Rats
Étude pharmacocinétique et pharmacodynamique de candidats médicaments.
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles urogénitaux
Rats : 270
Cochons d'Inde : 270
270 souris, 270 rats et 270 cochons d'Inde vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Cette société de prestations teste pour ses clients des molécules dont elle indique ignorer la nature et les effets, administrées par des voies multiples, avec des prélèvements sanguins par ponction rétro-orbitale, sublinguale ou intracardiaque et des séjours de 24 heures en cage à métabolisme qui isolent chaque animal. Le porteur reconnaît qu'il lui est difficile d'anticiper les nuisances puisqu'il ne connaît pas les composés testés. Il conclut que l'absence de modèle in vitro rend le recours à l'animal "incontournable" et fixe six animaux par groupe d'après quinze ans d'expérience, sans test statistique.
Objectifs
Ce projet approuvé par la direction de la société permettra d’évaluer l’absorption, la distribution et le métabolisme de candidats médicaments dans l’organisme après administration afin d’obtenir des données de pharmacocinétiques et pharmacodynamie. Etant une société de prestations de service, nous testons les molécules de nos clients dont nous n’avons aucune connaissance sur le type/famille de molécule. Cependant, ces molécules seront testées dans le cadre de la recherche de pathologies rénales, urologiques, oncologiques, gastro-entérologiques…nos principales thématiques de recherche.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de récolter du matériel biologique (sang, organes, urines, fecès, salive….) afin d’avoir des données pharmacocinétiques et pharmacodynamiques de candidats médicaments. Ces différentes données, obtenues au tout début des études pré-cliniques, permettront par la suite d’adapter les doses et la fréquence d’administration des composés dans des études plus complexes (pouvant mimer une pathologie).
Procédures
Les animaux seront traités par des molécules par différentes voies possible (per os, intrapéritonéale, intra-veineuse, sous-cutanée, intradermique, intra-vésicale…). Ces gestes sont en général rapides et durent moins d’une minute/animal. Les animaux pourront être anesthésiés pour certains gestes ou prélèvements (gazeuse : isoflurane ou fixe : xylazine/kétamine). Ces anesthésies devraient être rapides et ne pas durer plus de 1 heure (pour les administrations intra-vésicales). Des prélèvements sanguins sur animal vigil ou anesthésié au niveau des veines caudales, saphènes, de la veine abdominale, en sublinguale, submandibulaire, rétro-orbital ou intracardiaque pourront être réalisés. Ces gestes sont rapides et durent moins de 5 min. Les animaux pourront être mis dans les cages à métabolisme et seront donc isolés de leurs congénères quelque temps (24H maximum).
Impact sur les animaux
Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux. Cependant, les animaux vont être manipulés et vont recevoir des administrations de produits, pouvant engendrer un stress et une légère douleur. Les animaux pourront être mis dans des cages à métabolisme, et donc être isolés temporairement de leurs congénères (24 heures maximum), avoir des prélèvements sanguins, être anesthésiés…tout cela peut provoquer une nuisance.
Devenir
A l’issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés car des prélèvements de sang et d’organes seront réalisés.
Remplacement
Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent fournir du matériel biologique afin de réaliser différents tests de pharmacocinétique ou pharmacodynamie. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.
Réduction
Nous avons établi une stratégie d’expérimentation nous permettant dans la mesure du possible, de mesurer la valeur basale de chaque animal (l’animal est son propre contrôle). Cette stratégie permet donc de réduire sensiblement le nombre d’animaux par groupe. En général, ces études préliminaires de pharmacocinétique et pharmacodynamie ne sont pas réalisées sur un grand nombre d’animaux car ce sont des études préliminaires aux tests pré-cliniques. Aucun test statistique n’est utilisé pour déterminer le nombre d’animaux par groupe. Cependant, de par notre expérience de plus de 15 ans, nous savons qu’un nombre de 6 animaux par groupe est suffisant pour avoir des données fiables et statistiquement significatives. Dans une même étude, il sera rare que différentes espèces soient utilisées. Nous prévoyons de réaliser 3 études par an par espèce avec 18 animaux par étude.
Raffinement
Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et auront une phase d’acclimatation de 3-4 jours minimum avant d’être manipulés. Différents types d’enrichissement seront ajoutés aux animaux (coton, aspen brick (bout de bois), igloo en polycarbonate, tunnel, carré de coton…). Les procédures nécessitant une anesthésie seront réalisées avec des plaques chauffantes thermorégulées afin d'éviter une hypothermie à l'animal. Les méthodes utilisées pour récolter tout ce matériel biologique (par exemple les cages métaboliques avec une phase d’acclimatation pour réduire le stress) sont peu invasives et ne devraient pas provoquer chez l’animal un grand stress, ni de souffrance particulière et ne nécessitent donc pas l’utilisation d’antalgique. Tous les gestes techniques seront réalisés par du personnel compétent et qualifié diminuant ainsi les temps de contention et la souffrance ou le stress possible. Le personnel, sensibilisé au raffinement et à l’éthique animal, pourra modifier quelques protocoles, enrichissement des cages…. en fonction des nouvelles techniques mises au point et nouvelles obligations dans le but d’améliorer les conditions des animaux de laboratoire. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de point limite à savoir prostration, perte de poids supérieure à 20%, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure, … . Si un animal présentait un signe de douleur, de mal-être, il serait isolé dans un premier temps, hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière si besoin. Si son état ne s’améliorait pas dans les 72h, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient.
Choix des espèces
Dans notre laboratoire, nous utilisons ces 3 espèces (rat, souris et cobaye) selon les modèles et aires thérapeutiques employés. Ces trois espèces seront donc utilisées pour réaliser des études de pharmacocinétique et pharmacodynamie. Les animaux utilisés seront très dépendants des demandes de nos clients et de la thématique étudiée. Nous essayerons le plus possible d’utiliser des animaux âgés de 7 à 8 semaines afin d’avoir des animaux sexuellement matures permettant de mimer au mieux les conditions cliniques humaines. Cependant, l’utilisation d’animaux plus jeunes ou plus âgés sera possible.
Test du micronoyau sur érythrocytes de mammifères. Ligne directrice de l’OCDE n°474
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 1440
2 880 rongeurs, 1 440 souris et 1 440 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, pour un test réglementaire de génotoxicité suivant la ligne directrice OCDE n°474. Les animaux reçoivent les substances par instillation intratrachéale sous anesthésie, par inhalation "nez seul" avec contention dans des tubes jusqu'à quatre heures, ou par gavage, jusqu'à vingt-huit administrations. Le porteur indique que ces expositions peuvent induire des effets locaux et généraux "susceptibles de faire souffrir les animaux", avec des signes affectant la respiration et les muqueuses. Il justifie le recours à l'animal par les exigences réglementaires et affirme que les méthodes alternatives validées "ne permettent pas à elles seules" cette évaluation.
Objectifs
Les industriels doivent montrer qu’ils maîtrisent les risques de l’exposition aux substances chimiques qu’ils utilisent et/ou souhaitent mettre sur le marché pour répondre à des exigences réglementaires de détermination de leur toxicité et de sécurité. Les tests validés pour en caractériser les dangers suivent notamment les lignes directrices de l’Organisation de Coopération et de Développement Economiques pour les essais de produits chimiques. L’objectif de ces études est d’évaluer la capacité d'une substance chimique à altérer le génome suite à son exposition par voie orale et par inhalation chez le rongeur (rats ou souris). Les signes de toxicité, la mortalité et des analyses ex vivo après l’exposition aux substances permettront de déterminer les potentielles atteintes cellulaire induites et d’évaluer leur dangerosité.
Bénéfices attendus
Ces études renseigneront sur la capacité d'une substance chimique à altérer le génome suite à leur exposition aiguë et subaiguë pour répondre à des requis réglementaires ou des questionnements sanitaires.
Procédures
Observations cliniques (moins de 5 min/observation) : jusqu’à 3 fois par jour. Pesées (moins de 5 min/pesée) : au maximum 1 fois par jour. Administration dans la trachée (moins de 10 min/exposition) : 1 à 28 administrations (1/j) ; anesthésie, manipulations pour exposition et exposition à la solution d’essai par instillation intratrachéale. Exposition par inhalation en mode "nez seul" : 1 à 28 expositions (1/j) ; habituation à la contention imposée par le placement dans les tubes d’exposition (stabulation dans les tubes jusqu’à 30 min/j/3 jours consécutifs), exposition aux substances d’essai (4h/exposition). Gavage (moins de 3 min/administration) : 1 à 28 gavages (1/j) ; contention manuelle des animaux vigiles, gavage avec la solution d’essai. Mesure de la consommation alimentaire, exposition de plus de 7j (moins de 5 min/mesure) : 4 à 12 mesures (1 à 3 mesures/semaine/1 mois). Mesure de la température rectale, exposition de plus de 7j (moins de 5 min/mesure) : 4 mesures (1 mesure/semaine/1 mois) ; contention manuelle des animaux vigiles, manipulations pour mesure et mesure de la température rectale. Prélèvements de sang (moins de 5 min/prélèvement) : 1 à 9 prélèvements (1 à 2 prélèvements/semaine/1 mois) ; contention manuelle des animaux vigiles, manipulations pour prélèvement et prélèvement d’une goutte de sang.
Impact sur les animaux
Gavage : stress lié au gavage et à la contention manuelle nécessaire pour le réaliser ; Exposition par inhalation en mode "nez seul" : stress lié à la manipulation et à la contention du placement dans les tubes, à l'immobilisation, à l'impossibilité de se nourrir et s’abreuver, et à l'isolement ; Administration dans la trachée : stress lié à l’anesthésie ; Mesure de la température rectale : stress lié à la contention manuelle nécessaire pour la réaliser et à la manipulation ; Prélèvements de sang : stress lié à la contention manuelle nécessaire pour le réaliser. De manière générale, la manipulation des animaux pourra modifier leurs réactions à la préhension et leur niveau d’activité, et une légère perte de poids pourra être observée dans les jours qui suivront notamment les expositions aux substances d’essai. Les expositions de substances d’essai pourront également induire des effets locaux et au niveau de la totalité de l’organisme susceptibles de faire souffrir les animaux. Des signes cliniques anormaux, affectant notamment la respiration, les muqueuses et la physiologie, pourront être observés.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort aux temps de fin d’étude définis en fonction des analyses ex vivo prévues selon une méthode autorisée chez le rongeur.
Remplacement
Dans certains cas, les méthodes alternatives à l’expérimentation animale actuellement validées par la réglementation, ne permettent pas à elles seules de déterminer les capacités à altérer le génome via une exposition aiguë et subaiguë à des substances chimiques par voie orale ou par inhalation. Les études in vivo sont pour cette évaluation requises. Concernant le choix des animaux, le projet suivra les recommandations de la ligne directrice de l’Organisation de Coopération et de Développement Economiques n°474 (utilisation de rats ou de souris mâles et/ou femelles) à l’âge adulte et de souches couramment utilisées en laboratoire.
Réduction
Le nombre d’animaux qui sera utilisé suivra les recommandations de la ligne directrice de l’Organisation de Coopération et de Développement Economiques n°474. Une analyse des données bibliographiques disponibles sur la substance d’essai et ses analogues sera réalisée préalablement aux expérimentations pour déterminer la stratégie de test et la dose initiale à tester parmi des niveaux prédéfinis par les lignes directrices de l’Organisation de Coopération et de Développement Economiques. Elle sera choisie comme étant la dose la plus proche de celle qui devrait a priori permettre de déterminer la dose maximum tolérée (choix justifié par des données toxicologiques sur la substance) ou la plus pertinente pour limiter le nombre d’animaux utilisés (dose intermédiaire définie par les ligne directrice de l’Organisation de Coopération et de Développement Economiques n°474 en l’absence d’informations). Pour l’étude de recherche de la dose maximum tolérée et l’étude de confirmation, le taux de mortalité, le nombre d’animaux moribonds et l’occurrence de signes de toxicité détermineront la poursuite des études. Pour ces deux études, seule une analyse descriptive des données sera réalisée. Pour l’essai définitif et l’essai limite, des tests appropriés au traitement de chaque type de données et à leur distribution seront utilisés pour les comparer et ainsi évaluer les effets de l’exposition aux substances d’essai. De plus, plusieurs paramètres seront évalués sur un même animal, permettant ainsi de minimiser le nombre de rats utilisés.
