Rats
Définition de la biodistribution et du potentiel de remodelage musculaire de la population cellulaire MuStem humaine chez le rat dystrophique (DMDmdx)
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles musculosquelettiques
154 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 114 tués à l'issue et 40 reproducteurs maintenus en vie pour l'élevage. Modèles de la myopathie de Duchenne, ils reçoivent des injections intracardiaques ou intramusculaires de cellules souches humaines et un traitement immunosuppresseur, et subissent des prélèvements sanguins, des échographies et des tests musculaires, avant la mise à mort de la plupart pour prélever muscles et organes. Le porteur affirme n'attendre pas d'effets indésirables majeurs de ces injections, en s'appuyant sur des essais antérieurs chez le chien. Il justifie le rat dystrophique par les limites du modèle souris et le coût du modèle chien.
Objectifs
La dystrophie musculaire de Duchenne est la plus fréquente des dystrophies musculaires avec un garçon nouveau-né sur 3500. C’est une maladie génétique caractérisée par une mutation du gène codant une protéine musculaire : la dystrophine et entrainant son absence dans les fibres musculaires. Ceci entraîne une destruction des fibres puis le remplacement du muscle par du tissu fibreux et graisseux. Cliniquement, une réduction de la masse musculaire et une faiblesse musculaire sont observées conduisant au décès des patients vers l’âge de 20-30 ans. Il n’existe aucun traitement de la maladie à ce jour. L’injection de cellules saines fait partie des orientations thérapeutiques prometteuses. L’identification de populations de cellules souches au sein de tissus adultes ces dernières années et la démonstration de leur potentiel myogénique (capacité à régénérer des fibres musculaires, à en former de nouvelles ou des progéniteurs myogéniques de réserve) offrent des perspectives intéressantes. Notre équipe a isolé une population de cellules souches dérivées du muscle squelettique (cellules MuStem) et démontré son efficacité chez le chien malade en montrant des propriétés phénotypiques (propriétés à exprimer un ensemble de marqueurs de lignées cellulaires) et comportementales similaires à celles décrites pour la population canine. L’objectif du projet est de poursuivre la caractérisation des potentialités de la population hMuStem pour renseigner si celle-ci peut être présentée comme un support de biothérapie innovante pour les dystrophies musculaires. Pour cela, nous souhaitons déterminer l’innocuité (absence de caractère nuisible) et l’efficacité de son administration dans la circulation sanguine chez le rat dystrophique (DMDmdx). Ce modèle se révèle être un très bon modèle animal de la DMD pour réaliser les 1ères phases d’évaluation de nouveaux produits thérapeutiques. C’est la raison pour laquelle l’étude de biodistribution (dissémination au sein de l’organisme avec étude du comportement de l’agent à coloniser les tissus musculaires et/ou s’accumuler dans les organes filtres comme le poumon, le foie ou encore le rein) et d’impact de la population hMuStem sur la fonction et la reconstruction du muscle a été définie dans ce modèle.
Bénéfices attendus
Le projet décrit ici repose sur un ensemble conséquent de résultats in vitro et in vivo (chien, rongeurs, primate-non-humain) acquis progressivement ces 12 dernières années et qui tendent à montrer un potentiel thérapeutique des cellules MuStem dans le cadre de la prise en charge des affections musculaires et en particulier de la DMD. Pour progresser sur la qualification de cet agent dans le but de statuer sur son positionnement ou non comme médicament innovant, des données in vivo sur sa biodistribution et son efficacité de réparation musculaire (fonction et tissu) en contexte dystrophique sont fondamentales à ce stade du programme de recherche et pourraient permettre de proposer une nouvelle stratégie thérapeutique pour une pathologie musculaire qui reste à ce jour sans traitement curatif.
Procédures
Partie I : (i) Les animaux recevront les cellules hMuStem par injection intracardiaque (IC) unique, sous anesthésie générale et analgésie, plus contrôle échographique. Durée : 2 min. (ii)3 prises de sang en ante mortem, sous anesthésie, au niveau de la veine cave. Durée : 1 min. (iii)4 animaux supplémentaires auront une injection intraveineuse de produit de contraste afin de calibrer le protocole d’administration par voie IC sous contrôle échographique, pendant l’anesthésie générale préalablement au sacrifice. Durée : 1 min. Partie II : (i) Les animaux recevront les cellules hMuStem, en une seule fois, par injection intramusculaire (2 injections sur 3 muscles différents d’un membre), sous anesthésie générale et analgésie. Le même protocole d’injection sera mené sur le membre opposé avec du sérum physiologique. Durée : 10min (ii)3 jours au préalable, un traitement immunosuppresseur sera administré par voie sous-cutanée (SC) sur animaux vigiles ou sous légère tranquillisation, à raison de 4 injections à 10 jours d’intervalle. Durée : 3min (iii)5 prises de sang sur animal tranquillisé, à la veine jugulaire ou sous anesthésie avant sacrifice, au niveau de la veine cave. Durée : 1 min. Partie III A : (i) Les animaux recevront les cellules hMuStem ou du sérum physiologique sous forme de 3 IC espacées de 6 à 9 jours, sous anesthésie générale et analgésie. Durée : 2 min. (ii)un traitement immunosuppresseur identique à la Partie II (iii)prises de sang : n= 6 pour les suivis 2 mois, n=8- pour les suivis 4 mois. (iv) Un électrocardiogramme (ECG) et une échocardiographie en pré- injection, et avant sacrifice. Durée : 2 min (v)Une évaluation musculaire : 2 tests d’exploration fonctionnelle (test d’agrippement et test d’endurance) et un test d’évaluation motrice (test d’actimétrie) seront réalisés sur chaque animal à raison d’une fois au cours de son suivi . Durée : 25 min. Partie IIIB : Même protocole que la partie IIIA, mais avec un suivi des animaux de 7mois post injection. Les interventions seront donc identiques mais en nombre plus élevés : (i) prise de sang : n=11 (ii) 4 ECG et 4 échocardiographies en pré-injection, J60, J120 et J210 (iii) 3 évaluations musculaires (motrices et fonctionnelles) à J60, J120 et J210
Impact sur les animaux
L’administration par voie intra-cardiaque des cellules hMuStem ne devrait pas occasionner d’effets indésirables si on s’en réfère aux résultats que nous avons obtenus précédemment avec ce type cellulaire dans le cadre de protocoles d'injection systémique (intra-artérielle et intraveineux) chez le chien dystrophique. Néanmoins, nous serons attentifs à la formation d’agrégats cellulaires comme cela a été relaté pour d’autres types cellulaires, lesquels peuvent être à l’origine de troubles de la circulation sanguine. L’administration intra-musculaire des cellules hMuStem induira un dommage local avec le passage de l’aiguille. La mise en place du traitement immunosuppressif par voie sous cutanée ne devrait pas non plus occasionner d’effets indésirables majeurs mais un point de vigilance sera porté sur l’apparition d’éventuels dérèglements biochimiques et/ou hématologiques. L’échocardiographie et l’électrocardiogramme, les tests de force et d’endurance et le test d’actimétrie sont des techniques d’abord non invasives pour lesquelles il n’est pas identifié d’effet indésirable.
Devenir
A l'issue des procédures décrites dans ce projet, tous les animaux inclus dans cette étude (n=114 maximum) seront euthanasiés afin d’obtenir des échantillons de tissus qui seront utilisés pour des analyses qui ne peuvent pas se faire du vivant de l'animal. Les prélèvements concerneront certains muscles squelettiques, diaphragme, coeur et organes filtres correspondant au poumon, foie, rein et rate, et comporteront au moins 4 fragments par tissu. Seuls les animaux reproducteurs, au nombre de 40, seront maintenus en vie pour maintenir la production de l'élevage de rats DMDmdx.
Remplacement
Il ne sera pas possible dans cette étude dans la mesure où il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative pertinente et robuste pour tester l’effet d’un traitement de médecine régénérative in vivo. L’animal est le seul organisme vivant permettant d’étudier l’impact de cette thérapie dans différents organes et sur le phénotype de l’animal malade.
Réduction
Le nombre d’animaux qui a été fixé par groupe dans les 3 parties du projet repose sur notre expérience précédente dans la mise en place de protocoles de médecine régénérative lors desquels nous avons pu obtenir des résultats cohérents et reproductibles. Ainsi, ces nombres, validés par un agent agrégé en biostatistiques, sont minimaux et permettent d’assurer la robustesse (au sens de l’analyse statistique) des résultats sans être excessif en termes d’animaux à inclure. Les jeux de données acquis seront analysés selon des modèles linéaires généralisés qui pourront être complétés par des analyses multivariées type « analyse factorielle multiple - AFM. Par ailleurs, le projet a été structuré en 3 parties séquentielles afin de réduire au maximum l’utilisation d’animaux dans le sens où les parties I (biodistribution) et II (preuve de concept) seront déterminantes pour la suite du projet.
Raffinement
En ce qui concerne le raffinement (3R), le bien-être animal passera par : - de bonnes conditions d'hébergement selon la réglementation avec enrichissement du milieu (tunnels en cartons ou PVC, frisottis de papier, bûchettes de bois et hébergement à deux animaux). - un suivi régulier des animaux (observations biquotidiennes, pesées régulières, analyse du comportement), - l'instauration de points limites pertinents avec mise en place de mesures adaptées (anesthésies, analgésie ou euthanasie), - une réactivité accrue du personnel animalier avec mise en place d’une grille d'évaluation de la douleur par une liste de comportements /constatations à évaluer dès que nécessaire pour détecter précocement tout point limite et mettre en place les actions adéquates - la mise en place de mesures adaptées en fonction des interventions (anesthésie et analgésie).
Choix des espèces
Les modèles animaux de la DMD les plus souvent utilisés sont des modèles rongeurs et plus spécifiquement le modèle de la souris mdx. Ce modèle souffre néanmoins de sérieuses limitations, notamment la mise en place de mécanismes de compensation aboutissant à des lésions musculaires très limitées et une faiblesse musculaire quasiment inexistante. Ces éléments limitent grandement la transposition des résultats obtenus sur ce modèle à l’Homme. Le chien Golden Retriever Muscular Dystrophy (GRMD) présente des lésions tissulaires proches de celles retrouvées chez les patients DMD, mais reste un modèle de gros animal coûteux et lourd à manipuler. Ainsi, le choix du modèle de rat DMDmdx s’avère pertinent dans le sens où ce dernier présente un phénotype fonctionnel et tissulaire proche de celui décrit chez le patient DMD, caractérisé par une nécrose des fibres musculaires, une fibrose, une adipose ainsi qu’une faiblesse musculaire et une cardiomyopathie dilatée. Les rats seront inclus à l’âge 2 mois afin de se placer dans un contexte de lésion musculaire suffisamment avancé pour pouvoir détecter un éventuel effet sur la fonction musculaire et/ou le remodelage tissulaire. Par ailleurs, la mortalité des rats DMDmdx étant observée particulièrement à partir de 8 mois d’âge, il était important que l’inclusion des animaux se fasse précocement pour être en mesure d’avoir un suivi de l’impact éventuel sur une période satisfaisante mais aussi de possiblement observer une répercussion sur la durée de vie des animaux traités.
Réparation du nerf péronier lésé avec perte de substance à l’aide d’une greffe de vésicules extracellulaires issues des cellules souches olfactives humaines, chez le rat.
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
250 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit la section d'un nerf de la patte avec une perte de sept millimètres, réparée par un greffon, puis des injections, des tests locomoteurs hebdomadaires pendant douze semaines et une électrophysiologie terminale sous anesthésie, pour évaluer des vésicules issues de cellules souches olfactives humaines. Le porteur reconnaît que la lésion nerveuse entraîne des déficits sensorimoteurs et peut conduire à de l'automutilation, tout en affirmant que cette chirurgie n'entraîne pas de perte de poids. Il n'utilise que des mâles pour éviter la variabilité hormonale et conclut que le recours au mammifère est "absolument indispensable".
