Rats

Aux stades avancés de la maladie, les rats peuvent ne plus accéder à la nourriture ni à l'eau, et ceux dont l'état général se dégrade sont tués par anticipation. 30 rats porteurs d'une mutation du gène Mfn2, qui reproduit la maladie de Charcot-Marie-Tooth de type 2A, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. À six semaines, trois mois et cinq mois, ils passent une mesure de force d'agrippement, une analyse de la marche et un test du faisceau rétréci, de cinq à dix minutes chacun. Tous seront tués pour peser leurs muscles et mesurer les propriétés contractiles de muscles isolés, le projet ne visant pas à les soigner mais à repérer des paramètres de suivi utilisables dans de futurs essais thérapeutiques.

Objectifs

La neuropathie périphérique axonale liée au gène Mfn2 (correspondant à la maladie de Charcot-Marie-Tooth de type 2A ou CMT2A) est une affection génétique du système nerveux périphérique caractérisée par une dégénérescence progressive des axones, entraînant des déficits moteurs et sensitifs prédominant aux extrémités des membres. Malgré une compréhension partielle des mécanismes physiopathologiques impliqués, il n’existe à ce jour aucun traitement curatif. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est de caractériser de manière fonctionnelle les atteintes neuromusculaires dans un modèle de rat CMT2A, porteur de cette mutation. Cette étude vise à décrire l’installation et la progression des déficits moteurs et musculaires par une approche intégrée combinant des évaluations in vivo longitudinales et des analyses in vitro à des temps clés. Elle a pour finalité d’identifier des paramètres fonctionnels pertinents et robustes, en lien avec la physiopathologie de la maladie, pouvant servir de critères de suivi de la progression et d’outils d’évaluation dans un contexte de développement thérapeutique.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’améliorer la compréhension des atteintes neuromusculaires associées aux neuropathies périphériques axonales liées au gène Mfn2, en documentant leur installation et leur progression dans un modèle préclinique pertinent. L’identification de paramètres fonctionnels robustes et reproductibles contribuera à définir des critères objectifs de suivi de la maladie. Ces éléments constituent un prérequis essentiel au développement et à l’évaluation de nouvelles approches thérapeutiques, en facilitant la mise en place d’études précliniques et en renforçant la transposabilité des résultats vers la clinique.

Procédures

Au cours de la période de suivi, les animaux seront soumis à des tests non invasifs d’exploration fonctionnelle réalisés sur animaux vigiles, incluant des évaluations de la force musculaire, de la marche et de la coordination motrice. Chaque test a une durée comprise entre 5 et 10 minutes. Ces évaluations seront réalisées à trois reprises au cours du projet, aux âges de 6 semaines, 3 mois et 5 mois. En fin d’étude, les animaux seront soumis à une procédure terminale comprenant une anesthésie suivie d’une euthanasie conforme à la réglementation, puis à des prélèvements tissulaires (muscles squelettiques et cœur) réalisés après confirmation de la mort.

Impact sur les animaux

Les tests fonctionnels non invasifs (mesure de la force d’agrippement, analyse de la marche, test du faisceau rétréci) peuvent induire un stress léger à modéré lié à la manipulation des animaux et à leur isolement temporaire. La répétition des mesures au cours du suivi longitudinal peut également entraîner une fatigue passagère. L’évolution de la pathologie elle-même peut entraîner une altération progressive de l’état général, se traduisant notamment par des troubles locomoteurs, une diminution de la force musculaire et, potentiellement, des difficultés d’accès à la nourriture ou à l’eau aux stades avancés.

Devenir

L’ensemble des animaux sera euthanasié à l’issue de la procédure expérimentale afin de permettre la réalisation d’analyses terminales indispensables à la caractérisation du phénotype neuromusculaire. Ces analyses incluent notamment la mesure de la masse de différents muscles ainsi que l’étude des propriétés contractiles de muscles isolés, qui ne peuvent être réalisées que sur des tissus prélevés post-mortem.

Remplacement

Il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle alternatif non animal permettant de caractériser de manière intégrée le phénotype neuromusculaire associé à une neuropathie périphérique axonale liée au gène Mfn2. Les approches in vitro ou ex vivo ne permettent pas de reproduire la complexité des interactions entre système nerveux périphérique, muscle et contrôle moteur, ni d’évaluer la progression de la maladie à l’échelle de l’organisme. Le recours à un modèle animal est donc nécessaire pour étudier de façon fonctionnelle et longitudinale les altérations neuromusculaires et identifier des paramètres pertinents de suivi.

Réduction

Le nombre d’animaux a été défini au strict minimum nécessaire pour garantir la validité scientifique des résultats, tout en respectant le principe de réduction. Sur la base de données issues de la littérature et d’expériences antérieures sur des modèles similaires, un effectif de 15 animaux par groupe a été retenu.Ce nombre est nécessaire pour mettre en évidence de manière fiable les différences attendues entre les animaux porteurs de la mutation et les animaux témoins sains. Afin de limiter la variabilité expérimentale, les groupes seront constitués d’animaux issus de plusieurs portées, avec inclusion d’animaux mutés et témoins issus des mêmes portées lorsque cela est possible. Cette stratégie permet de contrôler les effets liés à la portée tout en optimisant le nombre total d’animaux utilisés. Par ailleurs, une approche longitudinale sera mise en œuvre, permettant le suivi répété des mêmes animaux au cours du temps, ce qui réduit le nombre total d’animaux nécessaires. Enfin, les différentes analyses (fonctionnelles in vivo et ex vivo) seront réalisées sur les mêmes individus afin de maximiser les informations obtenues par animal et d’éviter toute utilisation supplémentaire.