Raffinement
Les conditions d’hébergement seront adaptées aux rongeurs (rats ou souris) et enrichies pour favoriser leur bien-être. Ils seront hébergés à plusieurs par sexe et par groupe expérimental pour leur socialisation. Un fond sonore sera diffusé la journée pour leur permettre de s’habituer au bruit généré par les manipulations et ainsi limiter le stress pouvant être ressenti durant les expérimentations. Du matériau leur permettant de nidifier et du matériau en bois à ronger seront disposés dans leurs cages d’hébergement pour favoriser leur développement cognitif. Pour les animaux exposés par inhalation « nez seul », des tubes semblables à ceux utilisés pour l’exposition seront disposés dans leurs cages d’hébergement pour leur permettre de se familiariser avec ces objets et de se cacher. Préalablement à la 1ère exposition, ces animaux seront habitués à la contention imposée par le placement dans les tubes en y étant stabulés jusqu’à 30 min par jour durant 3 jours consécutifs. Les tubes seront tapissés de matériaux absorbants pour assurer le confort des animaux. Après chaque phase d’habituation, de la nourriture sera déposée dans leurs cages d’hébergement en guise de récompense. Des critères de raffinement des gestes techniques qui seront pratiqués (manipulation précautionneuse, surveillance continue, posologie adaptée, etc.), des points limites relatifs à l’apparition de signes de douleur (perte de poids, lésion, comportement anormal, etc.) et des actions correctives visant à soulager les animaux (surveillance accrue, soins, etc.) ont été définis en adéquation avec les paramètres étudiés pour assurer leur bien-être.
Choix des espèces
Ces expérimentations seront réalisées chez le rongeur car sa physiologie est largement connue et car il constitue un modèle de prédiction des effets toxicologiques reconnu par la réglementation (cf. Document d'orientation de l’Organisation de Coopération et de Développement Economiques n°39). Ce projet suivra les recommandations de la ligne directrice de l’Organisation de Coopération et de Développement Economiques n°474, d’utilisation d’espèces chez lesquels il est établit que l’élimination par la rate des cellules micronuclées ne compromet pas la détection des entités nucléaires anormalement formées dans une cellule vivante. Cela ayant été démontré chez le rat et la souris, ces modèles animaux sont pertinents pour réaliser ces études. Des souches communément utilisées en laboratoire seront utilisées.
Biodisponibilité polyphénolique après gavage chez la rate gestante ou allaitante
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
72 rates gestantes ou allaitantes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un cocktail de polyphénols par gavage puis subissent quatre prélèvements de lait sous anesthésie, afin de mesurer le passage des composés dans le sang, le cerveau, le foie et les urines. L'objectif, présenté comme une étape vers un complément alimentaire destiné à la femme enceinte, prolonge des travaux antérieurs sur la neuroprotection de ratons soumis à une hypoxie-ischémie. Le porteur affirme que l'évaluation du métabolisme "nécessite une approche intégrative" sans remplacement disponible.
Objectifs
Les précédents travaux de l'équipe ont montré un rôle neuroprotecteur d'une supplémentation maternelle en polyphénols, dans le cadre de l'hypoxie-ischémie néonatale. L'administration orale de polyphénols chez des femelles Wistar gestantes ou allaitantes a induit une neuroprotection des ratons ayant subi une hypoxie-ischémie néonatale (modèle Rice-Vannucci). L'effet préventif des polyphénols s'est illustré par (i) une diminution des volumes lésionnels cérébraux, mesurée par IRM ainsi que par une préservation des aptitudes sensori-motrices des ratons mise en évidence par des tests comportementaux. Les doses utilisées étaient nutritionnelles, rendant impossible le suivi des polyphénols chez les mères de même que chez les ratons (doses inférieures au seuil de détectabilité). Afin d'attribuer les effets bénéfiques à un composé phénolique ou à un de ses métabolites et d'évaluer la capacité des polyphénols/métabolites à franchir les différentes barrières biologiques (placenta, barrière hémato-encéphalique), l'objectif du projet sera de mesurer dans différents tissus (urines, sang, cerveau, foie), les concentrations de polyphénols ainsi que de leurs métabolites, chez les mères ainsi que chez les ratons.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont une compréhension de la biodisponibilité et du métabolisme d'un cocktail naturel de polyphénols (extraits à partir du fruit de la passion), tant chez la rate gestante allaitante que chez les ratons (fœtus et nouveau-nés). Cela pourrait faire la lumière sur les effets bioactifs de ces molécules, ainsi que sur certains mécanismes d’action potentiels. Ce travail pourra participer à la mise sur le marché d'un complément alimentaire à destination de la femme enceinte.
Procédures
Les animaux seront soumis à : - un gavage. Fréquence : 1 fois. Durée : quelques secondes – prélèvements de lait. Fréquence : 4 fois. Durée : 10 min. - prélèvement d'organes après mise à mort. Fréquence : 1 fois.
Impact sur les animaux
Le gavage nécessaire à l'administration du cocktail polyphénolique pourra entraîner un stress des femelles. Les prélèvements de lait pourraient entraîner un inconfort et un stress. Ces prélèvements seront réalisés sur des animaux anesthésiés. L'anesthésie pourrait entraîner un changement du rythme cardiaque et/ou respiratoire, mesurés grâce à un capteur placé sous l'animal.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin d'effectuer les prélèvements d'organes nécessaires aux dosages permettant de quantifier les polyphénols ainsi que leurs métabolites.
Remplacement
Le but final du projet est d'évaluer la biodisponibilité d'un cocktail polyphénolique ayant montré, in vivo, une neuroprotection d'une supplémentation maternelle dans le cadre d'une hypoxie-ischémie néonatale. L'évaluation du devenir du cocktail et de son métabolisme nécessite une approche intégrative, il n'existe pas de remplacement disponible à notre modèle expérimental.
Réduction
Les dosages polyphénoliques seront réalisés sur un nombre minimum d'animaux permettant de réduire les erreurs standard à la moyenne intergroupe sous les 5%..
Raffinement
Pour le gavage, les rates seront conditionnées à la contention un à deux jours avant la procédure. Le gavage est une procédure délicate, il sera réalisé par un expérimentateur expérimenté. Une canule à bout rond en plastique à usage unique sera utilisée afin de limiter les risques de blessure pour l'animal (perforation du tube digestif). Le volume administré, à température ambiante sera inférieur à 10 ml/kg. En l'absence de détresse respiratoire et de reflux, l'animal sera remis à sa cage. Dans l'heure qui suit, les signes cliniques de l’animal suite à l’exécution d’un gavage seront surveillés (détresse respiratoire, muqueuse pâle, isolement). Au niveau de l'hébergement, les animaux seront en cage (mère + portée), sur une litière de peuplier, caractérisée par un fort pouvoir absorbant et une granulométrie adaptée. L'hébergement sera enrichi avec un nid végétal, du coton et un tunnel en carton. Les animaux seront observés de façon journalière par le zootechnicien et/ou la personne en charge de l'expérimentation. Lors de ces observations, la capacité de l'animal à s'alimenter, le comportement et sa vivacité, la couleur de la peau ou l'état du pelage seront vérifiés. Un échange quotidien avec le zootechnicien et l'expérimentateur permettra une intervention et une prise de décision rapide en cas de souffrance constatée.
Choix des espèces
Le rat présente des avantages par rapport à la souris qui rendent le choix de l'espèce pertinent : la physiologie du rat est plus proche de celle de l'homme que ne l'est la physiologie de la souris. Ce point est important puisque ce projet devrait, en partie, mener au développement d'un complément alimentaire destiné à la femme enceinte. Les animaux seront utilisés aux stades de développement : - adulte, afin de définir la biodisponibilité chez les femelles gestantes ou allaitantes - fœtal, afin de définir la biodisponibilité chez les fœtus ainsi que la capacité des polyphénols et métabolites à traverser la barrière placentaire - nouveau-né, âgés de 8 jours, afin de définir la biodisponibilité chez les nouveau-nés et de déterminer la part de l'allaitement dans la neuroprotection.
Etude du rôle des récepteurs nicotiniques dans un ensemble de processus cognitifs altérés au cours de plusieurs pathologies neuropsychiatriques et identifications des circuits neuronaux mis en jeu
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
1866 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger et modéré. Ils subissent pendant des mois des tests comportementaux quotidiens, une restriction alimentaire, des tests d'anxiété et de locomotion, une chirurgie intracérébrale et des séances de contention forcée, pour étudier le rôle de récepteurs nicotiniques dans des troubles neuropsychiatriques. Le porteur qualifie les dommages de minimes en indiquant que les modèles employés n'induisent pas d'altération majeure de la santé. Il affirme que ces fonctions cognitives et émotionnelles ne peuvent s'étudier que sur des animaux au système nerveux entier et fonctionnel.
Objectifs
Un rôle important de certains récepteurs cellulaires a été mis en évidence par de nombreuses études dans un ensemble de pathologies neurologiques, neurodéveloppementales et psychiatriques, notamment dans les troubles cognitifs associés. L’objectif global du projet est de préciser ce rôle et d’identifier ses mécanismes sous-jacents qui ne sont pas encore élucidés, dans l’espoir d’ouvrir de nouvelles voies de recherche thérapeutique. Plus précisément les objectifs sont i) de mieux caractériser le rôle de deux sous-unités majeures d’un récepteur dans les processus cognitifs altérés au cours de différentes pathologies neuropsychiatriques, ii) de tester l’impact de molécules pharmacologiques agissant sur ces récepteurs sur certains de ces processus, et iii) d’identifier les circuits cérébraux impliqués dans leurs mécanismes d’action, en utilisant des modèles précliniques présentant une forte valeur translationnelle.
Bénéfices attendus
Les pathologies neurodégénératives, neurodéveloppementales et psychiatriques représentent l’un des enjeux majeurs de santé publique, et leur prévalence s’accroit. Il n’existe à ce jour pratiquement aucun traitement efficace pour soigner ces pathologies, notamment les troubles cognitifs qui leur sont associés. A court terme, ce projet devrait permettre une meilleure compréhension des rôles de certains récepteurs aux neurotransmetteurs, exprimés dans différentes régions du cerveau, dans les fonctions cognitives impactées au cours de ces pathologies. De plus, ce projet devrait permettre d’identifier une étiologie commune potentielle à différents troubles neuropsychiatriques, grâce à des approches précliniques impossibles à mettre en œuvre en recherche clinique. Grâce à l’implémentation de tests précliniques à forte valeur translationnelle, ce projet pourra ouvrir à plus long terme de nouvelles stratégies thérapeutiques basées sur des composés ciblant certains sous-types de récepteurs nicotiniques, tels que des modulateurs allostériques de ces récepteurs qui sont actuellement en voie de développement. Ce projet générera également des bases solides pour de futures études cliniques avec nos collaborateurs proches qui ont accès à des cohortes de patients.
Procédures
Les animaux seront soumis à des tests comportementaux quotidiens d’1h maximum par jour, pendant des mois, élaborés pour générer le moins de stress possible aux animaux. Ils seront également soumis, seulement une fois et pour 30 minutes maximum, à des tests d’anxiété et de locomotion, susceptibles d’entraîner un stress passager. Les animaux ne seront pas soumis à plus d’un test de comportement par jour. Les animaux seront soumis à une très légère restriction de nourriture pendant toute la durée de l’expérience mais ils auront accès à une récompense sucrée presque chaque jour, et l’eau sera laissée à volonté. En outre, certains animaux seront soumis à une seule procédure chirurgicale au cours de laquelle une infusion ou implantation intracérébrale sera réalisée. La chirurgie dure environ 30 minutes puis l’animal aura une semaine minimum pour récupérer. Certains animaux recevront des injections intrapéritonéales, ou infusions intracérébrales (qui dureront 3 minutes tout compris et auxquelles ils auront été progressivement habitués), de composés pharmacologiques, répétées maximum 9 fois par animal, avec au moins 3 jours d’écart entre chaque injection ou infusion. Enfin, certains animaux seront exposés à un stress de contention pendant 30 minutes pour un maximum de trois fois par animal avec une semaine d’écart entre chaque exposition.
