Rats
Thérapie cellulaire dans la gestion du diabète et de ses complications
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
Rats : 232
Jusqu'à trois prises de sang par semaine sur une étude de six mois au plus, et des tests de tolérance au glucose comptant chacun jusqu'à dix prélèvements en trois à six heures : 348 rongeurs, 116 souris et 232 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue pour des prélèvements terminaux. Rendus diabétiques par une injection de streptozotocine, ils reçoivent des îlots pancréatiques nus ou encapsulés, injectés ou implantés par chirurgie sous anesthésie, puis restent isolés environ une semaine pour récupérer. Jusqu'à une fois par semaine, l'équipe stimule leurs pattes au toucher ou à la chaleur pour mesurer la neuropathie, et examine le fond de leur œil. Les capsules doivent protéger les îlots greffés du système immunitaire, pour épargner un jour aux patients diabétiques de type 1 les traitements immunosuppresseurs. Ces procédures sont classées au niveau sévère, et le porteur écrit que "des effets indésirables légers peuvent apparaitre dans certaines procédures".
Objectifs
Le diabète est une maladie métabolique caractérisée par une hyperglycémie chronique résultant d’un défaut de sécrétion d'insuline (diabète type 1) ou d'action de l'insuline (diabète de type 2). L’hyperglycémie chronique expose les personnes atteintes à un risque accru de pathologies plus graves telles que la néphropathie, la neuropathie, les complications cardiovasculaires, oculaires (rétinopathie). Aujourd’hui, l’incidence du diabète a atteint une proportion pandémique et les estimations pour les prochaines années sont alarmantes, on estime que d’ici à 2045, le nombre de diabétiques s’élèvera à 700,2 millions dans le monde. Le diabète de type 1 (DT1), résulte d’une réaction auto-immune par une autodestruction progressive des cellules bêta des îlots de Langerhans du pancréas, productrices d’insuline. Ainsi, les patients souffrants de DT1 n’ont d’autre choix qu’un apport exogène d’insuline pour pouvoir réguler leur homéostasie glucidique. Aujourd’hui, malgré une amélioration non négligeable de la gestion du DT1 par le développement des analogues à l’insuline et l’utilisation de moniteurs de glycémie, la régulation glucidique reste compliquée pour certains patients. En effet, ces derniers sont souvent exposés à des épisodes d’hypoglycémie iatrogène.Une alternative offrant une meilleure capacité de régulation glucidique serait une greffe d’ilots pancréatiques. Toutefois, le recours systématique aux traitements immunosuppresseurs pour protéger les cellules greffes de la destruction à médiation immunitaire, reste le principal obstacle. Afin d’éviter l’utilisation de traitement immunosuppresseur, qui expose le patient à un risque accru de complications infectieuses, la greffe d’ilots pancréatiques encapsulés représente une stratégie thérapeutique prometteuse. En effet, les cellules d’ilots de Langerhans sont contenues dans une capsule semi-perméable, les protégeant ainsi du rejet par le système immunitaire, tout en permettant le passage à la fois des nutriments, de l’oxygène et de l’insuline. Ainsi, l’objectif du présent projet est d’évaluer l’efficacité des ilots encapsulés implantés chez les animaux diabétiques sur la régulation métabolique et à prévenir les complications liées au diabète (rétinopathie et neuropathie).
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer l’efficacité des implants d’ilots pancréatiques sur la régulation métabolique et leur tolérance locale chez les rats diabétiques. Par ailleurs l'effet préventif des implants sur les complications du diabète (neuropathie, rétinopathie) est également évalué.
Procédures
Les troubles métaboliques sont induits par une administration unique d'un réactif (durée d'environ 1 minute). Après sélection des animaux diabétiques, les ilots pancréatiques nus ou encapsulés sont injectés ou implantés/explantés par chirurgie sous anesthésie qui dure généralement 1 heure. Par la suite, les animaux sont maintenus isolés avec enrichissement pour une meilleure récupération post-chirurgicale (généralement pour une semaine). Juste avant la chirurgie et durant la période post chirurgicale, anti-inflammatoire et antibiotique sont administrés par bolus rapide (quelques secondes) par voie sous-cutanée ou intramusculaire (de manière générale) selon les bonnes pratiques vétérinaires. Les tests de tolérance au glucose et à l’insuline (1/ mois) nécessitent une administration unique par voie orale, intrapéritonéale ou sous cutanée (durée d’environ 1 minute) suivie de prélèvements d'une goutte de sang (durée de quelques secondes, 10 prélèvements maximum, sur 3 à 6 h de test). Par ailleurs, des prélèvements de sang peuvent être réalisés de manière répétée par exemple : 3 fois par semaine au maximum pendant la toute durée de l’étude (6 mois au maximum), chaque prélèvement durant quelques secondes à 3 minutes. De plus, un hébergement individuel (durée maximum de 24 h) peut être nécessaire au cours de l'étude pour prélèvement d'urine ou de fèces. L’évaluation de la neuropathie se fait par stimulation tactile et/ou thermique au niveau des pattes de l’animal, la procédure dure quelques minutes et peut être répétée 1 fois par semaine au maximum. Enfin, un examen du fond de l’œil (durée de quelques minutes, répété 1 fois par semaine au maximum) est réalisé par méthode non invasive (ophtalmoscope).
Impact sur les animaux
Dans ce projet, des effets indésirables légers peuvent apparaitre dans certaines procédures, ceux-ci sont essentiellement marqués par : (1) une perte de poids suite à l'induction des troubles métaboliques, (2) des phases d’hypoglycémie ou d'hyperglycémie, (3) une courte privation de nourriture (pour une durée n’excédant pas 16h ± 1 h) ou des prélèvements sanguins et/ou urinaires. Toutefois, si une souffrance devait apparaître, l’atteinte de points limites clairement établis permettraient l'euthanasie de l'animal. Par ailleurs, de courtes périodes d'isolement n’excédant pas 24h ± 1h sont nécessaires au projet (en veillant à conserver le contact olfactif, visuel et sonore entre les congénères). En outre, lors de la phase de récupération post-chirurgicale, une attention particulière est apportée (surveillance des cicatrices, état général, poids, appétit, excrétion de fécès…).
Devenir
Tous les animaux sont soumis à des prélèvements terminaux ce qui implique leurs euthanasies.
Remplacement
De nombreux tests ex vivo (in vitro et in silico) sont réalisés avant les tests sur l'animal. Ceux-ci constituent un point de départ permettant de générer des données préliminaires de concept, d’effectuer un tri du matériel d’encapsulation et de ne retenir que les matériaux présentant une certaine efficacité et inocuité.. Bien que ces tests permettent une réduction significative du nombre de substances à tester (et donc du nombre d’animaux), ils ne donnent aucune indication sur la tolérance et l’efficacité du complexe (capsule-ilots) chez l’Homme. Ainsi, les modèles d'animaux restent indispensables pour valider et optimiser de nouvelles thérapies pour leur utilisation en toute sécurité chez l'Homme.
Réduction
Les mesures de réduction s'intégrant à la règle des 3Rs vont consister à utiliser le plus petit nombre d’animaux possible pour chaque étude permettant d'obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte et d’éviter ainsi une répétition inutile des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif (Implant sans ilots ou Placébo) et éventuellement à un contrôle positif et négatif (implantation d’ilots par voie intra-portale : ilot allogénique et ilot syngénique) si cela s'avère pertinent. Quand le protocole d'étude le permet, un groupe traité est utilisé comme son propre contrôle permettant ainsi d’utiliser un nombre d’animaux réduit. Les données de la littérature indiquent qu’un effectif de 8 animaux (rats et souris) en standard par groupe (nombre de groupes variables, selon l’objectif de l’étude) est généralement nécessaire pour atteindre une sensibilité correcte du test. L’analyse statistique prévue repose sur des tests paramétriques. Par ailleurs, des prélèvements terminaux peuvent être ajoutés en fin de procédure pour éviter une répétition inutile de l'étude.
Raffinement
Les mesures de raffinement s'intégrant à la régle des 3Rs vont consister en un suivi des points limites clairement définis et spécifiques à la procédure, permettant de stopper l'étude et/ou d'euthanasier, de façon précoce, tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont suivis par le vétérinaire et manipulés fréquemment par des techniciens préalablement formés et attentifs, prêts à agir lorsque les critères d'interruption prédéfinis sont atteints. Par ailleurs, et au quotidien, un enrichissement complet est fourni aux animaux, celui-ci inclut dans leur hébergement : litière, objets de nidification, objets à ronger, présence de congénères (sauf cas contraire imposé par la procédure). Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De la même manière, les chirurgies sont raffinées au maximum, par la mise à disposition d’oxygène ou air ambiant à concentration ajustable, de tapis chauffants et/ou de lampes chauffantes et de soins pré/post-opératoires complets.
Choix des espèces
L’impact de substances pharmacologiques sur le métabolisme de rongeurs (rats, souris), est prédictif de leur efficacité et/ou sécurité en clinique. En effet, le rongeur s'est avéré être un modèle fiable pour découvrir et valider de nouveaux traitements du Diabète, il présente une physiologie proche de celle de l'Homme. Les études sont principalement menées sur des jeunes rongeurs sains dont l'âge est compris entre minimum 4 semaines (correspond à la fin du sevrage des animaux) et maximum 20 semaines (correspond à l'apparition du processus de sénescence). Par ailleurs les rongeurs soumis à la procédure d'induction du diabète par injection de streptozotocine seront agés au maximum de 12 semaines en début de traitement et ce afin d'éviter le risque de mortalité.
Contrôle qualité des médicaments radiopharmaceutiques marqués au Tc99m sur rongeurs en conformité des méthodes de la Pharmacopée EU.
- Tests réglementaires
- Contrôles de qualité
Rats : 1275
1 680 rongeurs, souris et rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil pour 1 275 d'entre eux et impliquant un niveau de souffrance léger pour 405. Anesthésiés, ils reçoivent l'injection d'un médicament radiopharmaceutique puis sont tués pour le prélèvement de leurs organes, afin de contrôler la biodistribution de chaque lot avant sa commercialisation. Le porteur indique que ce contrôle qualité est exigé par les pharmacopées européenne et américaine. Il signale qu'une évolution réglementaire a déjà permis d'arrêter la biodistribution sur 30 lots par an, sans étendre ce remplacement aux autres.
Objectifs
Ce projet a pour objet de permettre au laboratoire pharmaceutique de continuer à pouvoir contrôler des médicaments radiopharmaceutiques dans le respect des AMM (Autorisation de Mise sur le Marché) octroyées par les autorités de santé de tous les pays concernés (notamment la FDA « Food and Drug Administration ») et des méthodes de la Pharmacopée Européenne. Pour cela le laboratoire pharmaceutique a besoin de pouvoir réaliser des tests de distribution physiologique appelés « tests de biodistribution » in vivo sur des rongeurs, afin de valider l’efficacité de chaque lot de médicament radiopharmaceutique concerné avant son administration humaine.
Bénéfices attendus
La mise sur le marché des médicaments marqués, à usage thérapeutique et diagnostique pour l'homme, exige des essais d'efficacité : la distribution physiologique du produit sur rongeurs. Le recours à des rongeurs dans le cadre de contrôle qualité de médicaments radiomarqués est préférable à d'autres espèces car ces animaux permettent de fournir des résultats pertinents en utilisant la voie d'administration identique à celle de l'homme lors de diagnostic par scintigraphie.