Raffinement

Les animaux seront hébergés conformément à la réglementation en vigueur, avec un enrichissement du milieu adapté. L’état général des animaux sera surveillé quotidiennement par le personnel animalier et les expérimentateurs afin de détecter précocement tout signe de gêne, de douleur ou d’altération de l’état de santé, notamment en lien avec la progression de la pathologie (troubles locomoteurs). Des critères d’arrêt anticipé, définis à partir de grilles de suivi du bien-être animal et des recommandations en vigueur, seront appliqués. En cas d’apparition de signes cliniques sévères ou d’une dégradation importante de l’état général, le responsable de l’étude et le responsable de la structure de bien-être animal (SBEA) seront informés et une euthanasie sera réalisée sans délai afin d’éviter toute souffrance prolongée. Les signes observés seront évalués en tenant compte de leur persistance et de leur impact sur l’état général de l’animal. L’ensemble des évaluations fonctionnelles, validées et non invasives, sera réalisé sur animaux vigiles. Afin de limiter le stress lié à la manipulation et aux procédures expérimentales, les animaux bénéficieront d’une phase d’habituation préalable à la salle d’expérimentation, aux dispositifs et à l’expérimentateur. Les tests seront réalisés dans un environnement dédié, distinct de la salle d’hébergement, et des mesures de renforcement positif (récompense après les essais) seront mises en place. L’organisation et la fréquence des tests seront optimisées afin de limiter la fatigue et l’impact sur le bien-être des animaux.

Choix des espèces

Il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle alternatif non animal permettant de caractériser de manière intégrée le phénotype neuromusculaire associé à une neuropathie périphérique axonale liée au gène Mfn2. Les approches in vitro ou ex vivo ne permettent pas de reproduire la complexité des interactions entre système nerveux périphérique, muscle et contrôle moteur, ni d’évaluer la progression de la maladie à l’échelle de l’organisme. Le recours à un modèle animal est donc nécessaire pour étudier de façon fonctionnelle et longitudinale les altérations neuromusculaires et identifier des paramètres pertinents de suivi. Les animaux seront suivis à partir du stade juvénile, dès le sevrage (3–4 semaines), et jusqu’à l’âge adulte (jusqu’à 5 mois). Les évaluations in vivo neuromusculaires seront réalisées à 6 semaines, 3 mois et 5 mois d’âge permettent ainsi de caractériser précocement les premiers signes fonctionnels, puis leur évolution au cours du temps.

300 animaux sur 3 990 pourront être gardés en vie et renvoyés en hébergement hors étude après avis vétérinaire, les autres seront tués pour le prélèvement d'organes et de fluides. 3 300 rats et 690 souris vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour mesurer les effets de candidats-médicaments commandés par des donneurs d'ordre. Certains reçoivent un cathéter intraveineux implanté à demeure sous anesthésie, portent une veste à capteurs jusqu'à dix-neuf heures, passent jusqu'à sept heures trente dans une enceinte respiratoire ou jusqu'à six heures dans une enceinte à diurèse sans eau ni nourriture, et subissent jusqu'à huit prélèvements sanguins par séance. Le porteur affirme qu'aucune alternative ne permet de mesurer ces effets sur un "organisme entier" et revendique la "nécessité" d'accéder à l'animal dans son entièreté.

Objectifs

Les études de pharmacologie de sécurité chez les rongeurs visent à évaluer les effets d'un candidat-médicament en développement sur les grandes fonctions physiologiques et sont des prérequis réglementaires précliniques permettant à un donneur d’ordre d'initier des études cliniques pour un candidat-médicament destiné à l'Homme. Selon le candidat-médicament, l’établissement utilisateur évalue la procédure à effectuer, sachant que plusieurs procédures peuvent être combinées au sein d’une même étude (par exemple : étude combinant l’évaluation des fonctions respiratoire et neurologiques). Chaque animal est traité par un placebo ou une dose de candidat-médicament selon la voie d'administration prévue chez l'Homme. Les effets du candidat-médicament sont évalués sur une fonction physiologique données (neurologique, respiratoire, gastro-intestinale, rénale ou cardiovasculaire) à l'aide de capteurs et de logiciels enregistrant, en continu, le signal physiologique (fonctions respiratoire et cardiovasculaire), de tests spécifiques (fonctions neurologiques) ou de prélèvements d'organes/fluides biologiques (fonctions gastro-intestinale et rénale) effectués à un ou plusieurs temps après traitement, et dont l'analyse génère des valeurs quantitatives caractérisant la fonction étudiée. Les valeurs des paramètres mesurés à chaque dose de candidat-médicament sont ensuite comparées à celles mesurées en placebo et permettent ainsi d'évaluer l'impact du candidat-médicament sur la fonction étudiée. Pendant la durée de la procédure, de la réception des animaux à leur sortie d'étude, leur état de santé est suivi quotidiennement a minima, leur poids est mesuré périodiquement et l'atteinte de points limites est étroitement surveillée, avec prise de décision vétérinaire rapide et appropriée en cas d'altération du bien-être animal. Des dispositions, compatibles avec l'atteinte des objectifs de l'étude, sont prises pour limiter tout inconfort, stress, souffrance ou douleur inutile, par l'utilisation d'habituation à l'environnement expérimental et aux dispositifs d'enregistrement des fonctions physiologiques, de protocoles anesthésiques et analgésiques appropriés, ou par décision vétérinaire d'appliquer des soins, de diminuer les doses de candidat-médicament ou d'arrêter le traitement. En fin de procédure, selon les prérequis du protocole d'étude, les animaux peuvent être gardé en vie ou euthanasiés.