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’étudier l’efficacité de vésicules extracellulaires issues de cellules souches de la muqueuse olfactive dans la réparation nerveuse périphérique. Il s’agira d’étudier chez le rat Sprague Dawley, une nouvelle stratégie thérapeutique consistant, après lésion du nerf péronier (transsection) avec perte de substance de 7 mm, à réparer le nerf à l’aide d’un manchon veineux (segment de veine sous cutanée) dans lequel ont été injectées des vésicules extracellulaires fraiches ou cryopréservées. L’objectif principal étant d’améliorer la repousse des axones sensitifs et moteurs afin de conduire à une récupération sensori-motrice la plus complète possible. A terme, ces résultats pourraient être transférés aux bénéfices des patients ayant subit des dommages nerveux périphériques (plaies, coupures, sections…) avec perte de substance nerveuse suffisante pour ne permettre la suture bout-à-bout des manchons nerveux. L'évaluation qui portera sur la récupération locomotrice et l’activité electrophysiologique (réflexe H) sera complétée par des analyses histologiques et biochimiques.
Bénéfices attendus
Les vésicules extracellulaires dérivées des cellules souches olfactives humaines apparaissent comme une alternative prometteuse et innovante pour réparer les nerfs périphériques. En effet, ces vésicules ont des effets similaires à ceux de leurs cellules mères et bénéficient d'opportunités uniques telles que la disponibilité immédiate, la faible immunogénicité et l’absence de différenciation anarchique. Notre étude pré-clinique vise à tester l’efficacité thérapeutique de ces vésicules sur la régénérescence nerveuses périphériques en vue de proposer une thérapie cellulaire innovante transférable à l’Homme. Dans le domaine de la réparation nerveuse périphérique, l’extrapolation des résultats des études précliniques in vitro et in vivo à l’Homme échoue dans la grande majorité des cas et moins de 10% des substances testées en essais cliniques aboutissent à la mise sur le marché d’un médicament. Notre étude représente donc une étape très importante avant un transfert vers la clinique humaine.
Procédures
1) Chirurgie initiale lésionnelle (lésion nerveuse périphérique) et réparatrice (insertion d'un machon veineux ou nerveux) (tous les groupes expérimentaux) + implantation d'une mini-pompe osmotique (uniquement pour 3 groupes expérimentaux / 10) réalisée sous anesthésie : durée 1h. 2) Injections intramusculaires de vésicules (uniquement pour 3 groupes expérimentaux / 10) réalisée sous anesthésie : 1 injection par semaine pendant 4 semaines : durée 5 min. 3) Tests comportementaux (tous les groupes expérimentaux) réalisés en condition éveillée 1 fois par semaine pendant 12 semaines : durée 20 min. 5) Electrophysiologie terminale (tous les groupes expérimentaux) réalisée sous anesthésie et sans réveil : durée 1h.
Impact sur les animaux
La lésion nerveuse périphérique entraîne des déficits sensorimoteurs sous-lésionnels. Les nuissances éventuelles pouvant être rencontrées chez les animaux sont les infections liées à la chirurgie, les effets secondaires post-anesthésie, les douleurs post-traumatiques ou liées aux injections intramusculaires, le stress liés à leur manipulation (pour anesthésie, mesure périodique du poids…) ou lors des tests comportementaux. Il faut également noter que les lésions nerveuses périphériques peuvent conduire à de l’autophagie. Toutefois, l’expérience montre que ce type de chirurgie n’entraîne pas de perte de poids, de problème de miction, de déshydratation ou une dénutrition post-chirurgicale.
Devenir
A l'issu du projet, tous les animaux seront euthanisés afin de prélever les nerfs et les muscles pour une étude anatomo-histologique.
Remplacement
Le rat est un mammifère dont les mécanismes neurobiologiques mis en oeuvre après une section du nerf avec perte de subtance sont proches de celui de l’humain. Il n’existe pas d’alternative à l’utilisation de mammifères pour réaliser notre étude pré-clinique. Les études in vivo n’utilisant pas des mammifères ou celles in vitro réalisées à partir de cellules issues de mammifères livrent une quantité infime d’informations au regard de ce qu’il pourrait se passer chez l’Homme. Notre projet vise à proposer une stratégie innovante de réparation nerveuse périphérique directement transférable vers la clinique humaine. Pour cette raison, l’utilisation de mammifères est absolument indispensable et nécessaire. Il n’existe pas d’alternative au modèle animal in vivo. Pour cela, nous avons choisi d’utiliser des rats plutôt que des primates non humains, des bovidés, des porcidés, des canidés, des félidés… ou des murinés du genre Mus dont nous n’avons aucune expertise en termes de récupération post-traumatique nerveuse périphérique.
Réduction
Afin de mener à bien notre projet, nous devons constituer 10 groupes expérimentaux. Ces groupes seront constitués de rats males Sprague Dawley d’environ 250 g lors de la chirurgie initiale. Des males seront choisis en raison de l’absence d’importants cycles hormonaux mensuels pouvant introduire une grande variabilité dans les résultats attendus. Dans un souci de réduction du nombre d’animaux, chaque animal opéré sera engagé dans les 3 étapes expérimentales successives décrites dans la chronologie du protocole. Dans la mesure où la comparaison des résultats entre les groupes sera réalisée avec des tests statistiques paramétriques, nous prévoyons, au regard de nos expériences passées, d’inclure initialement dans chaque groupe au maximum 25 animaux, soit un total de 250 animaux. Toutefois, afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, nous enrolerons, dans un premier temps, 5 animaux par groupe, soit un total de 50 animaux. A l’issue de cette première vague expérimentale, nous calculerons, au regard des résultats obtenus et de la variabilité intergroupe, d’une puissance de 80% et d’un seuil de significativité de 5%, avec un test statistique approprié, les effectifs nécessaires pour pouvoir montrer une différence entre les groupes traités et ceux non-traités. Si le calcul indique que les effectifs nécessaires sont supérieurs à ceux envisagés initialement, nous réviserons nos objectifs initiaux et réduirons les groupes expérimentaux afin de privilégier les modes d’administration les plus favorables. Si, malgré la réduction du nombre de groupes, aucune différence intergroupe ne peut être dégagée pour un nombre d’animaux par groupe inférieur ou égal à celui initialement prévu, nous abandonnerons l’étude et concluerons à l’inéfficacité du traitement thérapeutique.
Raffinement
Du gel ophtalmique sera utilisé au cours de la chirurgie afin d’éviter l’assèchement de la cornée. Une injection de sérum physiologique glucosée permettra de réhydrater les animaux en fin de chirurgie. Une couverture antibiotique, ainsi qu’un traitement antalgique seront administrés au cours de la semaine suivant la chirurgie afin de réduire les éventuelles infections et douleurs post-chirurgicales. L’observation détaillée quotidienne de l’état de santé des animaux et l’évaluation de l’expression faciale permettront de prendre l’ensemble des mesures detinées à réduire la douleur et le stress. Les animaux atteignant le point limite seront euthanasiés selon la procédure réservée aux animaux éveillés. Au cours des 7 jours suivant la chirurgie, les animaux seront placés seuls dans une cage le temps que les plaies cicatrisent afin d’éviter les blessures et réouverture des plaies que pourraient occasionner les congénaires. De l’eau et de la nourriture seront données ad libitum. A l’issue de cette période critique, ils seront replacés avec leurs congénaires dans des cages enrichies avec des objets (tubes en polycarbonate rouge…) et de l’eau et de la nourriture données ad libitum. L’hébergement des animaux sera réalisé dans l’animalerie du laboratoire dont la température des locaux est aux environs de 22°C avec un cycle jour/nuit 12h/12h. Nous nous efforçerons à chaque instant d’affiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive, et des soins et des gestes adaptés, avec notamment, pour ces derniers, une diminution de l’angoisse et du stress des animaux par manipulation avant, pendant et après tout prélèvement, intervention et test comportemental.
Choix des espèces
Les mécanismes neurobiologiques mis en oeuvre chez les mammifères après une section du nerf avec perte de subtance sont proches de celui de l’humain. C'est pour cette raison que nous avons choisi d'étudier ces mécanismes chez les rongeurs (rats). Il n’existe pas d’alternative à l’utilisation de mammifères pour réaliser notre étude pré-clinique. Par ailleurs, afin d'étudier les processus régénératifs et la plasticité nerveuse, il est impératif d'utiliser des jeunes adultes. C'est pour cette raison que nous utiliserons des animaux de 250 g, c’est-à-dire de 2 mois d’âge environ.
Modèle de réparation de fracture chez le rat et effets de molécules ciblant la qualité osseuse
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
298 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie de pose d'une broche puis une découpe du fémur pour simuler une fracture, suivie de radiographies répétées sous anesthésie et d'injections sous-cutanées quotidiennes, avant sa mise à mort pour prélever les os. Le porteur reconnaît que la fracture provoquée est douloureuse à court terme et met en avant l'analgésie mise en place. Il justifie le rat par l'absence de modèle in vitro reproduisant une fracture et par la possibilité d'y poser des broches de chirurgie humaine.
Objectifs
La réparation des fractures a fait l’objet d’études antérieures et certaines molécules ont été développées et approuvées pour traiter les complications osseuses associées aux fractures (retard de consolidation, non consolidation, etc…). Cependant, l’utilisation de ces molécules est associée à de fortes contraintes ou effets secondaires indésirables (implantation locale via un dispositif médical nécessitant une chirurgie correctrice, augmentation localisée de la résorption osseuse, formation osseuse anarchique et anormale et quelques fois un œdème) avec en plus un fort coût économique qui ne semble pas justifié par rapport aux bénéfices apportés aux patients. Aujourd’hui, il n’y a pas de molécule, administrable par injection, permettant de faciliter la réparation des fractures et de réduire le risque de complications et de chirurgies correctrices. La consolidation des fractures osseuses nécessite une activation contrôlée des voies de la formation osseuse. La différentiation des cellules impliquées dans la réparation osseuse est conditionnée par la qualité du matériau osseux sur lequel ces cellules reposent et un changement de dureté/raideur du matériau osseux est suffisant pour activer le programme de différentiation de ces cellules. Cependant, aujourd’hui, aucune donnée sur la qualité du matériau osseux au site de fracture ou adjacent au site de fracture n’est disponible. Récemment, de nouvelles molécules ont été développés et leurs mécanismes d’action suggèrent une augmentation de la résistance osseuse dans les semaines qui suivent l’initiation du traitement. In vitro, ces composés stimulent la formation osseuse et augmente la qualité du matériau osseux déposé, résultant in fine en une meilleure résistance osseuse. Ces composés sont administrables par voie sous-cutanée et l’hypothèse de travail est qu’ils pourraient améliorer la réparation et consolidation des fractures osseuses réduisant ainsi les complications associées. Les objectifs de ce projet sont : (1) de générer un modèle animal de fracture fémorale afin d’évaluer la qualité du matériau osseux au site de fracture et juste à côté ; et (2) d’investiguer si les nouvelles molécules pourraient représenter une solution thérapeutique innovante dans la prévention des complications osseuses associées aux fractures.
Bénéfices attendus
Les principaux bénéfices de ce projet sont une meilleure compréhension de la qualité du matériau osseux afin de comprendre la contribution dans la différentiation cellulaire. Le second bénéfice est représenté par l’évaluation de nouvelles molécules qui a terme peuvent apporter un réel plus dans la prise en charge des patients avec fractures osseuses.
