Rats

Une injection dans la patte arrière provoque un œdème et une douleur qui dure de deux à sept jours, puis la voûte plantaire est soumise à un stimulus mécanique ou thermique jusqu'au retrait de la patte, à huit reprises en soixante-douze heures. 133 rats mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue pour des prélèvements terminaux, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'objet est de tester si un antihistaminique ancien, la mépyramine, encapsulé dans des nanoparticules, soulage durablement cette douleur après une seule injection. Le porteur qualifie ces mesures de "tests comportementaux non invasifs", tout en décrivant un stimulus qui "va déclencher une douleur légère à modérée provoquant le retrait spontané de la patte".

Objectifs

Les douleurs liées à l’inflammation (arthrites, tendinites, douleurs post-opératoires) sont très fréquentes et souvent traitées par des médicaments anti-inflammatoires ou des antidouleurs puissants (morphine et dérivés), dont l’usage prolongé expose à des effets indésirables et à un risque de dépendance. Ce projet étudie une nouvelle façon d’administrer un médicament antihistaminique connu depuis longtemps, la mépyramine, dont on a récemment découvert qu’il bloque des récepteurs impliqués dans la transmission de la douleur. Ce médicament est encapsulé dans des nanoparticules (NPs) qui permettent de le protéger, de le libérer progressivement et de prolonger son effet. Une autre nanoparticule, appelé hybride, associera la mépyramine à une morphine endogène naturellement produite par l’organisme pour soulager la douleur, afin de tester si la combinaison des deux est plus efficace. L’objectif est de vérifier, chez le rat, si ces nanoparticules permettent de soulager durablement la douleur liée à une inflammation, d’abord dans un modèle d’inflammation de courte durée (2-3 jours), puis, si les résultats sont positifs, dans un modèle d’inflammation plus durable (une semaine).

Bénéfices attendus

Si les résultats sont positifs, ce projet montrera qu’un médicament déjà connu, la mépyramine, reformulé sous forme de nanoparticules, peut soulager durablement la douleur d’inflammation après une seule injection, par un mécanisme différent de celui de la morphine et de ses dérivés. Cela ouvrirait la voie à de nouvelles options de traitement de la douleur inflammatoire, permettant de limiter le recours aux antidouleurs opioïdes et leurs effets indésirables (tolérance, dépendance), pour des pathologies très répandues (arthrites, douleurs post-opératoires). La combinaison avec la Leu-enképhaline, molécule naturelle de l’organisme impliquée dans le soulagement de la douleur, pourrait permettre de renforcer cet effet tout en utilisant de plus petites quantités de chaque substance. Ces résultats fourniront des données précliniques de preuve de concept et constitueront une étape importante avant d’envisager le développement clinique de ce type de traitement chez l’Homme (option analgésique périphérique non opioïde).

Procédures

80 rats seront soumis à : - trois injections sous anesthésie générale (quelques secondes par injection) - des tests comportementaux non invasifs sur animal vigile avec des mesures répétées sur les deux pattes, à 8 reprises sur 72 heures. Chaque mesure dure 10 à 20 secondes. 53 rats seront soumis à : - trois à sept injections maximum sous anesthésie générale (quelques secondes par injection, maximum une injection par jour), - des tests comportementaux non invasifs sur animal vigile avec des mesures répétées sur les deux pattes, à 6 reprises sur 7 jours. Chaque mesure dure 10 à 20 secondes.

Impact sur les animaux

Dans le modèle d’inflammation modérée de courte durée, les animaux développent un œdème local et une sensibilité douloureuse de la patte injectée (boiterie discrète, léger léchage de la patte), maximales entre 3 et 24 heures et résolutives en 48 à 72 heures. Aucune altération de l’état général, de la prise alimentaire ou du poids n’est habituellement observée à ces doses. Le modèle d’inflammation persistant induit un œdème plus marqué et plus durable, associé à une sensibilité douloureuse de la patte injectée, persistant sur toute la durée de la procédure (7 jours). Une boiterie modérée et une diminution transitoire de l’appui sur la patte affectée sont attendues. Une légère baisse de la prise alimentaire peut survenir dans les 48 premières heures. La voute plantaire des pattes arrière du rat sera soumise à un stimulus mécanique ou thermique, qui va déclencher une douleur légère à modérée provoquant le retrait spontané de la patte, l’animal n’étant pas contraint. L’anesthésie (pour réaliser les injections) entraînent un léger stress lié à la perte de conscience.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue de leur procédure. Cette mise à mort systématique est justifiée par la nécessité de réaliser des prélèvements terminaux (sang et organes) indispensables aux analyses.

Remplacement

Comprendre comment un médicament soulage la douleur nécessite d’observer un comportement chez un animal possédant un système nerveux complet : aucune méthode alternative (cultures cellulaires, simulations informatiques) ne permet aujourd’hui de remplacer complètement cette étape. Avant d’en arriver à l’animal, des études en laboratoire (sur des cellules et sur les nanoparticules elles-mêmes) ont déjà permis de vérifier que les médicaments conservent leur activité une fois encapsulés, et de choisir les formulations les plus prometteuses, limitant ainsi le nombre de produits testés chez l’animal. Aucune méthode de remplacement total n’est donc disponible à ce stade pour atteindre l’objectif scientifique du projet, à savoir démontrer in vivo l’efficacité analgésique périphérique et prolongée des nanomédicaments étudiées dans un contexte de douleur inflammatoire.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé au plus juste sur la base de tests statistiques pour obtenir des résultats fiables, en se basant sur l’expérience d’études similaires. Le projet est organisé en deux étapes : un premier test rapide (modèle de douleur transitoire, quelques jours) permet de vérifier si les nanoparticules sont efficaces avant de poursuivre, le cas échéant, avec un second test plus long (modèle de douleur persistante, une semaine). Si une formulation ne fonctionne pas lors du premier test, elle ne sera pas testée une seconde fois, ce qui évite d’utiliser des animaux pour des produits inefficaces. Chaque animal sera également son propre témoin, grâce à la comparaison entre la patte traitée et la patte non traitée, ce qui améliore la fiabilité des résultats sans augmenter le nombre d’animaux.

