Rats

120 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur induit une migraine par injection d'un neuropeptide, le PACAP-38, puis mesure la sensibilité de la face au moyen de filaments de Von Frey et de jets d'air répétés pendant quatre heures après chaque injection. Il décrit une douleur modérée dont l'animal peut s'écarter faute de contention, et tue tous les rats pour prélever leur cerveau. Le projet vise à mettre au point un modèle de migraine chez mâles et femelles, le porteur affirmant qu'aucune méthode ne peut remplacer l'observation in vivo de l'intégration de la douleur.

Objectifs

L’objectif du projet est de développer un nouveau modèle de migraine en se basant sur les derniers résultats scientifiques. Nous étudierons un nouveau neuropeptide présent dans le système trigémino-vasculaire mais également dans l’hypothalamus et la vascularisation des méninges. Ce composé jouerait un rôle dans l’inflammation neurogène ainsi que la modulation et la sensibilisation des neurones nociceptifs trigémino-vasculaires. Des étude récentes chez l’homme ont montré que l’administration de ce produit induit des crises de migraine chez des patients souffrant de migraine sans aura. Ainsi pour mimer les conditions cliniques, nous souhaitons utiliser l’administration systémique du neuropeptide pour provoquer l’activation du système trigémino-vasculaire chez le rat. Nous évaluerons les effets de ce neuropeptide sur le comportement de l’animal, mais également sur l’excitabilité du complexe trigémino-vasculaire en utilisant des marqueurs d’activation neuronale chez le mâle et la femelle. Nous souhaitons comparer d’une part l’activation des régions du système nerveux central chez les mâles et les femelles pour voir s’il y a des différences entre les mâles et les femelles, mais aussi en fonction des variations hormonales qui ont lieu pendant le cycle sexuel chez la femelle.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet nous permettra de développer un modèle animal plus proche de la clinique et des dernières études scientifiques. Ceci devrait nous aider par la suite à mieux comprendre les mécanismes de la crise de migraine, caractériser ses spécificités chez le mâle et la femelle et identifier de nouvelles thérapeutiques. En effet, la migraine est plus fréquente chez les femmes que les hommes, mais les études ont été majoritairement réalisées chez les mâles. Pourtant, il est connu qu’il existe des différences d’intégration inhérentes au sexe et au cycle hormonal. Ainsi à moyen terme, identifier les différences ainsi que le rôle des différentes régions cérébrales dans ce nouveau modèle murin de migraine nous permettra de mieux comprendre cette pathologie. Par ailleurs, on sait que les triptans sont les médicaments spécifiques de la migraine, malheureusement ces molécules ne sont efficaces que chez environ 60% des personnes suggérant que d’autres mécanismes triptan-indépendants sous-tendent la crise de migraine. Ainsi les découvertes récentes chez l’homme montrant que les triptans et les antagonistes du CGRP sont moins efficaces sur les céphalées induites, suggèrent que l’inhibition de la voie du neuropeptide étudié constitue une cible de choix pour développer de nouveaux traitements antimigraineux.

Procédures

Mesure de la sensibilité cutanée : les jours d’injection pendant 4h ; cette mesure se fait par l'application de filaments fins sur la peau de l'animal et par l’envoi d’un jet d’air toutes les 30 min pendant 4 h après l'injection des molécules en sous cutané (chaque application dure 3 secondes). Les jours entre les injections, la mesure se fait une fois.

Impact sur les animaux

Nous utilisons un modèle de migraine qui provoque une douleur modérée de l’animal. Cette douleur est ressentie après les injections, mais n’empêche pas les mouvements de l’animal. Enfin, les stimulations mécaniques avec les filaments de Von Frey ou les jets d’air avec l’AirPuff induisent un retrait de la face signe d’une douleur modérée. L’animal peut échapper à cette stimulation puisqu’il n’est pas en contention. Cette stimulation dure au maximum 3 secondes.

Devenir

La procédure ne permet pas de réutiliser les animaux. En effet, elle se termine par des études immunohistochimiques qui nécessitent de prélever le cerveau : les animaux seront donc mis à mort à la fin de la procédure.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. Il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique. Il est donc nécessaire de réaliser les observations chez l’animal in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum. Huit animaux par groupe est le nombre d'animaux nécessaire pour permettre de mettre en évidence une différence statistique entre eux (logiciel statistique dédié). Par ailleurs pour rendre compte des mécanismes sans doute différents chez l'homme et la femme (hormones différentes), nous avons besoin de réaliser l'étude à la fois chez les mâles et les femelles.

Raffinement

La nuisance identifiée sur le bien-être des animaux est la douleur engendrée dans le cadre du modèle. Concernant la douleur générée par l’application des stimulations mécaniques (à l'aide de filaments en plastique ) , nous respectons les recommandations de l'International Association for the Study of Pain. Nous limitons les stimulations en durée et en intensité au minimum et l’animal a toujours la possibilité d’échapper à la stimulation puisqu’il est libre de ses mouvements. Les stimulations mécaniques ne dépassent pas les point limite fixés. Pour améliorer le bien-être des animaux , les cages sont enrichies à l'aide de rouleaux permettant aux animaux de se cacher. La chirurgie et la mise à mort de l'animal sont realisées sous anesthésie generale.

Choix des espèces

La souche Sprague-Dawley est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires . C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Les animaux seront âgés de 6-8 semaines pour la comparaison avec les autres données de la littérature : les rats sont considérés comme adultes.