Impact sur les animaux
Les dommages escomptés pour les animaux sont minimes car nous mettrons tout en œuvre pour supprimer douleur et souffrance qui pourraient être induites par les différentes procédures, d’autant plus que les animaux doivent être en bonne santé pour être soumis aux différents tests cognitifs. Les différents modèles et protocoles qui seront employés pour induire l’expression ectopique de gènes d’intérêt ou des symptômes de type neuropsychiatriques ont déjà été testés et validés, et n’ont pas été associés à des altérations majeures de la santé physique ou émotionnelle des animaux. Ils ont été choisis sur cette base. On peut s’attendre cependant à voir l’apparition d’états d’inconfort, de douleur ou de stress passagers chez certains animaux soumis à une privation alimentaire légère, à un stress induit volontairement sur un temps court, ou à une chirurgie.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure car les cerveaux seront prélevés pour des expériences ex vivo
Remplacement
Pour identifier les mécanismes cérébraux mis en jeu et les effets de composés thérapeutiques sur les processus cognitifs associés à des pathologies neuropsychiatriques, il est essentiel de faire des mesures sur des modèles animaux ayant un système nerveux entier et fonctionnel, et d’étudier les comportements et les états émotionnels associés au fonctionnement exécutif au plus près de la façon dont ils se manifestent chez l’homme. Ceci ne peut, par essence, être réalisé autrement que sur des animaux vivants, ayant une connectivité physiologique intègre entre les différentes régions du cerveau et un degré de développement de leurs fonctions émotionnelles et cognitives suffisant pour en faire des modèles d’étude pertinents
Réduction
La méthodologie statistique a été discutée en amont de la soumission de ce projet avec un biostatisticien. Dans nos études, la variabilité inter-individuelle est élevée. Il est donc nécessaire de tester au moins 15 animaux, respectivement, par groupe expérimental, sexe et conditions pour obtenir des résultats statistiquement robustes. Un groupe contrôle adapté d’animaux sera systématiquement prévu pour chaque jeu d’expériences et sera spécifique de chaque condition expérimentale testée. Le nombre d’animaux par groupe se base d’une part sur notre expérience solide des procédures et des modèles et souches d’animaux qui seront utilisés dans ce projet, et d’autre part sur la littérature, très abondante sur le sujet et dans laquelle les mêmes souches de rats sont couramment utilisées. Notre expérience en chirurgie intracérébrale, études comportementales et marquages cellulaires nous a déjà permis de réduire cette variabilité et de mieux la prendre en compte pour l’expliquer. Les paramètres mesurés seront ensuite comparés entre groupes, sexes et conditions pour comparer les groupes. Les animaux ne pourront pas être réutilisés car leurs cerveaux seront systématiquement prélevés à l’issue des expériences pour effectuer des vérifications et mesures de marqueurs neurophysiologiques. Sur cette base, nous nous efforcerons de réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés en ajustant au mieux les protocoles expérimentaux et les analyses statistiques pour obtenir des résultats statistiques robustes tout en tenant compte de la variabilité inter-individuelle des animaux testés.
Raffinement
Avant chaque expérience nous passerons plusieurs jours à manipuler les animaux afin de les habituer à l’expérimentateur et à la manipulation. Il y aura, sauf circonstance imprévue, seulement un expérimentateur par groupe expérimental. Pendant toutes les expériences de comportement les animaux seront manipulés très régulièrement (presque tous les jours), ce qui les rend très peu réactifs émotionnellement à la manipulation, et ce qui permet de détecter le moindre changement d’attitude ou l’apparition de signes externes inquiétants. Pour les autres expériences, ils seront laissés tranquille dans leurs cages au maximum et surveillés plusieurs fois par semaine. Nous enrichirons le milieu avec des blocs de bois, et des tunnels en carton si un animal doit être isolé, et nous nous rapprocherons du comité responsable du bien-être animal pour redéfinir les conditions optimales d’enrichissement si besoin. Concernant les chirurgies, des antidouleurs seront appliqués au moins 30 min avant la chirurgie. L’état général et les signes de douleur des animaux seront évalués régulièrement, selon la grille d’évaluation de la douleur, du stress et de l’inconfort du comité responsable du bien-être animal. Au moins une fois par jour les animaux sont examinés pour des signes de détresse (changements de posture, yeux plissés, manque de toilettage) et l’incision est examinée pour signes d’infection. Si nécessaire, des doses supplémentaires d’analgésique seront données. Si au bout de 24h le traitement s’avère inefficace et les points limites atteints les animaux seront mis à mort. Pour l’ensemble du projet une pesée quotidienne et l’utilisation des traitements décrits ci-dessus seront appliqués en cas de dégradation de l’état de l’animal avant atteinte des points limites. Des points limites sont identifiés et leur atteinte conduira à la mise à mort de l’animal. Ces points correspondent à : une prostration, dos courbé et expression faciale très altérée, ou dénutrition majeure, ou perte de poids supérieure à 20%, et, pour les chirurgies, signes de douleur malgré l’analgésie, poils hérissés, animal prostré, hypothermie.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les meilleurs modèles, jusqu’à présent, sur lesquels on peut étudier les comportements liés à la psychiatrie, dont l’élevage et le maintien en bonnes conditions reste pratique à réaliser en laboratoire, et dont on sait également manipuler le génome (pour étudier notamment le rôle des sous-unités nicotiniques dans le cadre ce projet). Le rat est, en outre, un modèle particulièrement intéressant lorsqu'on souhaite étudier des fonctions cognitives complexes et particulièrement pour des tests cognitifs basés sur la technologie dite ‘touchscreen’ et l'auto-administration de drogue sur une longue période qui présentent une forte valeur translationnelle. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte pour la grande majorité (à partir de 8 semaines), afin que le développement de leur cerveau soit suffisamment mâture pour la réussite et la reproductibilité des interventions, et l’homogénéité de leur comportement. Un groupe d’animaux sera utilisé ponctuellement dès une semaine après la naissance pour recevoir des injections d’un composé pharmacologique dans le but de modeler le développement du cerveau (une injection aux jours 7, 9 et 11), puis laissés sans manipulation jusqu’à l’âge adulte. Un groupe d’animaux sera exposé in utero à un composé pharmacologique dans le but de modeler le développement du cerveau à travers une injection réalisée chez la mère vers le milieu de la gestation.
Etude, en fonction du sexe, des effets d’une inflammation excessive sur la contraction et la consommation d’oxygène musculaires de rat
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
60 rats vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque rat subit une chirurgie de dix minutes pour déclencher un sepsis, puis est tué pour prélever ses tissus, l'étude visant à comparer la réponse des mâles et des femelles. Le porteur situe les bénéfices à long terme, pour l'amélioration de l'état des patients en réanimation. Il affirme que le sepsis met en jeu des régulations globales qui ne peuvent être étudiées ni sur cellules ni sur organes isolés.
Objectifs
Le sepsis est un syndrome d’inflammation généralisée grave secondaire à une infection. Son incidence le classe en première position dans les causes de mortalité survenant dans les unités de soins hospitaliers. Il est en effet caractérisé par une réaction inflammatoire disproportionnée amenant à une dégradation structurale et fonctionnelle de plusieurs organes pouvant amener à la mort. Cette réponse inflammatoire systémique est également source de stress oxydant. Selon le sexe, il s’avère que la réponse au sepsis est différente. Cette étude a pour objectifs : 1) de comprendre la différence mâle et femelle sur un modèle de rat septique 2) contribuer à l’amélioration de l’état des patients hommes et femmes atteints de sepsis.
Bénéfices attendus
Les bénéfices du projet à long terme permettront de comprendre la différence de réponse entre les femmes et les hommes face au sepsis et ainsi de contribuer à l’amélioration de l’état des patients atteints de sepsis, état pathologique qui représente la première cause de mortalité dans les unités de réanimation médicale et de soins hospitaliers.
Procédures
L'animal sera contentionné pour induire l’anesthésie générale par injection (10 secondes pour une injection). Puis, l'animal aura une chirurgie d'une durée de 10 min maximum pour déclencher le sepsis. Pour le maintien de l’anesthésie/analgésie, au maximum 5 injections seront réalisées.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sont un stress de courte durée (1 minute) engendré par la contention de l'animal pour induire l’anesthésie générale par injection d’un mélange anesthésique/analgésique (10 secondes pour une injection, douleur légère). Pour le maintien de l’anesthésie, 5 injections (au maximum, 5 fois 10 secondes, douleur légère) d’un mélange anesthésique/analgésique (toutes les heures environ) seront réalisées. Les animaux auront 6 injections d'anesthésique/analgésique au maximum. Parmi les nuisances peu susceptibles d'arriver mais qui doivent être envisagées, on peut noter l'hémorragie, l'hyperventilation anormale ou la détresse respiratoire.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de réaliser les prélèvements tissulaires.
Remplacement
Il s’agit d’une étude sur les effets physiologiques au niveau de l’organisme pour laquelle le remplacement n’est pas possible.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés par groupe est limité au minimum permettant une étude statistique pour comparer les différences mâles /femelles.
Raffinement
Le raffinement est mis en place dans la pratique de l’antalgie et de l’anesthésie. Afin de prévenir tout risque de douleur, une injection analgésique par voie sous cutanée est réalisée 30 min avant l'anesthésie. Puis, l’animal est installé sur un tapis chauffant permettant le maintien de sa température corporelle à 37°C grâce à un monitoring par sonde rectale. Au cours de la procédure, le concepteur évalue la profondeur de l’anesthésie en pinçant les pattes arrières et réinjecte toutes les heures une dose d'analgésique/anesthésique. Une fiche de suivi de l’anesthésie a été mise en place.
Choix des espèces
Le sepsis est une pathologie complexe mettant en jeu des régulations physiologiques globales qui ne peuvent être uniquement étudiées sur des organes isolés ou a fortiori sur des cellules. De plus, les mécanismes physiologiques du sepsis chez le rat sont très proches de ce qui se déroule chez l’Homme. Les expérimentations seront menées sur le rat, qui représente pour ce type d’étude l’espèce de référence dans la littérature. De plus, cela permettra la comparaison avec des résultats déjà obtenus au laboratoire. La procédure sera réalisée sur des rats âgés de 8 semaines pour obtenir des résultats sur des animaux adultes mais pas trop âgés. Nos précédents résultats sont également basés sur cet âge, ce qui nous permettra de réaliser des comparaisons avec la littérature et nos précédents résultats.
Etude de la toxicité neurorespiratoire d’un traitement antalgique seul ou en association chez le rat.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
- Système respiratoire
168 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré et sévère. Ils subissent une chirurgie d'implantation d'une sonde de télémétrie, des gavages et des injections, une partie recevant de la morphine pendant neuf jours, pour étudier la toxicité respiratoire de la gabapentine seule ou associée à des dépresseurs du système nerveux. Le porteur indique que ces molécules peuvent provoquer une sédation allant jusqu'au coma, une hypothermie et une dépression respiratoire. Il justifie l'étude par l'usage détourné croissant de la gabapentine et affirme que la fonction respiratoire intégrée ne peut être évaluée in vitro.
Objectifs
Notre objectif global est de mieux comprendre les besoins non satisfaits des personnes atteintes de cancer et souffrant de douleurs chroniques neuropathiques, ainsi que les mécanismes de toxicité liés à la surconsommation ou à l’association des traitements habituellement utilisés (dont les gabapentinoïdes). Du fait de l’augmentation du taux de prescription de la gabapentine, notamment pour les douleurs neuropathiques, et de son usage illicite dans le monde et surtout aux Etats-Unis, ainsi que la tendance émergente de son association aux dépresseurs du système nerveux central, les inquiétudes sont de plus en plus grandes vis-à-vis de sa toxicité et de ses mécanismes. Même à doses thérapeutiques, les effets respiratoires de ces composés associés représentent un risque important pour les utilisateurs pouvant même aller jusqu’à engager leur pronostic vital. Les objectifs de notre étude sont ainsi de caractériser par une approche préclinique chez le rat, les effets neuro-respiratoires induits par l’administration de gabapentine seule, ou en association avec les dépresseurs du système nerveux central selon une approche pharmacocinétique/pharmacodynamique. Et dans un second temps, d’évaluer le potentiel de la gabapentine vis-à-vis d’une levée de la tolérance respiratoire suite à une administration prolongée d’opioïdes. La tolérance respiratoire est un processus d’adaptation de l’organisme caractérisé par une diminution des effets respiratoires produits par la même dose d’opioïde après un usage prolongé. La levée de tolérance respiratoire induit par la gabapentine pourrait donc expliquer la toxicité de ce traitement.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet permettront de caractériser les mécanismes de toxicité et les effets neuro-respiratoires induits par l’administration de la gabapentine seule ou en association avec d’autres dépresseurs du système nerveux central, et ainsi de mieux comprendre les mécanismes pharmacocinétiques et pharmacodynamiques des interactions entre les gabapentinoïdes et les psychotropes étudiés que l’on retrouvent de plus en plus fréquemment dans les intoxications, en particulier chez les patients souffrants de douleurs chroniques neuropathiques et plus à risque de surconsommation médicamenteuse, et ainsi alerter, prévenir et proposer des stratégies de prise en charge de ces effets toxiques ayant des conséquences potentiellement fatales.
Procédures
Pour les animaux inclus dans l'une des 4 procédures: Injections intrapéritonéales pour l'anesthésie (2 injections de chacune 5-10 secondes) + chirurgie (20 à 30 mins) + administration par gavage de molécule (1 gavage; 30 secondes – 1 minute) et 1 injection sous-cutanée de substances (1 injection : 5 -10 secondes). De plus, pour les animaux de la procédure 2 : prélèvements de sang (23 prélèvements ; 1 prélèvement durant 30 secondes). Les animaux de la procédure 4 seront soumis en plus à : Injections intrapéritonéales de morphine (2 injections/jour pour 9 jours, soit 18 injections durant chacune entre 5-10 secondes)
Impact sur les animaux
On s’attend à la suite de l’administration des différentes molécules à des effets indésirables pouvant aller d’une légère sédation jusqu’à un coma, une hypothermie et une dépression respiratoire. Les injections et les prélèvements sanguins induisent une douleur légère. Un stress lié au gavage avec risque de fausse route, quoi que rare, est à prendre en compte. De plus, suite à la chirurgie permettant l’implantation la sonde de télémétrie pour la procédure d’électromyographie, les rats seront hébergés en cage individuelle jusqu’à récupération post-chirurgicale complète pouvant être à l’origine d’un certain stress.
