept démontrant qu'un système de bioluminescence autonome permet un suivi tumoral in vivo continu, sensible et reproductible, sans administration répétée de substrat exogène. Il établira une corrélation robuste entre l'intensité/dynamique du signal luminescent et la cinétique tumorale, tout en confirmant l'absence d'altération des caractéristiques biologiques essentielles des tumeurs (croissance, morphologie). Sur le plan méthodologique, le projet vise à établir un nouveau standard d’imagerie préclinique en oncologie, en réduisant le recours aux injections répétées de substrat et à certaines procédures invasives tout en améliorant la qualité des données longitudinales (mesures fréquentes sur un même individu).

Procédures

- Injection de cellules tumorales 1 fois, 30 sec - Mesure de la taille de la tumeur : 2x/semaine pendant 6 semaines maximum, 1 min - Anesthésie et imagerie de la tumeur (5 min maximum) : 2x/semaine pendant 6 semaines maximum - Pesée des souris : 2x/semaine pendant 6 semaines maximum, 30 sec

Impact sur les animaux

- Douleur de courte durée lors de l'injection par voie sous-cutanée sous anesthésie isoflurane de cellules tumorales - Gène potentielle lors du développement de la tumeur. - stress lié aux anesthésies lors de l'imagerie, et aux contentions lors de la mesure du volume tumoral et pesées. - Gêne à la locomotion, nuisances possibles si le volume tumoral au site d'injection atteint le point limite.

Devenir

En fin de procédure, soit au maximum 42 jours post-implantation si aucun point limite n'a été atteint avant, tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement et analyse des tumeurs et ganglions drainants.

Remplacement

Avant toute expérimentation animale, un travail approfondi de sélection et de caractérisation a été effectué in vitro et en bio-impression 3D pour mieux mimer la croissance tumorale et limiter le passage à l’animal aux seuls clones répondant à des critères stricts. L’utilisation de l’animal n’intervient qu’après épuisement des possibilités d’optimisation in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux par condition est défini sur la base d’un compromis entre puissance statistique et minimisation des effectifs. Le recours à l’imagerie bioluminescente non invasive, répétée chez les mêmes animaux, augmente la quantité de données recueillies par individu, permettant ainsi de réduire le nombre total d’animaux. De plus, l’utilisation d’un logiciel de statistiques nous permet de calculer le nombre de souris strictement nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Avant toute manipulation, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation et d’habituation au(x)manipulateur(s) pendant 7 jours. Les expérimentateurs sont expérimentés et sont à même de détecter très rapidement le moindre signe de douleur afin d’appliquer les meilleures mesures. L’état général, le comportement (activité, isolement …), les critères physiques (poils hérissés, dos vouté) ou le moindre signe de douleur sera évalué et annoté sur une fiche de suivi, et comparé à la grille de score de référence pour prendre les mesures nécessaires afin que le bien-être animal soit respecté. Un anti-douleur sera injecté lors de la détection des signes de douleur selon la grille de scoring. Chaque cage présentera des enrichissements (coton de nidation, tunnels pour jeux) régulièrement renouvelés. Les copeaux de litière seront remplacés par de la cellulose afin d’être moins irritants pour les souris présentant des tumeurs et éviter les nécroses.

Choix des espèces

Les souches murines sont particulièrement adaptées pour l'étude des tumeurs. La petite taille des souris est adaptée à l'imager utilisé pour le suivi du signal de bioluminescence. Nous utiliserons de jeunes adultes pour favoriser la prise tumorale soit 6 à 8 semaines.

Ponctionnées chaque semaine à la jugulaire sous anesthésie pendant dix à quatorze semaines, 440 souris humanisées vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent un vecteur viral, des cellules immunitaires humaines, puis des injections répétées de lipopolysaccharide et d'interleukine pour moduler la réponse immunitaire. Le résumé ne décrit comme atteinte qu'une "légère douleur" au point de piqûre, sans mention des effets des produits inflammatoires injectés. Les animaux sont tués à la fin pour des analyses post-mortem.

Objectifs

La thérapie génique consiste à introduire un gène thérapeutique dans des cellules pour traiter une maladie. Pour véhiculer ce gène, les vecteurs viraux, et en particulier les virus adéno-associés (AAVr) constituent des outils de choix. Une seule injection d’AAVr permet une expression à long terme du gène thérapeutique. Néanmoins, malgré de récents succès, un des facteurs majeurs pouvant limiter l’efficacité du transfert de gène in vivo est la réponse immunitaire dirigée contre ce vecteur. Cette réponse immune délétère s'explique, en partie, par le fait que les humains sont naturellement infectés au cours de leur vie par des virus AAV sauvages. L’initiation ou non de cette réponse immune cellulaire anti-AAV semble être dépendante de nombreux facteurs et son impact sur l’efficacité du transfert de gène reste à ce jour difficile à prédire. Au laboratoire, nous avons récemment développé un modèle animal pour mimer la réponse préexistante anti-AAV. Ce modèle semble reproduire la réponse immune anti-AAV observée chez l’humain. Le profil immunologique du patient peut également être un facteur déterminant dans l’initiation de la réponse immune anti-AAVr. Le modèle ainsi développé va nous permettre de déterminer une signature immunologique pouvant déclencher un rejet du traitement et de développer des stratégies d’immunomodulation ciblée. Ce modèle animal ouvre un champ d’applications important pour aider au développement de médicaments de thérapie génique innovants plus efficaces et plus sûrs sur le plan immunologique pour prévenir un rejet du transfert de gène. Ainsi, fort de ces constats, nous proposons de tester, dans notre modèle de souris humanisées, différentes signatures immunitaires identifiées chez des donneurs sains et de développer une stratégie pour moduler la réponse immunitaire anti-AAV préexistante et ainsi prévenir le rejet lié au transfert de gène. L’objectif scientifique de ce nouveau projet est de mieux comprendre les réponses immunitaires responsables du rejet du traitement et de développer une stratégie pour moduler cette réponse.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux caractériser les cellules immunitaires responsables du rejet du transgène et de développer une stratégie dans le but de prévenir la réponse immunitaire anti-vecteur. In fine, ce projet permettra de développer des traitements de thérapie génique à l’aide d’AAVr, plus sûrs et plus efficaces.

