Rongeurs
Etudes précliniques in vivo pour le développement de nouvelles thérapies géniques.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
1 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées d'un niveau de souffrance léger. Leur moelle osseuse est d'abord affaiblie par une chimiothérapie, avant la greffe de cellules humaines puis l'injection de vecteurs de thérapie génique dans la veine de la queue. Le porteur reconnaît qu'il est impossible d'éliminer les risques d'effets secondaires, dont l'apparition de tumeurs si le gène s'insère dans une zone oncogénique. Les animaux sont ensuite mis à mort pour autopsie et analyse des tissus, l'étude servant à contrôler la sécurité de ces traitements avant les essais cliniques.
Objectifs
Certaines maladies génétiques graves peuvent aujourd’hui être traitées grâce à la thérapie génique qui vise à corriger ou remplacer un gène défectueux en introduisant une nouvelle information génétique dans les cellules du patient. Ce gène thérapeutique est transporté des « vecteurs », comme des virus rendus inoffensifs (thérapie in vivo) ou des cellules génétiquement modifiées en laboratoire (thérapie ex-vivo). La thérapie génique peut parfois provoquer des réactions immunitaires inattendues ou des effets secondaires, susceptibles de réduire l’efficacité du traitement. Il est donc indispensable de vérifier leur sécurité et la distribution du gène dans l’organisme avant les essais cliniques. Les études dites de biosécurité et de biodistribution permettent d’évaluer ces risques en vérifiant que le traitement ne provoque pas de toxicité, que le matériel génétique introduit reste contrôlé, qu’il ne se disperse pas de manière indésirable et qu’il ne perturbe pas le fonctionnement normal des cellules. Ces évaluations sont réalisées selon des règles strictes définies et sont fortement recommandée par les agences règlementaires européennes ou internationales. Les souris incluses dans ce projet sont immunodéficientes et ne possèdent pas leur propre système immunitaire fonctionnel, ce qui permet d’y implanter des cellules humaines sans rejet. Après transplantation de cellules souches humaine issues de moelle osseuse ou de sang de cordon, ces souris développent progressivement un système immunitaire, reconstituant les différentes sous-population de cellules hématopoïétique humaine. Elles constituent ainsi un modèle essentiel pour observer les effets des thérapies géniques dans un organisme vivant et mieux comprendre les réponses immunitaires associées. Différents modèles de souris immunodéficientes sont employés dans ce projet conçues pour accepter les cellules humaines. Ces modèles permettent d’évaluer la sécurité et l’efficacité des nouvelles thérapies avant leur passage en essais cliniques, contribuant ainsi à garantir la protection future des patients.
Bénéfices attendus
Les études de biosécurité et de biodistribution sont essentielles pour justifier la sécurité et l’efficacité de thérapies géniques avant le passage aux essais cliniques chez l'homme. L’ambition de la plateforme préclinique de l’ART-TG est d’aider, sous forme de prestation ou de collaboration, la progression de thérapies innovantes permettant de répondre à des besoins médicaux inassouvis. Ce laboratoire s'intéresse à développer de traitements ciblés pour des maladies génétiques telles que des déficits immunitaires ou la drépanocytose. Il développe également des traitements du cancer par l'ingénierie du système immunitaire avec des cellules CAR-T. Ces études s'inscrivent dans une médecine personnalisée, avec des effets durables potentiellement curatifs pour des maladies rares ou fréquentes.
Procédures
Le projet comporte au maximum 5 types d'interventions :: Étape 1 : Préparation des souris : Avant de leur greffer des cellules humaines, les souris subissent un traitement spécial pour affaiblir leur moelle osseuse, grâce à un médicament de chimiothérapie utilisé en clinique. Ce traitement est administré en deux injections à 24 heures d’intervalle. Chaque injection dure quelques secondes (< 5s). Étape 2 : Humanisation des souris : les cellules humaines sont injectées dans une veine de la souris. Il y aura qu’une seule injection par qui dure quelques secondes (< 10s). En fonction des groupes, les cellules peuvent avoir été modifiées génétiquement, préalablement au laboratoire. Étape 3 : Traitements génétiques in vivo: Il s'agit d'apporter le matériel génétique dans les cellules déjà greffées chez les souris en injectant des vecteurs dans la veine de la queue des souris, une fois par semaine, pendant 6 semaines. Il y a aura au total 6 injections qui durent quelques secondes chacune (< 10s). Étape 4 : Prélèvements intermédiaires : Comme le processus d’humanisation est long, des échantillons de sang sont prélevés chaque semaine sous anesthésie gazeuse à partir de la 5e semaine. Chaque prélèvement durent quelques dizaines de secondes (< 30s). Cela permet de suivre l’évolution de la greffe en analysant différents paramètres du sang. Étape 5 : Prélèvements finaux : À la fin de l’expérience, un prélèvement de sang (qui dure < 30 s) est réalisé sous anesthésie générale directement dans leur cœur. Ensuite, les souris sont euthanasiées de manière rapide et indolore.
Impact sur les animaux
Il est impossible d’éliminer complètement les risques d’effets secondaires. Les vecteurs utilisés (comme les cellules ou virus modifiés) ou les gènes qu’ils transportent peuvent provoquer des réactions indésirables, notamment l'apparition de tumeurs si le gène s'insère dans une zone oncogénique ou l'insertion perturbe le fonctionnement normal de la cellule.
Devenir
A la fin de la procédure, tous les animaux seront mis à mort pour permettre de les étudier (autopsie, analyse biomoléculaire des tissus).
Remplacement
Pour mettre aux points les vecteurs et les séquences de gènes, l’ensemble des méthodes alternatives à l’expérimentation animale ont été utilisé pour valider les mécanismes et l’approche scientifique de la thérapie (cultures cellulaires, les organoïdes, les modèles informatiques et les systèmes microphysiologiques comme les organes sur puce). Les méthodes alternatives offrent des solutions prometteuses pour réduire l’utilisation d’animaux, mais elles ne peuvent pas encore remplacer totalement l’expérimentation animale en thérapie génique. Leur principale limite réside dans leur incapacité à reproduire la complexité et l’interconnexion des processus biologiques à l’échelle de tout un organisme, ainsi que dans l’étude des effets à long terme ou systémiques des traitements : -Incapacité à reproduire la complexité d’un organisme entier : absence de réponse systémique (interactions entre les organes et systèmes immunitaires, systémiques, nerveux ou endocriniens). -Incapacité à reproduire la distribution du traitement dans les différents organes, les différents compartiments -Manque de modèles pour les interactions génétiques et environnementales. Ces interactions sont difficiles à reproduire dans des systèmes artificiels. A cela, s’ajoute également l’absence de variabilité biologique dans les modèles simplifiés qui génère une compréhension incomplète ou biaisée des effets d’une thérapie génique. -Durée et dynamisme des effets : Les thérapies géniques visent souvent des effets durables ou permanents. Les systèmes alternatifs comme les cultures cellulaires sont généralement limités en durée de vie, ce qui rend difficile l’étude des effets à long terme. Les réponses dynamiques (comme la régulation génétique sur plusieurs jours, semaines ou mois) sont complexes à modéliser in vitro ou par ordinateur. La recherche animale reste donc difficile à substituer totalement dans le cadre de la recherche en thérapie génique pour plusieurs raisons scientifiques, techniques et réglementaires. En effet, la thérapie génique repose sur des vecteurs (souvent des virus modifiés) pour introduire ou modifier du matériel génétique. Les réponses immunitaires ou les effets secondaires imprévus doivent être évalués dans un organisme entier avant d'envisager des essais cliniques sur l'humain. Les animaux permettent d'évaluer les effets hors cible (off-target effects) et les potentiels risques oncogènes dans un cadre biologiquement pertinent.
Réduction
Le projet a été élaboré afin de pouvoir minimiser le nombre d’animaux nécessaires tout en obtenant des résultats fiables et statistiquement significatifs. -Développement des techniques de biologie moléculaire avancées qui permettent de réduire ainsi le besoin d’animaux supplémentaires : des dosages multiplexés (qui permettent de mesurer plusieurs paramètres dans le même échantillon biologique); augmentation de la sensibilité des tests (diminution du volume de sang nécessaire (
Raffinement
Dans le cadre d’une étude de biosécurité portant sur une nouvelle thérapie génique, des mesures de raffinement adaptées aux protocoles expérimentaux ont été mises en place : •Hébergement en isolateur exempt de pathogènes et d’agents opportunistes : les souris étant immunodéficientes, ces conditions permettent d’éviter l’expression de phénotypes délétères. •Enrichissement du milieu : mise à disposition de maisons pour rongeurs (type Smart Home) en papier, de briques à ronger en bois ainsi que de matériaux de nidation (type Sizzle Nest ou Nestlets). •Réalisation des prélèvements sous anesthésie : anesthésie gazeuse pour les prélèvements rétro-orbitaires et injection d’une solution de kétamine et de xylazine pour les ponctions intracardiaques. •Suivi quotidien de l’état des animaux, avec un contrôle du poids pouvant aller jusqu’à trois fois par semaine durant la phase de conditionnement. •Mise en place de points limites adaptés et spécifiques aux procédures expérimentales.
Choix des espèces
Les souris humanisées, générées à partir de souris immunodéficientes, sont des outils précieux en thérapie génique et biosécurité. Leur système immunitaire affaibli permet de greffer durablement des cellules humaines, créant un modèle biologique proche de l'humain. Ces modèles permettent d'étudier les interactions entre vecteurs, gènes insérés et cellules humaines, tout en évaluant les effets secondaires spécifiques, comme les réponses immunitaires indésirables, les tumeurs ou la maladie du greffon contre l’hôte. En reproduisant des mécanismes biologiques humains, elles améliorent la prédictivité des résultats précliniques, renforçant la sécurité et l'efficacité des thérapies innovantes avant les essais cliniques. . Seules des souris femelles jeunes adultes seront utilisées dans ces études car elles permettent une meilleure prise de greffe ce qui fournit des résultats plus fiables donc limitant le nombre d’animaux nécessaires à l’étude.
Exploration de la neuro-inflammation dans le contexte des neuropathies périphériques chimio-induites : caractérisation sur modèles animaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
Pour reproduire chez le rat la neuropathie douloureuse provoquée par les chimiothérapies anticancéreuses, 192 rats reçoivent huit injections intraveineuses d'anticancéreux sur vingt-cinq jours, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Ils développent au fil des injections une allodynie, une douleur déclenchée par un contact normalement indolore, évaluée chaque semaine par des tests tactiles et thermiques. Le porteur qualifie cette induction de nuisance "indispensable à la conduite de l'étude". Un prélèvement sanguin final précède la mise à mort, destinée à des analyses sanguines et tissulaires.
Objectifs
La neuropathie périphérique chimio-induite est un effet indésirable caractéristique des anticancéreux neurotoxiques utilisés dans le cancer du sein, le cancer colorectal, le cancer du poumon. Cette neuropathie se manifeste par des désordres sensitifs dans les mains et les pieds (fourmillements, picotements et douleur), altérant la qualité de vie des patients et pouvant persister longtemps après la fin des traitements anticancéreux. La prise en charge thérapeutique reste très limitée, avec notamment aucun traitement préventif, et des traitements peu efficaces pour traiter les douleurs associées. Des travaux récents menés au sein de notre équipe de recherche ont mis en évidence l’activation de processus inflammatoires dans nos modèles animaux de neuropathie chimio-induite, et l’identification de potentielles cibles thérapeutiques pour atténuer les douleurs associées à cette neuropathie. Néanmoins, il reste difficile à ce stade d’identifier des anomalies inflammatoires communes à l’ensemble de ces modèles de neuropathie (différents types d’anticancéreux neurotoxiques), ce qui limite l’identification de cibles thérapeutiques robustes. L’objectif général de ce projet sera donc d’approfondir ces résultats préliminaires en explorant la neuroinflammation dans le contexte des neuropathies périphériques chimio-induites, à l’aide de modèles animaux harmonisés (en particulier en termes de durée de traitement) et validés, dans la perspective d’identifier et d’étudier de nouvelles cibles thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Ce projet propose d’étudier la neuroinflammation dans les neuropathies périphériques chimio-induites chez l'animal dans la perspective d’identifier de potentielles cibles thérapeutiques permettant de prévenir oui traiter les neuropathies périphériques chimio-induites. Rappelons qu’à ce jour la prise en charge des neuropathies périphériques chimio-induites est très limitée, avec aucune stratégie préventive recommandée et seule un médicament avec un niveau de recommandation modérée pour le traitement des douleurs neuropathiques associées. Ainsi ce projet pourrait ouvrir de nouvelles perspectives de traitement et de prévention des neuropathies périphériques chimio-induites.
Procédures
Tous les animaux des modèles de neuropathie périphérique chimio-induite recevront des injections intraveineuses (anticancéreux ou véhicule de l’anticancéreux) sous sédation légère. Le nombre total d’injections sera de 8 sur 25 jours, et pour une durée des injections de 10 secondes (max). Tous les animaux seront suivis par des tests comportementaux hebdomadaires et jusqu’à la fin des injections. Les tests comportementaux dureront en moyenne 5 à 10 min par animal. Il n’y aura aucun prélèvement sanguin durant les procédures. Un seul prélèvement sanguin total sera réalisé en fin de procédure sous anesthésie profonde (isoflurane à 4%) et avec analgésie, à la suite de quoi les animaux seront mis à mort.