Procédures
Dans le cadre du contrôle qualité du médicament radioactif à réaliser avant mise sur le marché, le test d'efficacité du produit sur 3 rats de faible poids se fait sous anesthésie générale par un mélange d'anesthésie/analgésique chimique avant injection du produit. Le volume à injecter est fonction du poids du rat. L'acte d'injection de ce mélange de faible volume dure quelques secondes. Une fois l'animal anesthésié, au remps indiqué dans la procédure, le technicien injecte le produit radioactif de faible volume à la seringue en quelques secondes. La voie d'injection avec un médicament marqué à usage diagnostic ou thérapeutique est la voie utilisée chez l'homme. Après un temps déterminé dans la procdure, le technicien s'assure que les animanux soient toujours anesthésiés avant de mourir, avant d'effectuer les gestes chirurgicaux nécessaires au test. L'euthanasie des animaux s'accompagne d'un prélèvement de sang au niveau de l'aorte abdominale. Elle est suivie des prélèvements d'organes cités dans la procédure de contrôle en vigueur. Concernant le test d'efficacité du produit radioactif chez les 3 souris, celles-ci sont soit anesthésiées par un mélange d'anesthésie/analgésique chimique avant injection du produit, soit elles sont injectées vigiles selon la procédure de contrôle en vigueur. Une fois l'animal anesthésié, au temps indiqué dans la procédure, le technicien injecte le produit radioactif de faible volume à la seringue en quelques secondes. Dans le cas des souris anesthésiées avant injection du produit radioactif, la pratique d'euthénasie appliquée est la dislocation cervicale avant d'effectuer les gestes chirurgicaux nécessaires au test. Elle est suivie des prélèvements d'organes cités dans la procédure de contrôle en vigueur. Dans le cas de souris vigiles, l'injection du produit radioactif d'un faible volume à la seringue se fait en quelques secondes. Après un temps déterminé dans la procédure, elles sont anesthésiées par un mélange d'anesthésie/analgésique chimique en tenant compte du poids de l'animal. Le technicien s'assure que l'animal est correctement anesthésié (immobilité, myorelaxation, pas de retrait lors du pincement de la patte) avant d'effectuer les gestes chirurgicaux nécessaires au test. L'euthanasie s'effectue par section de la carotide. Elle est suivie des prélèvements d'organes cités dans la procédure de contrôle en vigueur.
Impact sur les animaux
Nous pourrions attendre des effets indésirables si les molécules étaient défectueuses. C’est le but de notre test : identifier la qualité, ou les défauts de nos molécules radiomarquées. Si elles ne sont pas marquées correctement, elles sont rarement toxiques. Si une contamination quelconque était intervenue pendant la fabrication, les animaux pourraient subir des effets indésirables, comme un choc anaphylactique, mais ils sont anesthésiés et des mesures seraient rapidement prises pour prendre en charge cette situation.
Devenir
Les animaux sont mis à mort en fin de manipulation du fait de la manipulation de biodistribution consistant aux prélèvements d’organes.
Remplacement
Les autorisations de mise sur le marché et la Pharmacopée Européenne exigent des contrôles de qualité in vivo sur les médicaments radiopharmaceutiques avant leur administration à l'homme. Les médicaments sont fabriqués selon leur AMM (Autorisation de Mise sur le Marché) et sont soumis à des tests impératifs de contrôle qualité et libératoires avant commercialisation, dont la biodistribution fait partie. Ce test est appliqué selon les méthodes décrites dans la pharmacopée européenne et américaine et/ou du dossier d'Autorisation de Mise sur le Marché. Les méthodes physico-chimiques commencent à être prises en compte selon les produits par les autorités comme il est indiqué dans le paragraphe Réduction. 1) Les obligations réglementaires (pharmacopée européenne/américaine) évoluent et permettent l'arrêt des tests de biodistribution pour certaines spécialités pharmaceutiques. Nous profitons de cette opportunité pour cesser tout test de biodistribution sur la spécialité concernée. 2) Des démarches sont entreprises pour demander une variation du dossier d'AMM (Autorisation de Mise sur le Marché) ; celle-ci consiste à supprimer le test de biodistribution en s'appuyant sur la corrélation existante entre les résultats obtenus via le test de biodistribution et les tests physico-chimiques réalisés en parallèle. 3) Décision stratégique d'arrêt de certains produits pour lesquels la biodistribution était requise. 4) Lors de la formation pratique d'un nouveau technicien, l'utilisation du "rat trainer" s'est substituée à l'utlisation d'animaux pour apprendre les injections.
Réduction
Une étude de marché a induit l’arrêt de 2 produits. Une variation réglementaire du dossier d’AMM (Autorisation de Mise sur le Marché) de 2 autres produits a été acceptée par l'Agence du médicament, en s'appuyant sur les tests physico-chimiques. Cela implique l'arrêt de la biosdistribution sur 30 lots/an sur les 120 lots testés à ce jour.
Raffinement
Une amélioration continue de nos locaux permet d’accroitre la prise en compte des besoins des animaux au cours de procédures. Dès que les animaux sont anesthésiés, tout est mis en œuvre pour les maintenir au chaud et éviter toute perturbation. Tous les transports entre les lieux de vie des animaux et les laboratoires sont encadrés de précautions. Un tapis chauffant, par exemple, est placé au fond de la cage pendant l’attente, puis pendant le réveil. Un personnel expérimenté et formé manipule les animaux avec précautions. Nos procédures sont de courte durée et ne sont pas douloureuses.
Choix des espèces
La mise sur le marché de produits de contraste radioactifs exige des essais d'efficacité : la biodistribution sur rongeurs (rats ou souris) comme l'imposent les autorités européennes et américaines à l'industrie pharmaceutique qui produit ces marqeurs. Les tests réalisés par groupe de 3 rongeurs adultes permettent de valider l'innocuité et l'efficacité des marqueurs utilisés chez l'homme en utilisant la même voie d'administration, afin de fournir des résultats pertinents.
Administration intracérébrale de candidats médicaments, collectes de sang répétées et analyse comportementale chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Rats : 450
4 050 rongeurs, souris et rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 450 d'entre eux et sévère pour 3 600. Ils subissent une chirurgie stéréotaxique avec perçage du crâne pour une administration intracérébrale, puis jusqu'à huit prélèvements de sang en 24 à 48 heures, pour caractériser la pharmacocinétique de candidats médicaments pour le compte de clients. Le porteur reconnaît des douleurs post-opératoires de 24 à 48 heures et un risque lié au geste sur des molécules innovantes peu connues. Il affirme que l'évaluation in vivo reste "incontournable" et que la tolérabilité comportementale ne peut pas s'étudier in vitro.
Objectifs
Au cours du développement préclinique, de nombreuses études sont effectuées afin d’évaluer l’efficacité et l’innocuité des candidats médicaments (i.e., nouveaux composés ayant un potentiel thérapeutique). Les études pharmacocinétiques, qui sont menées en parallèle, permettent d’étudier le devenir du composé dans un organisme vivant. Classiquement, il s’agit de caractériser son absorption, sa distribution dans l’organisme, son métabolisme (c’est-à-dire comment l’organisme procède à sa transformation) et enfin son élimination. Les données collectées dans le cadre de ces études permettent notamment d’affiner les doses et par conséquent de contribuer à la détermination de fenêtres/marges thérapeutiques, qui matérialisent la zone de concentrations permettant d’observer une efficacité tout en limitant la survenue d’effets secondaires/toxiques. De plus, l’efficacité d’un composé est également dépendant de sa voie d’administration. Dans le cadre de pathologies touchant le système nerveux central (SNC), une des voies d’administration pouvant être la plus efficace est l’injection intracérébrale (ICB). Cette voie d’administration permet de contourner la barrière hémato-encéphalique (BHE) qui limite voire empêche le passage de certaines molécules provenant de la circulation sanguine. De plus, cette voie d’administration permet d’agir directement sur le tissu cérébral donc de focaliser de manière plus précise la biodistribution du composé dans la zone à traiter. In fine, cela permettrait de réduire la dose à injecter et donc de possiblement limiter les effets secondaires/toxiques potentiels. Cependant, il n’est pas impossible que certaines molécules injectées en ICB traversent la BHE et se retrouvent dans la circulation sanguine. Ainsi, en tant que prestataire de services pour l’industrie pharmaceutique, nous proposons à nos clients de réaliser la phase expérimentale de leurs études pharmacocinétiques. Ce projet a donc pour objectif de fournir à nos clients des échantillons de sang et/ou de tissus prélevés chez le rongeur (rat ou souris) dont l’analyse permettra de connaître les variations de concentration plasmatique (au cours du temps et/ ou en terminal) et/ou tissulaires (en terminal) des candidats médicaments après une administration unique. La tolérabilité de ces composés, injectés par voie ICB, pourra également être objectivée au cours du temps à partir d’une analyse comportementale basée sur une grille d’observation fonctionnelle (FOB test) de l’animal.
Bénéfices attendus
Les échantillons de sang et d’organes collectés seront traités et analysés par nos clients afin d’établir le profil pharmacocinétique de leur candidat médicament. En parallèle, l’analyse comportementale permettra de compléter les analyses tissulaires en évaluant les répercussions fonctionnelles du candidat médicament (FOB test) sur les animaux et ainsi d’en juger la tolérabilité afin d’affiner la dose optimale avec des effets secondaires maitrisés.
Procédures
Les animaux seront soumis à une administration de composé unique par voie intracérébrale sous anesthésie gazeuse dont la durée est variable allant de 30min à 1h30. Des prélèvements répétés de sang seront réalisés soit sur animal vigile, à la veine de la queue ou submandibulaire (souris uniquement) (durée : 5min), soit sur animal anesthésié par ponction directe de la veine jugulaire (durée : 10min). Ces prélèvements seront réalisés le plus souvent pendant les 24 à 48h suivant l’administration avec un maximum de 8 prélèvements sur cette période, mais ils pourront également être étalés sur plusieurs semaines (1 à 2 prélèvements par semaine maximum). Certains prélèvements pourront être réalisés en terminal par ponction intracardiaque pour les prélèvements sanguins sur animal anesthésié. Les souris de plus de 2 mois seront isolées pour tous le protocole dont la durée dépendra des objectif du client (de 7 jours à plusieurs semaines).
Impact sur les animaux
-Un des effets indésirables potentiel est lié à l'administration du candidat médicament. Le personnel est formé et entrainé à l’administration intracérébrale pour réduire tout risque. Cependant, un problème lors du geste technique ou un effet secondaire du composé testé peut-être observé surtout pour les nouvelles molécules innovantes avec peu de recul. -Les animaux seront soumis à une administration intracérébrale sur un ou plusieurs sites nécessitant une chirurgie réalisée sur un cadre stéréotaxique et sous anesthésie gazeuse pour disséquer les tissus cutanés et pour percer l'os crânien. Cette étape peut engendrer des douleurs durant les 24-48h suivant la chirurgie. La peau du crâne sera ensuite suturée ce qui peut provoquer des démangeaisons lors de la cicatrisation et un risque de retrait du point par l'animal. Des prélèvements de sang seront réalisés sur animal vigile soumis à une contention, impliquant parfois des ponctions directes dans les vaisseaux à l’aide d’une aiguille ou d’une lancette pouvant être à l’origine 1) d’une douleur, 2) de stress et 3) d’un écoulement sanguin persistant. Ces prélèvements pourront nécessiter également d’anesthésier les animaux et ce de façon répétée. Dans le cadre de prélèvements multiples, au maximum, 8 prélèvements pourront être réalisés sur 48h, ou encore 2 prélèvements maximum par semaine pendant plusieurs semaines. Lorsque des volumes importants seront nécessaires, le prélèvement pourra être effectué en intracardiaque de façon terminale, sous anesthésie. En cas de prélèvement du cerveau, les animaux subiront une thoracotomie précédent une perfusion intracardiaque sous anesthésie chimique et analgésie morphinique. Afin de limiter tout risque de bagarre (rapport dominant/dominé) et donc de blessures, les souris dont l’âge est au-dessus de 2 mois seront isolées ce qui est également une source importante d'anxiété.