Raffinement

Les animaux sont habitués à la manipulation et aux tests avant le début de l’expérience pour limiter leur stress le jour de la procédure. Toutes les injections sont réalisées par du personnel formé, sous une courte anesthésie générale. Un suivi clinique quotidien sera assuré par les expérimentateurs, avec des points limites permettant une intervention précoce en cas de signe de souffrance excédant les attendus du modèle. Les tests comportementaux seront réalisés dans une salle calme, par le même expérimentateur, afin de limiter le stress lié à la manipulation et la variabilité des mesures. Les animaux sont logés dans des cages aménagées, en groupes, avec accès libre à l’eau et à la nourriture, dans un environnement enrichi afin de favoriser le bien-être animal. L'accès à la nourriture et à l'eau sera facilité pendant la période où les animaux présentent une gêne locomotrice.

Choix des espèces

Le rat est l’espèce de référence pour les tests de douleur utilisés dans ce projet (mesure de la sensibilité de la patte). Sa taille permet des mesures précises et répétées. Des rats adultes jeunes (8 à 12 semaines), mâles, seront utilisés : ce stade correspond à un système nerveux et immunitaire matures, garantissant des réponses stables et comparables aux études antérieures.

Un prestataire de services en recherche préclinique vend l'évaluation de candidats médicaments sur des rats à qui il greffe une tumeur dans la vessie, protocole qu'il doit d'abord mettre au point : 1 200 rats vont être utilisés sur cinq ans, tous tués en fin d'étude parce qu'ils portent des tumeurs, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Chaque rat reçoit un transpondeur sous la peau, subit une chirurgie d'induction tumorale de moins d'une heure trente, puis une seconde chirurgie pour poser un cathéter dans la vessie, et reste isolé de un à dix jours pendant l'infusion du traitement, opération répétable. Les effectifs par groupe vont de trois à quinze rats selon les paramètres évalués. À cela s'ajoutent jusqu'à 30 % de rats supplémentaires, prévus parce que les deux chirurgies sont "des phases critiques techniquement complexes".

Objectifs

En 2020, le GLOBOCAN estimait à environ 573 000 nouveaux cas de cancer de la vessie dans le monde; en 2022, les estimations dépassent 600 000 cas. Ce cancer est parmi les dix plus fréquents, avec de fortes disparités régionales et une prévalence nettement plus élevée chez les hommes; l’incidence est largement liée au tabagisme et augmente dans régions en lien avec vieillissement. L’objectif global de ce projet est d’améliorer la prise en charge clinique au travers du développement de nouvelles thérapies efficaces contre ce type de cancer par l’intermédiaire d’un modèle préclinique pertinent : - Comprendre la biologie : mécanismes moléculaires, voies de signalisation, hétérogénéité tumorale et résistance aux traitements. - Découvrir des cibles et biomarqueurs : identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et des marqueurs pronostiques/prédictifs. - Développer et optimiser des traitements : criblage de petites molécules, anticorps, immunothérapies, thérapies combinées et stratégies de délivrance locale (instillations intravésicales). - Évaluation de la toxicité et pharmacocinétique : sécurité systémique et locale avant essais cliniques. - Réduction des échecs en clinique : validation robuste des hypothèses pour mieux sélectionner candidats et schémas thérapeutiques. - Individualisation des soins : tests ex vivo (organoïdes, cultures primaires) pour prédire réponse et guider thérapie personnalisée. - Aspects translationnels et réglementaires : définir biomarqueurs d’effet, critères d’inclusion pour essais et preuves préalables exigées par autorité L’objectif de ce projet est de développer un modèle de cancer de vessie chez les rongeurs (rats), le plus prédictif possible afin de refléter la pathologie cancéreuse et de pouvoir évaluer des composés thérapeutiques dans un contexte pathologique le plus proche possible de l’homme et d’arriver, avant les essais cliniques, à établir une réelle évaluation de l’efficacité de molécules destinées à traiter les tissus cancéreux localisés chez l’homme. Une fois le modèle établi, une évaluation complète des candidats médicament pourra aussi être réalisée avant de lancer un potentiel essai clinique chez l’homme.