Bénéfices attendus

L'évaluation des effets fonctionnels d'un candidat-médicament en développement par un donneur d'ordre dans les études de pharmacologie de sécurité chez le rongeur est conduite selon des recommandations ("lignes directrices") internationales, et constitue une étape réglementaire avant la conduite d'essais cliniques avec ce candidat-médicament chez des volontaires sains ou des patients. Ces études visent à définir le profil des effets pharmaco-toxicologiques de candidats-médicaments sur certaines fonctions physiologiques (incluant les fonctions vitales) qui surviennent généralement dans les heures à jours suivant leur administration. L'identification des fonctions modifiées par le candidat-médicament - s'il est considéré par le donneur d'ordre comme pouvant progresser dans les phases cliniques - permettra la mise en place de procédures de suivi de ces mêmes fonctions ("monitoring") chez l'Homme (ex.: mesure de l'électrocardiogramme, de la tension artérielle ou de la fréquence respiratoire; examens neurologiques) et donc, de rendre les essais cliniques plus sûrs pour les volontaires ou les patients y participant. En relation avec les données collectées dans les études de toxicologie réglementaire, celles issues des études de pharmacologie de sécurité permettent aussi de définir la dose qui sera testée (avec une marge de sécurité) pour la première administration à l’Homme. Au final, ce projet contribuera au développement de nouvelles solutions thérapeutiques, prophylactiques ou diagnostiques sûres pour les patients. Il est envisagé que, sur une durée de 3 ans, entre 25 et 35 candidats-médicaments pourront être évalués.

Procédures

Ces études consistent généralement en une administration unique du candidat-médicament, pendant une durée de quelques secondes pour des administrations par les voies orale, sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse rapide, ou de quelques minutes pour les administrations par la voie intraveineuse dites en "bolus lent". Certaines administrations par voie intraveineuse peuvent également durer plusieurs dizaines de minutes à quelques heures, et nécessitent l'implantation chirurgicale, sous anesthésie générale gazeuse profonde et avec un protocole analgésique péri-opératoire adapté, d'un cathéter laissé en place de manière permanente dans une veine périphérique. Ce cathéter est relié à un dispositif externe de perfusion adapté aux rongeurs, permettant de connecter la seringue délivrant le candidat-médicament, tout en laissant l'animal libre de ses mouvements. Ce dispositif de perfusion intraveineuse est implanté sous anesthésie générale profonde, à une seule occasion, pendant la période d'acclimatation. Les administrations de candidats-médicaments sont suivies d’évaluation de leurs effets sur les paramètres neurologiques (évalués individuellement pendant un maximum de 15 minutes, à différentes heures après traitement), respiratoires (avec placement de chaque animal dans une enceinte dédiée jusqu'à 7,5 heures), urinaires (avec placement de chaque animal dans une enceinte à diurèse jusqu'à 6 heures). Les animaux dont la fonction cardiovasculaire est évaluée portent une veste avec capteurs intégrés jusqu'à 19 heures. Si requis par le protocole d'étude, un ou plusieurs prélèvements sanguins seront effectués, par ponction d'une veine superficielle chez l'animal vigile, suivant des modalités et un nombre définis par les besoins de l'étude (jusqu'à 2 occasions par étude, avec un maximum de 8 prélèvements par occasion), tout en respectant les recommandations éthiques de l'établissement utilisateur. Si le protocole d'étude requiert un prélèvement sanguin unique d'un volume dépassant ces recommandations, ce prélèvement est effectué chez l'animal en fin d'expérimentation, sous anesthésie générale gazeuse profonde, puis celui-ci est euthanasié. Si requis par le protocole d'étude, une ponction de liquide céphalo rachidien unique est effectuée chez l'animal en fin d'expérimentation, sous anesthésie générale gazeuse profonde, puis celui-ci est euthanasié.

