Rats

280 rats vont être utilisé·es, tous tués à l'issue sous anesthésie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur injecte de la monocrotaline pour déclencher une hypertension artérielle pulmonaire, puis un anticorps anti-NGF, avant des mesures échographiques et de pression cardiaque sous anesthésie. Le porteur veut confirmer que bloquer le facteur de croissance NGF freine la maladie, avec des retombées thérapeutiques annoncées à terme. Il soutient que la maladie induite reste peu douloureuse faute d'effort imposé aux rats, et affirme que ces interactions complexes ne peuvent être reproduites in vitro.

Objectifs

L’hypertension artérielle pulmonaire ou HTAP est une maladie grave qui touche les artères pulmonaires conduisant le sang du cœur vers les poumons pour y être réoxygéné. Dans cette maladie, la pression augmente de manière anormale dans ces artères, et le cœur doit alors travailler plus fort pour envoyer le sang dans ces artères. A force de travailler plus, il finit par fonctionner mal, entrainant le décès des patients. Aucun médicament actuellement sur le marché ne permet de guérir cette maladie, et il faut donc essayer de développer des nouveaux médicaments plus efficaces. Nous pensons que développer un médicament qui bloquerait le facteur de croissance des nerfs NGF pourrait avoir un grand intérêt dans cette maladie. En effet, nos expériences sur cultures de cellules humaines suggèrent que le NGF participe à l’inflammation présente dans l’HTAP. Le NGF pourrait notamment attirer des cellules inflammatoires à proximité des artères pulmonaires, et ces cellules inflammatoires libèreraient alors des substances qui contribuent aux altérations de ces artères pulmonaires qu’on observe dans la maladie. Nous souhaitons à présent valider cette hypothèse dans un modèle plus intégré d’HTAP, en utilisant le modèle monocrotaline (MCT). Ce modèle d’HTAP chez le rat est classiquement utilisé dans la littérature et déjà en place au laboratoire. L’utilisation de ce modèle est nécessaire car nous ne pouvons pas modéliser en culture les interactions complexes qui existent entre les cellules inflammatoires et les cellules des artères pulmonaires, afin de déterminer quel est le rôle du NGF dans ces interactions. Ainsi, ce projet va nous permettre de traiter les rats avec un anticorps qui bloque le NGF et voir si ce traitement empêche le développement de la maladie, en modifiant l’inflammation et ses conséquences sur les artères pulmonaires.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de déterminer les conséquences du blocage in vivo du NGF sur le développement de l’HTAP, et en particulier sur sa composante inflammatoire. Ainsi, l’effet d’un traitement à l’aide d’anticorps bloquants anti-NGF sera évalué sur l’élévation des pressions ventriculaires droites et de la pression artérielle pulmonaire, sur le débit cardiaque et sur l’hypertrophie ventriculaire droite pour apprécier les effets bénéfiques sur les paramètres qui définissent l’HTAP. Puis l’effet de ce traitement sera évalué ex vivo sur l’infiltration des monocytes et leur activation dans le poumon, sur la sécrétion de substances inflammatoires et leurs conséquences sur les artères pulmonaires. Les résultats obtenus dans ce modèle nous permettront ainsi de mieux comprendre le rôle physiopathologique du NGF dans l’inflammation associée à l’HTAP, et ainsi de contribuer à confirmer que le NGF est une nouvelle cible thérapeutique d’intérêt dans cette pathologie.

Procédures

Dans la 1ère partie de la procédure, les animaux seront soumis à des injections intrapéritonéales. Ils en recevront au maximum 6 sur la durée totale du protocole (28 jours), réparties de la manière suivante : Jour 0 (Anticorps), Jour 1 (solvant ou monocrotaline), Jour 8 (Anticorps), Jour 15 (Anticorps) et Jour 22 (Anticorps). Les volumes injectés sont faibles à chaque injection (200 ou 500µl) et la durée d’injection est très courte (quelques secondes par animal). 240 animaux seront concernés par ces injections (groupes 3 à 14). Dans la 2ème partie de la procédure, les animaux seront soumis à des mesures in vivo, sous anesthésie gazeuse et analgésie complémentaire, afin de réaliser des mesures échographiques (durée : une dizaine de minutes par animal), puis des mesures de débit cardiaque et de pressions ventriculaires droites et artérielles pulmonaires (durée : une vingtaine de minutes par animal). L’ensemble des animaux seront concernés par ces mesures, soit 280 animaux.

Impact sur les animaux

L’injection intrapéritonéale est peu douloureuse lorsqu’elle est bien réalisée. Les injections de monocrotaline, de son solvant seul, des anticorps non pertinents ou des anticorps bloquants anti-NGF n’est pas décrite comme provoquant des douleurs post-injection dans la littérature. Toutefois, les signes cliniques de souffrance seront surveillés quotidiennement pendant la suite du protocole. Concernant le développement de la maladie en elle-même, chez l’homme, l’HTAP n’induit pas de souffrances élevées mais plutôt une gêne respiratoire exacerbée lors d’un effort. Etant donné que les animaux ne seront pas soumis à l’effort, la souffrance est considérée comme légère dans ce type de protocole d’induction d’une maladie.

Devenir

A la fin de la procédure, tous les animaux, toujours sous anesthésie gazeuse, seront euthanasiés (sans réveil) et les expérimentations suivantes auront lieu sur tissus prélevés après euthanasie.

