Rats
Etudes de pharmacologie de sécurité chez le rongeur (Rat, Souris) : Evaluation des effets des candidats médicaments sur la fonction respiratoire et le système nerveux
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 2560
Privés de nourriture et d'eau jusqu'à huit heures dans des chambres d'enregistrement respiratoire, parfois placés seize heures en cage à collecte d'urine et de fèces, 2 560 rats et 1 600 souris vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Ces études de pharmacologie de sécurité mesurent les effets de candidats médicaments sur la respiration et le système nerveux, étape que la réglementation impose avant toute première administration à un être humain. Le porteur justifie la mise à mort systématique par la volonté d'éviter qu'un même animal reçoive plusieurs composés, et décrit ces animaux comme "naïfs", sélectionnés sur des critères d'âge et de poids stricts pour rester comparables aux données historiques. Il annonce une observation fine du comportement lors des tests sur le système nerveux, sans nommer un seul des tests employés.
Objectifs
L'objectif de ce projet est d’évaluer de potentiels effets liés aux médicaments sur les systèmes vitaux de l’organisme tels le système respiratoire et le système nerveux. Les effets potentiellement indésirables d'un ou plusieurs composés pharmaceutiques sont évalués après administration unique ou répétée chez le rat ou la souris. Ces études de pharmacologie de sécurité entrent dans le cadre réglementaire du développement de médicament et sont exigées avant la première administration chez l’Homme. Le présent projet comprend 2 procédures de pharmacologie de sécurité chez le rongeur et couvre l’évaluation de la fonction respiratoire (procédure 1) et du système nerveux (procédure 2).
Bénéfices attendus
Le projet est réalisé dans un cadre réglementaire, conformément aux lignes directrices. Il s’agit d’un prérequis indispensable à la réalisation de la première administration chez l'Homme conformément aux lignes directrices et aux recommandations ICH (éditées par l’International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use (ICH)). Les bénéfices escomptés sont la détermination de marge de sécurité dans les doses de médicaments lors de la première administration chez l’Homme. Le but est d’assurer la sécurité des futurs médicaments. Les doses à administrer aux volontaires sont déterminées grâce à ces études et permettent d’assurer l’absence d’effets secondaires sur les fonctions vitales telles que la fonction respiratoire et le système nerveux.
Procédures
Les animaux sont généralement traités par une voie d’administration identique à celle envisagée chez l’Homme (orale, intramusculaire, sous-cutanée ou intraveineuse…). Il s’agit, le plus souvent, d’une administration unique. Parfois, l’administration peut être répétée. La durée de l’administration est généralement rapide (quelques secondes à quelques minutes) et peut atteindre au maximum 1 heure dans le cas de perfusion intraveineuse. La durée totale des études est de maximum 7 jours. Des prélèvements de sang, de fèces ou d’urine pourront être réalisés au cours du temps et analysés afin d’établir des bilans de santé et de déterminer les taux de médicaments chez les animaux. Ces prélèvements sont réalisés à une fréquence et aux volumes conformes aux recommandations éthiques en vigueur. Les animaux seront examinés quotidiennement afin de déceler tout signe clinique. Le poids corporel sera mesuré à différents temps au cours du projet. Les animaux seront euthanasiés à la fin du projet et un examen microscopique pourrait être réalisé sur les tissus collectés si nécessaire. Une mise dans des cages permettant de récupérer les fèces et les urines est parfois nécessaire, au maximum pendant 16h. Dans certaines situations, les animaux peuvent être soumis à un hébergement individuel dans leur cage mais, dans ce cas, leur environnement est amélioré. Il ne s’agit pas d’isolement : les contacts visuels, auditifs, olfactifs entre animaux sont maintenus. Lors des tests sur la fonction respiratoire, les animaux sont hébergés dans les chambres permettant l’enregistrement des paramètres respiratoires. Ils n’ont pas accès à la nourriture ni à l’eau pendant une période de 8h maximum. Lors des tests sur le système nerveux, le comportement des animaux est finement observé, avec une manipulation et une contrainte très limitée.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus correspondent aux effets pharmacologiques du produit administré (ex : action au niveau de la respiration ou du comportement), à l’inconfort, au stress et/ou à la douleur transitoires liés aux procédures (ex : manipulation et contention des animaux, administration en dose unique ou répétée). Une perte de poids peut être observée par exemple. En particulier, la mesure des paramètres respiratoires se fait alors que les animaux n’ont pas accès à la nourriture ni à l’eau. La durée maximum des enregistrements est de 8h.
Devenir
Les animaux utilisés dans le cadre de la pharmacologie de sécurité sont des animaux naïfs n’ayant reçu aucun traitement au préalable. Ces animaux sont généralement acceptés dans ces études en fonction de critères d’âges et de poids très strictes, facilitant une comparaison avec les données historiques obtenus conformément à ces critères. Enfin, pour éviter toute interaction entre plusieurs composés évalués sur un même animal, tous les animaux de ce projet seront euthanasiés à la fin de chaque étude.
Remplacement
Ce projet a pour but d’évaluer les effets indésirables de futurs médicaments sur les fonctions vitales de l’organisme, notamment la fonction respiratoire et le système nerveux. Cette évaluation doit être réalisée sur un organisme entier car les études in vitro ne sont pas une alternative. Seule l’observation sur un organisme entier permet de tenir compte de la complexité des interactions entre les différentes fonctions de l’organisme (ex : système respiratoire et système nerveux).
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe correspond toujours au minimum requis pour permettre une analyse statistique fiable, conformément à la règlementation en vigueur. D’autre part, en fonction du composé testé et de son indication thérapeutique, seul le sexe ciblé ou potentiellement sensible au composé testé est utilisé. En revanche, le plus souvent, le recours aux deux sexes s’avère nécessaire pour une évaluation d’un effet sexe sur les paramètres considérés. Ces caractéristiques sont spécifiques au produit et auront été déterminées au préalable grâce à des études préliminaires.
Raffinement
Les doses utilisées sont généralement similaires à celles envisagées chez l'Homme. En conséquence, des effets toxiques ne sont pas généralement pas attendus à ces doses physiologiques. Une habituation préalable à l’utilisation du pléthysmographe (et du cylindre de contention en cas d’administration intraveineuse) est mise en place avant le traitement. Des enrichissements sont proposés pour les animaux groupés et des enrichissements supplémentaires avec maintien du contact visuel auditif et olfactif sont proposés aux animaux hébergés individuellement, ainsi que la mise à disposition de matériaux de nidification.
Choix des espèces
Les espèces rat et souris sont des espèces de laboratoire très largement utilisée en recherche biomédicale (littérature et connaissance très larges) et sont couramment utilisées lors du développement de nouveaux médicaments. Ce sont des modèles acceptés par les autorités assurant la protection de la santé publique en évaluant les bénéfices et les risques. Le choix de l’espèce/souche est dicté par différents facteurs : résultats déjà existants (essais préliminaires in vitro et in vivo), voie d'administration et parfois sur la base des données historiques sur de médicaments similaires. De façon standard, les rats et les souris seront âgés de 6 à 10 semaines et 6 à 8 semaines, respectivement, correspondant à un développement « jeune adulte » de croissance et de développement nécessaire et suffisant pour conduire les expérimentations (capacité fonctionnelle des organes, volume circulant, etc.).
Signatures physiopathologiques des réseaux épileptogènes dans les hétérotopies corticales
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Rats : 589
Électroporées in utero après ouverture de l'abdomen de leur mère, opérées à la naissance ou à l'âge adulte par craniotomie pour recevoir électrodes ou canules, 779 souris et 589 rats vont être utilisés, dont 184 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils développent des crises d'épilepsie spontanées ou provoquées par des injections répétées d'un agent convulsivant ou par un séjour de vingt minutes dans une enceinte chauffée, avec secousses musculaires, mâchonnements et hypersalivation. Leur activité cérébrale est enregistrée trois jours par mois, pendant un à six mois selon l'espèce. Tous sont tués pour prélever le tissu cérébral, les crises provoquées qui ne cessent pas d'elles-mêmes après cinq minutes étant stoppées par injection d'une benzodiazépine.
Objectifs
Les malformations du cortex cérébral sont à l'origine d'épilepsies pharmaco-résistantes chez l’enfant et l’adolescent. L'étude des mécanismes conduisant à ces épilepsies est un défi, car les malformations corticales sont généralement diagnostiquées seulement après les premières crises. En outre, il est impossible d'accéder directement aux changements qui se produisent dans le cerveau des patients et conduisent à l'émergence et à la progression de l'épilepsie. C’est pourquoi les organismes modèles sont essentiels pour mieux comprendre cette maladie et de son évolution, et pour développer de meilleurs traitements. Dans ce projet, nous utiliserons des enregistrements électrophysiologiques pour étudier l'activité électrique du cerveau, des analyses du transcriptome pour mesurer l'expression des gènes, ainsi que des analyses histologiques et anatomiques. Cette approche combinée, multimodale, sera appliquée chez plusieurs modèles rongeurs reproduisant des malformations corticales similaires à celles rencontrées chez l’humain, et responsables de crises d’épilepsie. Cette étude nous aidera à mieux comprendre l’évolution pathologique de l'activité cérébrale, en la reliant aux régions cérébrales impliquées et aux changements dans l'expression des gènes, à des étapes cruciales de cette évolution : avant que les crises n’apparaissent, au moment des premières crises et lorsque la maladie est établie. Notre objectif à long terme est d’identifier de nouveaux marqueurs prédictifs de la progression de l’épilepsie, ainsi que des candidats potentiels pour des thérapies ciblées visant à en infléchir l’évolution.
Bénéfices attendus
Notre objectif à long terme est de mieux comprendre les réseaux responsables des crises dans les hétérotopies de la matière grise (des malformations cérébrales responsables d'épilepsie), d’identifier de nouveaux marqueurs prédictifs de la progression de l’épilepsie, ainsi que des gènes candidats ou mécanismes potentiels pour des thérapies ciblées visant à en infléchir l’évolution. Le volet expérimental présenté ici fait partie d’un projet collaboratif au périmètre plus vaste impliquant également des études cliniques menées chez des patients, permettant ainsi un dialogue fructueux entre recherche clinique et préclinique.
Procédures
Les animaux seront soumis à interventions chirurgicales réalisées sous anesthésie/analgésie : 1) pour les femelles gestantes, laparotomie afin d’exposer les cornes utérines et procéder à la transfection par électroporation (entre 30 min et 1h) ; 2) pour les jeunes adultes et les adultes, incision de la peau et implantation des émetteurs de télémétrie entre peau et muscle, incision du scalp et craniotomie pour implantation des électrodes (2h) ; 3) pour les nouveau-nés et juvéniles, incision du scalp et craniotomie pour mise en place de canules pour délivrer des vecteurs viraux (15 à 25 min). Ces interventions sont uniques et sont associés à des soins pré-, per- et post-opératoires. Les animaux seront également soumis à des protocoles d’induction de crises d’épilepsie par des moyens pharmacologiques (injections répétées toutes les 10 min de doses sous-convulsives d’un agent convulsivant, maximum 6 doses et 1h), ou par l’hyperthermie (placement dans une enceinte chauffée pendant 20 min maximum). Lorsque ces crises induites ne cessent pas spontanément après 5 min, elles sont stoppées par injection d’une benzodiazépine. Les animaux seront également soumis à des enregistrements continus et à long terme de l’activité cérébrale réalisés sous monitoring vidéo, sur des périodes de 1-3 mois pour les souris et 4-6 mois pour les rats. Ces enregistrements sont réalisés dans la cage et l’environnement de stabulation, sans contrainte (émetteurs sans fil pouvant être allumés/éteints sans contention grâce à des transpondeurs magnétiques). Ces périodes d’enregistrement durent 3 jours par mois (4-5 sessions de 3 jours sur une période de 6 mois chez le rat ; 3 sessions de 3 jours sur une période de 3 mois chez la souris).