Procédures

Un prélèvement sanguin par semaine sera réalisé pendant 10 semaines pour les animaux inclus dans la caractérisation de la réponse immunitaire et 14 semaines pour ceux inclus dans la stratégie d’immunomodulation. Les animaux seront anesthésiés et le sang sera prélevé au niveau de la jugulaire. La durée totale d’intervention est estimée à environ 3 mn. Chaque animal sera injecté 2 fois en intraveineuse dans la veine caudale en vigile. L’une pour l’injection d’AAVr à J 0, l’autre pour les cellules immunitaires humaines à J+1. La durée totale d’intervention est d’environ 3 mn. Les animaux recevront 3 injections en intra-péritonéale de lipo-poly-saccharide à J+1, J+2, J+3 après l’injection en intraveineuse du vecteur. Une injection en intra-péritonéale se fait en moins d’une minute. Des injections en intra-péritonéale d’interleukine-15 seront réalisées 2 fois par semaine pendant les 10 semaines de suivi du projet. Pour les animaux inclus dans la stratégie d’immunomodulation anti-CD45RC, l’anticorps anti-CD45RC ou l’anticorps contrôle seront injectés par voie intrapéritonéale 3 fois par semaine pendant 4 semaines. Compte tenu de la fréquence, les animaux ne seront pas anesthésiés. En cas de stress marqué, dû à la répétition des procédures, les animaux seront anesthésiés en gazeuse (isoflurane : induction 5% puis 2%)

Impact sur les animaux

Pour les prélèvements sanguins, les animaux seront sous anesthésies gazeuse. Les animaux ressentiront au réveil, une légère douleur au point du prélèvement sanguin due à la pénétration de l’aiguille. Pour les injections en intraveineuse et en Intra péritonéale, les souris seront maintenues en contention pour effectuer l’administration. Les animaux ressentiront une légère douleur au point d’administration due à la pénétration de l’aiguille.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure pour des études post-mortem.

Remplacement

L'utilisation de méthodes alternatives tels que des techniques in vitro ou in silico ne permettent pas de rendre compte de la réponse immunitaire dans son ensemble, l'emploi d'un organisme vivant est donc nécessaire. La souris est un modèle de choix par sa petite taille, ses performances de reproduction et sa durée de vie. Jusqu’à présent aucun modèle animal n’a pu prédire une réponse immune préexistante contre le vecteur AAV car la plupart ne sont pas des hôtes naturels de l’AAV. Néanmoins, dans plusieurs essais cliniques cette réponse a été mise en évidence et a conduit à la perte de l’efficacité du traitement. Le récent développement d’un modèle de souris humanisées nous a permis de développer un modèle pertinent mimant cette immunité préexistante en laboratoire. Ce modèle animal pourra nous permettre de développer des stratégies pour moduler la réponse immune et permettre le maintien de l’expression du gène thérapeutique à long terme.

Réduction

Chez l’humain, l’intensité de la réponse immune est variable, ainsi pour que les résultats soient statistiquement interprétables nous envisageons au maximum d’injecter les cellules de 10 donneurs humains par stratégie . Au maximum, 440 animaux seront utilisés dans le projet. Si la variabilité de réponse est faible entre les donneurs et donc que les résultats sont statistiquement interprétables avant d’atteindre les 10 donneurs, le protocole sera arrêté pour ne pas mettre à mort des animaux supplémentaires. Ce nombre a été calculé statistiquement et permet de réduire le nombre d'animaux au maximum tout en obtenant des résultats probants.

Raffinement

Le bien-être animal passera par : 1) de bonnes conditions d'hébergement selon la réglementation en vigueur (animaux hébergés à plusieurs par cage, dans la limite réglementaire ; accès à la nourriture et à l’eau ad libitum) avec un enrichissement du milieu (mise à disposition d’éléments d'enrichissement comme des carrés de coton, des tunnels en carton, des sizzle dry (papier) et des morceaux de bois) 2) un suivi régulier des animaux (observations quotidiennes, pesées régulières, analyse du comportement) 3) l'instauration de points limites pertinents et la mise en place de mesures adaptées si nécessaire (anesthésies, traitements analgésiques ou autre, ou euthanasie si pas d'autres alternatives). 4) Une grille de scoring de la douleur sera mise en place dès que celle-ci s'avère nécessaire afin de pouvoir détecter précocement tout point limite et mettre en place les actions adéquates. 5) la mise en place de mesures adaptées en fonction des interventions éventuelles (anesthésie et analgésie si nécessaire).