Bénéfices attendus

Notre société, prestataire de services en recherche préclinique propose un panel de modèles in vivo nécessaires à l’évaluation de nouveau composés thérapeutiques pour la recherche contre le cancer. Ce projet a pour finalité de sélectionner des molécules thérapeutiques grâce à des modèles précliniques les plus prédictifs possibles afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représentent un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux candidats médicament préalablement aux essais qui pourraient être ensuite mené chez l’homme. Au cours des expériences réalisées, il sera possible d’étudier les mécanismes de croissance d’une tumeur dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme, d’étudier les mécanismes de résistance après des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique, et les mécanismes de progression tels que la formation de métastases et également les voies d’administration telles que le mise en place d’un cathéter intra vésical par voie antérograde mime déjà pratiqué chez l’homme. Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi par exemple possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre le cancer

Procédures

L’implantation de transpondeur pour identifier l’animal sous la peau est réalisée sous anesthésie générale 0-3 jours avant le début de l’étude (inférieur à 5min). Chirurgie permettant l’induction tumorale est réalisée sous anesthésie générale (inférieur à 1h30). Avant les traitements, les animaux sont sélectionnés pour former des groupes homogènes en poids et/ou volume tumoral (stress léger durant 1 à 2 jours). Au cours des études, des méthodes d’imagerie non invasives peuvent être réalisée, potentiellement après un transport (inférieur à 2h). Des méthodes d’imagerie non invasives (indolore) pourront être réalisées sous anesthésie générale (inférieur à 1h). Mise en place d’un cathéter par chirurgie nécessaire à la mise en œuvre des traitements sera réalisée sous anesthésie générale (inférieur à 1h30). Les animaux seront traités par un système d’infusion continue nécessitant le recours à l’isolement temporaire des animaux durant le traitement (1 à 10 jours répétable). La palpation des tumeurs nécessitera une contention des animaux (inférieur à 30s, stress léger). Des prélèvements de sang, pourront être faits sous anesthésie générale . Des prélèvements d’urine pourront être réalisés en hébergeant individuellement les animaux moins d’une heure ou par légère pression sur le ventre sous contention (inférieur à 5min, stress léger). En fin d’étude, tous les animaux sont euthanasiés

Impact sur les animaux

La chirurgie d’induction tumorale pourra engendrer une douleur modérée sur 1-2j et un stress modéré. Un traitement antidouleur sera appliqué aux animaux durant cette période. Le développement de la tumeur dans la vessie pourra également engendrer une gêne. L’implantation chirurgicale d’un cathéter dans la vessie pour la mise en œuvre des traitements pourra engendrer une douleur modérée sur 1-2j et un stress modéré. Un traitement antidouleur sera appliqué aux animaux durant cette période. Les animaux seront maintenus en hébergement individuel durant le temps d’infusion, ce qui pourra engendrer un stress léger. Les périodes de traitements pourront engendrer un stress modéré. Les technique d’imagerie non invasive (IRM ou bioluminescence) pourront induire un stress léger. Au cours d’une étude, les animaux seront manipulés. Les mesures de poids et de volume tumoral pourront entraîner un stress que l’on peut considérer comme faible, et qui diminue avec l’habituation.

Devenir

Du fait que les animaux sont porteurs de tumeurs, ils seront tous mis à mort en fin de procédure

Remplacement

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte global ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais sont toutefois marginales

Réduction

Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon les critères définis dans l’étude. Le nombre de groupes sera ajusté à la question scientifique posée et aux paramètres étudiés. Les variations de ces paramètres et de la mortalité entre les groupes contrôles et traités seront comparées pour évaluer les composés testés. La validité scientifique nécessite d’utiliser un nombre minimum d’animaux par groupe pour que les tests statistiques soient valides et représentatifs d’éventuelles variations inter-individus. L’analyse statistique sera effectuée au moyen d’un test d'analyse de la variance (ANOVA). Une étude peut être composée de 2 à 10 groupes (au minimum un groupe avec tumeur, non traité et un groupe avec tumeur, traité; plusieurs groupes traités possibles pour évaluer différents traitements, doses etc). Le nombre d’animaux par groupe variera généralement entre 3 (biodistribution) à 15 (dans le cas de multiples paramètres d’efficacité à évaluer) par dose de produit. Jusqu’à 30% d’animaux excédentaires pourront être inclus initialement pour la mise en place du modèle au moment des chirurgies avant la sélection des animaux. La chirurgie d’implantation du cathéter et d’induction tumorale sont des phases critiques techniquement complexes qui nécessitent un nombre d’animaux excédentaires prenant en compte la complexité de la mise en place du modèle. Avec la pratique et l’amélioration continue des techniques, ce nombre pourra être réduit au cours du temps. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal

Raffinement

La chirurgie d’induction tumorale et l’implantation du catheter par chirurgie en intravesicale sont réalisées sous anesthésie générale avec couverture analgésique (antidouleur) durant toute la procédure et durant les 3 jours suivants celle-ci. Les chirurgies seront réalisées de façon aseptique, avec maintien de la température corporelle et surveillance jusqu’au réveil. Les chirurgies seront effectuées le matin pour surveiller les animaux durant la journée après leur réveil. L’induction tumorale et l’implantation du cathéter pourront se faire au cours de la même chirurgie. Dans le cas où l’induction tumorale et la mise en place du cathéter ne sont pas réalisés en même temps, un délai compris entre 5 et 12 jours devra être respecté avant la seconde intervention chirurgicale. La seconde intervention chirurgicale sera menée sous l’autorité du vétérinaire de l’établissement afin de s’assurer que les animaux est bien eu le temps nécessaire pour récupérer de la première intervention. Les prélèvements de sang seront effectués suivant les recommandations vétérinaires (anesthésie, volume, fréquence, antalgie). Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître les signes de souffrances et les points limites. Les personnes en charge du bien-être et du soin des animaux veillent au respect des points limites. Pour raffiner, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et de l’imagerie faiblement invasives permettant d’atteindre l’objectif plus tôt et de sortir l’animal de la procédure. Un enrichissement adapté aux animaux sera disposé dans chaque cage d’aniamux. Des animaux adultes seront utilisés. Une évaluation précise de l’état sanitaire des animaux sera mis en place de manière individuelle à l’apparition des premiers signes cliniques d’évolution de la maladie. Dans toutes les cages, une nourriture adaptée et de l’eau gélifiée seront rajoutés, la quantité de nourriture en fond de cage sera augmentée en fonction des besoins des animaux. Les scores cliniques les plus élevés, l’accumulation de scores intermédiaires et les pertes de poids élevées ou prolongées constitueront des points limites à l’experience.