Impact sur les animaux

Les nuisances peuvent inclure (variables selon les individus) : Stress, inconfort ou douleur brève (quelques minutes) lors des administrations, prélèvements sanguins ou euthanasie au gaz carbonique. Les injections intraveineuses lentes peuvent nécessiter une contention en tube, après une période d'habituation. Sensation de chaleur et stress lors du placement en enceinte chauffante utilisée pour prélèvements de sang ou injections intraveineuses ne nécessitant pas de pose de cathéter à demeure. Anesthésie de quelques minutes - avec risque d’incoordination motrice au réveil - , pour prélèvements de sang ou autres fluides biologiques. Anesthésie suivie d’une douleur légère à modérée pendant quelques jours après la pose de cathéters intraveineux à demeure. Port d’un harnais ou d’un bouton métallique permettant la perfusion prolongée par voie intraveineuse sans contention, pouvant provoquer gêne à l'ambulation et au toilettage, grattage et/ou frottements. Connexion à un dispositif de "joint tournant" lors des perfusions intraveineuses de 30 min à 24 heures/jour, pouvant limiter les déplacements dans la cage d'hébergement. Restriction d’espace et absence d’aliment (eau disponible) dans l'enceinte dédiée aux mesures respiratoires jusqu’à 7,5 heures. Restriction d’espace sans accès à l’eau ni à l’aliment dans les enceintes pour collectes urinaires (jusqu’à 6 heures) ou les arènes d’observations comportementales (jusqu’à 10 min). Stress lié à l’hébergement individuel, notamment chez les souris mâles et les animaux porteurs de dispositifs de perfusion intraveineuse implantés à demeure. Effets toxicologiques ou pharmacologiques légers à modérés des candidats-médicaments.

Devenir

Si le protocole d'étude prévoit des prélèvements de tissus et d'organes pour analyses métaboliques, de biologie moléculaire, d'évaluations histopathologiques ou de prélèvements terminaux de fluides biologiques, une fraction ou la totalité des animaux nécessaire à ces analyses sera euthanasiée. Si le protocole d'étude ne prévoit pas de prélèvements nécessitant l'euthanasie des animaux, ceux-ci pourront être gardé en vie et retourner en zone d’hébergement hors étude suite à l’avis du vétérinaire avec l’évaluation de la gravité réelle des procédures subies.

Remplacement

Il n’existe pas actuellement d’alternatives à l’utilisation d’animaux qui permettent de déterminer la nature et l'amplitude des effets pharmacologiques de candidats-médicaments sur un organisme entier. Dans les études de pharmacologie de sécurité visant essentiellement à évaluer les effets de candidats-médicaments sur les fonctions physiologiques interdépendantes (en particulier, les fonctions vitales (neurologique, respiratoire et cardiovasculaire), il est nécessaire d’avoir accès à l’animal dans son entièreté, pour évaluer l’ensemble des paramètres demandés par les lignes directrices édictées dans des recommandations réglementaires internationales.

Réduction

Lorsque la pharmacocinétique et/ou le mécanisme d'action du candidat-médicament le permet, les mêmes animaux peuvent être utilisés dans une même étude, dans le but d'évaluer, soit simultanément, soit séquentiellement, plusieurs fonctions physiologiques. Dans le cadre d'application de procédures de manière séquentielles, l'inclusion des animaux dans la seconde procédure suivant la première sera effectuée après un temps d'élimination du candidat-médicament de l'organisme suite à l'administration au cours de la première procédure, et après un examen clinique confirmant la capacité des animaux inclus dans la première procédure, à être inclus dans la seconde. Si l'étude requiert des prélèvements sanguins sur animal vigile et que la méthode analytique le permet, des microprélèvements de quelques dizaines de microlitres seront effectués chez les animaux en exploration fonctionnelle, évitant ainsi l'utilisation d'animaux satellites. S'il n'est pas attendu de différences pharmacologiques ou pharmacocinétiques notable entre mâles et femelles, et sauf avis contraire du protocole d'étude, ou justification d'une indication thérapeutique limitée à un seul sexe chez l'Homme, les études de pharmacologie de sécurité sont effectuées chez des mâles.