4 575 animaux non-humains, 1 525 souris, 1 525 rats et 1 525 lapins, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après retrait des couches superficielles de la cornée sous anesthésie, un agent pro-inflammatoire est appliqué sur un œil, suivi de traitements en gouttes ou en injections oculaires, les animaux ressentant une douleur et une inflammation de la surface de l'œil pendant toute l'étude. Le projet vise à identifier des traitements de l'inflammation et de la douleur oculaires. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative n'existe pour évaluer un traitement dans un modèle d'inflammation cornéenne et choisit le lapin pour la taille de son œil.

Objectifs

L’objectif du projet est de mettre en place, dans le plus grand respect du bien-être animal, un modèle expérimental induisant une inflammation et douleur modérée chez l’animal afin de pouvoir identifier et évaluer des traitements susceptibles de les réduire.

Bénéfices attendus

Les bénéfices susceptibles de découler de ce projet sont l’identification et la sélection de futurs traitements pouvant améliorer le bien-être des patients atteints de signes d'inflammations et de douleur au niveau de la surface oculaire.

Procédures

Au premier jour de la procédure, quinze minutes après avoir enlevé sous anesthésie les couches superficielles de la cornée, une goutte d’un agent pro-inflammatoire va être appliquée sur un œil. Au troisième jour, d’une procédure qui en durera cinq, l’application sera renouvelée. Une série de traitements est ensuite administrée suivant les groupes soit sous formes de gouttes soit sous formes d’injections oculaires en fonction du type de produit et de son mode d’action. Ces administrations par gouttes sont quotidiennes et sont répétés une à quatre fois par jour. Les injections oculaires se font moins fréquemment, généralement pas plus de cinq administrations sur la durée de la procédure. Ces administrations peuvent se faire chez l’homme sous anesthésie locale. Ici, l’animal est endormi à l’aide d’une anesthésie générale légère afin de l’immobiliser, de faciliter l’injection et de réduire un stress éventuel. Une série d’observations est ensuite réalisée quotidiennement afin d’évaluer l’efficacité des traitements sur l’inflammation et la douleur oculaire. Tous les examens réalisés durant ces cinq jours de procédure sont des examens réalisés chez l’homme en cabinet d’ophtalmologie ou en clinique vétérinaire. Ils sont de plus totalement indolores et ne durent que quelques minutes (cinq minutes tout au plus). Ils seront éventuellement réalisés sous anesthésie générale légère afin d’immobiliser l’animal, de faciliter la procédure et de réduire un stress éventuel.

Impact sur les animaux

Le projet a pour but de trouver des traitements à l'inflammation et à la douleur oculaire. Les animaux vont sur la durée de l'étude ressentir une douleur légère à modérée et une inflammation de la surface oculaire (cornée, conjonctives).

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux sont mis à mort pour l'analyse des tissus.

Remplacement

L’œil est un organe complexe. Il est composé de plusieurs tissus anatomiquement et physiologiquement très différents (très vascularisés ou très innervés pour certains, totalement avasculaires ou faiblement innervés pour d’autres). Il est soumis à d'importantes variations environnementales (température et humidité ambiantes), mécaniques (mouvements des globes, des paupières) et physicochimiques (osmolarité…), ainsi qu'à de nombreuses interactions biologiques avec les tissus et organes voisins. Contrairement aux tests d’irritation oculaire (test d’irritation oculaire de Draize par exemple) où plusieurs méthodes alternatives permettant de s’affranchir d’essais sur l’animal ont été validées, il n’existe pas à ce jour de méthode alternative permettant d’évaluer l’efficacité et la tolérance d’un nouveau traitement dans un modèle d’inflammation cornéenne. Les mécanismes impliqués dans les phénomènes inflammatoires et neuro-inflammatoires associés à des douleurs cornéennes sont nombreux et font intervenir différents acteurs (cellules immunes, cellules nerveuses, médiateurs pro-inflammatoires, facteurs de croissances…) présents bien sûr au niveau de l’œil mais aussi au niveau d’autres organes voisins (ganglions, noyaux sensitifs, système nociceptif présent dans le cerveau…). C'est pour cela que l’utilisation d’animaux vivants dans ces procédures expérimentales sont nécessaires pour atteindre les objectifs de ce projet, les modèles alternatifs ne pouvant pas prendre en compte ou faire intervenir à ce jour, toutes les interactions et tous les acteurs impliqués dans ces phénomènes neuro-inflammatoires.

Réduction

Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et historiques de l'établissement, du nombre d'études estimées et tient compte des variations du métabolisme, de la robustesse des mesures et de notre expérience. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'efficacité d'un traitement sera évaluée à chaque moment à l'aide de tests statistiques; chaque groupe traité sera comparé à celui du groupe témoin non traité. De plus, un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. Dès que les procédures expérimentales le permettront, des évaluations non invasives seront choisies tout au long du projet pour améliorer la condition animale et éviter la mise à mort inutile des animaux. De même, l'analyse des deux yeux sera privilégiée autant que possible afin de réduire le nombre d'animaux utilisé.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les rongeurs seront placés en groupe dans des cages d’hébergement contenant nourriture et boisson ad libitum et enrichissement à ronger et un abri. Les lapins seront placés préférentiellement par deux dans des cages avec boisson ad libitum, nourriture et enrichissement à ronger. Les examens choisis pour évaluer les signes cliniques de la maladie sont non invasifs et semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet d'ophtalmologie ou chez l’animal en clinique vétérinaire. Afin de réduire le stress de l'animal lors d'examens nécessitant l'immobilisation de l'animal, une administration d'anesthésique sera réalisée. Il en ira de même pour les procédures plus invasives afin de supprimer la douleur provoquée pendant et en l’atténuant après l’intervention. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum. Ce projet a été soumis pour évaluation à un comité d’éthique et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l'établissement