Impact sur les animaux
L’induction de la neuropathie périphérique chimio-induite chez l’animal sera une nuisance à part entière, mais indispensable à la conduite de l’étude. Les injections intraveineuses d’anticancéreux seront réalisées avec une sédation légère. La neuropathie périphérique chimio-induite sera associée à des désordres nociceptifs qui seront évalués dans le cadre du projet (test mesurant l’allodynie tactile et thermique) et qui se développeront au fur et à mesure des injections d’anticancéreux. L’allodynie est une réponse douloureuse à un stimulus qui ne l’est pas en condition normale. L’allodynie est mesurée grâce à un stimulus non douloureux tactile (von frey électronique) ou thermique (immersion de la patte à 10°C) et qui sera perçu comme douloureux. La mesure de l’allodynie offre un critère de jugement plus éthique que l’hyperalgésie (application d’un stimulus douloureux, ex : pression de la patte ou application de température nociceptive à 0 ou 4°C). De plus, l’allodynie est caractéristique de la douleur neuropathique en clinique chez l’homme. Les administrations répétées d’anticancéreux seront responsables d’une réduction du gain de poids des animaux. Le poids des animaux sera suivi régulièrement dans le cadre des administrations d’anticancéreux (dose en mg/kg et mesure bi-hebdomadaire), et permettra de contrôler la tolérance des animaux aux anticancéreux. Comme la douleur neuropathique est étudiée dans ce projet, il ne sera pas possible de mettre en place une analgésie continue chez l’animal. Les réponses nociceptives sont objectivables chez l’animal lors des tests nociceptifs (ici de l’allodynie), mais les animaux ne présentent habituellement pas de réponses douloureuses spontanées ou lors de la manipulation des animaux. Il est important de rappeler que, pour ce type d’étude avec des tests comportementaux, les animaux doivent conserver un très bon état général (activité spontanée, comportement), car des altérations sévères de l’état général biaiseraient la qualité des résultats obtenues avec les tests comportementaux.
Devenir
Les expérimentations conduiront à la mise à mort des animaux pour permettre des analyses biologiques sanguines et tissulaires afin d'optimiser l'emploi des animaux à des fins de recherche
Remplacement
Ce type d'étude sur modèle animal de neuropathie périphérique chimio-induite n'est pour le moment pas encore remplaçable par des modèles in vitro. Des travaux sont en cours sur cellules souches humaines de neurones ou organoïdes. Mais ces modèles in vitro ne permettent pas encore d'appréhender la complexité de la physiopathologie des neuropathie périphérique chimio-induite, qui n'est-elle-même pas encore complètement élucidée. Enfin, s'agissant d'une étude sur la douleur neuropathique, l'animal vivant est encore nécessaire pour explorer, évaluer et valider les troubles nociceptifs par l’intermédiaire de tests comportementaux.
Réduction
Le nombre d’animaux sera limité à 12 par groupe et par sexe, afin de respecter le principe de réduction tout en garantissant la robustesse scientifique de l’étude. Dans ce type d’étude exploratoire, une diminution plus importante du nombre d’animaux ferait courir un risque élevé de ne pas pouvoir conclure, ce qui entraînerait une perte de valeur scientifique et une utilisation inutile des animaux. Le nombre retenu permet de réaliser des analyses statistiques fiables, fondées sur des tailles d’effet attendues suffisamment larges pour mettre en évidence des différences pertinentes entre les groupes.
Raffinement
Les tests comportementaux ont été choisis car d’une part ils sont les moins douloureux pour les animaux, et d’autre part, ils sont plus proches de la clinique humaine. Ensuite une surveillance renforcée et des points limites précis, ont été établis sur la base d’une solide expérience sur de nos modèles animaux, dans l’objectif de maintenir leur bien-être animal tout au long de l’étude.
Choix des espèces
Le choix du rat plutôt que la souris se justifie d’abord par sa taille, qui permet de prélever une quantité plus importante de matériel biologique par individu et donc de limiter le nombre total d’animaux nécessaires tout en répondant aux objectifs scientifiques. La souche Sprague-Dawley, connue pour son comportement calme et sa bonne maniabilité, est particulièrement adaptée aux tests comportementaux de la douleur, contrairement à des souches plus actives comme Lou ou Wistar qui peuvent introduire davantage de variabilité dans les mesures. L’utilisation de cette souche s’appuie également sur l’expertise existante et des données antérieures au sein du laboratoire, ce qui renforce la robustesse et la comparabilité des résultats. Les animaux seront utilisés à un âge correspondant à de jeunes adultes (environ 9 semaines), ce qui est cohérent avec la plupart des études publiées et facilite la comparaison avec la littérature ainsi qu’avec les données internes. Des mâles et des femelles seront inclus afin de refléter la réalité clinique des traitements par paclitaxel, administrés aussi bien chez les hommes que chez les femmes, et de prendre en compte d’éventuelles différences liées au sexe dans les réponses aux traitements.
Rôle de cellules immunitaires du cerveau dans le maintien de la douleur après une lésion nerveuse
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Soumises à une lésion chirurgicale du nerf sciatique qui provoque une douleur sévère et des troubles anxiodépressifs pendant huit à dix semaines, 192 souris seront toutes tuées, la moitié dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Chaque animal reçoit aussi une fibre optique implantée dans le cerveau, puis subit des mesures de sensibilité par application de filaments sur la patte et par immersion de la patte dans un bain à 10 °C, répétées jusqu'à sept semaines après la chirurgie. L'objectif déclaré est de comprendre le rôle de certaines cellules immunitaires du cerveau dans le maintien de la douleur. À la fin, le cerveau et d'autres organes sont prélevés, ce qui interdit toute réutilisation des animaux.
Objectifs
La douleur neuropathique touche environ 10 % de la population mondiale et, malgré des années de recherche, les traitements restent limités et souvent associés à de nombreux effets indésirables. Une meilleure compréhension de sa physiopathologie pourrait améliorer sa prise en charge. Il a été suggéré que la dégradation d'un composant de la matrice extracellulaire, les réseaux périneuronaux (PNN) entourant les neurones, par la microglie activée au niveau de la moelle épinière pourrait jouer un rôle crucial dans la douleur neuropathique. Nous avons démontré précédemment que le cortex rétrosplénial (RSC) pourrait jouer un rôle important dans la douleur neuropathique dans un modèle de neuropathie par une approche d’imagerie cérébrale. Cette activation du cortex rétrosplénial était également associé à une activation de la microglie. Cependant, la dégradation des PNN par la microglie ainsi que les conséquences de cette dégradation sur l'activité neuronale et la structure synaptique au sein du cortex rétrosplénial et le comportement douloureux sont inconnus dans un contexte de neuropathie. Notre hypothèse principale est que l'activation de la microglie du RSC en condition neuropathique est responsable de la dégradation des PNN, favorisant une hyperactivité des neurones corticaux et une douleur pathologique. Cette étude sera réalisée sur un modèle de douleur neuropathique chez la souris. Le modèle SNI est un modèle particulièrement reproductible et largement utilisé dans les études précliniques sur la douleur. Dans un premier temps, nous caractériserons la dégradation des réseaux périneuronaux et le type de neurones (inhibiteurs ou excitateurs) affectés ainsi que leur structure synaptique, par la microglie activée dans le RSC au cours du temps par des approches d’immunohistochimie. Nous étudierons ensuite les conséquences de cette dégradation sur l’activité neuronale par d’imagerie calcique in vivo. Enfin, l'effet de l'inhibition locale de l’activation microgliale dans cette structure cérébrale dans la douleur neuropathique sera investiguée. Ce projet permettra d’explorer de nouveaux mécanismes impliqués dans ce type de douleur et de proposer de nouvelles cibles thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre comment certaines cellules du cerveau, appelées microglies, modifient le fonctionnement des neurones dans une région précise du cerveau, le cortex rétrosplénial, lors de la douleur neuropathique. Ces cellules peuvent dégrader des structures protectrices entourant les neurones, les réseaux périneuronaux, ce qui pourrait perturber l’équilibre des circuits nerveux impliqués dans la douleur. À plus long terme, mieux connaître ces mécanismes pourrait aider à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour prévenir ou réduire la douleur chronique en agissant sur ces processus de dégradation.
Procédures
Les interventions seront (1) l'administration d'antalgiques, (2) la chirurgie stéréotaxique et (3) la réalisation de tests comportementaux et de photométrie : -(1) chaque injection dure moins d’une minute. -(2) l'induction du modèle de douleur se fera sous anesthésie générale
Impact sur les animaux
(1) L'administration d'antalgique se fait 2 fois par animal le jour de l'implantation de canules, et 24h après. Dans la 2e procédure, les animaux recevront une injection quotidienne de tamoxifen pendant 5 jour afin de faire exprimer la protéine capable de bloquer l'activité de des cellules immunitaires du cerveau, induisant une douleur légère de courte durée. (2) La chirurgie Spared Nerve Injury (SNI) consiste à réaliser une lésion du nerf sciatique qui entraine une douleur sévère et des comorbidités anxiodépressives durant environ 8 à 10 semaines. L'implantation des canules induit une douleur modérée pendant environ 24h. Les injections virales induisent une douleur légère de courte durée. L’induction de l’anesthésie à l’isoflurane précédant la chirurgie stéréotaxique et SNI, et les injections de composés pharmacologiques induisent un stress léger de l’animal. (3) Les tests comportementaux induisent une douleur légère de courte durée et un stress léger de courte durée. La partie externe des canules peuvent entrainer une gêne légère mais n'entrave pas les mouvements et besoins des animaux.
Devenir
Aucune procédure ne permet de réutiliser les animaux. En effet, elle se termine par des études immunohistochimiques qui nécessitent de prélever le cerveau ainsi que d'autres organes pouvant servir à d'autres études : les animaux seront donc mis à mort à la fin de la procédure.
Remplacement
Aucune méthode alternative n'existe pour prévenir l'utilisation d'animaux dans ce protocole : en effet, il est nécessaire de réaliser ces études chez l'animal car l’intégration du toucher et de la douleur implique de nombreux neurones organisés en réseaux complexes et méconnus du système nerveux central et périphérique. Il n’est pas encore possible d’utiliser des méthodes alternatives pour modéliser l’ensemble du cerveau.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum afin obtenir des résultats statistiquement exploitables avec le plus petit nombre d’animaux possible. Le nombre d'animaux est défini à partir de tests statistiques donnant le nombre nécessaire pour la discrimination des effets (seuils de douleur) avec une différence de 50% entre les groupes. Nous utiliserons un nombre équivalent d'animaux mâles et femelles en respect de la règle des trois "R" et des directives sur la Recherche Animale. Une fois les animaux mis à mort, un maximum d'organes sera prélevé et stocké afin d'être utilisé pour ce projet ou pour d'autres études. Cela évitera de mettre à mort de nouveaux animaux pour ces autres études.
Raffinement
Les animaux seront reproduits au sein de notre animalerie selons les conditions d'hébergements règlementaires. De plus, nous utiliserons une pièce réservée pour la stabulation de souris transgéniques avec un cycle de lumière inversé (lumière de 19h à 7h) pour réduire le niveau stress lié à une perturbation du cycle circadien des animaux nocturnes. L'enrichissement pourra être supplémenté par des plateformes ou des roues d'exercice si des comportements agressifs sont observés. Les tests comportementaux à la douleur seront réduits au minimum (fréquence et intensité des tests) et réalisés selon des protocoles expérimentaux établis et acceptés par la communauté scientifique de la Recherche sur la douleur avec une période d'habituation systématique. Les expérimentations seront réalisées au sein du laboratoire ayant une expérience reconnu dans les approches décrites dans ce projet. Aucun des procédures décrites dans ce projet n'induit de déficit locomoteur sévère pouvant influer sur les besoins physiologiques de l'animal. Les animaux seront suivis quotidiennement par les membres utilisateurs du projet.
Choix des espèces
La souris est l'un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur et a été choisi pour comparer nos résultats avec les données de la littérature. Le choix de réaliser ce projet chez la souris permettra d'utiliser des animaux génétiquement modifiés pour des cibles impliqués dans le projet, ce qui peut être plus difficilement réalisé chez une autre espèce. Les animaux seront âgés de 8-10 semaines afin que les souris soient considérées comme adultes. L'expérience du laboratoire et les données de la littérature montrent que le seuil de sensibilité douloureux chez la souris varie au cours du développement, et atteint un seuil stable à l'âge adulte, permettant ainsi de comparer nos données aux précédentes études réalisées chez l'adulte.
Formation pratique d’étudiants de Master à la visualisation des connexions cérébrales du cortex moteur par l’injection d’un traceur chez la souris
- Enseignement supérieur
24 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit sous anesthésie une injection stéréotaxique d'un traceur dans le cerveau, suivie de sept jours d'observation puis d'une mise à mort au CO2. L'exercice n'a pas de finalité de recherche, il sert à former des étudiants de Master aux gestes de stéréotaxie et à la dissection du cerveau. Le porteur retient un ratio d'un animal pour trois étudiants et juge la formation pratique impossible à remplacer par une vidéo ou un simulateur.
