Rats

Tous tués à l'issue, 185 rats reçoivent par gavage de la quétiapine à la moitié de la dose létale 50, seule ou associée à des opioïdes et des benzodiazépines, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur écrit s'attendre "possiblement au décès" en raison de la dose choisie, et décrit une sédation pouvant aller jusqu'au coma, avec hypothermie et dépression respiratoire. Chaque rat subit une chirurgie de vingt minutes à une heure, certains jusqu'à vingt prélèvements sanguins sur animal vigile, et ceux porteurs de sondes de télémétrie sont hébergés seuls jusqu'à la fin. L'objectif déclaré est de comprendre la toxicité d'un médicament de plus en plus impliqué dans des surdoses humaines.

Objectifs

La quétiapine est un antipsychotique de plus en plus prescrit dans la prise en charge de la dépression chez les patients bipolaires et dans la prise en charge de la schizophrénie ainsi que chez les patients présentant des troubles anxieux généralisés. En raison de la fragilité de ces patients et l’accès encore peu restreint en comparaison à d’autres médicaments tels que les opioïdes, le quétiapine est de plus en plus mésusée et se retrouvent impliqués dans un nombre d’overdoses grandissant au cours des 4 dernières années en particulier en Europe. Bien que la quétiapine ne soit décrite comme agissant directement sur les récepteurs aux opioïdes, la prise massive de quétiapine semble induire une dépression respiratoire en plus d’un effet cardiovasculaire qui peut aller jusqu’à entrainer le décès du patient, et pour laquelle le mécanisme d’action reste à ce jour inconnu. Ainsi, les effets neurorespiratoires délétères constatés en clinique en cas de surdosage à la quétiapine seule ou lors de poly-intoxications, nous ont conduits à concevoir ce travail expérimental chez le rat, avec pour objectifs de caractériser selon une approche pharmacocinétique/pharmacodynamique, les effets toxiques (neuro-respiratoires et cardiovasculaires) induits par l’administration par voie orale de quétiapine seule à forte dose, ou en association avec les dépresseurs du système nerveux central, notamment les opioïdes et les benzodiazépines que l’on retrouvent fréquemment détectés dans les prélèvements sanguins post-mortem des intoxications attribuées à la quétiapine.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de caractériser les mécanismes de toxicité en particulier d’ordre neurorespiratoires et cardiovasculaires induits par l’administration de la quétiapine seule ou en association avec d’autres dépresseurs du système nerveux central, et ainsi de mieux comprendre les mécanismes pharmacocinétiques et pharmacodynamiques des interactions entre ce neuroleptique et les psychotropes étudiés que l’on retrouve de plus en plus fréquemment dans les intoxications, en particulier chez les patients dépressifs, plus à risque de surconsommation médicamenteuse, et ainsi permettre l'optimisation ou le développement de nouvelles thérapeutiques au-delà du simple traitement symptomatologique pour la prise en charge des patients intoxiqués.

Procédures

Pour la caractérisation de la fonction ventilatoire, tous les animaux subiront une procédure chirurgicale (20 mins) + gavages de molécules (30 secondes – 1 minute par gavage). Pour l'étude cinétique et métabolique, les animaux subiront tous une procédure chirurgicale (30 mins) + gavages de molécules (30 secondes – 1 minute par gavage) + prélèvements de sang sur animaux vigiles (20 prélèvements ; 1 prélèvement : 30 secondes). Pour l'évaluation de la fonction respiratoire périphérique ou la fonction cardiaque, tous les animaux subiront une procédure chirurgicale (45 mins à 1h) + gavages de molécules (30 secondes – 1 minute par gavage).

Impact sur les animaux

On s’attend surtout à des effets indésirables de type sédation pouvant aller d’une réduction de l’activité locomotrice jusqu’au coma en particulier dans le cas des associations médicamenteuses avec hypothermie et dépression respiratoire. De par le choix de la dose (50% de la dose létale 50), on s’attend possiblement au décès. La présence de ces effets, leur durée ainsi que leur intensité varient en fonction des molécules et des associations qui seront administrées. De plus, un stress lié au gavage, aux anesthésies et aux injections pourrait être perçu par l’animal lors des procédures expérimentales. Un risque de fausse route suite au gavage est à prendre en compte. En outre, lors de la quantification de la réponse ventilatoire, les rats seront isolés seuls dans le système dédié pendant 6 heures. De plus, après la chirurgie d’implantation des sondes de télémétrie pour les mesures de la fonction diaphragmatique et cardiaque, les rats seront hébergés en cages individuelles jusqu’à la fin de l’expérimentation ce qui pourra également induire un stress.

Devenir

La réutilisation des animaux est impossible en raison de la récupération post-mortem de l'appareillage de télémétrie ou de l'atteinte d'un point limite (atteinte du volume sanguin de prélèvement maximal autorisé) qui requiert la mise à mort des animaux.

Remplacement

L’ensemble des procédures ne sont pas remplaçables par des expériences in silico ou in vitro, en raison d’une approche physiopathologique du système respiratoire et cardiovasculaire intégrée sur animal entier ainsi que la caractérisation du comportement pharmacocinétique de la quétiapine dont les différentes phases ne peuvent être évaluées dans leur intégralité que par l’utilisation d’animaux.