Devenir
Les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de collecter du sang et/ou des organes.
Remplacement
Si des méthodes d’extrapolation in vitro-in vivo sont de plus en plus utilisées, comme la modélisation pharmacocinétique à fondement physiologique, ces approches présentent malgré tout encore certaines limites, notamment la difficulté à paramétrer certains processus mis en jeu en particulier pour les phases d’absorption et d’excrétion. Ces approches ne constituent qu’une aide à la caractérisation des interactions pharmacocinétiques, et l’évaluation in vivo du devenir d’un composé dans un organisme vivant reste incontournable. De même, il n’est pas possible d’évaluer la tolérabilité des composés sur la réponse comportementale fonctionnelle sur des modèles in vitro.
Réduction
Toutes les mesures seront prises pour limiter le nombre d’animaux utilisés dans ce projet tout en prenant en compte les besoins de nos clients (volumes de sang, nombre de points de prélèvements et de doses à tester nécessaires). Chaque animal pourra être son propre contrôle, et le recours à des prélèvements répétés au cours du temps sur le même animal permet également de limiter le N total par étude.
Raffinement
L’ensemble des expérimentations seront effectuées par un personnel compétent et entraîné. L’état clinique des animaux sera suivi quotidiennement grâce à une grille de score. Des points limites précis et spécifiques à chaque procédure sont également établis afin de s’assurer que toute douleur/souffrance éventuelle des animaux pourra être détectée et prise en charge rapidement. Les actes pouvant générer de la douleur seront réalisés sous anesthésie et/ou analgésie. Les animaux seront également habitués à la manipulation et à la contention pour diminuer le stress lié à ces procédures. Les prélèvements sanguins ainsi que les doses et volumes d’injection des anesthésiques chimiques (i.p), analgésiques (s.c) et de sérum physiologique (NaCl 0,9%) seront réalisés selon les recommandations éthiques pour chaque espèce. Après chaque prélèvement, une injection de NaCl 0,9% sera réalisée (volume équivalent injecté directement dans la voie veineuse ou 3 fois le volume prélevé injecté en sous cutané) afin de compenser la perte de volémie. Les chirurgies ICB seront sous anesthésie et analgésie et les animaux bénéficieront d’une surveillance accrue (minimum 2 fois par jour sur 48h) en phase post-opératoire. De la nourriture et/ou des gels enrichis seront déposés dans la cage afin de limiter la perte de poids des animaux après la chirurgie. Par ailleurs, l'eau et la nourriture seront fournis ad libitum et les animaux bénificiront d'un environnement enrichi. Les animaux hébergés (souris) individuellement disposeront d’un environnement avec plusieurs type d'enrichissements (petite maison et plusieurs matériaux pour la réalisation de leur nid). Ces dernières seront également disposées dans des cages transparentes et placées les unes à côté des autres pour qu'elles puissent se sentir et s'observer. La manipulation des animaux au cours du FOB test peut être une source d'anxiété. De plus, afin de limiter tout risque de bagarre (rapport dominant/dominé) et donc de blessures, les souris dont l’âge est au-dessus de 2 mois seront isolées ce qui est également une source importante d'anxiété.
Choix des espèces
Ces études de pharmacocinétique vont permettre de déterminer les doses qui seront ensuite utilisées pour les études d’efficacité et de pharmacologie de sécurité chez le rongeur, ce qui justifie le choix des espèces retenues pour ce projet. Le choix entre souris et rat sera ensuite conditionné notamment par l’historique des études déjà réalisées par nos clients, le choix du modèle de pathologie envisagé par la suite, et les volumes de sang requis pour les bioanalyses. Les animaux utilisés dans le cadre de ces études sont : - Des rats de tous âges soit environ 150 à 600g - Des souris de tous âges soit environ 20 à 40g Les études seront effectuées sur des animaux en post-sevrage dont l’âge des animaux dépendra du protocole à réaliser, des objectifs de l’étude et des candidats médicaments à tester.
Mécanismes neuropathogéniques des infections congénitales par le cytomégalovirus
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
360 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, 320 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 40 modéré. Des femelles gestantes subissent une laparotomie pour injecter le cytomégalovirus dans le cerveau de leurs embryons, puis les ratons sont soumis au test du réflexe de retournement et au test d'éloignement du vide et suivis pour des crises d'épilepsie. Le porteur indique que 60 à 80 % des ratons infectés présentent une hyperextension des membres et que 25 à 40 % font des crises généralisées, les petits étant tués au plus tard au dix-septième jour. Il affirme que ces mécanismes ne peuvent être modélisés ni in vitro, y compris sur cérébroïdes, ni in silico.
Objectifs
L'objectif principal de ce projet est d'explorer si une voie moléculaire connue pour être impliquée dans des processus inflammatoires, influence dans le cerveau en cours de développement, l'apparition et la sévérité de différents types de problèmes post-nataux, notamment neurologiques, constatés préalablement, ou anticipés, après infection du cerveau en développement par le cytomégalovirus (CMV). Outre une meilleure connaissance des évènements influençant les troubles neurologiques causés par ces infections congénitales dans l'espèce humaine, notre étude ouvrirait la voie vers de potentielles applications, cette voie moléculaire pouvant être modulée par de nombreuses molécules déjà existantes ou par d'autres stratégies thérapeutiques adaptées au ciblage de cette voie dans certains types de cellules cérébrales.
Bénéfices attendus
Les infections congénitales par le cytomégalovirus sont fréquentes (0.7 à 1% des naissances) et représentent une cause majeure de pathologie neuro-développementale, avec des conséquences médicales sévères et un impact socio-économique important. Cependant, les mécanismes restent mal compris et peu abordés. Les difficultés à générer un vaccin efficace et l'absence de traitement satisfaisant rendent nécessaires l'identification et l'exploration de nouvelles pistes mécanistiques. De ce point de vue, notre projet, en proposant l'implication de mécanismes inflammatoires dans la neuropathogénèse de ces infections, doit apporter des informations importantes pour la compréhension de la pathologie, tout en ouvrant la possibilité de cibler une voie moléculaire bien connue et pour laquelle de nombreuses molécules et stratégies d'intervention existent, sont améliorables et adaptables, ou peuvent être envisagées. Ainsi, la disponibilité d'un modèle récapitulant certains aspects-clés de la pathologie humaine et sa complexité, permettra à terme, à travers la compréhension de certains mécanismes-clés, d'obtenir des preuves de faisabilité pour la mise au point de telles stratégies d'intervention.
Procédures
Des femelles gestantes au 15ème jour de gestation subissent une chirurgie sous anesthésie générale, afin d’accéder aux embryons. Dépendant du nombre d’embryons à injecter, la durée de la chirurgie varie entre 30 et 45 minutes. Ceci nous permet de réaliser des injections intracérébroventriculaires de CMV directement dans le cerveau des embryons. Une seule injection par embryons est réalisée. A la fin de la procédure d’injection, les cornes utérines sont replacées dans la cavité abdominale de la femelle gestante puis réhydratées à l’aide d’une solution saline tempérée à 38°C. Le muscle et la peau sont suturés. La cage est placée sur un tapis chauffant. Le réveil des animaux, comme leur récupération post-opératoire, font l’objet d’un suivi attentif. Après l’intervention, les embryons poursuivent leur développement. En général, la cicatrisation de la femelle gestante est bonne, et la mise-bas se produit au stade attendu. Après la chirurgie, les rates gestantes font l'objet d'un suivi régulier et attentif, elles sont examinées quotidiennement pour guetter l'apparition éventuelle de signes et paramètres cliniques, comportementaux ou biologiques (les animaux font l’objet d’un suivi journalier reporté dans un registre, y compris les weekends et jours fériés). Au premier jour postnatal, les ratons d’une même portée sont déposés dans une cage placée sur un tapis chauffant. Chaque raton est identifié par un tatouage au niveau des pates avant et/ou arrière, et une biopsie (1 à 2 mm du bout de la queue) est prélevée pour identifier leur génotype. Les ratons sont l’objet d’un suivi attentif quotidien au cours des deux premières semaines de vie postnatale, ce qui nous permet d’évaluer leur état général (croissance pondérale, posture), le développement du système sensorimoteur (test du réflexe de retournement lorsque l’animal est placé sur le dos, réalisé dès le 1er jour postnatal, test du réflexe d’éloignement du vide lorsque la tête de l’animal est dans le vide, l’animal étant posé sur une plateforme élevée d’environ 8 cm, réalisé dès le 4eme jour postnatal), et la survenue de crises généralisées d’épilepsie. Chaque animal effectuera donc ces sessions de tests quotidiennement, d’une durée maximale de 2 à 3 minutes, après quoi il sera déposé délicatement dans le nid avec sa maman.
Impact sur les animaux
Les femelles gestantes subissent une laparotomie sous anesthésie générale pour accéder aux cornes utérines et réaliser des injections intracérébroventriculaires de CMV ou de solution contrôle dans le cerveau des embryons. L'anesthésie des femelles gestantes peut engendrer des dépressions respiratoires, une hypothermie, une déshydratation. La chirurgie elle-même peut engendrer en post-opératoire sur des temps courts (1 à 3 jours maximum) de rares et faibles hémorragies vaginales, des avortements partiels, des douleurs abdominales, une diminution de la mobilité / inactivité, une perte de poids, une inflammation des sutures. Les femelles gestantes sont isolées lors de la période post-opératoire jusqu'à la mise bas. Leur bien-être après chirurgie est évalué quotidiennement par mesure de paramètres cliniques, comportementaux ou biologiques (voir la fiche de suivi post-opératoire en annexes). La majorité des femelles gestantes (>97%) récupèrent très bien après la chirurgie et la gestation se poursuit normalement jusqu’à la mise bas. Concernant les animaux infectés in utero par le CMV, nous avons déjà établi dans notre modèle que cette infection cérébrale provoque un ensemble de phénotypes observables à partir de 4-5 jours après la naissance. Le suivi quotidien des ratons au cours des deux premières semaines de vie postnatale a mis en évidence la survenue d'hyperextension des membres inférieurs (ce symptôme a été observé à partir de P5 (5ème jour de vie postnatale) dans 60-80% des ratons infectés), la survenue de crises d'épilepsie (des crises d'épilepsie généralisées tonico-cloniques déclenchées par la manipulation ont été observées à partir de P7 jusque vers P15 dans 25-40% des ratons infectés), un défaut de développement de réflexes sensorimoteurs évalués par le test d'éloignement du vide (cliff aversion test) et le test de retournement (rigthing reflex) (la plupart des ratons infectés échouent à réaliser ces tests, ou les réalisent avec un certain délai, à partir de P4-P5).
Devenir
Les femelles gestantes récupèrent en général bien après la chirurgie, et le développement embryonnaire se poursuit normalement jusqu’à la mise bas. Dans cette situation, les nouveaux-nés, qui feront l’objet d’un suivi quotidien pendant les 2 premières semaines postnatales, sont laissés avec leur mère. A l’issue de cettre période, les mères sont mises à mort. Les femelles ne sont en aucun cas réutilisées pour d’autres expériences, ou pour le maintien de la colonie (les cornes utérines et les muscles abdominaux ayant déjà fait l’objet d’une manipulation et d’une chirurgie), ce qui évite tout trauma supplémentaire. Tous les ratons utilisés pour évaluer les conséquences cliniques de l’infection au CMV sont mis à mort à l’issue des sessions de tests permettant d’évaluer les phénotypes postnataux in vivo et in vitro, soit au plus tard à P17. Nous n’envisageons pas dans le présent projet de réaliser des tests à plus long terme chez des animaux adultes, bien que cela soit techniquement possible.