Impact sur les animaux
Les animaux vont subir les nuisances associées aux interventions chirurgicales (laparotomie pour les femelles gestantes et l’implantation des émetteurs de télémétrie, incision du scalp et craniotomie pour implantation des électrodes et des canules), ainsi qu’à l’inconfort associé à la récupération post-chirurgie. Ces nuisances seront contrôlées par l’anesthésie et l’analgésie, ainsi que par les soins pré-, per- et post-opératoires. Les animaux vont subir des crises d’épilepsie spontanées ou induites par des moyens pharmacologiques ou l’hyperthermie. Les crises d’épilepsie spontanées du modèle rat présentant des malformations bilatérales sont des crises « absence » associées à un arrêt comportemental mais sans convulsion ni perte de conscience ni de contrôle postural. Même si elles sont très fréquentes, elles n’entrainent aucun désagrément majeur. Lorsqu’elles sont induites par des conditions favorisant leur survenue (pharmacologie, hyperthermie), les crises sont d’abord associées à des secousses myocloniques des membres et du corps, des mâchonnements, de l’hypersalivation. La phase ultime de la crise est convulsive, tonico-clonique et généralisée. Elle est associée à une perte de conscience brève et transitoire. Si les crises d'épilepsie n'entraînent pas de douleurs physiques, des blessures peuvent néanmoins survenir, liées à des chocs possibles contre les parois de l'enceinte d’observation lors des secousses myocloniques ou des convulsions. Ces blessures, très légères (ex saignements du museau suite à un choc), sont difficiles à prévenir (les parois de la cage ne peuvent pas être capitonnées afin de permettre l’observation) et ne surviennent que très rarement. De plus, les manifestations épileptiques sont peu marquées du fait de l'immaturité des animaux aux stades de développement testés (étude limitée aux stades juvéniles). La récupération post-crise fait l’objet d’un suivi attentif. Si un état de mal épileptique survient et se prolonge plus de 5 minutes, il est stoppé par injection d’une benzodiazépine. La mort de l’animal peut survenir dans de rares cas.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort pour prélèvement du tissu cérébral en vue d’analyses histologiques et anatomiques. Ces analyses sont destinées à confirmer la présence de malformations corticales et à mesurer leur position et étendue, ceci, notamment, afin de réaliser des corrélations anatomo-fonctionnelles. Ces analyses sont également destinées à mesurer l’étendue des régions cérébrales concernées par l’expression des protéines transduites par les vecteurs viraux ou confirmer le site d’implantation des canules ou des électrodes. Enfin, la mise à mort est nécessaire afin d’explanter, le cas échéant, les dispositifs expérimentaux utilisés pour les explorations fonctionnelles (implants de télémétrie, électrodes).
Remplacement
Une part importante des expérimentations est réalisée in vitro (principe de remplacement), sur tranches de tissu cérébral maintenue en survie artificielle lors d’enregistrements électrophysiologiques, ou pour des études transcriptomiques et anatomiques réalisées après extraction de tissu et préparation de spécimens histologiques. Les explorations fonctionnelles menées in vivo sont limitées aux explorations ne pouvant être effectuées que chez l’animal entier. C'est le cas des explorations liées aux crises d'épilepsie, qui nécessitent pour se manifester de préserver le contexte in vivo, permettant d'évaluer modifications comportementales liées à la crise, en plus de l'activité électro-clinique globale.
Réduction
Ce projet combine des approches multiples (moléculaires, anatomiques et fonctionnelles, in vivo et ex vivo) menées chez 4 organismes modèles (et des témoins) appartenant à 2 espèces de rongeurs au sein d’une même équipe de recherche (3 chercheurs, 1 post-doctorant, 1 doctorant, 2 ingénieurs), permettant une utilisation au plus juste des effectifs d’animaux soumis à expérimentation. Les estimations d'effectif sont faites en utilisant un outil d'estimation des effectifs basé sur le calcul de puissance et en tenant compte du taux de succès des expérimentations.
Raffinement
Les explorations fonctionnelles menées in vivo sont limitées aux explorations ne pouvant être effectuées que chez l’animal entier : il s’agit de l’enregistrement de l’activité cérébrale par électro-encéphalographie, pratiquée dans des conditions très semblables aux explorations effectuées chez les patients avec épilepsie (principe de raffinement). Ces enregistrements sont effectués par télémétrie, grâce à des transmetteurs télémétriques permettant des enregistrements sans contrainte ("sans fil"). Les transmetteurs utilisés permettent, en plus du suivi de l'activité électrique cérébrale, de suivre la température corporelle, l'activité motrice et le rythme cardiaque, ce qui garantit une surveillance continue des indicateurs cliniques. Enfin, une partie des animaux explorés fait l'objet d'un suivi vidéo continu pour surveiller les indicateurs comportementaux associés aux crises d'épilepsie.
Choix des espèces
Le rat est adapté aux études électrophysiologiques et comportementales, mais il n’existe que peu de rats génétiquement altérés. La transfection par électroporation (voir procédures) permet d’inactiver l’expression corticale de gènes d'intérêt de manière focale et de créer un cortex mosaïque au sein duquel une population altérée se développe dans un environnement sauvage. Il est ainsi possible de créer des modèles avec des hétérotopies sous-corticales semblables à celles des patients, comme des hétérotopies en bande ou des hétérotopies nodulaires. La souris est adaptée aux études électrophysiologiques et comportementales, et de nombreuses lignées génétiquement altérées sont disponibles, permettant l'étude des conséquences de l'invalidation d'un gène, dans un tissu ou un organe spécifique. Ici, nous étudierons 2 modèles d'hétérotopies induites par l'inactivation conditionnelle et restreinte au télencéphale dorsal de 2 gènes, par croisement avec une lignée Cre. Les 2 modèles présentent des hétérotopies sous-corticales et péri-ventriculaires semblables à celles des patients.
Evaluation de l’efficacité de traitements d’infections septicémiques en utilisant un modèle préclinique par ponction et ligature du caecum chez le rongeur
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 1875
Le cæcum ligaturé puis perforé au cours d'une chirurgie de 40 minutes, pour déclencher une septicémie, 1 875 souris et 1 875 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent ensuite des substances testées, parfois quotidiennement pendant quatre semaines, et jusqu'à trois prélèvements sanguins par semaine. Le porteur écrit que la douleur opératoire, la prostration, la perte de poids et le choc septique ne sont pas limités dans le temps, peuvent durer tout le projet et restent irréversibles en l'absence de traitement. Le bénéfice annoncé tient en une phrase, améliorer la santé humaine, quand tous les animaux sont tués pour des analyses in vitro et ex vivo.
Objectifs
La septicémie (ou sepsis) est une maladie grave causée par une infection qui se propage dans tout l’organisme. La réaction du corps devient alors excessive et peut endommager les organes, ce qui peut entraîner la mort. Pour mieux comprendre cette maladie et développer de nouveaux traitements, il est nécessaire d’étudier comment elle évolue dans l’organisme. Dans ce projet, nous utilisons un modèle expérimental appelé Cecal Ligation and Puncture (CLP). Ce modèle consiste à provoquer une infection contrôlée chez l’animal, permettant de reproduire les principales caractéristiques du sepsis observé chez l’humain. Ce modèle est largement utilisé car il permet d’étudier les mécanismes de la maladie et de tester de nouvelles approches thérapeutiques dans des conditions proches de celles observées chez les patients.
Bénéfices attendus
Ce projet permet d’induire une pathologie afin de tester des substances sur ce modèle. Le bénéfice attendu est donc de pouvoir développer et tester ces substances sur l’Homme afin de proposer des traitements à cette pathologie. In fine, l’objectif est d’améliorer la santé humaine.
Procédures
Tous les animaux seront soumis une seule fois à une chirurgie induisant le sepsis, via la ligature et ponction du cæcum (première poche du gros intestin, située à la jonction avec l'intestin grêle). La durée de la chirurgie est de 40 minutes/animal. L’acte chirurgical sera réalisé sous anesthésie générale et analgésie. Une substance test sera inoculée en dose unique ou répétée avant et/ou après le développement du modèle. Ces administrations peuvent être quotidiennes pendant quatre semaines maximum. Les substances sont administrées par voie sous-cutanée, intraveineuse, intradermique, intramusculaire, intrapéritonéale, ou orale. Ces administrations sont de courtes durées (5 minutes maximum). Ces administrations sont réalisées sur les animaux vigiles sauf si ceux-ci présentent un stress, il sera alors possible réaliser une anesthésie gazeuse de courte durée (5 minutes maximum). Des prélèvements sanguins sont possibles en cours d’étude ceux-ci sont de courtes durée, 5 minutes maximum. Il y aura maximum 3 prélèvements sanguins par animal par semaine.
Impact sur les animaux
Le modèle d’induction du sepsis peut générer de la douleur per et post-opératoire lié à l’incision abdominale et à la perforation du caecum, un stress lié à l’anesthésie et à la chirurgie ainsi qu’un ralentissement du transit intestinal. Les signes cliniques peuvent se manifester par une prostration, une diminution de l’activité locomotrice, une perte de poids, une diminution de la prise alimentaire et hydrique ainsi qu’une hypo ou hyperthermie. L’évolution du modèle peut conduire à un état de choc septique et une détresse respiratoire. Ces effets ne sont pas limités dans le temps et peuvent durer tout le long du projet. En l’absence de traitement, ces nuisances sont irréversibles.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, tous les animaux sont mis à mort pour réaliser des analyses in vitro et ex-vivo.
Remplacement
Le développement de produits pharmaceutiques nécessite de réaliser des expériences chez l’animal dans le cadre du développement préclinique, afin d’évaluer l’activité des produits dans un organisme complet et complexe. Des tests in vitro sont réalisés au préalable. Il est nécessaire de recourir aux animaux afin de tester une substance dans un organisme complexe. Le modèle induit décrit dans ce projet est caractérisé par des signes cliniques physiques, tel qu’une perte de poids, de la fièvre un affaiblissement de l’animal. Ces signes pathologiques et leurs résorptions ne peuvent être observés qu’avec l’utilisation d’animaux.
Réduction
Pour chaque protocole, le nombre d’animaux est réduit au minimum requis tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement fiables. Chaque groupe est composé de 15 animaux maximum. Pour obtenir un effet statistique significatif, nous avons utilisé un outil informatique pour calculer le nombre d’animaux nécessaires. Il y aura environ 10 études par année.
Raffinement
De l’enrichissement comme des bâtonnets à ronger, des huttes/tunnels, du papier kraft/coton sont ajoutés dans les cages. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux compatibles. En fonction du mode d’administration, il est possible de mettre en place une analgésie adaptée en fonction des observations quotidiennes des animaux. Le poids corporel des animaux sera enregistré une fois par jour jusqu’à la fin de l’expérience. Si nécessaire, une pesée supplémentaire par jour peut être réalisée. Les animaux sont observés quotidiennement, 2 à 3 fois par jour et un monitoring (observation du déplacement, posture, paralysie, comportement, respiration, aspect des yeux, de la peau, des poils, des muqueuses et des excrétions dans la cage) est mis en place. La perte de poids sera évaluée en fonction du poids de départ de chaque animal. Selon les essais et besoins expérimentaux, une observation de la tolérance locale (observation de l’apparition et de l’évolution d’œdème ou d’érythème) après chaque traitement peut être réalisée. Pour la chirurgie, une anesthésie générale sera réalisée. Pendant toute la durée de la procédure, les animaux sont placés sur tapis chauffants et endormis par une anesthésie générale fixe ou gazeuse. Une couverture analgésique adaptée sera appliquée en pré-opératoire et en post-opératoire. L’analgésie est adaptée en fonction de l’observation des animaux. L’analgésie pré-opératoire est complétée par une analgésie locale. Le choix de l’anesthésie dépend du produit à tester et des possibles interactions médicamenteuses. Des points limites adaptés seront mis en place.
Choix des espèces
Les rongeurs sont des mammifères de petite taille ayant des mécanismes biologiques similaires à ceux de l’Homme. Leur génotype est connu. En outre, de nombreux articles bibliographiques sont disponibles pour décrire ce modèle d'étude. Les animaux utilisés seront des adultes ou des jeunes adultes, car ils nécessitent un système immunitaire et des organes totalement développés et fonctionnels.