Procédures
Les animaux subiront une procédure chirurgicale afin de réaliser l'implantation d'une broche osseuse pour stabiliser la fracture et une découpe du fémur afin de simuler une fracture osseuse. Cette procédure sera réalisée sous anesthésie générale et une administration de médicaments anti-douleur sera réalisée avant incision de la peau. De même, un antibiotique sera administré aux animaux avant la procédure chirurgicale afin de réduire le risque d'infection. Un suivi longitudinal des animaux sera réalisé par radiographie (3 radiographies pour les temps court et 8 radiographies pour le temps long) après anesthésie gazeuse. Des traceurs fluorescents non toxiques seront injectés aux animauxpar voie sous-cutanée afin de standardiser les mesures avant mise à mort. Les nouvelles molécules seront administrées quotidiennement par voie sous-cutanée. Les injections sous cutanée seront réalisées sur animaux vigiles avec une contention adaptée.
Impact sur les animaux
La réalisation chirurgicale de la fracture osseuse et de l’ostéosynthèse pourra être perçue comme une procédure douloureuse à court terme. Cependant, il est à noter ici que la séquence utilisée, pose d’une broche pour stabiliser le fémur avant fracture, a été choisi afin de ne pas engendrer de lésions des tissus entourant le fémur et de ne pas entrainer de mouvements des fragments osseux. Ceci dans un but de réduire la douleur ressentie par les animaux. Afin de réduire la souffrance des animaux, ce geste sera réalisé sous anesthésie générale et des médicaments anti-douleur seront administrés au moment du geste (analgésie péri et post-opératoire immédiate) et maintenu sur une période de 48h. Les animaux recevront également une dose cumulative de rayons x estimé au maximum à 0.020 mSv, équivalente à 60h d’irradiation naturelle. Enfin une grille de points limites adaptés a été mise en place et sera utilisée pour évaluer l’inconfort/souffrance des animaux. Le cas échéant, une administration de médicament anti-douleur pourra être réalisée. Les administrations de traceurs fluorescents et de nouvelles molécules thérapeutiques seront réalisées par voie sous-cutanée.
Devenir
Le but de l'étude étant d'étudier le retentissement d'une fracture osseuse, avec ou sans traitement, sur la qualité de la matrice osseuse, nous devons collecter des pièces osseuses à des temps bien précis. Les animaux de l'ensemble des procédures expérimentales seront mis à mort à la fin des 4 procédures de ce projet.
Remplacement
Malheureusement, à ce jour, aucune donnée de la littérature n’est disponible et ne permet pas de développer un modèle in vitro ou in silico permettant de reproduire les conséquences moléculaires, cellulaires et tissulaires d’une fracture osseuse. Le recours à l’emploi d’un modèle de petit animal est requis pour évaluer ces questions. Le rat est un modèle animal reconnu, peu coûteux et facilement maintenu en captivité. La physiologie de réparation des fractures chez cet animal est également transposable à l’homme. De plus, la taille des os longs et notamment du fémur, rend possible l’utilisation de broches osseuses utilisées en chirurgie osseuse humaine pour la stabilisation des fractures de phalanges.
Réduction
Le modèle de fracture osseuse proposé dans ce programme (stabilisation par broche osseuse et découpe du fémur pour simuler la fracture) est maitrisé dans notre laboratoire. Les investigations osseuses sont également toutes maitrisées. Les données de la littérature permettent d’établir un échec de la procédure (non-récupération de l’anesthésie, infection osseuse, mauvaise pose de la broche osseuse, points limites) d’environ 18%. Nos études antérieures de qualité osseuse dans des modèles animaux précliniques nous ont permis de réaliser un calcul d’échantillonnage (test d’inférence statistique) afin de déterminer le nombre minimum d’animaux à inclure par groupe pour observer une différence significative de la résistance osseuse et donc in fine de la vitesse de réparation osseuse. En tenant compte de l'ensemble des paramètres, un nombre de 13 animaux par groupe devraient nous permettre d’atteindre la significativité des résultats obtenus. Des tests statistiques seront utilisés et une valeur de p
Raffinement
Les animaux seront hébergés selon les conditions d’hébergements au sein de l’établissement utilisateur, à savoir : hébergement en groupe sociaux dans des cages normalisées, dans une pièce ventilée à hygrométrie et température contrôlées. Les animaux auront à leur disposition de l’eau et de la nourriture à volonté. Un cycle automatique jour/nuit – 12h/12h sera respecté. Il sera mis à la disposition des animaux un abri et de la cellulose pour la constitution d’un nid. Des frisottis de cartons et/ou des petits morceaux de bois à ronger seront mis à disposition. La fracture (stabilisation et découpe osseuse) sera réalisée sous anesthésie générale. Des médicaments anti-douleur seront administrés avant ouverture de la peau et renouvelés pendant les premières 48h post-opératoires. Un antibiotique sera injecté avant ouverture de la peau pour réduire les risques d’infection. Une grille de points limites, adaptée au modèle, sera mise en place et comportera les items suivants : expression faciale, activité, posture, respiration, automutilation, aspect des matières fécales et déshydratation. Le cas échéant une palpation de la zone opérée pourra être effectuée afin de s’assurer que celle-ci n’est pas douloureuse et ne présente pas de signe d’infection osseuse.
Choix des espèces
Une étude préliminaire préclinique sur un modèle rongeur est un prérequis des agences de régulation du médicament pour le développement d’une thérapie osseuse. Le rat est un modèle animal reconnu, peu coûteux et facilement maintenu en captivité. La taille des pièces osseuses rend l’utilisation des dispositifs biomédicaux humains possible pour la stabilisation des fractures. La réparation des fractures chez le rat présente également des mécanismes physiopathologiques similaires à ceux observés chez l’homme. De plus, notre équipe a depuis maintenant 10 ans développés et validés des outils d’analyse de la qualité osseuse directement applicable aux modèles de rongeurs. Les animaux seront utilisés à un âge d’environ 10 semaines +/- 1 semaine. Ce stade correspond à l’entrée dans le plateau de croissance des animaux et le tissu osseux est considéré comme significativement mature à partir de cet âge. De plus, cet âge est couramment employé pour ce modèle, ce qui permettra de faire une comparaison des données obtenues avec les données de la littérature obtenus avec d’autres agents thérapeutiques.
Elevage de rats GK à phénotype dommageable
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système urogénital
420 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, gardés en vie pour maintenir la lignée ou dirigés vers d'autres projets. Il s'agit d'élever une souche de rats spontanément diabétiques, la lignée GK, dont les individus développent hyperglycémie, polyurie et complications tardives comme des neuropathies ou des néphropathies. Le titre du projet qualifie lui-même ce phénotype de "dommageable". Le porteur destine la descendance à des recherches sur le diabète, la dysfonction érectile ou le syndrome des ovaires polykystiques, et décrit la souche comme "non remplaçable".
Objectifs
L’objectif de ce projet est de maintenir et faire prospérer une lignée de rat spontanément diabétique afin de pouvoir réaliser les expérimentations indispensables à l’activité du laboratoire en matière d’exploration préclinique dans les domaines de la dysfonction sexuelle mâle et femelle et des pathologies aux troubles métaboliques.
Bénéfices attendus
L’élevage de rats GK au phénotype particulier permettra l’exploration pré-clinique dans plusieurs domaines (métabolique, santé féminine, dysfonctionnement érectile) afin de sélectionner et tester l’efficacité de candidats médicaments afin de traiter ces troubles.
Procédures
La mesure de la glycémie nécessite une goutte de sang, prélevée à la queue du rat ou bien au niveau de la joue, sur une bandelette afin d’être lue dans un appareil de lecture adéquate. Ce prélèvement sera effectué au maximum une fois par mois, pendant une durée de 30 secondes à 1 minute maximum, chez les rats mâles de 9 semaines afin de choisir les reproducteurs.
Impact sur les animaux
Ces rats sont des rats diabétiques non obèses avec une hyperglycémie, une hypoinsulinémie et une polyurie. Ils peuvent aussi développer des complications tardives comme une rétinopathie, une microangiopathie, neuropathie ou une nephropathie, ou encore une inflammation des intestins qui peut mener à des diarrhées.
Devenir
À l’issue de cette procédure d’élevage, les animaux ont la possibilité d’être maintenu en élevage pour continuer de maintenir la lignée ou pourront être réutilisé le cas échéant sur d’autres des projets portant sur des études sur le diabète, mais aussi la dysfonction uro-génito-sexuelles ou le syndrome des ovaires polykystiques.
Remplacement
Le rat GK (Goto-Kakizaki) est une souche de rat présentant un diabète de type 2 sans obésité. Il s’agit d’un modèle précieux pour les études sur le diabète, mais aussi la dysfonction érectile, l’hyperactivité vésicale ou le syndrome des ovaires polykystiques. Dans ce contexte, l’élevage de rats GK permet une recherche préclinique pour pouvoir évaluer l’efficacité et sélectionner des candidats médicaments innovants pouvant présenter un intérêt dans le traitement de ces pathologies liées à l’expression naturelle du diabète de type II chez cette souche de rat. L’érection ou la miction sont des processus physiologiques nécessitant la coordination de plusieurs mécanismes physiologiques, ainsi, un modèle animal est requis pour pouvoir les étudier et évaluer l’érection et l’effet potentiellement bénéfique d’un nouveau médicament. De plus la souche de rat GK a été démontrée comme un modèle reproduisant les caractéristiques du diabète chez l’homme, incluant notamment une dysfonction érectile et une hyperactivité vésicale ayant fait l’objet d’un publication scientifique. De plus, il a été montré récemment que les rates GK développent spontanément un syndrome des ovaires polykystiques. L’éthiologie de cette pathologie est encore inconnue, et un modèle animal spontané est le meilleur outil pour les recherches scientifiques sur cette maladie. Ainsi le rat GK n’est pas remplaçable car il s’agit d’un modèle complexe qui ne peut pas être reproduit à l’aide d’une lignée cellulaire ou de modélisation informatique.
Réduction
Le nombre d’animaux sera maintenu au minimum et ajusté en fonction des demandes des équipes utilisatrices et du bon maintien de la lignée de manière à pouvoir renouveler les reproducteurs sans consanguinité.. De plus, le rat GK étant un modèle de plusieurs pathologies (syndrome des ovaires polykistiques, dysfonction érectile, urologie, diabète), la descendance mâle et femelle pourra être utilisée dans des projets incluants les procédures expérimentales correspondantes.
Raffinement
Une semaine d’habituation minimum est laissée aux animaux avant de pouvoir les regrouper en cages d’accouplement. Ils sont hébergés en groupe sociaux de 2 ou 3 (en fonction de leur poids/croissance,
Choix des espèces
Afin de limiter l’utilisation de gros animaux tels que le chien, les rongeurs et plus particulièrement le rat est l’espèce animale la plus largement utilisée dans le domaine de la médecine uro-génito-sexuelle. L’organisation anatomique des organes participant à l’activité uro-génito-sexuelle ainsi que leur innervation sont comparables chez le rat et chez l’homme. De plus le rat GK est un modèle spontané de diabète de type 2 et des pathologies uro-génito-sexuelles associées, ainsi que du syndrome des ovaires polykistiques. Les animaux mis en reproduction sont agés au minimum de 9 semaines afin d’avoir atteint leur maturité sexuelle. Le sevrage est effectué entre 4 et 5 semaines, selon le nombre et la taille des petits.
MTD: Evaluation chez le rongeur, de la dose maximale tolérée de composés biologiques ou chimiques d’intérêt.
