Rats

30 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur pose des cathéters dans les veines fémorales sous anesthésie, on administre par voie orale ou intraveineuse un candidat médicament anti-inflammatoire, puis on réalise cinq prélèvements sanguins sur douze heures et un placement en cage à métabolisme pendant vingt-quatre heures. Le projet mesure le devenir de la molécule dans l'organisme en vue d'un futur dossier d'autorisation de mise sur le marché. Le porteur affirme que la pharmacocinétique n'est "pas prévisible" par des études sur cellules et qu'elle doit être fournie in vivo pour ce dossier.

Objectifs

L'IMD-036B est un candidat médicament qui présente des caractéristiques intéressantes pour lutter contre les processus inflmmatoires à l'origine de maladies chroniques inflammatoires comme le psoriasis, la polyarthrite rhumatoïde, la sclérose en plaques ou encore l'hyper-inflammation responsable des orages cytokiniques comme dans le cas des formes graves de COVID19. Afin de compléter les données obtenues sur ce candidat médicament avant de pouvoir mener des essais cliniques chez l'Homme, il est nécessaire de connaître son devenir dans l'organisme et de déterminer si la molécule est bien absorbée et comment elle est éliminée (élimination rénale ou métabolisme hépatique). Notre projet a donc pour but de déterminer les paramètres pharmacocinétiques et la clairance rénale de l'IMD-036B après administration par voie orale (la voie préconisée pour l'administration future chez l'Homme) et par voie intraveineuse (la voie de référence permettant de déterminer la biodisponibilité de la molécule).

Bénéfices attendus

Ce projet est une première étape pour pouvoir déposer un dossier d'AMM pour un nouveau candidat médicament. Les premières données obtenues sur ce candidat médicament laissent fortement penser qu'il permettrait de traiter efficacement les processus inflammatoires dans un certains nombres de maladies chez l'Homme qui n'ont pour le moment peu ou pas de traitement (par exemple, sclérose en plaques ou COVID19). Dans un deuxième temps, son utilisation pourrait également bénéficier aux vétérinaires pour le traitement de dermatites atopiques chez le chien par exemple.

Procédures

1. Pose d'un ou deux cathéters au niveau des veines fémorales sous anesthésie générale + analgésie: une seule chirurgie de maximum 30 minutes avec un réveil rapide, 2. Administration par voie orale ou par voie intraveineuse d'IMD-036B: une seule administration de quelques secondes à une minute max à chaque fois, 3. Cinq prélèvements sanguins sur environ 12h (1 de 100 µL et 4 de 250 µL) via cathéter sur animal vigile: quelques secondes à 1 minute max à chaque fois, 4. Placement en cage à métabolisme pour recueil des urines sur 24h, 5. Prélèvement de sang sous anesthésie via cathéter ou par ponction intracardique suivi de la mise à mort des animaux.

Impact sur les animaux

La toxicité de cette molécule a déjà été testée sur rongeurs après des administrations répétées et à des doses bien plus importantes que celle utilisée dans notre projet. Aucun effet indésirable n'est attendu lors de l'administration unique par voie orale ou intraveineuse d'IMD-036B à la dose de 10 mg/kg à des rats. Les nuisances qui pourraient être observées sont plutôt inhérentes à la chirurgie effectuée sur les animaux, mais il s'agit d'une procédure largement maitrisée par le personnel en charge du projet et avec une analgésie très efficace.

Devenir

Les animaux ayant subi une chirurgie et l'administration d'une molécule qui n'est pas encore disponible sur la marché dont nous ne pouvons donc pas connaître les effets à long terme seront euthanasiés. Les animaux avec des cathéters non fonctionnels qui n'auraient pas reçu la molécule seront euthanasiés pour obtenir des matrices blanches permettant de réaliser gammes et QC pour le dosage de la molécule dans la plasma.

Remplacement

Il n'est pas possible de se passer d'animaux pour ce projet car le devenir d'un médicament dans un organisme (pharmacocinétique) n'est pas prévisible par des études in vitro compte-tenu de la complexité des mécanismes (absorption, métabolisme hépatique, diffusion tissulaire, élimination rénale...). De plus, lors du dépôt de dossier d'AMM pour ce nouveau candidat médicament, il sera nécessaire de fournir des données de pharmacocinétique in vivo.