Maintien d’une lignée de rat modèle de mucoviscidose
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système musculosquelettique
- Système respiratoire
- Système urogénital
Porteurs par construction génétique d'une mucoviscidose, 600 rats reçoivent une alimentation modifiée et du laxatif dans l'eau de boisson depuis l'âge de dix jours jusqu'à leur mise à mort, ce qui provoque des selles molles en continu. Le niveau de souffrance déclaré est léger et le projet se limite à entretenir la lignée. Les rats sont tués pour prélèvement d'organes ou versés dans d'autres projets soumis à autorisation, sans que le RNT indique la part de chacun. Le porteur écarte les modèles drosophile et poisson zèbre, qui existent, au motif qu'ils ne renseignent ni sur le microbiote pulmonaire ni sur la fonction testiculaire, et affirme la supériorité du rat sur la souris.
Objectifs
Le projet a pour but le maintien d'une lignée de rat mucoviscidose. Ce modèle permettra de mieux comprendre la genèse de la pathologie, d'évaluer son impact sur les différents organes et sur le microbiote intestinal et pulmonaire et de proposer ou de tester des solutions thérapeutiques pour limiter l'expression de la maladie.
Bénéfices attendus
Mettre à disposition d'équipes de recherche un modèle pertient de la mucoviscidose pour répondre à leurs questions scientifiques sur le sujet.
Procédures
Les animaux recoivent une alimentation adaptée et du laxatif dans l'eau de boisson depuis l'âge de 10 jours jusqu'à leur mise à mort.
Impact sur les animaux
Les animaux recoivent une alimentation modifiée et du laxatif dans l'eau de boisson qui peuvent provoquer la production de selles molles depuis le sevrage jusqu'à l'âge de sortie du projet.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à l'issue de cette procédure en cas de prélèvement d'organes ou de matériel biologique post mortem ou ils seront inclus dans d'autres projets soumis à demande d'autorisation.
Remplacement
Pour la mucoviscidose qui touche de nombreux organes, il n'existe pas de modèle intégré in vitro reproduisant la compléxité de la pathologie et les interactions entre les différents organes touchés. Il existe des modèles drosophile et zebrafish mais qui ne permettent pas de répondre à certaines questions ( caractérisation du microbiote pulmonaire et digestif, fonction testiculaire, ...). Des expériences ont montrées une supériorité du modèle rat sur le modèle souris avec un phénotype qui se rapproche plus de celui de l'humain.
Réduction
En fonction des demandes des équipes intéressées par le modèle, des tests statistiques seront réalisés à priori pour déterminer la taille des groupes expérimentaux en vue des différentes attendues (test de puissance) et/ou des tests à posteriori pour s’assurer de la validité statistique des résultats obtenus. En cas de projets en prévision ou en préparation, la lignée sera maintenue sous forme d'animaux porteurs d’une seule mutation ce qui permet d'avoir des animaux qui n’expriment pas la maladie et avec une alimentation conventionnelle (en effet, seuls les rats porteurs de 2 mutations expriment la maladie). Cela permettra la production des animaux d'intérêt au moment de la réalisation du projet. Si aucun projet n'est en prévision, la lignée sera conservée au maximum 12 mois à l'état respirant puis sera maintenue sous forme non respirante par conservation d’embryons congelés. Le maintien de la lignée à l’état respirant sur 12 mois correspond à peu près à une génération de rat (car les rats mâles peuvent être mis en reproduction jusqu'à cet âge) et permet d'éviter la décongélation de la souche cryoconservée qui est aussi consommatrice d'animaux. En effet les animaux obtenus nécessitent des accouplements sur une génération avec des animaux non consanguins pour éviter tout accouplement frère-sœur issus des embryons ce qui pourrait introduire un biais lié à la consanguinité
Raffinement
Des grilles de score seront mises en place pour détecter une altération du bien-être des animaux et prendre des mesures correctrices grâce à des points limites qui déclencheront une action curatrice ou une mise à mort des animaux si la souffrance ne peut pas être réduite. Un antalgique sera administré en cas de signe d'expression de douleur.
Choix des espèces
Le modèle rat a montré qu'à plusieurs égards qu'il est plus pertinent que le modèle souris. Il existe des modèles drosophile et zebrafish mais qui ne permettent pas de répondre à certaines questions ( caractérisation du microbiote pulmonaire, fonction testiculaire, ...).
Validation de la valeur diagnostique d’une modification de l’ADN libre circulant dans le contexte de l’Insuffisance Rénale Aiguë chez le rat.
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
Privés de circulation sanguine dans les deux reins pendant 25 à 40 minutes, ou intoxiqués par une molécule toxique pour le rein, 225 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils passent une nuit seuls en cage métabolique sans litière, sur une grille, subissent des recueils d'urine par frottement de la vessie et des anesthésies répétées pour poser puis retirer un capteur de fluorescence fixé sur le dos. Le porteur décrit une prostration, une perte de poids et des œdèmes, et cherche à savoir si l'analyse de l'ADN circulant pourrait remplacer la biopsie rénale chez les patients. Tous sont tués pour prélever reins, cœur, foie et cerveau, le rat ayant été préféré à la souris parce qu'il fournit un volume de plasma et d'urine plus important.
Objectifs
L'insuffisance rénale aiguë (IRA) correspond à un déclin soudain de la fonction rénale, survenant dans 10 pour cent des hospitalisations et chez 50 pour cent des patients en réanimation. Un épisode d'IRA est un facteur de risque pour le développement d'une maladie rénale chronique (MRC), qui représente un fardeau majeur pour les soins de santé. Lors d'une IRA, différentes structures rénales sont agressées. Les symptômes étant similaires, l'identification de la structure lésée sur le seul tableau clinique est impossible. Connaître l'origine de l'IRA est pourtant nécessaire car cela permet d'orienter le traitement. L'identification de la structure agressée repose aujourd'hui sur l'analyse d'une biopsie rénale, réalisée sous anesthésie locale. C'est un acte invasif qui présente certains risques, comme une hémorragie rénale. De plus, cette biopsie ne peut être répétée pendant des jours consécutifs. Mettre au point une méthode diagnostique permettant d'identifier les cellules lésées et de suivre l'évolution de l'IRA représenterait une avancée majeure dans la prise en charge des patients. Lors d'une IRA, les cellules agressées vont mourir et libérer leur ADN dans la circulation et/ou l'urine. Cependant, d'autres cellules non-rénales (comme les cellules inflammatoires) libèrent de façon normale et constante leur ADN dans la circulation. Il faut donc trouver un moyen d'identifier spécifiquement l'ADN des cellules rénales. Un de ces moyens est la caractérisation de la méthylation, qui correspond à l'addition d'un groupement méthyl sur l'ADN de façon spécifique à chaque type cellulaire. Ainsi, par exemple, l'ADN d’un type de cellules rénales ne sera pas méthylé de la même façon que celui des cellules inflammatoires ou d’autres cellules rénales. Caractériser la méthylation de l'ADN présent dans le sang et/ou l'urine pourrait donc permettre d'identifier le type de cellules agressées lors d'une IRA à partir d'une simple prise de sang ou de collection d'urine. Afin de vérifier cette hypothèse, nous allons étudier trois modèles d'IRA expérimentaux chez le rat qui ciblent des structures rénales différentes. Nous analyserons la méthylation de l'ADN sanguin et urinaire à différents stades de la maladie et comparerons les résultats avec l'analyse classique de biopsie de rein.
Bénéfices attendus
Les bénéfices du projet ont un impact à la fois social et médical. Les maladies rénales sont un problème de santé publique. Une personne sur dix est en effet atteinte par une maladie rénale chronique. Une partie importante de ces malades va évoluer vers l'insuffisance rénale terminale, qui est associée à un taux de mortalité élevé. Les seuls traitements de cette insuffisance rénale terminale sont la transplantation et la dialyse, dont le coût est extrêmement élevé (4 milliards par an). Ils représentent le premier budget de la sécurité sociale en France. L'insuffisance rénale aigue est un facteur de risque de maladie rénale chronique. Il est donc absolument essentiel d'améliorer le dépistage et le suivi des patients atteints de cette maladie afin d'optimiser leur prise en charge et réduire le risque d'évolution vers la maladie rénale chronique.
Procédures
(1) Induction des modèles d’insuffisance rénale : Une partie des animaux sera soumise à une procédure chirurgicale qui consiste à priver de la circulation sanguine les deux reins pendant 25 à 40 minutes. Elle s'accompagne d'injections pour l'analgésie et l'anesthésie. Ce protocole a une durée de 40-55 minutes. Une autre cohorte d’animaux sera répartie en deux groupes distincts, chacun recevant, sous anesthésie, l’administration d’une molécule toxique pour les reins. L’induction de ces deux autres modèles ne dure que 5 minutes. (2) Prélèvements : Une partie des animaux sera soumise à un recueil d’urine par miction spontanée puis, si besoin, avec un léger frottement sur la vessie (3-10 minutes). Une autre partie sera placée en cage métabolique une nuit pour recueillir un volume plus important d'urine. Un prélèvement de sang sera réalisé sur tous les animaux, sous anesthésie générale au moment de l’euthanasie, sur un plateau chauffant : durée 5 à 10 minutes. (3) Mesure de la fonction rénale : une partie des animaux sera soumise à la mesure de leur fonction rénale par une technique qui nécessite une anesthésie gazeuse pour injecter le traceur fluorescent et installer sur le dos de l'animal un capteur de fluorescence miniaturisé. Cette partie de la procédure dure cinq minutes. Une deuxième anesthésie est nécessaire deux heures plus tard pour retirer le capteur. Cette partie de la procédure ne dure que deux minutes. La mesure sera répétée plusieurs fois sur chaque souris à des jours différents selon la procédure. (4) Tous les animaux sont euthanasiés par une méthode règlementaire.
Impact sur les animaux
Les nuisances suivantes peuvent être générées. (1) Stress lié aux manipulations régulières pour les injections et les pesées (stress lors de la contention). (2) Stress lié à passage d’une nuit en cage métabolique : animal en hébergement individuel dans un cage sans litière, sur une grille. (3) Les injections : les douleurs induites sont de courte durée mais les animaux peuvent développer une inflammation locale. (4) Les complications associées aux injections de molécules toxiques pour les reins, soit une prise de poids en raison d’œdèmes, soit une dénutrition. En règle générale, l'induction d'une insuffisance rénale sévère entraine une altération de l'état général, une prostration et une perte de poids. (5) Les complications liées à la chirurgie pouvant provoquer des douleurs malgré une mise en place d’une analgésie péri opératoire (6) Les complications liées à l'anesthésie au moment de la chirurgie, de la mesure de la fonction rénale et l'euthanasie (détresse respiratoire, arrêt cardio respiratoire, stress thermique). Ces nuisances seront réduites au maximum grâce à l'utilisation de mesures de raffinement appropriées. Elles ne peuvent pas être complètement évitées car l'induction d'une insuffisance rénale est absolument indispensable pour le projet. La possibilité d'améliorer le diagnostic et le suivi de l'insuffisance rénale aigue représentera un bénéfice important pour la santé humaine.
Devenir
Tous les animaux (225) seront euthanasiés en fin de chaque procédure, par une méthode réglementaire sous anesthésie générale par une personne expérimentée. Nous devons en effet prélever des organes (rein, cœur, foie, cerveau) pour des analyses. Ce prélèvement sera réalisé après constatation de l’absence de battements cardio-respiratoires.
Remplacement
L'objectif du projet est d'évaluer si l'analyse de la méthylation de l'ADN libre circulant est aussi informative que la biopsie rénale et de déterminer dans quel fluide (urine ou sang) cette analyse doit être effectuée. Il est donc impossible d'effectuer cette étude dans un modèle non animal.
Réduction
Des expériences préliminaires ont permis d’évaluer l’hétérogénéité inter-individuelle du paramètre principal étudié (altération de la fonction rénale) dans nos modèles d'insuffisance rénale. Pour les procédures de mise au point, des lots de 5 groupes sont nécessaires. Pour les procédures dédiées à l'analyse de l'ADN circulant, des lots de 10 animaux de maladie rénale et 5 animaux contrôles sont suffisants pour obtenir la puissance suffisante pour mettre en évidence les différences entre les groupes d’animaux, et s’assurer de la reproductibilité de ces résultats d’une série à l’autre. Les effectifs ont été calculés à partir d’un module statistique de calcul de puissance. Nous utiliserons des tests statistiques appropriés pour l'analyse des résultats. Le nombre total d'animaux est de 225 rats.