Remplacement
Les mécanismes neurophysiopathologiques des infections congénitales par le CMV reposent de manière inhérente sur des interactions développementales multiples, entre la dynamique de l'infection virale elle-même, celle des réseaux neuronaux, et celle du système immunitaire cérébral (microglies, infiltrations par des cellules périphériques). Il est évident que certains de ces évènements, ainsi que leur complexité, et leurs relations réciproques, et évidemment leurs conséquences phénotypiques comportementales, ne peuvent être modélisés in vitro, y compris en utilisant des cérébroïdes, et encore moins in silico. Lorsque cela était possible, nous avons décidé de réaliser une partie de nos expériences d'enregistrements des activités épileptiques in vitro, sur des tranches aigues de cerveau, afin de réduire l’expérimentation sur l’animal vivant.
Réduction
Nous avons basé le nombre minimal d'animaux nécessaires sur la base de nos résultats antérieurs obtenus sur des portées sauvages (non mutées), et sur des calculs classiques de puissance statistique pour les tests les plus prévisibles. Nous optimisons la réduction des animaux utilisés de plusieurs manières : - chaque gestation et tous les embryons injectés in utero sont utilisés : ainsi, les croisements hétérozygotes utilisés génèrent les trois génotypes à comparer, ce qui homogénéise les résultats en diminuant les risques de biais de portées, diminuant ainsi la variabilité des résultats et donc le nombre d'animaux à utiliser pour atteindre une significativité statistique. - par ailleurs, un même animal est utilisé pour l'ensemble des tests (un animal passe tous les tests de la période néonatale, puis est utilisé pour les enregistrements in vitro à partir de P14 ; ceci a de plus l'avantage de permettre d'établir d'éventuelles corrélations entre plusieurs anomalies chez les mêmes animaux.
Raffinement
Le bien-être des animaux est évalué quotidiennement chez les femelles gestantes et chez les ratons nés après infection au CMV par des mesures de paramètres cliniques, comportementaux ou biologiques adaptés, y compris les weekends et jours fériés. Le tout est enregistré dans un registre. Tous les détails sont donnés en annexes (fiche de suivi post-opératoire pour les femelles gestantes, qui permet d'établir un score, et fiche de suivi des cohortes de ratons injectés au CMV) Chaque rate gestante et sa portée est hébergée dans une cage, avec nourriture et eau à volonté. L’environnement est enrichi avec des matériaux souples (rouleaux de papier foisonnant, litière en carrés de cellulose vierge) permettant la confection d’un nid et avec un tunnel en carton. Les femelles gestantes subissent une intervention chirurgicale, qui est réalisée sous anesthésie générale, sur un tapis chauffant. Le rythme respiratoire des animaux est surveillé en permanence, et une injection intra-péritonéale de sérum physiologique est réalisée en fin d’intervention. Après leur réveil, les femelles sont placées sur un tapis chauffant pendant au moins 30 minutes. Un suivi post-chirurgical est réalisé (voir fiche de suivi en annexe permettant d'établir un score post-opératoire) en particulier une surveillance de la cicatrisation (nettoyage de la plaie et nouvelles sutures si détérioration), de l’absence d'hémorragie vaginale, de la mise bas (euthanasie si retard de la mise bas supérieur à 1 jour), de la perte de poids (euthanasie si > à 20%), de l'hypothermie (froid au touché), des signes de douleur (prostration, agressivité, absence de réaction aux stimuli). En fonction du score obtenu, une injection d'analgésique ou d’anti-inflammatoire peut être pratiquée. Un suivi des ratons infectés avec le CMV est également réalisé (voir fiche de suivi des ratons injectés au CMV en annexe), avec notamment une surveillance quotidienne de leur état général et de leur prise de poids, et l’observation des phénotypes caractéristiques de notre modèle (échec aux tests de développement sensori-moteurs, hyperextension des membres inférieurs, crises généralisées tonico-cloniques).
Choix des espèces
Les animaux que nous utilisons, en l'occurrence les rats, sont des rongeurs de petite taille et d’élevage facile, avec une gestation d'une durée adaptée aux exigences des travaux de recherche. Ils possèdent un système nerveux central dont le développement présente de nombreuses similitudes avec celui du système nerveux humain, et dont l’organisation, certes simplifiée, est cependant suffisamment complexe pour être représentative. D'une manière générale, ils constituent des modèles de choix pour l’étude des mécanismes pathologiques du développement cérébral. Le rat est particulièrement adapté à des études électrophysiologiques, cognitives et comportementales. Dans le projet présenté ici, le choix de l'espèce est aussi orienté par l'utilisation d'une souche de cytomégalovirus de rat recombinante, car les cytomégalovirus, y compris ceux de rat, sont spécifiques d'espèce. Les rates gestantes seront âgées d'environ 10 semaines à 6 mois. Les infections in utero seront réalisées à E15, donc au début du dernier tiers de gestation, ce stade d'infection tenant compte de l'état de développement cérébral et des microglies notamment, d'impératifs méthodologiques (chirurgie des cornes, injection des ventricules cérébraux embryonnaires), et conduisant à reproduire les conséquences neurologiques postnatales rappelant la pathologie humaine modélisée ici. L'étude quotidienne des phénotypes post-nataux sera réalisée entre P1 et P14 (sur animaux non sevrés, donc), compte tenu de nos observations préalables. Pour l'étude des activités épileptiformes in vitro, des tranches de neocortex seront prélevées autour de P15 (entre P14 et P17), période classique où le cerveau immature, correspondant à la période néonatale chez l'homme, présente une plus forte susceptibilité aux activités épileptiques.
Modèles expérimentaux d’allergie oculaire
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles sensoriels
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Rats : 1800
Cochons d'Inde : 900
6 900 animaux non-humains, 4 200 souris, 1 800 rats et 900 cobayes, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont sensibilisés à l'ovalbumine et au pollen d'ambroisie, puis reçoivent des gouttes oculaires et des injections répétées, pour tester des substances contre la conjonctivite allergique. Le porteur indique que le nouveau contact avec l'allergène provoque un gonflement de la conjonctive, une hyperémie et un larmoiement, et que des nodules peuvent apparaître au site d'immunisation. Il affirme qu'aucune méthode ne reproduit l'œil dans sa globalité et conclut à la nécessité de recourir à ces animaux.
Objectifs
Comme l’allergie respiratoire, l’allergie oculaire est associée à une hypersensibilité allergique de type immédiat. Elle concerne essentiellement les conjonctivites allergiques bégnines c’est-à-dire la conjonctivite allergique saisonnière et la conjonctivite allergique péri-annuelle. Cette hypersensibilité concerne aussi pour partie les conjonctivites sévères compliquées de kératite comme la kératite conjonctivale vernale et la kératite conjonctivale atopique. Les allergènes responsables sont des pneumallergènes, aussi responsables de symptômes respiratoires, tels que les acariens ou les pollens ainsi que des trophallergènes comme l’arachide ou le blanc d’œuf. Ce projet a pour but de contribuer au développement de nouveaux traitements médicaux en permettant d’identifier et de tester l’efficacité de substances thérapeutiques visant à diminuer l’effet des allergènes dans la conjonctivite allergique. Dans ce cadre, nous proposons de mettre en place un protocole de sensibilisation à deux antigènes (l’ovalbumine et le pollen d’ambroisie) chez la souris, le rat ou le cobaye. Dans un second temps, nous testerons différents types de traitements.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu du projet est de proposer des modèles expérimentaux qui permettront d'évaluer l'efficacité de nouveaux traitements. La recherche de traitements est en constante évolution et nécessite de pouvoir les tester dans les meilleures conditions possibles et dans le plus grand respect du bien-être animal.
Procédures
Les procédures expérimentales nécessitent l'administration de différents produits par instillations (gouttes oculaires), par voie sous cutanée, intramusculaire ou intrapéritonéale (anesthésies). Ces procédures ne durent que quelques secondes. Les examens ophtalmologiques se feront à l'aide de techniques non invasives (imagerie, observations au biomicroscope). Ces examens sont réalisés chez l’homme en cabinet médical par un ophtalmologiste sans anesthésie et sans hospitalisation. Ils le sont également chez l’animal en clinique vétérinaire. Ces examens pourront se faire pour une partie sur animaux vigiles mais certains qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie légère, ce type d'examen ne dure que quelques minutes. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif ou tout autre marqueur d'intérêt. Ces prélèvements de sang se feront par ponction et dureront moins d'une minute.
Impact sur les animaux
Après un nouveau contact entre l'allergène et l'organisme « sensibilisé » par une précédente exposition, les nuisances attendues se manifesteront au niveau local par un gonflement de la conjonctive accompagné d'une hyperémie et d'un larmoiement. Au niveau du site d'immunisation, une réaction inflammatoire avec potentiellement la présence de nodules sous-cutanés peut être observée. L'administration des produits devrait engendrer tout au plus une gêne transitoire de courte durée.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour permettre des réalisés les évaluations ex vivo (évaluations histologiques, dosages...).
Remplacement
L’œil est un organe complexe. Il est composé de plusieurs tissus anatomiquement et physiologiquement très différents. Il est de plus soumis à d'importantes variations environnementales mécaniques et physicochimiques, ainsi qu'à d’importantes interactions biologiques avec les tissus et organes voisins. A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer l’œil dans sa globalité fonctionnelle et environnementale. C'est pour cela que l’utilisation d’animaux vivants dans ces procédures expérimentales sont nécessaires pour atteindre les objectifs de ce projet.
Réduction
Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et historiques de l'établissement, du nombre d'études estimées et tient compte des variations du métabolisme, de la robustesse des mesures et de notre expérience. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à chaque moment à l'aide de tests statistiques. Un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. De plus, dès que les procédures expérimentales le permettront, des évaluations non invasives seront choisies tout au long du projet pour améliorer la condition animale et éviter la mise à mort inutile des animaux. De même, l'analyse des deux yeux sera privilégiée autant que possible afin de réduire le nombre d'animaux utilisé.
Raffinement
Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les rongeurs seront placés en groupe dans des cages d’hébergement contenant nourriture et boisson ad libitum et enrichissement à ronger. Si la procédure expérimentale le permet un abri sera ajouté. Les examens non invasifs choisis pour évaluer les signes cliniques de la maladie sont semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet ophtalmologique ou chez l’animal en cabinet vétérinaire. Les examens de l'œil qui requièrent l’immobilité de l'animal pourront être réalisés pour son confort sous anesthésie légère. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum. Ce projet a été soumis pour évaluation à un comité d’éthique et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l'établissement.
Choix des espèces
Les espèces animales choisies ont une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée. De plus, les modèles expérimentaux concernant cette pathologie sont largement utilisés et décrits sur ces espèces dont les publications de référence sur laquelle le projet est basé. Pour ce projet, des souris, des rats et des cobayes ont été retenus pour tenir compte des particularités anatomiques et physiologiques de chaque espèce afin d’augmenter les chances de mener ce projet à terme. Les rongeurs ont minimum 6 semaines au début de l’étude, les cobayes 8 semaines. Ce qui correspond à de jeunes adultes ayant atteint leur maturité de développement oculaire comme il convient au modèle.
Rôle des autoinducteurs, molécules impliquées dans le Quorum sensing, dans l’assemblage néonatal du microbiote intestinal chez le raton
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
224 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Des mères reçoivent un antibiotique dans l'eau de boisson et leurs ratons subissent des gavages quotidiens entre le vingt-deuxième et le trente-cinquième jour de vie, avant mise à mort pour accéder au contenu de leur gros intestin. Le porteur indique que les mères ne peuvent être réutilisées et sont tuées après le sevrage, et prévoit d'utiliser les portées surnuméraires pour une étude annexe sur l'appétence au lait de soja. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne rend compte de la colonisation du tube digestif.