Réduction

Le projet sera découpé en deux parties: une première partie consistant à administrer la molécule à 15 rats par voie intraveineuse, la seconde partie consistant à administrer la molécule à 15 autres rats par voie orale. L'utilisation du second lot de 15 rats pour l'administration par voie orale ne sera faite que si les études menées in vitro sur Caco2, en parallèle de la première partie de notre étude, montrent que la molécule présente un bon passage au niveau intestinal. De plus, grâce à des techniques de modélisation des données, il est possible de réduire le nombre de prélèvements sanguins effectués sur les rats en ne réalisant pas tous les prélèvements sanguins à tous les temps sur tous les rats. Enfin, le fait de poser deux cathéters lors d'une seule chirurgie pour l'administration par voie intraveineuse et la réalisation des prélèvements sériés permet de réduire le nombre d'anesthésies pour ces animaux.

Raffinement

La réalisation du projet en deux parties permet de ne pas utiliser inutilement des animaux pour l'administration par voie orale alors que, si la molécule est mal absorbée, les résultats seront inexploitables. Les rats seront hébergés en groupe dans des milieux enrichis (papier pour faire des nids, rouleaux en carton en guise de tunnels et pour ronger), sauf juste après la pose des cathéters (au moins jusqu'au réveil de l'animal) et lors des 24h en cage à métabolisme. Les cages à métabolisme permettront tout de même aux animaux de se voir et se sentir.

Choix des espèces

Les études précliniques qui doivent être effectuées avant les essais cliniques chez l'Homme doivent l'être sur une espèce de référence comme le rat ou la souris. Le choix du rat a été fait car cette espèce permet, contrairement à la souris, de faire des prélèvements sanguins sériés. Animaux adultes. Dans un premier temps, on évitera les animaux trop jeunes ou senescents qui pourraient avoir un métabolisme différent car nous n'avons pas encore connaissance de la cinétique de la molécule et de la variabilité interindividuelle des concentrations plasmatiques et urinaires.

8 400 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une inflammation de l'intestin leur est provoquée par un agent chimique, par gavage d'une bactérie ou par injection de cellules inflammatoires, puis des composés leur sont administrés par gavage. Le porteur indique que les animaux développeront les signes des maladies inflammatoires de l'intestin, diarrhée, sang dans les selles et perte de poids. Il qualifie le recours aux modèles animaux d'"indispensable" pour tester des molécules déjà "testées et validées in vitro", les bénéfices pour les patients restant renvoyés au conditionnel et au long terme.

Objectifs

Les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI), telles que la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique, sont des troubles caractérisés par une inflammation de la paroi d’une partie du tube digestif, source de lésions destructrices. Ces maladies sont caractérisées par une forte migration de cellules inflammatoires de types granulocytes au niveau de la paroi du tube digestif. L’augmentation et la dérégulation du recrutement des granulocytes et leur sur-activation contribuent à la chronicité et à l’amplification de la maladie. Notre programme de recherche vise à découvrir des molécules qui agissent via des mécanismes d’action innovants et qui peuvent ainsi représenter des options thérapeutiques pour tous les patients atteints de MICI. L’ensemble de nos molécules ont préalablement été testées et approuvées in vitro. L’utilisation de modèles animaux est indispensable pour comprendre les mécanismes pathogéniques, identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, tester l’efficacité et la toxicité de thérapies anti-inflammatoires et immunomodulatrices innovantes. L’ensemble de nos molécules ont préalablement été testées et validées in vitro

Bénéfices attendus

A terme, ce projet permettra de de tester et développer de nouvelles approches thérapeutiques innovantes ayant le potentiel d’améliorer la prise en charge thérapeutique des patients atteints de MICI.

Procédures

Dans ce projet, nous utiliserons des modèles d’inflammation de l’intestin chez le rat et la souris afin de tester l’efficacité de nos composés. Ces modèles seront induits par un agent chimique ou par le gavage d’une bactérie ou par l’injection de cellules inflammatoires. Certains de ces modèles utiliserons des souris génétiquement modifiées ne présentant pas de phénotype dommageable.. Les composés seront administrés par gavage. Un prélévement sanguin sera également éffectué pour suivre la pharmacocinétique des composés testés.