Raffinement
(1) Raffinement hébergement et surveillance. Les animaux sont acclimatés dans l'animalerie une à deux semaines avant le début de la procédure. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce concernée excepté pour une courte période d’hébergement individuel en cage métabolique. Le bien-être des animaux est assuré par une surveillance quotidienne de l’aspect et de la motricité ainsi que par une pesée quotidienne pendant toute la durée des protocoles. Le bien-être des animaux est également assuré par un enrichissement de leur environnement grâce à l'utilisation d'une litière à base de cellulose composée de plusieurs éléments, de tailles différentes (matière compacte initialement, décompactée par les animaux), de morceaux de bois à ronger et d'un dôme refuge en cellulose dans toutes les cages. En dehors d'une courte période d'hébergement individuel limité à deux heures pendant la mesure de la fonction rénale, les rats restent dans leur cage initiale dans les mêmes groupes. (2) Raffinement injections. Les injections sont réalisées par du personnel expérimenté avec des aiguilles adaptées. De plus, certaines injections sont réalisées sous anesthésie générale, sur un plateau thermostaté à 37 degrés. (3) Raffinement Chirurgie. Pour assurer le bien-être des animaux, les actes chirurgicaux s'accompagneront d'une prise en charge péri-opératoire de la douleur et d'une anesthésie appropriée. Les rats seront placés dans une couveuse pour faciliter la phase de réveil dans leurs cages initiales. De la nourriture humidifiée est mise à disposition des animaux dans la cage. Les instruments chirurgicaux sont stérilisés. (4) Raffinement anesthésie. Pour limiter les complications liées à l’anesthésie les rats sont placées sur un plateau chauffant. (5) Raffinement cage métabolique : le temps passé dans ces cages est réduit au maximum (14 heures environ, en fin de journée). Les animaux ont un accès libre à l'eau et la nourriture. (6) Des points limites associés aux injections, à la chirurgie et aux différents modèles d’insuffisance rénale du projet ont été définis.
Choix des espèces
La souris et le rat sont des modèles pertinents de maladie rénale. Nous avons choisi d'utiliser le rat plutôt que la souris car un volume important de plasma et d'urine est nécessaire pour obtenir une quantité suffisance d'ADN libre circulant pour l'analyse de la méthylation. Pour toutes les procédures, les rats sont âgés de 9 à 10 semaines car à cet âge, ils ont atteint leur maturité sexuelle, présentent un système rénal mature et ne présentent pas encore de lésions de vieillissement.
Evaluation de l’efficacité de traitements anticancéreux en utilisant des modèles précliniques chez le rongeur
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 3750
3 750 souris et 3 750 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent des cellules tumorales ou des agents cancérogènes, puis des substances testées quotidiennement pendant jusqu'à trois mois, sont hébergés seuls en cage métabolique et mis à jeun, dix d'entre eux subissant en plus une ablation des ovaires. Le porteur décrit des douleurs tumorales, des diarrhées sanglantes dans les modèles de colite et des tumeurs assez volumineuses pour limiter les déplacements, effets pouvant durer jusqu'à la fin de l'étude. Sur le remplacement, il écrit en trois phrases qu'il est "nécessaire" de tester une substance dans un organisme complexe, sans détailler les tests in vitro préalables.
Objectifs
Le projet vise à évaluer l’efficacité de traitements candidats anticancéreux dans des modèles expérimentaux. L’étude repose sur trois approches complémentaires : un modèle de tumeur implantée permettant l’analyse rapide de la réponse tumorale, un modèle de cancérogenèse colique et un modèle de cancérogenèse mammaire. L’objectif principal est d’identifier et de caractériser des composés présentant un potentiel thérapeutique, en analysant leur impact sur la croissance tumorale, l’incidence des tumeurs et leur progression. Ce projet contribuera à améliorer la compréhension des mécanismes d’action des traitements anticancéreux et à sélectionner les candidats les plus prometteurs pour un développement ultérieur.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à évaluer l’efficacité thérapeutique de substances candidates dans des modèles précliniques pertinents de cancer chez le rongeur. Ces études sont destinées à contribuer au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour la prise en charge des cancers chez l'Homme. In fine, l’objectif est d’améliorer la santé humaine.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à des administrations de cellules tumorales, d’agents carcinogènes ou de substances testées. Ces administrations seront réalisées en dose unique ou répétée avant et/ou après le développement du modèle. Ces administrations seront quotidiennes pendant plusieurs semaines, avec une durée maximale de trois mois. Les substances sont administrées par voie sous-cutanée, intraveineuse, intradermique, intramusculaire, intrapéritonéale, intranasale ou orale. Ces administrations sont de courte durée (2 minutes maximum) et sont réalisées sur animaux vigiles, sauf si un stress est observé, auquel cas une anesthésie gazeuse de courte durée peut être utilisée (5 à 10 minutes maximum). Dans les modèles de cancer mammaire et cancer colorectal, les animaux seront soumis à une administration d’un agent carcinogène suivie de cycles d’induction chimique. L’administration de l’agent carcinogène est réalisée une seule fois (2 minutes maximum). Les cycles d’induction sont réalisés via l’eau de boisson pendant des périodes de 5 à 7 jours. Une intervention chirurgicale (ovariectomie) sera réalisée une seule fois chez un groupe composé au maximum de 10 animaux. Cet acte est réalisé sous anesthésie générale et analgésie. La durée de la chirurgie est de 15 à 30 minutes par animal. Les animaux seront hébergés individuellement en cage métabolique afin de permettre la collecte des urines et des fèces. Cet hébergement implique un isolement des congénères et pourra être associé à une mise à jeun lorsque celle-ci est requise par le protocole expérimental, pour une durée de 4 à 24 heures maximum. Des prélèvements sanguins pourront être réalisés chez l'ensemble des animaux en cours d'étude ou en fin de procédure afin d'évaluer les paramètres biologiques nécessaires à l'atteinte des objectifs scientifiques de l'étude (par exemple : suivi de l'activité de la substance test, dosage de biomarqueurs ou paramètres biochimiques). Ces prélèvements sont de courte durée (5 à 10 minutes maximum) et réalisés sous anesthésie si besoin. En fin d'étude, tous les animaux seront placés sous anesthésie profonde. Sous anesthésie, les prélèvements et interventions nécessaires à l'obtention des échantillons biologiques requis pour les objectifs de l'étude seront réalisés, puis les animaux seront mis à mort sans réveil. Cette intervention dure au maximum 10 à 20 minutes.
Impact sur les animaux
Les modèles tumoraux et inflammatoires peuvent générer une douleur liée au développement des tumeurs ou à l’inflammation induite, ainsi qu’un stress lié aux administrations répétées et aux manipulations. Les administrations de substances peuvent également entraîner des réactions locales au point d’injection (rougeur, irritation, inflammation). Les signes cliniques peuvent se manifester par une diminution de l’activité locomotrice, une perte de poids, une diminution de la prise alimentaire et hydrique, une altération de l’état général, ainsi que des modifications du pelage. Dans les modèles de colite, des diarrhées, parfois associées à la présence de sang, peuvent être observées. Le développement tumoral peut entraîner une gêne fonctionnelle en fonction de la localisation et de la taille des masses, pouvant aller jusqu’à une limitation des déplacements. Les interventions chirurgicales peuvent induire une douleur post-opératoire ainsi qu’un stress lié à l’anesthésie et à l’acte chirurgical. Ces effets peuvent apparaître progressivement au cours de l’étude et durer plusieurs jours à plusieurs semaines, voire jusqu’à la fin du projet. Une partie de ces effets est réversible avec l’arrêt des procédures ou avec la mise en place de traitements adaptés.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, tous les animaux sont mis à mort pour réaliser les prélèvements nécessaires aux analyses biologiques/biochimiques qui permettront d’atteindre les objectifs du projet.
Remplacement
Le développement de produits pharmaceutiques nécessite de réaliser des expériences chez l’animal dans le cadre du développement préclinique, afin d’évaluer l’activité des produits dans un organisme complet et complexe. Des tests in vitro sont réalisés au préalable. Il est nécessaire de recourir aux animaux afin de tester une substance dans un organisme complexe.
Réduction
Pour chaque protocole, le nombre d’animaux est réduit au minimum requis tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement fiables. Chaque groupe est composé de 10 animaux au maximum, conformément aux pratiques couramment décrites dans les modèles tumoraux précliniques et aux données historiques internes. Pour obtenir un effet statistique significatif, nous avons utilisé un outil informatique pour calculer le nombre d’animaux nécessaires.
Raffinement
De l’enrichissement comme des bâtonnets à ronger, des huttes/tunnels, du papier kraft/coton sont ajoutés dans les cages. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux compatibles. Certains modes d’administration des substances nécessiteront la mise en place d’une analgésie adaptée. En fonction du projet, le poids corporel des animaux sera enregistré deux fois par semaine jusqu’à la fin de l’expérience. Si nécessaire, une pesée plus régulière sera réalisée. Les animaux sont observés quotidiennement et un monitoring (observation du déplacement, posture, paralysie, comportement, respiration, aspect des yeux, de la peau, des poils, des muqueuses et des excrétions dans la cage) sera mis en place chez les animaux présentant des signes cliniques susceptibles d'affecter leur mobilité ou leur état général, afin de renforcer le suivi du bien-être animal. La perte de poids sera évaluée en fonction du poids de départ de chaque animal. Selon les essais et besoins expérimentaux, une observation de la tolérance locale (observation de l’apparition et de l’évolution d’œdème ou d’érythème) après chaque traitement sera réalisée. Des points limites spécifiques sont développés pour chacune des procédures décrites. Pour la chirurgie, une anesthésie générale sera réalisée. Pendant toute la durée de la procédure, les animaux sont placés sur des tapis chauffants et endormis par une anesthésie générale fixe ou gazeuse. Une couverture analgésique adaptée sera appliquée en pré-opératoire et en post-opératoire. L’analgésie est adaptée en fonction de l’observation des animaux. L’analgésie pré-opératoire est complétée par une analgésie locale. Le choix de l’anesthésie dépend du produit à tester et des possibles interactions médicamenteuses. Des points limites adaptés seront mis en place.
Choix des espèces
Les rongeurs sont des mammifères de petite taille ayant un des mécanismes biologiques similaires à ceux de l’Homme. Leur génotype est connu. En outre, de nombreux articles bibliographiques sont disponibles pour décrire ce modèle d'étude. Les animaux utilisés seront des adultes ou des jeunes adultes, car ils nécessitent un système immunitaire et des organes totalement développés et fonctionnels.
Décrypter les mécanismes biologiques de la radiothérapie spatialement fractionnée sur la réponse vasculaire et immunitaire chez la souris et le rat
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Rats : 1780
Les animaux qui montrent des signes cliniques anormaux plus de trois jours sont mis à mort. 1 780 souris et 1 780 rats vont être utilisés dans ce projet, dont 2 720 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués pour prélever poumons et cerveau. Les souris reçoivent une irradiation du thorax qui peut provoquer fibrose, rougeurs, croûtes, détresse respiratoire et mort au bout de cinq à six mois, les rats une irradiation du crâne suivie de dépilations et d'ulcérations pendant cinq à six jours. La rubrique décrivant les procédures reste à l'état de formulaire, l'instruction "pour chaque intervention préciser : durée, nombre de fois et nombre d'animaux concernés" y figurant en lieu et place des réponses.