Choix des espèces

Les modèles expérimentaux présentés sont largement utilisés et décrits sur le lapin et le rongeur dont les publications de référence citées sur lesquelles le projet est basé. Le lapin sera choisi pour la taille de son œil. Les observations des paramètres observées en sont facilitées. Si la quantité de produit à évaluer est limitée (difficulté à synthétiser, coût), le rongeur sera alors choisi. Il le sera aussi si des analyses histologiques spécifiques sont nécessaires, le catalogue d’anticorps par exemple y est plus développé. Enfin le choix de l’espèce, sera guidé aussi par les données existantes sur le produit à évaluer (spécificité d’action, données historiques sur l’espèce choisie). C’est pour ces raisons que des souris, des rats et des lapins ont été retenus pour tenir compte des particularités anatomiques et physiologiques de chaque espèce afin d’augmenter les chances de mener ce projet à terme. Les animaux seront de jeunes adultes : les rongeurs auront un minimum de 6 semaines au début de l’étude et les lapins environ 8 à 12 semaines. Ces âges correspondent à la maturité visuelle chez ces animaux.

98 rats Wistar vieillissants, 49 mâles et 49 femelles, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils suivent un entraînement d'endurance sur tapis roulant, des tests sensorimoteurs et cognitifs de force de préhension et de mémoire, et jusqu'à quatre prélèvements sanguins sur huit semaines, avant d'être tués pour prélever cerveau et muscles. Les retombées annoncées, transposer à l'humain les effets de l'entraînement sur le cerveau vieillissant, restent au conditionnel. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut reproduire l'interaction muscle-cerveau sur une telle durée.

Objectifs

Dans ce projet, l’efficacité de programmes d'intensité modérée (Moderate intensity continuous training ou MICT) et de haute intensité (High-intensity interval training ou HIIT) est évaluée sur l’évolution des paramètres physiologiques de la performance d’endurance et de la performance sensorimotrice/cognitive ainsi que sur la plasticité musculaire et cérébrale sur 98 rats Wistar mâles (n=49) et femelles (n=49) adultes vieillissants (12-15 mois). Ce projet implique donc des tests sensorimoteurs/cognitifs, de performance d’endurance sur tapis roulant, 2 prélèvements de sang seront réalisés avant et après les 2e séances des semaines 2, 4 et 8 (après désinfection à l’alcool à 70°) au niveau de la veine caudale latérale de la queue. Ces échantillons seront ensuite conservés pour des analyses moléculaires ultérieures. Cela implique aussi des mesures moléculaires musculaires et cérébrales (hippocampe et cortex) à la fin du protocole après prélèvement des tissus pour quantifier les protéines clefs impliquées dans la neuroplasticité et l’activité métabolique.

Bénéfices attendus

Le projet peut révéler la spécificité de chaque méthode d'entraînement en endurance sur les fonctions cérébrales ainsi que les fonctions cognitives et sensorimotrices chez les individus âgés où des troubles moteurs et cognitifs apparaissent fréquemment. Les protocoles d'endurance seront individualisés à partir de repères physiologiques (voir procédure 1 pour la méthodologie utilisée) afin d'être facilement transférables à l'humain comme cela sera dans ce projet de recherche.

Procédures

Pas de chirurgie avec réveil dans ce projet. 1) Les intensités d'effort sont individualisées pour limiter les vitesses de course excessives et stressantes pour les animaux. 2) Pour le prélèvement du cerveau et muscles, ils subiront d'abord une anesthésie profonde. Après disparition des derniers signes d'éveil (absence de reflexes palpébraux, de l’axe sensori-moteur et absence de mouvements des vibrisses), l’étape suivante consiste à les euthanasier par un surdosage d'anesthésique. 3) Prélèvement de sang à la base de la queue sous anesthésie pour réduire le stress et les mouvements de l'animal (maximum 4 prélèvements de sang sur 8 semaines). Le volume prélevé sera inférieur au 20% du volume sanguin total dans la période de 7 jours, soit 2 ml maximum de sang prélevé pour des rats de 400-550g sur 1 semaine incluant le prélèvement PRE et POST séance (séance 2 des semaines 2, 4 et 8).

Impact sur les animaux

Globalement, le protocole n'induit pas d'effets indésirables importants. De légères blessures possibles peuvent subvenir aux niveaus des pattes. les autres procédures sont réalisés sous anesthésie n'induisant pas d'effets indésirables.

Devenir

Ils seront euthanasiés pour prélever les organes afin de les utiliser pour des analyses moléculaires ultérieures (Western blot et ELISA).

Remplacement

Il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle de substitution in vitro pour étudier l’impact d’un entrainement d'endurance au niveau musculaire et cérébral et qui puisse faire le lien entre ces 2 systèmes. L’utilisation de culture de neurones (in vitro) ne peut pas remplacer l’utilisation des animaux dans ce projet car il n’est pas possible de mimer précisément l’entraînement physique de manière chimique. De plus, la durée de l’entraînement prévue est trop longue (8 semaines) pour pouvoir réaliser la même expérience in vitro. Les neurones en culture primaire ne restent pas exploitables sur cette durée. Il est également nécessaire de tenir compte des contraintes mécaniques imposées aux muscles actifs lors de la course. Ces contraintes contribueraient à la plasticité cérébrale mais le modèle in vitro ne peut pas reproduire ces phénomènes physiologiques d’interaction muscle-cerveau.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux pour chaque groupe, nécessaire à la réalisation d’un test statistique paramétrique, soit un total de 98 rats Wistar, mâles et femelles. Le protocole sera arrêté si l’animal présente des difficultés respiratoires, s’il est prostré ou en retrait, si ses poils sont hérissés.