Objectifs
La réalisation de cette procédure expérimentale s’inscrit dans un objectif strictement pédagogique visant à permettre aux étudiants de Master de comprendre concrètement les bases anatomiques, méthodologiques et techniques des approches neuroanatomiques utilisées en recherche biomédicale. L’objectif est précisément de former les étudiants aux techniques de stéréotaxie et de neuroanatomie chez la souris, compétences indispensables à leur formation en neurosciences expérimentales. Environ 2/3 des étudiants de Master pratiquent l’expérimentation animale dans le cadre de leur stage obligatoire en 1ère année et cette proportion augmente en 2e année, la grande majorité des étudiants travailleront avec le rongeur. La stéréotaxie est une méthode de référence permettant la localisation tridimensionnelle précise de structures cérébrales chez un animal anesthésié, à partir de coordonnées issues d’un atlas neuroanatomique standardisé. Ces coordonnées sont reportées sur un appareil stéréotaxique afin de cibler une région d’intérêt et d’y injecter un traceur. L’utilisation d’un animal vivant est indispensable, la diffusion du traceur au sein des réseaux neuronaux nécessitant l’intégrité anatomique et fonctionnelle des circuits cérébraux. Aucune méthode in vitro ou in silico ne permet de reproduire la complexité des connexions neuronales à l’échelle de l’organisme entier dans un objectif d’apprentissage pratique. La maîtrise de ces techniques ne peut être acquise de manière exclusivement théorique : elle requiert l’apprentissage encadré des gestes techniques, du positionnement sur cadre stéréotaxique, de la gestion de l’anesthésie et du respect des coordonnées anatomiques. Cette formation contribue à améliorer la rigueur méthodologique, la reproductibilité scientifique et, à terme, à limiter les échecs expérimentaux et l’utilisation d’animaux dans les projets futurs. Elle garantit également l’acquisition de compétences conformes aux exigences scientifiques et réglementaires encadrant l’expérimentation animale.
Bénéfices attendus
La compréhension des méthodes de stéréotaxie et d’injection de traceur cérébraux est indispensable pour l’interprétation des données issues de modèles pré-cliniques et pour la conception de futurs protocoles expérimentaux. Au cours de ces travaux pratiques, les étudiants acquièrent une compréhension concrète des principes méthodologiques, des contraintes techniques ; des exigences réglementaires et des mesures de raffinement mises en œuvre pour limiter la douleur, la souffrance et le stress des animaux, sans réalisation directe d’actes invasifs. Le bénéfice attendu est principalement pédagogique et formatif. Cette formation permet aux étudiants d’acquérir des compétences essentielles à leur insertion professionnelle dans le domaine de la recherche biomédicale, académique ou industrielle. Elle contribue également à leur sensibilisation approfondie aux principes des 3R (Remplacement, Réduction, Raffinement), aux exigences réglementaires et aux responsabilités éthiques associées à l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques. La compréhension des contraintes expérimentales et des mesures de bien-être animal participe à la formation de futurs professionnels capables de concevoir et de conduire des projets respectueux des exigences scientifiques et éthiques.
Procédures
Chaque animal suivra une seule procédure en 6 principales étapes : 1. Pesée (durée 1 minute). 2. Administration en injection sous-cutanée d’un anti-inflammatoire 30 minutes avant la chirurgie. 3. Anesthésie générale gazeuse d’une durée d’environ 15 à 20 minutes. 4. injection stéréotaxique dans le cerveau d’une molécule (appelée traceur) visant à identifier les réseaux de neurones. 5. Suivi post-opératoire pendant 7 jours avec pesées, évaluations du comportement, de l’apparence du pelage et de l’état de la suture. 6. Mise à mort par inhalation croissante de CO2.
Impact sur les animaux
Un stress peut être induit par la manipulation et la pesée individuelle des animaux L’acte chirurgical réalisé sous anesthésie générale est susceptible d’induire un inconfort, un stress ou encore une perte de poids.
Devenir
A l’issue de la procédure les animaux seront mis à mort. Le cerveau sera ensuite prélevé par les étudiants dans le but de les former sur ce geste et sur les expériences permettant la visualisation et l’identification des réseaux neuronaux.
Remplacement
L’objectif du projet est de caractériser l’organisation anatomique des réseaux neuronaux dans le cerveau de souris. A l’heure actuelle, aucune méthode alternative ne permet de reproduire de manière équivalente la complexité des interactions cellulaires, l’intégrité structurale du tissu nerveux ni la dynamique de migration des traceurs neuronaux au sein d’un cerveau dans son environnement physiologique. Les approches in vitro ou in silico ne permettent pas d’observer la distribution anatomique des traceurs dans un contexte tridimensionnel intégrant les connexions neuronales fonctionnelles. De plus, il n’existe pas à l’heure actuelle de logiciel de réalité virtuelle permettant l’injection cérébrale stéréotaxique chez le rongeur de manière réaliste. Ces travaux pratiques consistent à observer l’animal vivant lors de la chirurgie afin de contrôler ses paramètres vitaux ainsi que son endormissement à l’anesthésie et son réveil et d’appréhender les techniques d’asepsie. Enfin, une vidéo de la chirurgie n’est pas envisageable car l’acte chirurgical n’est pas l’unique finalité de ces travaux pratiques, c’est une étape dans l’étude globale des projections motrices du cerveau, les étudiants ont donc besoin aussi d’apprendre les manipulations post-mortem comme la dissection du cerveau, et d’appréhender les techniques de traitement du tissu cérébral très fréquemment utilisées en neurosciences (perfusion cardiaque, coupes du cerveau, visualisation du traceur). Par conséquent, l’utilisation d’animaux vivants est nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques et pédagogiques du projet. Néanmoins, l’utilisation du modèle animal est strictement limitée au minimum nécessaire, et l’ensemble des procédures est conçu de manière à limiter la douleur, la souffrance et le stress des animaux. Des méthodes alternatives sont utilisées lorsque cela est possible, notamment pour la formation théorique des étudiants, l’analyse des données et l’interprétation des résultats expérimentaux.
Réduction
Les méthodes expérimentales utilisées dans ce projet pédagogique sont des techniques déjà validées et maitrisées par les enseignants intervenants dans ces travaux pratiques, ce qui permet de limiter les phases de mise au point et donc d’éviter l’utilisation d’animaux supplémentaires à des fins de calibration technique. L’ensemble des procédures est réalisé par un enseignant habilité et formé à l’expérimentation animale, ainsi qu’à la chirurgie, garantissant ainsi la reproductibilité des gestes, limitant les variations expérimentales susceptibles d’augmenter le nombre d’animaux nécessaires, respectueux des contraintes réglementaires, et des mesures de raffinement. Le nombre d'animaux est déterminé en fonction des besoins pédagogiques du module d’enseignement, tout en étant réduit au minimum pour que cela reste compatible avec un apprentissage efficace des étudiants et avec la bonne réalisation des observations scientifiques. La promotion de Master comprend environ 20 étudiants par an. Afin de limiter le nombre d’animaux tout en permettant un encadrement pédagogique efficace, un ratio d’1 animal pour 3 étudiants est appliqué pour les travaux pratiques, ce qui correspond à 7 animaux par an. S’ajoute à cela un animal supplémentaire prévu à des fins de raffinement en cas d’atteinte des points limites et de nécessité d’arrêt anticipé de la procédure. Ainsi, le projet nécessite 8 souris par an, soit un maximum de 24 animaux sur la durée totale du projet de 3 ans. Cette stratégie permet de garantir un équilibre entre les exigences pédagogiques, la qualité de la formation dispensée aux étudiants et le respect du principe de réduction du nombre d’animaux utilisés, conformément aux principes éthiques et réglementaires en vigueur.
Raffinement
L’ensemble des procédures est conçu de manière à réduire au maximum la douleur, la souffrance, et l’angoisse des animaux. Les animaux sont hébergés dans des salles d’animalerie dédiées, éloignées des sources de bruit et des perturbations liées à l’activité d’enseignement. Ces locaux sont agréés pour l’hébergement des rongeurs de laboratoire et l’hébergement comprend une période d’acclimatation de 10 jours. De plus, les animaux sont hébergés en groupe afin de limiter le stress lié à l’isolement avec au moins un matériau de nidification permettant la construction de nids et l’expression de comportements naturels. Les manipulations expérimentales sont réalisées par un enseignant formé et habilité à l’expérimentation animale ainsi qu’aux gestes chirurgicaux, garantissant la maîtrise des procédures, la réduction du temps d’exposition des animaux à la procédure expérimentale et une contention adaptée et de courte durée. Ainsi le stress et l’inconfort qui pourraient survenir pendant la pesée des animaux et durant les manipulations sont réduits. Une anesthésie générale gazeuse est systématiquement utilisée, associée à l’administration d’un traitement anti-inflammatoire et anti-douleur adapté en pré- et post-opératoire afin d’assurer une prise en charge optimale de la douleur. Le bien-être des animaux est contrôlé à chaque étape de la procédure chirurgicale. Pendant l’acte chirurgical, la température corporelle est maintenue à l’aide d’un dispositif de tapis thermorégulé contrôlé par sonde thermique afin de prévenir l’hypothermie associée à l’anesthésie. Après la chirurgie, les animaux sont surveillés par les étudiants immédiatement après la procédure, puis quotidiennement par l’enseignant responsable afin de détecter précocement tout signe de douleur ou de complication. Après euthanasie et prélèvement du cerveau, les autres organes seront proposés à la communauté universitaire. Concernant l’animal surnuméraire prévu dans le protocole, celui-ci sera utilisé uniquement en cas d’atteinte anticipée des points limites. S’il n’est pas utilisé, il pourra être replacé à d’autres projets de recherche ou d’enseignement, contribuant ainsi à la réduction globale du nombre d’animaux utilisés.
Choix des espèces
Les souris de souche Swiss sont utilisées dans le cadre de ce projet car elles constituent un modèle animal de référence largement utilisé en recherche biomédicale et en enseignement en neurosciences. Cette espèce présente une organisation anatomique et fonctionnelle du système nerveux bien caractérisée, permettant l’étude des structures cérébrales et des réseaux neuronaux d’intérêt. L’utilisation de cette espèce facilite également l’interprétation des résultats et la comparaison avec les données scientifiques disponibles dans la littérature spécialisée. Le choix de cette souche permet ainsi de garantir une standardisation des conditions expérimentales et d’assurer un apprentissage fiable des techniques par les étudiants, tout en limitant les variations expérimentales susceptibles d’augmenter le nombre d’animaux nécessaires. Cela s’inscrit dans le respect du principe des 3R, pour atteindre les objectifs pédagogiques. Les animaux utilisés sont des souris adultes âgées d’environ 8 semaines. Ce choix d’animaux adultes est justifié par les caractéristiques techniques des procédures expérimentales prévues, la visualisation des réseaux de neurones nécessitant un animal dont le développement cérébral est achevé et dont l’anatomie cérébrale est stable. L’utilisation d’animaux adultes permet en effet l’utilisation d’atlas cérébraux de référence établis chez la souris adulte, facilitant la reproductibilité des expériences. De plus, le choix d’animaux adultes ne présentant donc pas de vulnérabilité particulière liée au développement ou au vieillissement, est adapté aux procédures prévues dans le protocole. Enfin, la taille du cerveau adulte permet d’obtenir un nombre plus important de coupes histologiques par animal, augmentant ainsi la quantité de données analytiques exploitables par individu et contribuant au principe de réduction du nombre total d’animaux utilisés.
Modèles expérimentaux de cancer de la prostate pour l’évaluation de nouvelles thérapeutiques par imagerie in vivo
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
2 690 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, la plupart classées sévère. Elles subissent l'induction de tumeurs de la prostate, parfois une castration chirurgicale, puis un suivi par imagerie jusqu'à seize semaines, les modèles à métastases osseuses atteignant le squelette entier. Le porteur décrit un projet mené "à la demande de chercheurs extérieurs" et pour "nos clients" souhaitant des études d'efficacité thérapeutique. Ce travail relève ainsi d'une prestation commerciale facturée, dont dépend la mise à mort des 2 690 souris.
Objectifs
Ce projet a pour but de mettre en œuvre, à la demande de chercheurs extérieurs à notre laboratoire, des modèles de cancer de la prostate et de les étudier par imagerie in vivo, à des fins de compréhension de mécanismes fondamentaux ou d'évaluation de nouveaux médicaments. Il s’agit d’une nouvelle demande faisant suite à la fin de validité de la précédente autorisation. Dans le projet précédent, nous avons réalisé 18 études qui nous ont permis de proposer des modèles tumoraux de cancer de la prostate. Les résultats que nous avons obtenus ont été très pertinents avec une publication scientifique et une autre en cours de rédaction. Nous avons testé le potentiel thérapeutique ou métastatique de certains canaux ioniques dans le cancer de la prostate et nos clients souhaitent poursuivre sur des études d’efficacité thérapeutique. Avec 60 000 nouveaux cas en France tous les ans, le cancer de la prostate représente aujourd’hui la première cause de mortalité chez l’homme après 70 ans. On compte actuellement 9 000 décès par an pour ce cancer qui touche 1 homme sur 8. Actuellement, le Docetaxel est le traitement de référence des cancers de la prostate métastatiques résistants au traitement hormonal (CRPC). Cette chimiothérapie apporte un réel bénéfice au niveau de la survie des malades. Malheureusement, on sait qu’une grande partie des malades traités par ce médicament développent une résistance à la chimiothérapie. C’est pourquoi aujourd’hui, l’enjeu majeur consiste à trouver à la fois des méthodes pour prédire cette résistance et de nouvelles combinaisons de traitements pour surmonter cette résistance et éviter les traitements inutiles et toxiques. Le projet représente un ensemble d’études types qui pourront viser à comprendre des mécanismes impliqués dans la progression tumorale ou à évaluer l'efficacité thérapeutique de nouveaux traitements.
Bénéfices attendus
Il s’agit d’étudier par imagerie in vivo des modèles de cancer de la prostate à des fins de compréhension de mécanismes fondamentaux ou pour l'évaluation de nouveaux médicaments. Dans le projet précédent, les résultats que nous avons obtenus ont été très pertinents, nous avons testé le potentiel thérapeutique ou métastatique de certains canaux ioniques impliqués dans le cancer de la prostate et nos clients souhaitent poursuivre sur des études d’efficacité thérapeutique qui mettent en œuvre ces canaux ioniques. Ces travaux ont fait l’objet d’une publication scientifique et une autre en cours de rédaction.