Objectifs
Il est établi que, chez l’adulte, le microbiote intestinal interagit, de façon variable selon sa composition, avec la santé de l’hôte. Les données récentes suggèrent que ceci serait également vrai en période néonatale avec d’éventuelles répercussions sur le risque de maladie tout au long de la vie. Comprendre les mécanismes qui contrôlent la composition et l’assemblage du microbiote en période néonatale constitue donc un enjeu majeur en termes de prévention à long terme de la santé. Nous supposons que certaines molécules secrétées par les bactéries dénommées « auto-inducteurs » (AIs) sont impliquées puisqu’elles permettent la communication inter-bactérienne et peuvent interagir avec la composante immunitaire de l’hôte, qui participe au contrôle de l’assemblage du microbiote. Notre objectif est donc de démontrer l’implication de ces auto-inducteurs dans la modulation de l’assemblage néonatal du microbiote intestinal. Pour ce faire, nous évaluerons i) l’influence d’une modulation de la composition des microbiotes néonataux, induite par antibiothérapie transitoire des mères, sur la production des autoinducteurs par le microbiote des descendants au cours de son assemblage et ii) la capacité d’aliments modèles, enrichis en différents autoinducteurs, à moduler le microbiote non stabilisé.
Bénéfices attendus
Le projet établira la contribution des AIs au contrôle de l’assemblage du microbiote intestinal chez le rat. Ce résultat revêt un intérêt en termes de transposabilité à d’autres couples hôte/microbiote (ex microbiote intestinal chez l’homme, microbiotes cutané, vaginal, …). En outre, en identifiant les AIs majoritairement impliqués, il contribuera à accroître la connaissance des mécanismes d’interaction hôte-microbiote et à garantir la sécurité des aliments fermentés dont certains contiennent naturellement des AIs. De telles avancées ouvrent la voie à de nouvelles stratégies de modulation des microbiotes ce qui revêt un intérêt majeur au vu de l’implication du microbiote dans la régulation de la santé de l’hôte.
Procédures
Tous les animaux inclus dans ce projet seront soumis à manipulation lors de la constitution des portées ou des suivis pondéraux. Certains d’entre eux (i.e. les 64 ratons élevés par les 8 mères dont l’eau de boisson sera supplémentée en antibiotique) seront soumis à un traitement antibiotique indirect alors que d’autres (ie les 80 ratons inclus dans la procédure 2) seront soumis, quotidiennement entre leur 22e et 35e jour de vie, à des gavages intra-stomaccaux réalisés sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
Pour les animaux inclus dans ce projet, les nuisances induites par les 2 procédures qui relèvent des classes de sévérité « légère » ou "modérée" devraient se limiter au stress généré par les séparations mères/portées ponctuelles et par la manipulation lors de leurs pesées, gavages et mises à mort puisque les traitements qui seront appliqués ne devraient entraîner aucun effet indésirable spécifique. En effet, le traitement antibiotique qui sera appliqué est d’usage courant en médecine vétérinaire et la supplémentation d’aliments modèles enrichis en AIs mime des situations usuelles puisque les AIs sont des composés naturellement présents dans l’alimentation humaine.
Devenir
Compte tenu de l’influence connue du nombre de gestations vécues sur la physiologie et le comportement maternel, les rates utilisées pour générer les portées au sein de chacune des 2 procédures ne peuvent être réutilisées dans nos expérimentations animales et seront mises à mort une fois leurs ratons sevrés. Dans chacune des 2 procédures, l’accès aux contenus du gros intestin, segment intestinal dans lequel l’implication des AIs est la plus probable, est indispensable. De ce fait, la mise à mort des ratons en fin de mise en place du microbiote intestinal est inévitable.
Remplacement
Aucun des modèles in vitro existant ne permet de rendre compte de la complexité des mécanismes physiologiques et immunitaires mis en jeu lors de la colonisation du tube digestif par les bactéries en période périnatale. L’étude in vivo est donc irremplaçable pour d’atteindre l’objectif de ce projet.
Réduction
Le nombre d’animaux est calculé en tenant compte des différences entre mâles et femelles, des nombres d’individus statistiques nécessaires ainsi que des risques de non fécondation des rates ou d’obtention de portées naturelles de taille insuffisante. En absence de données de concentrations luminales en AIs, les nombres d’individus statistiques ont été déterminés par calcul d’effectif réalisé à partir de données décrivant l’impact d’une antibiothérapie au cours de la gestation sur diverses caractéristiques du microbiote des descendants. La procédure n°1 repose sur le traitement de rates allaitantes : l’individu statistique indépendant correspond donc à la portée. Ainsi, 18 rates saillies de l’avant-veille seront commandées afin de garantir l’obtention de 16 portées de 8 ratons (4 mâles et 4 femelles) à subdiviser entre les 2 groupes expérimentaux. L’utilisation à différents stades de développement des 128 ratons mâles et femelles issus de ces portées valorisera au mieux les animaux obtenus à la mise bas. Pour la procédure n°2, les traitements seront appliqués aux descendants sevrés, chacun de ceux-ci constitue un individu statistique pertinent. De ce fait, 10 rates saillies de l’avant-veille seront commandées afin de garantir l’obtention de 8 portées de 10 ratons (5 mâles et 5 femelles), ces 80 descendants seront ensuite repartis (1 male et 1 femelle de chaque portée) dans les 5 groupes expérimentaux pour générer un effectif final de 8 males et 8 femelles consommant chacun des 5 suppléments testés. Pour éviter un gaspillage des animaux, les mères gestantes surnuméraires obtenues dans chacune des procédures (au maximum 4) et leurs descendants excédentaires seront utilisés pour une étude ancillaire destinée à évaluer la possibilité d’un projet futur en mesurant l’appétence des ratons nouvellement sevrés pour les boissons végétales à base de soja. Ces portées seront alors élevées sans traitement spécifique tout au long de la lactation. Après leur sevrage, les ratons, à qui sera proposé le lait de soja en parallèle de leur eau de boisson, feront l’objet d’un suivi de croissance et de consommationjusqu'à leur mise à mort (35e jour de vie). Cette valorisation des portées surnuméraires sera possible puisque pour chacune des procédures, le nombre de portées surnuméraires sera connu dès la mise bas alors que les traitements spécifiques seront appliqués soit au 5e jour de lactation (procédure 1) soit à l’issue du sevrage des ratons (procédure 2).
Raffinement
Le stress généré par les procédures en particulier par la manipulation des portées qui interférera avec les soins maternels et, dans le cas de la procédure 2, par des gavages sera limité du fait de leur mise en œuvre rapide mais sans brusquerie par un personnel compétent et entraîné, dans le respect de la charte nationale sur l’éthique de l’expérimentation animale et des recommandations relatives aux volumes administrables par gavage. En outre, la sélection d’une souche de rat présentant de bonnes qualités maternelles (Sprague-Dawley), l’usage de tapis chauffants sur lesquels positionner les portées séparées de leurs mères, l’enrichissement des cages à l’aide de matériau cellulosique pour le nid et de tunnels et l’hébergement par 2 pendant la majeure partie de la gestation et après sevrage contribueront à minimiser le stress des mères et des ratons. L’absence de nuisance durable sur le bien-être animal sera néanmoins vérifiée par observation des animaux lors des visites qui seront effectuées quotidiennement, y compris le week-end. L’évaluation de l’état des animaux qui sera alors effectuée conditionnera les éventuelles décisions d’administration d’analgésique dans le cas d’observation de signes attestant d’une souffrance (dos vouté, ventre rétracté, facies contracté, aggressivité, vocalisation).
Choix des espèces
Le choix du rat comme modèle d'étude résulte du fait que son microbiote intestinal s’établit au cours des premières semaines de vie, qu'il presente un développement rapide, qu'il est omnivore et que son coût est modéré. En outre, comparativement à la souris, sa moindre susceptibilité au stress le rend plus adapté à la manipulation des descendants au cours de la lactation et sa taille facilite la collecte de contenus intestinaux en quantité adaptée aux besoins de l’étude. De plus, l’expérience acquise par notre unité de recherche sur ce modèle renforce l’intérêt pour ce modèle animal dans le cadre de ce projet particulier.
Etude de l’efficacité d’un nouveau dispositif expérimental sur le traitement de plaies cutanées chez le rat
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
50 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une plaie est créée chirurgicalement sur leur dos sous anesthésie, puis irradiée par lumière visible chaque jour jusqu'à cicatrisation, l'appareil étant maintenu par un harnais qui impose un hébergement individuel. Le porteur reconnaît que l'isolement peut être source de stress, atténué selon lui par des cages transparentes laissant un contact visuel. Il conclut qu'aucun modèle in vitro ne permet un suivi prolongé du processus de cicatrisation.
Objectifs
Les plaies cutanées chroniques représentent un problème de santé publique important avec en France près de 50 000 patients atteints d’ulcère de jambe, 40 000 diabétiques avec une plaie du pied et 350 000 escarres. Leur prise en charge induit des coûts importants de par la chronicité de ces plaies. Les soins sont prolongés, le matériel est parfois coûteux, le temps infirmier nécessaire est important, les arrêts de travail et les hospitalisations sont longues. Les objectifs de ce projet sont, à la suite des essais préliminaires effectués in vivo chez le rat, d’évaluer l’efficacité du traitement de plaies cutanées à l’aide du nouveau dispositif expérimental utilisant les effets thérapeutiques de la lumière visible conçu pour le traitement de celles-ci. Les essais effectués chez le rat sans induction d’une plaie cutanée ont permis de s’assurer du maintien de la partie du dispositif expérimental appliquée sous anesthésie directement sur le dos, laissé en place pendant 5 heures sur le rat sans anesthésie à l’aide d’un harnais conçu spécifiquement et sur mesure. Ces essais ont également permis de d’assurer du maintien de la connexion avec le module de contrôle placé en dehors de la cage d’habitation, du contrôle en continu de la température corporelle au niveau de la zone d’application du dispositif expérimental et de celle du dispositif expérimental, ainsi que de la tolérance locale au niveau de la peau saine suite à l’irradiation lumineuse à l’aide de ce dispositif expérimental et sur 48 heures par la suite. Le dispositif expérimental va donc être utilisé pour traiter des plaies cutanées induites chez le rat. Des irradiations longues pendant 5 heures, ou séquentielles pendant 7 minutes 30 toutes les 15 minutes sur 5 heures, vont être utilisées pour le traitement des plaies cutanées, quotidiennement jusqu’à cicatrisation complète de celles-ci. Ces durées d’irradiations ont été déterminées suite à la réalisation d’études menées chez le rat dans le cadre d'un projet européen. Les traitements débuteront dès la fin d’induction des plaies cutanées et seront effectués jusqu’à cicatrisation complète de celles-ci. Ce projet constituera la toute première évaluation de ce nouveau dispositif médical pour le traitement de plaies cutanées chez le rat.