Raffinement

Rats mâles et femelles et souris femelles sont hébergés en groupes sociaux (sauf incompatibilité comportementale ou avec la procédure expérimentale) en cage sur litière, avec enrichissement adapté, augmenté en cas d’hébergement individuel. Les techniques limitant stress et inconfort seront privilégiées; les actes pouvant les engendrer seront réduits en nombre et durée au minimum nécessaire et réalisés sous anesthésie générale avec un protocole analgésique adapté. Les rongeurs sont observés au moins une fois par jour pour rapidement détecter des signes cliniques et limiter toute souffrance ou douleur inutile. En cas d'atteinte du bien-être, un vétérinaire prendra des mesures rapides et appropriées (soins, arrêt momentané ou définitif du traitement…). Le stress de la manipulation est réduit par la procédure de gestion de faible stress. Etudes d'évaluation de la respiration par pléthysmographie: une habituation à l'enceinte de mesure en Plexiglas transparent (permettant aux animaux de voir et d'entendre leurs congénères et leur environnement) est effectuée par placement des animaux pendant 1 à 2 heures avant traitement (et en période de prétraitement, si requis au protocole d'étude). Etudes d'évaluation cardiovasculaire par veste connectée: en prétraitement, un fragment du tissu de la veste est déposé dans la cage d'hébergement pendant au moins 24 heures, puis les rats sont équipés de la veste seule (sans capteurs) jusqu'à 5 heures. Administration IV lente > 5 minutes: l'habituation au tube de contention est faite au moins 2 fois avant le premier traitement. Administration par voie orale et prélèvement sanguin en veine jugulaire chez rongeurs âgés ou peu manipulés: l'habituation à la manipulation est mise en place avant le premier traitement. Les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale avec un protocole analgésique adapté. Si compatibles avec les objectifs de l'étude, des microprélèvements sanguins seront effectués, limitant ainsi le stress et facilitant la récupération. Le design de chaque étude sera détaillé dans le protocole d’étude et une évaluation éthique sera réalisée avant le démarrage. Le pH et l'osmolarité seront mesurés (ou communiqués par le donneur d'ordre) avant toute première administration par voie parentérale. Enfin, les volumes d'administration et de prélèvement de sang ont été établis selon des recommandations internes, elles-mêmes basées sur des recommandations éthiques (Diehl et al. (2001); J. Appl. Toxicol.).

Choix des espèces

Le choix de l'espèce animale dans les études visant à étudier les effets de candidats-médicaments sur les fonctions physiologiques est basé sur les recommandations réglementaires édictées dans des lignes directrices internationales, les informations concernant la distribution et l'élimination des candidats-médicaments dans l'organisme, leur mécanisme d'action après liaison à leur cible biologique, les données de la bibliographie scientifique, et les analogies des fonctions physiologiques entre l’animal et l'Homme. Selon les fonctions physiologiques susceptibles d'être modifiées par le candidat-médicament et de la population concernée par celui-ci, l’âge le plus adéquat sera sélectionné, cet âge pouvant varier de l’âge juvénile jusqu’à l’âge de maturité sexuelle. Ce choix de l'âge répond à l’ensemble des études réglementaires conduites chez l'animal et nécessaires à la conduite des essais cliniques avec un candidat-médicament chez l’Homme.

Une injection unique de monocrotaline installe en trois à quatre semaines une hypertension pulmonaire qui épaissit le ventricule droit et peut évoluer vers une insuffisance cardiaque. 132 rats, mâles et âgés de quatre semaines à l'injection, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis gavés pendant 28 jours avec du carvacrol, un composé de l'origan et du thym. Chacun passe ensuite sous anesthésie générale un électrocardiogramme, une IRM d'une heure et demie, une échographie et une mesure de la pression pulmonaire, avant d'être tué pour prélever les tissus. Le porteur décrit chez ces rats un "léger essoufflement" et une gêne qu'il qualifie de modérée au motif que les animaux ne sont pas soumis à l'effort.

Objectifs

L’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est une affection cardiovasculaire sévère caractérisée par une élévation anormale de la pression dans les artères pulmonaires, entraînant une surcharge de travail inadéquate du cœur droit. Cette surcharge de pression provoque progressivement un épaississement de la paroi du ventricule droit, pouvant dans les cas les plus extrêmes conduire à une insuffisance cardiaque. Malgré des avancées thérapeutiques, l’HTAP évolue rapidement et demeure difficile à détecter à un stade précoce, compromettant ainsi le pronostic vital. De nombreuses études ont montré que l’HTAP est associée à un remodelage des vaisseaux pulmonaires, à des altérations de l’activité électrique cardiaque et à un remodelage de la structure du cœur. Parmi les composés bioactifs issus de sources naturelles, le Carvacrol (CAR) présent dans l’origan, le cresson poivré et le thym suscite un intérêt croissant pour ses propriétés antioxydantes, anesthésique, analgésique, anti-inflammatoires et cardioprotectrices. Des études récentes indiquent que le CAR pourrait moduler l’activité électrique cardiaque en agissant et il aurait la capacité de protéger le cœur des effets de l’infarctus. Dans ce contexte et malgré l’utilisation répandue du CAR dans les médicaments, les compléments alimentaires et les aliments, les données relatives à ses mécanismes d’action, en particulier concernant la fonction cardiaque dans un contexte HTAP, demeurent encore insuffisantes.. Dans ce contexte, nous chercherons à déterminer si le CAR peut contribuer à limiter le remodelage cardiaque et les altérations de l’activité électrique dans un modèle HTAP induite chez le rat.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra à court terme de mieux comprendre les mécanismes associés à la pathologie de l’HTAP. Elle permettra également de mettre en évidence l’effet thérapeutique de substances pharmacologiques sur ces divers mécanismes mis en jeu. L’efficacité de traitements préventifs et curatifs seront mis en évidence ainsi que d’éventuels effets secondaires. Si les études sont positives, des études cliniques pourront être envisagées à plus long terme sur les substances bénéfiques identifiées de façon à mettre en place un traitement plus efficace avec un rapport bénéfice-risque minimum pour les patients.