Objectifs
La radiothérapie est un traitement largement utilisé contre le cancer. Elle repose sur l’irradiation ciblée des tissus tumoraux afin de détruire les cellules cancéreuses ou de limiter leur progression, tout en cherchant à préserver au mieux les tissus sains situés à proximité. Malgré les progrès techniques importants réalisés ces dernières années, les effets indésirables sur les tissus non ciblés restent une contrainte majeure de ce type de traitement. Dans ce contexte, il apparaît nécessaire d’explorer de nouvelles approches permettant d’améliorer le rapport entre l’efficacité du traitement et la protection des tissus sains. Parmi ces approches, certaines visent à modifier la manière de déposer la dose dans le volume irradié. Ces stratégies innovantes s’écartent volontairement des pratiques conventionnelles en proposant une distribution volontairement non homogène du traitement. Des travaux antérieurs menés dans différents modèles expérimentaux ont montré que ce type d’approche pourrait à la fois améliorer le contrôle de la maladie et réduire les atteintes aux tissus sains. Des résultats encourageants ont également été observés dans des contextes cliniques exploratoires, suggérant un fort potentiel de transfert vers une utilisation thérapeutique plus large. Cependant, les mécanismes biologiques à l’origine de ces effets favorables restent encore insuffisamment compris. Une meilleure connaissance de ces phénomènes est indispensable pour sécuriser, optimiser et étendre l’utilisation de ces nouvelles modalités de traitement. Ainsi, l’objectif principal de ce projet est d’améliorer la compréhension des réponses biologiques induites par cette approche innovante, en s’intéressant plus particulièrement aux réactions des vaisseaux et du système immunitaire. Ces connaissances permettront d’évaluer le potentiel thérapeutique de cette stratégie et de contribuer à terme au développement de traitements plus efficaces et mieux tolérés.
Bénéfices attendus
Les enjeux autour de ces nouvelles techniques de radiothérapie (SFRT) sont nombreux : • Anticiper leur déploiement rapide, voire imminent, en pratique clinique. • Questionner la justification de ce type de techniques en termes de radioprotection des patients, puisqu’elle repose sur un changement de paradigme important. • Saisir l’opportunité du positionnement de l’institut et de la France autour de cette question Acquérir des connaissances et des compétences autour des concepts liés aux modifications du volume d'irradiation pour alimenter l’expertise concernant la radioprotection des patients.
Procédures
- Irradiations sous anesthésie - Prélèvements de sang sous anesthésie - Imagerie scanner sous anesthésie - Echo doppler sous anesthésie Pour chaque intervention préciser : durée, nombre de fois et nombre d’animaux concernés
Impact sur les animaux
Des effets indésirables pourront être occasionnés par l’exposition aux rayonnements ionisants. Pour le modèle souris, les irradiations localisées au niveau des poumons pourront conduire à de la fibrose radio-induite aux temps tardifs (plus de trois mois post-irradiation). Les souris pourront également développer des lésions cutanées (rougeurs, érythèmes, croutes) suite à l’irradiation. Aux temps les plus tardifs de l’étude (5-6 mois post-irradiation), les animaux pourraient être en détresse respiratoire voire décéder. Les animaux devront donc être surveillés de près et euthanasiés en cas d’atteinte importante de leur bien-être, comme une perte de poids, une mobilité réduite. Concernant le modèle d’irradiation localisée cérébrale chez le rat, suite à l’irradiation des signes de détresse ou de mal-être peuvent apparaître, suivis d’une perte de poids et d’une réduction de la mobilité pendant quelques jours (3 à 5 jours). Les animaux peuvent présenter des dépilations voire des croutes et même des ulcérations sur le dessus de la tête, à l’endroit de l’irradiation pendant quelques jours (5 à 6 jours). Pour les deux modèles, compte-tenu de l’objectif qui est d’étudier la réponse vasculaire pulmonaire de ces nouvelles stratégies thérapeutiques, il est nécessaire de fixer un temps d’étude long, ici de 6 mois, pour toutes les études envisagées.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés, les organes d’intérêt (poumon, cerveau notamment) seront prélevés pour des analyses histologiques ou moléculaires.
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative non animale à ce jour concernant l’étude de la réponse moléculaire des cellules endothéliales et immunitaires dans leur environnement tissulaire complet, qui joue un rôle sur la réponse moléculaire des cellules. L’utilisation d’animaux vivants est indispensable à cette étude.
Réduction
Les modèles d’expérimentation pour l’étude des lésions pulmonaires et cérébrales tardives radio-induites sont fortement influencés par la physiologie des animaux. Dans le but d’effectuer des tests statistiques sur les analyses histologiques, des microscanners, des analyses moléculaires, des groupes de 20 animaux sont nécessaires. Nous avons déterminé le nombre d’animaux par groupe à l’aide d’un logiciel statistique. Pour mettre en évidence une différence de 25%, biologiquement significative, entre groupes traités et groupes témoins, il nous faudra inclure 20 animaux par groupe. Dans certains cas, le nombre d’animaux contrôle est augmenté car toutes les irradiations ne peuvent pas être réalisées le même jour. Les animaux seront suivis 6 mois maximum.
Raffinement
Un délai minimum d’une semaine est respecté entre la réception des animaux et la mise en place des procédures expérimentales pour leur permettre de s’adapter à leur nouvel environnement. Tous les animaux du projet seront surveillés afin de vérifier que la perte de poids ne dépasse pas 20 % du poids du groupe témoin Ils seront pesés 2 fois par semaine semaines après l’irradiation. Des observations de signes comportementaux et cliniques (absence de mobilité, de réactivité, prostration, signes de détresse respiratoire) seront effectuées. L’observation de signes comportementaux ou cliniques anormaux pendant plus de 3 jours entraînera l’euthanasie. Lors des irradiations, afin d’assurer un meilleur réveil, les animaux seront placés en thermacage dès la fin de l’irradiation. Des poches d’eau gélifiées ainsi que des croquettes seront également placés dans les cages de transport. Les souris pouvant montrer des signes d’agressivité, des enrichissements supplémentaires seront mis dans les cages (bâtonnet en bois, dôme en carton, coton, papier kraft si nécessaire).
Choix des espèces
Dans le cadre de ce projet nous utiliserons des rats et des souris qui sont des modèles les plus utilisés pour les modèles précliniques. Le modèle d’irradiation thoracique chez la souris est un modèle très utilisé depuis de nombreuses années au sein du laboratoire pour comprendre le rôle de l’endothélium vasculaire dans les lésions pulmonaires radio-induites. Le modèle d’irradiation cérébrale rat est un modèle maitrisé par nos collaborateurs du projet qui participeront aux expériences. Nous choisissons des animaux de même âge, et jeunes adultes, pour éviter l’éventuelle hétérogénéité de la réponse liée à l’âge. Il s’agit de la gamme d’âge classiquement utilisée pour ces modèles d’irradiation localisée. Comme tenu du potentiel caractère agressif des souris mâles, notamment en vieillissant, ils seront hébergés par 3 à 4 avec un enrichissement augmenté par rapport aux standards de l’animalerie. En cas de bagarres et/ou de blessures, les animaux pourront être hébergés en cages individuelles.
Évaluations précliniques de nouvelles stratégies thérapeutiques contre les infections multirésistantes bactériennes, fongiques ou virales MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Rats : 1500
Quatre-vingt-dix études prévues sur cinq ans mobilisent 5 250 souris et 1 500 rats, tous tués à l'issue, dont 3 600 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Les animaux sont infectés une fois par un virus, une bactérie ou un champignon, puis traités une à quatre fois par jour pendant dix jours, avec pesées quotidiennes et prélèvements de sang hebdomadaires sous anesthésie. Selon les protocoles, ils reçoivent un cathéter intra-urétral, une administration intranasale ou une lésion cutanée provoquée, et développent fièvre, perte de poids, détresse respiratoire et mobilité réduite. Le rat est retenu parce que sa taille permet des prélèvements de sang répétés plus abondants, la souris parce que les lignées transgéniques y sont nombreuses.
Objectifs
Le projet propose l’évaluation préclinique de composés anti-infectieux pour déterminer leur efficacité contre des agents pathogènes, incluant des virus, des bactéries et des champignons. L’objectif principal est d’explorer le potentiel thérapeutique de ces traitements pour la diminution de la résistance aux antibiotiques et la découverte de traitement contre les infections virales et fongiques dans les secteurs de la santé humaine et animale. Le nombre d'étude envisagées sur 5 ans est 90. L'efficacité des traitements sera mesurée à travers des tests biologiques et cliniques sur les modèles animaux, en évaluant leur capacité à éliminer ou inhiber la prolifération des agents infectieux, tout en favorisant une réponse immunitaire appropriée. Ce projet s’inscrit dans une démarche de développement de nouvelles solutions thérapeutiques, dans une perspective de prévention et de traitement des infections.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont multiples avec un impact significatif sur la santé humaine et animales. En développant des composés anti-infectieux, le projet vise à répondre à des besoins non satisfaits dans la lutte contre les infections virales, bactériennes et fongiques, en particulier face à la résistance antimicrobienne et aux effets secondaires des traitements existants. Le projet permettra de concevoir de nouveaux traitements ciblant plus efficacement les infections, en particulier dans les contextes où les thérapies actuelles échouent. Cette innovation pourrait améliorer la gestion des infections résistantes et des maladies difficiles à traiter. Les résultats du projet auront un impact direct sur la santé humaine et animale, en réduisant la prévalence des infections et la résistance aux traitements, contribuant ainsi à améliorer la santé publique. A court terme, ce projet permettra l'identification rapide de composés prometteurs ayant une activité anti-infectieuse spécifique et une compréhension fine de la physiopathologie infectieuse, en particulier les interactions hôte-pathogène et les réponses immunitaires induites. A long terme, ces recherches autoriseront le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour des infections graves ou résistantes alternatives aux antibiotiques. La réduction de la mortalité et de la morbidité associées aux infections bactériennes, fongiques ou virales, en particulier dans les populations à risque (immunodéprimés, enfants, patients hospitalisés), favorisera l'amélioration de la préparation face aux pandémies par la mise au point de traitements adaptables à différents pathogènes et des avancées scientifiques transversales profitant à d’autres domaines (cancérologie, immunologie, microbiome, médecine personnalisée).
Procédures
Le projet implique une seule administration des virus, bactéries ou champignons pour l'ensemble des protocoles. Cette procédure n'excède pas 15 secondes pour chaque animal et est réalisée sous anesthésie gazeuse. Les traitements avec les composés testés sont de 1 à 4 fois par jour pendant 10 jours maximum. Ce geste n'excède pas 10 secondes par animal. Pour l'ensemble des protocoles, des pesées journalières sont réalisées ; pour chaque souris, une contention de 20 secondes maximum est nécessaire pour cette mesure. Enfin, des prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse (pendant 1 minute) sont pratiqués pour la mesure des paramètres inflammatoires. En prenant en compte le temps de récupération des souris, le nombre maximum de prélèvement est de 1 fois par semaine pour l'ensemble des procédures. 30 minutes avant le prélèvement, un traitement avec un analgésique est pratiqué pour réduire la douleur ; ce traitement est également réalisé pour les installations de cathéters et la génération de lésions cutanées.
Impact sur les animaux
Les nuisances principales concernent la douleur et l'inconfort induits par les injections, les inflammations et l'infection. Des efforts sont faits pour limiter ces impacts en suivant des protocoles de réduction de la douleur et du stress. L'anesthésie avec l'isoflurane induit un stress de courte durée (15 secondes). Les piqûres d’aiguille pour infecter ou traiter les animaux entraînent une douleur légère de courte durée (2 secondes). Lors d'infection urinaire l'installation d’un cathéter intraurétral peut induire une inflammation locale de la vessie, causant un léger inconfort temporaire (1 minute). L'administration par voie intranasale de molécules peut entraîner une inflammation : douleur modérée (10 secondes). La génération de lésion cutanée (modèle cicatrisation) induit une douleur importante de 2minutes ; cet effet indésirable majeur sera contrôlé par analgésique et anesthésie. L'infection par des agents pathogènes induit la pathologie avec des symptômes attendus comme la fièvre, la perte de poids, la diminution de la prise alimentaire et hydrique, détresse respiratoire et une mobilité réduite. Ces symptômes sont causés par la maladie elle-même, ce qui constitue une altération de l'état général de l'animal. La préhension répétée, bien que de courte durée (20 secondes), peut être perturbant pour les animaux et induit un stress, mais il est géré en limitant la fréquence et la durée de ces manipulations. Ceci peut affecter le bien-être psychologique des animaux pendant la durée de la manipulation. UNE PRIVATION DE NOURRITURE DE PLUSIEURS HEURES PROVOQUE UN STRESS MÉTABOLIQUE MARQUÉ PAR UNE CHUTE DE LA GLYCÉMIE ET UNE HAUSSE DES HORMONES DU STRESS. CET ÉTAT DÉCLENCHE UNE ALTÉRATION COMPORTEMENTALE, OSCILLANT ENTRE UNE AGITATION ANXIEUSE ET UNE LÉTHARGIE. LES SOURIS AYANT DES MALADIES METABOLIQUES AURONT PLUS DE NUISANCE, COMME L'ETAT GENERAL ET LA MOBILITE. LES NUISANCES ATTENDUES SONT LES SIGNES CLINIQUES DETAILLE DANS L'ANNEXE 1.