Raffinement

Les méthodes utilisées sont soit non invasives, soit très peu invasives (prise de sang) soit sans réveil. Les expérimentations seront optimisées dans l’optique de réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, la douleur ou l'angoisse subie par les rats afin d’assurer le bien-être de l'animal. Ce qui est prévu : L’environnement des cages sera enrichi et renouvelé toutes les semaines par la présence d'objets afin de réduire l'ennui des animaux (igloos cartonnés, des tunnels en Carton 5 mm et en polycarbonate ainsi que des mini-rouleaux de papier). Les mêmes expérimentateurs restent en contact avec les animaux tous les jours afin qu'ils s'habituent à eux. Les animaux sont familiarisés avec les dispositifs expérimentaux avant le début du protocole pour réduire le stress éventuel. Pour le protocole de la ponction de la veine caudale latérale (gauche ou droite) est réalisé sous anesthésie générale (gazeuse). Pour le prélèvement du cerveau et muscles, les rats reçoivent un antalgique 30 min avant la procédure et sont ensuite anesthésiés profondément. Après disparition des derniers signes d'éveil (absence de reflexes palpébraux, de l’axe sensori-moteur et absence de mouvements des vibrisses), l’étape suivante consiste à les euthanasier avec un surdosage d’anesthésique. Cette procédure n'induira pas de perte de poids de plus de 20%. Ils devraient même en prendre régulièrement. Dans le cas contraire, ils seront euthanasiés. le porteur du projet prendra cette décision.

Choix des espèces

Les répercussions musculaires et métaboliques à l'exercice montrent des similitudes entre un rat et un homme (par exemple, présence d'un seuil lactique, biogenèse mitochondriale, gains de masse musculaire) comme en témoignent de nombreuses publications. Il permet, en outre, à partir de tests comportementaux (sensibilité mécanique, force de préhension, mémorisation à court terme…) et immunohistologique, de vérifier l'efficacité de nouvelles stratégies d'entrainement. Les rats sains vieillissants seront inclus à partir de 12 mois (12-15 mois). Le taux de survie est plus important comparé aux rats âgés de 20 mois. De plus, ces animaux sont davantage susceptibles de courir sur le tapis roulant que des rats plus lourds. Ce modèle de rats vieillissants est fréquemment utilisé dans la littérature pour étudier les effets du vieillissement sur le cerveau.

900 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque rat subit une opération de microchirurgie vasculaire d'environ trois heures sous anesthésie, pour entraîner des chirurgiens en formation et hors de toute production de connaissances, puis il est tué le lendemain pour vérifier la perméabilité du montage. Le porteur décrit un apprentissage d'abord mené sur simulateurs et cuisses de poulet, avant un passage sur l'animal vivant qu'il juge "nécessaire" pour se rapprocher des conditions réelles. Il justifie le rat par la similitude de son réseau vasculaire avec les micro-vaisseaux humains et par le fait que la thrombose, signe d'échec, ne se vérifie pas in vitro.

Objectifs

Les objectifs principaux du Diplôme Universitaire en Recherches Microchirurgicales sont : -Préparer des chirurgiens en formation (venant de spécialités diverses) à l'utilisation du microscope et à la pratique de la microchirurgie. -Donner aux chirurgiens des outils de réflexion microchirurgicales, pour les indications et pour les bases de rigueur et de finesse nécessaire à une telle chirurgie de pointe. - l'élargissement du champ d'action du chirurgien qui doit manipuler des structures toujours plus petites. Dans ce domaine, l'oeil est sa limite et le microscope offre ainsi de nouvelles perspectives dans de nombreuses spécialités chirurgicales.

Bénéfices attendus

Cet enseignement fournit aux chirurgiens une formation théorique et pratique à la technique et aux indications de la microchirurgie vasculaire et nerveuse (les lambeaux libres, chirurgie réparatrice, chirurgie de la main..)

Procédures

Chaque animal sera soumis à une seule intervention chirurgicale de type microchirurgie vasculaire et qui dure environ 3 heures. La chirurgie est pratiquée sous anesthésie générale et couverture analgésique.

Impact sur les animaux

-La manipulation des animaux avant l'anesthésie peut leur causer du stress -Des nuisances liées à l’anesthésie (perturbation hémodynamique, troubles respiratoires, troubles cardiovasculaires, retard de réveil .) -Des nuisances liées à la chirurgie (risque infectieux, risque d’hémorragie, risque d’hypovolémie, risque d’hypothermie) - Des nuisances en post chirurgie (anorexie, diminution de la prise hydrique,hypovolémie, hypo ou hyperthermie, arrachement des points de suture par l’animal). Les effets indésirables peropératoires sont indiqués dans les points limites.

Devenir

L'ensemble des animaux est euthanasié le lendemain de la réalisation d'un montage micro-chirurgical pour la vérification de la perméabilité de l'anastomose et la recherche de thrombose vasculaire, signe d'échec.