Impact sur les animaux

Les animaux developperont les signes cliniques des MICI qui se caractérisent par une diahrée, du sang dans les fèces et de la perte de poids.

Devenir

Tous les animaux dans les procédures recevront une sédation préalable par inhalation d’isoflurane et seront mis à mort avec la méthode adaptées à l'espèce. Le réalisateur s’assurera de la mort effective de l’animal avant l’élimination du cadavre. Les tissus seront collectés pour analyse de l'impacte de nos composés sur la physiopathologie de la maladie.

Remplacement

L’utilisation de modèles animaux est indispensable pour comprendre les mécanismes pathogéniques, identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, tester l’efficacité et la toxicité de thérapies anti-inflammatoires et immunomodulatrices innovantes. L’ensemble de nos molécules ont préalablement été testées et validées in vitro. L'utilisation de modèles animals est indispensable pour avoir une vue globale de la physiopathologie de la maladie ainsi que la pharmacocinétique des composées sur l'ensemble des organes ce que ne permet pas les modèles in vitro.

Réduction

Nous utilisons des modèles établis dans la littérature que nous utilisons en routine dans notre établissement utilisateur depuis 5 ans. Une analyse statistique rétrospective a permis de calculer le nombre nécessaire et suffisant d'animaux par groupe pour obtenir pour chaque paramètre étudié. Afin de générer des résultats reproductibles et de limiter la variabilité intergroupe au seul effet du paramètre testé, nous veillerons à travailler sur des groupes les plus homogènes possibles au moment de leur inclusion dans l’étude.

Raffinement

Afin de réduire le stress, une acclimatation d’au moins 5 jours sera réalisée avant l'entrée en étude et leur environnement sera enrichi avec des aspens, igloos, et feuilles de cellulose à déchirer ou du sizzle-dry. Afin de pallier l'inconfort lié aux procédures, un programme d'anesthésie et d'analagésie sera envisagé. Afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux, une surveillance journalière et des points limites précoces et spécifiques aux modèles ont été établis conduisant à l’arrêt temporaire des traitements ou au sacrifice anticipé de l’animal

Choix des espèces

Les espèces animales utilisées dans le cadre de ces recherches sont la souris et le rat. Les différents modèles seront mis au point, sur la base de la littérature existante et en s’appuyant sur l’expertise du fournisseur. Nous avons souhaité nous appuyer sur de la bibliographie solide et sur des modèles déjà bien documentés afin d’éviter l’utilisation d’un nombre excessif d'animaux pour les mises au point. En accord avec la littérature pour les différents modèles, les animaux seront utilisés au stade adulte afin d’évaluer les composés à visée anti-inflammatoire, sur un système immunitaire mature

24 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur implante par chirurgie 64 électrodes intracérébrales, puis ils cherchent de la nourriture dans des environnements variés sous restriction alimentaire maintenant leur poids à 90 %, pour enregistrer l'activité de l'hippocampe et du thalamus visuel. Le porteur précise que les rats sont hébergés seuls pour préserver l'appareillage et qu'ils sont pesés chaque jour, l'alimentation redevenant libre au-delà de 15 % de perte. Il affirme que ces enregistrements invasifs sont incompatibles avec l'humain et qu'aucune approche in vitro ou in silico ne peut remplacer l'animal.