Devenir
A la fin de chaque procédure tous les animaux sont mis à mort et des prélèvements d'organes et de sang sont réalisés pour des mesures de charge microbienne, de paramètres inflammatoires et des études d'histologie.
Remplacement
Préalablement à toute utilisation d'animal, nous intègrons dans nos projets des modèles in vitro, tissulaires et des organoïdes, afin de réduire le nombre d'animaux utilisés et d’optimiser les essais précliniques. Il existe plusieurs alternatives non animales dans la recherche sur les maladies infectieuses et inflammatoires, mais elles ne peuvent pas remplacer totalement les tests sur les animaux utilisés dans ce projet. 1. Modèles in vitro : Les cultures cellulaires humaines ou animales permettent d’étudier des interactions cellulaires et les réponses inflammatoires. Cependant, elles ne peuvent pas reproduire la complexité d'un organisme entier, notamment les interactions multicellulaires complexes et la réponse immunitaire systémique. 2. Modèles ex vivo : Les tissus humains ou animaux (biopsies, organes) permettent d’étudier des processus biologiques en conditions plus réalistes, mais il manque des interactions entre plusieurs systèmes organiques, essentiels pour comprendre les maladies infectieuses et inflammatoires. 3. Modèles organoïdes et organes sur puce : Ces systèmes imitent des organes comme les poumons ou les reins pour étudier les réponses biologiques. Cependant, ils ne peuvent pas reproduire la réponse systémique d'un organisme complet. 4. Modélisation informatique : Les simulations informatiques peuvent modéliser certaines interactions pathogènes et immunitaires, mais elles ne peuvent pas simuler toutes les réactions biologiques complexes d'un organisme vivant. Ces alternatives ne peuvent pas complètement remplacer les animaux, pour les raisons suivantes : • Complexité biologique : Les modèles non animaux ne peuvent pas reproduire la complexité d’un organisme vivant complet, limitant leur capacité à simuler des réponses biologiques globales. • Interactions systémiques : Les maladies infectieuses et inflammatoires nécessitent l'étude des interactions complexes entre les systèmes biologiques, ce qui ne peut être simulé sans un modèle vivant.
Réduction
Nous intègrons dans notre projet des modèles in vitro, tissulaires et des organoïdes, afin de réduire le nombre d'animaux utilisés et d’optimiser les essais précliniques. Les modèles in vitro et tissulaires permettent de tester les composés anti-infectieux et immunomodulateurs sur des cultures cellulaires et tissulaires, évaluant leur efficacité, leur innocuité et leurs mécanismes d’action avant tout essai in vivo. Les organoïdes reproduisent des structures d’organes spécifiques, comme les poumons, la vessie et les reins, permettant d’étudier la réponse des tissus aux infections et traitements dans un environnement plus réaliste. En combinant ces approches, nous contribuons à la réduction des expérimentations animales, tout en garantissant la précision des résultats. Cette approche permet d'identifier les composés les plus prometteurs et de maximiser l'efficacité des traitements contre les infections virales, bactériennes et fongiques. De façon systématique des analyses statistiques sont effectuées pour déterminer le nombre d’animaux optimal afin de produire des résultats robustes pour chaque end point: généralement la charge virale, bactérienne ou fongique dans les organes ciblés, analyse de la survie, mesure de biomarqueurs (exemple: biomarqeur hépatique) et évaluation de l'inflammation.
Raffinement
Dans les expérimentations pour les maladies infectieuses et inflammatoires, la fréquence de surveillance des animaux est essentielle pour garantir leur bien-être. Les signes de détérioration de l’état de santé, sont particulièrement surveillés par l'observation de points limites en raison des effets des infections et inflammations. Après l'infection ou l'administration de traitements, une surveillance plus rapprochée (toutes les 2 à 4 heures) est mise en place dans les premières 12 heures, pour détecter rapidement des signes de détresse. Des critères d'arrêt stricts sont définis pour éviter la souffrance excessive des animaux. L’objectif est de garantir que l’état de l’animal est constamment suivi et que des soins vétérinaires sont fournis dès que nécessaire. La prévention du stress est intégrée au protocole expérimental par l'utilisation d'une anesthésie gazeuse et administration d'analgésique au préalable des gestes douloureux (injection par piqure...).
Choix des espèces
En infectiologie, les souris sont le modèle le plus documenté pour les infections bactériennes, fongiques et virales. Leur système immunitaire, bien caractérisé et très proche de celui de l’humain, permet l’analyse fine de la réponse hôte. Il y a une grande disponibilité de lignées transgéniques, utiles pour étudier des voies spécifiques des défenses immunitaires. Les rats ont une taille corporelle supérieure à celle de la souris, permettant des prélèvements répétés de sang en quantité suffisante pour des dosages biochimiques, hématologiques ou pharmacocinétiques. Ils présentent une meilleure tolérance aux manipulations, ce qui les rend adaptés aux études de suivi prolongé, à administration chronique. Les modèles infectieux bien établis pour certaines pathologies spécifiques, comme les infections pulmonaires et urinaires, sont parfois plus représentatifs chez le rat que chez la souris. Les animaux utilisés dans le cadre des modèles de pathologies infectieuses sont des jeunes adultes, âgées de minimum de 6 à 10 semaines. Ce stade de développement correspond à une maturité immunologique, métabolique et physiologique optimale, ce qui en fait un modèle préclinique pertinent et standardisé pour l’étude des maladies infectieuses et inflammatoires humaines. A partir de la 6e semaine, les animaux présentent un système immunitaire complet (réponses innée et adaptative), permettant une réponse fiable aux agents pathogènes étudiés (bactéries, virus, champignons). Les animaux sont sevrés, stabilisés, et moins sujets aux fluctuations hormonales ou de croissance rapides, ce qui renforce la reproductibilité expérimentale. La morphologie permet des manipulations techniques précises (voies d’infection, prélèvements sanguins, administration de traitements). La majorité des publications scientifiques et des recommandations réglementaires utilisent ce stade pour modéliser des infections systémiques, respiratoires, digestives ou cutanées.
Utilisation d’animaux dans le cadre de la formation et du perfectionnement des expérimentateurs aux gestes techniques et aux techniques chirurgicales chez les rongeurs
- Formation professionnelle
Rats : 500
Former le personnel de l'établissement aux gestes techniques, y compris pour répondre aux demandes de clients, justifie l'utilisation de 500 souris et 500 rats, tous tués à l'issue. 200 d'entre eux sont opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil, les autres relevant de procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Chaque animal peut subir jusqu'à trois gestes différents par semaine pendant quatre semaines consécutives, injections, prélèvements de sang, d'urine ou de liquide synovial, ou chirurgie avec réveil. Le remplacement "ne peut pas être assuré" et le recours à des animaux vivants est "nécessaire et indispensable", écrit le porteur, qui précise par ailleurs que les sutures s'apprennent sur peau artificielle et les chirurgies sur cadavres décongelés.
Objectifs
Les recherches menées au sein de notre laboratoire, ainsi que les demandes faites par les clients vont nous amener à former notre personnel sur des techniques d’expérimentation animale. L’objectif du projet est d’avoir du personnel formé mais également que chaque expérimentateur conserve son niveau technique tout au long de l’année. Quel que soit le geste, une injection ou une technique de chirurgie invasive, la formation et l’entraînement des expérimentateurs est très importante. En effet, un expérimentateur formé et entraîné sera confiant, moins stressé, ce qui limitera/induira moins de stress chez les animaux et permettra par ailleurs une meilleure homogénéité des gestes et techniques ainsi qu’une meilleure reproductivité. Les animaux utilisés seront des rats et des souris âgés de 0 à 2 ans mâles ou femelles. Tous ces critères seront choisis en fonction du geste technique à effectuer et du protocole pour lequel l’entraînement ou la formation sera attribué. Cette saisine comprend 3 procédures : Procédure 1 : Formation en expérimentation animale avec une sévérité de classe légère. Cette procédure concernera essentiellement les formations et entraînements qui n’auront pas ou peu d’impact sur le bien-être des animaux. A titre d’exemple, les gestes techniques pourront être des administrations de solvant, des prélèvements de sang, d’urine, de liquide synovial. Procédure 2 (sans réveil) et Procédure 3 (avec réveil) : Formation en expérimentation animale avec une sévérité de classe modérée. Cette procédure concernera toutes les formations et entraînement qui auront au maximum un impact modéré et surtout réversible sur les animaux. A titre d’exemple, cette procédure sera utilisée pour les formations et entrainement aux chirurgies pour lesquelles une douleur post-opératoire transitoire sera présente.
Bénéfices attendus
Ce projet, prévue sur 5 ans, permettra de former les expérimentateurs, de les entraîner et de maintenir et développer leurs compétences/niveau d’expertise sur nos techniques d’expérimentations animales. Ces formations permettent aux expérimentateurs d’acquérir des gestes techniques parfaitement maîtrisés. Ceux-ci visent à limiter au maximum l’inconfort et l’anxiété de l’animal pendant l’expérimentation. De plus, la qualité des résultats expérimentaux obtenus dans les études sera améliorée par la maîtrise de ces gestes et permettra de ne pas réaliser ces expérimentations sur un plus grand nombre d’animaux que nécessaire (réduction du nombre d’animaux utilisés).
Procédures
Selon la procédure à laquelle est affecté l'animal, les interventions pourront être : - des administrations de solvant sur animal vigile ou anesthésié (Procédure 1), 2 fois maximum par semaine, - des prélèvements de sang, d'urine ou de liquide synovial sur animal vigile ou anesthésié (Procédure 1), 1 fois maximum par semaine et dans le respect des volumes maximum recommandés, - un geste chirurgical sans réveil (Procédure 2) ou avec réveil (Procédure 3) sur animal anesthésié et avec une prise en charge de la douleur et un suivi post-opératoire adaptés à la chirurgie pratiquée.
Impact sur les animaux
Les gestes ou actions expérimentales effectuées par une personne peu expérimentée peuvent générer du stress, un inconfort ou une douleur locale. Des effets indésirables attendus liées au geste chirurgical, seront suivis avec rigueur. Plus précisément, nous surveillerons l'état général et clinique des animaux pour estimer une éventuelle gêne ou douleur occasionnée par l’acte chirurgical, tel qu’un traumatisme et une inflammation au niveau de la zone opérée. Aucun signe clinique n’est attendu suite à l’administration de solvant ou le prélèvement de sang sauf un petit hématome au point d’injection ou de prélèvement qui ne doit pas persister sur du long terme.
Devenir
Les mêmes animaux utilisés pour la formation de l’administration peuvent être également utilisés pour les formations de prélèvement. Un maximum de 3 gestes (différents) par semaine, par animal et sur un maximum de 4 semaines consécutives ne sera pas dépassé. Dans la mesure de possible, les animaux sont utilisés pour collecter des organes ou du plasma à la fin de l’ensemble des procédures. A l’issue de chaque procédure tous les animaux seront humainement mis à mort et autopsiés minutieusement. Les organes d'intérêts, dont les pièces osseuses, seront prélevés. Les prélèvements sanguins et urinaires pourront être utilisés pour doser un marqueur en lien avec le modèle/la chirurgie. Une analyse macroscopique des organes sera réalisée et différents tissus et organes pourront être prélevés en vue de réaliser des analyses histologiques, des analyses par imagerie micro-CT, et/ou des analyses moléculaires.
Remplacement
Le remplacement ne peut pas être assuré car nous avons besoin des animaux vivants pour pouvoir les manipuler et réaliser le geste (chirurgical ou non), faire un suivi post-opératoire et anticiper toute réaction de l’animal lors de nos protocoles par la suite. Aucune méthode alternative ne permet actuellement de reproduire tous les paramètres physiologiques qui sont liés à un individu dans sa globalité. L'utilisation de modèles animaux vivants est donc nécessaire et indispensable.