Bénéfices attendus
La cicatrisation des plaies cutanées est un phénomène naturel de reconstruction de la barrière cutanée mais si les plaies sont mal soignées, cela peut aboutir à des complications. La cicatrisation cutanée fait intervenir différentes phases qui entrainent la disparition de la lésion et le remplacement des cellules atteintes par des cellules saines. Les plaies chroniques qui ne cicatrisent pas, les plaies chirurgicales,les ulcères du pied chez le diabétique, les ulcères veineux… représentent un fardeau pour les patients, les professionnels de la santé et les systèmes de soins de santé, affectant plus de 40 millions de patients et induisant des coûts d’environ 50 milliards d’euros annuellement, et avec un taux de mortalité plus élevé que dans la population générale, pouvant atteindre jusqu’à 20% en fonction de la pathologie considérée. Il est donc très important de tester de nouvelles substances, de nouveaux pansements ou de développer de nouveaux dispositifs médicaux sur des modèles de plaies simples et chroniques représentatifs chez l’animal qui pourront être utilisés par la suite chez l’Homme et ainsi permettre d’améliorer la cicatrisation de ces plaies, surtout les plaies chroniques. Nous allons donc évaluer l’efficacité d’un nouveau dispositif expérimental tout d’abord sur un modèle de plaie simple, dans la perspective de réalisation par la suite d’études d’efficacité sur des modèles de plaies chroniques et infectées ou non chez le rat sain et diabétique. Ce dispositif expérimental pourrait ainis à terme, être utilisé chez l’Homme, pour le traitement de plaies chroniques qui ne cicatrisent pas ou très difficilement.
Procédures
Les 50 rats seront soumis à une procédure chirurgicale pour l’induction d’une plaie cutanée sur une région du dos, procédure effectuée sous anesthésie générale, en 5 minutes environ. Un traitement analgésique sera administré avant l’induction de la plaie cutanée puis 6 heures après celle-ci, et si nécessaire 12 voire 24 heures après. Les plaies cutanées seront traitées quotidiennement jusqu’à cicatrisation complète, pendant 7 minutes 30 sous anesthésie gazeuse, ou 5 heures en fractionné ou en continu sans anesthésie. Les plaies cutanées, protégées par un pansement et un harnais, seront observées et photographiées 3 fois par semaine lors du renouvellement du pansement, effectué en 10 minutes environ. Un suivi quotidien des rats sera réalisé pendant toute la durée des expérimentations. En cas d’inflammation sévère du tissu cutané au niveau de la plaie cutanée traitée par irradiation lumineuse, le protocole d’irradiation serait systématiquement arrêté. Un maintien des rats en cage individuelle est nécessaire pour éviter qu’ils ne s’arrachent le harnais, le pansement et surtout le dispositif expérimental de traitement des plaies cutanées placé dans le harnais, mais avec des briques d’Aspen placées dans leur cage comme enrichissement pour assurer leur bien-être. Des cages transparentes seront utilisées pour maintenir un contact social visuel entre les rats d’un même portoir.
Impact sur les animaux
L’induction d’une plaie cutanée peut induire une souffrance mais limitée dans le temps, souffrance qui sera limitée au maximum par la réalisation de la procédure expérimentale sous anesthésie générale gazeuse et sous couverture analgésique. Les changes de pansement, effectués également sous anesthésie générale gazeuse de courte durée, environ 5 à 10 minutes, n’engendreront quant à eux aucune douleur. L’hébergement en cage individuelle des rats est nécessaire tout au long de l’étude pour éviter qu’ils ne s’arrachent entre eux le harnais, le pansement et surtout la partie de dispositif expérimental placé dans le harnais. Cet hébergement en cage individuelle des rats peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes mais cet effet sera limité par l’utilisation de cages transparentes, permettant à chaque rat de voir au moins un de ses congénères et de maintenir ainsi une forme de contact social.
Devenir
Procédure expérimentale 1 (seule procédure expérimentale) : les 50 rats nécessaires à la réalisation de ce projet seront mis à mort par injection intrapéritonéale d’une surdose d'euthanasiquel effectuée sous anesthésie gazeuse profonde, et un prélèvement de peau correspondant à la zone traitée par la lumière sera effectué pour réaliser des analyses histologiques.
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant de réaliser des traitements et un suivi sur une durée prolongée, plusieurs semaines, du processus cicatriciel dépendant de mécanismes complexes. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de cette étude mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs quant aux objectifs envisagés selon notre expérience et les résultats obtenus d’études précédentes sur ce modèle de plaie cutanée. S’agissant en effet de la toute première étude menée chez l’animal avec ce dispositif expérimental, il ne nous est pas possible de définir un effectif minimal nécessaire à l’aide d’un test de puissance statistique. Les résultats qui seront obtenus, et le traitement statistique des données générées en analyse non paramétrique, le permettront pour les études suivantes.
Raffinement
Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de l’induction des plaies cutanées (analgésie pré-opératoire, maintien des conditions d’asepsie, maintien de la température corporelle) puis après réalisation de celle-ci (analgésie post-opératoire), ainsi que lors de la réalisation de chaque irradiation lumineuse. Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré trois fois par semaine lors de chaque change de pansement et observation des plaies cutanées. Si une perte de poids supérieure à 20% par rapport au poids maximal ou de plus de 10% entre 2 prises de poids est observée, ou si des signes d’infection de la plaie cutanée ou des modifications du comportement des animaux sont observés, ceux-ci seront euthanasiés dans des conditions éthiques. Les rats seront placés en cycle de lumière inversé pour observer leur comportement pendant leur phase active et ainsi respecter leur horloge biologique (chronobiologie) et respecter également la période de réalisation des traitements appliqués pour être dans des conditions similaires à celles qui seront utilisées chez l’Homme. Des briques de bois seront placées dans chaque cage de rat comme dispositif d’enrichissement pour assurer leur bien-être, et seront remplacées lors de chaque change de litière (2 fois par semaine). L’utilisation de cages transparentes permettra de maintenir un contact social visuel entre les rats d’un même portoir.
Choix des espèces
Le rat est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet, en raison de sa taille et de celle du dispositif expérimental qui va être utilisé (2x2 cm pour la partie au contact direct de la peau), et également en raison de sa facilité de manipulation. Les animaux seront de jeunes rats âgés de 6 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 7 semaines pour le démarrage des expérimentations, avec un poids de 175-200 g. Cela correspond au poids de rat nécessaire afin d’avoir une surface corporelle suffisante pour mettre en place le harnais et le dispositif expérimental d’irradiation lumineuse (2x2 cm pour la partie au contact direct de la peau).
Évaluation du potentiel thérapeutique de la stimulation d’une modification protéique, la O-GlcNAcylation, dans le choc hémorragique chez le rat Wistar de 10 – 13 semaines
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
1 128 rats Wistar vont être utilisés, tous tués à l'issue, la moitié sous anesthésie sans réveil et la moitié dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils subissent une chirurgie d'environ deux heures trente provoquant un choc hémorragique, un prélèvement de sang à la queue, puis une seconde chirurgie suivie de la mise à mort pour prélever sang et organes. Le porteur décrit un état de choc avec mobilité fortement réduite et absence de réaction aux stimuli, et indique que les rats trop douloureux sont sacrifiés en cours de protocole. Il conclut que ces réactions systémiques complexes rendent l'animal indispensable faute de méthode alternative.
Objectifs
Les buts du projet sont de 1) valider l’innocuité des molécules 2) valider une cinétique d’administration de molécules plus spécifiques et stables, 3) valider une dose d’administration de molécules plus spécifiques et stables, 4) valider une voie d’administration et enfin, de manière plus transversale, mieux comprendre les mécanismes dans lesquels est impliquée l’O-GlcNAcylation via l’identification de protéines cibles. Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle de l’O-GlcNAcylation dans l’état de choc hémorragique et potentiellement de développer une nouvelle stratégie thérapeutique.
Bénéfices attendus
Avec les différents résultats précédemment obtenus par l’équipe et celle de John C. Chatham, les résultats attendus sont une amélioration de la réponse inflammatoire, une amélioration de la fonction cardiovasculaire et des différents marqueurs de stress et ceux à différents temps d’administration, à différentes doses et selon les différentes voies d’injection. Ces résultats seront objectivés par l’étude in vivo de la fonction et du stress cardiovasculaire (pression artérielle, fréquence cardiaque), rénaux et hépatiques mais également par des tests biochimiques (RT-qPCR, Western blot) validant l’effet des molécules testées. Un bénéfice à très long terme peut être le développement d’une nouvelle approche thérapeutique dans la prise en charge du choc hémorragique.
Procédures
Les animaux seront soumis à 3 interventions. La première intervention consiste à la chirurgie permettant de développer le choc hémorragique (juste la chirurgie pour le groupe contrôle). Cette chirurgie durera environ 2h30 (sur la base des études précédemment menées). La seconde intervention consiste en un prélèvement d’une goutte de sang au bout de la queue sur un animal vigile. Cette intervention ne durera que quelques secondes. La troisième et dernière intervention consiste à la chirurgie permettant d’avoir accès aux valeurs hémodynamiques de l’animal 24h après l’induction du choc. Cette chirurgie durera environ 10 minutes et sera suivi du sacrifice de l’animal pour prélèvement du sang et des organes de l’animal.
Impact sur les animaux
Le modèle de choc hémorragique est un modèle sévère. Au cours de ce protocole, l’état de santé des animaux va s’aggraver du fait du développement du choc hémorragique avec une mobilité fortement réduite, une absence de réaction aux stimuli sonores et toucher mais également une diminution de la prise alimentaire, sans toutefois de réel impact sur le poids, le protocole n’ayant une durée que de 24h. Enfin, une douleur peut être associée à la chirurgie réalisée sur l’animal. L’apparition de ces effets indésirables est environ 2 à 3h après l’induction du choc et jusqu’au sacrifice.
Devenir
En fin de procédure 1 (développement du choc hémorragique), les animaux présentant des signes de douleur trop importants seront sacrifiés. Seuls les animaux ne présentant pas des signes de douleur trop importants seront conservés pour la procédure 2. En fin de procédure 2, l’ensemble des animaux seront mis à mort pour prélever le sang et les organes pour effectuer des analyses.
Remplacement
Le choc hémorragique est une pathologie sans traitement et faisant intervenir des mécanismes complexes et intégrés, nécessitant impérativement l'utilisation de modèles animaux, en effet, les réactions systémiques complexes de l'organisme ne peuvent pas être reproduites in vitro sur des modèles cellulaires, rendant l'utilisation d'animaux indispensables pour mieux comprendre les mécanismes associés et explorer de nouvelles pistes thérapeutiques. Ainsi, il n’existe pas de méthode alternative pour reproduire notre modèle et évaluer l’efficacité de nouvelles thérapies.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est réduit au minimum tout en ayant des données statistiques assez puissantes (dans la mesure du possible les tests seront réalisés en aveugle, afin d’augmenter la puissance de l’étude) qui ne nécessiteront pas l’utilisation de nouveaux animaux. Les rats utilisés sont des Wistar mâles âgés de 10 à 13 semaines, âge standard pour ces manipulations. La taille des animaux permet de réaliser plusieurs analyses sur un même animal et donc de limiter le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les différentes procédures expérimentales de la première étape (mise au point) seront réalisées sur des effectifs réduits afin de déterminer les conditions d’utilisation optimales. Dans un second temps, lorsque les conditions d'utilisation optimales auront été déterminées, les procédures seront réalisées sur un plus grand nombre d’animaux avec seulement les conditions sélectionnées dans la première étape. Afin de raffiner le modèle, des mesures seront mises en place afin de maximiser le confort des animaux par exemple avec la mise en place de scores et de points limites comprenant des critères morphologiques (aspect, comportement) et physiologiques (température, fréquence respiratoire, lactates), l’administration d‘un antidouleur en début de procédure (lidocaïne 2%, gouttes sur les zones d’incision (maximum de 0,49mL pour un rat de 350g), en fin de procédure (buprénorphine à 0,05 mg/kg) et à 8 heures post-chirurgie (buprénorphine à 0,05 mg/kg) est prévue et la réinjection d’une dose supplémentaire peut être considérée en cas de signe de douleur. Tout au long de l’étude, les animaux seront hébergés par 2, dans des cages avec enrichissement, sur portoirs ventilés et avec accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Après chirurgie, afin d’éviter au maximum le stress, les animaux seront placés dans la même cage. Un respect strict des cycles jour/nuit sera observé.