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Rats : 500
1 500 rongeurs, 1 000 souris et 500 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, la plupart tués à l'issue et soixante-quinze réutilisés en formation. Ils reçoivent des agents à tester par voie orale, sous-cutanée, intrapéritonéale ou intraveineuse afin d'établir la dose maximale tolérée, avec pesées et prélèvements sanguins quotidiens. Le porteur décrit les effets attendus de la première administration, perte de poids, posture courbée, expressions faciales de douleur, hypothermie ou diarrhée, et fixe un point limite à 20 % de perte de poids. Il affirme que les méthodes alternatives ne permettent pas de prévoir la toxicité in vivo et que la tolérance doit être "vérifiée chez le rongeur".
Objectifs
Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. En 2020, quelque 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer (CIRC). Selon l’OMS, une personne sur cinq souffrira d’un cancer dans sa vie. Un homme sur huit et une femme sur onze en décèderont. Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, différents types de cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente à un traitement. L’objectif de ce projet est d’évaluer la tolérance des animaux pour un agent thérapeutique pouvant être d’origine biologique, chimique, cellulaire, viral ou bactérien après une ou plusieurs administrations chez le rongeur. Ce projet permettra d’identifier la dose maximale après une ou plusieurs administrations qui n’engendre pas d’effet toxique chez les animaux (tolérance, Maximum Tolerated Dose, MTD) afin d’utiliser ces composés aux doses non toxiques pour d’autres expériences.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour finalité d’évaluer la tolérabilité d’un traitement par un agent thérapeutique pouvant être d’origine biologique, chimique, cellulaire, viral ou bactérien après une ou plusieurs administrations chez le rongeur. Cette évaluation est critique afin de pouvoir ensuite envisager des études d’efficacité sur des modèles expérimentaux complexes (animaux porteurs de tumeurs) permettant de démontrer des preuves concepts avant d’envisager des investigations plus poussées en clinique.
Procédures
Les animaux seront identifiés par la mise en place d’un système d’identification sous anesthésie générale (moins d’1 min, une seule fois) pouvant entrainer un stress léger. Les animaux seront randomisés pour former des groupes homogènes en poids pouvant entrainer un stress de 1-2j lié au changement de congénères (une seul fois). Les traitements peuvent être administrés aux animaux par voies : • Orale sur animaux vigiles (moins d’1 min) (max de 40 mL/kg/jour repartie en plusieurs prises / 4 prises maximum intervalle de 6h) • Sous-cutanée sur animal anesthésié (moins de 5 min) ou vigile (moins d’1 min) au niveau des flanc ou du dos (jusqu’à 10 mg/kg (rat) ou 40 mL/kg (souris) réparti sur 2-3 sites avec un maximum de 3 sites par jour) • Intrapéritonéale sur animal anesthésié (moins de 5 min) ou vigile (moins d’1 min) (jusqu’à 20 mL/kg (rat) ou 80 mL/kg (souris)), • Intraveineuse sur animal anesthésié (moins de 5 min) ou vigile (moins d’1 min) ( jusqu’à 25 mL/kg en injection lente avec, pour des volumes supérieur à 20 mL/kg, des produits chauffé à 37°C), Les animaux seront pesés et observés (moins de 5 min, tous les jours) pour détecter d’éventuelle effets secondaires. Les prélèvements sanguins, lorsqu’ils sont requis, seront effectués sous anesthésie par les méthodes recommandées les moins traumatisantes et en prélevant le volume minimum requis. Les méthodes de prélèvements sont validées par le vétérinaire : • Jugulaire (3 prélèvements par jugulaire/jours) (moins d’1 min) • Saphène (3 prélèvements par coté sur 24h) (moins d’3 min) • Queue, soit au niveau de la veine mandibulaire (2 prélèvements / 24h), (moins d’1 min) • Via un cathéter (fémorale ou jugulaire) (moins d’1 min après la pose du cathéter, moins de 5 min) Tous les prélèvements sanguins seront faits par des personnes compétentes. La fréquence des prélèvements et les volumes collectés respecteront les recommandations du comité d’éthique. Un document de référence est à disposition des concepteurs et des techniciens. Pour les prélèvements, unique ou répété, individuels d’urine et/ou de fèces, il pourra être nécessaire d’héberger individuellement les animaux en cages, sans enrichissement (max une heure). Les prélèvements de tissus et/ou d’organes seront réalisés sur animaux euthanasiés. Avant euthanasie, sous anesthésie générale profonde avec analgésie, une perfusion pourra être réalisée pour rincer les organes. Cela durera moins d’une 15 minutes avant euthanasie.
Impact sur les animaux
Lors de l’injection pour la première fois d’un agent thérapeutique, les effets sur l’animal peuvent être : une perte de poids, un aspect corporel détérioré, une distension abdominale, une posture courbée, la texture de la fourrure altérée, une couleur des oreilles et des pattes plus pâles ou cyanosées, des expressions faciales de douleur, une respiration et des habitudes naturelles détériorées ; critères d’observation avancés : comportement provoqué anormal, déshydratation, diarrhée, hypothermie…
Devenir
Les animaux ayant fait l’objet de gestes techniques et reçu des traitements, aucune autre utilisation ne peut être envisagée. Tous les animaux inclus dans les groupes de traitement seront mis à mort à l’issue de chaque procédure (la méthode utilisée étant l’une de celles autorisées par la Directive 2010/63). Les animaux ayant reçu une administration unique et étant rester moins d’une semaine en procédure pourront être utiliser en formation.
Remplacement
Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir la toxicité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte global ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Les données in vitro sont souvent insuffisantes pour prédire les effets in vivo des molécules sur les organes. La tolérabilité réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée chez le rongeur.
Réduction
Au cours des trois prochaines années, nous prévoyons l’utilisation de 500 animaux (rats et souris) par an, soit 1500 animaux sur 3 ans répartis sur 40 études. Dans la mesure du possible, afin de limiter le nombre d’animaux inclus dans une étude, le même animal pourra recevoir des administrations uniques à doses croissantes du même composé (au minimum 72h d’élimination entre deux doses) plutôt que d’avoir recours à des animaux différents pour chaque dose. Dans le cas de recherche de toxicité aigue ou à moyen terme avec différents groupes pour différentes doses, le premier traitement des différents groupes sera décalé d’au moins 24 heures, avec un lancement initialement du groupe recevant la plus faible dose. Ainsi l’administration n’aura pas lieu pour les groupes suivants devant recevoir une dose supérieure dans le cas ou des effets secondaires immédiats ou à moyen terme ont été observés. En pratique, si 20% ou plus des animaux recevant une dose ont été euthanasiés sur point limite (perte de poids de 20% ou plus, score de 3 sur un critère, score de 2 persistant plus de 3h sur un critère, score de 2 sur au moins 3 catégories) dans les 24h suivant l’administration, le traitement à cette dose et à toute dose supérieure sera stoppé et il ne sera pas envisagé d’administrer de dose supérieure. Sur la base des expériences passées, le nombre minimum permettant d’obtenir Une réponse satisfaisante de tolérabilité se situe entre 3 à 5 animaux par groupe. L’exploration de la dose maximale tolérée se fera toujours sur un nombre entre 3 à 5 animaux par groupe. Une fois la dose déterminée le même produit pourra être utilisé dans le cadre de ce projet sur un nombre plus important d’animaux (10 au maximum) pour obtenir une puissance statistique plus grande compte tenu des analyses ex-vivo prévues et de leur variabilité.
Raffinement
Les injections/prélèvements seront réalisées selon les standards validés par le comité éthique en termes de volume, de fréquence, d’antalgie et d’anesthésie. Tous les gestes techniques seront réalisés par des techniciens formés et dont les compétences ont été validées. Chaque animal sera observé et pesé quotidiennement et un scoring clinique sera réalisé pour détecter d’éventuels effets secondaires des traitements. La fréquence de pesée et de l’observation des animaux pourra être augmenter suivant leur état général. Les animaux présentant des signes de douleur ou de souffrance seront suivis par la structure chargée du bien-être animal. De l’enrichissement sera utilisé dans toutes les cages dès l’arrivée des animaux dans l’animalerie. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte. Dans le contexte de la première administration d’un traitement thérapeutique non testé in vivo, elles seront réalisées le matin, et les animaux sont observés en continue durant les 30 premières minutes qui suivent la première administration puis toutes les 2h pendant les 6 premières heures post-administration. Afin d’évaluer la toxicité aigüe immédiate ainsi que la toxicité à moyen terme suite à une administration unique ou répétée, les animaux seront observés et pesés quotidiennement. Les observations des signes cliniques feront l’objet de la mise en place d’un scoring clinique individuel. Les scores cliniques les plus élevés constitueront des points limites, ainsi que l’accumulation de scores intermédiaires. Les pertes de poids supérieures ou égales à 20% constitueront un point limite. Si 20% ou plus des animaux recevant une dose ont été euthanasiés sur point limite, le traitement à cette dose et à toute dose supérieure sera stoppé et il ne sera pas envisagé d’administrer de dose supérieure.
Choix des espèces
Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines (modèles xénogéniques) dans le cadre de la recherche en oncologie. De plus, diverses souches de souris et rats immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. Les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à partir de l’âge de 6 semaines afin que leur morphologie supporte mieux les effets secondaires des composés testés.
Neuroimagerie moléculaire et fonctionnelle d’oligonucléotides antisens chez le rat et la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 281
588 animaux non-humains, 307 souris et 281 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La plupart reçoivent une injection d'oligonucléotides antisens dans le liquide céphalo-rachidien ou le cerveau, suivie de séances d'imagerie TEP ou ultrasonore sous anesthésie et, pour certains, d'une chirurgie d'amincissement du crâne. Le porteur mentionne des tests comportementaux chez soixante rats sans en préciser la nature, et signale des risques de paralysie, d'œdème et d'ataxie. Il justifie l'usage de deux espèces par le besoin de disposer de données chez le rat comme chez la souris pour de futurs candidats-médicaments.
Objectifs
Il existe aujourd’hui plus de 5 000 maladies neurologiques rares qui touchent près de 350 millions de personnes dans le monde. 70% d’entre elles se manifestent pendant l’enfance et la majorité ne dispose d’aucun traitement. La plupart de ces maladies orphelines présentant une origine génétique, il est envisageable d’utiliser des traitements ciblant la cause génétique de ces maladies. Les oligonucléotides antisens (ASOs), qui sont capables d’interagir spécifiquement avec l’ARN messager, ont montré des résultats prometteurs pour certaines de ces maladies, mais atteignent très difficilement le système nerveux central. La voie intrathécale (consistant à injecter ces agents directement dans le liquide céphalo-rachidien) a montré de meilleurs résultats, mais cette voie reste encore méconnue. Il est nécessaire de réaliser des études dédiées afin de mieux comprendre comment obtenir une diffusion dans le cerveau et un effet thérapeutique optimal des ASOs après injection intrathécale. Afin de répondre à cette problématique, nous souhaitons développer et évaluer chez le rat et la souris des techniques d’imagerie qui permettront de mesurer la distribution et l’effet d’ASOs dans le cerveau par voie intrathécale. La mise en place de tels outils est cruciale pour guider le développement préclinique et clinique de futurs candidats-médicaments ciblant l’ARN dans les maladies neurologiques. Nous évaluerons la possibilité de marquer directement des ASOs à l’aide d’isotopes radioactifs ou de groupements chimiques fluorescents, permettant leur visualisation directe, respectivement en imagerie par tomographie par émission de positons (TEP) ou par microscopie. Nous utiliserons également des approches d’imagerie indirectes qui permettront d’étudier l’intensité et la durée des effets spécifiques des ASOs sur des cibles et mécanismes moléculaires.