Devenir
La réutilisation des animaux est impossible en raison de la récupération post-mortem de l'appareillage de télémétrie ou de l'atteinte d'un point limite requérant la mise à mort des animaux.
Remplacement
L’ensemble des procédures ne sont pas remplaçables par des expériences in silico ou in vitro, en raison d’une approche physiopathologique de la fonction respiratoire intégrée sur animal entier ainsi que de la pharmacocinétique dont les différentes phases ne peuvent être évaluées dans leur intégralité que par l’utilisation d’animaux.
Réduction
La taille des groupes expérimentaux (6 animaux/groupe) a été prédéterminés à l’aide de tests de puissance afin de permettre l’analyse des résultats entre les différents groupes expérimentaux en utilisant un test non paramétriques pour s’assurer de leur validité et l’atteinte du seuil de significativité fixé à 5%. De plus, à l’aide d’une technique de dosage sur microprélèvements, les prélèvements sanguins pour la mesure des gaz du sang artériel et la pharmacocinétique s’effectueront sur le même animal. Enfin, en cas de l’absence d’effets ventilatoires significatifs suite à l’administration concomitante de certains traitements en pléthysmographie corps-entier, ces associations médicamenteuses ne seront pas étudiées en gaz du sang, ni en électromyographie, dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Pour améliorer leur bien-être, les animaux sont hébergés en groupes sociaux dans des cages contenant des bâtonnets et des bandelettes de papier kraft à titre d’enrichissement. La surveillance quotidienne des animaux sera assurée par un personnel qualifié, et des points limites spécifiques adaptés aux différentes procédures seront mis en place pour détecter et réduire toute souffrance ou douleur. Si nécessaire, des analgésiques seront administrés, tout en veillant à ne pas perturber le déroulement de l'expérience. En cas de besoin, des procédures réglementaires de mise à mort anticipée seront appliquées. Toutes les interventions chirurgicales prévues dans ce projet seront réalisées sous anesthésie générale et accompagnées d'une gestion adéquate de la douleur pendant la période péri-opératoire. De plus, une ouate en silicone sera utilisée après la chirurgie pour favoriser une meilleure cicatrisation et une prise en charge plus rapide en cas de saignement. Enfin, l’étude pharmacocinétique sera réalisée à l’aide de microprélèvements dans le but de réduire au maximum le volume sanguin à prélever.
Choix des espèces
Le rongeur, et plus spécifiquement le rat, est le modèle de référence dans le domaine de la toxicité respiratoire, notamment du fait de sa physiologie respiratoire qui est très proche de la physiologie humaine. De plus, son métabolisme est très semblable à celui de l’Homme, ce qui facilitera les études pharmacocinétiques. Des rats âgés de 6 à 9 semaines seront utilisés dans le but de pouvoir faire l’analogie avec les expériences déjà faites au sein du laboratoire et les articles publiés dans la littérature, la population jeune étant la plus affectée par les problèmes de mésusage de substances.
Efficacités de produits rodenticides à action anticoagulante dans le cadre d’autorisations de mise sur le marché
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 200
200 souris et 200 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils sont isolés quatre jours puis reçoivent un appât anticoagulant, avant une surveillance quotidienne sur 28 jours et une mise à mort dès les premiers signes d'empoisonnement. Le porteur décrit des hémorragies, un état de faiblesse et une anémie conduisant à la mort, et empoisonne ainsi des rongeurs pour homologuer des produits destinés à tuer des rongeurs. Il affirme qu'aucun remplacement n'est possible, la réglementation imposant de tester l'appétence et la mortalité sur les espèces cibles.
Objectifs
La lutte contre les rongeurs est un enjeu de santé publique et un enjeu économique majeur pour l’industrie agro-alimentaire. En plus des mesures classiques d’hygiène et de conception des bâtiments, la politique de lutte contre les rongeurs fait appel à des appâts anticoagulants. Ces appâts sont consommés par les rongeurs et ils ont un effet biocide. L’utilisation de ces biocides est considérée comme étant la méthode chimique létale la plus efficace. Tous les anticoagulants ont le même mécanisme d’action, ils inhibent les facteurs de la coagulation sanguine, dits « vitamine K1 dépendants », conduisant à un trouble de la coagulation. Ce trouble de la coagulation engendre de la mortalité dans la population de rongeurs diminuant ainsi les problèmatiques liées à une surpopulation. La toxicité de ces anticoagulants est connue et souvent déjà bien évaluée in vitro et in vivo. Cependant, la réglementation exige de nouveaux tests in vivo si la composition d’un traitement évolue (e.g. : concentration, appétence augmenté, passage d'une formulation liquide à une formulation solide). En effet, le changement de composition peut entrainer une modification du comportement des rongeurs face à l’appât. Selon la réglementation, ces produits modifiés doivent être obligatoirement testés conformément à des recommandations précises avant de pouvoir être mis sur le marché. L’entreprise à l’origine de cette DAP est prestataire pour d’autres entreprises. Ces entreprises lui délèguent les tests nécessaires à l’homologation de leurs produits anticoagulants rodenticides ou le cas échéant la ré-homologation imposée par la législation après 5 ans d'utilisation commerciale. Les procédures réalisées dans ce projet permettent de tester l’appétence et l’efficacité d’un rodenticide sur rat et/ou souris (mesure de la consommation et de ses effets). Les résultats de ces procédures permettrons de jugué quant à l'homologation du produit ou non. Cette demande d’autorisation de projet, encadre différents produits et formulations de produits provenant de différents délégataires. Les principes actifs de ces produits sont tous des anticoagulants perturbant le métabolisme de la vitamine K. Les résultats des procédures alimentent un dossier réglementaire très strict permettant de réaliser des demandes d’autorisation de mise sur le marché. Ces autorisations sont obligatoires et positivement bien encadrées.
Bénéfices attendus
La gestion problématique des déchets de consommations et des poubelles a intensifié un fait ayant toujours existé, la présence de rats et de souris en contact direct avec l’être humain. Comme pour beaucoup d’espèces vivantes, une prolifération intense engendre des conséquences négatives. Dans notre cas, la prolifération de rats et de souris peut avoir des conséquences sanitaires (droit de retrait pour le rammassage des containers poubelle, leptospirose, transmission de diverses bactéries et helminthes), cela peut entrainer des dégâts sur les ressources alimentaires (10% à 15% des pertes mondiales :consommés/contaminés/jetés) et les rongeurs sont à l'origine de dégâts matériels conséquent (en France : coût annuel des dégâts = environ 38 millions d'euros, galeries, accès aux bâtiment, sites de passage souillés, câbles rongés, accidents liés au dysfonctionnement). De plus les proliférations de rongeurs ont un impact très négatif sur l'image des sites infestés et une répercution économique et sociale importante sur ces sites (fermetures d'écoles, industrie agroalimentaire fermé par le autorités sanitaires, restaurant, boulangeries). Quant aux particuliers concernés par ces infestations la répercussion psychologique n'est pas négligeable. Le développement de produits rodenticides plus performants est un élément important de la lutte contre la prolifération des rongeurs. L'utilisation d'anticoagulants est le moyen chimique le plus efficace pour diminuer la pression parasitaire. Ces anticoagulant doivent être homologués, aussi la réalisation de tests réglementaires est indispensable à la mise sur le marché de ces produits. De plus, les rodonticides ne présentant pas les résultats attendus par la réglementation ne seront pas autorisés. Donc ce projet permet d’empêcher la mise sur le marché de produits inefficaces. Or l'utilisation de produits inefficaces peut être à l’origine de résistances pour la cible (rongeurs) mais demeurer mortel pour des espèces non-ciblées (eg.chien). Aussi Il est très important de tester ces produits afin d'écarter les produits inefficaces. En résumé, il y a des avantages économique, écologique, sociale et sanitaire à la mise sur le marché de produits efficaces, or cette mise sur le marché nécessite la réalisation des tests décrits dans ce projet comme préconisé par la loi et la réglementation.
Procédures
Les animaux seront maintenus en cage individuelle (isolement) durant 4 jours. Les cages des animaux isolés sont à proximité de cages contenant des congénères afin de conserver un contact visuel, sonore et olfactif. Les cages individuelles contiennent un enrichissement supplémentaire (abris et du coton). Durant 4 jours, un produit anticoagulant est proposé à la consommation en libre choix en regard d’une alimentation habituelle. Quotidiennement durant 28 jours, les animaux sont sortis de leur cages et doucement manipuler durant moins de 10 minutes afin d’observer leur orifices (nez, yeux, bouche oreille, anus appareil génital) et d’être pesé. Lorsque les animaux présentent les signes cliniques d’une intoxication aux anticoagulants, alors afin de limiter la souffrance des animaux, ils sont mis à mort.
Impact sur les animaux
Au regard de leur nature sociale, l’isolement des individus (rats et souris) durant 4 jours est une source de mal-être chez le rat et la souris. C'est à pondéré avec un maintien des individus à proximité d’autres cages afin de maintenir un contact visuel, auditif et olfactif avec leurs congénères. Nous n'attendrons pas d'observer d'intoxications graves dues aux anticoagulants. En effet ceux-ci entrainent des hémorragies, occasionnant différents maux et troubles significativement négatifs : hémorragies interne et externe entrainant un état de faiblesse et d'apathie, sans douleurs mais susceptible de provoquer un mal-être et dont l'issue est une anémie aigüe entrainant la mort. Aussi, il est inconcevable d'attendre la mort par intoxication aux anticoagulants. Aussi, une observation régulière des animaux permettra de déceler les animaux commençant à présenter des signes négatifs d’intoxication (prostration, pelage, léthargie, décoloration des extrémités ou saignements); ces points limites permettront d’effectuer une mise à mort très en amont de la mort liée à l’anticoagulant. La sortie, l'auscultation et la pesé régulière des animaux peut être une source d'angoisse surtout si cela se cumule avec un mal-être/souffrance existante aussi une période d'habituation permettra de diminuer les contraintes liées à ces manipulations.
Devenir
Attendre une intoxication létale aux anticoagulants est inenvisageable. Sont mis à mort les animaux montrant des signes précoces d’un empoisonnement aux anticoagulants. La mise à mort permet d’éviter des souffrances inutiles à l’animal. Si l'animal ne présente pas de signes cliniques permettant de juguer quant à son empoisonnement, il est néanmoins victime d'une fragilité au niveau de la coagulation pouvant perdurer plusieurs mois. Cette fragilité de coagulation pourrait se révéler cliniquement en dehors du temps d'observation prévu par la procédure et engendrer des souffrances importantes si une mise à mort n'est pas réalisée à temps. Ce risque de fragilité de coagulation est trop important pour envisager une réutilisation des animaux. Aussi, les animaux ayant reçu l’anticoagulant sont euthanasiés à la fin des procédures.
Remplacement
Il n'y a pas de stratégie de remplacement possible. En effet, la réglementation impose de tester l'attractivité alimentaire du traitement (consommation) et les effets du traitement (mortalité). Ces critères ne peuvent être observés que sur animaux vivants, le comportement de consommation en particulier ne peut être simulé. De plus, la réglementation impose que ces produits soient testés sur les espèces cibles, c’est à dire rats et souris. il y a donc une obligation réglementaire empêchant ce remplacement par d'autre espèces animales.
Réduction
Dans le cadre d’une Autorisation de mise sur le marché (AMM) d’un produit produit biocide de type anticoagulant, les essais règlementaires soumis au législateur doivent être mis en place selon des recommandations strictes. Pour chaque formulation à l’étude, il est recommandé de tester à minima 10 animaux par espèce ciblée. Pour chaque formulation et selon la revendication du produit, des tests pourront être conduit sur les 2 espèces ou sur une espèce. Ainsi, si un produit à l’étude cible les rats et les souris alors 20 animaux sont utilisés dans la procédure (10 rats et 10 souris). La loi exige de tester un minimum de 10 animaux; nous souhaitons utiliser le moins d'animaux possible, aussi nous ne testerons que le minimum d’individus préconisé soit 10 animaux par procédure. Un test statistique sera réalisé afin de vérifier si la consommation et la mortalité sont identiques entre les 2 sexes, le cas échéant ces taux seront calculés en prenant en compte la population entière. Le nombre d’animaux définit suffira à déterminer la tendance statistique nécessaire pour voir si le produit testé est suffisamment consommé (≥20% de la ration alimentaire) et s’il permet une mortalité efficace (≥90% des animaux testés). Afin de ne pas inclure inutilement des animaux dans les procédures, nous ne testons pas d'animaux témoin. Nous nous basons sur une survie théorique de 100% des individus témoin en nous basant sur les périodes d'acclimatation et d'habituation qui précédent le test. Afin d'éviter un biais de placement pour la mesure de la consommation, l'emplacement du produit est inversé quotidiennement avec l'emplacement de l'aliment de laboratoire habituel (aliment extrudé ou biberon d'eau).