Choix des espèces

Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines dans le cadre de la recherche en oncologie. De plus, les rats autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7-8 semaines lors de leur première manipulation). Des animaux adultes sont utilisés afin qu’ils aient leur poids et leur morphologie adulte pour faciliter l’injection des cellules tumorales et l’implantation du cathéter en intra vésical. Les animaux adultes pourront mieux supporter les effets secondaires des composés à tester. Les effets du développement tumoral sera plus facilement supporté par des animaux adultes.

120 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent un traitement par voie orale vingt jours cumulés, jusqu'à cinq jours par semaine, subissent des régimes pauvres en sodium ou riches en potassium pendant trente jours au plus, passent cinq jours consécutifs en cage individuelle pour le recueil des urines, et voient leur pression artérielle mesurée cinq fois de suite par un ballonnet gonflé sur la queue. L'administration orale peut irriter leur œsophage, le régime et les traitements faire perdre du poids et modifier la mobilité, l'hébergement individuel provoquer un stress social. Cette recherche est fondamentale, et le porteur écrit avoir "besoin de réaliser des expériences in vivo chez le rat" parce qu'il juge impossible de recréer in vitro la complexité d'un "organisme entier".

Objectifs

L'hypertension arterielle et ses complications cardiovasculaires et rénales a une très forte prévalence en Europe et augmente avec l'age pour atteindre près de 50 pour cent après 60 ans. L'hypertension arterielle participe au cercle vicieux liant insuffisance rénale chronique (IRC) et pathologies cardiovasculaires. Il est important de comprendre les mécanismes sous-jacents des interactions entre vaisseaux, rein et coeur et d’identifier des thérapeutiques permettant de limiter ces comorbidités. Les données recueillies chez l’Homme et l’animal montrent que l’aldostérone, une hormone produite par les glandes surénales, joue un rôle important et induit inflammation et fibrose tissulaire, ce qui joue un rôle critique dans le remodelage rénal et cardiaque induit par l'hypertension artérielle. L'aldostérone a également un role crucial dans la balance hydrosodée, régulant l'excretion rénale de sodium et potassium. Les objectifs du projet sont d'étudier les conséquences de l'inhibition de la synthèse d'aldosterone par un nouvel inhibiteur spécifique de l'aldosterone synthase sur la balance hydrosodée et la pression artérielle

Bénéfices attendus

L’insuffisance rénale chronique (IRC) dont la prévalence est d’environ 10 pour cent en europe, selon les pays, a des conséquences cardiovasculaires majeures avec une morbidité et mortalité importantes ce qui représente un cout sociétal considérable. Le nombre de décès liés à l’IRC est estimé à 1,5 million dans le monde et est la 5ieme cause de perte d’année de vie. La proportion de sujets en France ayant une qualité de vie altérée variait de 20 à 50 pour cent dans les dimensions à composante physique selon le degré d’IRC. Disposer d'un modèle rongeur permettant de tester les bénéfices éventuels d'un inhibiteur de la synthase d'aldosterone serait une avancée therapeutique potentielle

Procédures

Les animaux sont soumis à diverses interventions. Certains animaux seront mis sous régimes spéciaux (animal vigile) pendant un maximum de 30 jours pour chaque serie expérimentale. Les animaux seront soumis à une administration orale d'un traitement sur animal vigile, 20 jours maximum cumulés, 1 minute par geste, par periode de 5 jours par semaine, avec une periode de repos de 2 jours, puis une semaine entre les protocoles nourriture controle puis nourriture pauvre en sodium ou riche en potassium. Il est réalisé par une personne formée à cet acte. Pour le recueil des urines (3 fois pendant 8h, une fois pendant 24h) un hébergement individuel temporaire est nécessaire (animal vigile). Il est réalisé 5 jours consécutifs (animal vigile) pendant 4 périodes selon le protocole avec des temps de repos de 2 jours entre chaque période. Certains animaux ont une injection (1 fois, 1 minute, animal vigile). La mesure de la pression artérielle est réalisée cinq fois sur 5 jours consécutif pendant 15 min (animal vigile). Elle consiste à placer un ballonnet gonflable sur la queue de l’animal puis à mesurer la pression du ballonnet à laquelle le pouls est de nouveau perçu. L’euthanasie est réalisée selon une méthode réglementaire en fin de période expérimentale après prélèvement sanguin sous analgésie et anesthésie (1 fois, quelques minutes).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables notoires seront 1) la douleur et le stress de contention lors de l'administration orale avec irritation possible de l'oesophage , 2) les conséquences de changement de la pression artérielle (perte de poids, perte d’appétit, diurèse augmentée) 3) le régime alimentaire spécial et les traitements peuvent entrainer une perte de poids et modifier la mobilité et le comportement des animaux, 4) l’hébergement individuel temporaire dans les cages à métabolisme pourra engendrer un stress social mais les animaux seront dans la même pièce que leur congénères 5) le stress lié à la manipulation et la contention durant l'administration du traitement et la prise de pression artérielle 6) le stress et la douleur légère de courte durée au site d'injection 7) le stress et la douleur légère de courte durée au site de prélèvement de sang avec un risque minime d'hémorragie

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure car des analyses biochimiques sanguines (composition, molécules pro-inflammatoire) ainsi que des analyses sur organes prélevés sont obligatoires pour mener à bien ce projet.