Bénéfices attendus
Les besoins thérapeutiques liés aux maladies du système nerveux central ne sont que partiellement couverts par les médicaments actuels, en particulier les maladies orphelines génétiques. Les oligonucléotides antisens ont le potentiel de traiter efficacement ces maladies mais leurs propriétés pharmacocinétiques et pharmacodynamiques ne sont pas suffisamment connues, en particulier par voie intrathécale. Cette étude sera donc très importante à la fois pour le développement préclinique (et à plus long terme, clinique) des ASOs en apportant des informations inédites.
Procédures
La quasi-totalité des animaux (237 rats sur 281 et 249 sur 307 souris) recevra une injection intrathécale (au niveau des lombaires, entre les méninges dites de l’arachnoïde et de la dure-mère, afin d’atteindre le liquide céphalo-rachidien), sous anesthésie et analgésie locale (10 minutes). Les autres animaux (44 rats et 58 souris) recevront une injection intracérébrale, également sous anesthésie et analgésie générale et locale (1h). Ensuite, les animaux pourront : - soit n’être exposés à aucune autre nuisance à part une anesthésie terminale nécessaire au prélèvement du cerveau (total de 179 rats et 115 souris), - soit être utilisés pour une ou plusieurs sessions d’imagerie de TEP sous anesthésie d’une durée d’une heure (total de 72 rats, dont 60 recevront également des tests comportementaux pendant 70 minutes le lendemain de chaque imagerie, et 36 souris) ou de 2 à 6 heures (30 rats et 30 souris) - soit être utilisés pour une ou plusieurs sessions d’imagerie ultrasonore sous anesthésie (1h), la première session étant précédée la veille par une chirurgie d’amincissement du crâne (30 min) sous anesthésie et analgésie (96 souris) - soit être utilisés pour plusieurs sessions d’imagerie fUS éveillée (30 min) puis imagerie TEP sous anesthésie (20 min), avec une première chirurgie (30 min) sous anesthésie et analgésie de pose d’un chapeau nécessaire à l’imagerie éveillée (quelques jours avant la première session), suivie d’une période d’habituation progressive aux sessions d’imagerie en tête-fixée sur une à deux semaines (sessions d’habituation de 5 minutes les premiers jours à 1 heure le dernier jour), puis d’une seconde chirurgie d’amincissement du crâne (30 min) sous anesthésie et analgésie la veille de la première session (30 souris).
Impact sur les animaux
La procédure d’injection par voie intrathécale peut s’accompagner d’effets indésirables tels une paralysie ou une fuite de liquide céphalo-rachidien entraînant un œdème. Certains ASOs sont susceptibles d’entraîner des symptômes d’anxiété, ou des troubles moteurs de type ataxie, voire une perte de poids.
Devenir
Tous les animaux à la fin de la procédure seront mis-à-mort afin de permettre diverses analyses histologiques ou moléculaires du tissu cérébral.
Remplacement
L’objectif de l’étude est de mieux comprendre la biodisponibilité et l’effet d’oligonucléotides antisens administrés par la voie intrathécale, et ne peut donc pas être atteint avec des modèles in vitro. La voie intrathécale étant assez invasive et peu d’ASOs étant à ce jour validés pour une utilisation clinique, il est nécessaire de réaliser cette étude chez l’animal.
Réduction
Selon notre expérience en termes de variabilité et de taille d’effet sur ces données d’imagerie, le nombre d’animaux par groupe pour les techniques d’imagerie in vivo a été estimé à 8 sur la base d’un calcul de puissance statistique. Nous prévoyons 2 animaux supplémentaires par groupe en prenant en compte la possibilité d’échec de l’injection dans le liquide céphalo-rachidien (le taux de succès de l’injection étant rapporté autour de 80% dans la littérature). Pour les groupes de validation préliminaire des ASOs par stéréotaxie ou les approches ex vivo telles que l’autoradiographie ou la microscopie, les groupes de 3 à 6 animaux seront constitués étant donné les besoins statistiques plus limités pour ces analyses et la meilleure résolution spatiale de ces techniques. Concrètement, les données expérimentales générées seront traitées à l’aide de tests de Student ou d’analyse de variance à deux dimensions (two-way ANOVAs), selon les paramètres évalués, ou de tests non paramétriques équivalents, en fonction de la distribution normale ou non de nos données. Dès lors que la question expérimentale le permet, les mêmes animaux seront étudiés pour plusieurs sessions d’imagerie, permettant une réduction du nombre d’animaux.
Raffinement
Les injections seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie locale. Les animaux seront surveillés régulièrement grâce à une grille de score et des points limites adaptés prenant en compte les éventuels troubles liés à l’injection intrathécale, voire aux troubles liés à la baisse d’expression des protéines étudiées dans les procédures 2 et 3. En cas de signes de détresse, la procédure serait interrompue et la mise à mort de l’animal serait effectuée. L’environnement sera enrichi avec morceaux de bois, boites ou cylindres et nourriture en pâtée après la chirurgie.
Choix des espèces
Le rat et la souris sont deux espèces utilisées très régulièrement dans le développement préclinique de médicaments en général, et pour modéliser des pathologies du système nerveux central. Nous souhaitons donc obtenir des informations pertinentes chez les deux espèces qui seront utiles par la suite lors de l’évaluation de candidats-médicaments ASOs dans des modèles rongeurs d’intérêt, qui pourront être le rat ou la souris en fonction des pathologies. Adulte, afin d’étudier les mécanismes de biodistribution des ASOs sur des cerveaux pleinement développés.
Mise en place de modèles de glioblastomes implantés en stéréotaxie chez le rat immunocompétent Fischer puis opérés (EU1/2)
- Recherche appliquée
- Cancers
88 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères. Chaque animal reçoit une greffe de glioblastome dans le cerveau par stéréotaxie, une partie subissant ensuite une chirurgie d'ablation de la tumeur classée sévère, avec un suivi par imagerie sous anesthésie. Le porteur indique que la tumeur peut provoquer des atteintes neurologiques et des pertes de poids, et que trente-six animaux seront conduits jusqu'à un point limite. Il s'agit d'une mise au point de modèle, dont le bénéfice thérapeutique pour l'humain reste présenté comme un objectif "à plus long terme".
Objectifs
Le glioblastome (=tumeur intracérébrale) est la forme la plus agressive des tumeurs du cerveau avec des récidives systématiques malgré des traitements lourds. Le traitement actuel consiste en une chirurgie pour enlever la tumeur accompagnée d’un traitement par chimiothérapie et radiothérapie. Notre laboratoire affiche une bonne expertise dans l'utilisation de modèles tumoraux d'origines humaines développés sur rongeurs immunodéficients. Cependant, ces animaux apportent une réponse incomplète à nos recherches menées sur les tumeurs cérébrales de par l'absence de la prise en charge de l’immunité. Pour cela, nous souhaitons développer des modèles issus de tumeurs de rongeurs portées par des rongeurs immunocompétents, dont la réponse immunitaire joue un rôle primordial dans le développement de la tumeur ou dans la réponse antitumorale. Notre choix s'est porté sur 2 types de glioblastomes (2 différents) de rat qui sont caractérisés par une forte capacité d'invasion et d'infiltration dans le tissu cérébral sain mais aussi par des capacités de radiorésistance et de chimiorésistance : cet échappement aux stratégies thérapeutiques standards en fait de bons candidats permettant l'extrapolation en cancérologie humaine. L’objectif à terme de ce projet de mise au point de modèle opéré (chirurgie pour enlever la tumeur) permettra de repositionner nos travaux futurs dans un contexte clinique de prise en charge thérapeutique (dont le traitement de référence inclut entre autre la chirurgie pour enlever de la masse tumorale principale).
Bénéfices attendus
Ce projet préliminaire permettra de mettre en place un modèle de tumeurs cérébrales enlevées par chirurgie sur rats immunocompétents au sein du laboratoire, l'intégration de la composante immunitaire étant primordiale dans la continuité de nos travaux. En outre, ce projet de mise au point d'un modèle expérimental avec notamment l'intégration de la chirurgie pour enlever la tumeur servira dans des études pour lesquelles une stratégie thérapeutique sera menée en utilisant la cavité laissée suite à la chirurgie. A plus long terme, le bénéfice attendu est de proposer une stratégie thérapeutique pour améliorer la prise en charge du glioblastome humain.
Procédures
-Procédure 1 et 2 : greffe intracérébrale de tumeurs cérébrales réalisée une fois au début de l'étude à J0 (durée 45min) Puis développement de la tumeur du cerveau jusqu’à 21 jours. - Procédure 2 : Chirurgie pour enlever la tumeur : réalisée une fois au milieu de l'étude (durée 45 min). - Anesthésie isoflurane réitérée 4 fois (procédure 1) et 5 fois (procédure 2) pour l’imagerie durant 15 minutes.
Impact sur les animaux
La première nuisance, modérée, est liée à l'implantation même de la tumeur dont le développement conduit chez les rats à une possible atteinte neurologique (atteinte de la motricité et de la coordination) associée à des pertes de poids. Notre recherche bibliographique a mis en avant une survie des animaux comprise entre J21 et J24 . La seconde nuisance est liée à la chirurgie pour enlever la tumeur (classée sévère). Enfin, le transport depuis l'animalerie (EU 1/2) jusqu'au site d'imagerie IRM (EU 2/2) et l’anesthésie à l’isoflurane hebdomadaires des animaux représentent une nuisance légère .
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure. 44 pour prélèvement du cerveau et analyse histologique et 36 pour atteinte d'un point limite (suivi de la croissance tumorale par imagerie).
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est dans ce contexte clairement pas possible puisque le développement de tumeurs cérébrales dépend de phénomènes biologiques complexes. De plus, la mise en place d’une tumeur est un phénomène impliquant différents types de cellules. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé que sur un modèle animal.
Réduction
S’agissant d’une étude prospective, aucune analyse statistique ne sera réalisée. Afin de limiter le nombre d’animaux, les expérimentations seront menées étape par étape par pallier, tout d'abord en se concentrant sur une tumeur nécessitant 44 rats maximum (36 + 8 surnuméraires). Dans un premier temps, 8 rats seront utilisés pour réaliser le suivi de croissance. Ce nombre a été évalué comme minimum pour caractériser la croissance tumorale par imagerie et analyses histologiques. Dans un second temps, la tumeur sera enlevée par chirurgie sur 10 rats à condition que les résultats sur la 1ère série de 8 rats correspondent à nos attentes (prise de tumeur visible à l’imagerie et analyse histologique correspondant). Si cette série de chirurgie pour enlever la tumeur est satisfaisante, nous complèterons les effectifs avec respectivement 8 animaux pour le suivi de la croissance tumorale et 10 animaux pour la chirurgie pour enlever la tumeur. Les 2 séries ne seront répétées (avec la même stratégie) pour les 2ème type de tumeurs, que si les résultats obtenus avec la 1ère tumeur ne donnent pas les résultats escomptés en termes de croissance et de chirurgie pour enlever la tumeur (2° tumeur : 44 rats maximum (36 + 8 surnuméraires).
Raffinement
Les animaux bénéficieront en permanence d'un enrichissement sous forme de feuilles de papier craft et de buchettes en bois à ronger et bénéficieront d'un cycle jour/nuit inversé dans leur salle d'hébergement. Ils seront hébergés par 2 ou 3 dans des cages de 900 cm2 et les expérimentations ne débuteront qu'après une semaine d'acclimatation suite à la réception des animaux. Une attention toute particulière sera portée aux animaux après l'implantation de la tumeur et après son retrait chirurgical (pesée quotidienne, observation quotidienne du comportement et de la motricité, vérification de l'alimentation et de l'hydratation, désinfection et vérification de la bonne cicatrisation de la plaie). Des points limites précoces sont définis (perte de poids et problèmes de motricité essentiellement) afin d’anticiper toute souffrance ou dégradation de l’état général liée à la tumeur. Le transport des animaux vigiles entre l’animalerie et le site d’imagerie sera réalisé en maintenant une température optimale par l'intermédiaire de bouillottes chauffantes placées sous les cages.