Choix des espèces

Dans les études de thérapie génique et d’immunologie, il est nécessaire d’utiliser des modèles animaux, en particulier des mammifères, afin d’obtenir des résultats pertinents pour l’humain. La souris est très utilisée, notamment parce qu’il existe des modèles dits « humanisés » qui reproduisent en partie le système immunitaire humain. De plus, il est facile de constituer des groupes suffisamment nombreux pour réaliser des analyses statistiques fiables. Ce modèle est particulièrement adapté au transfert de cellules humaines (appelé transfert adoptif), car ces cellules peuvent survivre et fonctionner correctement chez la souris. Cependant, pour que ces cellules reconnaissent correctement leur environnement, il est indispensable que la souris exprime une molécule spécifique du système immunitaire humain : HLA-A2.1. En effet, les cellules humaines utilisées sont capables de reconnaître uniquement cet allèle. Enfin, comme une réponse immunitaire préexistante contre les vecteurs AAV a déjà été démontrée dans ce modèle de souris NSG HLA-A2, celui-ci est particulièrement pertinent pour tester et développer de nouvelles stratégies visant à moduler ou contrôler la réponse immunitaire. Les souris seront injectées entre 8 et 14 semaines d’âge. A ce stade, les tissus de soutien et les niches nécessaires au support et à la survie des cellules adoptives transférées sont suffisamment développés pour permettre le succès du transfert adoptif.

Injectées avec des molécules de chimiothérapie, jusqu'à une administration quotidienne pendant cinq jours, 3 840 souris seront toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une partie des traitements est infligée à des souriceaux, du cinquième au dixième jour après la naissance. Le résumé annonce une perte de poids "légère et temporaire" de deux à trois jours comme principal effet, sans autre détail sur les atteintes. Les organes sont prélevés après la mise à mort, pour analyser les effets de l'invalidation d'un gène sur la fertilité.

Objectifs

L'objectif est d’étudier le rôle de la protéine PAXBP1 dans la physiologie des cellules germinales des gonades et son rôle dans la reprotoxicité induite par des traitement de chimiothérapie afin d’analyser la survenue des troubles de la fertilité.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra : * De mettre en évidence le rôle clé de PAXBP1 dans la physiologie des cellules germinales et leur sensibilité aux traitements anti-cancéreux de chimiothérapies. * Mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l’infertilité * Décrypter les mécanismes moléculaires sous-jacents impliqués dans les effets secondaires à long terme des médicaments sur la fertilité. * Ouvrir des pistes de traitements pour minimiser les effets reprotoxiques des chimiothérapies

Procédures

Les nuisances pour les animaux seront la préhension par l’expérimentateur et les injections des molécules de chimiothérapie. Au maximum, les souris subiront une injection quotidienne pendant 5 jours. Ces interventions seront réalisées du 5ième jour postnatal jusqu'au 10ième jour pour les traitements en période néonatale, ou bien pendant 5 jours consécutifs à 3 mois pour les traitements à l'âge adulte.

Impact sur les animaux

Les traitements par chimiothérapie chez la souris adulte pourraient conduire à une perte légère et temporaire perte de poids à partir du troisième jour du traitement. Ces effets ont une durée de 2 à 3 jours.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort pour le prélévement des organes afin d'analyser les impacts de l'invalidation du gène PAXBP1 lors de traitement de chimiothérapie sur la fonction de reproduction.

Remplacement

Le remplacement par des approches alternatives n'est pas possible car aucune approche ne permet à l'heure actuelle d'analyser les mécanismes des interactions cellulaires intra et inter-organes pouvant contrôler le développement et le maintien de la spermatogenèse sur le long terme (plusieurs semaines/mois) et d’analyser les impacts sur la santé de la descendance.

Réduction

L’analyse en temps réel des données recueillies à chaque expérience nous permettra, si nécessaire, d’ajuster le protocole : certains timings d’étude pourront être supprimés sur les répétitions prévues, afin de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Notre stratégie de repose sur différents éléments reprenant les points clés : Nous minimiserons les animaux pouvant présenter des phénotypes dommageables grâce à la génération d’animaux présentant une invalidation ciblée de la protéine d’intérêt dans un seul type cellulaire. Afin de limiter le stress, les animaux seront maintenus en groupes sociaux (5 au maximum); Les animaux seront hébergés en présence d’environnement contrôlé et enrichi (tunnel, coton…) avec un accès illimité à la nourriture et la boisson. Nous veillerons au bien- être des animaux par l’ajout de plaques de papier à ronger et de maisons en carton ou polycarbonate. De plus, du coton sera ajouté dans les cages pour faciliter le maintien de la température corporelle. Pour les transferts des souris d'une cage à l'autre nous utiliserons des méthodes low stress (Cupping). Pour les observations, les souris seront manipulées à la suite de leur entrée dans un petit tube afin d’être déposé sur la grille puis manipulées. Le suivi régulier des animaux nous permettra au mieux d’identifier les signes d’alerte afin de réaliser des mesures visant à minimiser la douleur, souffrance ou angoisse induite par les contraintes liées aux procédures expérimentales. Ce rythme de surveillance sera accru si un animal devait présenter des signes importants de souffrance, douleur. Si un animal devait présenter des signes de douleur, l’animal sera isolé et un analgésique sera administré. En ce sens, nous avons défini des points limites spécifiques et adaptés pour les expériences menées.