Remplacement

Ce projet a pour but d’identifier des mécanismes in vivo pour valider la pertinence des résultats obtenus in vitro. En effet, nous recherchons à identifier un lien entre NGF, monocytes, IL-1b et altérations des artères pulmonaires. Nous avons réalisé des expériences in vitro qui nous ont permis notamment de montrer que le NGF stimule la libération d’une substance inflammatoire qui induit in vitro différents effets sur les cellules artérielles pulmonaires humaines en culture. Pour montrer que le blocage du NGF et de ce mécanisme conduit à des effets bénéfiques sur le développement de l’HTAP, ce projet nécessite à présent l’utilisation d’animaux pour modéliser cette pathologie in vivo (pathologie impossible à modéliser in vitro de manière complète pour le moment) et pour valider l’utilisation d’anticorps bloquants anti-NGF comme traitement possible de l’HTAP.

Réduction

L’estimation du nombre d’animaux à utiliser est basée sur les analyses des études déjà menées au laboratoire sur ce même modèle compte-tenu de la taille requise des échantillons pour une analyse statistique pertinente dans ce type de recherche. De plus, cette estimation tient également compte des données de la bibliographie et du fournisseur qui décrivent un effet variable de la monocrotaline en fonction des lots commandés. Pour optimiser le nombre d’animaux utilisés : (1) le plan d’expériences a été optimisé afin de pouvoir réaliser les expériences in vivo et ex vivo sur les mêmes animaux et afin d’utiliser les deux poumons de chaque animal (utilisation par exemple du poumon gauche pour les expériences de contraction et utilisation du poumon droit pour l’étude de l’expression de différentes protéines d’intérêt) (2) parallèlement à ce protocole, des études continueront à être réalisées sur des cellules d’artères pulmonaires humaines en culture afin d’étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeu dans les effets observés. Ainsi, nous optimiserons l’utilisation des animaux et les remplacerons par des cellules humaines autant que possible. Au final, cette démarche nous a conduit à un protocole utilisant 14 groupes comptant chacun 20 animaux, soit un total de 280 animaux (140 mâles et 140 femelles, puisque nous souhaitons également explorer les différences éventuelles des effets observés en fonction du sexe). Ce nombre sera réduit si les résultats obtenus sont statistiquement significatifs (ou résolument non significatifs) avant la fin de la totalité des séries prévues. Les expérimentations sont planifiées pour obtenir un maximum de résultats expérimentaux sur un nombre d’animaux le plus faible possible (mesures échographiques, de débit cardiaque et de pression artérielle pulmonaire puis expériences ex vivo ultérieures après euthanasie réalisées sur les mêmes animaux, une seule procédure).

Raffinement

À leur arrivée, les animaux sont hébergés en cages collectives, pourvues d’enrichissement du milieu (litière : copeaux de peuplier ; enrichissement : papier tressé, morceaux de bois, tunnels et maisons en carton). 2 à 3 animaux seront hébergés dans chaque cage. La nourriture et l’eau seront données à volonté, et le change effectué une fois par semaine (cage, litière, biberon). Un suivi quotidien (week-ends, vacances et jours fériés inclus) des animaux sera effectué par le personnel de l’animalerie pour prévenir tout inconfort, souffrance ou comportement anormal des animaux. Au moment de cette procédure expérimentale, les animaux seront observés et cette surveillance portera sur le suivi du poids des animaux, sur leur apparence, et sur des paramètres comportementaux (mobilité, interaction avec ses congénères, peur, agression, vocalisation, automutilation, activité diminuée ou augmentée, prostration). Une feuille de suivi des animaux, sur laquelle sont précisées les conduites à tenir en cas de problème de santé de l’animal, sera complétée. L’expérience des personnels de l’animalerie nous garantit un bon suivi des animaux. Si le suivi du poids fait apparaitre une perte de poids des animaux supérieure à 5% par rapport à leur poids initial, une mise à disposition de nourriture humidifiée posée directement au fond de la cage sera effectuée, jusqu’à ce qu’une amélioration de l’état de l’animal soit observée. Les animaux seront sacrifiés en cas de perte de 20% de poids par rapport à leur poids initial, ou si l’animal perd 10% de son poids par rapport à la dernière pesée. En cas de détection de signe de douleur, dans un premier temps, une administration d’antalgique sera réalisée, et l’animal en souffrance sera alors surveillé toutes les demi-heures pendant deux heures. En cas de souffrance ou de détresse persistante au-delà de cette période malgré l’administration d’antalgique, une procédure d’euthanasie sera mise en œuvre.

Choix des espèces

Le rat est une espèce classiquement utilisée pour le développement de modèles d’hypertension pulmonaire. De plus, le laboratoire utilise cette espèce depuis plusieurs années, et dispose donc de nombreuses données sur lesquelles s’appuie le présent projet. Le modèle monocrotaline est le modèle que nous souhaitons utiliser dans cette DAP pour compléter des expériences déjà réalisées avec ce modèle. Le choix du rat est d’autant plus justifié par le fait que le modèle monocrotaline ne fonctionne pas chez la souris. En effet, pour être active et induire le développement d’une hypertension pulmonaire, la monocrotaline doit être métabolisée en un dérivé, appelé monocrotaline pyrrole, par des enzymes présentes dans le foie. Or ces enzymes nécessaires à cette réaction n’existent pas chez la souris. Ce modèle monocrotaline ne fonctionne donc pas chez la souris, et nécessite forcément l’utilisation du rat. Nous utiliserons des rats jeunes de 200g. Le protocole utilisé se déroule sur 4 semaines et les données de la littérature ainsi que les résultats précédents obtenus au laboratoire préconisent d’utiliser des rats de ce poids pour ce type de protocole. En effet, au-delà de 200g en début de protocole, l’injection de monocrotaline est décrite comme moins efficace pour entraîner le développement d’une hypertension artérielle pulmonaire.

1 260 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les expérimentateurs sectionnent les deux nerfs caverneux sous anesthésie pour provoquer une dysfonction érectile, administrent des composés pendant une à douze semaines, puis mesurent l'érection par stimulation du nerf sous anesthésie. Le porteur reconnaît des risques de douleur, d'infection et d'inconfort liés aux chirurgies de l'abdomen, à la lésion nerveuse et aux prélèvements en cage à métabolisme. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne permet d'évaluer l'érection, résultat de l'interaction entre système nerveux et vaisseaux, ce qui imposerait le recours au rat.