Objectifs

Ce projet vise à comprendre comment des structures cérébrales, bien connues par ailleurs pour leur rôle dans le traitement des informations visuelles, participent à la construction de la représentation spatiale chez le rongeur. La représentation de l'espace constitue une question centrale dans le domaine de la recherche en cognition. Près de cinquante années de recherche en neurophysiologie, reposant pour l'essentiel sur l'utilisation du modèle rongeur, ont permis d'identifier les structures cérébrales indispensables à la construction de cette représentation spatiale. L'hippocampe est l'une de ces structures. Les études électrophysiologiques visent à essayer de comprendre le fonctionnement d'une structure cérébrale en analysant l'activité des neurones en relation avec le comportement de l'animal. Les principales cellules hippocampiques sont des neurones pyramidaux qui montrent une intense activité lorsque l'animal se trouve à un endroit particulier de l'espace dans un environnement donné. Ces cellules de lieu permettent donc collectivement à l'animal de savoir où il se trouve et dans quel environnement il se trouve. Nous savons désormais que l’activation de ces cellules repose sur des informations de nature multimodalitaire (par exemple olfactive, tactile, visuelle, etc.) ce qui fournit au système de navigation un fort potentiel adaptatif. Néanmoins, les relations fonctionnelles entre les structures spécialisées dans le traitement des informations visuelles et celles spécialisées dans le traitement des informations spatiales restent très largement méconnues. Le but de ce projet est donc d’enregistrer l’activité neuronale simultanément dans deux structures cérébrales, l’une spécialisée dans le traitement des informations spatiales (hippocampe), l’autre dans le traitement des informations visuelles (corps genouillé dorso-latéral), et d’observer les interactions neuronales en réponse à des manipulations environnementales. Pour ce faire, les animaux seront implantés avec des microdescendeurs équipés de 64 électrodes et devront se déplacer dans des environnements plus ou moins complexes à la recherche de nourriture. Un deuxième volet de l’étude consiste à établir une cartographie des champs récepteurs visuels de ces deux populations neuronales chez l’animal anesthésié. D'une durée de 5 ans, ce projet nécessitera l'utilisation de 24 rats (mâles et femelles) de souche Long-Evans adultes.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet nous permettront de clarifier le rôle des informations visuelles dans la consolidation mnésique telle qu’observée au niveau hippocampique. Les expériences de cartographie des propriétés visuelles des neurones thalamiques nous permettront, quant à elles, de confirmer la présence de cellules de lieu dans cette région sous-corticale. L’ensemble de ces résultats nous amènera éventuellement à reconsidérer le rôle du corps genouillé dorso-latéral dans les processus de mémorisation et plus simplement dans le traitement des informations visuelles.

Procédures

Procédure chirurgicale (Procédure 1). Implantation chronique d'électrodes intra-cérébrales. Procédure unique. 4 heures en moyenne. Procédure facultative de réparation des implants (Procédure 2). Anesthésie de courte durée. Procédure facultative, de 0 à 2 fois par animal. Entre 10 et 15 minutes en moyenne. Procédure comportementale (Procédure 3). Tâche de recherche aléatoire de nourriture chez l'animal libre de ses mouvements. Maximum 3 fois par jour pendant 3 mois. 12 minutes par session. Procédure d'enregistrement de l'activité cérébrale (Procédure 4). Recueil des données électrophysiologiques au cours de la tâche comportementale. Maximum 3 fois par jour pendant 3 mois. 12 minutes par session. Procédure de cartographie des propriétés visuelles (Procédure 5). Anesthésie de l'animal et caractérisation des propriétés visuelles des neurones thalamiques. Procédure unique. 5 heures en moyenne.

Impact sur les animaux

Les animaux après chirurgie sont placés individuellement dans des cages standard dont la grille est réhaussée de 13 cm. Cette mesure d'hébergement particulière est indispensable afin d'assurer le bon état de fonctionnement des microdescendeurs porte-électrodes. L'hébergement de plusieurs animaux dans une même cage pourrait aboutir à l'endommagement irréversible de cet appareillage et rendre ainsi impossible le bon déroulement des expérimentations. Puisqu’un contrôle alimentaire est prévu pendant toute la durée de l’expérience afin de réduire le poids des animaux à 90% de leur poids initial, les rats sont pesés tous les jours afin d'éviter des réductions trop importantes de leur poids. Si la perte de poids d'un animal est trop importante (e.g. >15%), l’alimentation de l’animal devient ad libitum jusqu’au retour du poids désiré.

Devenir

A l'issue des procédures 1 à 4 incluse, tous les animaux sont gardés en vie. La décision de maintien en vie découle des objectifs de l'expérimentation, à savoir enregistrer les modifications de l'activité cérébrale en réponse à des modifications environnementales au cours des procédures comportementales. Ce n'est qu'à la fin du projet, (après la procédure n°5), que tous les animaux sont mis à mort de façon à pouvoir prélever le cerveau pour analyse histologique. Ce contrôle histologique est indispensable pour confirmer la position des électrodes au niveau des structures cérébrales d'intérêt.