Choix des espèces

Choix des espèces. Nous utiliserons des souris car les modèles génétiquement modifiés pour PAXBP1 sont disponibles permettant ainsi l'analyse de l'impact de la perte du gène PAXBP1 lors de traitement anti-cancéreux sur la fertilité et la physiologie des gonades. La souris présente une physiologie testiculaire proche de l’espèce humaine et elle est un modèle mammifère de choix pour réaliser des études au cours du développement de la gonade et pour l'analyse de la fertilité. Ainsi, ce travail se base sur les points communs de la physiologie des cellules germinales entre les espèces : dans la mise en place des cellules souches dans la période prépubère, l’entrée en méiose à la puberté et la production des spermatozoïdes de la puberté à la mort de l’individu. De plus, le gène étudié ainsi que la fonction de la protéine qui en découle sont très proches entre différentes espèces notamment l’homme et la souris. Choix des stades: Pour l'analyse de l'impact des chimiothérapies, nous travaillerons sur des souris mâles traités aux chimiothérapies lors de la période néonatale (traitement de 5 à 10 jours). Pour l'analyse des impacts sur la physiologie testiculaire, nous suivrons les souris mâles à différents âges. Cela aura pour but d'analyser la mise en place des cellules germinales (de P5 à P15 post-natal), leur maintien de la puberté à l'âge adulte (de 20 jours à 365 jours), dans le but de définir l'impact sur la fertilité. Pour cela, nous mettrons à mort des souris à P6, P10, P15, P20, P40, P60, P90, P180. Pour l’analyse chez les souris adultes, ces dernières seront mises à mort à différents temps après traitement afin de définir l'impact de PAXBP1 dans la réponse aux molécules de chimiothérapie sur la perte des cellules germinales et de la fertilité puis pour l'analyse des capacités régénératives de cellules germinales et le retour de la fertilité. AInsi, nous mettrons à mort des souris 1jour, 4 jours, 7 jours, 10 jours, 20 jours, 60 jours, 90 jours et 180 jours après le début du traitement.

3 780 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, certaines recevant jusqu'à soixante-huit injections sur un mois. Elles servent à tester deux substances censées bloquer une molécule impliquée dans la mémoire, contre la maladie d'Alzheimer. Les tests comportementaux mesurent la mémoire et l'anxiété, l'un d'eux pouvant provoquer une douleur modérée de quelques secondes. La mise à mort permet de prélever des tissus, dont certains à l'état frais pour des analyses ex vivo.

Objectifs

L’objectif de cette étude est de tester des substances pouvant agir comme traitement dans le cerveau de la souris, afin de lutter contre la maladie d’Alzheimer, en particulier contre les troubles de la mémoire. Deux substances ont été choisies car elles sont capables de bloquer l’action d’une petite molécule naturellement produite par le cerveau. Cette molécule peut modifier l’activité des neurones (les cellules du cerveau) ainsi que la structure des connexions entre ces cellules. Elle agit en se fixant sur un type particulier de “récepteur” (une sorte de capteur situé sur les neurones), qui joue un rôle important dans la transmission des informations et la mémoire. On a observé que cette molécule est présente en plus grande quantité chez les personnes atteintes de la maladie d’Alzheimer, et qu’elle contribue à certains symptômes, comme les pertes de mémoire et les perturbations de l’activité du cerveau. Le but de ce projet est donc de vérifier si les deux substances sélectionnées peuvent devenir des traitements efficaces contre la maladie d’Alzheimer, en les testant sur trois modèles de souris reproduisant cette maladie.

Bénéfices attendus

Dans le monde, environ 50 millions de personnes sont touchées par des troubles importants de la mémoire et du raisonnement, dont la maladie d’Alzheimer est la forme la plus fréquente. Cette maladie concerne environ une personne sur trois après 80 ans, et le nombre de personnes touchées augmente avec le vieillissement de la population. Aujourd’hui, il n’existe pas encore de traitement permettant de guérir cette maladie. Trouver de nouvelles solutions est donc une priorité majeure pour la santé publique. Notre équipe de recherche s’intéresse à une petite molécule présente dans le cerveau qui semble jouer un rôle important dans la communication entre les cellules du cerveau. Cette molécule est retrouvée en plus grande quantité chez les personnes atteintes de la maladie d’Alzheimer. Dans ce projet, nous allons tester deux substances pour voir si elles peuvent corriger les problèmes de communication entre les cellules du cerveau et améliorer les troubles de la mémoire liés à cette maladie. Les résultats obtenus seront très importants pour savoir si ces substances pourraient, à l’avenir, être développées comme traitements chez l’être humain.

Procédures

Certaines souris seront entrainées pour des analyses de comportement afin de comprendre leurs capacités de mémorisation et leurs niveaux d'anxiété. Ces analyses de comportement dureront quelques minutes par jour par souris sur une durée d'un mois. D'autres souris seront traitées avec un composé thérapeutique dans le but de développer un traitement pour la maladie d’Alzheimer. Certaines souris traitées le seront pendant toute la durée du comportement (1 mois donc 68 injections) et certaines souris seront traitées uniquement 4 jours (8 injections). Chaque injection ne durera que quelques secondes par jour. Les injections seront faite 2 fois par jour et peuvent aussi induire une nuisance.

Impact sur les animaux

Le projet s’intéresse à la mémoire. Par conséquent les effets indésirables principaux pourront se manifester par des troubles de la mémoire. Les tests comportementaux seront majoritairement sans douleur (un seul test peut entrainer une douleur modérée transitoire de quelques secondes). Il pourrait y avoir une douleur transitoire lors de l'injections des composés.

Devenir

Après les tests comportementaux, les animaux seront euthanasiés pour prélever des tissus et réaliser des études post-mortem. Certains animaux seront euthanasiés pour prélever des tissus afin de maintenir les circuits neuronaux actifs mais aussi pour effectuer certaines analyses ex-vivo qui nécessitent des préparations à partir de tissus frais.