Réduction

D'après nos expériences précédentes avec des modèles animaux similaires, il a été déterminé que l'utilisation d'un groupe de 8 animaux est suffisante pour conduire une analyse statistique fiable. Ce nombre de 8 rats par groupe a été prédéfinie par une approche statistique adéquate. De plus, il est prévu d'utiliser le même animal pour les mesures des gaz du sang artériel, les mesures de lactatémie, ainsi que l’étude pharmacocinétique, ce qui permettra de réduire le nombre total d'animaux nécessaires grâce à une technique de dosage par microprélèvements. Enfin, si aucun effet ventilatoire significatif n’est perçu à la suite des associations médicamenteuses, celles-ci ne seront pas étudiées en gaz du sang, ni en électromyographie, dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

La surveillance quotidienne des animaux sera assurée par un personnel qualifié, et des points limites spécifiques adaptés seront mis en place pour détecter et réduire toute souffrance ou douleur. Si nécessaire, des antalgiques seront administrés, tout en veillant à ne pas perturber le déroulement de l'expérience. En cas de besoin, des procédures réglementaires de mise à mort anticipée seront appliquées . Toutes les interventions chirurgicales prévues dans ce projet seront réalisées sous anesthésie générale et accompagnées d'une gestion adéquate de la douleur pendant la période péri-opératoire. De plus, une ouate en silicone sera utilisée après la chirurgie pour favoriser une meilleure cicatrisation et une prise en charge plus rapide en cas de saignement. Enfin, l’étude pharmacocinétique sera réalisée à l’aide de microprélèvements dans le but de réduire au maximum le volume sanguin à prélever.

Choix des espèces

Le rongeur, et plus spécifiquement le rat, est un modèle très pertinent notamment du fait de sa physiologie respiratoire et cardiovasculaire très proche de la physiologie humaine. En plus de sa taille importante qui permet une facilité et une répétabilité des prélèvements, son métabolisme est très semblable à celui de l’Homme, ce qui facilitera la translation des données pharmacocinétiques à l’Homme. Pour les études télémétriques (pléthysmographie, éléctromyographie et électrocardiographie), la pose des sondes est plus aisée et donc plus reproductible. Des rats jeunes adultes âgés de 6 à 8 semaines ayant un poids de 250 à 350 g seront utilisés dans le but de pouvoir faire l’analogie avec ce que l'on retrouve dans la littérature scientifique, la population jeune étant la plus affectée par les problèmes de mésusage de substances en particulier dans un contexte de pathologie psychiatrique sous-jacente.

Tués à l'issue, pour les prélèvements ou en raison d'une difficulté supposée à les remettre en groupe après 24 heures d'isolement, 1 900 rongeurs, 750 souris et 1 150 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souris passent jusqu'à 24 heures seules en cage à métabolisme après administration du produit, tandis que des rats sont opérés pour recevoir un cathéter dans le canal biliaire, parfois deux autres dans le duodénum et la veine fémorale, une chirurgie qui peut durer jusqu'à deux heures. Les rats porteurs de deux ou trois cathéters peuvent repasser en cage à métabolisme une semaine plus tard, la mesure de la diurèse sur 24 heures peut être répétée jusqu'à trois fois, et les deux espèces peuvent être privées d'eau ou de nourriture. Le porteur range parmi les bénéfices destinés aux rats et aux souris eux-mêmes "une amélioration des connaissances scientifiques pour l'espèce utilisée".

Objectifs

L'évaluation de l'élimination et de la toxicité sont des étapes obligatoires au cours du développement d'un nouveau candidat médicament. Chaque étude de ce projet a pour but d’évaluer les différentes voies d'élimination (hépatique, rénale, gastro-intestinale, sanguine) d'un candidat médicament et sa toxicité sur les principales voies métaboliques de l'organisme.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la découverte de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires dans la pathologie humaine qui est ciblée par la/les substance(s) active(s) testée(s) dans ce projet. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont principalement une amélioration des connaissances scientifiques pour l’espèce utilisée (rat et souris) grâce au développement de méthodes de raffinement de plus en plus adaptées et à la sélection de l’espèce la plus adéquate pour répondre aux objectifs scientifiques attendus.

Procédures

Les souris de ce projet pourront subir une administration (moins de 2 min) suivie d'une mise en cage à métabolisme (24h maximum) pour la collecte d’urine et/ou de fèces avec ou non des prélèvements sanguins (moins de 2 min). Les rats de ce projet pourront subir une chirurgie pour l’implantation d’un cathéter dans le canal biliaire (30 min à 1h) . Cette chirurgie pourra comprendre l’implantation d’un ou deux cathéters supplémentaires un dans le duodénum et/ou un dans la veine fémorale (1h30-2h). Les rats de ce projet pourront également subir une administration (moins de 2 min) suivie d'une mise en cage à métabolisme (24h maximum) pour la collecte de bile et/ou d’urine et/ou de fèces avec ou non des prélèvements sanguins (moins de 2 min). Les rats avec les 2 ou 3 cathéters pourront être mis à 2 reprises en cage à métabolisme séparées d’environ 1 semaine. Les animaux de ce projet pourront subir une chirurgie pour l'implantation d'une minipompe servant à la délivrance en sous cutané ou en intraveineux d'une substance (20 à 45 min), suivie d'une mise en cage à métabolisme (24h maximum) pour la collecte d’urine et/ou de fèces avec ou non des prélèvements sanguins (moins de 2 min). La mesure de la diurèse sur 24h pourra être répétée jusqu’à 3 fois en faisant 1 session par semaine après contrôle de l’état de santé de l’animal (poids et hydratation).