Procédures
Induction du modèle de cancer : - par chirurgie : 1 acte par animal (15min max d’intervention sous anesthésie générale) - sans chirurgie : injection intracardiaque (quelques secondes sous anesthésie générale) - par injection sous cutanée (quelques secondes sous anesthésie générale) par injection intra tibiale (5min sous anesthésie générale avec radiologie). Castration : 1 acte par animal par chirurgie (15min max d’intervention sous anesthésie générale). Non systématique. Suivi par imagerie : au maximum 2 examens non invasifs par semaine pendant 16 semaines sous anesthésie générale. Traitements : au maximum 5 traitements par semaine pendant 16 semaines par voie orale, intrapéritonéale ou intraveineuse. Prélèvement de sang sur animal vigile au niveau sub mandibulaire ou sur animal anesthésié en rétro-orbitaire : (en 3 fois sur 24h ou en 1fois/jour sur 5 jours) Prélèvement de sang terminal par ponction cardiaque sur souris endormie en fin d’étude.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables potentiels sur les animaux sont: -pour le modèle sous-cutané (SC) : taille de la tumeur importante en fin d'étude entrainant une gêne pour la locomotion, nécrose de la tumeur (Incidence modérée sur le bien-être ou l’état général des animaux). -pour le modèle orthotopique : taille de la tumeur importante en fin d'étude provoquant une gêne dans la mobilité, les fonctions urinaires et digestives. (Incidence modérée sur le bien-être ou l’état général des animaux). -pour le modèle intracardiaque : développement de métastases osseuses ostéolytiques ou ostéoblastiques sur tout le squelette (Incidence sévère sur le bien-être ou l’état général des animaux). -pour le modèle intra tibia : développement d’une tumeur osseuse ostéolytique ou ostéoblastique au niveau du tibia et fémur (Incidence sévère sur le bien-être ou l’état général des animaux). -dans les cas d’administrations répétées de traitements : effets indésirables tels que rougeur au niveau du site d’injection ou une légère perte de poids. Les nuisances décrites ci-dessus (certaines sévères) sont potentielles car il ne sera pas nécessaire d’atteindre ces effets pour les besoins expérimentaux. Lors de notre précédent projet, nous avons pu tester les modèles : - Sous cutané : Nous n’avons pas observé de problème particulier, le suivi permet d’éviter l’atteinte des points limites. - Intraprostatique : Nous avons pu observer sur 50% des souris, une perte de poids comprise d’entre 5 et 10%, 5 jours après la chirurgie. Elles ont repris leur poids à J11 grâce aux mesures de raffinement. - Intracardiaque : Nous avons pu observer sur 11% des souris de ce modèle des difficultés de locomotion associé à une perte de poids supérieure à 10%, sur 21% des souris une perte de poids supérieure à 10% sans autres signes apparents. Ces difficultés apparaissent en fin d’expérimentation, elles ont duré moins de 5 jours pendant lesquelles des mesures de raffinement ont été prises avant mise à mort.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort à l'issue de chaque procédure car des prélèvements d'organes seront effectués par la suite.
Remplacement
Le cancer et la formation des métastases sont des phénomènes complexes qui font intervenir de multiples étapes, tissus et types cellulaires, conduisant en particulier à l’échappement des cellules cancéreuses de la tumeur primaire et leur survie et dissémination dans l’organisme. Ces paramètres ne pouvant être étudiés in vitro, le recours aux animaux est indispensable. Par ailleurs, afin de développer de nouvelles stratégies anti-cancéreuses, des études précliniques sont nécessaires et ne peuvent être réalisées que chez l'animal pour tenir compte de la complexité de la physiologie d'un organisme entier.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit au maximum sans toutefois compromettre les objectifs. Les groupes témoins seront regroupés lorsque cela sera possible. La mise en œuvre de l'imagerie permettra de suivre le même animal au cours du temps ce qui permet de réduire significativement leur nombre à 10 par lot. Des tests non paramétriques (type Test de Mann-Whitney ou test de Kruskal-Wallis) seront utilisés par nos clients.
Raffinement
Les méthodes d'imagerie mises en œuvre sont non invasives et certains actes sont réalisés sous anesthésie ce qui limite le stress infligé au cours de l’expérimentation. Les animaux seront observés quotidiennement et des points limites prédictifs nous permettront de prendre les mesures nécessaires afin de limiter la souffrance au cours de l’expérimentation. De plus, durant les examens d'imagerie et l'induction du modèle tumoral, les souris seront anesthésiées et chauffées (tapis chauffant pour la chirurgie ou plateau chauffant pour l’imagerie). La douleur liée à la chirurgie sera également prise en charge par l'utilisation d'analgésiques. Par ailleurs, nous donnons du gel nutritif (adapté à la récupération après chirurgie) 7 jours avant la chirurgie pour habituation et une fois la chirurgie réalisée, pour assurer un meilleur rétablissement post-opératoire. Pour garantir le statut sanitaire des souris immunodéficientes, elles seront hébergées en portoir ventilé et des procédures strictes seront respectées durant les différentes séances d’imagerie (désinfection du matériel, entretien des locaux, ordre de passage des souris dans l’imageur…).
Choix des espèces
La souris est une espèce animale classiquement utilisée pour les études de tumorigenèse, de progression tumorale et métastatique de par la relative faible durée des expérimentations (quelques semaines), ainsi que par la possibilité d’utiliser des techniques d’imagerie in vivo. C’est ainsi le modèle animal de choix afin de réaliser des expérimentations permettant d’étudier la croissance de tumeurs primaires et de métastases issues de cellules cancéreuses. Par ailleurs il existe des souris immunodéficientes bien adaptées pour les implantations de cellules d'origine humaine. Modèle de cancer réalisable chez la jeune souris (6 à 8 semaines). A ce stade, la croissance et le développement des tumeurs sont optimaux. Sur des animaux plus âgés, il est possible qu’une légère immunocompétence apparaisse, augmentant ainsi le risque de rejet de greffe tumorale.
Étude de la biologie du parasite responsable du paludisme et développement de vaccins anti-paludéens à l’aide de modèles murins MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
6 570 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, pour étudier le paludisme et développer un vaccin. Chacune peut recevoir des infections par Plasmodium, par injection ou par piqûres de moustiques infectés, des prélèvements sanguins quotidiens sur près de trois semaines, et pour certaines des chirurgies comme l'implantation d'un anneau de titane, une ablation de la rate ou une greffe de peau humaine. Le RNT classe ces manipulations répétées en souffrance légère. Les souris sont mises à mort avant l'apparition des symptômes du paludisme, que le porteur cherche à devancer.
Objectifs
Notre but majeur est la compréhension fonctionnelle des interactions parasite-hôte qui surviennent lors de la phase initiale de l’infection palustre dans le but ultime de développer un vaccin anti-paludique pré-érythrocytaire. A cet effet, nous utilisons une combinaison d’outils de génétique moléculaire, de biologie cellulaire et d’imagerie intra-vitale afin de comprendre comment l’animal est infecté et comment il monte une réponse immunitaire protectrice contre le parasite. Tous ces sujets doivent être abordés in vivo, en utilisant l'expérimentation animale, car la complexité de l'infection et de l'immunité ne peut être reproduite in vitro. Par conséquent, en utilisant principalement P.berghei et P.yoelii dans un modèle murin de paludisme, notre travail se décline selon trois axes majeurs : 1. Imagerie fonctionnelle de la phase pré-érythrocytaire de l’infection. 2. Compréhension de la mise en place de la protection contre la phase pré-érythrocytaire 3. Développement préclinique d'un vaccin pré-érythrocytaire contre le paludisme.
Bénéfices attendus
Dans ce projet nous espérons (i) mieux comprendre les premières étapes de l’infection en utilisant des approches de biologie cellulaire et moléculaire ainsi que la microscopie intra-vitale pour identifier les composants essentiels du parasite susceptibles de constituer des cibles pour de nouveaux médicaments et vaccins, (ii) mieux comprendre comment une immunité protectrice contre le parasite peut se développer et identifier de nouvelles cibles vaccinales, et (iii) développer pré-cliniquement un vaccin plus efficace contre le paludisme.
Procédures
[MODIFICATION] IMMUNISATIONS POUR VOIE INTRANASALE et DUREE DU PROJET Afin d’identifier et d’évaluer l’activité protectrice de nouvelles cibles vaccinales ou plateformes d’administration et d’élucider leur mécanisme d’action, les souris impliquées dans cette procédure expérimentale pourront être soumises à des injections sous-cutanées (15 sec), intrapéritonéales (15 sec), intramusculaires (15 sec) ou intraveineuses (30 sec) ainsi qu’à des prélèvements sanguins et un ou plusieurs challenges infectieux par des parasites de Plasmodium. Bien que susceptibles d’être répétées, ces manipulations sont toutes considérées de sévérité légère et seront, de plus, suffisamment espacées dans le temps pour limiter le stress infligé aux animaux. Pour infecter les souris vigiles avec des sporozoïtes, le parasite sera micro-injecté dans le coussinet plantaire (15 sec) ou par la voie intraveineuse (30 sec). Les souris anesthésiées seront infectées par micro-injection dans la peau du pavillon auriculaire (15 sec) ou par des piqûres de moustiques infectés. Après infection, la parasitémie des animaux est contrôlée par frottis sanguins ou cytométrie en flux, à partir d’une goutte de sang prélevée par ponction de la veine caudale de la queue (30 sec). Pendant la phase de croissance exponentielle du parasite, qui se produit normalement entre le 3ème et le 6ème jour post-infection les prélèvements seront réalisés quotidiennement. Alternativement, l’infection hépatique sera mesurée de manière non invasive par bioluminescence, ou par microscopie/ RT-PCR dans le foie disséqué. Des souris anesthésiées seront soumises à un acte chirurgical sans réveil (20 min) pour réaliser l’imagerie à court terme dans le foie ou la rate. Des souris anesthésiées et analgésiées seront soumises à un acte chirurgical avec réveil pour l’implantation abdominale d’un anneau en titane (imagerie longitudinale – foie, rate) (45 min), pour une splenectomie (45 min), ou pour la greffe de la peau humaine (30 min) (imagerie longitudinale de P. falciparum – peau).
Impact sur les animaux
Le rongeur vigile pourra souffrir de l'inconfort causé par des injections (intrapéritonéale, sous-cutané, intramusculaire, intraveineuse), par la micro-injection dans la peau, ainsi que par le prélèvement d'échantillons de sang à la queue, au menton ou à la joue. Bien que susceptibles d’être répétés, les prélèvements seront suffisamment espacés dans le temps pour limiter le stress infligé aux animaux : les prélèvements d’un volume sanguin de 25 µL à 50 µL au niveau d’un même site (joue, menton, veine caudale) seront espacés au minimum d’une semaine et les prélèvements d’une goutte de sang à l’extrémité de la queue pourront être répétés au plus quotidiennement pendant 20 jours consécutifs mais en aucun cas le volume prélevé n’excèdera 20 µL par période glissante de 7 jours. Les animaux infectés par le parasite seront mis à mort par la dislocation cervicale ou par exposition au CO2, avant l'apparition des symptômes du paludisme expérimental.
Devenir
Toutes les souris utilisées dans les procédures expérimentales seront infectées par des parasites type Plasmodium. Il ne sera donc pas possible de les maintenir en vie ou les réutiliser. Les souris seront mises à mort avant la phase symptomatique du paludisme. Seulement méthodes de mis à mort validées par le comité étique seront utilisées.
Remplacement
Les processus conduisant à l'infection de l'hôte par les différents stades parasitaires ou à la protection de l'hôte contre ces stades par le biais de la vaccination sont extrêmement complexes. Dans la phase initiale de l’infection, ils impliquent des interactions multiples et dynamiques entre le parasite et plusieurs types cellulaires dans la peau, les ganglions, les vaisseaux, le sang, la rate et le foie, qu'il est impossible de répliquer dans leur ensemble dans un système in vitro. L’étude approfondie de cette phase nécessite donc l’utilisation de modèles animaux pour appréhender cette incroyable complexité. Depuis les années 1950, les espèces de Plasmodium qui infectent les rongeurs, P. berghei et P. yoelii, sont devenues les espèces de choix pour étudier cette phase, et ont notamment permis la découverte des candidats vaccins les plus importants contre le paludisme. Pour évaluer les activités cellulaires des sporozoïtes (motilité, traversée cellulaire, infection cellulaire), et les effets neutralisants des effecteurs immunitaires ou antipaludiques, les expériences seront effectuées in vitro. Malheureusement, certains effets observés in vitro ne correspondent pas à ce qui est observé in vivo, nous obligeant à valider les résultats obtenus in vitro dans des modèles expérimentaux animaux.
Réduction
Nous utilisons le nombre minimum possible d’animaux pour nos expériences calculé à l'aide d'un logiciel développé à l'Institut Pasteur (shade.pasteur.fr) qui compare deux moyennes de groupes non jumelés à l'aide d'un test bilatéral paramétrique, en tenant compte des données expérimentales. Pour l’analyse statistique de nos expériences, nous appliquerons un test paramétrique ANOVA non jumelé, si nécessaire, ajusté pour comparaison multiple. Nous normaliserons les tests statistiques sur un effet "répétition/cage" grâce à l'utilisation de modèles mixtes. Également, nous rechercherons toujours à réduire ce nombre en améliorant les procédures, par exemple, en développant des méthodes d'imagerie intravitale non invasive pour diminuer le nombre de souris utilisées dans les études longitudinales.