Procédures

Ce projet vise à mieux comprendre et traiter l’hypertension artérielle pulmonaire, une maladie grave qui touche les vaisseaux sanguins des poumons et fatigue fortement le cœur. Pour cela, un modèle de cette maladie sera reproduit chez le rat grâce à une injection unique d'une molécule pour déclencher la maladie. La maladie apparaît généralement après 3 à 4 semaines. L’augmentation de la pression dans les artères pulmonaires oblige alors la partie droite du cœur à travailler davantage. Avec le temps, cela provoque un épaississement du muscle cardiaque (hypertrophie) qui peut évoluer vers une insuffisance cardiaque droite. Le projet permettra d’évaluer les effets protecteurs de la molécule, ce traitement sera administré par gavage (par voie orale) pendant 28 jours après l’apparition de la maladie. Son efficacité sera étudiée à partir d’analyses du sang et des tissus. Lorsque la maladie sera installée, plusieurs examens seront réalisés sur chaque animal sous anesthésie générale afin de limiter la douleur et le stress : un électrocardiogramme (ECG) pour étudier l’activité électrique du cœur (une seule fois, environ 10 minutes) ; une IRM avec injection d’un produit de contraste pour observer le cœur et les vaisseaux (une seule fois, environ 1h30) ; une échographie cardiaque (une seule fois, environ 30 minutes) ; une mesure de la pression dans les artères pulmonaires et du débit cardiaque (une seule fois, environ 30 minutes) - un prélèvement sanguin (une seule fois, quelques minutes). L’ensemble de ces examens permet de suivre l’évolution de la maladie et d’évaluer si le traitement testé peut protéger les poumons et le cœur.

Impact sur les animaux

Chez le rat, la pathologie peut se manifester par un léger essoufflement et une diminution de l’activité. Comme les animaux ne sont pas soumis à l’effort, la gêne attendue est considérée comme modérée. Une prise de poids plus faible peut également être observée. Les anesthésies nécessaires aux examens peuvent entraîner une hypothermie,. L’injection du produit induisant l’HTAP peut provoquer une légère irritation locale. Enfin, le CAR, composé naturel présent notamment dans le thym et l’origan, est généralement bien toléré et ne présente pas d’effets indésirables significatifs aux doses utilisées.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever les tissus d'intérêt pour des analyses.

Remplacement

Il est indispensable de mieux comprendre les mécanismes physiologiques et moléculaires mis en jeu dans cette pathologie afin de pouvoir élaborer une prise en charge plus ciblée. Seules des expérimentations sur modèle animal entier pourront permettre d’atteindre ce but. Par ailleurs, il est très difficile d’obtenir des échantillons de patients souffrant d’hypertension pulmonaire, ce qui limite considérablement l’étude directe des mécanismes cellulaires et moléculaires de l’HTAP et renforce donc indirectement la nécessité de modèles expérimentaux fiables pour tester en routine des médicaments à fort potentiel thérapeutique.

Réduction

Pour limiter le nombre d'animaux, les animaux sont répartis dans différents groupes expérimentaux et seront mutualisés pour permettre l’obtention de données scientifiques robustes. Les échantillons prélevés serviront pour des analyses histologiques, biochimiques et fonctionnelles. L’estimation du nombre d’animaux repose sur notre expertise préalable, en cohérence avec les données issues de la littérature, et tient compte également des besoins requis pour une analyse statistique adéquate réalisée préalablement.

Raffinement

Une attention permanente sera portée au bien-être des animaux tout au long du protocole, Lors des examens, les animaux seront sous anesthésie générale avec un protocole antidouleur approprié ainsi qu’une surveillance accrue (électrocardiogramme, capteur de pression…). Si l’état de l’animal le nécessite, les responsables du projet et/ou les vétérinaires pourront intervenir pour adapter le protocole antidouleur ou interrompre la procédure. Afin de garantir le bien-être des animaux tout au long de l’expérimentation, des outils structurés tels que l’arbre décisionnel et les critères d’arrêt des souffrances sont mis en place pour guider la prise de décision et intervenir rapidement en cas de détresse. Des points limites ont été définis afin de prévenir toute souffrance excessive des animaux inclus dans l’étude. Ces critères reposent sur l’identification de signes cliniques et comportementaux traduisant une altération significative du bien-être de l’animal, le suivi est réalisé par le personnel formé et attentif aux conditions des animaux.

Choix des espèces

Le rat est utilisé car les rongeurs sont des espèces couramment employées pour développer des modèles expérimentaux d’HTAP. En effet, les rongeurs permettent de reproduire de manière fiable les altérations vasculaires et hémodynamiques observées dans cette pathologie ce qui permet d’évaluer efficacement les traitements expérimentaux. L’injection de la molécule induisant la pathologie sera effectuée chez les rats mâles juvéniles âgés de 4 semaines et l’évaluation de l’effet de la molécule thérapeutique sera donc réalisée chez des rats de 8 semaines.