Impact sur les animaux

Les souris de ce projet pourront subir une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors de l'administration du produit, un stress lié à l'isolement en cage à métabolisme (24h) pour la collecte d’urine et/ou de fèces, avec ou non une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors des prélèvements sanguins, un stress lié à la privation d'eau et/ou de nourriture. Les rats de ce projet pourront subir un stress lié à l'anesthésie gazeuse, un stress postopératoire (une légère douleur/inconfort est possible malgré les analgésiques), un stress lié à la contrainte du bouton dermique lié au cathéter pour le recueil de la bile et/ou du duodénum et/ou de la veine fémorale, une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors de l'administration du produit, un stress lié à l'isolement en cage à métabolisme (24h ou 2ou3X 24h séparée d’environ 1 semaine) pour la collecte d’urine et/ou de fèces, avec ou non une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors des prélèvements sanguins, un stress lié à la privation d'eau et/ou de nourriture.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure du fait soit des prélèvements nécessaires à l'étude soit de leur isolement pendant 24h et de la difficulté à les remettre en groupes sociaux ensuite qui sera vérifiée au cours de la mise au point du modèle de rat avec les cathéters bilaires, duodénal (et/ou fémoral ou carotide) maintenu en vie 8-10 jours.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rat ou la souris car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur le métabolisme hépatique, intestinal et/ou rénal. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le rat ou la souris est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : 4 à 8 / par groupe.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales.

Choix des espèces

Les souris et les rats font parties des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour les modèles animaux de la recherche biomédicale et les études de médecine comparative en raison de leur similarité anatomique, physiologique et génétique avec l'homme (les rats, les souris et les humains partagent environ 95% de gènes). Les rongeurs sont des animaux de petite taille, facile d'entretien, avec un cycle de vie court et pour lesquels il existe une abondance de leurs ressources génétiques. Le rat et la souris sont donc les espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer le métabolisme d'un produit et sa toxicité sur les voies d'élimination de ce produit. Animaux adultes, à partir de 7 semaines. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

36 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélever le gros intestin, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent de l'amoxicilline associée à l'acide clavulanique par gavage ou par injection intramusculaire, et leur abdomen est massé jusqu'à neuf fois pour provoquer la défécation. Le porteur prévoit douleur, stress, réactions d'hypersensibilité locale et diarrhées, et indique que les rats perdant 15 à 20 % de leur poids ou montrant des signes de douleur persistants seront mis à mort. L'objet du projet reste l'effet d'un antibiotique courant sur la flore intestinale, une question que le porteur affirme ne pouvoir trancher qu'in vivo pour mesurer directement la quantité d'antibiotique au contact du microbiote.

Objectifs

Le microbiote intestinal (MI) est fondamental pour la santé des mammifères. Les traitements antibiotiques causent un déséquilibre qui comporte l'augmentation d'espèces pathogènes et/ou porteurs de mécanismes de résistance, au détriment d'espèces bénéfiques à la santé de l'hôte. De plus, les antibiotiques sont souvent associés à l'inflammation des tissus intestinaux. Les voies d'administration par injection semblent avoir un effet moins important sur la sélection des résistances dans le MI, mais peuvent l'affecter en causant des déséquilibres au niveau de la composition du MI. L'association amoxicilline - acide clavulanique (AMC) est active contre plusieurs espèces bactériennes. L'AMC est utilisé chez l'Homme et les animaux. Les études sur l'impact de l'AMC sur la composition du MI, conduites chez l'Homme et certaines espèces animales, ne sont pas concluantes. Deux limites principales ont été observées: i) l'absence de comparaison avec un groupe contrôle constitué de sujets sains non traités; ii) dans certaines expérimentations chez l'animal, l'administration de l'AMC via la consommation ad libitum d'eau ne reflète pas la réalité d'un traitement et de l'exposition de l'indivdu à l'antibiotique. Les objectifs de cette étude sont : i) étudier l'impact de l'AMC sur la composition du MI chez le rat après administration par voie intramusculaire ou orale, versus des groupes contrôles sains non traités ; ii) quantifier les gènes de résistances dans les fèces avant et après l'administration d'AMC et en absence de traitement; iii) évaluer l'exposition du MI, selon les deux voies d'administration, par dosages de l'AMC dans les fèces et le gros intestin ; iv) évaluer la résilience (retour à la composition initiale) du MI après un traitement à l'AMC.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet concernent plusieurs aspects. L'analyse du MI via une analyse métagénomique par séquençage aléatoire à haut débit permettra de déterminer quelles communautés bactériennes et fonctions biologiques sont perturbées par l'AMC. Ces connaissances mettront les bases pour développer des stratégies afin de préserver les fonctions du MI. Chez l'Homme, la voie par injection est plus courante dans les hôpitaux avec un relais par voie orale dès que possible. En santé animale, selon les espèces, l'une des deux voies est privilégiée (injectable chez les bovins, orale chez les carnivores domestiques). Cette étude permettra de confirmer l'éventuel impact de la voie injectable sur le MI et donnera les bases pour privilégier une voie d'administration. La plupart des études se sont focalisées sur l'impact d'un traitement antibiotique sur la composition du MI sans évaluer, en parallèle, la quantification des gènes de résistance aux antibiotiques. Cette étude fournira, pour la première fois, une connaissance plus approfondie sur ces deux aspects.