Raffinement
Nos points limites sont établis de manière à éviter la phase symptomatique du paludisme chez les animaux infectés. Les souris auxquelles sont inoculées les espèces de Plasmodium adaptées aux rongeurs de laboratoire sont suivies quotidiennement durant la phase sanguine de l’infection afin de déterminer leur niveau de parasitémie. Les animaux sont mis à mort avant que n’émergent des symptômes signant des dommages systémiques – prostration, aspect du pelage, perte de poids - et témoignant du développement asexué non contrôlé du parasite dans le sang. Il est important de souligner que la phase de l’infection que nous analysons est asymptomatique, et que lorsque les procédures expérimentales nécessitent d’atteindre la phase érythrocytaire de l’infection, les animaux sont sacrifiés avant la survenue de symptômes ou complications létales- neuropaludisme, anémie prolongée. Nous utiliserons la grille comportementale/clinique de la SBEA pour évaluer l'état de santé des souris. Les souris avec plus de 1% de parasitémie seront observées quotidiennement, les autres seront suivies hebdomadairement. Les animaux obtenant un score de deux points (ex : poil hérissé, prostration) bénéficieront de mesures d'amélioration des conditions d'hébergement (enrichissement, chaufferette), de l'aliment (gel diététique) ou de traitements médicamenteux (analgésie). Les souris présentant un score supérieur à deux seront mises à mort par exposition au CO2.
Choix des espèces
Les hôtes naturels des parasites P. berghei et P. yoelii sont des espèces de rongeurs sauvages (Grammomys, Thamnomys) d’Afrique Centrale. Des isolats de ces parasites ont été transmis et adaptés aux souris et rats de laboratoire depuis de nombreuses années par plusieurs équipes. Il est reconnu dans la communauté scientifique que l’infection des rongeurs avec ces parasites est un modèle biologiquement pertinent pour étudier plusieurs aspects du paludisme chez l’Homme. La preuve de l’intérêt d’une recherche rigoureuse chez le rongeur pour éclairer ou informer la recherche chez l’Homme n’est plus à faire. Nous privilégions l’utilisation de souris dans nos études car la plupart des concepts issus des modèles souris, en particulier dans le domaine de la vaccinologie anti-palustre, se sont révélés exacts chez l’Homme. De plus, la disponibilité de diverses souris transgéniques rend cette espèce adaptée aux études fonctionnelles des voies impliquées dans l'infection et la protection de l'hôte. Les inoculations de parasites aux souris seront réalisées sur de jeunes adultes de 4 semaines car ils ne sont pas immunocompétents, ce qui favorise l’infection par le parasite. Les expériences d’imagerie in vivo seront réalisées sur des souris de 4-12 semaines. Les expériences sur les réponses immunitaires seront réalisées sur des souris adultes immunocompétentes âgées de plus de 6 semaines.
Rôle du métabolisme des phosphoinositides dans la physiopathologie de la myopathie centronucléaire liée au chromosome X (1/2)
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
1 217 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère. Modifiées pour perdre une protéine musculaire, elles développent une myopathie qui les affaiblit jusqu'à la perte de mobilité et la mort vers treize semaines, et subissent des tests répétés de force, de course sur tapis et de motricité. Le porteur affirme que la maladie ne provoque pas de douleur, tout en décrivant une dégradation musculaire qui mène à la mort. Les bénéfices thérapeutiques restent suspendus à de futurs essais, quand la dissection des muscles après mise à mort, elle, est programmée.
Objectifs
La myopathie centronucléaire liée au chromosome X est une maladie grave, touchant les garçons dès la naissance, qui rend les muscles très faibles et pour laquelle il n’existe malheureusement pas encore de traitement. Elle est causée par des mutations d’un gène codant une protéine qui contrôle le métabolisme de certains types de lipides. Lorsque la protéine ne fonctionne pas bien, les muscles perdent leur force et deviennent plus petits. Afin de mieux comprendre le rôle de cette protéine dans le fonctionnement du muscle et dans le développement de la myopathie centronucléaire, nous avons créé une nouvelle lignée de souris dans laquelle cette protéine a perdu sa fonction. Ces souris commencent à montrer des signes de myopathie vers 6 semaines et vivent moins longtemps que les souris normales. Dans leurs cellules musculaires, deux fonctions semblent particulièrement perturbées : la fonction mitochondriale et la fonction lysosomale. L’objectif du projet est de mieux caractériser l’évolution de la fonction musculaire chez ces souris au cours du développement de la myopathie centronucléaire et de comprendre comment les fonctions mitochondriale et lysosomale sont contrôlées par cette protéine. Nous testerons également plusieurs traitements pour restaurer les fonctions mitochondriale et lysosomale lorsque la protéine ne fonctionne plus afin de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques contre cette maladie. Le projet se deroulera dans deux établissements utilisateurs : les tests auront lieu dans l’EU 1 et la mise à mort sera effectuée dans l’EU 2.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre comment la perte de fonction de la protéine perturbe le fonctionnement normal du muscle et provoque la myopathie centronucléaire liée au chromosome X (XLCNM). Plus précisément, il permettra d’étudier le rôle des fonctions mitochondriale (production d'énergie pour la cellule) et lysosomale (recyclage des déchets cellulaires) dans le développement de la maladie. De plus, il permettra de tester de nouveaux traitements potentiels en vérifiant qu’ils ne sont pas toxiques et qu’ils sont efficaces pour empêcher ou ralentir le développement de la XLCNM. Si les résultats sont positifs, ils pourront être proposés pour de futurs essais chez les patients atteints de myopathie centronucléaire.
Procédures
Sur le 1er groupe d’animaux, 4 fois (semaines 4-7-10-13), sur animal vigile sauf si mention contraire : -mesure de composition corporelle : contention dans l’appareil de mesure de la composition corporelle, 2 minutes -test de force (force d'agrippement des 4 membres à une grille reliée à un dynamomètre): 5 x 1 seconde, avec au moins 1 minute de repos entre 2 essais -test de course sur tapis roulant : 10-45 minutes selon la capacité des animaux -test de motricité (temps mis pour franchir un obstacle de type "échelle horizontale" en marchant): 3 x 30 secondes à 5 minutes selon la capacité des animaux -test de la fonction de la jonction neuromusculaire (animal anesthésié) : stimulation électrique 8 x 0,2 millisecondes Sur le 2ème groupe d’animaux, 1 fois : 1 injection sur animal anesthésié, 10 secondes Sur le 3ème groupe d’animaux : -injection intrapéritonéale : 1 / jour pendant 28 jours consécutifs, 28 x 10 secondes -test de force: 5 x 1 seconde, avec au moins 1 minute de repos entre 2 essais ; toutes les 2 semaines, entre 6 et 10 fois (selon de combien de temps le traitement retarde l’apparition des symptômes sévères) -test de motricité : 3 x 30 secondes à 5 minutes selon la capacité des animaux ; toutes les 2 semaines, entre 6 et 10 fois (selon de combien de temps le traitement retarde l’apparition des symptômes sévères) Sur le 4ème groupe d’animaux : -test de force: 5 x 1 seconde, avec au moins 1 minute de repos entre 2 essais ; toutes les 2 semaines, entre 6 et 10 fois (selon de combien de temps le traitement retarde l’apparition des symptômes sévères) -test de motricité : 3 x 30 secondes à 5 minutes selon la capacité des animaux ; toutes les 2 semaines, entre 6 et 10 fois (selon de combien de temps le traitement retarde l’apparition des symptômes sévères) Toutes ces interventions seront réalisées dans l’établissement EU 1.
Impact sur les animaux
La myopathie centronucléaire chez l’Homme se caractérise par une faiblesse musculaire dès la naissance, sans douleur, due à l’absence d’une protéine. La faiblesse musculaire s’aggrave progressivement jusqu’ à ce qu’ils ne puissent plus respirer et meurent vers l’âge de 2,5 ans. La souris que nous avons créée, dont la protéine n’est plus fonctionnelle, développe les premiers symptômes autour de 6 semaines. D’après nos premiers résultats, ces symptômes deviennent sévères rapidement pour aboutir à une perte de mobilité des membres inférieurs et à la mort des animaux autour de 13 semaines en moyenne. Ponctuellement, les souris seront soumises à des stress et de l’inconfort pour des durées très courtes (contention nécessaire aux injections et injections elles-mêmes, mesures de composition corporelle et de force) ou courtes avec fin immédiate du stress et de l’inconfort à l’arrêt de la manipulation (tests d’endurance). Les traitements viseront tous à améliorer le phénotype musculaire et à prolonger la durée de vie. Deux d’entre eux ont déjà été largement utilisés dans des modèles animaux et testés lors d’études cliniques. Concernant le troisième, son absence de toxicité à haute dose à court et moyen termes (4 mois) a déjà été testée et validée sur des souris. Afin de déterminer les conditions de traitement optimales, la présente demande inclut une expérience préliminaire au cours de laquelle des petits groupes de souris seront traités selon différentes modalités, mais à des doses inférieures ou égales à celle déjà testée. Enfin, l’injection par voie intraveineuse d’un virus spécial (utilisé chez l’Homme en thérapie génique), qui permettra de faire briller une protéine dans certaines parties de la cellule, bien que réalisée sous anesthésie, pourrait entraîner un inconfort léger au réveil. Pour éviter cela, nous utiliserons un gel analgésique localement.
Devenir
A l’issue des procédures, les animaux seront mis à mort et leurs muscles disséqués pour réaliser des analyses histologiques et moléculaires ou pour préparer des cultures de cellules musculaires in vitro.
Remplacement
Le but principal de ce projet est d’étudier un nouveau modèle de la myopathie centronucléaire pour mieux comprendre comment les muscles sont touchés. Ensuite, ce modèle servira à tester plusieurs traitements qui pourraient aider les muscles à mieux fonctionner. Pour cela, nous devons mesurer des paramètres importants du fonctionnement du muscle comme la force, l’endurance, la façon dont les souris bougent mais aussi combien de temps elles vivent. Ces paramètres ne peuvent pas être mesurés avec d’autres méthodes. Les autres méthodes disponibles sont des cellules musculaires qui poussent dans une boîte en plastique au laboratoire, mais ces cellules ne deviennent jamais aussi développées, ni aussi fortes, que de vrais muscles dans un corps vivant. Elles ne peuvent même pas vraiment se contracter comme un vrai muscle. Elles ont quand même été utiles pour comprendre ce qui ne marche plus quand la protéine d’intérêt est absente, et pour trouver quelles parties de la cellule sont perturbées (par exemple, les mitochondries et les lysosomes). Ces cellules seront d’ailleurs à nouveau utilisées plus tard pour comprendre comment elles réagissent aux traitements, mais pour bien étudier l’effet des médicaments sur les muscles, il faut utiliser les souris du modèle de myopathie centronucléaire.
Réduction
Nous avons utilisé des méthodes statistiques pour calculer combien de souris utiliser pour chaque expérience afin d’être sûrs d’obtenir des résultats fiables, tout en utilisant le moins d’animaux possible. Tout d’abord, nous comparerons la force des muscles entre les souris saines et les souris malades au cours de l’évolution de la maladie. D’après nos tests précédents, il faut environ 21 souris par groupe pour voir une vraie différence. Nous incluerons 2 souris de plus dans le groupe malade au cas où certaines souris meurent plus tôt à cause de la myopathie. Des souris seront également nécessaires pour étudier ce qui se passe à l’intérieur des muscles aux différentes étapes du développement de la maladie, c’est-à-dire aux âges de 4, 7, 10 et 13 semaines. Pour ces analyses, nous aurons besoin de 9 souris par groupe. Ensuite, nous ferons un essai pour vérifier une nouvelle technique qui permet de « marquer » certaines parties des cellules musculaires (mitochondries et lysosomes) avec un virus spécial. Pour ça, nous utiliserons seulement 3 souris saines par groupe. Pour comparer les protéines et les petites molécules dans ces mitochondries et ces lysosomes chez les souris saines et les souris malades, nous utiliserons 6 à 12 souris par groupe selon la variabilité des mesures. Les groupes de souris malades auront une souris de plus au cas où l’une meure plus tôt à cause de la myopathie. Puis nous testerons différents traitements (3 médicaments, donnés à différents moments au cours du développement de la maladie) pour essayer d’améliorer la force des muscles et augmenter la durée de vie des souris. Pour cela, nous aurons besoin de plusieurs groupes de souris pour comparer les effets de ces traitements à des souris saines et à des souris malades non traitées. Nous aurons besoin de 19 souris par groupe pour détecter une différence intéressante, et nous ajouterons 2 souris de plus dans les groupes de souris malades au cas où certaines souris meurent plus tôt à cause de la myopathie. Enfin, des souris serviront à préparer des cellules musculaires en laboratoire pour comprendre ce qui se passe à l’intérieur des cellules et comment elles réagissent aux traitements.
Raffinement
La myopathie centronucléaire, chez les souris comme chez les patients, ne provoque pas de douleur au niveau des muscles, ni ailleurs. Nous serons quand-même attentifs à ce que les souris ne souffrent pas durant nos expériences. Pour cela, nous leur permettrons d’avoir un comportement aussi naturel que possible dans leurs cages en leur donnant du matériel leur permettant de ronger et de faire un nid, et elles seront plusieurs par cage afin de ne pas souffrir d’isolement. Lorsque leurs muscles deviendront faibles et qu’elles auront du mal à se déplacer, nous leur fournirons la nourriture et l’eau directement au fond de la cage pour qu’elles n’aient aucun effort à faire pour s’alimenter. Avant de réaliser les tests de la fonction musculaire, nous les habituerons aux systèmes utilisés pour qu’elles ne soient pas stressées au moment de faire les tests. Lorsque des anesthésies seront nécessaires, nous les placerons sur un tapis chauffant pour ne pas qu’elles aient froid durant l’expérience. Suite aux injections intraveineuses de virus, nous utiliserons un analgésique local.