Remplacement

L’enseignement se fait d’abord sur des modèles inertes (des simulateurs de microchirurgie et des cuisses de poulet de commerce), puis une fois que les stagiaires valideront les techniques de microchirurgie sur ces modèles, ils passeront chez le rat qui a été choisi par rapport aux similitudes de son réseau artério-veineux fémoral avec les micro-vaisseaux humains. Il est nécessaire de former les chirurgiens aux organismes vivants (ici le rat) pour se rapprocher des conditions réelles. en effet, le signe principal de l'échec d'une microchirurgie est la thrombose ( formation de caillot sanguin) qui ne peut pas être vérifié in vitro.

Réduction

Du fait de l’objectif pédagogique de cette formation, l'approche statistique n'est pas pertinente. Le nombre d’animaux utilisé est calculé par rapport au nombre de montages que les étudiants doivent pratiquer et le nombre d’étudiants inscrits par an. Le nombre d’animaux a été minimisé par l’entrainement préalable de ces montages sur un modèle non vivant qui est la cuisse de poulet et par l'utilisation des rats Ces TP ne générant pas de valeurs de mesure, aucun test statistique n’est effectué.

Raffinement

Avant les procédures, les animaux sont hébergés en groupes sociaux, dans des micro-environnements enrichis par la présence de tunnel en carton et de carfil nestin, au sein d’une animalerie exempte de pathogènes spécifiques et dont les paramètres physiques et sanitaires sont strictement contrôlés. L'alimentation et l'eau seront distribuées à volonté. Le choix des instruments est adapté aux techniques de chirurgie « classique » microinvasive afin d’éviter les lésions et délabrements superflus des tissus, sources de douleurs. Toute souffrance animale est évitée par la mise en place des points limites et d’un protocole analgésique et anesthésique adéquat. Les animaux sont visités et suivis régulièrement par un personnel formé et compétent.

Choix des espèces

Le rat est choisi par rapport à la similitude de son réseau artério-veineux avec les micro vaisseaux humains avec des possibilités de montage vasculaire sur le pédicule fémoral et le pédicule jugulo-carotidien. Adultes, entre 350 et 450 grammes en moyenne. Des animaux plus jeunes rendent la réalisation des différents montages plus difficile.

1 182 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, cette autorisation ne couvrant que les séances d'IRM, à l'issue desquelles les animaux repartent dans un autre établissement pour la suite du projet. Porteurs de tumeurs cérébrales greffées et irradiés dans le cadre d'autres procédures, ils subissent ici des examens d'IRM répétés sous anesthésie, jusqu'à huit sessions sur un an, pour suivre les effets d'une radiothérapie à mini-faisceaux. Le porteur décrit l'IRM comme non invasive, les effets attendus se limitant à l'anesthésie et à une légère perte de poids. Il présente le suivi longitudinal d'un même animal comme une réduction du nombre d'individus et juge le recours au modèle animal "indispensable".

Objectifs

Le principal défi de la radiothérapie est de parvenir à déposer une dose curative dans la tumeur tout en s’assurant que les tissus sains environnants soient préservés dans leur intégrité. Pour certains types de tumeurs radiorésistantes comme les gliomes (tumeurs cérébrales), la radiothérapie ne peut être que palliative. Pour parvenir à une dose de radiation curative, le risque de dommages graves aux tissus sains est trop élevé pour pouvoir être considéré. Dans ce contexte, notre objectif principal s’inscrit dans l’amélioration des traitements de radiothérapie. Le but de ce projet est d’utiliser l’IRM (Imagerie par Résonance Magnétique, technique non invasive et atraumatique utilisée en clinique chez l’homme) chez le modèle rongeur pour étudier le mode de fonctionnement et les conséquences morphologiques de nouveaux modes d’irradiation, et notamment la Radiothérapie avec Mini-Faisceaux (MBRT).

Bénéfices attendus

La radiothérapie avec mini-faisceaux (MBRT) étant une technique novatrice, il est primordial de très bien comprendre les mécanismes microscopiques et macroscopiques intervenant lors de son utilisation, pour pouvoir optimiser les conditions d’utilisation : pour ce faire, la réaction de différentes lignées de cellules cancéreuses plus ou moins agressives doit être étudiées et ce, avec différentes géométries et puissances de faisceaux. Par le suivi IRM des animaux implantés (différentes lignées cancéreuses) et irradiés (différentes conditions d’irradiations), nous espérons pouvoir établir les meilleures conditions de MBRT en vue d’applications futures en clinique.

Procédures

Pour les sessions d’ IRM (objet de la présente DAP) permettant de suivre les effets de la radiothérapie, les animaux recevront une anesthésie gazeuse. Ce suivi sera d’un an maximum et comportera une session IRM à plusieurs moments après irradiation (2, 7, 14, 21, 30, 40 jours, 3 et 6 mois après irradiation). Chaque session IRM n’excédera pas 1 heure.

Impact sur les animaux

L’examen IRM étant une modalité de neuroimagerie totalement non-invasive et non-irradiante, les potentiels effets indésirables sont liés au fait que l’examen est réalisé sous anesthésie générale légère. Afin de vérifier que cette dernière n’a pas d’effet néfaste sur la respiration du sujet anesthésié, la fréquence respiratoire est surveillée en permanence tout au long de l’examen. Il est également possible d’observer une légère perte de poids le lendemain de l’examen, suite au stress potentiellement induit par la combinaison transport/examen entre les deux animaleries.

Devenir

Après l’examen IRM, tous les animaux retourneront dans l’autre établissement utilisateur pour continuer le projet (utilisation continue).