Raffinement
Phase d'Acclimatation : durée = 7 jours minimum , acclimatation le cas échéant à la salle, à l’aliment, aux procédures d’hébergement, aux congénères. Phase d'Habituation : Durée = 7 jours. Afin d’individualiser les animaux, un signe distinctif est réalisé au marqueur indélébile sur leur queue. Afin d’habituer les animaux aux manipulations et au manipulateur, celui-ci réalise différentes actions sur les animaux. Quotidiennement, le manipulateur consigne pour chaque animal : l’état du pelage, des yeux et des oreilles et le comportement de l’animal. Pour chaque animal, le manipulateur saisit délicatement l'animal, le sort de la cage, réalise une brève observation et le pèse. Lors de la brève observation, le manipulateur vérifie l’état des différents orifices (bouches, oreilles, nez, anus, appareil génitale). La masse des animaux et la masse d’aliment non-consommé est consignée quotidiennement, puis une masse déterminée d’aliment est mise à disposition. Ainsi, le manipulateur prend connaissance du comportement "normal" de chaque animal et pourra le comparer à celui de l'animal sous anticoagulant. De plus, l'animal habitué réagira moins aux manipulations lorsqu'il sera sous anticoagulant, ce qui évitera l'accumulation de contraintes. Phase d’isolement : durée = 4 jours . Lors de l’hébergement individuel, l’environnement est enrichi (cachette + coton). Les animaux sont placés dans des cages transparentes à proximité d’autres cages afin de maintenir un contact visuel, auditif et olfactif avec leurs congénères. Après ces 4 jours d'isolement, les rongeurs femelles sont regroupés. Les mâles non-agressifs seront regroupés suivant leur affinité et groupe de départ. Sinon, ils seront maintenus isolés. Phase d’observation de la mortalité (J+2 à J+21) : Signes précoces d’intoxication ou de morbidité = mise à mort. Afin d’éviter des souffrances inutiles aux animaux, l'observations des points limites en regard d'un score au delà duquel les animaux sont mis à morts est mis en place. Les cages et éléments d’élevage sont adaptés à l’espèce et au nombre d’animaux. Si une baisse de poids supérieure à 10% est observé, alors de l’aliment humidifié et de l’eau gélifiée seront fournis à l’animal. À la suite de chaque réalisation de procédure, une analyse rétrospective sera réalisée pour le comité éthique afin d'améliorer d'un point de vue "éthique animal" la procédure (affinement des points limites, des observations ...).
Choix des espèces
Les produits sont destinés à limiter la surpopulation indésirable de rongeurs en agriculture, en industrie ou en milieu urbain. La réglementation exige l’utilisation des espèces cibles comme modèle expérimental. L’utilisation de rongeurs est appropriée puisque les produits testés ont pour destination une utilisation sur rats et souris. Bien que les traitements anticoagulants ciblent les rongeurs « sauvages », nous utilisons des souches de laboratoire. En effet, en plus de la contrainte d’obtention, d’habituation et du risque sanitaire, la récupération d’individus sauvages est en soit une source de stress et de mal-être chez l’animal. Une souche de laboratoire « non résistante » nous permet de réaliser plus efficacement l’observation des points limites. Les souches testées sont quasiment identiques aux souches sauvages. Nous utiliserons des adultes afin de conserver une certaine homogénéité dans la consommation interindividuelle de produit à l’étude. Ainsi, nous conservons une relative maitrise de l'intensité et du délais avant apparition des effets toxiques. Ainsi, nous pouvons anticiper de manière plus fine et donc mieux gérer la souffrance et détresse. Dans un objectif de réutilisation, les animaux utilisés seront idéalement d’anciens reproducteurs issus des laboratoires d’élevage. Nous utiliserons des animaux âgés de plus de 6 mois et de moins de 1,5 an, cela correspondant à la fourchette d'âge observée dans la nature, de plus les individus sont de masses relativement homogènes et donc plus facilement comparables.
Etude de la biocompatibilité d’un dispositif médical (DM) sur la santé humaine par l’utilisation d’un modèle de rat.
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
1085 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré et sévère, la majorité en gravité sévère. Ils subissent des tests réglementaires de toxicité d'un dispositif médical par gavage, application cutanée, injection ou instillation nasale. Le porteur indique que ces tests peuvent provoquer des signes de toxicité générale allant jusqu'à la mort, ainsi que des lésions cutanées pouvant aller jusqu'à l'escarre et la destruction de la peau. Il affirme que les méthodes in vitro susceptibles de remplacer ces essais ne sont "pas encore validées" et que ces tests sont imposés par la réglementation européenne.
Objectifs
Les professionnels de santé utilisent aujourd’hui des dispositifs médicaux (implants, prothèses, instruments…) que nous appelons « DM ». Le but du projet est d’évaluer la biocompatibilité de ces dispositifs. Autrement dit nous devons déterminer si les dispositifs, qui vont avoir un contact direct avec les tissus et fluides interne, sont compatibles avec le corps humain. Pour cela les DM doivent faire l’objet de tests réglementaires de toxicité évaluant en particulier les risques de toxicité systémique aigüe et de tolerance locale. Parmi les paramètres à étudier pour évaluer la biocompatibilité d’un DM, il faut évaluer sa toxicité systémique ainsi que sa tolérance locale. Cette évaluation est imposée par les instances règlementaires européennes. Pour répondre aux obligations règlementaires avant mise sur le marché de produit, nous réaliserons des tests de toxicité systémique aigüe sur le modèle du rat (par voie orale, voie cutanée, voie intraveineuse et/ou intrapéritonéale) et un test de tolérance locale sur la muqueuse nasale du rat. Pour la toxicité systémique, le produit à tester ou son extrait est administrée par voie idoine chez le rat afin de déterminer la toxicité du produit, par les différents signes cliniques observés et les potentielles mortalités. Pour la tolérance locale, le produit à tester ou son extrait est administré par instillation nasale chez le rat afin de vérifier, par l’observation de réactions locales, si une réaction d’irritation se produit.
Bénéfices attendus
Le projet permet d’obtenir des données expérimentales utilisées pour conclure sur la sécurité biologique d’un DM, sa biocompatibilité. Ce projet fait donc partie intégrante de l’évaluation biologique des DM, une exigence essentielle en matière de sécurité requise par le Règlement Européen et exigée par les organismes notifiés afin d'accorder ou non la mise sur le marché. Le but est d’obtenir une autorisation de mise sur le marché de DM sans risque pour la santé de l’homme.
Procédures
-TAOiso : traitement unique par gavage (1 minutes). Pesée à J0, J2, J7 et J14. Observations cliniques quotidiennes. Injection intrapéritonéale pour l'euthanasie (15 secondes). - TADiso : traitement unique local par patchage (24h) / dépatchage (1minute) (mise d’un pansement puis retrait). Pesée à J0, J2, J7 et J14. Observations cliniques quotidiennes. Injection intrapéritonéale pour l'euthanasie (15 secondes). - TAI : traitement unique par injection intraveineuse ou intrapéritonéale (1 minute). Pesée de J0 à J3. Observations cliniques quotidiennes. Injection intrapéritonéale pour l'euthanasie (15 secondes). - MN : instillations intranasales (3 minutes) (fréquences et nombre de jours de traitement dépendant du protocole). Pesée à en début, milieu et fin d’étude. Observations cliniques quotidiennes. Injection intrapéritonéale pour l'euthanasie (15 secondes).
Impact sur les animaux
Toxicité systémique : Les réactions attendues sont des signes cliniques généraux relevant d’une toxicité systémique (sur l’activité spontanée des animaux, le réflexe de Preyer, la respiration, la température corporelle, le réflexe de retournement, le tonus musculaire, la ptose palpébrale, l’aspect de la pupille, l’aspect du poil, il peut aussi y avoir des convulsions, tremblements, salivation, larmoiement), pouvant aller jusqu’à la mort de l’animal. S’il y a atteinte des points limites alors l’animal peut être euthanasié pour raison éthique avant la fin de l’étude. Pour le test TADiso, en plus des effets systémiques, des réactions locales limitées à la zone de traitement peuvent être attendues (sécheresse cutanée, perte de souplesse de la peau, érythème pouvant aller jusqu’à la formation d’escharre et/ou de croûte, desctruction de l’épidermes et du derme, œdème) Pour le test MN un phénomène d’irritation peut apparaître (érythème, œdème, secheresse). Les réactions attendues sont locales, limitées à la zone de traitement.
Devenir
Les tests de toxicité systémique aigüe par voie orale et par voie cutanée ont pour but d’évaluer la toxicité d’un dispositif médical qui sera observé lors de l’autopsie générale. Cette autopsie permettra également l’observation du site de traitement (estomac ou peau selon la voie d’administration). Les tests de toxicité systémique aigüe par voie intraveineuse et/ou intrapéritonéale ont pour but d’évaluer la toxicité d’un dispositif médical qui sera observé lors de l’autopsie générale. Les tests de toxicité systémique par voie nasale ont pour but d’évaluer la toxicité d’un dispositif médical qui sera observé lors de l’autopsie générale. Lors de cette autopsie les muqueuses nasales seront prélevées afin de réaliser une analyse histologique de ces tissues.
Remplacement
Les tests de toxicité systémique aigüe sur le modèle du rat (par voie orale, voie cutanée, voie intraveineuse et/ou intrapéritonéale) sont menés après avoir rassemblé toutes les informations disponibles sur la substance d’essai (identité et structure chimique, propriétés physico-chimiques, résultats obtenus dans tous les autres essais de toxicité in vitro et in vivo, données toxicologiques de substance structurellement apparentées et l’usage escompté). Les tests de toxicité systémique aigüe doivent être effectués sur le modèle du rat car les modèles in-vitro pouvant les remplacer n’ont pas encore été validés à l’heure actuelle. Le test de tolérance locale sur la muqueuse nasale ne doit pas être effectué sur un produit irritant pour la peau, les yeux, les muqueuses ou ayant un pH ≤ 2 ou ≥ 12.5 (le pH étant une échelle permettant de savoir si une solution est acide, neutre ou basique). Par ailleurs les tests d’irritations ne doivent être envisagés seulement si les données de sécurité ne peuvent être obtenues par d’autres moyens. Il n’existe pas de modèle in-vitro validé pour l’irritation nasale.
Réduction
- TAOiso : ces tests sont réalisés sur un seul sexe (normalement des femelles). Pour limiter le nombre d’animaux utilisés dans ces tests, nous réalisons un test témoin négatif tous les six mois et non à chaque essai. - TADiso : Les produits chimiques d’essai ne doivent pas être administrés à des doses connues pour provoquer une douleur importante ou une détresse par un mécanisme potentiellement corrosif ou fortement irritant. Le test est réalisé sur un seul sexe (normalement des femelles). Pour limiter le nombre d’animaux utilisés dans ces tests, nous réalisons un test témoin négatif tous les six mois et non à chaque essai. - TAI : ces tests sont réalisés sur un seul sexe. Pour limiter le nombre d’animaux utilisés dans ces tests, nous réalisons un groupe contrôle commun aux différentes études se déroulant en même temps. - MN : Lorsque plusieurs DM sont testés dans un même temps, le lot contrôle sera communs aux différentes études.
Raffinement
A leur arrivée, les animaux sont mis en cage par l’animalier qui effectue un premier contrôle de leur état de santé. En vue de leur acclimatation aux conditions du laboratoire, les animaux sont gardés pendant au minimum 5 jours avant le début des procédures, dans des cages communes par 3 ou 5, pour garantir leur bien-être. La taille des cages est adaptée aux critères de bien être animal, elles sont transparentes et contiennent de la litière constituée de particules de bois résineux déshydratée puis tamisée et un tunnel en carton comme enrichissement. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau et la litière souillée est remplacée par de la litière propre 2 fois par semaine. Des points limites (basés sur l’état général de l’animal) sont définis pour chacun des tests afin d’éviter toute souffrance inutile aux animaux.
Choix des espèces
Le rat, reste le modèle de choix utilisé pour les tests de toxicité. L’espèce et le stade de développement des animaux à utilisé est imposé par les normes ISO correspondantes. Le choix d’une autre espèce doit être justifié. - TAOiso, TADiso, TAI, MN : rats jeunes adultes de 7 à 9 semaines. Si des femelles sont utilisées elles doivent être nullipares et non gravides.