Remplacement

Ce projet repose sur des méthodes invasives d'enregistrement de l'activité cérébrale, incompatibles avec une approche chez le sujet humain. De plus, de par la nécessité d'enregistrer l'activité cérébrale au sein d'un système complexe intégré, il est impossible de remplacer l'animal par des expériences in vitro, in silico ou ex vivo.

Réduction

L'utilisation de microdescendeurs indépendants à haute densité d'enregistrement permet de réduire considérablement (près de 50%) le nombre d'animaux nécessaires à la réalisation de ce projet.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages rehaussées (+13 cm) spécifiquement à cette occasion. Cette hauteur permettra aux animaux de pouvoir se redresser complètement dans leur cage sans que l'implant ne gêne leurs mouvements. Les implants seront équipés d'un système de connexion magnétique ce qui permettra à l'expérimentateur de connecter les animaux sans avoir à les restreindre. Toutes les procédures chirurgicales seront effectuées à l'aide de produits anesthésiques et analgésiques adaptés. Les animaux sont surveillés pendant toute la période post-opératoire en utilisant une grille d'évaluation adaptée pour détecter d'éventuels signes de douleur ou de mal être et une injection supplémentaire sous-cutanée d'analgésique est réalisée en cas de besoin. Les autres traitements éventuels sont établis par le vétérinaire de notre établissement d'expérimentation. Puisqu’un contrôle alimentaire est prévu pendant toute la durée de l’expérience afin de réduire le poids des animaux à 90% de leur poids initial, les rats sont pesés tous les jours afin d'éviter des réductions trop importantes de leur poids. Si la perte de poids d'un animal est trop importante (e.g. >15%), l’alimentation de l’animal devient ad libitum jusqu’au retour du poids désiré. Notre grille de score permet de caractériser l'état général de l'animal sur la base d'un certain nombre de paramètres auxquels des points sont attribués (apparence générale, abreuvement et alimentation, examen clinique, comportement naturel, comportement provoqué) et, selon le score obtenu en additionnant les points correspondant aux paramètres, permet de conduire les actions suivantes : 0-4 Normal, pas d’action requise. 5-9 Observer attentivement, envisager l’utilisation d’antalgiques (Kétoprofène 5mg/kg, PO ou Carprofène 5mg/kg, SC). En cas de dermatite au niveau du scalp, l’application d’une pommade nettoyante, antiseptique et cicatrisante peut être envisagée (Acide Malique, DERMAFLON). Si présence d’infection, envisager l’utilisation d’antibiotiques à large spectre (Oxytetracycline, 10 mg/kg, SC) pendant trois à cinq jours. 10-14 Souffrance, administration d’antalgiques (Buprenorphine, 0.05 mg/kg, SC) et observer régulièrement. Demander un deuxième avis (SBEA et/ou Vétérinaire référent). 15-17 Souffrance sévère. Mise à mort.

Choix des espèces

Le rat représente le modèle de choix pour les études du comportement spatial qui est à la base des protocoles comportementaux qui seront utilisés. Il présente d'excellentes performances dans les tâches de navigation spatiale. Par ailleurs, 90% des études portant sur les bases neurales de l'apprentissage et des comportements de choix réalisés chez le rongeur reposent sur l'utilisation du rat, ce qui permet de disposer d'une littérature abondante sur laquelle s'appuyer. Enfin, tous nos travaux antérieurs ont été réalisés chez le rat, ce qui facilite la comparaison des résultats entre eux. Le projet vise à établir le rôle de certaines structures cérébrales chez le rat jeune adulte. Afin de pouvoir comparer les résultats avec les travaux antérieurs, nous utiliserons des animaux qui auront 3 mois au début de l'expérience.

64 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit sous anesthésie générale l'implantation intracérébrale d'une sonde de microdialyse pendant environ une heure, suivie d'une acquisition IRM d'une heure. Le porteur indique que la pose de la canule et de la sonde présente un risque de saignement et d'hémorragie, avec douleur post-opératoire et stress liés à la présence de la canule sur le crâne, et précise que la procédure ne permet pas de garder les animaux en vie. Il présente cette approche de chélation des métaux comme une piste thérapeutique contre des maladies neurodégénératives, les bénéfices annoncés restant à valider.