Choix des espèces
Ce modèle est, historiquement et actuellement, le plus utilisé et le mieux décrit. Sa proximité avec la symptomatologie du choc hémorragique chez l’Homme et sa très bonne reproductibilité font un modèle efficace pour cribler et valider l’efficacité des traitements. De plus l’ensemble des travaux et des résultats précédemment obtenus par l’équipe de JC Chatham sur l’étude du choc hémorragique ont été réalisé sur ce modèle, preuve de son utilisation et donc de la connaissance de ce modèle. Les rats utilisés sont des Wistar mâles âgés de 10 à 13 semaines, âge standard pour ces manipulations. La taille des animaux permet de réaliser plusieurs analyses sur un même animal et donc de limiter le nombre d’animaux utilisés. Les effectifs sont choisis pour avoir une puissance statistique suffisante pour conclure sur nos résultats. Ils sont choisis sur la base des tests statistiques utilisés et de l'expérience de ce modèle, permettant de réduire le nombre d'animaux. 10-13 semaines – c’est un âge standard pour ce genre de manipulations.
Plateforme comportement rongeur : Validation méthodologique et formation utilisateurs
- Enseignement supérieur
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 70
1 140 rongeurs, des souris et des rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 360 dans des procédures classées d'un niveau de souffrance sévère. Ils sont placés dans des tests de comportement dont la durée va de quelques minutes à plusieurs heures, répartis en trois classes de gravité sans que le résumé précise en quoi consiste le test sévère. Ces manipulations ne visent pas à produire des connaissances mais à valider les appareils d'une plateforme de comportement et à former ses utilisateurs. Le porteur affirme que le recours aux souris et aux rats est une "étape obligatoire" impossible à remplacer.
Objectifs
Le projet vise à 1- évaluer les tests comportementaux présents dans la plateforme, à valider les différentes méthodes possibles et de créer une base de données sur les modèles commerciaux couramment utilisés au sein de l'institut et 2- former les utilisateurs aux tests au sein de l'institut par petit groupe de 2-3 personnes maximum donnant lieu à un suivi des validations internes des personnels.
Bénéfices attendus
La plateforme a pour vocation de former les utilisateurs aux différents appareillages de mesure comportemental utilisés par ces derniers. Pour cela, la plateforme pourra mettre à disposition les lots d'animaux à des fins éducatives. Les données recueillies serviront de base aux analyses des utilisateurs de la plateforme
Procédures
Dans les trois procédures, de classe légère (procédure 1), de classe modérée (procédure 2) et de classe sévère (procédure 3), les animaux sont placés dans le test et la réponse comportemental est observée. La durée d'observation dépend du test et s'étale de quelques minutes à plusieurs heures en fonction du test
Impact sur les animaux
Aucun, nous utiliserons tous les méthodes adéquates pour l'hébergement et les grilles d'évaluation de la réponse comportementale en fonction des tests.
Devenir
Procédure 1 (comportement de classe légère) : euthanasie, procédure 2 (comportement de classe modérée), procédure 3 (comportement de classe sévère)
Remplacement
S’agissant d’une plateforme comportement rongeur, le recours à des souris et des rats est une étape obligatoire du processus. Il nous est impossible de substituer ces travaux avec d’autres méthodes n’utilisant pas ces animaux.
Réduction
le nombre d'animaux utilisés est réduit au maximum mais doit permettre une formation adéquate des utilisateurs
Raffinement
raffinement, les procédures prennent en compte des temps de récupération et des nombres d’essais visant à réduire le stress et la fatigue des animaux. les animaux sont hébergés en groupe jusqu'à 6 animaux par cage, dans un milieu enrichi avec un nid et une maisonnette si l'animal est hébergé individu. Le monittoring de la température, de l'hygrométrie ainsi que le suivi est réalisé quotidiennement
Choix des espèces
la plateforme est dédiée à l’étude comportementale des rongeurs. Notre projet nécessite donc l’utilisation de souris et de rats. Les animaux seront utilisés après sevrage et jusqu’à 24 mois . Nous réaliserons la formation des utilisateurs en fonction de la thématique de recherche et des modèles animaux utilisé: par exemple maladie d'Alzheimer avec des animaux de plus de 10 mois et maladie de Charcot avec des animaux au sevrage et 2/3 mois, dans ce cas les animaux sont identifié par tatouage car génotypé entre P10-P115. Pour l'évaluation et la validation des aspects méthodologiques de ces tests comportementaux, nous utiliserons des modèles commerciaux de 2 /3 mois. Dans ce cas, les animaux ne sont pas génotypés et sont marqués sur la queue avec un stylo.
Evaluation préclinique de nouvelles molécules thérapeutiques pour le traitement des maladies inflammatoires articulaires chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Rats : 6300
29 500 rongeurs, des souris et des rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont plus de vingt-sept mille dans des procédures classées d'un niveau de souffrance sévère. On leur provoque une polyarthrite rhumatoïde par injections de collagène dans la queue ou une arthrite psoriasique par un vecteur viral, ce qui gonfle et enflamme les articulations, puis on leur administre des composés par gavage. Le projet sert à évaluer des candidats médicaments anti-inflammatoires déjà criblés sur cellules. Le porteur qualifie d'"indispensable" le recours aux modèles animaux et renvoie les bénéfices pour les patients à un horizon lointain.
Objectifs
Les maladies inflammatoires articulaires peuvent divisées en en deux catégories, la polyarthrite rhumatoïde (PR) et l’arthrite psoriasique (AP). - La PR est une maladie auto-immune plurifactorielles qui survient vers 45 ans avec une prévalence de 0.5-0.8% de la population générale. - L’AP est une forme d’arthrite inflammatoire qui survient ordinairement chez des personnes atteintes d’un psoriasis. De 10 à 30 % des personnes atteintes de psoriasis seront atteintes d’AP. Cette pathologie touche autant les hommes que les femmes et se manifeste généralement entre 20 et 50 ans. Il n’existe aucun moyen de guérir l’AP, mais grâce à un diagnostic précoce et à un traitement approprié, il est possible de maîtriser la maladie et de prévenir les lésions articulaires graves. Ces deux maladies inflammatoires articulaires se caractérisent par une atteinte et une dégradation osseuse de l’articulation conduisant à un enraidissement douloureux puis à une incapacité du patient à mobiliser l’articulation affectée. De nombreux patients ne répondent pas aux traitements actuels qui reposent sur les antiinflammatoires non-stéroïdiens, les corticoïdes et les immunosuppresseurs, des anticorps monoclonaux anti-CD20, des anti-TNFa ou encore des anti-IL-6. Des traitements plus performants sont nécessaires. Notre programme de recherche vise à découvrir des molécules qui agissent via des mécanismes d’action innovants et qui peuvent ainsi représenter des options thérapeutiques pour tous les patients atteints de maladie inflammatoire articulaire.. L’utilisation de modèles animaux est indispensable pour comprendre les mécanismes pathogéniques, identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, tester l’efficacité et la toxicité de thérapies anti-inflammatoires et immunomodulatrices innovantes. L’ensemble de nos molécules utilisées chez les animaux ont préalablement été testées et validées in vitro.
Bénéfices attendus
A terme, ce projet permettra de de tester et développer de nouvelles approches thérapeutiques innovantes ayant le potentiel d’améliorer la prise en charge thérapeutique des patients atteints de polyarthrite rhumatoïde et d’arthrite psoriasique.
Procédures
Dans ce projet, les souris recevront 2 injections indradermiques de collagène dans la queue pour les modèles de polyarthrite rhumatoïde. Un modèle AP inductible par une unique injection intraveineuse d'une vecteur viral codant une cytokine pro-inflammatoire sera également utilisé chez la souris. Nous utiliserons également des souris génétiquement modifiées ne présentant pas de phénotype dommageable. Les composés seront administrés par gavage. Un prélévement sanguin sera également éffectué pour suivre la pharmacocinétique des composés testés.
Impact sur les animaux
Les animaux developperont les signes cliniques de la la polyarthrite rhumatoïde (PR) et l’arthrite psoriasique (AP) qui se caractérisent un gonflemment et une inflammation des articulations du poignet et des doigts.
Devenir
Tous les animaux inclus dans les procédures recevront une sédation préalable par inhalation d’isoflurane et seront mis à mort avec la méthode adaptée à l'espèce. Le réalisateur s’assurera de la mort effective de l’animal avant l’élimination du cadavre. Les tissus seront collectés pour analyse de l'impacte de nos composés sur la physiopathologie de la maladie.
Remplacement
L’utilisation de modèles animaux est indispensable pour comprendre les mécanismes pathogéniques, identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, tester l’efficacité et la toxicité de thérapies anti-inflammatoires et immunomodulatrices innovantes. L’ensemble de nos molécules ont préalablement été testées et validées in vitro.
Réduction
Nous utilisons des modèles établis dans la littérature que nous utilisons en routine dans notre établissement utilisateur depuis 5 ans. Une analyse statistique rétrospective a permis de calculer le nombre nécessaire et suffisant d'animaux par groupe pour obtenir pour chaque paramètre étudié. Afin de générer des résultats reproductibles et de limiter la variabilité intergroupe au seul effet du paramètre testé, nous veillerons à travailler sur des groupes les plus homogènes possibles au moment de leur inclusion dans l’étude.
Raffinement
Afin de réduire le stress, une acclimatation d’au moins 5 jours sera réalisée avant l'entrée en étude et leur environnement sera enrichi avec des aspens, igloos, et feuilles de cellulose à déchirer ou du sizzle-dry. Afin de pallier l'inconfort lié aux procédures, un programme d'anesthésie et d'analgesie sera prévu. Afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux, une surveillance journalière et des points limites précoces et spécifiques aux modèles ont été établis conduisant à l’arrêt temporaire des traitements ou au sacrifice anticipé de l’animal
Choix des espèces
Les espèces animales utilisées dans le cadre de ces recherches sont la souris et le rat. Les différents modèles seront mis au point, sur la base de la littérature existante et en s’appuyant sur l’expertise du fournisseur. Nous avons souhaité nous appuyer sur de la bibliographie solide et sur des modèles déjà bien documentés afin d’éviter l’utilisation d’un nombre excessif d'animaux pour les mises au point. En accord avec la littérature pour les différents modèles, les animaux seront utilisés au stade adulte afin d’évaluer les composés à visée anti-inflammatoire, sur un système immunitaire mature
Travaux pratiques d’une formation pour être concepteur de projet ou applicateur de procédures expérimentales, modèles rat et souris
- Formation professionnelle
Rats : 600
1 200 rongeurs, six cents souris et six cents rats, vont être utilisés dans des procédures classées d'un niveau de souffrance léger, réutilisés ensuite dans d'autres travaux pratiques. Ils servent à entraîner des stagiaires aux gestes de base, préhension, contention, injection intra-péritonéale de sérum physiologique, et à des tests de comportement, open-field, labyrinthe en croix surélevée, planche à trou et chambre claire-obscure. Ces manipulations n'ont pas de finalité de connaissance mais visent la formation réglementaire des concepteurs et applicateurs d'expériences. Le porteur affirme qu'aucune méthode de substitution ne restitue les comportements de l'animal et que les gestes doivent être acquis sur l'espèce cible vivante.
Objectifs
Les personnels des établissements utilisateurs d'animaux à des fins scientifiques ont pour obligation d'être compétents en expérimentation animale. Cette compétence repose pour les concepteurs sur un niveau de formation initiale, une formation spécialisée et une formation continue. Pour les applicateurs, la compétence repose sur la formation spécialisée et la formation continue. Le projet de travaux pratiques présenté ici comprend la partie pratique des deux programmes de formations spécialisées "concepteur" et "applicateur". Il comprend deux procédures expérimentales : un TP pour acquérir les gestes de base : préhension, contention, administrations, prélèvements et un TP pour se familiariser aux tests de comportements pratiqués chez les rongeurs : Open-field, Labyrinthe en croix surélévée, planche à trou, chambre claire-obscure.