Inhibition du Canal TRPC3 dans les muscles de rat DMD pour le traitement de la Dystrophie Musculaire de Duchenne par thérapie génique
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
105 rats porteurs de la mutation de la myopathie de Duchenne vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections intramusculaires d'un vecteur de thérapie génique, l'implantation chirurgicale d'une mini-pompe dans l'abdomen ou une injection intraveineuse, avant une exsanguination terminale sous anesthésie. Le porteur présente cette étude comme un essai pilote destiné à sélectionner l'approche la plus efficace avant une étude ultérieure à plus grand effectif. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ne reproduit un transfert de gène dans un "organisme entier" et que l'animal est le "seul organisme vivant" permettant cette étude.
Objectifs
La Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie génétique affectant environ 1 garçon sur 5000 à la naissance. Elle est due à des mutations dans le gène DMD codant pour la protéine Dystrophine, essentielle au fonctionnement et au maintien de l’intégrité des fibres musculaires. L’absence de Dystrophine dans l’intégralité des muscles de l'organisme provoque leur dégénérescence progressive, une faiblesse musculaire, la perte de la marche avant 15 ans, l’apparition de déficiences respiratoire et cardiaque, et, finalement une mort prématurée. La thérapie génique est une des approches prometteuses pour le traitement de la DMD. L’efficacité thérapeutique passe par le transfert d’un gène thérapeutique dans les muscles, à l’aide d’un vecteur viral recombinant dérivé du virus adéno-associé (AAV). Le gène de la dystrophine étant trop grand pour être inséré dans un vecteur AAV, des transgènes miniaturisés de la Dystrophine, appelés microDystrophines (MD) ont été générés. Si les premiers résultats obtenus après injection de patients DMD à l’aide de vecteurs AAV-MD sont encourageants, nous savons déjà que la correction ne pourra qu'être partielles et il reste nécessaire de développer des produits de 2ème génération qui seront alternatifs ou complémentaires à la thérapie génique AAV-MD. L'objectif de notre projet est de tester une nouvelle approche thérapeutique basée sur le blocage de canaux calciques, présents à la surface des cellules musculaires, et dérégulés dans la DMD. L'utilisation de bloqueurs de canaux calciques spécifiquement dans les muscles cardiaques et squelettiques représente une stratégie complémentaire à la thérapie génique AAV-MD. Ce projet est une étude pilote dans laquelle nous souhaitons faire la preuve de concept que l’inhibition moléculaire d'un canal calcique (via l'utilisation de vecteurs AAV) peut être bénéfique pour traiter la DMD. Pour cela, nous traiterons des rats DMDmdx à l’aide de différentes stratégies.
Bénéfices attendus
A court terme, les résultats obtenus dans cette étude pilote nous permettront de (i) cumuler des 1ères données suite à un traitement combinatoire AAV-MD + inhibition d'un canal calcique via une approche pharmacologique, et (ii) sélectionner l’approche moléculaire la plus efficace pour inhiber l’activité d'un canal calcique à l'aide d'un vecteur AAV, et améliorer les lésions histologiques musculaires du rat DMDmdx. La construction la plus efficace sera ensuite évaluée pour son efficacité thérapeutique dans le même modèle animal du rat DMDmdx, mais avec un nombre d’animaux plus important par groupe expérimental afin d’assurer la robustesse des évaluations phénotypiques. Cette efficacité thérapeutique sera évaluée seule et en combinaison avec un traitement AAV-MD. Cette seconde étude fera l’objet d’une autre demande d’autorisation de projet. A long terme, les bénéfices attendus de ce projet pilote sont de développer un candidat présentent un fort potentiel thérapeutique pour le traitement de la Dystrophie Musculaire de Duchenne par thérapie génique AAV. En cas de succès, le produit final sera évalué dans une étude de toxicologie réglementaire afin de pouvoir prétendre ensuite réaliser un essai clinique chez des patients DMD.
Procédures
(i) Pour maximum 66 animaux: injection intramusculaire réalisée dans 2 muscles des pattes postérieures. Geste réalisé une fois par animal sous anesthésie. Durée de l'intervention: environ 10min. (ii) Pour maximum 22 animaux: implantation mini-pompe osmotique dans la cavité péritonéale. Geste réalisé une fois par animal sous anesthésie. Durée de l'intervention: maximum 20min. (iii) Pour maximum 12 animaux: injection intravaineuse dans une veine caudale sur animal vigile. Geste réalisé une fois par animal sous analgésie. Durée de l'intervention: maximum 5min. Puis, 2 semaines après, implantation mini-pompe osmotique dans la cavité péritonéale. Geste réalisé une fois par animal sous anesthésie. Durée de l'intervention: maximum 20min. (iv) Pour tous les animaux (maximum 105): Exanguination terminale au niveau de la veine cave : pas de stress ou de douleur pour les animaux, puisque cet examen sera réalisé sous anesthésie générale renforcée par une analgésie ce qui limitera une éventuelle douleur liée au geste invasif. Ce prélèvement se fera au moment de la mise à mort des animaux.
Impact sur les animaux
(i) Injection intramusculaire réalisée dans 2 muscles des pattes postérieures: geste réalisé une fois par animal (sur une partie des animaux) sous anesthésie. Elle ne provoquera donc pas de stress ou de douleur aux animaux. Durée de l'intervention: environ 10 min. Les animaux seront surveillés après leur réveil par un examinateur. La récupération devrait être rapide. Par ailleurs, l’injection intramusculaire d’un vecteur viral chez le rongeur est connue pour ne provoquer aucun effet indésirable. Il a été en effet documenté dans de nombreuses études que l’injection intramusculaire d'un tel vecteur chez le rongeur est très bien tolérée. (ii) Implantation mini-pompe osmotique dans la cavité péritonéale : cette procédure chirurgicale peu invasive sera réaliséz une fois par animal (sur une partie des animaux) sous anesthésie générale, et avec une analgésie adaptée. Malgré tout, les animaux pourraient ressenti une douleur modérée au niveau de la zone d’incision pendant la période de cicatrisation (maximum 7 à 10 jours). Durée de l'intervention: maximum 20 min. (iii) Injection intraveineuse réalisée dans une veine caudale: geste réalisé une fois par animal (sur une partie des animaux) sous contention, sans anesthésie, mais sous analgésie afin de limiter le stress de l'animal et la douleur provoquée par la ponction de l'aiguille. Durée de l'intervention: maximum 5 min. Par ailleurs, l’injection intraveineuse d’un vecteur viral chez le rongeur est connue pour ne provoquer aucun effet indésirable. Il a été en effet documenté dans de nombreuses études que l’injection systémique d'un tel vecteur chez le rongeur est très bien tolérée. (iv) Exanguination terminale au niveau de la veine cave : pas de stress ou de douleur pour les animaux, puisque cet examen sera réalisé sous anesthésie générale renforcée par une analgésie ce qui limitera une éventuelle douleur liée au geste invasif. Ce prélèvement se fera au moment de la mise à mort des animaux.
Devenir
A l'issue des procédures décrites dans ce projet, tous les animaux de cette étude seront euthanasiés afin d’obtenir des échantillons de tissus qui seront utilisés pour des analyses calcique, moléculaires, biochimiques et histologiques nécessaires au projet. Ces analyses ne peuvent se faire du vivant de l'animal.
Remplacement
Il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative pour tester l’effet d’un traitement de thérapie génique in vivo. Nous savons que l’efficacité du transfert de gène dans une lignée cellulaire in vitro n’est pas comparable à ce qui peut se passer in vivo dans un organisme entier et sur le long terme (plusieurs semaines après injection). L’animal est le seul organisme vivant permettant d’étudier l’impact d’un transfert de gène dans différents types cellulaires et sur un tissu pathologique dans toute sa complexité. Ce projet, qui vise à faire la preuve de concept que l’inhibition d'un canal calcique peut en effet être bénéfique pour réduire les anomalies calciques et les lésions musculaires liées à la pathologie DMD ne peut donc pas être réalisé in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe est basé sur notre expérience précédente de protocoles de thérapie génique lors desquels nous avons pu obtenir des résultats cohérents et reproductibles dans des groupes de cette taille, pour les analyses pilotes qui seront réalisées ici (analyses calciques, moléculaires, biochimiques et histologiques). Cela semble être un nombre minimal qui permette d’assurer la robustesse des résultats sans qu’il soit excessif en terme d’animaux à inclure. D’autre part, par l’identification des constructions les plus efficaces, cette étude pilote permettre de réduire le nombre total d’animaux qui seront à inclure dans l’étude qui suivra et qui visera à évaluer l’efficacité thérapeutique de la meilleure construction, en combinaison ou non avec un AAV-MD. En effet, tester d’emblée ces 10 approches d’inhibition moléculaires calciques aurait demandé l’inclusion d’un nombre très important d’animaux, supérieur au nombre total qui sera inclus via ces 2 études.
Raffinement
Le bien-être animal passera notamment par : 1) de bonnes conditions d'hébergement selon la réglementation en vigueur avec un enrichissement du milieu (mise à disposition de tunnels en cartons ou PVC, frisottis de papier, bûchettes de bois), un hébergement à deux animaux (par groupe expérimentaux), accès à l’eau et à l’alimentation à volonté. 2) un suivi régulier des animaux (observations biquotidiennes, pesées régulières, analyse du comportement) 3) l'instauration de points limites pertinents et la mise en place de mesures adaptées si nécessaire (anesthésies, traitements analgésiques ou autre, ou euthanasie si pas d'autre alternative) 4) Afin d'améliorer la réactivité du personnel animalier, une grille de scoring de la douleur sera mise en place dès que celle-ci s'avère nécessaire afin de pouvoir détecter précocement tout point limite et mettre en place les actions adéquates. 5) la mise en place de mesures adaptées en fonction des interventions éventuelles (anesthésie et analgésie si nécessaire).
Choix des espèces
Le rat DMDmdx possède une mutation dans l’exon 23 du gène dmd codant pour la protéine Dystrophine. Dans ce modèle animal de la DMD, l’expression de la dystrophine est nulle et le phénotype sévère. Les modèles animaux atteints de DMD les plus classiquement utilisés : souris mdx et chien GRMD, présentent des limites pour les projets pré-cliniques. La souris mdx ne reproduit que partiellement les lésions tissulaires avec un phénotype peu marqué. Le chien GRMD présente des lésions tissulaires proches de celles des patients DMD et un phénotype sévère, mais reste un modèle "gros animal" lourd à manipuler. Le rat DMDmdx est donc un modèle intermédiaire avec un bon reflet de la pathologie humaine, tout en présentant moins de limitations. Les animaux seront injectés à l’âge de 1 mois pour les animaux traités avec les vecteurs AAV, et à l’âge de 1,5 mois pour les animaux traités avec le produit Pyr10. Le décalage de 15 jours entre ces 2 groupes est lié au fait qu’il faut au moins 15 jours pour obtenir une expression significative d’une protéine après injection d’un vecteur AAV, alors que le produit Pyr10 sera actif immédiatement. Les animaux seront ensuite mis à mort à l’âge de 3 mois. Dès l’âge de 1,5 mois, les rats DMDmdx présentent des anomalies calciques dans leurs muscles, avec une augmentation de ces défauts au cours du temps, et la mise en place de fibrose musculaire bien présente à 3 mois d’âge. L’âge de début des différents traitements et la durée de ceux-ci permettront donc d’évaluer les bénéfices sur la dystrophie musculaire des stratégies d’inhibition testées et de les comparer entre elles. Ce planning nous garantira de pouvoir effectuer l’intégralité du protocole chez tous les animaux inclus, sans atteindre un âge critique où la dégradation de l'état de santé due à la maladie pourrait devenir sévère. En effet, cette myopathie est associée à une dégradation progressive de l’état général de l’animal. Cette dégradation devient sévère (troubles locomoteurs, douleurs à la manipulation) pour la plupart des animaux au delà de 8-9 mois.
Maintien d’une ligné de rats DMDmdx
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
1150 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger et modéré, pour maintenir une lignée de rats porteurs de la mutation de la myopathie de Duchenne. Chaque raton subit vers huit à dix jours une biopsie de la queue sous anesthésie locale pour le génotypage, sans analgésie prévue d'emblée. Le porteur indique que les rats au génotype voulu rejoignent de futures études de thérapie génique ou le pool de reproduction, les autres étant mis à mort. Il décrit le rat DMDmdx comme plus proche de la maladie humaine que la souris mdx ou le chien, et affirme qu'aucune méthode alternative ne teste un traitement sur un "organisme entier".