Remplacement

Pour comprendre comment fonctionne le cerveau et comment la maladie d’Alzheimer affecte la mémoire et le comportement, il est nécessaire d’étudier un cerveau complet, comme celui des mammifères. En effet, les modèles plus simples (comme des cellules en laboratoire, des simulations informatiques ou des animaux très simples) ne permettent pas de reproduire toute la complexité du cerveau et de ses connexions. Nous utilisons donc des souris, car ce sont aujourd’hui les modèles les plus adaptés pour étudier cette maladie.

Réduction

Le nombre de souris utilisé est soigneusement calculé pour obtenir des résultats fiables tout en évitant d’en utiliser plus que nécessaire. De plus, chaque souris participe à plusieurs étapes de l’étude lorsque cela est possible, afin de limiter le nombre total d’animaux. L’organisation des groupes est aussi optimisée pour utiliser au maximum les animaux élevés dans ce projet. Avant de faire ces tests sur les animaux, nous avons d’abord réalisé des expériences en laboratoire (sur des cellules) pour sélectionner les substances les plus prometteuses. Cela nous a permis de réduire le nombre de substances testées sur les animaux, en ne gardant que deux substances actives et une substance de comparaison.

Raffinement

Tout au long de l’étude, le bien-être des animaux est une priorité. Les chercheurs surveillent attentivement tout signe de souffrance (comme une perte de poids, un manque d’activité ou un mauvais état du pelage). Si un problème apparaît, l’expérience est arrêtée immédiatement et l’animal est pris en charge, voir euthanasié si les moyens mis en oeuvre pour diminuer sa souffrance sont insuffisants. Avant les tests, les souris sont habituées progressivement à être manipulées par les chercheurs afin de réduire leur stress. Elles sont également placées dans un environnement calme avant chaque test pour qu’elles s’y acclimatent. Les expériences sont organisées de manière à augmenter progressivement le niveau d’inconfort, afin de ne pas perturber les résultats.

Choix des espèces

Nous avons une très bonne connaissance des caractéristiques biologiques des souris par les travaux scientifiques et techniques publiés. L’élevage selon les mêmes conditions assure la reproductibilité des expérimentations. Pour comprendre comment fonctionne le cerveau et comment la maladie d’Alzheimer affecte la mémoire et le comportement, il est nécessaire d’étudier un cerveau complet, comme celui des mammifères. En effet, les modèles plus simples (comme des cellules en laboratoire, des simulations informatiques ou des animaux très simples) ne permettent pas de reproduire toute la complexité du cerveau et de ses connexions. Nous utilisons donc des souris, car ce sont aujourd’hui les modèles les plus adaptés pour étudier la maladie d'Alzheimer. Cette étude permettra de développer une approche thérapeutique de la maladie d'Alzheimer. Nous disposons de techniques adaptées à cette espèce. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, où les premiers symptômes de la maladie d’Alzheimer peuvent être observés dans les lignées murines.

Menée par une société qui a mis au point sa propre technologie de vectorisation, l'étude soumet 600 souris à des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chaque animal reçoit une greffe de tumeur sous la peau, puis deux à quatre administrations des molécules à tester et jusqu'à quatre prélèvements sanguins. Les souris qui atteignent un point limite sont mises à mort en urgence, les autres à la fin du protocole. L'objectif est d'évaluer l'efficacité et la distribution de molécules conjuguées destinées à cibler les cellules cancéreuses.

Objectifs

Les cancers demeurent la première cause de mortalité en France et nécessitent le développement de stratégies thérapeutiques plus ciblées et plus efficaces. L’identification de récepteurs ou transporteurs surexprimés à la surface des cellules tumorales constitue une approche prometteuse pour améliorer la spécificité des agents thérapeutiques et diagnostiques. Notre société a mis au point une technologie qui associe des vecteurs biologiques à différentes molécules d’intérêt. Cette approche exploite les mécanismes naturels de passage des cellules pour permettre aux molécules de franchir certaines barrières biologiques et d’atteindre les tissus ciblés. Le projet vise à évaluer l’efficacité et la distribution dans l’organisme de ces molécules conjuguées (molécules-C) en oncologie, en ciblant des récepteurs ou transporteurs surexprimés par les cellules cancéreuses. Les résultats attendus permettront d’apprécier le potentiel de cette approche de vectorisation pour le développement de stratégies thérapeutiques plus spécifiques.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre d’évaluer l’efficacité de molécules vectorisées pour délivrer de manière ciblée des agents thérapeutiques et diagnostiques vers des tumeurs. Les résultats attendus incluent une meilleure compréhension de la distribution et des effets biologiques de ces molécules, ainsi que la validation de modèles précliniques pertinents pour l’oncologie. Ces connaissances pourront contribuer au développement de stratégies thérapeutiques plus spécifiques et potentiellement moins toxiques, et orienter la conception de futures approches ciblées en oncologie.