Choix des espèces
Dans les études menées pour traiter le cancer, les modèles animaux utilisés sont majoritairement les modèles murins (souris et rats). Les rats constituent l'espèce de référence compte tenu de leur accessibilité et de leur facilité de manipulation. Le choix de cette espèce se justifie par la taille du cerveau plus importante permettant une implantation de la tumeur dont le volume deviendra suffisamment important pour permettre l’imagerie. Par soucis de cohérence avec les données et protocoles de la littérature, les rats utilisés seront des âgés de 6 semaines à la réception. Au moment de l'implementation de la tumeur, ces rats seront pubères (envron 7 semaines pour un poids de 200 à 250g).
Modèles chirurgicaux chez les rongeurs et lagomorphes
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 7500
Cochons d'Inde : 1500
Hamsters dorés : 750
Hamsters de Chine : 750
Lapins : 1500
15 000 rongeurs et lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Souris, rats, cochons d'Inde, hamsters et lapins subissent des chirurgies destinées à induire une pathologie, dont délétion osseuse pour créer de l'arthrose, plaie cornéenne, plaie cutanée, extraction de dents ou pose d'un cathéter jugulaire, avant application d'une substance test. Le porteur reconnaît douleurs, boiteries, difficultés à s'alimenter et parfois automutilation, puis tue tous les animaux pour analyses. Ces modèles servent à tester substances et dispositifs médicaux pour l'industrie pharmaceutique, présentés comme un préalable au test sur l'humain.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de réaliser différentes chirurgies chez les rongeurs et les lagomorphes pour induire une pathologie, comme l’arthrose, ou mettre en place des modèles de transplantation, ou encore pratiquer des administrations intraveineuses répétées en perfusion, afin d’évaluer l’efficacité ou la toxicité de substances ou dispositifs médicaux, pour l’industrie pharmaceutique.
Bénéfices attendus
Ce projet permet d’induire des pathologies par chirurgie afin de tester une substance ou un dispositif médical sur des modèles expérimentaux correspondants. In fine, le bénéfice attendu est de pouvoir développer et tester ces substances sur l’Homme.
Procédures
Tous les animaux sont anesthésiés et analgésiés avant le début de la chirugie. Pour les modèles de délétion osseuses, les animaux subissent une délétion au niveau des lombaires ou de la trochlée fémorale. Pour le modèle de plaie cornéenne, les animaux subissent une lésion de la cornée avec application d'une substance test. Pour le modèle de plaie cutanée, les animaux subissent une lésion au niveau de la peau avec application d'une substance test. Pour le modèle de chirurgie dentaire, les animaux subissent le retrait d'une ou plusieurs dents, suivi de l'application d'une substance test. Pour le modèle de cathétérisation jugulaire, on met en place un dispositif vasculaire au niveau du cou permettant l'injection d'une substance test. En fonction des projets, différents prélèvements sanguins peuvent être réalisés. A l'issue du projet, tous les animaux sont mis à mort pour des analyses vitro et ex-vivo.
Impact sur les animaux
Les modèles de délétion osseuse peuvent générer de la douleur et des boiteries modérées à plus ou moins long terme. Le modèle de plaie cornéenne peut générer une douleur modérée et une sensibilité ophtalmique jusqu’à cicatrisation. Le modèle de plaie cutanée peut générer une douleur modérée, une sensibilité dermique et une réaction inflammatoire jusqu’à cicatrisation. Le modèle de chirurgie dentaire peut générer une douleur modérée, une réaction inflammatoire, des difficultés à s’alimenter et se toilleter jusqu’à cicatrisation. Le modèle de cathétérisation jugulaire peut générer une douleur modérée et de l'incofort lié au dispositif pendant toute la durée de l’étude. Ces effets peuvent aboutir à une baisse d’activité ainsi qu’un changement de comportement (baisse de la prise alimentaire, agressivité, auto-mutilation, …). Ces effets sont limités dans le temps et ne dépassent pas deux semaines.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, tous les animaux sont mis à mort pour des analyses vitro et ex-vivo.
Remplacement
Le développement de produits pharmaceutiques ou de dispositifs médicaux nécessite de réaliser des expériences chez l’animal dans le cadre du développement non clinique, afin d’évaluer l’activité des produits dans un organisme complet et complexe : - Développement du modèle sur un petit nombre d’animaux, inférieur à 10 - Validation du modèle sur un plus grand nombre d’animaux - Etude pilote : application de la substance test sur un petit nombre d’animaux - Etude réglementaire : application de la substance test sur un nombre d’animaux permettant une analyse statistique représentative. Des tests in vitro sont réalisés au préalable par nos clients ou par notre instalaltion. Il est nécessaire de recourir aux animaux afin de tester une substance dans un organisme complexe.
Réduction
Pour chaque protocole, le nombre d’animaux est réduit au minimum requis tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement fiables. Les analyses statistiques seront effectuées à l'aide d'un logiciel, comme décrit dans les procédures internes. La distribution des données sera vérifiée et les tests statistiques seront sélectionnés en fonction de la normalité des données. Afin de réduire le nombre d’animaux, des échantillons de sang, d’urine, de salive, de LCR, de fécès ou des organes peuvent être prélévés pour des analyses à posteriori.
Raffinement
Pour les rongeurs, de l’enrichissement comme des batonnêts à ronger, des huttes/tunnels et du papier kraft sont ajoutés dans les cages. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux compatibles. Pour les lapins, des bâtonnets à ronger et/ou du foin sont ajoutés dans les cages. Les animaux sont hébergés par un ou deux, entre animaux socialement compatibles. Pour la chirurgie, une anesthésie générale, adaptée en fonction des espèces, est réalisée. Une couverture analgésique adaptée est appliquée et évaluée en fonction des observations quotidiennes des animaux. En fonction du projet, le poids des animaux est enregistré deux fois par semaine jusqu’à la fin de l’expérience. Les animaux sont observés quotidiennement et un monitoring (observation du déplacement, posture, paralysie, comportement, respiration, aspect des yeux, de la peau, des poils, des muqueuses et des excrétions dans la cage) peut être mis en place. La perte de poids est évaluée en fonction du poids de départ de chaque animal ou du poids maximal de l’animal si celui-ci n'est pas adulte au début de l’étude. Selon les essais et besoins expérimentaux, une observation de la tolérance locale après chaque traitement peut être réalisée. Une observation accrue des animaux est réalisée 2 à 6 heures après les traitements. Des points limites adaptés sont mis en place.
Choix des espèces
Les rongeurs sont des mammifères de petite taille ayant un organisme similaire à l’Homme. Leur génotype est connu et ils sont faciles à héberger. En outre, de nombreux articles bibliographiques sont disponibles pour décrire les différents modèles. Les lagomorphes sont des mammifères de taille moyenne ayant un organisme similaire à l’Homme. Leur métabolisme ainsi que la taille des organes font de cette espèce un modèle pertinent pour l’évaluation de certains produits. De plus, le modèle lapin permet comparer les résultats au modèle rongeur. En fonction des essais et études réglementaires (lié aux caractéristiques de la substance ou du dispositif testé), les animaux utilisés seront des adultes ou des jeunes adultes, car ils nécessitent un système immunitaire et des organes totalement développés et fonctionnels.
Etudes préliminaires des mécanismes d’action sous-tendant l’effet anti-épileptique de GAO-3-02
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
730 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur déclenche pharmacologiquement, sur animal vigile, soit une crise convulsive généralisée suivie pendant trente minutes puis interrompue par la mise à mort, soit un état de mal épileptique arrêté au bout de trente minutes. Tous les rats sont tués pour prélever leur cerveau et mener des analyses ex vivo. Le porteur revendique un "besoin fort" de nouveaux antiépileptiques et affirme que ni les modèles in vitro ni in silico ne peuvent reproduire les crises et les comportements associés.
Objectifs
Les épilepsies regroupent un ensemble de syndromes neurologiques se caractérisant par des crises pouvant se manifester sous des formes diverses, allant des absences aux convulsions. Leur origine peut être génétique mais le plus souvent elle est associée à une agression cérébrale sévère initiale, telle qu'un traumatisme crânien, une infection, ou un état de mal épileptique (EME). Bien qu’une épilepsie puisse se manifester à tout moment de la vie, les pics d’occurrence sont observés avant l’âge de 20 ans et après 60 ans. Plus de 20 médicaments sont disponibles pour contrôler les crises. Toutefois, un patient sur trois continue d’en faire malgré la prise de médicaments, et un grand nombre de ceux dont les crises sont contrôlées par ces médicaments se plaint de comorbidités affectant gravement leur qualité de vie. Il existe donc un besoin fort et urgent de développer de nouveaux candidats médicaments permettant non seulement de contrôler les crises pour ceux qui ne répondent pas aux médicaments, mais aussi de réduire le degré d’inconfort qui compromet une bonne observance thérapeutique. Le candidat médicament CM1 a été récemment développé pour répondre aux besoins non satisfaits des patients. Il s’agit d’un candidat-médicament de nature lipidique, dont le mode d’action diffère totalement des anti-épileptiques classiques. Il possède des effets anti-crises d’épilepsie (occurrence d’une seule crise) et des effets anti-épileptiques (occurrence de plusieurs crises spontanées), tout en protégeant certaines fonctions cognitives. Ces observations ont été réalisées dans le cadre d'un projet précédent. Des études in vitro et ex vivo ont montré : 1) que les effets anti-crises pouvaient passer par une augmentation des processus réduisant l’activité cérébrale ; 2) que l’activation d’un récepteur particulier, appelé ici CM1-R1, pouvait potentiellement être responsable des effets bénéfiques du CM1 ; et 3) que le CM1 pouvait modifier le profil lipidique cérébral. Les objectifs de ce projet sont d'apporter des réponses: 1) quant aux mécanismes par lesquels le CM1 augmente la réduction de l’activité neuronale ; 2) sur l’implication du récepteur CM1-R1 et d’un homologue R2 sur les mécanismes décrits en (1) ; 3) quant aux effets du CM1 sur les mécanismes de neurotransmission GABAergique et Glutamatergique, et l’implication de 2 récepteurs dans ces effets ; et enfin 4) sur les modifications de la composition lipidique cérébrale induites par le CM1.
Bénéfices attendus
Les épilepsies constitutent la seconde maladie neurologique après la migraine, et affectent près de 70 millions de personnes dans le monde. De nombreux traitements existent, mais malgré cela, près d’un tiers de patients continuent de faire de crises malgré la prise de ces traitements. En outre, parmi les personnes qui répondent aux traitements existants, le ralentissement de l’activité cérébrale qu’ils entrainent constitue un effet secondaire fortement handicapant pour une grande part d’entre elles, réduisant de ce fait l’observance du traitement. II est donc impératif de poursuivre le développement de nouveaux traitements, capables non seulement de réduire le nombre de crises ou leur sévérité, mais aussi de maintenir, voire même d’améliorer les capacités cognitives (mémoire). Le projet s’appuie sur le développement d’un potentiel candidat médicament, CM1, dont il a été montré qu’il exerce une activité anti-crise, anti-épileptique et cela sans altérer, voire même en améliorant, les capacités cognitives. L’objectif de ce projet est d’apporter des premiers mécanismes d’action in vivo de cette molécule, étape indispensable à la poursuite du développement de ce potentiel candidat médicament.