Objectifs

La dysfonction érectile (DE) est définie comme l’incapacité à obtenir et ou à maintenir une érection suffisante pour l’accomplissement d’un rapport sexuel, de manière constante ou récurrente. La DE peut être psychogénique (médié par l’adrénaline), d’origine organique ou mixte. Les causes d’une DE organique sont nombreuses : neurogéniques (lésion de la moelle épinière, sclérose en plaques, maladie de Parkinson etc..), vasculaires (athérosclérose, hypertension artérielle, diabète etc…), iatrogéniques (suite à la prise de certains médicaments comme les béta-bloquants, certains antidépresseurs etc..) ou hormonales. Toutes les études ont montré une augmentation de l'apparition de la DE avec l’âge. En effet, la DE touche entre 1 et 9% des hommes de moins de 40 ans, et plus de la moitié des hommes de plus de 70 ans. La DE a des conséquences personnelles négatives telles que la frustration, soucis, souffrance psychologique et ou l’évitement de l’intimité sexuelle, ce qui occasionne une altération de la qualité de vie et des difficultés relationnelles dans le couple. Actuellement, différents traitements sont disponibles pour la DE, comme les comprimés de sildénafil (viagra) ou de vardenafil (Levitra), les injections dans l'urètre ou directement dans le corps caverneux du pénis d’alprostadil, les pompes à vide, la pose d’implant, ou plus récemment les thérapies par onde de choc. Cependant, ces traitements peuvent être inconfortables (nécessité de planifier l’acte sexuel, des injections invasives) ou contre-indiquées avec certains autres traitements (contre-indication entre la prise de sildénafil ou vardénafil avec les dérivés nitrés, ces derniers étant utilisés pour traiter l’angor). De plus, certains types de patients (diabétique, personne ayant eu une prostatectomie) répondent difficilement ou sont insensibles aux traitements actuels. Au final, il y a encore une forte proportion de patients avec une DE qui nécessite une alternative thérapeutique dans leur prise en charge. Ce projet s’inscrit donc dans le cadre du développement des traitements pharmacologiques pour la DE, ou dans la recherche d’un effet indésirable sur la fonction érectile d’un traitement médicamenteux.

Bénéfices attendus

La DE est une pathologie fortement liée à l’âge, ainsi l’allongement de l’espérance de vie augmente le nombre de personnes ayant une DE dans la population. Cependant, chez les patients souffrant de pathologies cardiovasculaires et ou métaboliques, la DE s’accompagne d’une résistance aux traitements thérapeutiques disponibles actuellement. De plus, il n’existe pas encore de traitement médicamenteux curatifs à la DE, en effet, les traitements médicamenteux actuels restent symptomatiques. La recherche de médicaments pour compléter l’arsenal thérapeutique actuel contre la DE est donc indispensable et reste active. Ce projet permettra de sélectionner les candidats médicaments efficaces dans le traitement de la DE et ou de discriminer ceux qui pourraient avoir un effet néfaste sur la fonction sexuelle. De même, ce projet donnera une preuve d’efficacité à un candidat médicament, dans un modèle animal standardisé, complétant les études précliniques règlementaires avant les essais chez l’homme.

Procédures

Les interventions que vont avoir les animaux sont : - L’induction du modèle de DE par lésion bilatérale du nerf caverneux chez le rat anesthésié. Cette procédure est réalisée une seule fois afin de mettre en place la DE, et l’opération dure environ une heure. Elle permet de mimer la lésion du nerf caverneux au cours d'une chirurgie de prostatectomie, sans réaliser la chirurgie. - Une administration (voie selon la molécule à étudier) du composé à analyser, d’un contrôle négatif (souvent le véhicule du composé à tester) et de la molécule de référence. La fréquence et la durée du traitement dépendra du composé à tester (une ou plusieurs fois par jour pendant 1 à 12 semaines). Tout type d’administration, réalisé par des personnels tutorés, dure moins d’une minute sur un animal vigile, et moins de 30 min sur un animal anesthésié. - Mesure de la fonction érectile suite à une chirurgie sur animal anesthésié: stimulation artificielle du nerf caverneux et mesure de l’augmentation de la pression intracaverneuse (signe de l’érection). Cette procédure est sans réveil, donc réalisée une fois par animal, et la mesure dure environ 2 heures incluant le temps de chirurgie. - Si le protocole le requiert, des prélèvements de sang et d’urines pourront être envisagés. Les prélèvements sanguins respecteront les normes en vigueur, limitant le volume inférieur à 10% du volume total sanguin de l’animal, et jamais plus de 15% sur une période de 28 jours. Chaque prélèvement sanguin, réalisé par des personnels tutorés, durera moins de 3 minutes. Si le protocle le recquiert, des récoltes d'urine par isolement de l'animal dans un hébergement individuel peuvent être réalisés, à raison d'une fois par semaine au maximum, et l'isolement est inférieur à 24 heures. A noter que tous les animaux n’auront pas forcément toutes ces interventions. En effet, les interventions seront limitées selon leur pertinence et selon les recommandations dans le cadre d’un partenariat avec une entreprise pharmaceutique.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont : - Les chirurgies de l'abdomen (pour réaliser les lésions nerveuses, les administrations intraprostatiques ou intracaverneuses, ou encore pour mesurer la fonction érectile) présentent des risques de douleur, d’infection et d’inconfort. - La lésion des nerfs caverneux pour créer la dysfonction érectile peut présenter des risques de douleur - L’administration du composé à tester qui nécessitera une contention, et l’implantation des pompes osmotiques peuvent entraîner des risques de stress et de douleur - Prélèvements de sang et d’urine en cage à métabolisme peuvent stresser l’animal. Les risques de douleur et d'infection sont pris en compte pendant le projet par l’utilisation des antalgiques et/ou antibiotiques. De plus, les personnels qualifiés et tutorés vont limiter le stress au maximum. A noter que tous les animaux ne vont pas forcément subir toutes les procédures dans la liste.