Objectifs
La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est la plus fréquente des maladies musculaires (1 garçon sur 5000 naissances). Elle est due à un défaut dans le gène codant pour une protéine nommée Dystrophine, situé sur le chromosome X et est à l'orgine d'une dégénérescence progressive du tissu musculaire. La maladie touche tous les muscles de l’organisme, y compris le muscle cardiaque et le diaphragme. Chez les patients DMD, la marche est définitivement perdue avant l’âge de 15 ans et le décès survient généralement avant 30 ans. Aucun traitement n’est disponible à ce jour sur le marché. La thérapie génique, la thérapie cellulaire ou l'utilisation de certaines molécules pharmocologiques font partie des approches envisageables pour le traitement de cette pathologie ou pour le maintien ou l’amélioration de la fonction musculaire. En 2014, un consortium de laboratoires a généré un nouveau modèle animal de la DMD : le rat DMDmdx. Cette lignée de rat, totalement caractérisée, se révèle être un très bon reflet de la pathologie humaine (atteintes supérieures à d'autres modèles animaux, notamment au niveau de l'atteinte cardiaque) . Notre projet vise à maintenir une colonie de rats DMDmdx à partir de femelles porteuses et de mâles sains. Les rats mâles DMDmdx générés et les rats sains issus de portées communes aux rats DMDmdx (rats mâles littermates) seront destinés à être inclus dans des études futures de thérapie génique, cellulaire ou pharmacologiques. Certaines femelles porteuses générées seront destinées à devenir à leur tour reproductrices. Afin d'assurer le maintien d'une colonie et de répondre aux besoins des études, nous devons générer au maximum 150 rats mâles DMDmdx par an. Nous estimons qu'il sera nécessaire de mettre à la reproduction environ 40 femelles porteuses et 40 mâles sains par an, soit un total de 400 animaux reproducteurs utilisés sur 5 ans afin de générer environ 750 rats mâles DMDmdx. La détermination du nombre total d’animaux à inclure dans ce programme de reproduction a été réalisée sur la base de l'expérience de précédentes reproductions menées pour des projets de thérapie génique chez le rat DMDmdx.
Bénéfices attendus
(i) Le maintien d'une lignée de rat DMDmdx présentant une atteinte musculaire proche de la pathologie humaine de la Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) permettra d'obtenir un modèle animal supplémentaire et complémentaire à ceux existants, afin d'évaluer et définir les doses thérapeutiques des traitements expérimentaux développés (thérapie génique, cellulaire ou pharmacologique) dans des projets pré cliniques. La souris mdx et le chien GRMD (pour Golden Retriever Muscular Dystrophy), tous deux porteurs d’une mutation dans leur gène de la dystrophine, sont 2 modèles largement utilisés, mais présentent cependant un certain nombre d’inconvénients : La souris mdx ne reproduit que partiellement les lésions tissulaires retrouvées chez les patients DMD - Le chien GRMD présente des lésions tissulaires proches et une évolution semblable à la maladie des patients DMD, mais reste un modèle de gros animal coûteux et lourd à manipuler. (ii) Un élevage aggrée a arrêté récemment sa production de rats DMDmdx et à ce jour aucun autre fournisseur n'en propose à la communauté scientifique. (iii) Le maintien d'une colonie de rat DMDmdx sur notre Centre permettra de mettre à disposition des équipes de recherche, tant académiques que privées, ce modèle animal pertinent de la DMD et de réaliser sur site les études associées.
Procédures
Une biopsie de queue (prélèvement d'environ 1 millimètre de la queue) sera réalisée sur les ratons de toutes les portées issues des reproductions de la lignée DMDmdx. L'acte sera réalisé une seule fois, précocement au cours de la vie de l’animal, de 8 à 10 jours après la naissance, afin de déterminer son génotypage, c'est à dire identifier si l'animal est atteint de la maladie Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) ou bien s'il s'agit d'un animal sain. Le prélèvement se fera sous anesthésie locale.
Impact sur les animaux
(i) Gestion de la douleur lors des caudectomie : une anesthésie locale est prévue lors de la réalisation des biopsie de queue pour le génotypage chez le raton de 8/10 jours. Pas d'analgésie complémentaire prévue d'emblée , mais une observation bi-quotidienne des animaux sera effectuée par les techniciens animaliers, et si besoin, un traitement adéquat sera mis en place par le vétérinaire du centre. Si nécessaire, en cas de douleur chez le raton, comme le défaut de reptation, l’émission de cris, le fait de rester à l'écart du reste de la portée et la non reprise de la tétée dès la remise au nid, une injection en sous-cutanée de Buprénorphine® pourra être réalisée. (ii) Le phénotype lié à la maladie des rats DMDmdx est évolutif et dégénératif (troubles locomoteurs, douleurs à la manipulation, difficultés à s'alimenter liées à une mauvaise usure des dents / déficits des muscles masticateurs). Cette dégradation devient sévère pour la plupart des animaux au delà de 8-9 mois. Aussi, le plus souvent les animaux générés seront inclus dans les études à un âge auquel les animaux sont considérés comme "juvéniles", et mimant donc le stade auquel des patients DMD pourraient être injectés lors d'un futur essai clinique (enfants ou jeunes adolescents, pré-pubères). Cependant, jusquà inclusion dans une étude, l’aspect et le comportement général des animaux seront observés de façon quotidienne par le personnel animalier. L’appétit, la consommation hydrique, la prise de poids et la capacité de locomotion de l’animal constitueront les principaux éléments surveillés de façon hebdomadaire pour estimer une éventuelle gêne ou douleur liées à l’expression clinique de la maladie. Ces observations seront automatiquement fournies au vétérinaire responsable.. Dans le cas, où l’animal n’arriverait plus à se déplacer correctement, perdrait du poids et présenterait des symptômes laissant penser à l’existence de douleurs chroniques, la mise à mort de l’animal sera anticipée.
Devenir
Suite au génotypage, le devenir des animaux générés lors de notre programme de reproduction sera fonction des besoins des projets dans lesquels ils seront inclus : (i)Les rats mâles DMDmdx, voire les rats sains issus de portées communes aux rats DMDmdx (rats sains littermates) seront inclus dans les études futures de thérapie génique, cellulaire ou pharmacologiques au fil de l’eau en fonction du dynamisme de la colonie implantée. (ii)Une partie des femelles porteuses (environ une par portée) obtenue sera conservée en vue d'intégrer le pool des reproducteurs. (iii) Les autres animaux issus des portées et ne pouvant pas être intégrés dans un projet seront euthanasiés dès le rendu des résultats des génotypages.
Remplacement
Il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative pour tester l’effet d’un traitement sur un organisme complet et ses effets sur les différents organes/tissus. Pour exemple, en thérapie génique , nous savons que l’efficacité du transfert de gène dans une lignée cellulaire in vitro n’est pas comparable à ce qui peut se passer in vivo dans un organisme entier. L’animal est le seul organisme vivant permettant d’étudier l’impact d’un transfert de gène dans différents types cellulaires (différents tissus: muscle squelettique, coeur, foie et autres tissus majeurs). Cette lignée permet en outres de tester l'effet d'un traitement à la fois dans un contexte malade (rat DMD) et un contexte sain (rat sain littermate).
Réduction
La détermination du nombre total d’animaux à inclure dans ce programme de reproduction a été réalisée par approche statistique et sur la base de l'expérience de précédentes reproductions menées pour des projets de thérapie génique chez le rat DMDmdx. Dans ce projet, afin de générer au maximum 150 rats mâles DMDmdx par an, nous estimons qu'il sera nécessaire de mettre à la reproduction environ 40 femelles porteuses et 40 mâles sains par an, soit un total de 400 animaux reproducteurs utilisés sur 5 ans afin de générer environ 750 rats mâles DMDmdx. Ce nombre est estimé en fonction de nos connaissances actuelles sur les particularités de reproduction sur ce modèle et en considérant que la lignée génèrera des portées de taille standard.
Raffinement
Le bien-être animal passera notamment par : 1) de bonnes conditions d'hébergement selon la réglementation en vigueur avec un enrichissement de l'environnement mis en place systématiquement, favorisant entre autres la nidation (mise à disposition de tunnels en cartons ou PVC, frisure de papier, cellulose, bûchettes de bois), accès à l’eau et à l’alimentation ad libitum. Une alimentation convenant à l'élevage sera mise en place dès que la femelle sera gestante. Les prélèvements seront réalisés dans une salle d’expérimentation différente de la salle d’hébergement. 2) un suivi régulier des animaux (observations biquotidiennes, pesées régulières, analyse du comportement) 3) l'instauration de points limites pertinents et la mise en place de mesures adaptées si nécessaire (anesthésies, traitements analgésiques ou autre, ou euthanasie si pas d'autre alternative) 4) Afin d'améliorer la réactivité du personnel animalier, un tableau de points limites sera miseen place dès que celui-ci s'avère nécessaire afin de pouvoir détecter précocement tout point limite et mettre en place les actions adéquates (cf exemple en annexe 1 de la saisine). 5) la mise en place de mesures adaptées en fonction des interventions éventuelles (anesthésie et analgésie si nécessaire).
Choix des espèces
Le rat DMDmdx possède une mutation dans l’exon 23 du gène dmd codant pour la protéine Dystrophine. Ce modèle a été généré par l’utilisation de TALENs. Dans ce modèle animal de la DMD, l’expression de la dystrophine est nulle et le phénotype l'expression de la maladie sévère. En 2014, un consortium de laboratoires a généré un nouveau modèle animal de la Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) : le rat DMDmdx. Dans ce modèle animal de la Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD), l’expression d'une protéine, la dystrophine, essentielle au fonctionnement et au maintien de l’intégrité des fibres musculaires est nulle, d'où une expression sévère de la maladie DMD. Cette lignée de rat, totalement caractérisée, se révèle être un très bon reflet de la pathologie humaine (atteintes ssupérieures à d'autres modèles animaux, notamment au niveau de l'atteinte cardiaque). Les modèles animaux atteints de DMD les plus classiquement utilisés, la souris mdx et chien GRMD (pour Golden Retriever Muscualr Dystrophy), présentent des limites pour les projets pré-cliniques : -La souris mdx ne reproduit que partiellement les lésions tissulaires avec une expression de la maladie peu marquée. -Le chien GRMD présente des lésions tissulaires proches de celles des patients DMD et une expression de la maladie sévère, mais reste un modèle "gros animal" lourd à manipuler. Le rat DMDmdx est donc un modèle intermédiaire avec un bon reflet de la pathologie humaine, tout en présentant moins de limitations. Pour le programme de reproduction, de jeunes adultes en âge de procréer et adultes pour les animaux reproducteurs sont utilisés : - rats sains provenant d'un fournisseur agréé : entre 12 et 14 semaines - rats femelles porteuses de la maladie : 14 semaines. La fin de la fertilité pour la lignée rat DMDmdx étant entre 10 et 11 mois. Les animaux générés, les rats mâles DMDmdx générés et les rats mâles sains issus des mêmes portées, sont ensuite en général inclus dans les protocoles expérimentaux au moment du sevrage. Selon les projets, les animaux seront utilisés à différents âges, ce qui sera justifié au niveau des saisines de chacun des projets.
Acquisition et maintien des compétences techniques en chirurgie expérimentale et analyse comportementale
- Formation professionnelle
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
100 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie crânienne d'une heure pour implanter un dispositif de mesure, puis des tests d'équilibre, de motricité et des mesures auditives et vestibulaires dont le nystagmus post-rotatoire. Ces procédures ne visent pas à produire des connaissances mais à maintenir les compétences techniques du personnel, dont la validité expire tous les six mois dans l'établissement. Le porteur décrit le remplacement comme "difficilement applicable" puisque l'objectif est l'entraînement au geste lui-même.
Objectifs
La bonne réalisation d’un projet scientifique utilisant des animaux de laboratoire requiert que le personnel appliquant les procédures expérimentales soit parfaitement formé aux gestes techniques nécessaires à l’atteinte des objectifs du projet. Ce projet est dédié au maintien des compétences des personnels maîtrisant les gestes techniques impliqués dans ces 2 procédures. Ceux-ci ayant une durée de validité de 6 mois dans notre établissement, il est donc nécessaire d’utiliser des animaux spécifiquement pour ce maintien de compétence. Ainsi, la bonne formation du personnel permet 1) d’améliorer le bien-être des animaux en prévenant les gestes mal effectués, et 2) d’éviter de refaire des expérimentations en raison du manque de reproductibilité des résultats scientifiques et donc de limiter le nombre d’animaux utilisés. Cette demande d’autorisation de projet a un double objectif : 1. Former le personnel aux diverses méthodes expérimentales réalisées dans l’établissement utilisateur. Elle permettra une montée en compétence des expérimentateurs et donc in fine une diminution probable des mauvaises manipulations pouvant conduire à des mises à morts inutiles ou à des reproductions d’expérimentation. 2. Raffiner les procédures expérimentales, notamment évaluer la possibilité de réaliser diverses procédures fonctionnelles et comportementales sur le même animal et ainsi réduire le nombre d’animaux utilisés à des fins scientifiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de former les personnes impliquées dans la mise en oeuvre des procédures afin 1) d’améliorer la santé et le bien-être des animaux en prévenant les gestes mal pratiqués et 2) d’optimiser les procédures expérimentales afin de réduire le nombre d’animaux utilisés.