Remplacement

Nous désirons valider un potentiel nouveau mode de traitement par radiothérapie dans le cadre du cancer du cerveau. Pour évaluer l’efficacité de la technique, nous allons étudier la préservation des tissus sains environnants de la tumeur et contrôler la croissance des tumeurs irradiées. Les mécanismes biologiques activés impliquent très probablement des effets vasculaires et immunologiques. Aussi, le recours à des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans ce projet et il nous est indispensable de développer des modèles animaux. En effet, une culture in vitro de tissus ne permettrait pas d’apprécier l’effet des traitements, ni un modèle in silico.

Réduction

L’IRM permettant un suivi longitudinal des animaux, et chaque animal étant observé à 8 stades différents, nous utiliserons 8 fois moins d’animaux que par une méthode classique d’histologie. Le nombre d’animaux (1182 rats au total) a été statistiquement défini pour permettre l’obtention de résultats fiables avec le moins d’animaux possible. Une analyse de puissance a été effectuée comme décrite et validée par le projet précédent.

Raffinement

Que ce soit durant leur transport sur le lieu de l’examen IRM, ou lors de l’examen lui-même, une grande attention est apportée au bien-être des animaux, et tout est mis en œuvre pour éviter les sources potentielles de stress. Transports : Les animaux sont transportés dans leur boîte habituelle (enrichie), avec leurs partenaires habituels et manipulés par les personnes assurant leur suivi quotidien. Les boîtes sont protégées du froid ou du chaud éventuel. Manipulations/anesthésie avant/après examen IRM : Ces actes sont réalisés par les personnes qualifiées assurant le suivi quotidien des animaux. Examen IRM : Il est réalisé sous anesthésie, dans un berceau chauffé uniquement dédié à ces animaux, avec contrôle de la respiration et de la température. Manipulations après examen IRM : Le réveil naturel de l’animal se fait au calme en cage individuelle sur un matelas chauffant. Lors de l’examen IRM, si la respiration sort des limites prévues, l’examen est immédiatement interrompu et l’animal est mis sous surveillance accrue jusqu’à sa récupération. Par ailleurs, le temps de l’examen IRM a été réduit à son minimum. En dehors des sessions d’examen IRM, une grille de scoring et des points limites ont été définis pour suivre le bien-être des animaux.

Choix des espèces

Les rongeurs sont particulièrement utilisés en cancérologie et dans les études de radiothérapie car il s’agit d’espèces génétiquement caractérisées et pour lesquelles les références bibliographiques sont très nombreuses dans la littérature ayant trait au domaine de la radiothérapie. Notre projet va nécessiter de travailler sur des rats chez lesquels la taille plus importante du cerveau va être plus adaptée aux types d’irradiations proposées dans le cadre des procédures expérimentales que celle des souris. De nombreux articles ont déjà été déposés avec le modèle « rat », nous poursuivons donc nos études avec ce modèle. Les procédures seront réalisées sur des animaux adultes de 6-7 semaines, âge compatible avec un développement suffisant et la possibilité de garder les animaux assez longtemps pour permettre une étude des effets à long terme de l’irradiation.

96 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélever leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une restriction alimentaire destinée à les motiver, des tests d'impulsivité de choix, des injections intrapéritonéales deux fois par semaine et des prélèvements sanguins sur animal vigile, pour évaluer trois candidats médicaments. Le porteur décrit un design où chaque rat est son propre témoin et teste les trois composés, présenté comme une réduction du nombre d'animaux. Il rattache le projet à une phase préclinique, une entrée en clinique restant conditionnée à des résultats positifs.

Objectifs

La prise de décision fait partie intégrante de notre quotidien. Un déficit connu de la prise de décision se traduit par des troubles de l'impulsivité. Cette dernière se traduit par une impossibilité à retarder le début d'une action, qui commencera donc de manière prématurée, c'est alors une impulsivité d'action. Il existe également une autre forme d'impulsivité, appelée impulsivité de choix. Il existe différentes tâches comportementales pour étudier cette forme d'impulsivité. Dans ces tâches, les animaux doivent choisir entre 2 ou plusieurs options ayant des rapports coûts/bénéfices différents. Dans ce projet, nous souhaitons tester l'effet potentiel modulateur de 3 candidats médicaments sur l'impulsivité de choix chez le rat.

Bénéfices attendus

Le projet s'intégrè dans la phase pré-clinique du développement de candidat médicaments. En cas de résultats positifs, le ou les candidats médicaments retenus pourront, à terme, entrer dans des études cliniques.

Procédures

Les animaux seront soumis à des tests comportementaux ainsi qu'a des injections intrapéritonéales 2 fois par semaine. Les tests comportementaux seront rapides et se dérouleront pendant 4 semaines. A la suite des injections des candidats médicaments, les animaux, vigiles, seront également soumis à un prélèvement sanguin. De plus, à la fin de chaque protocole, les animaux seront mis à mort.

Impact sur les animaux

Le traitement bi hebdomadaire des animaux par injection intrapéritonéale peut induire un stress, particulièrement lors des 1ères administrations. Ces injections peuvent également indurie une légère douleur. De plus, les tests comportementaux peuvent induire une nuisance chez les animaux, notamment à cause de la restriction alimentaire afin d'augmenter leur motivation à réaliser la tâche. Enfin les prélèvements sanguins, bien que réalisés par du personnel compétent et entrainé, pourront aussi entrainer une douleur légère chez les animaux.

Devenir

Les animaux seront mis à mort afin de collecter le cerveau pour des analyses histologiques.