Devenir

Tous les animaux vont avoir au minimum un traitement par le composé à tester et des composés témoins. Ensuite, selon les paramètres à analyser, suite à des prélèvements d’organes, et ou de sang, et ou la mesure de la fonction érectile, les animaux seront anesthésiés puis euthanasiés par un surdosage en anesthésique.

Remplacement

L’érection survient suite à une interrelation entre le système nerveux (centrale et périphérique) et différents types cellulaires, conduisant à cet afflux de sang au niveau du corps caverneux du pénis. Il n’existe à ce jour aucun modèle in vitro pertinent permettant d’évaluer cette fonction et la sélection de candidat médicament efficace dans le traitement de la DE. De plus, la survenue d'une DE est la résultante de la dérégulation de plusieurs mécanismes physiologiques chez les diabétiques et les personnes atteintes d’une hypertension artérielle. Ainsi, la possibilité d’utiliser des souches de rats diabétiques et hypertendus est essentielle afin de sélectionner un candidat médicament efficace contre la DE associé à ces pathologies.

Réduction

Une analyse de puissance statistique a été réalisée afin de réduire au minimum le nombre de rats par groupe. La formule est n=1+2C (s/d)^2 pour calculer la taille du groupe pour des variables continues. D’après notre expérience suite aux expérimentations réalisées précédemment dans le laboratoire, le critère principal a une déviation standard (s) de 0,5. Afin de mettre en évidence un effet significatif, le produit d’intérêt devrait modifier ce critère de 0,75 par rapport au groupe contrôle (d). Avec une puissance (1-β) de 90% et un niveau de significativité (α) de 5%, la constante C correspond à 10.51. Ainsi, en reprenant la formule, le nombre de rats par groupe nécessaire pour l’étude est : n= 1+ 2*10.51*(0.5/0.75)^2 = 10,3. Notre expérience passée nous a permis de fixer la taille du groupe expérimental à n=12 rats afin d’obtenir des données interprétables pour 10 animaux/groupe avec les tests statistiques utilisés car 20% des données sont non interprétables, inhérentes aux difficultés techniques du modèle expérimental.

Raffinement

Une réduction de la douleur, la souffrance et l’angoisse est mise en place dès que cela est possible : - Les rats sont hébergés par 2 animaux par cage, afin de favoriser leur interaction sociale et réduire leur stress. - Un suivi quotidien de tous les rats sera réalisé par les zootechniciens (observation comportement, état de santé général et état sanitaire de leur cage). - L’induction de la DE par une lésion du nerf caverneux se fait sous analgésie et anesthésie générale. Un traitement antibiotique est aussi mis en place pour éviter toute complication infectieuse. - L’évaluation de la fonction érectile se fait sous analgésie et anesthésie générale et est sans réveil. A noter que toutes les procédures expérimentales ne seront pas forcément appliquées aux animaux. Les procédures expérimentales appliquées à chaque groupe de rats seront attribuées en fonction de leur pertinence (voir dans la description de chaque procédure) et selon les recommandations dans le cadre d’un partenariat avec une entreprise pharmaceutique.

Choix des espèces

Le choix du modèle animal est guidé par le souci d’utiliser un nombre minimum d’animaux, les moins sensibles du point de vue neurophysiologique et présentant le maximum de chance d’obtenir des résultats satisfaisants. Les rongeurs sont ainsi le modèle le plus utilisé en recherche et notamment dans le domaine de la médecine sexuelle. L’organisation anatomique des organes participant à l’activité sexuelle ainsi que leur innervation sont comparables chez le rat et l’homme. De plus, les modèles pathophysiologies de diabète et d’hypertension artérielle présentant une dysfonction érectile ont été décrits chez le rat. Les animaux seront utilisés adulte, à partir de 7 semaines d’âge, en effet l’évaluation de la fonction érectile se fait forcément après la maturité sexuelle. Ce choix est justifié par la littérature scientifique.

195 souris et 60 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon les groupes, ils subissent une chirurgie crânienne d'une heure, des injections dans l'abdomen et des tests comportementaux, certains étant imagés éveillés sous un microscope auquel ils doivent s'habituer. Le porteur signale une douleur post-opératoire, un risque d'infection de la cicatrice et, après administration de LPS, anorexie, baisse de locomotion, perte de poids et anxiété. Il affirme que l'usage d'animaux est "inévitable" pour comprendre l'activité des circuits neuronaux, la souris permettant en outre d'obtenir aisément des animaux génétiquement modifiés.

Objectifs

Le bon fonctionnement du cerveau repose sur l'interaction des différentes cellules du cerveau. L'objectif de ce projet est de étudier les différents types de cellules gliales et d’évaluer son rôle dans le comportement animal. Les cellules gliales qui comprennent les oligodendrocytes, les astrocytes et la microglie, sont des cellule spécialisée dont la fonction est d'entourer, de soutenir et d'isoler les cellules nerveuses (neurones) du système nerveux central (SNC), y compris le cerveau et la moelle épinière. La principale fonction des oligodendrocytes est la formation de la gaine de myéline, une membrane grasse qui permet d'isoler et de protéger les fibres nerveuses du cerveau et de la moelle épinière. Les astrocytes assurent une diversité de fonctions importantes, centrée sur le support et la protection des neurones. La microglie forme la principale défense immunitaire dans le système nerveux central. Nous étudierons les cellules gliales par des expériences d'imagerie, de biologie moléculaire et de comportement chez les rats et les souris. Nous étudierons aussi l’activité électrique des neurones et des cellules gliales.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de former les étudiants afin qu’ils soient en mesure de réaliser au mieux les procédures qu’ils auront apprises et transmettre ainsi ces techniques dans leur laboratoire d’origine. Une meilleure connaissance des nouvelles techniques de chirurgie et d'imagerie leur permettra aussi de réduire le nombre d’animaux utilisés lorsqu’ils voudront réaliser ces techniques pour leurs besoins de recherche.