Choix des espèces
La myopathie centronucléaire est une maladie musculaire due à l’absence d’une protéine dans le muscle. Nous avons donc créé une nouvelle lignée de souris chez laquelle cette protéine ne fonctionne pas dans le muscle afin d’étudier comment la protéine provoque la maladie. Ces souris ne présentent initialement pas de symptômes ; à partir de 6 semaines, leur fonction musculaire commence à se dégrader et elles meurent en moyenne vers 13 semaines. Dans les expériences sans traitement, nous utiliserons des souris âgées entre 4 et 13 semaines, c’est-à-dire avant le moment où elles risquent de mourir de la maladie. Dans les expériences avec traitements, ceux-ci auront pour objectif d’améliorer la fonction musculaire, mais également d’augmenter la durée de vie. Si ces traitements fonctionnent, nous serons donc amenés à étudier les souris au-delà de 13 semaines, plus ou moins longtemps en fonction de l’efficacité des traitements pour maintenir la fonction musculaire.
Elevage et caractérisation génétique par prélèvement, d’un modèle de rongeur permettant l’étude et l’évaluation de composés thérapeutiques ciblant une maladie neurodégénérative (Projet multi-sites : 1/2)
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
Génétiquement modifiées pour modéliser la sclérose en plaques, 3 900 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dans le cadre d'un élevage et d'un génotypage par biopsie. De 3,5 à 4 % d'entre elles peuvent développer spontanément une paralysie, et environ 13,5 % un lymphome comprimant les poumons. Le RNT justifie l'élevage par le besoin de fournir ces animaux à d'autres projets de recherche. Une partie des souris est expédiée vers un autre établissement ou maintenue pour l'élevage, le reste mis à mort, notamment les animaux sans génotype d'intérêt ou atteignant les points limites.
Objectifs
La sclérose en plaques est une maladie inflammatoire auto-immune (le corps attaque ses propres constituants) chronique du système nerveux central (cerveau, moëlle épinière et nerfs optiques). Elle se manifeste par des troubles moteurs, sensitifs, de l’équilibre, visuels… responsables à long terme d'un handicap. Elle touche 120000 personnes en France dont 3000 nouveaux cas par an. Dans la majorité des cas, les premiers symptômes apparaissent entre 25 et 35 ans. Des facteurs génétiques mais également des facteurs environnementaux prédisposent à la maladie. Les causes exactes de la sclérose en plaques restent inconnues à ce jour. L’objectif de ce projet est d’élever des rongeurs modèles pertinents pour l’étude de cette pathologie. Ces modèles peuvent développer spontanément ou via des altérations génétiques une ou plusieurs caractéristiques de la sclérose en plaques. Les animaux issus de ces développements seront utilisés afin d’étudier l’apparition et le développement de la sclérose en plaques mais également de tester de nouveaux traitements. Ce projet et la procédure qu'il comporte seront mis en œuvre sur notre Etablissement utilisateur 1 et sur notre Etablissement utilisateur 2.
Bénéfices attendus
L’identification des mutations spontanées et l’amélioration des outils permettant les manipulations génétiques ont permis de créer et/ou d’identifier des modèles animaux de diverses maladies humaines provoquées par l'expression qualitativement ou quantitativement anormale d'un gène, modèles dont l'intérêt pour la compréhension de la pathologie humaine comme pour la mise au point d'éventuelles thérapeutiques est évident. Ces modèles murins, au plus proche de la maladie humaine, sont donc très pertinents pour l’étude de l’apparition et du développement de la sclérose en plaques mais également le développement de traitements pharmacologiques.
Procédures
Les animaux présentent un phénotype dommageable (modèle de sclérose en plaque). Une biopsie sera réalisée sur animal vigile afin de génotyper l’ensemble des animaux obtenus. Cette procédure ne durera pas plus de 30 secondes. En règle générale, une biopsie suffit pour établir le génotype de l’animal.
Impact sur les animaux
Une douleur légère ainsi qu’un léger stress peuvent être induits lors du prélèvement de biopsies en vue du génotypage. En fonction des besoins et afin d’améliorer l’indice de productivité de la lignée, il pourrait être nécessaire d’héberger individuellement des mâles pour une période ne dépassant pas 7 jours avant qu’ils soient présentés aux femelles afin de mettre en place des accouplements. Cela pourrait générer un stress léger. 3,5 à 4% des animaux de la lignée peuvent développer à tout âge de façon spontanée une maladie neurodégénérative dont les signes cliniques vont d’une paralysie partielle ou légère de la queue (principalement à l'extrémité) ou des membres à une paralysie complète de la queue ou des membres. Les animaux porteurs de la mutation d’intérêt développent un lymphome dont l’apparition se fait à environ 7-8 mois. Ces lymphomes touchent environ 13,5% des animaux et sont caractérisés par un gonflement du thymus induisant une constriction des poumons à l’intérieur du thorax.
Devenir
Les animaux sont soit expédiés dans un autre établissement utilisateur soit utilisés dans notre établissement (utilisation continue), soit mis à mort pour la gestion de l'élevage (atteinte des points limites du phénotype dommageable, prélèvement de gamètes). Les animaux ne présentant pas de génotype d’intérêt pour la poursuite du projet seront mis à mort (pas d’autre utilisation possible).
Remplacement
Les projets expérimentaux comportent classiquement une phase d'étude initiale in vitro qui permettent une sélection initiale des propriétés pharmacologiques et qui permettent de valider certaines hypothèses permettant l'obtention de données préliminaires et complémentaires. Les modèles murins proposés ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car une deuxième étape d'étude nécessite de consolider les résultats in vitro et valider ses hypothèses sur un modèle in vivo. Le projet actuel ne peut pas être envisagé sans étape in vivo donc sans modèle animal ; en effet, avant de pouvoir envisager une étude clinique sur les patients souffrant de maladies neurodégénératives, il est nécessaire de démontrer que les molécules sélectionnées ont les effets pharmacologiques escomptés et qu'elles ne présentent pas d'effets toxiques majeurs.
Réduction
Les protocoles sont réalisés en fonction des besoins expérimentaux liés à l'utilisation de ces animaux par nos collaborateurs. Le nombre d’animaux est déterminé de manière à utiliser le minimum d’animaux par groupe permettant l’obtention de résultats homogènes. Par ailleurs, notre savoir-faire et nos données historiques permettent d’utiliser le minimum d’animaux avec une optimisation de rendement pour des résultats robustes et reproductibles. Aucune approche statistique n’a été réalisée.
Raffinement
Les animaux porteurs de la mutation d’intérêt sont susceptibles de développer une maladie neurodégénérative de façon spontanée. L’apparition des symptômes signe du développement sous-jacent d’une maladie neurodégénérative entrainera la mise à mort de l’animal concerné. De plus, à partir de l’âge de 7-8 mois, ces animaux peuvent également développer un lymphome. Afin d’anticiper l’atteinte des points limites, les animaux porteurs de la mutation d’intérêt seront donc euthanasiés, au plus tard, lorsqu’ils auront 6-7 mois. Les animaux seront évalués sur leur aspect physique et leur comportement selon une grille d’observation indiquant les points limites. Les animaux aptes au transport seront livrés d’un établissement à l’autre via un transporteur agréé et en respectant le bien-être des animaux. Le transport entre les 2 EU prend moins d’une heure. Au cours de ce voyage, les animaux seront placés dans des colis munis de filtres (afin de maintenir leur statut sanitaire), de litière, d’aliment, d’enrichissement et d’hydrogel. Les animaux seront transportés via des camions ventilés et thermorégulés.Le transport entre les 2 EU prend moins d’une heure. Au cours de ce voyage, les animaux seront placés dans des colis munis de filtres (afin de maintenir leur statut sanitaire), de litière, d’aliment, d’enrichissement et d’hydrogel. Les animaux seront transportés via des camions ventilés et thermorégulés.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce est conditionné par les besoins scientifiques des projets. Les rongeurs sont des modèles animaux simples à élever, à reproduire et à entretenir en grand nombre ainsi qu’à manipuler et modifier génétiquement comparativement à d’autres espèces. Ils sont un modèle de choix pour les études précliniques en raison de leur petite taille, de leur courte gestation, de leur durée de vie et de la disponibilité en réactifs expérimentaux. Le génome des souris est bien caractérisé et très comparable au génome humain. Enfin, la proximité clinique entre les modèles de rongeurs génétiquement modifiés et les maladies humaines fait de ceux-ci des modèles de choix relativement robustes pour extrapoler les résultats et en tirer des résultats pertinents pour la pathologie humaine. L’âge des animaux est conditionné par les objectifs scientifiques du projet. Les animaux seront hébergés dans nos locaux dès leur naissance et jusqu’à leur envoi ou leur mise à mort. Pour l’élevage, les accouplements seront réalisés à maturité sexuelle. Au moment de l’expédition, l’âge varie en fonction des besoins. Les animaux pourront être envoyés à nos partenaires dès le sevrage ou avec leur mère si les animaux ne sont pas encore sevrés. Des femelles gestantes pourraient également être expédiées avant le dernier tiers de la gestation. Pour la collecte de sperme et d’ovocyte, des adultes matures sexuellement seront utilisés.
Nouvelle immunothérapie dans le contrôle de l’inflammation responsable du développement tumoral dans le poumon chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Soumises à une inoculation de tumeur par injection ou par chirurgie, 1 864 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, la grande majorité classée sévère. Elles reçoivent ensuite des injections de traitements plusieurs fois par semaine pendant deux à quatre semaines, les tumeurs pouvant provoquer douleurs, perte de poids et gêne respiratoire. Le RNT range tous ces modèles parmi les plus sévères et prévoit une surveillance quotidienne aux moments critiques. À la fin de chaque procédure, les souris sont mises à mort et des organes prélevés.
Objectifs
Ces dernières années, la compréhension des différents acteurs d’une réponse inflammatoire que ce soit dans le cas d’auto-immunité, de rejet d’organes, ou de réponse antitumorale a mis en lumière l’équilibre entre l’activation et l’inhibition de cette réponse. Les traitements de plus en plus ciblés visent des gènes spécifiques de l’immunité sur l’une ou l’autre catégorie des populations immunitaires avec pour effet de moduler la réponse immune. Dans le cas du cancer, les molécules ciblant des points de blocage à la surface des cellules immunitaires ont eu de très bons résultats en essais cliniques. Ces essais ont été rendus possibles grâce à la preuve de concept sur des modèles précliniques chez la souris. Malgré ces avancées, les rechutes sont encore trop nombreuses et il est essentiel de chercher d’autres molécules et d’autres combinaisons. Ce projet s’inscrit ainsi afin d’étudier le potentiel thérapeutique de nouvelles molécules de type protéique dans des modèles de cancer. Nous aimerions donc tester différents traitements de l’immunité capables d’activer un ou plusieurs types cellulaires et analyser les effets engendrés par cette activation dans des modèles de cancer.
Bénéfices attendus
A terme, ce projet pourrait permettre d’identifier un traitement très novateur dans la recherche de nouvelles stratégies thérapeutiques contre le cancer humain afin de répondre à des besoins cliniques importants. Durant toutes ces évaluations précliniques, de nouvelles découvertes pourront être faites, notamment durant l’étude de la mécanistique du produit sur le système immunitaire en mettant en lumière des populations cellulaires antitumorales et des mécanismes d’action particuliers et inhérents aux molécules étudiées.
Procédures
Les animaux seront soumis à une inoculation de tumeur via injection (5min), ou via intervention chirurgicale sous anesthésie et analgésie (10-15min). Pour le suivi de chaque modèle, les animaux seront également soumis à des injections (1min) pour les traitements (environ 3 fois par semaine pendant 2 à 4 semaines selon le type de traitement) sur animaux vigiles et, si besoin, pour l’injection d'une molécule "traceur" de la tumeur lors du suivi de la croissance tumorale par "scanner" (1 à 2 fois par semaine). Les animaux pourront être soumis à des injections (environ 3 fois par semaine pendant 2 à 4 semaines) vigiles ou sous anesthésie (5min). Dans le cadre de l’étape d’identification des mécanismes mis en jeu dans la réponse antitumorale, un prélèvement de sang des animaux pourra être effectué sous anesthésie (intervention sans réveil). Certains animaux seront prélevés en sang en vigile (4 fois par jour le premier jour, puis une fois par jour la première semaine puis une fois par semaine, 20sec).
Impact sur les animaux
Les modèles tumoraux décrits dans cette saisine ont plusieurs effets indésirables en fonction du modèle. Une altération de la respiration peut être observée (point-limite). Tous ces modèles (or les modèles sous-cutanés) peuvent induire de la douleur, une perte de poids chez la souris, une diminution de la mobilité, un stress notamment dû à la chirurgie associée, et un comportement altéré provoqué par ses différents effets indésirables. Tous ces modèles sont considérés comme sévères et une attention particulière sera apportée régulièrement aux souris (quotidiennement aux points les plus critiques). Les modèles tumoraux sous-cutanés peuvent provoquer de la douleur en fonction de la taille, donc la tumeur ne devra pas provoquer de gêne pour la mobilité de l’animal, ni excéder une taille point limite.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort et des organes d’intérêt pourront être récupérés pour compléter les analyses.
Remplacement
A ce jour, aucune méthode ne peut remplacer un système immunitaire complet et donc rend indispensable l’utilisation d’animaux. Des études préliminaires sur des cellules humaines en culture ont permis d’identifier une activité biologique de ces nouveaux traitements et donc, ont orienté les paramètres à évaluer lors de l’étude de la molécule chez l'animal.