Remplacement

Cette recherche est de type fondamentale. Nous avons besoin de réaliser des expériences in vivo chez le rat afin de pouvoir confirmer nos données obtenues in vitro (spécificité de l'antagoniste aldosterone synthase (ASI) dans des cellules de surrénale). Cette étude ne peut être conduite qu'in vivo car il n’y a pas de modèles alternatifs pour l’étude intégrée et multi-organes de l’activation du récepteur minéralocorticoïde par l'aldostérone et de la signalisation sous-jacente dans l'hypertension artérielle. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires entrant en jeu

Réduction

Nous avons d'abord fait une étude de la littérature (ainsi qu'une estimation grâce à un algorithme fournis par un logiciel) pour s'assurer de la faisabilité du projet ainsi que pour estimer le nombre d'animaux nécessaire pour qu'on puisse mettre en évidence des différences statistiques entre les résultats de nos différents groupes. Pour la réalisation de cette étude, nous utiliserons des groupes de 10 rats males ou femelles pour permettre une évaluation statistique solide des effets analysés. Nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si les expériences initiales ne confortent pas l’hypothèse de travail. Le nombre total d’animaux sera de 120 rats

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation avec un cycle jour nuit automatique: les animaux sont hébergés avec leurs congénères en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès à volonté à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec un des enrichissements ci-après: carré de lanière kraft et batonnet en bois. Un enrichissement pour se cacher et grimper pourra être ajouté (tunnel, hutte ou équivalent en PVC ou autre). Les conditions de températures et d’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les animaux sont vérifiés quotidiennement. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive, des soins adaptés. La prise alimentaire sera contrôlée pendant les traitements et les analyses métaboliques. Enfin, certaines analyses cardiovasculaires seront réalisées après habituation, afin de réduire le stress des animaux. Des points limites suffisamment précoces ont été définis. Pour réduire les nuisances les actions suivantes seront réalisées: le comportement des animaux sera surveillé attentivement, en référence à une grille de scoring de l’animalerie. Les rats sont maintenus 2 par cage au minimum (ça dépend de leur poids, nous suivons les recommandations de la réglementation française). Une période d’acclimatation réglementaire de 7 jours est respectée si les animaux proviennent d’un fournisseur extérieur.

Choix des espèces

L'espèce rat a été choisie car c'est un modèle établi pour le développement de l'hypertension et maladies cardiovasculaires et rénales. De plus nous disposons d'un modèle de rats génétiquement modifiés Les animaux sont utilisés à l’âge adulte (7 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé. Les animaux contrôles sont les littermates (frères et soeurs des même portée) non transgéniques donc élevés au même endroit.

Le choix entre le rat et la souris dépend des demandes des clients de l'entreprise : 3 140 souris et 3 140 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour des prélèvements post-mortem, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un inducteur chimique ou une exposition hormonale déclenche chez les femelles un syndrome des ovaires polykystiques, avec des administrations jusqu'à deux fois par jour pendant dix-huit semaines, un régime gras pendant dix semaines, des frottis vaginaux quotidiens et des chirurgies de trente minutes, ovariectomies, implantation de pellets, injections intra-ovariennes ou intracérébroventriculaires. Le porteur indique que ces dernières peuvent entraîner des lésions, que des composés sont administrés à des nouveau-nés non sevrés au risque que la mère les rejette, et que le syndrome induit peut faire apparaître insulinorésistance, diabète et hypertension artérielle. Rien ne fonde l'effectif de ces 6 280 souris et rats, il écrit : "Aucun test statistique pour déterminer la taille des lots n'a été fait".

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer les effets de candidats médicaments dans un modèle mimant le syndrome des ovaires polykystiques (SOPK) chez le rongeur.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patientes atteintes du syndrome des ovaires polykystiques. En effet, actuellement, les traitements utilisés sont uniquement symptomatiques et l’évaluation de candidats médicaments traitant la pathologie dans son ensemble (origine du dysfonctionnement hormonal) serait bénéfique. L’UTILISATION DE DIFFÉRENTS INDUCTEURS DANS LES MODÈLES EXPÉRIMENTAUX DE SYNDROME DES OVAIRES POLYKYSTIQUES (SOPK) CHEZ LE RONGEUR PRÉSENTE UN INTÉRÊT MAJEUR, CAR AUCUN MODÈLE NE REPRODUIT À LUI SEUL L’ENSEMBLE DES COMPOSANTES ENDOCRINIENNES, REPRODUCTIVES, OVARIENNES ET MÉTABOLIQUES DU SYNDROME HUMAIN. LE PHÉNOTYPE OBTENU DÉPEND NOTAMMENT DE LA NATURE ET DE LA DOSE DE L’INDUCTEUR, DE SA VOIE D’ADMINISTRATION, DE L’ÂGE AUQUEL DÉBUTE L’EXPOSITION, DE LA DURÉE DU TRAITEMENT, AINSI QUE DE L’ESPÈCE, DE LA SOUCHE ET DU RÉGIME ALIMENTAIRE UTILISÉS. CES PARAMÈTRES DOIVENT DONC ÊTRE PRIS EN COMPTE LORS DE LA SÉLECTION ET DE L’INTERPRÉTATION D’UN MODÈLE EXPÉRIMENTAL.