Réduction
Pour la mise en place de la Procédure 2 (sans réveil) et de la Procédure 3 (avec réveil), le personnel s’entraîne au préalable sur du cadavre animal décongelé ou sur de la peau artificielle (sutures). Le nombre d’animaux est choisi en tenant compte du nombre nécessaire et suffisant pour avoir du personnel formé, compétent et sûr de lui. Le nombre d’animaux vivants est réduit au maximum (en effet tout ce qui peut être réalisé sur cadavre ou sur peau artificielle (comme les sutures) est mis en œuvre) afin d’avoir des expérimentateurs suffisamment entraînés et en maîtrise des gestes techniques (chirurgies, administrations et prélèvements), permettant la mise en place de gestes standardisés et reproductibles dans les études, permettant d’éviter tout éventuel risque de surmortalité pendant les phases d’anesthésie, de chirurgie et d’administration.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes sociaux dans des locaux adaptés permettant leur maintien dans un environnement adéquat et induisant le minimum de stress. Des mesures spécifiques et adaptées aux douleurs éventuelles occasionnées par les différents gestes pour éviter toute souffrance inutile et prolongée seront mises en place. Les conditions d’hébergement seront optimisées : les animaux seront hébergés en groupe (au maximum 4 rats ou au maximum 5 souris par cage avec de la litière en chips spécifique) avec un enrichissement du milieu (tunnel en PVC transparents rouge, carré de cellulose, bâton de bois ou billes de bois, kraft), un accès facilité à la nourriture (quand nécessaire) et/ou ajout de nourriture appétente, et seront surveillés bi-quotidiennement les jours ouvrés et quotidiennement les week-end et jours fériés. Les formations seront données par du personnel expert afin d’assurer au mieux les contentions, les manipulations et les gestes techniques afin d’éviter tout stress et limiter toute souffrance pour l’animal. Par ailleurs, l’acquisition des gestes chirurgicaux sera en priorité acquis initialement sur des cadavres d’animaux décongelés et maîtrisés sur des animaux anesthésiés sans réveil avant une validation finale sur des animaux avec réveil et suivi post-opératoire. Pour tous nos protocoles, y compris les animaux de formation, une grille de points limites est mise en place. La mise en place d’un traitement analgésique et/ou anti-inflammatoire préventif et/ou curatif seront également mis en place en fonction du type d’entraînement. Les animaux seront maintenus le minimum de temps dans une situation d’inconfort et de douleur. Un suivi sera mis en place afin d’avoir l’historique des gestes effectués sur chaque animal tout au long de sa vie dans notre animalerie. Cela nous permettra de nous assurer qu’un temps de récupération nécessaire a été respecté entre deux gestes effectués sur un même animal (respect du délai entre deux prélèvements de sang, entre deux administrations…).
Choix des espèces
Sous le couvert de la réglementation française, le stade de développement des animaux sera défini avant chaque type d’entraînement sur des animaux âgés de 0 à 2 ans. Les besoins de formation et d’entraînement au sein de notre établissement sont sur les espèces de rat et de souris.
Traitements innovants des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Rats : 2400
7 720 souris et 2 400 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une colite est provoquée chez chaque animal, avec perte de poids puis diarrhées et baisse d'activité, avant d'appliquer une lumière UV dans le colon, d'injecter des leurres apoptotiques synthétiques ou d'administrer des nanovecteurs. Aucun analgésique ne leur est donné, le porteur indiquant que les anti-inflammatoires modifieraient la motilité intestinale et le mécanisme inflammatoire étudiés. Les animaux dont le score clinique passe en sévère sortent de l'étude et sont mis à mort, une quantité importante de sang étant prélevée sur les autres au moment de leur propre mise à mort.
Objectifs
Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) touchent un nombre croissant de patients en France et dans le monde. Elles ont un impact important sur la qualité de vie tant sur le plan physique que psychologique et social. L’apparition des MICI chez l’Homme est très souvent due à une dérégulation du système immunitaire. Lors d’une agression pathogène physique ou chimique, une inflammation va se créer au niveau de l’intestin. Dans certain cas, cette inflammation va persister et ainsi provoquer une inflammation chronique. L'objectif de ce projet consiste à évaluer de nouvelles approches thérapeutiques ayant déjà montré un intérêt après évaluation dans des modèles simplifiés in vitro. Une première approche consiste à appliquer une lumière UV in situ au niveau de la lésion du colon. Cette exposition va permettre d’induire une mort cellulaire programmée, nommée apoptose, de certaines cellules sur le site de l’inflammation et ainsi de ré-engager la résolution de l’inflammation ainsi que la réparation tissulaire. Des premiers résultats encourageants montrent une amélioration du score clinique des animaux après traitement. Il est donc essentiel de continuer ces travaux pour comprendre afin d’améliorer, et rendre cette thérapie accessible aux patients. La deuxième approche consiste à appliquer des particules imitant les cellules en mort programmée pour ré-engager la résolution et la réparation tissulaire. Pour cela différentes formulations des leurres apoptotiques synthétiques devront être testées afin de se rapprocher au mieux de la cellule apoptotique physiologique. La troisième partie est orientée sur la formulation de substances actives pour en améliorer leur efficacité et leur tolérance. Pour cela, différents nanovecteurs seront développées afin de renforcer l’activité de l’actif thérapeutique par le biais d’un meilleur ciblage de la lésion inflammatoire permettant ainsi de pouvoir administrer des médicaments.
Bénéfices attendus
Les MICI touchent un nombre croissant de patient en France (+ de 300000 patients) et dans le monde. Aujourd’hui des traitements symptomatiques efficaces existent : anti-inflammatoires, corticoïdes, biothérapies. Malgré tout cet arsenal, 50% des patients doivent subir une chirurgie lourde à 10 ans. Il est donc nécessaire de développer de nouvelles alternatives thérapeutiques pour palier à ces pathologies. Dans ce projet, nous développons des thérapies qui visent, les symptômes de la maladie tout en en réduisant les effets secondaires, mais aussi les causes en venant moduler et rééduquer le système immunitaire. A échéance courte, ce projet permettra de proposer de nouvelles formes médicamenteuses spécifiques de ces maladies et apportera des connaissances cruciales quant aux mécanismes cellulaires et immunologiques responsables de la pathologie. Cela permettra de promouvoir de nouvelles stratégies thérapeutiques accessibles aux patients à plus long terme. De plus, ces traitements, que nous évaluons dans ces modèles de MICI, ne sont pas spécifiques de ces pathologies mais pourront ensuite être testés et adaptés à une grande majorité des maladies inflammatoires chroniques tels que la polyarthrite rhumatoïde, la sclérose en plaque…
Procédures
Les traitements seront administrés sous anesthésie. Pharmacocinétique : les prélèvements de sang se feront au niveau de la veine caudale grâce à un catheter.
Impact sur les animaux
Dans cette étude, les animaux vont développer différentes formes des maladies chroniques de l’intestin. Ces pathologies sont caractérisées et évaluées sur différents critères relevant des nuisances causées aux animaux. Un des premiers signes est la perte de poids. Ensuite apparaissent des diarrhées. L’activité des animaux va alors être impactée. Ces nuisances apparaissent généralement quelques jours après le début de l’induction.
Devenir
Une quantité impotante de sang sera prélévé au moment de la mise à mort et différents organes seront prélevés pour évaluer l'efficacité des traitements. Des analyses de biodistribution seront réalisées.
Remplacement
Un modèle animal, et plus précisément mammifère doté d’un système immunitaire complexe, est nécessaire pour étudier les acteurs des réponses immunes dans les pathologies inflammatoires chroniques. En plus des éléments apportés par les expériences réalisées préalablement à l’aide de modèles de culture cellulaire, le modèle vivant est essentiel à la preuve d’efficacité des thérapeutiques développées dans ce projet. Les études de délivrance et de biodistribution nécessitent forcément d’avoir recours à l’expérimentation animale. Il n’est pas possible de créer in vitro la complexité du système immunitaire ou celle des barrières épithéliales avec tous les acteurs cellulaires entrant en jeu.
Réduction
Le nombre d’animaux est calculé au plus juste afin de détecter une différence de 20-30% sur les scores clinique, histologique et marquers de l'inflammation avec une puissance statistique de 80% et un risque alpha de 0,05 soit des des groupes de 6-10 individus pour les souris et 5-8 pour les rats. Ces paramètres ont été consolidés par le passé grâce à nos expériences réalisées sur ces mêmes modèles.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des cages stériles pour les études impliquant une action directe sur le système immunitaire afin de ne pas entrainer de biais sur les expériences. Pour les études concernant la formulation d’actifs thérapeutiques, elles seront réalisées dans des cages non stériles. L’intensité de la pathologie est contrôlée lors de l’induction afin de ne pas induire une pathologie trop intense avec une trop grande souffrance des animaux. Les animaux seront suivis quotidiennement afin d’évaluer les nuisances causées ainsi que la sévérité de la pathologie. En cas de score estimé sévère sur l’état général de l’évaluation clinique, les animaux seront exclus de l’étude et mis à mort car l’utilisation d’anti-inflammatoire n’est pas envisageable en raison de la pathologie inflammatoire induite et des modifications induites sur la motilité intestinale et le mécanisme inflammatoire par les analgésiques. En cas de réduction d’activité, les animaux recevront de la nourriture et/ou de l’eau sous une forme plus accessible dans la cage.
Choix des espèces
La souris ainsi que le rat présentent un système immuno-physiologique très proche de celui de l’humain, idéal pour l’évaluation des thérapeutiques. Les modèles utilisés dans ce projet sont les modèles de références unanimement validés par la communauté scientifique internationale. La souris présente également l’avantage d’être disponible avec différentes mutations génétiques permettant d’étudier plus profondément certains mécanismes cellulaires. Souris agées de 3 à 8 semaines seront utilisées Rats agés de 5-6 semaines
Effet de la réduction de l’expression d’une protéine dérivée du cerveau sur l’hémostase et la thrombose chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
Soumis à une chirurgie de 1 h 30 à 2 h sous anesthésie gazeuse pour provoquer un accident vasculaire cérébral, 426 rats passent deux tests comportementaux, une semaine avant l'opération et 48 heures après. Le projet en utilise 654 au total, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, 184 étant saignés sous anesthésie sans jamais se réveiller. Tous finissent par une perfusion intracardiaque, après jusqu'à dix injections, pour prélever sang, moelle osseuse et cerveau. Le RNT annonce que le modèle d'AVC peut provoquer douleur post-opératoire, perte des sensations et des mouvements, perte de poids et déshydratation, sans nommer les deux tests comportementaux qu'il impose.
Objectifs
Les accidents vasculaire cérébraux représentent un enjeu majeur de santé publique avec une incidence annuelle ≥ 140 000 cas en France. 85% de ces accidents sont dûs à la formation d’un caillot de sang dans le cerveau. Il s’agit d’une urgence diagnostique et thérapeutique : chaque retard de rétablissement d’un flux sanguin normal dans le cerveau de 30 min augmente de 20% le taux de mortalité. Comprendre les mécanismes de cette maladie permettra de développer de nouvelles approches diagnostiques et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche vise à comprendre le rôle naissant d’une protéine spécifique dans la formation du caillot sanguin intracérébral. La réalisation de ce projet nous permettra potentiellement de développer de nouvelles stratégies diagnostiques, et/ou d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques qui seraient facilement transférables en clinique.
Procédures
Une partie des animaux (144 animaux) subiront un prélèvement sanguin sous analgésie et anesthésie générale gazeuse sans réveil. Une partie des animaux (426 animaux) subiront une procédure chirurgicale sous analgésie et anesthésie gazeuse et sera soumise à une série de 2 tests comportementaux, une semaine avant la chirurgie et 48h après la chirurgie. Une partie des animaux (40 animaux) subiront un test de saignement sous anesthésie et analgésie sans réveil. L’ensemble des animaux subiront une perfusion intracardiaque sous anesthésie gazeuse profonde. Au maximum les animaux subiront 10 injections au cours des procédures.