Procédures
Dans la procédure n°1, les animaux utilisés seront des rats soumis à un processus de déclenchement unique d’une crise convulsivante généralisée aiguë, induite pharmacologiquement. Les rats sont obligatoirement vigiles, car dans le cas contraire, aucune crise ne pourrait être induite. Dans les procédures 2 à 4, les animaux utilisés seront des jeunes rats soumis à un état de mal épileptique induit pharmacologiquement. Cette induction pharmacologique se fait sur animal vigile. L’état de mal est stoppé au bout de 30 min. Dans les procédures 2 et 4, il est important de chasser le sang des capillaires sanguins de tout l’organisme, en particulier le cerveau.
Impact sur les animaux
Le projet repose sur 4 procédures, réalisées sur le rat. Pour la procédure n°1, les crises d’épilepsies généralisées, de classe sévère, seront suivies sur une période n’excédant pas 30 minutes, au-delà desquelles les rats seront euthanasiés. Les rats développent en général les premières crises tonico-cloniques généralisées (GTCS) dans les 10-20 minutes qui suivent l’administration de l'agent convulsivant. Si le traitement testé a un effet pro-convulsivant, les rats développeront en moyenne les GTCS avant les 10 premières minutes. Au contraire, si le traitement a un effet anti-crise, les GTCS apparaitront après 20 minutes. Ce modèle, très bien standardisé au niveau international, n’excède pas 30 minutes ; en effet, on considère que l’effet protecteur est total quand aucune GTCS n'est observée dans les 30 minutes qui suivent l’administration de l'agent convulsivant. Les procédures 2 à 4 seront réalisées chez le rat après un état de mal épileptique (EME, série de crises convulsivantes en continu sur 30 minutes) induit pharmacologiquement à l’âge de 21 jours. A l’issue des 30 min d’EME, il sera stoppé pharmacologiquement. L’EME induit une douleur de type sévère pendant 3 à 5 jours, pendant laquelle aucun analgésique ne peut être administré en raison du blocage provoqué sur le processus même de développement d’une épilepsie. Sur ces 3 à 5 jours, durant lesquels le poids est contrôlé quotidiennement, les ratons ont une activité réduite, avec dos voussé.
Devenir
Pour la procédure n°1, les rats auront tous été soumis à un protocole d’induction d’une crise convulsivante généralisée. Ils seront tous mis à mort pour éviter de prolonger un état épileptique. Pour les procédures n°2 à 4, les cerveaux de tous les animaux seront prélevés, soit pour des études histologiques, biochimiques ou électrophysiologiques ex vivo.
Remplacement
Compte tenu du fait que les épilepsies regroupent une diversité de syndromes, il existe à ce jour très peu d’alternatives permettant d’évaluer les différents aspects de la pathologie sur des modèles in vitro ou ex vivo. De plus, l’analyse de comportements complexes, comme ceux de l’anxiété et de l’apprentissage spatial, et de surcroît la manifestation de crises épileptiques ne peuvent être appréhendées au niveau préclinique autrement qu’in vivo chez des vertébrés, et ne peut aujourd’hui être remplacée par des méthodes alternatives in vitro ou in silico.
Réduction
Ce projet impliquera l’utilisation d’un total de 730 rats sur une durée de 5 ans. Ce nombre d’animaux a été réduit au minimum tout en ne compromettant pas l’atteinte des objectifs de l’étude. Il a été déterminé à l’aide d’outils statistiques, en tenant compte des résultats d’études antérieures (notamment de la variabilité observée) dans le laboratoire sur ces mêmes modèles. Pour les procédures 1 et 2, des étapes GO/NOGO ont été mises en place. En effet, elles ont pour objectifs d’évaluer l’implication de 2 récepteurs potentiels du candidat médicament testé dans les effets observés. Nous commencerons par tester l’effet du récepteur R1. Si tout l’effet du candidat médicament passe par ce récepteur R1, alors les expérimentations visant à étudier l’implications de R2 ne seront pas réalisées.
Raffinement
Les animaux mâles arriveront suffisamment tôt pour permettre une semaine d'acclimatation avant le début des procédures. Leur poids sera suivi hebdomadairement, et les animaux seront soumis à une surveillance attentive à l’aide d’une grille d’évaluation du bien-être, pour limiter au maximum stress et douleur, et apporter des soins adaptés, le cas échéant. Plus spécifiquement, pour la procédure n°1, qui dure au maximum 30 minutes, la mise à mort de l’animal sera réalisée dès qu’il a atteint la première crise convulsivante généralisée. Pour les procédures n°2 à 4, l’état de mal épileptique induit par la pilocarpine (Pilo-EME) entraîne une souffrance sévère sur les 3 à 5 premiers jours, avec perte de poids pouvant atteindre 25%. Afin de favoriser le recouvrement, nous maintenons les ratons avec la femelle nourricière jusqu’au terme de ces 5 jours (26 jours d’âge). En outre, nous massons quotidiennement l’abdomen des ratons pour stimuler à nouveau le transit intestinal, temporairement interrompu par l’administration de scopolamine (antagoniste des récepteurs muscariniques centraux et périphériques). Depuis que nous avons introduit ces deux améliorations, le taux de survie des ratons est passé de 75% à 95%.
Choix des espèces
L’ensemble des données antérieures de l’équipe a été obtenu sur des rats Sprague-Dawley. L’utilisation de la même souche de rat nous permettra de comparer les données de ce projet avec celles des études antérieures de l’équipe. Enfin, chaque fois que cela est possible, le rat est choisi à la souris du fait qu’il est physiologiquement, génétiquement et morphologiquement plus proche de l’humain. En outre, son répertoire comportemental, notamment au regard de certaines compétences cognitives, le rend plus pertinent que la souris. Nous travaillons sur des ratons jeunes (3 semaines), car la grande majorité des cas d’épilepsie acquise (non génétique) chez l’humain se déclare chez le jeune de moins de 20 ans.
- Tests réglementaires
- Contrôles de qualité
Rats : 450
Cochons d'Inde : 1300
Cochons : 1600
Moutons : 140
Bovins : 2000
7 590 animaux non-humains vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, la plupart tués (7 440) et 150 réutilisés. Souris, rats, cochons d'Inde, cochons, moutons et bovins sont vaccinés puis suivis par prises de sang pour vérifier l'innocuité, l'activité sérologique et la pureté de lots de vaccins vétérinaires. Le porteur annonce n'attendre aucun dommage au-delà d'un léger stress et justifie ces contrôles par les exigences de la Pharmacopée Européenne. Il indique que des tests d'activité passent déjà in vitro mais juge le remplacement des autres impossible en l'état de la réglementation.
Objectifs
Le projet a pour objectifs de confirmer l’innocuité, de déterminer l’activité sérologique, de vérifier la pureté (absence d’agents contaminants) de vaccins, et de confirmer l’innocuité d’adjuvants entrant dans leur composition. Ces objectifs doivent être respectés afin d’être en conformité avec les exigences réglementaires de la Pharmacopée Européenne et des pays destinataires pour la constitution d’un dossier de mise sur le marché et pour la fabrication d’un lot commercial. La Pharmacopée Européenne exige la démonstration de résultats, dont certains doivent être obtenus chez l’animal. Les tests sont donc effectués soit sur une des espèces cibles (porc, mouton ou bovin) soit sur espèce alternative (autres espèces d’animaux de rente ou rongeurs) pour limiter le recours à l’espèce cible. Cette alternative peut être réalisée lorsqu’une équivalence entre les modèles animaux a pu être démontrée. Ces tests garantissent une commercialisation de vaccins sans danger pour l’animal et pour le consommateur potentiel.
Bénéfices attendus
Ces tests permettent la libération d’un nombre important de doses de vaccins améliorant considérablement la qualité sanitaire des élevages et la sécurité alimentaire des consommateurs.
Procédures
Tous les animaux passent par une phase d’acclimatation à leur nouvel environnement avant le début du test : au moins 4 jours pour les animaux de rente, et au moins 2 jours pour les rongeurs. - Pour les animaux de rente, à J0 une prise de sang (si elle est requise) et la vaccination sont faites. Un rappel est possible, en fonction des techniques. Les animaux sont suivis quotidiennement, une prise de sang intermédiaire et /ou terminale peuvent être réalisées si nécessaire. - Pour les rongeurs, à J0 la vaccination est faite. Un rappel est possible, en fonction des techniques. Les animaux sont suivis quotidiennement et, à la fin, une prise de sang terminale peut être réalisée. L’évaluation de l’innocuité et de la pureté sont basées sur l’absence de réactions à la suite de l’injection et se font à l’aide de l’examen clinique local et général ou bien par la vérification d’absence de contaminants à l’issue des titrages des sérums. La détermination de l’activité sérologique est possible grâce au titrage des anticorps. Chez les animaux de rente, les contrôles durent entre 14 et 35 jours pour les porcs, entre 14 et 30 jours pour le mouton et entre 21 et 28 jours chez les bovins. Chez les rongeurs, les contrôles durent entre 7 et 35 jours pour la souris, entre 14 et 42 jours pour les cobayes et 28 jours pour les rats.
Impact sur les animaux
Aucun dommage n’est attendu, un léger stress lié aux manipulations et injection des vaccins peut apparaître. Toutes les manipulations sont réalisées par du personnel formé et compétent. Ces tests garantissent la qualité du produit pour les animaux et leur environnement.
Devenir
Certains animaux seront réutilisés, les autres euthanasiés
Remplacement
La nécessité de l’utilisation d’animaux provient de la réglementation en vigueur sur ces tests, en conformité avec la pharmacopée du pays destinataire. Ils permettent de démontrer l’innocuité, l’activité sérologique et la pureté. De nombreux tests d’activité sont passés in vitro. Il n’est actuellement pas possible de remplacer les autres tests restants.
Réduction
La réduction du nombre d’animaux est possible grâce au retrait des groupes témoins dans les puretés porc et à la mutualisation de groupes témoins
Raffinement
Dans ce projet, aucune souffrance ou stress significatif est attendu. Le personnel est compétent pour identifier les cas pour lesquels l’animal n’est plus dans sa zone de confort. Les conditions d’hébergement varient selon l’espèce et l’âge des animaux pour maximiser leur confort et leur bien-être. Tous les animaux sont hébergés en groupe. Des enrichissements du milieu ont été mis en place dans les hébergements. La Structure du Bien-Etre Animal (SBEA) garantit l’amélioration des techniques de soins et des conditions de vie pour les animaux.
Choix des espèces
Ce sont une des espèces cibles ou alternatives pour le porc, l’ovin et le bovin. Les souris, les rats et cobayes servent d’espèces alternatives pour réduire le nombre de tests faits sur les animaux de rente. Les porcs doivent être âgés de 3 semaines à 4 mois, ou peser entre 16 et 36 kg. Les ovins sont âgés entre 3 et 6 mois et les bovins entre 20 jours et l’âge adulte. Les souris doivent peser entre 11 et 25g et/ou être âgées entre 5 et 6 semaines. Les cobayes doivent peser entre 250 et 450g et les rats doivent avoir entre 8 et 10 semaines. Les stades de développement varient en fonction des techniques. Ils correspondent à l’âge ou au poids requis pour répondre au dossier déposé aux autorités.
Evaluation de la sécurité préclinique des candidats médicaments dans le cadre d’études avec immuno-modulation
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
Rats : 240
Macaques à longue queue : 30
1 710 souris, rats et macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, la quasi-totalité tués (1 697), une dizaine de macaques réutilisés et trois proposés à l'adoption. Les animaux reçoivent des candidats médicaments immunomodulateurs au moins deux fois par mois et subissent des prélèvements sous anesthésie, dont moelle osseuse et liquide cérébrospinal, avec un risque de choc anaphylactique. La plupart sont tués pour une analyse anatomo-pathologique terminale des organes. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit les interactions du système immunitaire d'un "organisme entier" et retient le primate pour sa proximité avec l'humain.