Procédures

Les animaux seront soumis à une administration d'amoxicilline associée à l'acide clavulanique par voie orale (groupe B), soit par voie intramusculaire (groupe A). L'administration par voie intramusculaire se fera sous sédation gazeuse (durée : 1 minute) pour soulager l'inconfort et la douleur occasionnée par l'injection (durée : 30 secondes). Le gavage (durée : 1 minute) ne nécessite pas de sédation, puisque la pratique repose sur un geste techniqué et maîtrisé. Afin de réaliser les prélèvements de matières fécales, les rats seront disposés dans des boites préalablement désinfectées et l'abdomen de chaque animal sera massé pour favoriser la défécation spontanée. Cette manipulation sera effectuée neuf fois sur 24 rats et 8 fois sur 36 rats. Le gros intestin de tous les rats sera prélevé après sédation gazeuse et mise à mort.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sont la douleur et le stress dus à l'administration de l'antibiotique ainsi que des réactions d'hypersensibilités locales après l'administration intramusculaire de la solution d'AMC. Potentiellement des diarrhées peuvent émerger.

Devenir

J11 et J100, les rats seront mis à morts afin de prélever le gros intestin.

Remplacement

Le modèle animal choisi pour cette étude ne peut pas être remplacé. Seulement les études in vivo permettent de reproduire l'exposition di MI dans le cadre d'une thérapie antibiotique. La quantification directe de l'AMC dans l'intestin permettra d'objectiver directement la quantité d'AMC présente au contact du microbiote.

Réduction

Il est prévu d'utiliser le minimum de sujets nécessaires dans chaque groupe pour pouvoir rendre les résultats interprétables. Selon une approche statistique, il a été estimé qu'un total de 36 rats seraient nécessaires pour la totalité du projet. L'étude nécessite 4 groupes de 9 rats, en tenant compte d'un tiers sera utilisé pour une analyse du microbiote intestinal après la fin de l'administration de l'amoxicilline associée à l'acide clavulanique, et les deux tiers restants pour l'analyse à trois mois après la fin de l'administration de l'antibiotique.

Raffinement

Les rats auront une période d'acclimatation de 3 semaines avant d'effectuer le protocole. Les rats seront hébergés dans des cages spéciales rats qui leurs permettront la stature bipède. Un tunnel, des Sizzle-Nest et des os à ronger sont disponibles dans les cages. La socialité des animaux sera garantie en hébergeant 3 rats par cage. Pour réduire le stress dû à l'administration de l'AMC, les rats auront une sédation. Pour soulager la douleur due à l'injection d'AMC ou à une éventuelle hypersensibilité locale, de la pommade contenant de la lidocaïne sera placée sur la cuisse concernée. Pendant l'administration d'AMC, le poids des animaux sera monitoré. Si une perte de poids importante (-15 à -20% dans les 3 jours et comparée au poids pré-administration ou aux groupes contrôles) est observée, l'animal sera mis à mort. Si l'animal montre des signes de douleur( le poil hérissé, le dos arrondi, le faciès contracté et/ou l'isolement), du paracétamol (200 mg/kg) sera administré par voie orale (biberon), 3 fois maximum pendant 24h. Si les signes de douleur persistent au-delà de 3 jours, l'animal sera mis à mort. La diarrhée est un effet secondaire possible. L'incidence de la diarrhée associée à l'administration d'AMC chez le rat n'est pas connue. En se basant sur les observations conduites chez l'Homme, si une diarrhée de courte durée sans signes de douleurs et sans déshydratation (pli de peau persistant) émerge, aucune modification ne sera apportée au protocole. Cependant, en cas de signes de douleur, du paracétamol sera administré à tous les animaux pour éviter un biais lié à cette administration. Si la diarrhée se prolonge sur plus de 3 jours, associée à des signes de déshydratation et une perte de poids, l'animal sera mis à mort.

Choix des espèces

L'utilisation des rats comme modèle d'étude nous permet de contrôles les facteurs, comme l'âge, l'alimentation ou encore l'état de santé , qui peuvent jouer un rôle dans la composition du MI et donc être confondant pour l'évaluation de l'impact de l'AMC. Les rats sont le modèle le plus utilisé dans les études du microbiote intestinal. De plus, le rat est souvent utilisé pour les études sur le MI humain, car son MI conserve des caractéristiques communes à tous les mammifères, permettant la généralisation des résultats. Dans le cadre de l'étude de l'impact de l'AMC sur le MI, les rats seront adultes (8 semaines). En effet, à ce stade, la composition du MI est stabilisée. Ainsi, les perturbations observées après l'administration d'AMC peuvent être attribuées à l'antibiotique et non au sevrage des rats.