Remplacement

Les processus physiopathologiques de l'impulsivité impliquent l'interaction de différentes structures cérébrales. Les composés médicaments sont supposés agir sur des structures cérébrales précises. Ce degrè de compléxité et la validation du site d'action ne peuvent être atteints qu'avec un modèle animal. Le rat possèdant un système cérébral complexe, présentant des similitudes avec le système nerveux humain, en particulier dans le domaine de la prise de décision et de l'impulsivité, est donc un bon modèle pour notre sujet d'étude. De plus, les 1ères phases de validation des composés, de leur non toxicité ont été réalisées au sein du laboratoire de notre partenaire.

Réduction

En se basant sur la littérature scientifique et sur l'expertise de notre équipe en terme d'études comportementales, le nombre de rats (n=24 par expérience, n=8 par sous-groupe) a été optimisé afin d'avoir un groupe d'animaux suffisant pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. De plus, le design expérimental choisi permet de réduire le nombre d'animaux utilisés puisque chaque rat sera son propre contrôle et testera les 3 candidats médicaments. Les 3 sous-groupes correspondent chacun à un ordre d'administration des candidats médicaments différents, afin d'éviter tout biais d'ordre. De plus, nous avons choisi de réaliser des tests statistiques de type régression linéaire multiple pour nos sorties comportementales de type temps de réaction, temps de mouvement (variable réponse numérique continu) ,ou de type modèle linéaire généralisé pour les paramètres comportementaux type nombre d'appui sur le levier, de réponses prématurées, d'entrée dans la mangeoire (variable réponse de type comptage) afin d'avoir une puissance statistique plus important et donc de pouvoir réduire notre nombre d'animaux.

Raffinement

Les animaux auront une période d'acclimatation à l'animalerie ainsi qu'aux expérimentateurs (par manipulation quotidienne) avant le début des expérimentations afin de réduire au maximum le stress potentiel. De plus, des stratégies d'analgésie et le contrôle strict des besoins physiologiques des animaux (poids) seront mis en place afin de veiller au mieux au bien-être des animaux durant toute la durée du projet. Une grille de score pour le suivi du bien-être des animaux sera utilisée pour surveiller au mieux les animaux et prendre les décision les plus adaptées sans attendre. La souffrance des animaux sera limitée au maximum par une surveillance quotidienne. Dans le cas où les animaux atteindraient des points limites définis ou si le traitement analgésique n'était pas efficace, l'animal sera mis à mort.

Choix des espèces

Le rat possède un système cérébral complexe, présentant des similitudes avec le système nerveux humain, en particulier dans le domaine de la prise de décision et de l'impulsivité. De nombreuses études ont déja été menées en neurosciences dans ce domaine là utilisant des modèles rongeurs. De plus, de part l'expertise de notre équipe, nous sommes en mesure de développer un modèle d'impulsivité fiable chez cette espèce. Nous disposons également de tout le matériel nécessaires à la manipulation et aux soins de ce type de rongeur. Nous utiliserons des rats jeunes adultes pour ce projet. Les animaux seront commandés à environ 10 semaines d'âge. Cet age correspond à l'age classiquement utilisé dans les études qui nous interessent et correspond à un stade de développement cérébral permettant de répondre à notre problématique scientifique. Après leur arrivée, les animaux auront 1 semaine d'acclimation. Ainsi, les rats auront 11 semaines au début des tests.

170 souris et 170 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, réutilisés d'une séance à l'autre puis destinés à d'autres travaux pratiques, dont des procédures sans réveil. Des étudiants novices leur infligent à répétition des contentions, des injections sous-cutanées et des sondages gastriques, chaque animal pouvant être manipulé jusqu'à quatre fois. Le porteur classe ces gestes comme individuellement légers mais reconnaît que leur répétition par des débutants peut les porter à un niveau modéré. Il justifie l'usage d'animaux vivants par la formation réglementaire de futurs techniciens en expérimentation animale, qualification décrite comme recherchée dans son bassin d'emploi.

Objectifs

Durant leurs études, nos étudiants suivent une formation qui qualifie le personnel appliquant des procédures expérimentales aux animaux (niveau II/A), spécifique aux modèles rongeurs. Cette formation réglementaire nous permet de former des techniciens qualifiés en expérimentation animale, qualification très appréciée et recherchée dans notre bassin d’emploi. Le programme de la formation inclut l’acquisition de diverses compétences théoriques et pratiques permettant la manipulation de rongeurs dans le respect de leur bien-être. La réalisation de la contention ainsi que l'exécution de quelques injections figurent parmi les toutes premières compétences à acquérir. Pour y parvenir, les travaux pratiques que nous souhaitons mettre en place permettront une familiarisation progressive des étudiants aux rongeurs et à ces techniques, en multipliant les supports pédagogiques. Les objectifs pédagogiques de ces séances sont multiples: -familiarisation des étudiants avec les rongeurs -sensibilisation au respect du bien-etre animal -apprentissage des règles d'hygiène et de sécurité propres à la pratique de l'expérimentation animale -connaissance du matériel nécessaire aux injections, préparation de ce matériel, notions d'asepsie -acquisition des compétences techniques de préhension, contention, injection sous-cutanée, sondage gastrique, injection intra-péritonéale.