Impact sur les animaux
Les animaux pourront être soumis à un stress transitoire lors des manipulations. Les injections sous cutanée engendrent un stress et une douleur légère et de courte durée. L’induction de l’anesthésie pourra induire un stress léger. Les procédures chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale gazeuse durant 1h30 à 2h. Les modèles d’accidents vasculaires cérébraux peuvent induire une douleur après la chirurgie, une perte des sensations et des mouvements, une perte de poids et une déshydratation. Les tests comportementaux peuvent induire un stress chez l’animal.
Devenir
Pour la procédure 1, les reproducteurs trop âgés sont mis à mort pour éviter le développement de tumeurs spontannées. La mise à mort des animaux des procédures 2 à 6 est nécessaire pour réaliser des analyses sur les différents prélèvements réalisés (sang total et cerveau).
Remplacement
Notre projet fait suite à des études in vitro dans l’équipe, rapportant des effets notoires de notre protéine d’intérêt sur la formation des caillots sanguins et leur dissolution. Notre objectif est maintenant de caractériser les effets de cette protéine dans la formation du caillot sanguin intracérébral et le saignement. Il nécessite donc l’utilisation d’animaux vivants. Nous ne pouvons pas utiliser de souris car elles ne possèdent pas notre protéine d’intérêt dans leur circulation sanguine. Le choix s’est alors porté sur le rat qui est un modèle largement utilisé pour ce type d’étude.
Réduction
Nous avons réduit le nombre de rats utilisés au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude. De plus, nous envisageons un maximum de tests sur les prélèvements sanguins réalisés chez les rat(te)s sous anesthésie générale et analgésie appropriée. En plus du sang, la moelle osseuse et le cerveau seront prélevés afin de pouvoir répondre à de nombreuses questions scientifiques avec le nombre minimum d’animaux. Les calculs pour estimer le nombre de rats nécessaires dans les différentes expériences ont été réalisés à l’aide d’un logiciel dédié (G*Power).
Raffinement
Afin de prévenir toute douleur qui pourrait être associée aux expériences, les animaux recevront un traitement antalgique (buprénorphine) au moment des procédures de manière systématique jusqu’à leur mise à mort. Les procédures seront réalisées sous anesthésie gazeuse adaptée (isoflurane). Le bien-être animal avant et après toute procédure sera aussi amélioré par l’enrichissement du milieu. Les cages seront pourvues de papier kraft, bâtonnets de bois, tunnels. Les rats sont placés dans une pièce au calme. En post-chirurgie, une attention particulière sera portée aux animaux jusqu’au réveil, un tapis chauffant thermostaté sera utilisé. Une surveillance quotidienne des animaux sera réalisée à l’aide d’une grille de score avec la mise en place de points limites. Tout animal présentant des signes de souffrance sera pris en charge et/ou mis à mort si nécessaire.
Choix des espèces
La majorité des recherches portant sur le rôle de notre protéine d’intérêt dans le cerveau ont été réalisées chez des souris. Cependant, celles-ci n’ont pas cette protéine au niveau sanguin ce qui empêche leur utilisation dans nos manipulations. Les rats, en revanche, possèdent notre protéine d’intérêt dans leur circulation sanguine, comme les humains, ce qui en fait une espèce appropriée pour notre étude. Les rats génétiquement modifiés pour ne pas exprimer cette protéine, ne peuvent pas survivre. Par contre, ceux exprimant partiellement cette protéine, vivent aussi longtemps que les rats sauvages, avec une quantité de protéine d’intérêt réduite de moitié dans leur circulation sanguine. Ce modèle de rat génétiquement modifié permettra donc d’étudier le rôle de notre protéine d’intérêt dans la propension à développer des caillots sanguins, notamment intracérébraux, et à saigner. Cette pathologie étant essentiellent une pathologie de l’âge adulte, nous utiliserons des animaux adultes agés de 12 à 16 semaines.
Etude de biocompatibilité et de néovascularisation d’un assemblage de biomatériaux chez le rat irradié (EU2/2)
- Recherche appliquée
- Cancers
- Maladies animales
Opérés sous anesthésie générale pendant environ trente minutes pour recevoir un assemblage de quatre biomatériaux, 25 des 34 rats sont ensuite irradiés trois fois par semaine pendant quatre semaines, puis tous sont tués trois mois après la dernière intervention pour explanter le dispositif. Ces procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré et exposent les rats à des douleurs postopératoires, des difficultés à s'alimenter, une infection du site opératoire, une dermatite radio-induite et des troubles du comportement décrits comme anxiété, dépression ou agressivité. Le porteur revendique une démarche One Health, aucun modèle in vitro ne permettant selon lui d'évaluer la biocompatibilité de l'assemblage après irradiation. La réduction du nombre de rats est justifiée par la suite du programme, un essai clinique vétérinaire sur des chats et des chiens atteints de cancers de la bouche.
Objectifs
La présente demande couvre une sous partie du projet de recherche hospitalo-universitaire (RHU) , qui vise à développer une solution innovante pour résoudre un problème clinique pour lequel les solutions actuelles ne sont pas optimales : la reconstruction osseuse immédiate et personnalisée pour les cancers de la tête et du cou, tout en limitant la morbidité. Nous souhaitons modifier le procédé chirurgical standard de reconstruction des os du visage - qui consiste actuellement à utiliser un lambeau osseux libre du patient - en proposant un dispositif médical (DM) idéal, combinaison de 4 biomatériaux. Le projet repose sur un consortium de 7 partenaires experts dans le domaine de la recherche clinique humaine et vétérinaire, du DM, et de la caractérisation des biomatériaux. Le DM final sera constitué par 4 DM distincts qui seront associés le jour de l’intervention: 1- Implant en céramique: substitut osseux. 2- Implant à base de Titane : Système de fixation utilisé en combinaison avec le substitut osseux . 3- Membrane d’albumine (Alb) : revêtement cicatrisant et biocompatible, avec des propriétés anti-inflammatoires. 4- Spray antimicrobien.. Plus particulièrement la partie du projet qui fait l’objet de cette présente demande d’autorisation a pour but d'évaluer l’efficacité du DM en termes de biocompatibilité et néovascularisation après irradiation versus sans irradiation. L’objectif primaire est d'évaluer l’efficacité du DM en termes de biocompatibilité et néovascularisation après irradiation versus sans irradiation. La tenue d’un tel dispositif post-irradiation reste un challenge, compte tenu de l’impact de la radiothérapie sur les tissus environnant. L'objectif secondaire vise à évaluer l'effet de l'albumine avec ou sans spray antibactérien sur la biocompatibilité du DM et sa capacité de néovascularisation comparée à celui du DM HA-Ti seul chez le rat irradié ou non irradié. La biocompatibilité du DM sera évaluée par analyse histopathologique dans les différentes conditions. Cet essai est nécessaire avant l’essai clinique de reconstruction osseuse faciale par la procédure sur des animaux de compagnie souffrant de cancers de la cavité orale dans le cadre d’une médecine « One Health ». Le projet est réalisé dans 2 Etablissements Utilisateur (EU1 et EU2)
Bénéfices attendus
A moyen terme, le projet permettra d'éviter le risque de séquelles esthétiques et morbides sévères aux patients atteints d’un cancer de la tête et du cou et aux animaux de compagnie ayant besoin d’une reconstruction osseuse, et ainsi d’améliorer leur qualité de vie et réduire le fardeau économique pour la collectivité. Le DM mis au point dans le cadre du projet pourra également bénéficier aux animaux de compagnie, pour lesquels il n’existe actuellement pas de solution de reconstruction des os de la face. Plus particulièrement, cette étude de biocompatibilité et de néovascularisation chez le rat irradié est cruciale puisqu’elle permettra de donner les premières preuves de faisabilité d’utilisation du DM suite à une radiothérapie avant de passer à des essais cliniques sur des animaux de compagnie souffrant de cancer de la tête et du cou.
Procédures
Les 34 rats vont subir 1 chirurgie d’implantation du dispositif sous anesthésie générale d’environ 30 minutes réalisés dans l'EU 2/2. Les 2/3 des animaux (25 rats) seront ensuite irradiés 3 fois par semaine pendant 4 semaines (soit 12 séances d’une durée d'une minute maximum par animal à chaque fois), 4 semaines après l’implantation , cette étape est réalisée dans l'EU 1/2. 3 mois après la chirurgie (groupe contrôle),ou 3 mois après la dernière séance d’irradiation (groupe expérimental) seront mis à mort et explantés pour analyse, étape réalise dans l'EU 2/2
Impact sur les animaux
1. Douleurs post-opératoires dans les jours suivant l'implantation 2. Difficultés à l'alimentation dans les jours suivant l'implantation / les séances d'irradiation 3. Infection du site opératoire dans les jours suivant l'implantation 4. Mauvaise cicatrisation dans les jours suivant l'implantation 5. Dermatite radio induite dans les jours suivant les séances d'irradiation 6. Effets secondaires systémiques : tels que des effets sur le poids corporel, le métabolisme, ou d'autres paramètres physiologiques. 7. Problèmes de comportement tels que l'anxiété, la dépression ou l'agressivité.
Devenir
Tous les rats seront euthanasiés trois mois après la dernière intervention (implantation ou radiothérapie, selon le groupe). Les analyses qui seront faites pour vérifier l’intégration des DMs ne permettent pas de maintenir les animaux en vie.
Remplacement
Cette étude de biocompatibilité et de néovascularisation vise à évaluer la faisabilité d’implantation d’un nouveau DM dans un contexte de tissu irrad L’utilisation des implants à base d’Hydroxyapatite et à base de Titane est déjà autorisée en reconstruction osseuse et a été largement documentée. Les deux autres éléments qui composeront le DM final, le spray antibactérien et la membrane d’albumine, ont déjà fait d’étude in vitro et in vivo mais dans le cadre de tests séparés. Cette étude sera la première à tester la biocompatibilité et la néovascularisation suite à l’implantation de l’assemblage des 4 DMs. Il n’existe à ce jour et à notre connaissance aucun modèle in vitro permettant une telle évaluation.
Réduction
Le projet s’inscrit dans la démarche One Health. En effet, il est prévu que le DM mis au point soit aussi testé chez des chats et chiens atteints de cancers oraux dans le cadre d’une étude clinique vétérinaire. Les données générées lors de cette étude permettront de réduire l’utilisation d’animaux de laboratoire tout en offrant une solution de reconstruction pour les animaux participants à cette étude clinique. Le nombre d'animaux nécessaire a été réduit par une analyse statistique optimale établie en fonction des résultats attendus (avec un biostatisticien), ainsi que le choix de modèles animaux et de protocoles déjà validés dans la littérature. Le taux de succès sera estimé dans chaque groupe avec un intervalle de confiance de 95% . L’effet de l’irradiation sera évalué par un test statistique non paramétrique . Le protocole d’irradiation a été défini avec une spécialiste de radio-oncologie vétérinaire
Raffinement
Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux. Les animaux ne seront jamais seuls en cage (sauf si un isolement est nécessaire, notamment en post-opératoire). Les animaux seront surveillés avec attention chaque jour (comportement, cicatrice) et seront pesés de manière hebdomadaire durant toute l'expérience. La douleur sera prise en charge dès que nécessaire. La taille des DM a été adaptée à la morphologie des animaux. Dans les jours suivants la chirurgie et les séances d’irradiation, une surveillance renforcée des animaux sera mise en place (Un enrichissement environnemental dans les compartiments sera réalisé avec mise en place de cachettes, de papier, coton pour réaliser des nids. Des points limites seront respectés pour éviter toute souffrance excessive. L'ensemble du personnel est qualifié et compétent en matière d'expérimentation animale, et l'animalerie possède l'agrément et le plateau technique nécessaires. A noter que les animaux ne pourront pas être réutilisés car l’évaluation de la régénération tissulaire nécessitera une autopsie.
Choix des espèces
Le rat est un modèle établi pour les tests de biocompatibilité..De plus, comme nous cherchons à reproduire le protocole de soins, et en particulier la radiothérapie subit par les patients et les animaux de compagnie atteints de cancer de la tête et du cou. Le projet visant la mise au point d’un DM permettant la reconstruction faciale chez l’adulte, les procédures ne concerneront que des rats adultes