Procédures

Les animaux pourront recevoir des traitements de candidats médicaments et/ou D’INDUCTEUR DE LA PATHOLOGIE par différentes voies d’administration pendant maximum 18 semaines de façon biquotidienne AU MAXIMUM POUR LES VOIES D’ADMINISTRATION CLASSIQUES. Les administrations étant réalisées par du personnel expert, ces gestes dureront de 30 sec à 1 min environ. CERTAINES ADMINISTRATIONS NECESSITERONT UNE CHIRURGIE SOUS COUVERTURE ANESTHESIQUE ET ANALGESIQUE ADAPTEE (ENVIRON 30 MIN DE CHIRURGIE). Les animaux seront pesés régulièrement (à chaque administration à minima, 30 SEC POUR REALISER CE GESTE) et pourront être mis sous régime gras type « high fat » pendant maximum 10 semaines, subir DES CHIRURGIES selon le protocole expérimental (environ 30 minutes de chirurgie). Des frottis vaginaux seront réalisés afin de connaître le cycle oestral des animaux, au maximum un frottis quotidien. Il faut environ 30 sec pour faire un frottis par animal. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours de l’étude avec de petits volumes (1 GOUTTE POUR DES ANALYSES BIOLOGIQUES) ou des volumes un peu plus importants pour les études de pharmacocinétique PAR EXEMPLE OU AUTRE. Un prélèvement sanguin de petit volume durera environ 30 sec 1 minute. La fréquence et le volume dépendront des demandes. Cependant, les prélèvements seront effectués en concertation avec le responsable éthique de l’entreprise et en total respect de la réglementation internationale et européenne. Un prélèvement sanguin terminal plus important sera réalisé sous anesthésie ou sédation (environ 1 min pour prélever le volume terminal). Des tissus (ovaires, cerveau, tissu adipeux, utérus...) seront prélevés à la fin de l’expérimentation.

Impact sur les animaux

Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux dues aux candidats médicaments. Toutefois, des manipulations, administrations répétées, prélèvements de sang, anesthésies sur les animaux peuvent provoquer du stress, une légère douleur (douleur de l’aiguille). Ce modèle agit essentiellement sur le système endocrinien des animaux pouvant provoquer un dérèglement hormonal influençant leur comportement. De plus, dans ce modèle, une insulinorésistance, du diabète ainsi qu’une hypertension artérielle peuvent apparaître, augmentant ainsi le risque de maladies métaboliques et cardiovasculaires. Les contentions et administrations de substances répétées pourront générer du stress chez les animaux. De plus, certaines étapes du protocole pourront entraîner une douleur légère ou modérée (au point d’injection de l’aiguille, lors des chirurgies (implantation de pellets, ADMINISTRATIONS INTRA-OVARIENNE OU INTRACEREBROVENTRICULAIRE, ovariectomie). L’ADMINISTRATION DE COMPOSES CHEZ DES NOUVEAU-NES NON SEVRES PEUT INDUIRE UN STRESS AUX ANIMAUX, UN MAL-ETRE POUR LA FEMELLE ALLAITANTE QUI PEUT REJETER LES NOUVEAU-NES. L’ADMINISTRATION INTRACEREBROVENTRICULAIRE PEUT ENTRAINER DES LESIONS SUR LES ANIMAUX. UNE OBSERVATION RENFORCEE DU COMPORTEMENT DES ANIMAUX SERA REALISEE POUR DETECTER TOUT SIGNE D’ATTEINTE NEUROLOGIQUE.

Devenir

A l’issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés car des prélèvements tissulaires post-mortem seront réalisés.

Remplacement

Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique efficace pour le traitement du syndrome des ovaires polykystiques. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. En effet, aucun de ces modèles ne peuvent mimer le dysfonctionnement hormonal de cette pathologie en tenant compte des différents organes intervenants et des multiples hormones, sachant que le paramètre hormonal est primordial pour cette pathologie. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.

Réduction

Nous avons établi une stratégie d’expérimentation nous permettant, dans la mesure du possible, de mesurer la valeur basale de chaque animal pour les paramètres sanguins (l’animal est son propre contrôle). Cette stratégie permet donc de réduire sensiblement le nombre d’animaux par groupe. Ce modèle étant nouveau pour nous, une ou deux études pilotes pour mettre au point le modèle seront nécessaires dans un premier temps (test sur un nombre restreint d’animaux). Aucun test statistique pour déterminer la taille des lots n’a été fait mais en considérant la variabilité interindividuelle des animaux (et en accord avec ce qui a déjà été publié par des équipes scientifiques et leurs résultats obtenus) nous conduit à dimensionner les groupes de traitement avec des effectifs de 8-10 animaux par groupe afin d’envisager des différences statistiquement significatives entre les groupes de traitement. Ce projet nécessite l’utilisation de femelles gestantes et seuls les nouveau-nés femelles seront gardés pour la suite des procédures expérimentales. Les nouveau-nés mâles pourront être utilisés pour d’autres dap (formation aux gestes techniques par exemple), permettant ainsi de diminuer l’utilisation du nombre d’animaux. Ce projet étant nouveau, il nous semble que 3 études par an soit une estimation raisonnable par rapport à nos autres modèles et aux demandes de nos clients.