Procédures

- Le groupe A suivra: une chirurgie (1 heure). Deux semaines plus tard, les animaux recevront une injection intrapéritonéale et deux heures plus tard ils suivront un test comportemental (5 minutes). Le lendemain, elles recevront une deuxième injection et 2h plus tard elles seront exposées au deuxième test comportemental (5 minutes). - Le groupe B suivra: une injection intrapéritonéale (1 minute) et deux heures plus tard ils suivront un test comportemental (5 minutes). Le lendemain, ils recevront une deuxième injection (1 minute) et 2h plus tard ils seront exposés au deuxième test comportemental (5 minutes). - Le groupe C suivra: une chirurgie (1 heure). Deux semaines plus tard, les animaux suivront un test comportemental (10 minutes). Finalement les animaux seront euthanasiés (1 minute) et leur cerveau sera prélevé́. - Le groupe D suivra: une chirurgie (1 heure). Deux semaines plus tard, les animaux seront habitués à rester sur le microscope et ensuite l’activité́ neuronale sera imagée chez les animaux éveillés. Les séances d’imagerie dureront 30 minutes et elles auront lieu une fois par jour pendant 3 jours. A la fin de la dernière séance, les animaux seront euthanasiés et leur cerveau sera prélevé́. - Le groupe E suivra: une chirurgie (1 heure) pour implanter une fibre optique sur leur tête. Deux semaines plus tard, les animaux suivront une deuxième chirurgie (1 heure). Deux semaines plus tard, les rats seront connectés au niveau de la fibre optique vers un système d’enregistrement de l’activité́ électrique et leur comportement spontané́. Chaque séance durera 20 minutes et chaque rat suivra 3 séances. A la fin de la dernière séance, les animaux seront euthanasiés et leur cerveau sera prélevé́.

Impact sur les animaux

- Nuisances liées aux procédures chirurgicales : douleur post opératoires, risque mineur d’infection de la cicatrice, risque mineur de détérioration des implants crâniens - Nuisances liées à la connexion des animaux à la fibre optique : stress de la contrainte du maintien sous l’objectif du microscope auquel l’animal doit s’habituer - Douleur légère liée aux différents injections intrapéritonéales. L'administration de LPS aux animaux peut induire de l'anorexie, la diminution de la locomotion, la perte de poids et de l’anxiété.

Devenir

A l’issue de toutes les expériences, les animaux seront euthanasiés et leur cerveau sera prélevé pour effectuer des analyses immuno-histologiques.

Remplacement

Pour comprendre l'activité des circuits neuronaux dans le cerveau, il est nécessaire de générer des données biologiques pertinentes. L'utilisation d'animaux est donc inévitable. Les souris et les sont les modèles animaux de prédilection pour les recherches dans ce domaine en raison de la structure anatomique et de la fonction bien définies de différents cortex corticaux. La souris est aussi l’espèce de rongeurs qui permet d’obtenir aisément des animaux modifiés génétiquement.

Réduction

L’expertise de nos instructeurs sur ces modèles garantit que le nombre d'animaux utilisés est minimisé par une pratique toujours de haute qualité dès le départ. De même il est extrêmement important pour nos objectifs éducatifs de pouvoir démontrer et mettre en pratique les actes de préparation chirurgicaux, le nombre d'animaux sera donc adapté en conséquence. Ce projet a aussi pour but de former les étudiants afin qu’ils soient en mesure de réaliser au mieux les procédures qu’ils auront apprises et transmettre ainsi ces techniques dans leur laboratoire d’origine. Une meilleure connaissance des nouvelles techniques de chirurgie et d'imagerie leur permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés lorsqu’ils voudront réaliser ces techniques pour leurs besoins de recherche. Par an, 20 étudiants et 10 instructeurs suivront les projets décrits dans cette DAP. Dans ce context, lors de la formation, les instructeurs réalisent une démonstration de la procédure puis les étudiants auront l’occasion de pratiquer la procédure sous-couvert des instructeurs.

Raffinement

Nos mesures mises en place pour réduire la douleur pendant les procédures expérimentales impliquent une induction et suivi de l'anesthésie, une mise en place d'analgésie, une installation tout au long des procédures chirurgicales de contrôle de la température par tapis chauffant. Les souris seront placées en cages de 4-5 souris et les rats de 2. Ils seront tous placés sur un rack ventilé, placé dans une salle d'hébergement. Un enrichissement de leur milieu (carrés de cellulose, maisons en papier mâché que les animaux peuvent utiliser pour se cacher et/ou ronger) permettra de favoriser les comportements d'exploration et d'empêcher le stress. Les animaux opérés seront observés quotidiennement par l’expérimentateur pendant la période qui suit le réveil (2h) ainsi que pendant les 4 jours suivant. L'évaluation des points limites se fera selon une grille d'évaluation (Annexe 1) incluant le poids de l'animal, l'état de la plaie, l'état du pelage, la mobilité de l'animal et les signes de douleur. Si l'animal présente un score entre 6 - 16, une seconde injection de carprofène s.c. sera effectuée et reconduite toutes les 24h si les signes persistent lors des observations suivantes. Si l’animal n’a pas repris de poids au bout de 4 jours, ou si des signes de souffrance sont observés, le traitement sera étendu de 2 jours supplémentaires. Si la récupération ne s’effectue pas bien et si le score des critères de la grille d’évaluation est supérieur à 11 durant 2 jours consécutifs l’animal sera euthanasié par l'expérimentateur par dislocation cervicale. Dans des cas très rares, les implants (fibre optique et le système de fixation) peuvent se détacher du crâne. Dans cette situation, les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