Procédures
Procédure 1 : Mesure de l'activité cérébrale et analyse comportementale de la fonction motrice chez le rat. La procédure comporte une chirurgie crânienne sous anesthésie gazeuse (1h) permettant la mise en place d’un dispostif de mesure de l’activité du cerveau. Ensuite, des tests de comportement (30min au total) sont effectués pour évaluer la motricité et l’équilibre de l’animal. Procédure 2 : Mesure du nystagmus post-rotatoire et évaluation des fonctions vestibulaire et auditive. La procédure inclut une chirurgie crânienne sous anesthésie gazeuse (1h) permettant la mise en place d’un dispositif de fixation pour réaliser le test du nystagmus post-rotatoire (10min). Ensuite, des tests de comportement (10min au total) sont effectués pour évaluer l’équilibre de l’animal. Enfin, des mesures auditives sous anesthésie médicamenteuse sont pratiquées (20 secondes de mesure ; 1h pour le reveil de l’animal dans une armoire chauffante).
Impact sur les animaux
Les nuisances subies par les animaux sont principalement dues aux chirurgies crâniennes.
Devenir
La totalité des animaux prévus dans ce projet sont mis à mort à la fin de la procédure les concernant, afin de récupérer les tissus biologiques d’intérêt pour les analyser.
Remplacement
Difficilement applicable à ce projet puisqu’il vise à garantir le niveau de compétence du personnel dans la réalisation des gestes en expérimentation animale. Les mesures fonctionnelles, comportementales et de mises à mort n’offrent pas cette possibilité.
Réduction
Ce projet vise à former le personnel aux diverses méthodes expérimentales réalisées dans l’établissement utilisateur. Elle permet une montée en compétence des expérimentateurs et donc une diminution probable des mauvaises manipulations. Une approche de formation « centralisée » sera mise en œuvre afin que plusieurs personnes puissent assister simultanément aux procédures. L’utilisation de chaque animal est optimisée autant que possible pour réaliser à la fois des explorations fonctionnelles et comportementales : - Les animaux dont l'activité cérébrale est mesurée sont également utilisés pour les tests comportementaux et mis à mort pour l’analyse histologique. - Les animaux dédiés à la mesure du nystagmus post-rotatoire sont également utilisés pour les tests comportementaux, la mesure des produits de distorsion acoustiques, les dosages sanguins et mis à mort pour l’analyse histologique. Ceci permet de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures.
Raffinement
- Les animaux seront surveillés quotidiennement par les expérimentateurs ou les zootechniciens de façon à évaluer leur état physiologique et leur comportement. Après chaque procédure invasive, un suivi renforcé des animaux sera réalisé afin d’identifier toute forme de souffrance ou d’atteinte de point limite ; - Les animaux seront hébergés à plusieurs par cage à chaque fois que cela est possible ; - Un enrichissement varié (tunnel, éléments de nidification, briquettes en bois) leur sera apporté ; des friandises issues de fournisseurs d'aliments pour animaux de laboratoire leur seront données après la réalisation des gestes ; - Si possible, les animaux seront habitués progressivement aux divers dispositifs au moins une semaine avant le début des tests.
Choix des espèces
Le choix du modèle animal s’est porté sur le rat Long Evans. Le rat est un des modèles recommandés dans les lignes directives de l’OCDE portant sur les essais in vivo de toxicité des produits chimiques, domaine d’expertise du laboratoire. La souche Long Evans a été choisie car il est possède une oreille interne plus proche de l’Homme que celle des rats Albinos. Les procédures sont réalisées sur des rats adultes afin que la croissance du crâne soit terminée, et permettre ainsi les chirurgies crâniennes.
Bioréacteur pancréatique implantable
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
110 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance sans réveil, léger et sévère, 90 tués à l'issue et 20 réutilisés. Une partie est rendue diabétique par injection, subit une chirurgie dorsale d'implantation d'un pancréas bio-artificiel et de nombreux prélèvements sanguins, pendant que des rats donneurs sont tués pour fournir les cellules greffées. Le porteur indique que les rats ne répondant pas à l'induction du diabète servent à l'entraînement technique du laboratoire, et que les animaux ayant suivi l'étude sont tués pour analyse des organes. Les bénéfices annoncés pour le diabète de type I sont renvoyés à d'éventuels essais ultérieurs, l'animal étant présenté comme le modèle le plus fiable avant la clinique.
Objectifs
L'objectif du projet est de déterminer si un pancréas bio-artificiel (encapsulation de cellules sécrétrices d'insuline dans une matrice de composition standardisée) améliore l'efficacité de la greffe d'îlots pancréatiques en vue de la mise en place d'essais cliniques.
Bénéfices attendus
Si les résultats sont positifs et mettent en évidence un avantage thérapeutique de la greffe d'îlots dans la matrice, nous prévoyons de proposer une suite au projet à travers la continuité de tests précliniques ainsi que des validations réglementaires en vue d’un essai clinique (first in man), pour évaluer la sécurité et la fiabilité de cette approche thérapeutique innovante. Le développement d'un tel dispositif permettrait d'améliorer considérablement la prise en charge du diabète de type I en augmentant le nombre de patients éligibles à une greffe d'ilots de Langerhans. De plus, les dispositifs testés pourraient permettre de réduire voir d'arrêter la prise d'immunosuppresseurs des patients ainsi greffés, ce qui participerait à une augmentation de leur qualité de vie et à une diminution des risques induits par ces traitement (e.g. cancers, insuffisance rénale,..).
Procédures
55 rats seront recevront 1 ou 2 injections d’une molécule les rendant diabétiques (30 sec). Afin de suivre leur glycémie et donc leur état diabétique, une goutte de sang sera prélevée de façon bi-quotidienne la première semaine puis tous les jours pendant 2 semaines, soit 28 prélèvements sanguins d’une durée de 1 minute chacun. Lors de la greffe d’îlots, des animaux considérés comme "donneurs" seront euthanasiés afin de fournir les cellules sécrétrices d'insuline aux animaux diabétiques. Les animaux diabétiques seront ensuite anesthésiés, recevront un analgésique par injection, et auront une chirurgie dorsale (30 min) pour implanter les pancréas bio-artificiels qui contiendront les cellules sécrétrices d'insuline. La glycémie continuera d'être suivie quotidiennement jusqu'au sacrifice des animaux (8 semaines post-greffe). 10 gouttes de sang seront prélevées toutes les semaines pendant 11 semaines, soit 11 prélèvements sanguins d’une durée de 3 minutes chacun. Un test de tolérance au glucose sera réalisé durant 120 minutes à 35 jours post-greffe. Cela consiste à faire ingérer du glucose par gavage oral (30 sec) puis à mesurer la glycémie à différents temps (13 gouttes de sang prélevées durant les 120 minutes du test). A l'issue de l'étude, les animaux seront anesthésiés et recevront une analgésie afin d'etre euthanasiés (durée totale de la procédure 20 minutes).
Impact sur les animaux
Les inconforts prévisibles liés à la technique d'induction du diabète sont i) le risque d’hypoglycémie pouvant survenir dans les 48h suivant l’injection de la molécule et ii) un risque d'hyperglycémie apparaissant une fois les que les animaux ont développé le diabéte de type I. De plus ce modèle d'induction du diabète est à l'origine de pertubations de la prise alimentaire qui peut entrainer une perte de poids des animaux. La greffe d'ilots en sous-cutanée peut aussi être à l'origine d'une gêne pour les animaux au niveau de l'incision dorsale, un traitement antalgique sera utilisé pour éviter cela.
Devenir
Les rats non répondant à l'injection de la molécule induisant le diabète ne seront pas considérés comme naïfs, ils permettront l'enseignement de techniques expérimentales au sein du laboratoire par et pour les personnes formées à l'expérimentation animale. Les 50 animaux ayant suivi l'étude (10 contrôles, 10 diabétiques, 10 diabétiques greffés d'îlots, 10 diabétiques greffés avec le pancréas bio-artificiel 1 et 10 diabétiques greffés avec le pancréas bio-artificiel 2) seront mis à mort à la fin de celle-ci pour prélever les organes et faire des analyses moléculaires. Les rats inclus dans la procédure d'isolement d'ilots seront euthanasiés lors du prélèvement jusqu'à l'obtention des 40 000 ilots équivalents nécessaires à cette étude. Si nous obtenons le nombre d'ilots nécessaire avant l'utilisation des 45 animaux prévus, ils seront considérés comme naïfs et permettront l'enseignement de techniques expérimentales au sein du laboratoire par et pour les personnes formées à l'expérimentation animale.
Remplacement
Les tests ont été préalablement faits sur des lignées cellulaires et îlots isolés avant l'approche in vivo. Cette étape est essentielle après le test sur les lignées et avant la clinique (îlots humains). Cela représente le modèle le plus fiable avant la clinique. Il est nécessaire de pouvoir étudier l'effet de la greffe d'îlots dans cette matrice sur un organisme entier et pas uniquement sur des cellules isolées avant l'utilisation chez l'humain.
Réduction
Pour ce projet, nous prévoyons d'utiliser 50 animaux qui nous permettrons de constituer les 5 groupes nécessaire pour tester l'efficacité de nos pancréas bio-artificiels. Chaque groupe sera constitué de 10 animaux comme cela est classiquement utilisé dans la littérature pour obtenir la puissance statistique recherchée pour détecter une restauration de la régulation de la glycémique par la greffe d’ilots. Au total ce projet nécessite l'usage de 110 rats qui correspondront à : 1) isolement d'îlots (n=45); 2) le groupe contrôle (n=10) ; 3) l'obtention des 4 groupes de rats diabétiques (n=55 pour en obtenir minimum 40, en prévoyant une efficacité de 75% de l'injection de la molécule inductrice du diabiète en rapport avec notre expérience et les données de la littérature). Grace à l'optimisation du protocole d'induction du diabète de type I l'efficacité est de 75% de réussite ce qui nous permet de réduire le nombre d'animaux 55. De plus, nous stopperons la procédure d'induction du diabète lorsque les 40 animaux nécessaires à ce projet seront atteints et les rats surnuméraires (non injectés) seront affectés à un autre projet (notamment enseignements pratiques nécessitant l'utilisation d'animaux).
Raffinement
Dans un objectif de raffinement, plusieurs mesures seront mises en place: 1) Amélioration de l’hébergement des animaux par un milieu enrichi; 2) Observation quotidienne (pesée, glycémie, comportement, aspect, détection de toute souffrance) durant toute la période d'hebergement des animaux leur état général sera évalué selon des critères précis et adaptés qui nous permettrons de determiner si les animaux atteignent des points limites gradés qui correspondent à un critère d'arret de l'étude; 3) Dans les 48h suivant les injections de la molécule inductrice du diabète nous mettrons à disposition de l'eau avec 10% de sucre pour réduire le risque d'hypoglycémie; 4) Suivi régulier de la glycémie des animaux diabétiques et injection d'une unité d'insuline rapide si celle-ci dépasse les 3g/L; 5) Change fréquent des animaux diabétiques car celui-ci augmente la diurèse (toutes les 48h ou plus si nécessaire); 6) La chirurgie sera faite sous anesthésie volatile en association à une analgésie préopératoire, du gel occulaire pour réduire le dessèchement de la cornée, et les animaux seront placés sur un tapis thermostaté afin d'éviter tout risque d'hypothermie; 8) Lors du suivi post-opératoire, les animaux seront maintenus sous lampe chaude jusqu'à leur réveil complet, de la nourriture semi-liquide sera mise à leur disposition et nous utiliserons une litière en cellulose pour plus de propreté; 9) Une analgésie pré et post-opératoire sera réalisée par injection toutes les 12h durant 48h.
Choix des espèces
Nous avons choisi d'utiliser un modèle de rats car celui-ci est classiquement utilisé pour l'isolement d'ilots pancréatiques, ainsi que pour étudier le diabète de type I. L'utilisation de ce modèle nous permettra donc de comparer nos résultats aux données de la littérature ainsi qu'aux résultats antérieurs obtenus au sein du laboratoire d'accueil. La souche de rats choisie est non-consanguine ce qui nous permettra d'étudier l'efficacité des pancréas bio-artificiels à isoler les ilots de Langerhans greffés de la réponse inflammatoire des receveurs. Enfin la souche de rats choisie est classiquement utilisée dans les projets ayant attraits à des tests de greffe ainsi que des protocoles d'études pré-cliniques ciblant les maladies métaboliques, ce qui correspond exactement à l'objectif de ce projet. Les animaux utilisés pour l'isolement des ilots de Langherans et l'induction du diabète auront un poids corporel compris en 300-350g (age: 50-60 jours) ce qui correspond a un stade post-pubertaire à partir duquel toutes les grandes fonctions de l'organisme sont matures.