Pour tester des nanoparticules poreuses censées porter des gaz et des médicaments jusqu'aux tumeurs, 1 692 souris et 504 rats sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous mis à mort pour prélever leurs organes. Une partie reçoit une implantation de cellules tumorales dans le cerveau sous anesthésie, puis trois séances d'irradiation de 4 Gy et des injections intraveineuses trois jours de suite. Le porteur s'attend à une perte de poids, de motricité et de sensibilité chez les animaux porteurs d'une tumeur cérébrale, ainsi qu'à une dégradation de l'état général jusqu'à une semaine après l'irradiation du crâne, avec pelades sur la tête et sécrétions au museau. Il justifie le projet par le "besoin d'améliorer" des thérapies dont il constate le manque d'efficacité, et présente le nombre annoncé comme un maximum susceptible d'être réduit si les seuils statistiques sont atteints plus tôt.

Objectifs

Ce projet a pour but de caractériser l’intérêt de nanoparticules (NPs) poreuses comme vecteur de thérapies (gazeuses et médicamenteuses) pour les tumeurs hypoxiques, décrites dans la littérature comme résistantes aux traitements actuels. En effet, un meilleur ciblage de la tumeur par ces NPs permettrait d’améliorer l’efficacité des traitements actuels tels que la radiothérapie (RT), les chimiothérapies (CT) ou encore les immunothérapies (IT). Devant le manque d’efficacité des thérapies standards, ce projet se justifie par le besoin d’améliorer, par des approches innovantes, les thérapies actuelles.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est une amélioration des stratégies thérapeutiques actuelles en utilisant comme vecteur des NPs qui ont montré, par nos études précédentes, leur capacité à s’accumuler dans la tumeur tout en préservant le tissu sain environnant .

Procédures

Les animaux sont soumis à plusieurs types d’interventions : - Chirurgie (implantation cérébrale de cellules tumorales sous anesthésie générale) : 30 minutes maximum par animal, réalisée une seule fois sur chaque animal. - Injection intraveineuse de cellules tumorales (animal vigile) : 1 fois à l’injection des cellules ; 5 minutes maximum par animal. - Injection sous-cutanée de cellules tumorales (animal vigile) : 1 fois à l’injection des cellules ; 5 minutes maximum par animal. - Injection intraveineuse des NPs (animal vigile) : 3 fois sur 3 jours consécutifs ; 5 minutes maximum par animal. - Injection intraveineuse des CT ou IT (animal vigile) : 3 fois sur 3 jours consécutifs ; 5 minutes maximum par animal. - Irradiation (sous anesthésie générale) : 3 séances de 4 Gy sur 3 jours consécutifs : 10 minutes maximum par animal. - Injection sous-cutanée de buprénorphine (animal vigile) : 1 fois avant la mise à mort pour tous les animaux et 3 fois pour les animaux avec des tumeurs cérébrales qui auront deux injections supplémentaires en péri-opératoire ; 2 minutes maximum par animal.

Impact sur les animaux

Parmi les procédures expérimentales, les injections intraveineuses (cellules tumorales, NP, CT ou IT) ou les injections sous-cutanées effectuées sur un animal vigile peuvent causer un stress à l'animal lors de l'intervention, ce qui peut être considéré comme une nuisance légère. De plus, au regard de l’expérience du laboratoire concernant les différentes procédures expérimentales, nous nous attendons à avoir des effets indésirable modérés avec une perte de poids, de motricité et de sensibilité chez les animaux qui auront un développement de tumeur cérébrale. Également, sur ces modèles de tumeur cérébrale, nous nous attendons à une fatigue et une dégradation de l’état général (porphyrine autour des yeux et de la bouche, sécrétions au niveau du museau, pelades sur la tête) induit par l'irradiation cérébrale jusqu’à une semaine après l’irradiation.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort pour prélèvement d'organes.

Remplacement

Les tumeurs sont connues pour être multi-compartimentales, c'est-à-dire qu’au-delà du simple compartiment de la cellule tumorale existent la vascularisation, l’hypoxie et l’inflammation qui influent fortement sur la cellule tumorale. L’utilisation de modèles in vivo complets permet d’intégrer ces différentes composantes, indispensables à la compréhension des mécanismes de développement tumoral et à la réponses aux différents traitements. Ce projet intervient après plusieurs étapes de validation in vitro ayant permis de retenir les meilleures NPs (taille, aspect de toxicité, oxygénation) mais ne peut pas s’effectuer intégralement sur des modèles de remplacement in vitro ou in silico.

Réduction

L’utilisation des méthodes d’imagerie non invasive et des modèles de tumeur sous-cutanés se conforment à la réglementation en vigueur dans le respect de la réduction du nombre d’animaux car elles permettent de suivre à différents temps l’évolution de la tumeur chez le même animal sans nécessité d’euthanasier plusieurs animaux à chacun des temps. Chaque animal est dans ce cas son propre contrôle et permet de réduire le nombre total d’animaux nécessaires pour l’étude. Toutefois, dans tous les protocoles d’imagerie, d’irradiation, les animaux seront anesthésiés par inhalation d’isoflurane, non sans risque pour l’animal. Afin de pouvoir réaliser des analyses statistiques, nous estimons qu’au minimum, 12 animaux par groupe au départ sont nécessaires afin de réaliser des tests statistiques puissants, et ainsi comparer les effets des différents traitements et ce, en fonction du temps. Ces 12 animaux sont calculés sur la base d’un test de puissance connaissant la variabilité intrinsèque des modèles tumoraux basés sur nos travaux antérieurs. Il est important de noter ici que le nombre d’animaux calculés est un nombre maximal. En effet, les expériences seront réalisées par plusieurs lots et si les seuils statistiques sont atteints alors le protocole sera stoppé.