Raffinement

En accord avec la règle de raffinement, les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale avec maintien de la température corporelle via l’utilisation de plaque chauffante thermo-régulée. Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et un enrichissement sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de point limite à savoir prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure, … Pour chaque intervention chirurgicale, les animaux sédatés seront placés sur des plaques chauffantes thermorégulées afin d’éviter toute hypothermie et recevront un analgésique (type buprénorphine) afin de limiter la douleur post-opératoire et un gel ophtalmique sera utilisé. Après chaque intervention chirurgicale, une attention particulière sera apportée sur le réveil des animaux et l’absence d’agressivité vis-à-vis de leurs congénères. L’ADMINISTRATION DE COMPOSES CHEZ DES NOUVEAU-NES NON SEVRES PEUT INDUIRE UN STRESS AUX ANIMAUX, UN MAL-ETRE POUR LA FEMELLE ALLAITANTE QUI PEUT REJETER LES NOUVEAU-NES. UNE MANIPULATION PARTICULIERE DES NOUVEAU-NES SERA REALISEE AFIN DE LIMITER AU MAXIMUM UN REJET POSSIBLE DE LA MERE (CHANGEMENT DE GANTS ENTRE CHAQUE CAGE, FROTTER LES GANTS SUR LA LITIERE AVANT DE MANIPULER LE PETIT POUR CONSERVER L’ODEUR, REMETTRE LE PETIT CONTRE SA MERE, GESTE RAPIDE, ATTENTION PARTICULIERE POUR MAINTENIR LE PETIT AU CHAUD…). AUGMENTATION DE L’OBSERVATION DES ANIMAUX SUITE A UNE ADMINISTRATION INTRACEREBROVENTRICULAIRE POUR VOIR SI DES TROUBLES NEUROLOGIQUES APPARAISSENT.

Choix des espèces

LE SOPK DEBUTANT A L’ADOLESCENCE LORS DE LA PUBERTE, LE MODELE INDUIT PAR UN INDUCTEUR CHIMIQUE SERA REALISE SUR DES ANIMAUX ADULTES OU PREPUBERES (3 SEMAINES). DE CE FAIT, NOUS UTILISERONS DES ANIMAUX AGES D’AU MOINS 3 SEMAINES (ANIMAUX LIVRES AVEC LEUR MERE CAR LE SEVRAGE NE SERA PAS TERMINE). POUR LE MODELE D’EXPOSITION AUX HORMONES, NOUS UTILISERONS DES FEMELLES GESTANTES DE 2-3 MOIS OU NON GESTANTES AGEES DE 4 SEMAINES MINIMUM (FEMELLES PREBUBERES OU ADULTES SELON LES MODELES), ET DES NOUVEAU-NES FEMELLES AGES DE 10 JOURS MINIMUM. SELON LE MECANISME D’ACTION ET LA CIBLE DU CANDIDAT MEDICAMENT, LE RAT ET/OU LA SOURIS POURRONT ETRE UTILISES. LE CHOIX DU MODELE UTILISE SERA DEPENDANT DES DEMANDES CLIENTS CAR LES MODELES SOPK INDUITS PAR UN INDUCTEUR CHIMIQUE OU PAR EXPOSITION HORMONALE SONT BIEN DECRITS DANS LA LITTERATURE CHEZ LES DEUX ESPECES. LE CHOIX DES MODELES DEPEND DE L’OBJECTIF DE L’ETUDE.

168 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Des particules de cobalt radioactif leur sont instillées dans la trachée sous anesthésie, puis ils reçoivent soit des expectorants par gavage deux fois par jour pendant trois jours, soit un aérosol de solution saline très concentrée, enfermés vigiles par deux ou trois pendant quinze minutes, avant quatre jours en cage à métabolisme sur grille. Le porteur annonce une irritation de la trachée, une altération des cordes vocales et une perturbation de la ventilation pulmonaire, et écrit que ces rats "devenus irradiant à cause du cobalt radioactif incorporé ne pourront pas être replacés". Il justifie le recours aux rats en écrivant que "La réalisation de ce projet nécessite des études à l'échelle de l'organisme entier donc chez l'animal", l'objectif étant de protéger les opérateurs de centrales nucléaires ayant inhalé de telles particules.

Objectifs

Au sein de composants situés à proximité du réacteur d’une centrale nucléaire, des particules d’oxyde de cobalt peuvent se former puis devenir radioactives. Lors de chantiers de maintenance, des opérateurs ont déjà accidentellement inhalé de telles particules fortement radioactives, malgré les précautions de radioprotection. Une fois déposées dans le système respiratoire, des particules seront naturellement éliminées du corps, alors que certaines resteront piégées dans les poumons pour de longues périodes. Un travailleur qui aura inhalé de telles particules sera alors exposé à une irradiation gamma chronique, pouvant conduire à un risque sanitaire comme le développement possible d’un cancer à long terme. L’objectif du projet est de tester des stratégies pour accroitre l’élimination de ces particules irradiantes inhalées, et donc réduire l’irradiation pulmonaire et les risques associés. Pour cela, les efficacités de deux stratégies seront évaluées chez le rat exposé par voie pulmonaire à des particules de cobalt radioactif : celle d’une prise orale d’expectorants déjà disponibles sur le marché, et celle d’une inhalation d’une solution saline très concentrée déjà utilisée chez l’Homme pour d’autres indications.

Bénéfices attendus

Si l’une des stratégies testées chez l’animal permet effectivement de stimuler la remontée le long des voies respiratoires des particules d’oxydes de cobalt, et ainsi de favoriser leur élimination corporelle, le traitement pourra être rapidement testé chez l’Homme et mis à disposition auprès des services médicaux des installations nucléaires s’ils s’avèrent efficaces. De plus, cette action étant non spécifique du métal contaminant mais a priori seulement du caractère particulaire, les traitements pourraient être applicables à d’autres métaux radioactifs présents sous forme particulaire comme les oxydes de plutonium.