Objectifs

Les objectifs du projet de recherche portent sur le développement, la validation et l’application de nouvelles méthodes pour limiter la présence de métaux indésirables dans le cerveau. Le projet repose sur l’utilisation de molécules capables de capturer (chélater) puis d’extraire un certain nombre de métaux (Al, Fe, Cu, Zn, Mn, Pb,…). L’objectif thérapeutique de cette nouvelle approche de chélation des métaux est d’aider à rétablir l’équilibre en métaux qui se trouve perturbé dans des pathologies neurodénégératives (maladie de Parkinson ou d’Alzeihmer) ou dans des maladies génétiques (accumulation de cuivre dans le cas de la maladie de Wilson). L’efficacité des métodes de chélation sera évaluée par l’analyse de la concentration des métaux à l’aide de l’imagerie par résonance magnétique (IRM).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de la réalisation de ce projet sont la validation de nouvelles stratégies thérapeutiques pour lutter contre les déséquilibres (excès de métaux) présents dans des maladies neurodégénératives (Parkinson, Alzeihmer, huntington), génétique (maladie de Wilson) et lors d’intoxications aiguës ou chroniques liées à des expositions accidentelles à des métaux.

Procédures

Les animaux (64), seront soumis à l’implantation intracérébrale d’une sonde de microdialyse utilisée pour la chélation de cations métalliques durant 1 heure environ. La procédure d’implantation et de dialyse sera réalisée, une seule fois, sous anesthésie générale et sera suivie d’une acquisition IRM sous anesthésie générale également durant 1 heure environ.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables et nuisances attendus et possibles pour les animaux sont les suivants. La pose de la canule présente un risque de saignement avec des effets indésirables de douleur post-opératoire et de stress lié à la présence de la canule sur le crâne de l’animal. L’introduction de la sonde de micro-dialyse présente un risque d’hémorragie. Durant la réalisation des gestes, existent également des risques de déshydratation et de sécheresse oculaire.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure. La procédure subie par les animaux ne permettant pas de les maintenir en vie.

Remplacement

En ce qui concerne l’exigence de remplacement, la validation amont des protocoles de recherche sera réalisée dans la mesure du possible in vitro sur des solutions contenant des métaux à des concentrations similaires à celles rencontrées in vivo. L’ensemble de ces validations en amont permet de réduire le nombre d’animaux qui seront utilisés dans le projet et de s’assurer autant que possible de la pertinence de l’approche avant sa validation in vivo.

Réduction

En ce qui concerne l’exigence de réduction, la spectroscopie et l’imagerie par résonance magnétique (SRM et IRM) sont des techniques qui permettent de suivre longitudinalement l’évolution d’une pathologie ou les bénéfices d’une thérapie. L’imagerie in vivo est clairement reconnue comme une approche permettant de reduire le nombre d’animaux. De plus chaque animal peut être son propre témoin. Ceci permet de réduire fortement le nombre d’animaux nécessaire pour distinguer de façon statistiquement significative deux populations.

Raffinement

Le raffinement des conditions d’hébergement comprend l’installation dans les cages de cachettes, coton, frisures pour nidification en lanières de peuplier ou papier craft afin d’introduire de la nouveauté et briquette à ronger. L’hébergement se fait en groupe (3 rats par cage) durant la période d’acclimatation. L’ensemble des gestes est réalisé sous anesthésie générale par isoflurane avec administration d’antalgique (analgésie multimodale) pré et post-chirurgie pendant 48h. Ceci permet de réduire la douleur ou l’angoisse des animaux et de répondre à l’exigence de raffinement requise pour les protocoles expérimentaux sur animaux. Un tapis chauffant, permettant de maintenir la température des animaux pendant les opérations de chirurgie et les sessions d’imagerie, est utilisé ainsi que l’administration de gel ophtalmique Ocrygel afin de compenser la sécheresse occulaire. Le suivi de la fréquence respiratoire est réalisé lors des sessions d’imagerie ainsi qu’une rehydratation des animaux pendant les gestes chirurgicaux. De la nourriture sous forme de gel (geldiet energy) sera déposée dans la cage après le réveil des animaux. Une fiche de suivi post-opératoire sera utilisée. Les animaux seront suivis quotidiennement. Les gestes sont évalués de classe modérée ou légère. Les expérimentateurs et les soigneurs disposent des formations nécessaires pour répondre à la mise en place des conditions de raffinement.