Bénéfices attendus

Au cours d’une procédure expérimentale, le technicien doit être en mesure de limiter le degré de mal-être généréà l’animal, en apportant des réponses adéquates afin de restreindre celui-ci. Ceci nécessite un apprentissage rigoureux et méthode, réalisé durant des séances d'entrainement. Ce projet permettra à nos étudiants et futurs techniciens, par sa progressivité et la multiplicité des supports à nos étudiants, futurs techniciens d'acquérir les compétences de contention et d'injections courantes chez le rat et la souris tout en veillant à respecter leur bien-être.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections répétées. Par séance, chaque animal pourra être soumis à une injection sous-cutanée et un sondage gastrique. Cet animal sera réutilisé au minimum 48-72h après pour la même intervention mais nous veillerons alors à alterner les sites d'injection sous-cutanée. Le plus fréquemment, il s'écoulera au moins une semaine entre deux injections. Il pourra ainsi être réutilisé jusqu'à 4 fois mais, plusieurs promotions d'étudiants étant concernées, les périodes de travaux pratiques seront espacées parfois de plusieurs semaines avant que l'animal soit soumis à une nouvelle injection. Nous veillerons au suivi attentif des animaux et ne les réutiliserons qu'en absence de mal-être. Ainsi un meme animal sera soumis à, 1 injection sous-cutanée et 1 sondage gastrique sur 4h, ceci répété au maximum 3 fois espacées de 48 à 72h minimum courant novembre de chaque année puis 1 injection sous-cutanée et 1 sondage gastrique sur 4h, ceci répété au maximum 1 fois espacée de 48 à 72h minimum courant janvier et enfin 1 injection sous-cutanée et 1 sondage gastrique, ceci répété au maximum 1 fois espacée de 48 à 72h minimum courant mars (que ce soit 1 rat ou 1 souris)

Impact sur les animaux

Les actes pratiqués ici sont individuellement d’un degré de sévérité léger mais leur répétition (réutilisation des lots à plusieurs jours/semaines d'inrervalle pour réduire le nombre d'animaux utilisés), leur réalisation par des étudiants novices pourraient les classer dans un degré de sévérité modéré. Les effets indésirables possibles, qui seront recherchés et évalués à l'aide d'une grille de scoring et conduiront à la réalisation d'un traitement antalgique adapté, sont : - une perte de poids (évaluée en % et par jour), - un comportement inadapté (comportement des animaux sans intervention du manipulateur – contractions, boiteries des pattes antérieures, position antalgique, prostration - et en réponse au geste du manipulateur : agressivité ou passivité, retrait après toucher du point d'injection) - une déshydratation (détectée par l’apparence physique telle que yeux plissés, enfoncés, pli de peau moins élastique …), -un aspect physique altéré (aspect du site d'injection, poil hérissé, sale), -une hyperventilation

Devenir

L'ensemble des animaux du projet sera réutilisé dans des TP ayant fait l'objet d'une DAP.

Remplacement

Nous commençons l’apprentissage en visionnant des vidéos afin d'etre en mesure de mentaliser les procédures. Puis nous passons sur support non vivant (modèles plastiques et /ou cadavres de souris congelées le cas échéant, qui sont des souris de réforme euthanasiées au sein de laboratoires pharmaceutiques ou plateformes partenaires). Néanmoins les gestes doivent cependant être pratiqués sur rongeurs vigiles pour ces futurs techniciens en expérimentation animale. Nous utilisons un animal par étudiant lors des TP mais les animaux sont réemployés grace à une rotation espacant les séances et en veillant à leur bon rétablissement.

Réduction

.Nous recourons à une souris et un rat par étudiant, par séance. Nous estimons que l'emploi d'un animal pour 2 étudiants au cours d'une même séance serait préjudiciable à l'animal qui serait alors manipulé 6 fois au cours du TP soit 2 fois plus (pour mémoire un même animal est manipulé 3 fois lors du TP n° 2 : révision contention - injection sous cutanée - sondage gastrique). Par ailleurs il nous faudra former 9 groupes de 16 étudiants, mais nous n’aurons recours qu’à deux lots de 17 souris et 17 rats (dans chaque lot, un animal par étudiant + un animal pour l'enseignant faisant démonstration). La formation de ces 9 groupes n'aura pas lieu en meme temps : 3 groupes seront formés courant novembre, 3 autres groupes seront formés courant janvier et les 3 derniers seront formés courant mars. Ainsi les 2 lots de 17 animaux benéficieront de plusieurs semaines de repos complet à l'animalerie entre chaque formation. Après ces séances, les animaux pourront être réutilisés dans d’autres TP de notre établissement, correspondant à des procédures sans réveil (autres projets autorisés).

Raffinement

Les animaux sont systématiquement amenés en salle de TP une heure avant le début de la séance, afin de s’acclimater à ce nouvel environnement. Des recommandations sont données, rappelées aux étudiants à chaque séance afin que la manipulation ait lieu dans le calme. Après retour à l'animalerie, les zootechniciens surveilleront les animaux et leur bien-être quotidiennement à l’animalerie. Il est important qu’ils soient informés des actes réalisés sur les animaux durant les TP, de façon à connaître les douleurs potentiellement occasionnées. Une grille d’évaluation du bien-être des animaux est couramment employée pour ce type d’acte. Prenant en compte des critères objectifs, elle servira à adapter un traitement antalgique. Si le traitement n’aboutit à aucune amélioration (suite à évaluations plus fréquentes si une douleur a été détectée), l’euthanasie de l’animal sera réalisée après anesthésie (injection létale après anesthésie gazeuse).

Choix des espèces

Les rongeurs sont les animaux les plus utilisés en expérimentation, il est donc logique que nous formions nos étudiants à la manipulation de ces animaux. Les actes de contention, sondage gastriques, sous-cutanées sont fréquemment réalisés chez ces espèces. Nous démarrerons avec de jeunes adultes plus faciles à manipuler pour des étudiants en phase d'apprentissage.