Procédures

Les manipulations expérimentales seront réalisées sur animaux vigiles et de manière précises et rapides (≤ 2min). Elles incluent : L’annotation des queues au moyen d’un marqueur spécifique permettant l’identification des individus (1 fois /semaine). Les pesées : Une pesée sera réalisée avant chaque administration et une avant l’euthanasie des animaux. La mise en contention (avant toutes administrations intraveineuses (1 à maximum 3) ou prélèvements intermédiaires (maximum 4). Les administration(s) intraveineuse(s) ou sous-cutanée(s) : 2 à maximum 4. A noter : Dans le cas d’administration répétées, un délai de minimum 24 à 48h sera respecté entre deux administrations. Les administrations intrapéritonéales : 1 seul/individu (euthanasie). Les prélèvements intermédiaires : Des prélèvements sanguins intermédiaires peuvent être réalisés en cours de cinétique (maximum de 4 prélèvements de 50μl/semaine). Cette procédure ne présente pas d’anesthésie, pas d’analgésie, ni de chirurgie avec réveil.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances ou effets indésirables sont liés au stress physique et à l’inconfort des animaux : - Lors des manipulations expérimentales : stress lié à la mise en contention, aux différentes administrations (induction tumorale par injection sous-cutanée (100µl), administration des molécules-C par voie intraveineuse ou sous-cutanée (une à trois maximum par individu), administration intrapéritonéale lors de la mise à mort (dose unique de 0.1 ml de mélange d’anesthésiques/10g de souris) et aux prélèvements sanguins intermédiaires (maximum 4 prélèvements ≤50 µl par individu, ne dépassant pas 10 % de la volémie sur 14 jours). - Lors de l’implantation et croissance tumorale : inconfort ou gêne locale liée à l’implantation des cellules tumorales et au développement des tumeurs. Les souris athymiques, en raison de leur phénotype immunodéprimé, peuvent présenter une sensibilité aux infections et une altération de l’état général ; ces nuisances potentielles sont toutefois limitées par les conditions d’hébergement (cages individuellement ventilées) et la surveillance régulière appliquées à l’ensemble des souris.

Devenir

En fin de procédure, tous les animaux seront euthanasiés. Si, au cours de l’expérimentation, un animal atteint un point limite, il sera euthanasié en urgence après validation par le vétérinaire et le porteur de projet.

Remplacement

Pour mener à bien nos projets, nous réalisons en amont une première série de tests in vitro afin de vérifier le maintien des interactions avec les récepteurs cellulaires (SPR, mesure d’affinité cellulaire). Cependant, ces tests ne permettent pas de prendre en compte l’ensemble des paramètres physiologiques (mécaniques, immunitaires, métaboliques et d’élimination) qui conditionnent le succès de nos vecteurs conjugués. Pour évaluer ces paramètres complexes, il est nécessaire de recourir à un modèle vivant, ici la souris, premier modèle animal disponible proche de l’homme pour l’étude des mécanismes physiologiques in vivo. Aucun modèle informatique ou in vitro n’est actuellement capable d’intégrer toutes les interactions physiologiques requises pour étudier la pharmacocinétique et l’efficacité pharmacologique de nos vecteurs. La souris reste donc, à ce jour, le système le plus pertinent pour étudier de manière complète la pharmacologie des molécules conjuguées chez les mammifères.

Réduction

L’optimisation de nos vecteurs permet d’utiliser des doses réduites, limitant ainsi les effets secondaires indésirables (Raffinement) et le nombre d’animaux nécessaires (Réduction). Le nombre d’animaux par groupe (15) a été défini pour garantir une puissance statistique suffisante, en tenant compte de l’effet biologique attendu, de la variabilité individuelle. Chaque étude comporte 2 groupes expérimentaux (1 contrôle et 1 traité), permettant de tester chaque molécule avec un minimum d’animaux. La planification annuelle et quinquennale a été optimisée pour que le nombre total sur 5 ans ne dépasse pas 600, tout en assurant des données fiables. Enfin, une sélection ciblée des tissus à prélever permet d’éviter des prélèvements inutiles et d’optimiser l’utilisation des animaux pour plusieurs analyses.

Raffinement

Les animaux sont répartis à raison de 5 individus maximum par cage et maintenus dans un environnement familier (même cage pour les odeurs, taille standard pour portoir ventilé + couvercle filtrant), litières (copeaux de bois) avec un triple enrichissement. De plus, une observation quotidienne des animaux porteurs de tumeurs, avec mesure régulière des volumes tumoraux, permettra d’établir quotidiennement un score prenant en considération la perte de poids, la présence de signes de douleur ou de souffrance notable (cardiaque, respiratoire). Toutes les administrations (iv, ip et sc) sont réalisées par un personnel formé, expérimenté pratiquant en routine ce type d’études chez la souris, tout en respectant les recommandations de volume injecté en fonction des voies d’administration. Lorsqu’ils ont lieu, les prélèvements intermédiaires de sang sont réalisés après asepsie de l’extrémité de la queue. Une compresse de gaz imbibée d’eau oxygénée est appliquée immédiatement après le prélèvement. Les prélèvements terminaux sont réalisés sur des souris sous anesthésie générale profonde et ayant préalablement étaient analgésiées. Les points limite impliquant l’euthanasie immédiate des animaux sont les suivants : un volume tumoral supérieur à 1000 mm³, une perte de poids supérieure ou égale à 20 % par rapport au poids corporel maximal, ou un score de souffrance supérieur à 10 avec analgésie inefficace après 2 h. A la fin du projet tous les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