Choix des espèces

Les rats sont les modèles animaux largement utilisés sur les plateformes d’imagerie IRM dites pré-cliniques. L’instrumentation (microdialyse, antenne RF) et les protocoles IRM pré-cliniques sont bien adaptés à cette espèce animale. Le rat type Wistar sera utilisé dans ce projet. Les animaux sont utilisés à l’âge adulte (entre 3 et 6 mois) afin de faciliter le geste de chirurgie (pose de canule, implantation de la sonde microdialyse).

108 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur ouvre le crâne pour y déposer un implant en céramique, puis on répète l'imagerie au micro-scanner et on injecte un agent pour visualiser les vaisseaux, avant la mise à mort pour analyse. Le porteur décrit des douleurs post-chirurgicales et un protocole d'analgésie sur trois jours, pour comparer des géométries d'implants destinés à combler des pertes osseuses. Il écarte les modèles in vitro et in silico, jugés incapables de reproduire la complexité de la réparation osseuse et sa vascularisation.

Objectifs

La réparation du squelette après perte de substance osseuse demeure toujours un problème lorsque les défauts sont de grande taille. Si le traitement par autogreffe (prélèvement osseux du patient sur un autre site) reste la référence, il a cependant des inconvénients (quantité disponible, morbidité..). Les céramiques à base de phosphates de calcium (CaP) sont une bonne alternative à l’autogreffe osseuse car elles possèdent une composition chimique similaire à la phase minérale de l’os, les rendant biocompatibles et ostéoconductrices (favorisant la repousse osseuse à la surface du matériau) . Cependant, la faible vascularisation et pénétration des tissus néoformés dans les céramiques poreuses en CaP n’en font une solution satisfaisante que pour des défauts de petite taille. L'augmentation de leur efficacité clinique implique une amélioration de leurs propriétés angio- et ostéo conductrices (favoriser l’invasion vasculaire et la formation osseuse). Ces propriétés peuvent être obtenues en modulant les caractéristiques chimiques et architecturales de la céramique. L’architecture des céramiques (comprenant la forme, la porosité, la taille des pores, leur interconnectivité et la surface interne) conditionne le transport de nutriments, la migration cellulaire et tissulaire et la distribution des contraintes de cisaillement. Les techniques récentes de fabrication additive associées à celles de conceptions assistées par ordinateur permettent dorénavant de produire des implants avec des formes externes personnalisées (épousant parfaitement le défaut osseux) ainsi qu'une macro-architecture interne optimisée et reproductible. Ce présent projet fait suite à un précédent projet récemment terminé qui a consisté à évaluer le potentiel de réparation de défauts osseux au niveau du crâne de rat avec des implants à base de céramiques de phosphates de calcium et 2 géométries différentes. Nos résultats, obtenus sur des défauts de taille non critique (5 mm de diamètre) ont montré que les paramètres porosité / taille des pores étaient critiques par rapport à la surface interne. Ce projet a pour objectif de valider ces premiers résultats sur un défaut de taille critique (8 mm de diamètre) et de mieux discriminer l’impact des paramètres (i) porosité, (ii) taille de pores et (iii) surface interne sur la cinétique de l’invasion osseuse. Par ailleurs, nous évaluerons la relation entre formation osseuse, vascularisation et impact de la géométrie des implants.

Bénéfices attendus

De nombreux travaux issus de la littérature ont tenté de déterminer l’impact de certains paramètres géométriques d’implants substitut osseux sur l’invasion osseuse, mais la plupart des études ne tiennent compte que d’un seul paramètre (généralement la taille des pores) ; cette étude permettra de discriminer l’impact de la porosité globale, de la taille des pores et de la surface interne sur l’invasion osseuse et l’invasion vasculaire. Le bénéfice attendu à plus long terme est l’optimisation de la fabrication des implants en biocéramique pour le comblement de grands défauts osseux en remplacement de l’autogreffe.