La souris et les rats sont les espèces de choix pour les études sur le système nerveux central des vertèbres. L'organisation du système central de ces espèce est assez proche de celle de l'homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes synaptiques à une échelle cellulaire et aussi au niveau des circuits neuronaux. Nous utilisons le modelé souris qui est l'espèce de rongeur permettant d'obtenir aisément des animaux modifies génétiquement. Le projet sera réalisé sur des animaux agés de plus de 6 semaines, ce qui correspond à l’âge adulte pour ces espèces. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau homogène pour une bonne reproductibilité des procédures chirurgicaux.

18 450 rongeurs, 17 200 souris et 1 250 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les animaux subissent l'implantation d'un transpondeur, des prélèvements sanguins répétés dont des ponctions cardiaques et des gavages, dans des modèles d'allergie cutanée, alimentaire et d'anaphylaxie pour tester des composés. Le porteur indique que la stimulation par l'allergène peut provoquer une hypothermie, des atteintes respiratoires et cardiaques et une anaphylaxie "pouvant être mortelle". Tous les animaux sont tués à l'issue, le porteur affirmant qu'il n'existe "pas de modèles in silico ou in vitro" pour évaluer ces composés.

Objectifs

Ce projet consiste à évaluer l’efficacité thérapeutique de nouveaux composés dans des modèles d’allergie chez le rongeur. Les pathologies allergiques sont actuellement placées au 4ème rang mondial des maladies inflammatoires chroniques par l’OMS et selon les estimations statistiques réalisées la moitié de la population mondiale sera concernée d’ici à 2050. Il est donc primordial de poursuivre la recherche de nouvelle thérapies et l’évaluation de l’efficacité de ces traitements dans ce domaine. Ce projet visera particulièrement les allergies cutanées (urticaire, dermatite, …), alimentaires et généralisées telles que les anaphylaxies dont la prévalence a largement augmenté avec l’industrialisation mondiale. L’allergie est une pathologie complexe et multifactorielle, associée à un dérèglement du système immunitaire, nommée hyperréactivité, à l’égard de substances banales de l’environnement : les allergènes, conduisant à une perte de tolérance. L’allergie peut toucher de nombreux organes, néanmoins la peau et les muqueuses sont les tissus les plus souvent atteints de par leur interaction directe avec l’environnement. Elle se définit par une cascade d’événement qu'il est important d'identifier et de charactériser afin de développer des stratégies innovantes efficaces. Durant la première phase, dite de sensibilisation, l’individu est exposé pour la première fois à un allergène et va synthétiser des immunoglobulines E (IgE) spécifiques de cet allergène. La seconde phase, dite effectrice, induite lors de l’exposition secondaire ou chronique où l’individu pourra développer les symptômes d’une allergie (rougeurs, démangeaisons...). Des IgE seront produites et leurs interactions avec le récepteur FceRI permettront l’activation de cellules immunitaires innées telles que les mastocytes, basophiles, neutrophiles principalement retrouvées dans la peau, le tube digestif et les poumons. cette activation conduira à la libération très rapide de médiateurs pré-stockés tels que l’histamine, des leucotriènes ou des prostaglandines, responsables des symptômes engendrés dans les premières minutes de la réaction allergique : rougeurs, démangeaison, sécrétion et œdèmes. Puis la sécrétion de médiateurs lipidiques et protéiques permettra de soutenir cette inflammation locale qui peut à long terme être responsable d’altérations tissulaires et d’une anaphylaxie correspondant à une réaction allergique hyper-aiguë pouvant être mortelle.

Bénéfices attendus

Les traitements actuels des pathologies allergiques ou anaphylactiques (utilisation d’anti-histaminiques, de bronchodilatateurs, injection intramusculaire d’adrénaline) réduisent les symptômes mais affectent peu la progression de la maladie. Les traitements biologiques récents sont plus efficaces mais très couteux et tous augmentent le risque d'infection. En outre ces traitements peuvent engendrer une immunogénicité et une perte d'efficacité due à la production d'anticorps neutralisants par le patient. Les procédures qui constituent ce projet s'inscrivent dans le cadre du développement de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes. A court terme, elles permettront de prédire l'efficacité de nouveaux candidats médicament dans les pathologies inflammatoires. A plus long terme, ces procédures constitueront la base pour un traitement applicable à l'Homme en déterminant les doses efficaces qui pourraient être administrées chez les patients.

Procédures

Les gestes techniques concernent tous les animaux :  Pesées : Durée 30 secondes sur animal vigile, jusqu’à une fois par jour sur la durée des études.   Mesure de la température corporelle : Durée 1 minute sur animal vigile ou sous anesthésie générale, par le biais d'un transpondeur implanté ou via une sonde rectale pour rongeur, pourraient être effectuées toutes les heures au cours des 24 heures ou sur une durée de 15 jours suivant le challenge avec les antigènes.   Implantation de transpondeur pour la mesure de la température : Durée 1 minute, sous anesthésie générale gazeuse ou par injection.   Prélèvements de sang   par voie retro orbitale au cours des procédures : Durée 30 secondes sous anesthésie générale gazeuse ou par injection.   Via la submandibulaire : Durée 30 secondes sur animal vigile ou sous anesthésie générale gazeuse ou par injection.    via la veine caudale : Durée 30 secondes sur animal vigile ou sous anesthésie générale gazeuse ou par injection.    via ponction cardiaque : Durée 1 minute sous anesthésie générale gazeuse ou par injection.   Les volumes et la fréquence des prélèvements seront généralement de 20 à 50 µl chez la souris et de 20 à 200 µl chez le rat. Le volume total prélevé n'excédera pas 7.5% du volume estimé de sang total de l'animal sur une période de 24 heures. Des périodes de récupération seront mises en place pouvant aller jusqu'à une semaine. •    Administrations des composés à potentiel thérapeutiques   par voie orale (gavage à l'aide d'une sonde gastrique), intrapéritonéale, sous-cutanée, par application topique ou via la veine caudale : Durée 30 secondes sur animaux vigiles.   Administrations intraveineuses par voie retro orbitale : Durée 30 secondes Sous anesthésie générale (Isoflurane ou kétamine/xylazine).