Raffinement

A leur arrivée, les animaux seront placés en groupe sociaux (4 souris par cage et 3 à 2 rats par cage) dans des cages standards répondant aux normes européennes. Ils bénéficieront d’un temps d’adaptation de 7 jours minimum avant toutes expérimentations et bénéficierons également d’enrichissement (roue d’activité, tunnel en carton, stimulation sensorielle par différents objets). Les animaux seront surveillés de leur arrivée à la fin du protocole par un personnel compétent afin de déterminer leur état (poids, apparence physique) et la mise en place, si nécessaire, de mesures afin d’améliorer le bien-être animal. Cette évaluation sera réalisée quotidiennement pendant les phases critiques (implantation, irradiation) et 3 fois par semaine par la suite. Enfin, les différents protocoles ont été pensés de manière à limiter au maximum la souffrance animale par l’administration d’agents analgésiques et anesthésiques appropriés et par le choix de points limites cohérents. Pour les animaux immunodéprimé, la procédure est identique à l’exception de l’hébergement. En effet, les animaux sont placés dans des cages ventilées individuellement par des portoirs spécifiques, ces deniers étant eux-mêmes dans une zone spécifique et dédiée à la manipulation des animaux immunodéprimés pour la recherche en cancérologie.

Choix des espèces

La souris et le rat immunodéprimés sont des espèces de choix pour évaluer l’évolution du volume tumoral dans le temps dès lors que les cellules tumorales utilisées sont d’origine humaine. Notre expertise des différents modèles de tumeurs cérébrales, nous a permis d’établir que suivant le type cellulaire, nous obtenons des tumeurs plus ou moins hypoxiques et plus ou moins vascularisés (Corroyer-Dulmont et al., Biol Chem. 2013). Ces deux composantes, influençant la croissance tumorale et l’efficacité des traitements actuels, il est nécessaire de travailler avec ces différents modèles in vivo, afin de se rapprocher de la situation clinique. Lorsque les cellules tumorales (cérébrales et pulmonaires) sont d’origine murine (issues de souris C57Bl/6) alors nous pouvons utiliser des animaux immuno-compétents de même souche (souris C57Bl/6) dans ce projet afin de prendre en compte l’ensemble du système immunitaire et le contexte inflammatoire du micro-environnement étudié et connus pour participer à la réponse aux traitements. L’ensemble des animaux utilisés dans cette étude seront de jeunes adultes, mâles et femelles, âgés de 8 à 12 semaines en début de protocole. Cela permettra le développement de tumeurs plus reproductibles. De plus, à ce stade, le cerveau est mature et il est possible de suivre l’évolution des animaux sur des temps longs. Cet âge leur confère également une résistance aux protocoles expérimentaux utilisés.

Pour étudier la vulnérabilité à l'addiction à la cocaïne, 652 rats sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour prélèvement d'échantillons. La plupart subissent une chirurgie cérébrale de deux heures puis la pose d'un cathéter veineux, avant trente séances d'autoadministration de cocaïne sur plusieurs semaines. Le porteur écrit que le rat "s'autoadministre à son gré et librement", une formulation qui gomme le dispositif expérimental imposant l'accès à la drogue. L'étude relève de la recherche fondamentale, ses applications thérapeutiques restant évoquées de façon générale.

Objectifs

L’addiction à la cocaïne est un enjeu de santé publique. Aucun traitement n’est actuellement approuvé pour cette addiction qui se développe chez environ 20% des usagers dits vulnérables. Au moyen d’un modèle validé chez le rat, qui permet d’identifier 20% de sujets à risque de développer un comportement de type addiction à la cocaïne, nous cherchons à comprendre les différences biologiques entre sujets vulnérables et résilients afin d’identifier des mécanismes pathologiques et des cibles thérapeutiques. Précisément, nous cherchons à identifier dans le comportement des animaux vis-à-vis de récompenses naturelles palatables des facteurs prédictifs de cette vulnérabilité à l’addiction à la cocaïne. Nous cherchons à comprendre les mécanismes cérébraux d’un comportement adapté vis-à-vis des récompenses naturelles et vis-à-vis de la cocaïne, et à établir comment sujets vulnérables et résilients à l’addiction diffèrent pour ces mécanismes.

Bénéfices attendus

La consommation de cocaïne est en forte expansion en Europe et un enjeu de santé publique mondial. Ce projet participe à la compréhension des mécanismes biologiques et comportementaux qui sous-tendent la vulnérabilité à cette addiction. Cette compréhension doit permettre de guider les approches thérapeutiques, y compris psycho-comportementales.