Des essais in vitro sont réalisés en amont pour vérifier l’interaction des vecteurs avec leurs récepteurs cellulaires. Ces approches ne permettent cependant pas d’évaluer l’ensemble des paramètres physiologiques complexes impliqués in vivo, tels que la distribution dans l’organisme, la pharmacocinétique ou l’efficacité tumorale. À ce jour, aucun modèle alternatif (in vitro ou in silico) ne permet de prédire de manière fiable ces paramètres. Le recours à des modèles murins est donc indispensable pour l’évaluation de vecteurs à visée thérapeutique ou diagnostique dans un contexte tumoral. La souris constitue un modèle mammifère pertinent, intégrant l’ensemble des mécanismes physiologiques nécessaires à l’étude de l’efficacité pharmacologique. Pour cette procédure, des animaux dits « jeunes adultes » seront utilisés, âgés d’environ 6 semaines et pesant en moyenne 24g à 28g, ce qui permet d’optimiser les posologies et la standardisation des expérimentations. Deux souches seront employées selon les besoins expérimentaux : - Une souche déficiente en système immunitaire, permettant l’implantation et la croissance reproductible de tumeurs solides humaines sous-cutanées, facilitant la prise tumorale et le suivi de la croissance tumorale. - Une souche sauvage présentant un système immunitaire fonctionnel, permettant l’évaluation des vecteurs dans un environnement tumoral incluant la réponse immunitaire.

Pour évaluer si une lumière rouge ou infrarouge réduit les lésions de la peau et de la bouche causées par la radiothérapie, 3 320 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chaque animal reçoit une greffe de cellules tumorales, des séances d'irradiation sous anesthésie générale et, pour certains groupes, des injections d'anticorps trois fois par semaine pendant trois semaines. Les atteintes attendues, perte de poids, irritations de la peau et de la muqueuse buccale, viennent surtout de l'irradiation et de la tumeur. La mise à mort permet des examens sur tissus, et l'effectif de plus de trois mille animaux n'est pas justifié dans le résumé.

Objectifs

Ce projet a pour objectif d’évaluer la capacité de la photobiomodulation, utilisant une lumière rouge ou proche infrarouge, à réduire les toxicités induites par la radiothérapie et/ou la chimiothérapie au niveau de la muqueuse buccale et de la peau. La photobiomodulation est déjà largement utilisée en clinique pour la prise en charge des effets secondaires liés aux traitements anticancéreux, ainsi que dans d’autres indications telles que l’alopécie ou la cicatrisation post-chirurgicale. L’objectif principal de ce projet est d’évaluer la sécurité et l’efficacité de la photobiomodulation dans des modèles murins de toxicités radio-induites, en particulier la radiodermite et la mucite orale, tout en s’assurant de l’absence de toxicité cutanée et muqueuse induite par la photobiomodulation elle-même. Un objectif secondaire est de vérifier que la photobiomodulation n’induit pas de protection tumorale vis-à-vis de la radiothérapie. À ce titre, le projet vise également à évaluer l’impact de la photobiomodulation sur la réponse tumorale à la radiothérapie, et à explorer la possibilité d’un effet radiosensibilisant de la photobiomodulation.

Bénéfices attendus

Bien que l’efficacité clinique de la photobiomodulation soit aujourd’hui bien établie dans la prévention et le traitement de la mucite orale, l’analyse de son effet sur les toxicités cutanées et muqueuses radio-induites permettra de mieux comprendre comment la photobiomodulation agit au niveau cellulaire et moléculaire pour limiter l’inflammation et favoriser la réparation des tissus sains exposés aux irradiations. Certaines études précliniques ont déjà démontré une réduction de la mucite orale par l’utilisation de lasers de faible intensité chez l’animal. Toutefois, ce projet vise à confirmer ces résultats à l’aide de techniques complémentaires, permettant d’étudier précisément les mécanismes biologiques impliqués dans la réduction des effets secondaires, et surtout à étendre cette démonstration au contexte de la radiodermite, dont la diminution n’a pas encore été démontrée de manière robuste en préclinique, tout en s’assurant de l’absence de toxicité cutanée et muqueuse propre à la photobiomodulation. Par ailleurs, les paramètres d’utilisation de la photobiomodulation (doses, longueurs d’onde, durée d’exposition) étant actuellement très hétérogènes en préclinique et en clinique, ce projet contribuera à leur optimisation et standardisation dans le cadre des soins de support en oncologie. Dans la littérature préclinique, l’impact de la photobiomodulation associée à la radiothérapie sur la tumeur reste controversé. Ce projet vise à clarifier ces effets en explorant de manière rigoureuse l’influence de la photobiomodulation sur la réponse tumorale à la radiothérapie, dans différents modèles tumoraux. La mise en évidence, à l’aide de preuves précliniques solides et de techniques d’analyse avancées, d’un effet radiosensibilisant, d’une modulation du microenvironnement tumoral, ou d’un ralentissement de la croissance tumorale constituerait une avancée majeure dans la compréhension des interactions entre la photobiomodulation et les traitements anticancéreux. Ces données permettront de mieux caractériser les mécanismes biologiques impliqués, notamment en termes de vascularisation tumorale, d’inflammation et de réponse immunitaire, et de trancher les divergences actuelles de la littérature.

Procédures

Il y aura une injection des cellules tumorales sous anesthésie locale (durée 10 secondes). Pour chaque procédure, la photobiomodulation sera délivrée pendant au maximum 10 min sans contact direct à une distance de 40 mm. Elle sera délivré pour chaque groupe sous anesthésie générale après une séance de radiothérapie pour les groupes irradiés ou pour les groupes témoins. Pour chaque procédure, les souris seront également irradiées sous anesthésie générale (durée: 15 minutes max) . Dans certains groupes, elles seront traitées 3 fois par semaine avec un anticorps en injection durant trois semaines (durée de l'injection 10 secondes). Cette injection se fera sous anesthésie locale. Certains groupes recevront un produit de contraste pour voir la vascularisation sous micro-CT juste avant le prélèvement final sous anesthésie générale (une injection, durée 10 secondes, sous anesthésie générale).