Bénéfices attendus
Les bénéfices sont l'apport d'une compétence pratique à la préhension, la contention, certaines techniques d'administration et de prélèvements et de se familiariser à des tests simples mais néanmoins informatifs pour l'étude du comportement des animaux.
Procédures
Pour le TP sur les gestes de base, les actes les plus contraignants sont l'administration de sérum physiologique en intra-péritonéale (piqûre d'aiguille). Ce sont dans les deux cas des gestes brefs qui durent quelques secondes. Pour le TP sur le comportement, les actes expérimentaux réalisés sur les animaux ne sont pas douloureux, tout au plus, il sont stressés quelques minutes du fait d'un environnement nouveau. Les trois tests expérimentaux durent entre 3 et 10 min chacun. Les deux TP sont des procédures expérimentales de classe légère.
Impact sur les animaux
Les animaux vont être manipulés en réduisant au maximum les nuisances, car ils le seront selon les recommandations du Centre 3R anglais. Les nuisances les plus importantes seront tout au plus de gravité légère et comprennent une administration intra-péritonéale (nuisance équivalente à une piqûre d'aiguille).
Devenir
Les animaux seront réutilisés car ils auront été impliqués dans des procédures légères uniquement.
Remplacement
Pour ce projet, il n'existe pas de méthodes de substitution qui pourrait restituer fidèlement les comportements et réactions des animaux qui peuvent être complexes. Les gestes étant spécifiques de l'espèce rat ou souris, ils doivent être acquis chez l'espèce cible. Toutefois, des outils vidéos en provenance d'une source reconnue de tous (NC3R = Centre 3R anglais) et d'un intérêt indéniable seront utilisés en tout premier lieu, avant la pratique car ils présentent des méthodes modernes, de préhension/contention par exemple. La mise en place des TP sur animaux vivants est donc complétée par une approche préalable complémentaire basée sur les vidéos du centre NC3R. Les gestes ou approches à acquérir imposent que l'animal soit vivant pour évaluer les critères de réussite.
Réduction
Nous sommes attentifs à réduire au maximum le nombre d'animaux, à un rat et une souris par stagiaire, ce qui permet d'atteindre l'objectif pédagogique visé. Par ailleurs, les animaux impliqués dans le TP comportement, nécessairement naïfs, seront utilisés dans un second temps pour le TP gestes de base, permettant de mutualiser l'utilisation d'animaux entre les différentes procédures. Ils ne seront pas euthanasiés mais seront également impliqués quelques mois après la formation dans d'autres TP universitaires (qui feront l'objet de demandes d'autorisation de projet indépendantes de celle-ci).
Raffinement
Les animaux impliqués dans les procédures expérimentales de ce projet sont hébergés dans la zone d'hébergement pendant plusieurs semaines avant les TP, avec une enrichissement social et physique (acclimatation). Les procédures menées sont tout au plus de classe légère (administration intra-péritonéale de sérum physiologique). Les tests de comportement sont tout au plus un peu stressants pour les animaux. Dans ces conditions, aucune administration d'antalgique ne sera réalisée car elle n'est pas pertinente. Les autres gestes comme la préhension et la contention ne sont pas douloureux. Toutefois, une attention particulière sera portée à l'atteinte de potentiels points limites qui sont malgré tout très peu probables.
Choix des espèces
Les espèces qui seront utilisées dans ce projet correspondent aux espèces cibles, c'est à dire aux espèces du module complémentaire de la formation règlementaire en expérimentation animale. Ce sont les espèces dont les stagiaires auront besoin pour leurs futures activités de recherche. Les animaux seront des animaux matures de six semaines au moins. Nous utilisons ces stades car les animaux adultes correspondent aux animaux utilisés classiquement pour les tests de comportement prévus. Ce sont par ailleurs des stades où les animaux sont facilement manipulables pour les travaux pratiques (sachant que nous choisissons des souches d'animaux connus pour être calmes).
Projet Fibrose
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Rats : 1550
11 000 rongeurs, des souris et des rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Chez une partie, des fibroses du poumon, du foie, du rein ou de la peau sont provoquées de façon accélérée, et tous reçoivent des composés par voie orale, intra-péritonéale, sous-cutanée ou intraveineuse une à deux fois par jour pendant six à huit semaines, avec prélèvements sanguins et chirurgies. Le projet teste des molécules anti-fibrose en vue de leur développement clinique et de leur "mise sur le marché". Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de recourir à des modèles animaux reproduisant la pathologie humaine, que les tests sur cellules ne remplacent pas.
Objectifs
A ce jour, aucun médicament utilisé dans le traitement de la fibrose n'a permis de reverser et/ou stopper complètement une fibrose établie sur le plan histologique ou clinique. Le but des expérimentations mises en place est de développer des molécules pouvant ralentir et/ou stopper le développement de la fibrose dans nos modèles expérimentaux.
Bénéfices attendus
A ce jour, aucun médicament utilisé dans le traitement de la fibrose chez l’homme n'a permis de reverser et/ou stopper complètement une fibrose établie sur le plan histologique ou clinique. Toute fibrose confondue représente 45% des décès dans les pays développés. Le but des expérimentations mises en place est de développer des molécules pouvant ralentir et/ou stopper le développement de la fibrose dans nos modèles expérimentaux. Les différentes procédures utilisées dans ce projet vont nous permettre d’avoir une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans le développement des différentes fibroses. Elles vont également nous permettre, en support du travail réalisé in vitro, la recherche et la validation de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement de la fibrose. De plus ces procédures nous permettront, une fois une cible identifiée, de développer de petites molécules permettant de reverser et/ou stopper le développement de la fibrose et aussi d’évaluer des combinaisons thérapeutiques afin d’augmenter l’efficacité ou de limiter les effets non désirables de certains composés prometteurs pour le traitement de la fibrose. L’ensemble de ces travaux a pour but d’avancer au maximum le développement préclinique de traitement anti-fibrotique en vue de leur développement clinique et leur mise sur le marché.
Procédures
Les gestes techniques réalisés sur animaux se pratiquent sur rats et souris, vigiles ou anesthésiés. - Sur animaux vigiles : o Identification individuelle (oreille, queue, patte). Tous les animaux de ce projet sont concernés par au moins un type d’identification. o Administration de composés par voies orale, intrapéritonéale, sous-cutanée, intraveineuse. Ces gestes concernent la totalité des animaux de ce projet. Les administrations par voies orale, péritonéale et sous-cutanée peuvent être réalisées une à deux fois par jour, pendant 6 à 8 semaines. Les administrations par voie intraveineuse peuvent être réalisées une à deux fois par semaine, pendant 6 à 8 semaines. -Sur animaux anesthésiés par voie gazeuse ou par voie systémique : oAdministration par voie oropharyngée. Acte unique. oAdministration par voie sous-cutanée. Acte réalisé au maximum 5 fois par semaine, pendant 4 semaines. oPrélèvements sanguins intermédiaires au maximum 4 fois par animal ou terminaux. Ils sont réalisés en respectant les recommandations en termes de volumes et temps de récupération. Tous les animaux de ce projet sont concernés. oMises à mort par une méthode règlementaire ou une méthode validée par un comité d’éthique. Tous les animaux de ce projet sont concernés. oChirurgie (acte unique). Un protocole d’analgésie pré- et post-opératoire s’applique dans ces cas.
Impact sur les animaux
Quatre procédures décrivent des modèles de fibroses (pulmonaire, hépatique, rénale et dermique) qui, par conséquent, recréées de façon accélérée le développement de ces pathologies. Ces modèles sont bien caractérisés dans nos laboratoires et n’engendrent pas d’effets indésirables autres que ceux liés aux modèles eux-mêmes. Nous ne nous attendons pas à avoir d’effets indésirables dans nos modèles lorsque nous évaluons des composés car ils ont pour but de guérir la fibrose et ont, en amont de nos modèles, démontré une efficacité dans nos tests in vitro. Ils sont également passés dans des études de pharmacocinétique vitro puis vivo durant lesquels les composés qui auraient montré des effets indésirables sont écartés. Toutefois en cas d’éventuels signes cliniques observés, le traitement serait suspendu ou adapté. Sans amélioration, les animaux seraient mis à mort. Des points limites sont définis pour chaque procédure afin d’anticiper les actions à mettre en œuvre et de préserver leur bien-être.
Devenir
La mise à mort des animaux à l’issue des procédures est indispensable afin de pouvoir prélever le sang et les organes et réaliser les analyses permettant de répondre aux objectifs du projet.
Remplacement
Pour tester l’activité in vivo des composés issus du screening cellulaire in vitro, il est indispensable de recourir à l’utilisation de modèles animaux reproduisant le plus possible la pathologie humaine, qui intègrent toute la complexité des réactions physiologiques (interactions intercellulaires, inter-organes, inflammations…). Tous les modèles utilisés sont très bien décrits dans la littérature scientifique et ont été validés avec des composés qui ont montré leur efficacité chez l’homme dans des études cliniques. Le processus de screening des composés est réalisé sur des tests cellulaires ou non-cellulaires in vitro. Ces tests permettent de réduire le nombre de composés à tester chez l’animal mais ne permettent malheureusement pas de se passer des modèles animaux.
Réduction
La sélection des composés est faite en utilisant des tests cellulaires ou non cellulaires in vitro. Seules les molécules présentant une activité sur les tests in-vitro et ayant des caractéristiques pharmacocinétiques adéquates seront testées sur les animaux. Ce système permet de réduire considérablement le nombre de molécules testées chez l’animal et donc le nombre d’animaux utilisés. Seuls les modèles animaux, bien décrits et validés par la communauté scientifique sont réalisés. En règle générale, 8 à 12 animaux sont utilisés par groupe (1 groupe par composé à tester incluant le véhicule du composé). Une analyse de variance à 1 ou 2 facteur(s) suivi d’un test de Dunnett comparant le véhicule avec le composé à tester permettent de mesurer si l’effet du composé est significatif. L’étude est répétée une deuxième fois pour évaluer la reproductibilité du test.
Raffinement
Toutes les dispositions nécessaires en matière d’hébergement, d’enrichissement, d’observation et de soins aux animaux sont prises afin d’assurer les meilleures conditions de vie aux animaux. Ils sont observés tous les jours et leur état clinique est évalué au minimum deux fois par semaine. Les conditions de chaque procédure expérimentale sont étudiées individuellement par la Structure Chargée du Bien-Être Animal (SBEA) qui émet ses recommandations en matière de prévention de la douleur, souffrance et détresse des animaux. Les animaux affaiblis sont maintenus dans des conditions aménagées facilitant l’accès à l’aliment et à l’eau de boisson (par exemple ajout d’eau gélifiée).
Choix des espèces
En pharmacocinétique, la souris puis le rat sont les espèces standards dans les premières phases de recherche et développement de nouveaux candidats médicaments. Le rat est choisi pour les molécules les plus intéressantes, afin de commencer la comparaison pharmacocinétique inter espèce, ainsi que de préparer les études de toxicologie futures. En pharmacologie, la souris est l’espèce recommandée et largement utilisée pour les premières étapes de la recherche. Elle permet de réduire les quantités de composés nécessaires à l’évaluation de leur efficacité. Les souris génétiquement modifiées permettent de valider de façon plus spécifique certains mécanismes d’action. Les modèles de fibrose ainsi que les études de pharmacocinétique sont réalisés avec des animaux juvéniles à adultes qui permettent une bonne évaluation de leur efficacité et la détermination de l’exposition des composés.