Procédures

380 animaux seront soumis à une chirurgie cérébrale (durée moyenne : 120 min) puis 20 à 30 jours plus tard à une chirurgie intraveineuse pour l'implantation d'un cathéter intraveineux (durée moyenne : 30 min) suivie de 30 sessions d'autoadministration de cocaïne (2h par jour, 5 jour par semaine). 192 animaux seront soumis à 30 sessions d'autoadministration orale d'une solution palatable (2h par jour, 5 jour par semaine) suivies d'une chirurgie intraveineuse pour l'implantation d'un cathéter intraveineux (durée moyenne : 30 min) suivie de 30 sessions d'autoadministration de cocaïne (2h par jour, 5 jour par semaine). 80 animaux seront soumis à une chirurgie cérébrale (durée moyenne : 120 min) suivi de 35 sessions d'autoadministration orale d'une solution palatable (2h par jour, 5 jour par semaine). Toutes les chirurgies sont effectuées sous anesthésie générale, en conditions aseptiques, sur couverture chauffante.

Impact sur les animaux

Les procédures appliquées dans ce projet sont toutes de gravité modérée. Les nuisances attendues sont celles associées à une chirurgie vasculaire ou cérébrale, dans des conditions où toutes les mesures sont prises pour réduire douleur et risque d’infections (aseptie, anesthésie générale, analgésie/anti-inflammatoire pré- et post-opératoire sur plusieurs jours). Les nuisances attendues sont celles associées à l'autoadministration de cocaïne dans des conditions où toutes les mesures sont prises pour minimiser les risques cardiovasculaires connus liés à l'usage de cette drogue (limite de la quantité prise par jour, alternance d'accès et de non accès à la drogue, traitement anti-thrombose). L'autoadministration est un comportement opérant ; le rat émet une réponse comportementale qui lui donne accès à la récompense (cocaïne ou solution palatable). Il s'autoadministre à son gré et librement.

Devenir

Au terme des trois procédures, les animaux seront mis à mort selon une méthode réglementaire, pour prélèvement d’échantillons.

Remplacement

Seul le modèle animal permet d’interroger les mécanismes neurobiologiques difficilement accessibles chez l’homme. De plus, l’étude du comportement addictif ne peut se réduire à la simple étude de l’effet de la drogue. Ce comportement met en jeu des mécanismes psychopharmacologiques complexes qui ne peuvent pas être appréhendés par des modèles ex vivo.

Réduction

L'utilisation d'un trop grand nombre d'animaux est contraire à l'éthique, mais si trop peu d'animaux sont utilisés, l'expérience peut manquer de puissance statistique. Nous procédons à des analyses statistiques afin de déterminer le nombre minimum de sujets nécessaires pour obtenir un résultat fiable. Notre grande maîtrise des chirurgies et des procédures comportementales que nous mettons en œuvre nous permet de ne pas dépasser ce nombre minimum.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en cycle inversé (obscurité : 7h-19h). Les expériences se déroulent dans la phase active de ces animaux nocturnes, respectant leur sommeil. Ils sont hébergés individuellement pour éviter des blessures ou dégâts aux implants entre congénères. Les cages transparentes sont disposées pour que chacun ait un contact visuel, auditif et olfactif avec deux de ses congénères. Pour enrichissement, des lanières de papier kraft sont placées dans la cage et renouvelés systématiquement lors du change. Les paramètres environnementaux sont contrôlés en permanence. Hors études comportementales, les animaux sont manipulés deux fois et pesés une fois par semaine. Dès le début des études comportementales, les animaux sont pris en main deux fois par jour (sauf week-end où ils sont observés). Une à deux semaines avant leur application, les animaux sont habitués à toutes les manipulations, jusqu’à ce que chaque animal, si c’était le cas, n’exprime plus d’inconfort. Un anti-inflammatoire/analgésique est administré en pré-opératoire. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale gazeuse ou anesthésie/analgésie chimique. Des mesures strictes d’asepsie sont appliquées. Les chirurgies sont réalisées sur couverture chauffante. Les périodes post-opératoires font l’objet d’un suivi spécifique pendant trois jours incluant une pesée quotidienne et un traitement antalgique/anti-inflammatoire. Des points limites stricts et spécifiques au projet ont été définis qui conduisent à décider d’une euthanasie en accord avec le vétérinaire.

Choix des espèces

Compte tenu des questions que nous posons, il est nécessaire d’utiliser une espèce mammifère dont le développement des réseaux neuronaux permet l’expression d’un comportement aussi complexe que la prise de drogue. Or il a été montré un continuum entre les mécanismes psychologiques et biologiques des processus de récompense entre le rat et l’homme, et ces processus sont à la base de l’addiction, étudiée dans ce projet. Nous utilisons des rats âgés de 8 à 10 semaines à leur arrivée au laboratoire (250-275 / 270-300g) correspondant au stade jeunes adultes, ce qui garantit, compte tenu des périodes d’habituation appliquée, d’étudier l’addiction de façon stable à l’âge adulte.

Pour initier des étudiants aux techniques d'expérimentation animale, 150 souris et 150 rats sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués puis congelés pour être ensuite disséqués. Manipulés par des étudiants inexpérimentés, les animaux reçoivent des injections sous-cutanées, intrapéritonéales et des gavages d'eau physiologique. Le porteur détaille les précautions sonores demandées aux étudiants, chuchoter, couper les téléphones, éviter les parfums, pour limiter le stress des animaux. Il conclut qu'aucune méthode ne peut remplacer l'animal vivant, la certification imposant une manipulation sur animal réel.