Procédures

1-Craniotomies latérales et dépôt d’un implant ( 1X ; durée ~40 min) 2- Imagerie micro-scanner (μCT) in vivo (Max 7X; durée 15 min) 3- Injection de fluorochromes (2X, durée 5 min) 4- Infiltration du réseau vasculaire par un agent radio-opaque (1X; durée 30 min)

Impact sur les animaux

Nuisances attendues causées durant les actes expérimentaux : stress dû à la contention puis lors de la perte de connaissance par le gaz anesthésiant; Injection en sous cutané ; Injection en intrapéritonéal (sous anesthésié gazeuse) ; Chirurgie au niveau du crâne (sous analgésie et anesthésie) ; thoratocomie. Nuisances attendues engendrés suite aux expérimentations : douleurs post-chirurgie

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de projet permettant des analyses post-mortem (analyse au scanner à haute résolution de la formation osseuse et du réseau vasculaire pénétré dans le matériau macroporeux + histologie des cranes réparés)

Remplacement

Aucun modèle de néoformation osseuse in vitro n’est disponible aujourd’hui. La cicatrisation osseuse est un processus séquentiel orchestré complexe impliquant l’interaction de nombreuses populations cellulaires différentes : cellules osseuses, cellules vasculaires, cellules du système immunitaire et cellules des tissus environnant tels que le périoste ou le tissu musculaire ; à cela s'ajoute l'impact d'un système hormonal complexe. Les modèles in silico actuels ne peuvent pas reproduire cette complexité cellulaire et moléculaire, d’autant plus que tous les processus intervenants dans la réparation osseuse ne sont pas encore connus. Les modèles in vitro (organoide, co-culture) permettent de reproduire certaines des interactions matrice-cellules ou cellules-cellules, mais n’incluent que 2 ou 3 interactions (cellules osseuses / cellules immunitaires par exemple). Les modèles ex vivo (explants osseux) sont les plus proches de la situation physiologique et permettent d’étudier la physiologie osseuse sur quelques jours. Ces modèles, cependant, sont dénués de système vasculaire qui joue un rôle clé dans la réparation osseuse. Pour toutes ses raisons les alternatives non animales actuellement disponibles ne sont pas appropriées pour étudier la réparation osseuse et il est nécessaire d’avoir recours à un modèle in vivo.

Réduction

Le suivi de la formation osseuse seront réalisées sur les mêmes animaux par imagerie in vivo. Le suivi de la vascularisation aux temps précoces ne se fera qu’à 2 et 4 semaines et que sur 2 groupes (1 seule géométrie et défaut vide). Ces études nécessiteront 10 animaux par groupe compte tenu des variations de résultats pouvant être observées dans les études in vivo, de cassures de l’implant, et de l’étape de perfusion vasculaire qui, parfois faillit en ne remplissant pas parfaitement le réseau vasculaire, notamment les capillaires. Pour les analyses statistiques, nous effectuerons les tests adéquats après test de normalité.

Raffinement

Les rats initialement hébergés ensemble (3 rats/cage) le resteront du début à la fin du protocole et bénéficieront d’une période d’acclimatation de 7 jours avant le début de la procédure expérimentale. Un analgésique leur sera administré avant chaque intervention chirurgicale laquelle sera faite sous anesthésie générale. Des injections bi quotidiennes d’analgésique en sous cutanée seront aussi pratiquées pendant les 3 jours post opératoires. Pour chaque analyse en imagerie, les rats seront anesthésiés par voie gazeuse. L’acte terminal nécessitera des doses élevées d’analgésie et d’anesthésie afin que l’animal soit en condition péri-mortem.

Choix des espèces

Le modèle choisi est le rat male WISTAR (non-syngénique). Le rat est un bon compromis entre la souris (trop petite pour obtenir un défaut de taille suffisante pour l’évaluation d’implants massifs) et le lapin (couteux et trop gros pour permettre un suivi en imagerie micro-scanner in vivo). De plus, le modèle de défaut au niveau de la calvaria est bien décrit dans la littérature et autorise la réalisation de défauts reproductibles et contrôlés. Jeunes adultes (3 mois) car de taille suffisamment importante pour permettre l’implantation en site osseux et leur phase de croissance est terminée.