Impact sur les animaux

Les nuisances qui surviennent à l’animal sont principalement dues à l’irradiation et à la tumeur. Les effets indésirables attendues liés à l’implantation de la tumeur, le développement progressif de la tumeur pouvant entraîner une gêne légère à modérée et une perte de poids. Les nuisances que l’animal peut également rencontrer sont les irritations cutanée ou muqueuse légère et transitoire et la perte de poids modérée, liée à l’irradiation dans les modèles de radiodermites et de mucite orale radio-induites. L’association de la photobiomodulation à la radiothérapie ne génère pas de nuisance supplémentaire pour l’animal. Aucun effet indésirable spécifiquement lié à la photobiomodulation n’est attendu sachant qu’elle non ionisante, non invasive et appliquée en surface à des doses ne causant aucune élévation thermique mesurable. Dans ce contexte, la photobiomodulation est susceptible de réduire certaines toxicités radio-induites, telles que la radiodermite et la mucite orale, et pourrait ainsi contribuer à une amélioration du bien-être animal.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour des études et examens sur tissus post-mortem.

Remplacement

Le recours à l’animal est justifié par l’impossibilité de reproduire in vitro l’ensemble des phénomènes biologiques étudiés dans ce projet. Les effets de la photobiomodulation sur les toxicités radio-induites et sur la réponse tumorale impliquent des interactions complexes entre plusieurs compartiments cellulaires, microenvironnement tissulaire de la tumeur , et la dynamique tumorale avec certains types de cellules ou médiateurs chimiques est très important, qui ne peuvent être modélisées de manière pertinente par des systèmes cellulaires isolés. D’autant plus que les données issues de la littérature basée majoritairement sur des études in vitro sont très limitées dans l’analyses sur les mécanismes d’actions de la photobiomodulation sur la réparation tissulaire ou sur la réponse tumorale, manquant d’aller plus loins dans la recherche ou dans les conclusions. Ils démontrent par ailleurs que les effets de la photobiomodulation diffèrent significativement entre les modèles in vitro et in vivo. Ainsi, l’utilisation de modèles murins reste indispensable si on veut étudier de manière intègre les effets de la photobiomodulation sur les tissus développant la mucite orale et la radiodermite proche de celui des patients et sur la tumeur, dans un contexte de radiothérapie, et pour produire des résultats transposables à la clinique humaine.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé dans ce projet sera strictement limité au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement exploitables. Les effectifs ont été définis sur la base : d’une analyse statistique à priori, afin de calculer le nombre d’animaux nécessaire et suffisant dans chaque procédure pour détecter des différences significatives pour chaque procédure expérimentale. Sur des données précliniques existantes, les modèles de radiodermite et de mucite orale utilisés dans ce projet sont très développés dans le laboratoire et décrits dans la littérature. Mais également la création de modèle avec des tumeurs ou il y a un contrôle tumoral par la radiothérapie est également très développé dans le laboratoire. Du fait de ce recul important, nous n’avons pas besoin de mettre en place nos modèles d'irradiations et de tumeurs. Ceci nous permettra de réduire les conditions expérimentales et donc le nombre de souris.

Raffinement

La photobiomodulation constitue une approche non invasive, non ionisante, appliquée à des paramètres n’induisant aucune élévation thermique mesurable, et ne générant pas de douleur directe chez l’animal. Toutefois, un appareil d'imagerie thermique (Ti20 thermal imager) peut être utilisé pour vérification. Les animaux seront pesés trois fois par semaine, et un examen clinique biquotidien sera réalisé afin d’évaluer l’état général, le développement des effets radio-induits cutanés et/ou muqueuses. Le scoring de ces effets se fera avec le score de Parkins ou CTCAE. Le développement tumoral sera suivi trois fois par semaine par la mesure du volume tumoral à l’aide d’un pied à coulisse, ou par une imagerie IVIS (Système d’imagerie in vivo basé sur la luminescence), permettant un suivi longitudinal non invasif. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués, conduisant si nécessaire à une euthanasie immédiate, réalisée conformément aux recommandations réglementaires en vigueur. Les souris seront hébergées en groupe afin de limiter le stress lié à l’isolement. Leur environnement sera enrichi (coton, nids en carton, papier) pour favoriser les comportements naturels et réduire l’anxiété. En cas de besoin, des compléments alimentaires riches en énergie et facilement accessibles seront mis à disposition, et des traitements analgésiques pourront être administrés conformément aux recommandations vétérinaires.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale de référence pour les études de radiobiologie, en raison de la bonne caractérisation de ses réponses tissulaires et immunitaires aux rayonnements ionisants. Les lignées choisies ont été sélectionnées car ce sont des modèles largement utilisés et validés pour l’étude du développement tumoral et des effets secondaires de la radiothérapie. Leur homogénéité génétique (souris congéniques) garantit une bonne reproductibilité des résultats. Par ailleurs, ces lignées ont déjà été utilisées dans le laboratoire pour l’étude des mucites buccales et de la radiodermite, assurant ainsi une continuité scientifique avec les travaux similaires. Les souris jeunes seront âgées de 8 semaines, un âge où la souris est suffisamment mature. Elles représenteront les souris jeunes. Sur la base des résultats obtenus, certains résultats clés peuvent être confirmés sur des souris âgées de 15 à 18 mois pour voir si l’âge joue dans les résultats.