Objectifs

Pédagogiquement, ces travaux pratiques permettent aux étudiants une initiation à l’expérimentation animale. Et comme demandé dans les compétences visées par le module, ils apprennent à mettre en oeuvre des techniques d’expérimentation animale. Les étudiants diplômés du bachelor universitaire de technologie (BUT) génie biologique parcours Biologie médicale et biotechnologie (BMB) peuvent être amenés à faire un stage dans des établissements utilisateurs d’animaux à des fins scientifiques ou à y travailler au cours de leur vie professionnelle. L'objectif est d’obtenir la certification d’expérimentation animale niveau applicateur, les étudiants ont une partie théorique puis une partie pratique (Travaux pratiques en expérimentation animale : initiation chez le rat et la souris).

Bénéfices attendus

Cet enseignement permettra aux étudiants de découvrir le monde de l'expérimentation animale, de pouvoir passer le Certificat d’expérimentation animale niveau applicateur et de pouvoir travailler pendant l’année scolaire comme vacataire dans un établissement utilisateur d’animaux. Ce projet permettra aux étudiants d'acquérir la compétence " Mener des études à l'échelle de l'organisme et de la cellule en biologie de la santé" exigées dans le cadre du bachelor universitaire de technologie (BUT) parcours Biologie médicale et biotechnologie (BMB(. L'acquisition de cette compétence nécessite pour l'étudiant de maitriser un certain nombre d'apprentissages critiques (AC) qui sont, pour cette compétence, : i) Mettre en oeuvre des procédures expérimentales d'études physiologiques. Le contenu de ce projet répond ainsi à ces apprentissages critiques et entre donc dans le processus d'acquisition de cette compétence en complément des autres enseignements théoriques et pratiques de la Ressource "Physiologie et Expérimentation animale" et de la SAé associée.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections sous-cutanée et intra-péritonéales d'eau physiologique. Un gavage pourra être pratiqué. Un animal recevra au maximum 1 IP et une sous cutanée pendant une séance de TP de 5 h.

Impact sur les animaux

Les animaux seront manipulés (administrations diverses – sous cutanée, intra-péritonéales, gavage, anesthésie) par des étudiants inexpérimentés, ce qui pourrait être source de stress et de nuisances pour les animaux. Donc avant le début de la séance, il sera demandé aux étudiants de chuchoter, de rester calme et d'éviter les déplacements (matériels et humains) durant la manipulation des animaux. Afin d'atténuer le stress des animaux, une musique d'ambiance calme pourra être mise en place à l' animalerie et dans la salle de TP pour créer un fond sonore homogène afin de réduire le stress des animaux. Enfin, il sera demander de couper les téléphones portable et d'éviter les parfums forts pour éviter l'inconfort des animaux.

Devenir

A l’issue des séances de travaux pratiques, les animaux seront euthanasiés. La mort de l’animal est vérifiée par contrôle de l'arrêt cardiaque en palpant la cage thoracique et par l' absence de reflexe. Les animaux morts seront ensuite stockés au congélateur dans le but d’être disséqués par les étudiants de première ou deuxième année de Génie biologique dans le cadre d'études d'histologie

Remplacement

Pour cet apprentissage, il n’est pas possible de remplacer l’utilisation des animaux vivants par une autre méthode pour observer et manipuler rats et souris. Les objectifs de ces TP sont d’être capable de mettre en oeuvre les techniques d'expérimentation animale pour des études de toxicologie, de pharmacocinétique, d’études du métabolisme ou de pharmacodynamie. Afin de respecter le programme national publié en 2021 par le ministère, un remplacement n’est pas possible dans ce contexte car, les titulaires du diplôme DU APEX doivent être en mesure d’intervenir en expérimentation animale in vivo et in vitro. De plus, la certification en expérimentation animale « niveau applicateur » ne peut être obtenu qu’après manipulation sur animal vivant (arrêté du 1er fevrier 2013). Afin de préparer au mieux les étudiants et ainsi éviter des mauvais gestes avec les animaux, les étudiants auront avant les travaux pratiques, une information théorique sur les différentes techniques avec des photos et ces photos seront disponibles pendant la scéance de TP. Une sensibilisation sur l'éthique et le bien être animal sera faite également avant les TP. Enfin, juste avant la séance de manipulation sur l'animal, une video explicative sera présentée.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été réduit au maximum en prenant en compte que la formation s’adresse à 5 étudiants qui au cours de chaque séance vont manipuler plusieurs animaux afin de pouvoir apprendre correctement sans toujours utiliser le même animal, et aussi bien des mâles et que des femelles. De plus, les animaux morts sont utilisés ensuite pour des séances de dissections en travaux pratiques.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe, dans des cages standards aux normes européennes, avec enrichissement. Le bien-être des animaux est suivi quotidiennement. Les principes éthiques et les standards de raffinement sont utilisés jusqu’à la mise à mort des animaux.

Choix des espèces

Les rongeurs sont les animaux les plus utilisés en expérimentation animale. Ce sont donc des animaux sur lesquels les étudiants seront susceptibles de travailler. De plus, la souris et le rat sont les animaux sur lesquels portent plus particulièrement le certificat d’expérimentation animale niveau applicateur.