Réduction
L’ensemble des animaux prévus ne sera pas utilisé selon les résultats observés sur les trois traitements évalués et sur les modèles précliniques évalués. Seulement le ou les traitements efficaces se verront évalués lors des étapes suivantes, limitant ainsi le nombre d’animaux à utiliser. Par conséquent, dans le cas de l’observation d’un effet, nous réaliserons ensuite des études d’une part pour faire des études de combinaison de traitements avec des traitements standard en oncologie et d’autre part, pour déterminer les mécanismes mis en œuvre, notamment en euthanasiant des souris avant d’atteindre le point limite à différents temps après l’initiation de la pathologie. Dans le but d'utiliser un nombre d'animaux cohérent avec une pertinence statistique, nous avons défini le nombre d'animaux par groupe de 7 animaux selon les étapes pour l’ensemble des groupes. Ce nombre d’animaux par groupe nous permet d’analyser nos données en combinant un test statistique fiable et un nombre d’animaux réduit.
Raffinement
Une étape d’acclimatation de 4 jours minimum sera systématiquement réalisée à l’arrivée des animaux pour éliminer le stress dû au transport et permettre l’habituation aux nouveaux locaux et personnels animaliers avant tout acte sur l’animal. Nous chercherons à obtenir dans un premier temps des différences significatives et reproductibles sur l’efficacité thérapeutique des traitements entre les groupes de souris, puis un effet combinatoire de traitement avec des traitements anti-cancéreux conventionnels, et enfin à décortiquer les mécanismes évoluant dans cette réponse antitumorale. La douleur sera dans la mesure du possible évitée en mettant à mort les animaux selon un score clinique vétérinaire ou par injection d’analgésique dans le cas de morsure par exemple. En outre, les animaux sont maintenus dans un cycle jour/nuit de 12h/12h avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté. Des brindilles de papier sont placées dans la cage pour permettre aux souris de s’enfouir et se cacher. Si un mâle se retrouve dominant et attaque ses congénères malgré la présence d'enrichissements, il sera isolé dans une cage individuelle avec deux enrichissements supplémentaires du fait de son isolement (frisottis et dôme/tunnel). L’analgésie, quant à elle, dépendra de la cause. Pour les animaux en souffrance, l’animal se verra administrer une injection d'analgésique deux fois par jour jusqu’à diminution du score ou exclusion de l’étude. Pour les plaies de surface comme les morsures, après désinfection, les animaux pourront recevoir directement sur la plaie un analgésique local. Enfin, nous utiliserons préférentiellement des mâles car les hormones du sexe féminin peuvent apporter une protection générant de l’hétérogénéité sur le développement tumoral. Toutefois, nous n’excluons pas la possibilité de tester les thérapies sur les deux sexes car cette protection hormonale n’est pas valable pour tous les modèles précliniques de tumeur.
Choix des espèces
Nous travaillerons avec la souris qui est un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les examens précliniques. Il s’agit en effet d’un modèle animal pour lequel de nombreux outils génétiques et biologiques sont disponibles. Les modèles d’inflammation dans ces souris autorisent une relevance pathologique satisfaisante en comparaison avec la réalité clinique. Des adultes de 7 à 10 semaines seront utilisés, car la prise tumorale est homogène dans cette tranche d’âge contrairement à des âges précoces ou avancés où les défenses immunitaires sont différentes et peuvent induire une hétérogénéité de réponse antitumorale, et donc un stade tumoral différent.
Radiothérapie interne vectorisée sur deux modèles murins de glioblastome
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Pour tester une radiothérapie interne ciblée sur deux modèles de glioblastome, 660 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une injection de cellules tumorales cérébrales puis un suivi par IRM jusqu'à six fois, la tumeur pouvant entraîner la mort en une trentaine de jours sans traitement. Le RNT annonce un bénéfice pour l'humain formulé au conditionnel et repoussé "ultérieurement". Toutes les souris sont mises à mort, une issue présentée comme évitant la souffrance liée à la croissance de la tumeur.
Objectifs
Le projet consiste à mettre en place une nouvelle stratégie thérapeutique basée sur une molécule qui a déjà été testé en clinique et qui mérite une attention particulière pour des développements thérapeutiques pertinents. Il s’agit d’une molécule ayant une faible pénétration dans les tissus, ce qui permettrait de proposer une thérapie plus précise dont la toxicité auprès des tissus sains serait moindre. L’objectif sera de tester cette nouvelle stratégie thérapeutique sur 2 souches de souris différentes.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est l'innovation thérapeutique par le ciblage de nouvelles cibles thérapeutiques sur une tumeur en place pour une amélioration de la prise en charge de ces tumeurs ultérieurement chez l'homme.
Procédures
Les animaux seront anesthésiés et soumis à des actes expérimentaux modérées (durées d'environ 30 minutes) telles que l'injection de cellules tumorales, de thérapies spécifiques, de suivi par imagerie IRM. En fonction de la procédure concernée un animal peut subir d'un seul acte jusqu'à 3. Le nombre d'IRM maximal réalisé sur un même animal est de 6.
Impact sur les animaux
L’administration des traitements peut entraîner une certaine fatigue et un affaiblissement rapidement réversible (environ deux jours) de l'animal. L'induction d'une tumeur par injection de cellules entraîne en l'absence de traitement une détoriation de l'état général de l'animal pouvant entraîner la mort au bout de 30 jours. Il n'y a pas d'autres nuisances ou d'effet indésirables attendus sur les animaux.
Devenir
Tous les animaux du projet sont mis à mort pour éviter toute souffrance liée à la pousse du glioblastome.
Remplacement
Le projet ici proposé a pour but l’étude de "cibles" et leur ciblage par une thérapeutique innovante sur tumeur en place pour l’éradication de tumeurs cérébrales. Si sa mise en place nécessite l’utilisation d’animaux pour valider les étapes finales de caractérisation des "cibles" (tumorigénicité, radiorésistance des cellules tumorales) et celle d’élimination (traitements sur tumeur en place), alors de nombreuses étapes amont, ont été réalisées in vitro sur des modèles cellulaires pour répondre aux normes de remplacement. Des études protéomiques et la modélisation informatique de ces données ont été faites sur des cellules hors du contexte animal. Par ailleurs justement pour ces dernières validations dans le contexte réel, il n'y a pas d'alternatives ni d'explants, ni d'organoides, ou coupes organotypiques sur lesquelles nous pourrions répondre à nos questions de tumorigénicité et de réponse au traitement dans le contexte global.
Réduction
En amont de ces expériences chez l'animal, divers essais sur ces cellules tumorales ont été réalisés limitant aux seuls prototypes utiles alors implantés chez l'animal la réalisation de cette étude. Le nombre d'animaux utilisés a été défini pour pouvoir générer des données statistiquement interprétables.
Raffinement
Les animaux sont stabulés dans un environnement favorable à leur bien-être, par ailleurs vérifié par le SBEA local. Pour chaque protocole, un suivi quotidien du comportement, de la perte de poids de l'animal et de sa cicatrisation est effectué. Un suivi IRM est également réalisé de manière hebdomadaire pour surveiller la progression du volume tumoral dans le cerveau de l'animal. Les animaux bénéficient d’une surveillance accrue jusqu’à leur réveil afin de détecter précocement toute forme de souffrance. Ils bénéficient de soins post-opératoires, mesures de gestion de la douleur avec analgésique, conditions d'hébergement optimale, enrichissement du milieu. Les animaux seront hébergés dans un environnement dont la température, l’humidité, le renouvellement de l’air ainsi que le cycle d’éclairage sont contrôlés selon les normes légales en vigueur. Un enrichissement du milieu avec des petites maison et tunnel ainsi que des frisotis est mis en place du début à la fin. Toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie générale. Une anesthésie gazeuse sera appliquée aux animaux lors du suivi IRM hebdomadaire.
Choix des espèces
La raison pour laquelle il est envisagé d’utiliser deux types de cellules dans deux souches différentes de souris est de pouvoir réaliser les tests sur des cellules humaines de glioblastome dans un cas et dans l'autre cas de pouvoir étudier le rôle de l’immunité.
Recherche des paramètres d’exposition sonore et médicamenteuse induisant un déficit auditif léger chez le rat
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Quatre semaines d'exposition sonore à raison de huit heures par jour cinq jours sur sept, ou des injections répétées de molécules toxiques pour l'oreille : 264 rats vont être utilisés, tous tués, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère. L'objectif est de calibrer des doses de bruit, d'anticancéreux et d'antibiotiques provoquant une perte auditive légère, ces molécules pouvant aussi entraîner une toxicité rénale et digestive. Le RNT reconnaît que la mort d'un petit nombre d'animaux ne peut être exclue. Tous les rats sont mis à mort pour le prélèvement des oreilles et du sang.
Objectifs
Le bruit n’est pas la seule nuisance pouvant endommager le système auditif. Des substances chimiques peuvent également altérer l’audition en détruisant les cellules sensorielles de l’oreille. Parmi elles figurent, entre autres, des substances industrielles (métaux, solvants, …) et des médicaments. Les études révèlent que l’exposition simultanée au bruit et aux médicaments peut entraîner des pertes auditives plus importantes que la simple addition des effets de chaque facteur pris isolément. Le projet actuel s’intéresse à deux familles de médicaments, les anticancéreux et les antibiotiques, qui sont suspectés de persister de longues périodes dans l’oreille, et pourraient donc fragiliser l’oreille vis-à-vis du bruit sur le long terme. L’objectif du projet est de déterminer si des rats préalablement exposés à ce type de médicaments sont plus sensibles au bruit, et si oui, pour combien de temps après la fin des traitements. Avant de mettre en œuvre ces expérimentations, il est nécessaire de déterminer des niveaux de bruit et des doses de médicaments permettant d’obtenir des pertes auditives légères, tout en minimisant la toxicité générale (dans le cas des médicaments). L’objectif est de générer des pertes auditives suffisamment faibles pour ne pas endommager massivement l’oreille, et permettre d’observer une augmentation des pertes lors d’une exposition différée au bruit. C’est l’objet de cette demande d’autorisation de projet.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif de développer des modèles de déficit auditif léger, induits soit par une exposition sonore répétée représentative des conditions rencontrées en milieu professionnel, soit par l’administration de médicaments toxiques pour l’oreille, reproduisant au mieux les protocoles cliniques. Pour chaque nuisance, plusieurs doses ou protocoles d’administration seront testés afin de déterminer celui permettant d’obtenir une perte auditive légère. Ces modèles seront utilisés dans le cadre d’une future étude qui visera à mettre en évidence si des rats traités préalablement avec ces médicaments sont plus vulnérables au bruit après la fin du traitement, et ce pour combien de temps. Ces informations, aujourd’hui absentes de la littérature scientifique, apporteront des informations précieuses sur la vulnérabilité au bruit des personnes ayant été traitées avec ce type de médicaments, et reprenant leur activité professionnelle.
Procédures
Deux groupes de 16 animaux (8 mâles et 8 femelles) seront exposés, dans leur cage d’hébergement, à des bruits industriels conçus pour induire des pertes auditives légères. L’exposition sonore durera 4 semaines (8h/j, 5j/semaine). Un groupe contrôle (6 mâles et 6 femelles) sera exposé au bruit ambiant de l’animalerie sur la même période. Un groupe exposé (n=16) et un groupe contrôle (n=12) seront ajoutés uniquement si les pertes auditives mesurées ne correspondent pas aux pertes attendues. Deux groupes de 24 animaux (12 mâles et 12 femelles) recevront une molécule anticancéreuse toxique pour l’oreille par 4 injections réparties sur 6 semaines. Chaque injection demande une contention de quelques secondes. Les doses seront ajustées pour induire une perte auditive légère. Un groupe contrôle de 12 animaux (6 mâles et 6 femelles) recevra 4 injections de liquide physiologique sur la même période. Un groupe traité (12 mâles et 12 femelles) et un groupe contrôle (6 mâles et 6 femelles) pourront être ajoutés si les doses initiales ne permettent pas d’induire la perte auditive visée. Deux groupes de 24 animaux (12 mâles et 12 femelles) recevront un antibiotique toxique pour l’oreille, à raison de 10 injections consécutives sur 10 jours. Chaque injection demande une contention de quelques secondes. Les doses seront ajustées pour induire une perte auditive légère. Un groupe contrôle (6 mâles et 6 femelles) recevra 10 injections de liquide physiologique sur la même période. Un groupe traité (n=24) et un groupe contrôle (n=12) pourront être ajoutés si les doses initiales ne permettent pas d’induire la perte auditive visée. L’audition des rats sera évaluée par une méthode non invasive réalisée sous anesthésie qui nécessite une injection et une contention de quelques secondes. Ce test dure environ 20s par animal : • Rats exposés au bruit : Les mesures seront effectuées avant l’exposition, toutes les 2 semaines pendant l’exposition, puis 4 semaines plus tard. • Rats traités avec l’anticancéreux : Les mesures auront lieu avant le traitement, toutes les deux semaines pendant la durée du traitement, puis 4 semaines plus tard. • Rats traités avec l’antibiotique : Les mesures seront réalisées avant le traitement, à la fin du traitement, puis 4 semaines plus tard. À l’issue des mesures, les animaux seront mis à mort pour prélèvements de sang (analyses biochimiques) et des oreilles pour évaluer les dommages aux cellules auditives.
Impact sur les animaux
L’exposition des rats à différents bruits, au sein même de leur cage d’hébergement, pourra induire un stress modéré et réversible, sans atteinte majeure de l’état de santé des animaux, mis à part une perte auditive. Le traitement des rats par un anticancéreux ou un antibiotique peut générer une toxicité au niveau du système auditif (effet attendu) mais également générer une toxicité rénale. Ces deux molécules peuvent également entrainer des troubles digestifs et une diminution de la prise alimentaire. La mort d’un petit nombre d’animaux ne peut pas être totalement exclue. Les mesures auditives répétées impliquent des anesthésies successives. Un stress léger lié à la récurrence de cette manipulation peut survenir. C’est également le cas pour les injections répétées de médicaments.