Impact sur les animaux

Ces procédures peuvent engendrer une dégradation rapide de l’état de santé de l’animal pouvant se traduire par une modification du comportement animal (inactivité, absence de réaction aux stimuli, des vocalisations), une hypothermie, des atteintes respiratoires (angio-œdème, baisse de la fréquence respiratoire, baisse du volume courant, hypoxie), cardiaques (hypotension, tachycardie, vasodilatation, diminution de la perméabilité vasculaire), cutanées (érythème, œdème, épaississement de la peau), intestinale (diarrhée), une perte de poids. Ces effets surviennent suite à la stimulation avec l’allergène et s’établissent très rapidement (en quelques minutes ou heures). Les animaux seront également soumis à une anesthésie, des administrations et des prélèvements sanguins sous anesthésie générale qui peuvent constituer des nuisances.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue des études. Les modèles décrits ne permettent pas la réutilisation des animaux.

Remplacement

A notre connaissance, il n'existe pas de modèles in silico ou in vitro qui permettent d’évaluer une potentielle efficacité thérapeutique de composés dans des pathologies allergiques. Seul un modèle animal peut permettre de mimer de manière séquentielle le développement de la pathologie et contenir tous les acteurs cellulaires et moléculaires nécessaires à ces diverses étapes.

Réduction

Les composés auront préalablement été évalués de manière extensive sur une batterie de tests in silico et in vitro. Ces tests permettent de prédire le profil pharmacocinétique du composé (ex : lipophilie, absorption, distribution, métabolisme), de déterminer les caractéristiques d’interaction du composé avec la cible d’intérêt (ex. un récepteur, un canal ionique, une enzyme). En outre, le profil pharmacocinétique chez le rongeur aura aussi été déterminé. De nombreux composés auront donc été éliminés du fait de leur faible performance sur ces tests. La probabilité d’observer une activité sur les modèles rongeurs de ce projet sera par conséquent élevée. Le nombre d’animaux prévu pour ce projet se base sur les données de la littérature et les données de mise en place des modèles, notamment des analyses de puissance statistique et des tests de détermination de la taille des groupes expérimentaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des locaux conformes aux standards réglementaires de la directive n°2010/63/UE. Ils seront groupés dans des cages contenant de l'enrichissement et des matériaux spécialisés pour faciliter la nidification. Les procédures potentiellement douloureuses ou source d'inconfort ou de stress se feront sous anesthésie gazeuse. Les animaux feront l'objet d'une surveillance clinique et sanitaire journalière sur la durée de la procédure. Les locaux d'hébergement font l'objet de surveillance sanitaire régulière par le biais de contrôles environnementaux des systèmes d'hébergement et d'animaux sentinelles. Des soins adaptés seront donnés aux animaux affectés, par ou sous l'autorité du vétérinaire ou mis à mort selon les recommandations définis dans la consigne en vigueur. Un plan d'action sera établi et mis en place lors d'apparition d'évènements inattendus. Le nombre de manipulations sur l'animal sera réduit au strict nécessaire. Le stress lié à la manipulation peut avoir un impact sur la réponse inflammatoire et immunitaire. Des critères d'arrêt anticipé seront mis en place pour chaque procédure afin de réduire tout inconfort, stress, souffrance ou douleur inutile.

Choix des espèces

La grande majorité des modèles et techniques utilisés dans la recherche médicale et pharmaceutique ont été décrits chez le rat et la souris. De nombreuses données sur les modèles d’allergie chez le rongeur existent déjà dans la littérature et peuvent être utilisées pour la mise en place des modèles et aider à l'avancement des projets (doses de l'agent allergènes, effets de molécules de références etc.) Adulte : Les données de la littérature indique clairement que les rats et les souris adultes représentent des modèles fiables pour l'évaluation de l'efficacité de composés dans le domaine des pathologies allergiques

240 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un accident vasculaire cérébral est provoqué chirurgicalement chez chaque animal sous anesthésie, suivi d'injections d'une thérapie combinant vésicules extracellulaires et un traitement moléculaire. Le porteur indique une perte de poids d'environ 10 % et des déficits neurologiques présentés comme réversibles en une semaine, et utilise des rats hypertendus pour se rapprocher des patients. Tous les rats sont mis à mort pour prélever le cerveau, les retombées cliniques étant renvoyées au long terme avec un impact socioéconomique décrit comme "très important".

Objectifs

Face au manque de l’efficacité des traitements actuels contre l’AVC et de leur courte fenêtre thérapeutique, ce projet a pour but d’évaluer une nouvelle thérapie combinant les vésicules extracellulaires (VE) et un un traitement moléculaire mimétique des héparanes sulfates, à la suite d’une ischémie cérébrale chez le rat. Les effets bénéfiques des VE et du traitement moléculaire, administrés séparément, ont déjà été montrés dans des modèles in vitro et in vivo, y compris dans notre laboratoire. Les VE seront issues des cellules souches mésenchymateuses (CSM) humaines préalablement traités ou non par le traitement moléculaire. La préexistence de l’hypertension artérielle chronique (HTA) est connue pour être un facteur de risque et un facteur aggravant important pour l’AVC. Aussi, pour se rapprocher le plus possible des conditions cliniques, nous utiliserons dans ce projet des rats normotendus et des rats hypertendus.