Deux à trois semaines à 4-6 °C, vingt-quatre heures sur vingt-quatre, en cage individuelle, avec une prise de température rectale quotidienne : 610 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Pour 94 d'entre eux, le froid arrive après huit semaines passées à 28 °C, transition que le porteur décrit comme "un stress plus important", avec sortie du protocole si la température corporelle reste durablement sous 33,5 °C. L'objectif déclaré est de comprendre comment le tissu adipeux brun produit de la chaleur, piste explorée contre l'obésité. Le rat a été préféré à la souris parce que sa taille fournit davantage de tissu adipeux brun par animal, ce qui permet d'en utiliser moins pour une même expérience.

Objectifs

La progression de l'obésité dans le monde est une préoccupation cruciale de la recherche médicale. L’une des stratégies envisagées pour lutter contre ce fléau consisterait à stimuler la thermogenèse, en particulier par le tissu adipeux brun et beige, qui ont la capacité de produire une grande quantité de chaleur à partir de la graisse qu’ils brûlent. La caractérisation des mécanismes de thermogenèse constitue donc une piste de recherche prometteuse pour la prévention et le traitement des maladies métaboliques. Le projet présenté ici permettra d'identifier précisément le rôle du système Créatine-Kinase / Phosphocréatine, dans le processus de production de chaleur par les tissus adipeux brun / beige et de déterminer si ce système pourrait être une cible thérapeutique potentielle dans la lutte contre l’obésité.

Bénéfices attendus

Le système Créatine-Kinase / Phosphocréatine (système CK / PCr) est connu depuis des années pour jouer un rôle majeur dans le transfert d’énergie (réserve et navette énergétique) au sein des cellules musculaires et nerveuses. Des travaux récents montrent une nouvelle fonction de ce système dans la thermorégulation par le tissu adipeux, et également dans la prévention des maladies métaboliques, Cependant, les mécanismes impliqués restent à être élucidés. Notre projet vise à caractériser pour la première fois le rôle du système CK / PCr dans la bioénergétique des tissus adipeux et de déterminer par quel(s) mécanisme(s) et à quelle ampleur, le système CK / PCr participe à la production de chaleur par les tissus adipeux brun/beige. Cette étude pourrait apporter une connaissance primordiale concernant la bioénergétique des tissus adipeux et conduire à de nouvelles approches thérapeutiques dans la prévention et le traitement des maladies métaboliques associées à l’obésité.

Procédures

Les 3 groupes d’animaux seront exposés aux différentes températures (respectivement à 4-6°C, 22-23°C ou 28°), 24h/24, 7J/7 durant 14 ou 21 jours (selon le protocole choisi lors de la série préliminaire), en armoire ventilée et en cage individuelle. La prise de température corporelle (sonde rectale) sera prise quotidiennement durant toute la période de stabulation (phase d’habituation de 5 jours avant le début de l’exposition aux différentes températures et pendant toute la durée de l’exposition jusqu’au jour de l’euthanasie de l’animal, soit durant 19 ou 26 jours (selon le protocole choisi lors de la série préliminaire). La prise de la température corporelle aura lieu 1 fois par jour pour tous les groupes, à l’exception des 5 premiers jours concernant les animaux du groupe exposé au froid (4-6°C), pour lesquels la température corporelle sera prise 2 fois par jour (début de matinée vers 9h et milieu d’après-midi vers 15h). Cette prise de température, qui nécessite une légère contention, ne dure pas plus d’une minute.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les rats seront hébergés en cage individuelle afin de pouvoir suivre précisément leur prise alimentaire. L'isolement constituera donc un inconfort pour l'ensemble des animaux. La seconde source d'inconfort sera liée à l'exposition au froid (4-6°C), 24h/24, durant 2-3 semaines. Elle concerne 204 animaux. Les études utilisant de tels protocoles d'exposition au froid, ne décrivent ni de chute drastique de la température corporelle, ni d'inconfort majeur. Après quelques jours d'acclimatation, durant lesquels les animaux peuvent frissonner et présenter une légère baisse de leur température corporelle, les animaux retrouvent une activité normale. L'inconfort lié à l'exposition au froid est d'autant moindre que, la température de thermoneutralité des rats étant autour de 28°C, lorsque ces derniers sont hébergés à 22°C, ils présentent déjà une certaine adaptation (présence marquée de tissu adipeux brun interscapulaire). Début de modification [Le protocole pour le lot supplémentaire (exposition des animaux à la neutralité thermique (28°C) pendant 8 semaines avant leur exposition au froid (4-6°C) constituera un stress plus important que le passage de 22°C au froid (94 animaux sont concernés), mais au vu des premiers résultats obtenus avec le protocole initial d'exposition au froid, cela semble nécessaire pour favoriser le brunissement du tissu adipeux blanc inguinal (en plus de l'induction du TAB interscapulaire). Les études utilisant ce type de protocole ne décrivent aucune nuisance majeure sur l’animal. On a pu également observer durant notre protocole initial d’exposition au froid, qu'aucun animal ne s’est retrouvé en difficulté et qu'aucune mesure corrective n'a été nécessaire.] Fin de modification.

Devenir

A l'issue de l'unique procédure 1, tous les animaux seront euthanasiés. Ceux qui auraient éventuellement été exclus de la procédure seront également euthanasiés dès la sortie du protocole. Des tissus pourront éventuellement être prélevés après euthanasie et congelés en vue d’une utilisation ultérieure en TP pour des dosages biochimiques.