Objectifs
Les études de sécurité préclinique chez l’animal de laboratoire font partie intégrante de la Recherche et Développement et ont pour but d’évaluer les potentiels effets indésirables des candidats médicaments avant leur administration à l’Homme. Ce projet a pour objectif d’affiner l’évaluation de ce risque, en déterminant quelles sont les voies impliquées dans les modulations du système immunitaire, déclenchées par certains candidats médicaments biologiques (anticorps, vaccins, cellules, gènes). Ces réactions immunitaires, impliquant les voies humorales ou cellulaires, sont par exemple l’hypersensibilité immédiate ou retardée, la tempête de cytokines. Leur complexité nécessite la mise en œuvre de modèles animaux mimant le processus complet le plus proche de l’Homme.
Bénéfices attendus
La détermination des voies impliquées dans les réactions immunitaires permettra de sélectionner les candidats médicaments les plus prometteurs et/ou d’arrêter précocement le développement de molécules ayant un profil toxicologique non acceptable au regard de l’indication thérapeutique. Ces données permettront d’encadrer de manière la plus optimale, les études animales réalisées en aval, afin d’éviter des réactions type choc anaphylactique. A plus long terme, cela pourra constituer si nécessaire les bases de gestion de ce risque lors des premières administrations à l’Homme.
Procédures
Les animaux vigiles seront concernés par l’administration de molécules (candidat médicament couplé ou non à une molécule de référence), par différentes voies (le plus souvent veineuse), au moins 2 fois au cours de l’étude sur une durée maximale d’1 mois. Des prélèvements, associés à une contrainte légère de quelques minutes, seront nécessaires pour évaluer différents paramètres (par exemple hématologie, biochimie, immunologie) ; leur fréquence et leur volume sont conformes aux recommandations éthiques en vigueur et sont réalisés sous anesthésie/analgésie (entre 15 et 30 minutes) quand ils sont invasifs (par exemple moëlle osseuse, liquide cérébrospinal). Des mesures comme par exemple, la température corporelle (avec puce électronique), le poids (2 fois par semaine) sont réalisées en fonction de l’objectif de l’étude. Plus rarement, les rats seront implantés avec un cathéter intra-veineux (une chirurgie réalisée le plus souvent chez le fournisseur) lorsqu’il y aura besoin d’un accès vasculaire. Des tests comportementaux observation des animaux dans leur cage d'hébergement, en champs libre et en manipulation pourront-être réalisés 1 à 2 fois au cours de l'étude, leur durée est de 5 à 15 minutes.
Impact sur les animaux
Les effets attendus correspondent à ceux de l’administration de molécules immunomodulatrices pouvant se traduire chez l’animal par exemple par une baisse d’activité, une modification du comportement de l’animal, une modification de la température corporelle, une baisse de la consommation alimentaire, une perte de poids. Dans certains cas, la survenue d’une réaction immunitaire rapide comme l’hypersensibilité de type I pourra entrainer un choc anaphylactique. Par ailleurs, les prélèvements et examens nécessaires au cours des études peuvent entraîner des nuisances type stress de courte durée (ex : contention, prélèvements sanguins, isolement de l’animal de quelques heures pour le recueil d’urine).
Devenir
Ce type d’étude nécessite le plus souvent une analyse anatomo-pathologique terminale pour évaluer les atteintes sur les organes et tissus. C’est seulement lorsque les objectifs de l’étude ne nécessitent pas cette analyse et que les atteintes/lésions sont réversibles que certains primates pourront être ré-utilisés après approbation du vétérinaire. L’estimation de ce nombre est d’environ 30%. Certains de ces primates pourront être proposés à l’adoption via des associations et des structures d’accueil spécifiques et en accord avec les autorités compétentes.
Remplacement
Ce projet s’inscrit dans une démarche globale qui intègre revue bibliographique, modélisation in silico, tests in vitro (cellulaires par exemple). Le recours à l’animal de laboratoire reste nécessaire car il n’existe aujourd’hui aucun modèle in vitro mimant les interactions cellulaires complexes du système immunitaire d’un organisme entier (coopération précise entre divers types cellulaires, contacts de cellule à cellule par l'intermédiaire de récepteurs présents à leur surface et échange de messages moléculaires) et les effets possibles d’un candidat médicament sur celui-ci.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe et le nombre de groupes sont définis sur des bases scientifiques (bibliographie et données historiques) et/ou avec l’apport des biostatistiques afin d'avoir un effectif minimum mais statistiquement exploitable pour pouvoir interpréter les différents effets. Les tests statistiques utilisés sont dépendants des paramètres étudiés. De plus, lorsque les objectifs d’étude le permettent et en accord avec le vétérinaire, certains animaux peuvent être réutilisés, ce qui participe à diminuer le nombre total d’animaux utilisés.
Raffinement
Ce projet fait l’objet d’une démarche qualité rigoureuse avec la réalisation des études par du personnel formé et compétent, le respect des impératifs éthiques tels que les modalités d’administration et de prélèvements réalisés sous anesthésie-analgésie pour les plus invasifs, l’hébergement et l’enrichissement du milieu spécifique. Les effets indésirables potentiellement associés au statut immunitaire des animaux (cas des rongeurs immunodéficients par modification génétique) sont contrés par l’hébergement en environnement protégé. La contrainte des prélèvements et administrations sous contention est minimisée par la mise en place d’habituations et training avec distribution systématique de récompenses alimentaires (renforcement positif). L’état clinique des animaux est surveillé au moins quotidiennement, des pesées ou autres mesures (températures, examens sanguins, etc.) sont réalisées régulièrement afin d’anticiper au maximum l’apparition de toute douleur et de mettre en place des mesures spécifiques (arrêt anticipé de l’étude, mise en place de soins de support ou analgésie) par le responsable d’étude en concertation avec le vétérinaire en application des points limites stricts et spécifiques du projet.
Choix des espèces
Afin de mettre en évidence un lien entre la toxicité observée et les modulations immunitaires provoquées par certains candidats médicaments, les espèces pertinentes sont les souris et les rats, espèces rongeurs habituelles pour les études de toxicologie générale, ouvrant la possibilité de modification génétique d’intérêt (par exemple humanisation de certaines protéines ou immunodéficience), et les primates non humains, qui présentent la plus proche similitude physiologique avec l’Homme. Toutefois, les primates non humains seront utilisés de manière exceptionnelle et uniquement si aucune réponse pertinente ne peut être obtenue chez les rongeurs. Les animaux utilisés sont des animaux sevrés, juvéniles ou adultes pour évaluer de manière satisfaisante les modulations du système immunitaire.
Evaluation de la distribution tissulaire des radiotraceurs dans un modèle rongeur.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles nerveux
Rats : 750
1 500 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures dont la souffrance va de l'absence de réveil à modérée. Sous anesthésie, ils reçoivent un cathéter veineux et fémoral, une injection de composé radiomarqué puis jusqu'à trente prélèvements artériels au cours de séances d'imagerie de deux heures. Tous sont ensuite tués pour extraire leurs organes. Le porteur qualifie les retombées de "majeures" pour la connaissance de la distribution des médicaments et affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne peut évaluer cette distribution tissulaire.
Objectifs
L’objectif de cette étude est l’évaluation préclinique de la distribution tissulaire de candidats médicaments radiomarqués d’intérêt chez le rongeur en utilisant une technique d’imagerie non invasive. Cette technique d’imagerie non invasive (tomographie par émission de positons ou monophotonique) consiste à injecter un analogue de composé radiomarqué par différents isotopes utilisés en médecine humaine. La distribution tissulaire des composés radiomarqués peut ainsi être mesurée par des approches d’imagerie non-invasive correspondant aux isotopes utilisés et qui sont également utilisés en médecine humaine. Cette étude permettrait d’évaluer l’exposition tissulaire par le composé radiomarqué, en présence d’un candidat médicament. Les candidats médicaments étudiés concernent le diabète, le cancer, les pathologies neuropsychiatriques comme l’addiction et également les neuroprotecteurs. Plusieurs séances d’imagerie seront nécessaires. La première imagerie permet d’établir les paramètres pharmacocinétiques initiaux des composés radiomarqués. La seconde imagerie permet d’étudier la spécificité de la fixation tissulaire des composés radiomarqué dans des modèles d’une pathologie. La troisième imagerie permet d’étudier la spécificité de la fixation tissulaire des composés radiomarqué en présence d’un candidat médicament. Les doses de médicament seront choisies en fonction de la littérature et du recul de l’utilisation de cette molécule chez l’homme ou chez le rongeur. Afin d’évaluer intégralement l’exposition tissulaire, la pharmacocinétique du traceur et du candidat médicament seront également étudiés.
Bénéfices attendus
Les retombées de ce projet sont majeures puisqu’elles permettront d’apporter des informations pertinentes sur l’exposition tissulaire et sur les spécificités de la distribution et de l’élimination des médicaments.
Procédures
Les interventions prévues sur les animaux sont listées ci-dessous : • Réalisation de sessions d’imagerie sous anesthésie gazeuse (durée 120 minutes au maximum) • Pose d’un cathéter veineux (30 secondes) et fémoral (5 minutes) • Injection d’un radiotraceur associé ou non à un candidat médicament (1min) • Réalisation de prélèvements artériels sous anesthésie gazeuse (30 prélèvements qui durés 2-3 secondes espacés sur 120 minutes au maximum)
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sur les animaux : Les rongeurs seront anesthésiés lors des sessions d’imagerie (2h maximum). Lors du réveil les rongeurs peuvent être désorientées et stressées.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin d’extraire les organes et réaliser des manipulations ex vivo permettant de corréler les mécanismes biologiques, la distribution des biomarqueurs d’intérêt avec les données en imagerie.
Remplacement
Dans l’état actuel des connaissances, modéliser in vitro ou in silico des tissus complexes en prenant en compte la distribution périphérique, les transporteurs, l’élimination hépatique ou hépatobiliaire, le métabolisme etc..., afin d’évaluer l’exposition tissulaire par le radiotraceur n’est pas possible. Le recours à l’expérimentation animale est donc nécessaire pour étudier l’exposition tissulaire par le radiotraceur en présence et en absence de candidat médicament.
Réduction
L’utilisation des différentes modalités d’imagerie décrites permettra de réduire drastiquement le nombre d’animaux. Le nombre d'animaux par groupe a été déterminé comme minimal grâce à une approche statistique.
Raffinement
Une surveillance quotidienne des rongeurs sera pratiquée par les zootechniciens et les expérimentateurs. Une semaine d’acclimatation est prévue après à la réception des animaux. Ils seront entraînés à la manipulation avant le début du protocole ce qui permet de diminuer l’état de stress et d’améliorer leur bien-être. Ils seront hébergés en groupe dans une cage enrichie avec un tunnel de camouflage, bâtonnets de bois et du matériel pour la fabrication de nids. En cas de complications, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin de mettre en œuvre des traitements appropriés. Toutes les interventions invasives sont réalisées sous anesthésies générales par voie gazeuse afin de minimiser le stress de l’animal et les douleurs liées aux interventions, avec un maintien et une surveillance de la température et du rythme respiratoire. Des points limites sont définis pour éviter toute souffrance animale.
Choix des espèces
Ces espèces présentent l’avantage d’être particulièrement adaptées aux études d’imagerie par TEP (Tomograhie par émission de positons) précliniques. Un certain nombre d’étude ont déjà été publiées dans la littérature ce qui nous permettra de limiter le recours aux rongeurs. L’évaluation de la distribution tissulaire nécessite des tissus pleinement développés (récepteurs, transporteurs, fonction hépatique etc..) et donc les rongeurs utilisés seront au stade adulte (5 semaines à 8 semaines). Le projet sera conduit sur des individus adultes (maturité et développement complet atteint).