Bénéfices attendus

Les accidents vasculaires cérébraux (AVC) constituent un problème majeur de santé public. Ils représentent la 2ème cause de mortalité et la 1ère cause d’handicap chez l’adulte. Plusieurs facteurs de risque favorisent le déclenchement de cette pathologie dont l'hypertension artérielle chronique qui est le facteur de risque le plus important. Dans les AVC de types ischémiques, la thrombolyse et la thrombectomie mécanique sont les seules interventions approuvées par les autorités de santé. Cependant, ces interventions ne sont applicables que chez une minorité de patients. Aussi, il est crucial de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les AVC. Dans ce contexte, notre projet devrait permettre le développement d’une nouvelle intervention thérapeutique associant les VE et le RGTA pour protéger et réparer le cerveau et améliorer la récupération neurologique après un AVC. L’impact socioéconomique d’un tel développement sera très important.

Procédures

Les animaux sont soumis à plusieurs types d’interventions : - Chirurgie (induction de l’AVC sous anesthésie générale) : 1 heure maximum par animal, réalisée une seule fois sur chaque animal, les 240 animaux sont concernés. - Injection intra-artérielle (animal anesthésié ) : 1 fois (1 h après l’induction de l’AVC) ; 5 minmaximum par animal, les animaux du groupe 2, 5 et 6 sont concernés, donc 120 animaux au total. - Injection intraveineuse (animal anesthésié) : 1 fois, 24 h après l’induction de l’AVC ; 10 min maximum par animal. Les animaux des groupes 2, 3, 4, 5 et 6 sont concernés, donc 200 animaux au total

Impact sur les animaux

Dans le modèle d’ischémie utilisé, les animaux décrivent une perte de poids (10% environ) ainsi que des déficits neurologiques (diminution de l’activité locomotrice) pendant les 3-4 jours suivant l’induction de l’ischémie cérébrale. Cependant, la perte de poids et les déficits neurologiques sont réversibles et les animaux récupèrent spontanément un bon état général au bout d’une semaine. Ces critères seront pris en compte dans les points limites de l’étude.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort , sous anesthésie profonde, dans le but de récupérer les cerveaux pour analyses en post-mortem.

Remplacement

L’AVC, une pathologie complexe, fait intervenir différents acteurs moléculaires (molécules de signalisation cellulaire intervenant dans le fonctionnement cellulaire, l’inflammation et la mort cellulaire) ainsi que des acteurs cellulaires (y compris neurones, les cellules gliales et les cellules endothéliales). Bien que des tests aient déjà été réalisés sur des modèles cellulaires in vitro, pour l’instant, il n’existe aucun modèle de substitution qui permet de mimer dans sa complexité la physiopathologie de l’AVC. De plus, l’utilisation d’animaux présentant des facteurs de comorbidité (HTA) permet d’avoir un modèle se rapprochant de l’humain et de déterminer ainsi la stratégie à suivre pour le traitement de l’AVC ischémique.

Réduction

L’utilisation des méthodes d’investigation non invasives telles que l’imagerie par IRM et les tests de comportements se conforme à la réglementation en vigueur dans le respect de la réduction du nombre d’animaux. Celles-ci permettent de suivre l’évolution de l’AVC à différents temps sans nécessité d’euthanasier plusieurs animaux à chacun de ces temps. Chaque animal est dans ce cas son propre contrôle ce qui permet de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour l’étude. Dans le but de pouvoir réaliser des tests statistiques, l’estimation du nombre d’animaux par groupe est basée sur les données de nos études antérieures chez le rat et le nombre d’animaux par groupe a été déterminé par une approche statistique. Par conséquent, nous estimons que 20 rats par groupe est suffisant pour réaliser les tests statistiques. Les résultats de la première cohorte nous permettront de réaliser des statistiques séquentielles et ainsi de décider du nombre d’animaux à inclure dans la deuxième cohorte pour obtenir des résultats significatifs et ainsi de réduire le nombre d’animaux au total

Raffinement

Dès leur arrivée, les animaux seront mis en groupe sociaux (2 rats par cage) dans des cages standards répondant aux normes Européennes. Ils auront un temps d’adaptation avant toute expérimentation et ils bénéficieront également d’enrichissement via des stimulations sensorielles par différents objets disposés dans les cages. Tout au long du protocole, un personnel compétent surveillera les animaux afin de déterminer leur état (poids, apparence physique) et la mise en place, si nécessaire, de mesures afin d’améliorer le bien-être animal. Cette évaluation sera réalisée quotidiennement. Enfin, les différents protocoles ont été pensés de manière à limiter la souffrance animale par l’administration d’agents analgésiques et anesthésiques appropriées et par le choix de points limites cohérents.

Choix des espèces

Le rat est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine de l’ischémie cérébrale : les modèles d’ischémie focale sont bien connus et de nombreux mécanismes de cette pathologie ainsi que des essais de neuroprotection ont ainsi été étudiés chez cette espèce animale. En effet, l’anatomie ainsi que la circulation cérébrale sanguine du rat sont bien décrites et, par ses grands traits, semblables à celles de l’Homme. De plus, cette espèce se prête facilement à l’étude fine des capacités sensorimotrices et cognitives par l’intermédiaire de tests comportementaux appropriés. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour l’étude de l’ischémie cérébrale. Les animaux utilisés ont un poids d’environ 250-350 g, âgés de 12 semaines au début du protocole, ce qui correspond à la maturité cérébrale adulte. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes pour comparer les données obtenues avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles d’AVC chez le rat. De plus, chez l’Homme, les AVC surviennent très majoritairement chez l’adulte.