Remplacement

Au vu de sa complexité, le phénomène de brunissement induit naturellement en réponse à l'exposition au froid, ne peut pas être entièrement reproduit in vitro. En effet, les tissus adipeux sont constitués de cellules de différents types qui interagissent entre elles et il est difficile de reproduire cette hétérogénéité et ce dialogue in vitro. De plus, l’étude des modifications adaptatives des tissus adipeux en réponse au froid nécessite une approche intégrée à l’échelle de l’organisme, qui préserve la communication nerveuse et hormonale, entre les différents types de tissus adipeux d’une part, et entre ces tissus et les organes impliqués dans le métabolisme, comme le foie et le pancréas, d’autre part. L'exposition au froid de l'animal, constitue donc une approche indispensable à l'étude du phénomène de brunissement et aucun modèle alternatif ne peut remplacer le modèle animal. Cependant, en parallèle de ces travaux à l'échelle de l'animal, l'utilisation de modèles cellulaires issus de tissus adipeux humains permettra de voir si certains mécanismes observés sur les adipocytes de rat acclimatés au froid sont retrouvés/ transposables chez l'Homme.

Réduction

Le choix du modèle animal, le rat plutôt que la souris, permet de limiter le nombre d'animaux à utiliser. En effet, les tissus adipeux brun et beige sont des tissus peu abondants et certains des protocoles de l’étude nécessiteraient, chez la souris, de grouper les TAB provenant de 3 à 4 animaux pour une seule expérimentation. Chez le rat, 2 animaux seulement devraient suffire pour obtenir la même quantité d’informations. Par ailleurs, le choix d'une exposition prolongée au froid (2-3 semaines) afin d'obtenir une adaptation maximale de l’animal, permettra d’atteindre les objectifs de l’étude tout en limitant le nombre d’animaux nécessaire. Grâce à l'utilisation d'appareillage de précision, une précision maximale des mesures pourra être obtenue avec très peu de matériel biologique. Pour finir, le niveau de dispersion des données attendues a été pris en compte, afin de calculer le nombre d'animaux au plus juste sans risquer pour autant de compromettre l'interprétation statistique des résultats. De plus, si les données issues de la série préliminaire pour la condition choisie sont exploitables, elles pourront être intégrées à l'étude principale, ce qui réduira le nombre total d'animaux de 8 individus.

Raffinement

Un suivi attentif des animaux, par un personnel formé, sera opéré chaque jour durant la période de stabulation avant et pendant l'exposition aux températures étudiées, afin d'évaluer l'inconfort subi (isolement, température ambiante) et leurs éventuelles conséquences sur le bien-être animal. Début de modification [Des critères comportementaux visant à évaluer l'état général de l'animal et la mesure de variables physiologiques concrètes (masse corporelle, température rectale) de façon journalière et la prise de nourriture (2 fois par semaine) ont été mis en place et seront également appliqués y compris dans ce nouveau protocole. Les animaux mis en cage individuelle, pourront se voir et se sentir dans les armoires ventilées. Afin de réduire le stress, l'habituation aux conditions de stabulation en armoire ventilée et en cage individuelle se fera en 2 temps. Durant notre protocole initial d’exposition au froid, aucun animal ne s’est retrouvé en difficulté et aucune mesure corrective n'a été nécessaire. Dans ce nouveau protocole, où la transition au froid sera plus marquée, la surveillance rapprochée (2 fois par jour) des animaux sera maintenue. Les points limites déjà définis permettront de mener des actions visant à réduire l'inconfort, pouvant aller jusqu'à la sortie du protocole si les signes de souffrance dépassent certaines limites fixées ou si la température corporelle chute durablement en dessous de 33,5°C.] Fin de modification. En plus des expériences prévues dans le projet ANR (sur les tissus adipeux), il est prévu de prélever d'autres organes (foie, coeur, cerveau, muscle, vaisseaux sanguins) afin de recueillir un maximum de données sur les effets du froid et sur l'impact de la température de stabulation (22-23°C versus 28°C neutralité thermique).

Choix des espèces

La plupart des études sur les mécanismes de thermorégulation ont été menées sur les modèles rat ou souris. Plus récemment, le cycle futile de la créatine a été décrit chez la souris. Le choix de focaliser l'étude sur le modèle rat a été motivé principalement par le fait que la taille de l'animal étant supérieure, la quantité de tissu adipeux brun est considérablement plus importante et que par conséquent le nombre d'animaux nécessaire pour une même expérience pourra être réduit par rapport au modèle souris. Par ailleurs, le rat est considéré comme étant un modèle plus proche de l'humain, ce modèle est couramment utilisé et de nombreuses données existent. Les animaux mâles et femelles seront utilisés à l'âge jeune adulte, environ 8-10 semaines. Début de modification [afin de limiter le développement du TAB avant l'exposition au froid, les animaux seront placés à la neutralité thermique dès l'âge de 4 semainesleur réception Chez l'adulte tous les mécanismes de thermorégulation sont établis et l'influence hormonale est stabilisée.