Devenir
Les animaux inclus dans ce projet seront mis à mort afin de prélever les oreilles pour analyse des tissus. Pour les animaux ayant reçu des médicaments, un prélèvement sanguin sera également pratiqué au moment de la mise à mort pour analyse biochimique.
Remplacement
L’utilisation d’un modèle animal est indispensable car l’étude des médicaments toxiques pour l’oreille et de l’exposition au bruit nécessite un système auditif complet ainsi qu’un métabolisme actif. Les réponses physiologiques de l’oreille interne impliquent des mécanismes complexes qui ne peuvent pas être reproduits de manière satisfaisante par des modèles cellulaires ou informatiques. Par exemple, ces modèles ne permettent pas d’étudier l’impact combiné du bruit et des médicaments dans un organisme entier, ni d’évaluer l’évolution temporelle d’un déficit auditif. Le rat constitue un modèle pertinent et reconnu pour l’étude des effets du bruit et des substances toxiques pour l’oreille, ce qui permettra une comparaison avec les données de la littérature.
Réduction
Le protocole a été construit de telle sorte que le nombre d’animaux soit réduit au minimum tout en garantissant d’observer l’effet attendu et en prenant en compte le risque de toxicité. - Grâce à une analyse de la littérature scientifique et de nos données historiques, nous avons pu identifier des gammes de doses suffisamment réduites pour limiter le nombre de doses/niveaux testé(e)s à 3 par type de nuisance. - Certaines doses de médicaments et niveaux de bruit seront testés en plusieurs phases, afin de s’offrir la possibilité de ne pas réaliser certains essais si la dose optimale a été identifiée précocement. - Les effectifs par groupe et par sexe ont été définis comme le nombre minimal d’animaux nécessaire pour qu’une perte auditive légère soit mesurable par rapport au niveau initial, connaissant la dispersion des mesures individuelles, et en faisant l’hypothèse que les effets du bruit multiplient par deux cette dispersion et les médicaments par trois.
Raffinement
Après la période d’acclimatation d’une semaine à l’animalerie, une technique de manipulation positive dite de « tickling » (ou « chatouilles » en français) sera mise en place pendant 5 jours. Cette méthode consiste à reproduire, par des stimulations tactiles douces et répétées, les comportements de jeux sociaux entre jeunes rats et à créer des états émotionnels positifs. Le « tickling » sera ensuite pratiqué avant chaque manipulation de l’animal pendant toute la durée du protocole. Tout au long du protocole, les rats seront régulièrement placés, en groupe, dans une aire de jeu sécurisée comportant des tunnels, abris et différents éléments d’exploration. Cet environnement favorise les interactions sociales, stimule l’activité exploratoire naturelle et contribue à réduire le stress lié à l’hébergement et aux manipulations expérimentales, améliorant ainsi le bien-être général des animaux. Compte tenu des risques d’effets secondaires pour le rein causés par les traitements médicamenteux, les animaux recevront des injections sous-cutanées de solution de réhydratation pendant le traitement. Par ailleurs, pendant la période de traitement, des aliments gélifiés appétents complémentés de friandises seront disposés à l’intérieur des cages. Enfin, toutes les procédures seront réalisées dans l’enceinte de l’animalerie, y compris les expositions au bruit et aux médicaments, ce qui permettra de minimiser le déplacement des rats et le stress associé.
Choix des espèces
Le rat est un mammifère qui a un système auditif qui présente un fort degré de ressemblance biologique avec l’Homme, contrairement aux espèces non mammifères (oiseaux, poissons ou insectes) qui sont pertinentes pour l’étude de la toxicité pour les molécules ou les cellules, mais qui sont peu adaptées à l’étude de la fonction auditive dans son ensemble. Ainsi, le rat est un animal couramment utilisé pour modéliser les anomalies auditives. Son oreille interne présente également un volume suffisant pour permettre une dissection et une analyse des tissus relativement aisées. Les rats choisis sont pigmentés. Ils ont donc un pigment coloré dans l’oreille, contrairement aux rats albinos. Cette caractéristique les rapproche davantage de la physiologie humaine. Ce choix permet ainsi une meilleure validité des résultats pour l’Homme. Les rats utilisés seront des jeunes adultes (16 semaines). Cet âge a été choisi pour que leur cerveau, leur métabolisme et leur oreille interne soient complètement développés et pour modéliser des humains d’âge adulte.
Programme de tutorat pour l’acquisition des gestes techniques courants en expérimentation animale sur rats et souris
- Formation professionnelle
Rats : 173
Tous tués à l'issue, 863 souris et 173 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, non pour produire des connaissances mais pour entraîner des personnes aux gestes techniques de l'expérimentation. Chaque animal sert de support à des injections, à des prises de sang répétées et parfois à des chirurgies, avant d'être endormi puis tué. Le RNT indique que certains animaux proviennent de surplus d'élevage ou d'autres protocoles, une origine présentée comme leur donnant "une utilité". La finalité reste la formation de personnels, réglementairement obligatoire avant toute intervention autonome.
Objectifs
Ce projet a pour but de former, de manière encadrée et progressive, les personnes amenées à manipuler des rats et des souris dans le cadre de la recherche scientifique. Il s’agit d’un programme de formation pratique qui permet aux nouveaux arrivants d’apprendre les gestes techniques nécessaires, comme les prises de sang ou les injections, dans des conditions sécurisées et respectueuses des animaux. Ce type de formation est obligatoire en France et en Europe avant de pouvoir intervenir sur des animaux à des fins scientifiques. Le projet vise à garantir que chaque personne soit bien préparée, accompagnée, et évaluée avant de travailler de façon autonome. Il contribue ainsi à améliorer la qualité des soins aux animaux et la fiabilité des expériences. Ce programme de formation participe également à une démarche éthique plus large, en veillant à limiter le nombre d’animaux utilisés et à réduire au maximum leur stress ou leur douleur.
Bénéfices attendus
Ce projet de formation permet aux personnes qui travaillent en recherche d’apprendre à manipuler correctement les animaux de laboratoire, en particulier les rats et les souris. Il est important que ces gestes soient bien maîtrisés, car une erreur technique peut faire souffrir l’animal ou fausser les résultats d’une étude scientifique. Pour apprendre, les participants doivent s’entraîner directement sur des animaux vivants, car certains gestes ne peuvent pas être reproduits correctement sur des modèles artificiels. Toutefois, tout est mis en œuvre pour limiter le nombre d’animaux utilisés et pour réduire au maximum leur stress ou leur douleur. Cette formation encadrée permet ainsi d’assurer une meilleure prise en charge des animaux dans les futurs projets de recherche, en garantissant que les personnes soient compétentes, formées et responsables. C’est une étape indispensable pour améliorer les pratiques scientifiques tout en respectant les animaux.
Procédures
Les animaux utilisés dans ce projet de formation seront principalement des rats et des souris. Ils seront soumis à différents gestes techniques que les participants doivent apprendre à maîtriser. Ces gestes incluent par exemple des injections (sous la peau, dans le ventre ou dans une veine), des prises de sang à différents endroits du corps, ou des gestes plus complexes comme ceux réalisés lors d'une chirurgie. Chaque animal suivra un parcours progressif avec plusieurs gestes différents, adaptés au niveau du stagiaire. Tous les gestes sont réalisés dans un cadre très encadré, avec des limites strictes sur le nombre d’interventions par animal. À la fin de leur participation, les animaux seront endormis profondément puis euthanasiés sans réveil. L’apprentissage est organisé de manière à limiter au maximum les manipulations inutiles et à garantir le respect du bien-être animal tout au long du programme. La durée de chaque geste est volontairement limitée et adaptée au niveau de formation, afin de réduire au maximum le temps de manipulation et l’impact sur l’animal.
Impact sur les animaux
Les gestes que les participants apprennent à réaliser sur les rats et les souris peuvent parfois provoquer un léger inconfort, voire une douleur temporaire. Cela dépend du type de geste (prise de sang, injection, etc.), de la fréquence à laquelle il est réalisé, et du niveau d’expérience de la personne en formation. Parmi les effets indésirables possibles, on peut citer : un stress passager lié à la manipulation de l’animal ou à la contention (tenir l’animal immobile pour le geste) ; de petites inflammations ou hématomes au point d’injection ou de prélèvement sanguin ; des réactions à l’anesthésie, comme une respiration ralentie ou un réveil plus long que prévu ; des complications rares comme une infection locale ou une fausse route lors de l’administration par la bouche ou le nez. Certaines chirurgies sont simulées, mais si une intervention réelle est nécessaire, elle est faite sous anesthésie profonde et l’animal n’est pas réveillé ensuite. Dans tous les cas, les gestes sont réalisés de manière encadrée, avec des mesures de prévention de la douleur et un suivi attentif de l’état de santé de chaque animal.
Devenir
Dans le cadre de ce projet de formation, tous les animaux seront euthanasiés à la fin de leur participation. Cela s’explique par le fait que certains gestes techniques réalisés sont potentiellement invasifs ou causent un stress ou un inconfort temporaire. De plus, le projet a une visée pédagogique, ce qui implique des manipulations répétées sur un même animal. Afin d’éviter toute douleur ou souffrance prolongée, et de respecter les règles de bien-être animal, chaque animal sera endormi profondément lorsque cela est nécessaire, puis euthanasié de manière conforme aux réglementations en vigueur, sans qu’il ne se réveille. Cette décision permet de garantir à la fois une formation de qualité et un traitement respectueux des animaux utilisés.
Remplacement
Dans ce projet de formation, l’utilisation d’animaux vivants n’a lieu qu’en dernier recours, lorsque cela est vraiment nécessaire pour apprendre correctement un geste. Avant cela, les participants passent par une phase de préparation théorique, avec des documents, des vidéos pédagogiques et des explications détaillées. Ensuite, lorsque c’est possible, ils s’entraînent sans utiliser d’animal vivant. Par exemple, ils peuvent manipuler des cadavres d’animaux déjà euthanasiés pour d’autres raisons, ou utiliser des morceaux de tissus animaux (comme de la peau de poulet) ou encore des modèles en plastique conçus pour simuler des gestes. Ces étapes permettent d’apprendre les bons réflexes et de s’habituer au matériel sans faire souffrir d’animaux. L’usage d’animaux vivants est donc limité à ce qui est strictement nécessaire pour valider les compétences dans des conditions proches de la réalité.
Réduction
Ce projet de formation a été conçu pour utiliser le moins d’animaux possible, tout en permettant aux participants d’apprendre correctement les gestes nécessaires à leur travail. Chaque personne formée apprend plusieurs gestes sur un seul animal, ce qui permet de mutualiser les apprentissages et d’éviter d’utiliser un animal différent pour chaque geste. En moyenne, une personne réalise une seule procédure de formation qui nécessite cinq animaux. Au total, pour l’ensemble du projet, cela représente environ 863 souris et 173 rats sur cinq ans, en comptant une marge de sécurité pour les imprévus. Quand cela est possible, les animaux utilisés ne sont pas élevés spécifiquement pour ce projet : ce sont par exemple des animaux surnuméraires, des animaux non utilisés dans d’autres expériences ou des animaux de contrôle en fin de suivi. Cela permet de réduire encore davantage le nombre d’animaux produits et de donner une utilité à des animaux qui auraient été euthanasiés sans avoir servi. Cette organisation permet donc de former les professionnels de manière efficace, tout en respectant les principes de réduction fixés par la réglementation européenne.
Raffinement
Dans ce projet de formation, tout est mis en œuvre pour limiter au maximum la douleur, le stress ou l’inconfort que pourraient ressentir les rats et les souris. Les participants commencent toujours leur apprentissage sans utiliser d’animaux vivants, en s’exerçant d’abord sur des modèles ou des animaux déjà décédés. Ce n’est qu’une fois ces étapes franchies qu’ils manipulent un animal vivant, sous la supervision d’un formateur expérimenté. Quand un geste est potentiellement douloureux, un médicament antidouleur (buprénorphine) peut être donné à l’animal avant l’intervention. Si un geste s’avère trop difficile à réaliser sans gêne pour l’animal, une anesthésie temporaire peut être utilisée pour éviter toute souffrance. Les chirurgies, lorsqu’elles sont nécessaires, sont toujours faites sous anesthésie profonde et l’animal n’est pas réveillé ensuite. L’état de chaque animal est suivi à l’aide d’une grille d’observation (cf. Annexe 4) qui permet de détecter rapidement tout signe de douleur ou de malaise. Si un animal atteint un seuil critique (appelé « point limite »), il est euthanasié sans souffrance. Des soins supplémentaires sont apportés, comme le maintien au chaud, la mise à disposition d’aliments faciles à manger après une anesthésie, et la surveillance régulière de leur état. Toutes ces mesures sont mises en place pour respecter les principes de protection animale définis par la réglementation européenne, et garantir une formation de qualité sans exposer inutilement les animaux à la douleur.
Choix des espèces
Les rats et les souris sont les deux espèces les plus utilisées dans la recherche scientifique. En France, elles représentent environ 70 % des animaux utilisés dans les laboratoires. Ce sont donc les espèces que les participants à cette formation seront amenés à manipuler dans leur travail. Les animaux utilisés sont tous adultes, en bonne santé, et sans maladie. Ce choix est important : les animaux adultes sont plus faciles à manipuler, leur taille permet de bien voir les gestes à effectuer, et cela correspond aux conditions réelles dans lesquelles les chercheurs travaillent. Aucun animal jeune ou âgé n’est utilisé pour la formation. Utiliser des rats et des souris adultes permet donc d’apprendre dans de bonnes conditions, tout en limitant les risques pour l’animal et en respectant les règles éthiques.