Procédures

-Des particules d’oxyde de cobalt sont administrées à tous les rats sous anesthésie gazeuse (148 rats au maximum, 4 min, 1 fois). -Parmi ceux-ci : Des rats seront traités oralement par des expectorants, 2 fois par jour pendant 3 jours (132 rats au maximum). Ils seront au préalable légèrement anesthésiés au gaz (3 min, 6 fois au total). D’autres rats seront traités par inhalation d’un aérosol de solution saline très concentrée, à raison de 2 fois par jour pendant 3 jours (84 rats au maximum). Ils seront traités vigiles, enfermés par 2 ou 3 individus à la fois dans une enceinte recevant l’aérosol (15 min, 6 fois au total). -Tous les rats seront hébergés individuellement pendant 4 jours maximum post-exposition pulmonaire au cobalt dans des cages à métabolisme. Ce type de cage est conçu pour la collecte individuelle, c’est-à-dire rat par rat, de leurs urines d’une part, et de leurs selles d’autre part. Les animaux ne seront isolés que physiquement, car pourront se voir et communiquer par les sons et les odeurs.

Impact sur les animaux

Après l’exposition pulmonaire des rats aux particules de cobalt une irritation de la trachée, une altération des cordes vocales, et une perturbation passagère de la ventilation pulmonaire le temps que le liquide soit absorbé par le tissu pulmonaire peuvent être observées. L’administration de liquide dans l’estomac peut entrainer une liquéfaction des selles, et une perturbation transitoire de leur appétit. Les rats hébergés en cage à métabolisme comme en cage conventionnelle évoluent sur une grille et non sur une litière traditionnelle pour rongeurs, pouvant entrainer un inconfort de la marche voire des lésions aux pattes, ce qui n’a jamais été observé jusqu’alors. Un stress des rats est attendu lors de : -leur manipulation lorsqu’ils sont conscients et vigiles, -leur anesthésie (manipulation + hypothermie) préalable aux actes réalisés lors de leur phase d’inconscience, -leur changement de condition d’hébergement entre cage individuelle et cage par groupe, et inversement, -leur traitement par inhalation où ils seront enfermés vigiles pendant 15 min dans une enceinte par 2 ou 3 individus.

Devenir

Afin d’évaluer l’efficacité des traitements sur la rétention en cobalt dans différents tissus d’intérêt, un prélèvement de ces tissus est nécessaire ; nécessitant l’euthanasie des animaux. Le cobalt activé étant un émetteur de rayons gamma, une mesure au niveau de l’animal entier ne permettrait pas de distinguer si ce cobalt provient des poumons, du système digestif (en cours d’élimination) ou de tissus secondaires. Par ailleurs, ces animaux devenus irradiant à cause du cobalt radioactif incorporé ne pourront pas être replacés .

Remplacement

Les traitements testés devraient modifier la production de fluides pulmonaires dont le mucus au niveau de la trachée, et la vitesse de battements des cils de certaines cellules de la trachée. L’objectif est de déterminer si ces modifications vont dans le sens d’une accélération/augmentation de la remontée des particules de cobalt le long des voies respiratoires, et sont suffisantes pour les éliminer de manière significative. Le critère principal d’évaluation de l’efficacité sera une diminution de la charge pulmonaire en cobalt, associée à une augmentation de leur élimination par les fèces. Elle sera indirectement estimée par la mesure de la radioactivité associée aux particules de cobalt activé. La réalisation de ce projet nécessite des études à l’échelle de l’organisme entier donc chez l’animal.

Réduction

La littérature scientifique a été étudiée pour ne tester que des médicaments expectorants ayant déjà été démontrés leur efficacité. Les précédentes études du laboratoire montrent que des groupes de 8 rats sont nécessaires pour prouver l’efficacité d’un traitement sur la charge pulmonaire en un métal, après exposition pulmonaire à celui-ci par une administration intratrachéale. Par une analyse statistique, il a été déterminé que 8 rats par groupe permettraient de mettre en évidence une diminution de 15 à 20% de la charge pulmonaire en cobalt chez un groupe traité par rapport au groupe non traité, et entre deux groupes traités.

Raffinement

L’instillation intratrachéale (pour administration pulmonaire) et le gavage gastrique (pour administration orale) seront effectués chez des rats pendant leur phase d’inconscience suite à leur exposition à un gaz anesthésiant pour : i) prévenir leur inconfort/sensibilité à la douleur, ii) assurer la reproductibilité de la localisation et de la dose délivrée en cobalt ou expectorant, iii) pour la radioprotection des opérateurs. Ces gestes sont maitrisés au laboratoire et ont apporté leurs preuves pour le confort des rats, comme pour la qualité des résultats. L’inhalation de la solution saline très concentrée se fera dans une enceinte au sein de laquelle les rats vigiles seront exposés par groupe de 2-3 individus pour limiter le stress, et la durée de cette inhalation sera limitée à 15 min. Les rats seront hébergés individuellement dans des cages à métabolisme pendant 4 jours consécutifs maximum. Ils pourront se voir, s’entendre et se sentir et continuer à communiquer. Ces cages sont les plus grandes du marché. Par ailleurs, des Nylabone® sont ajoutés. Une observation 1 à 2 fois par jour et une pesée régulière (2 fois par semaine) des rats seront effectuées pour suivre l’état des rats, et pouvoir apporter des soins au plus vite si besoin.. Pour estimer objectivement le niveau de douleur/inconfort des rats, différents critères seront considérés et évalués selon une grille de scores (indicateurs généraux : Évolution masse corporelle, apparence externe et comportement + respiration). Une « Fiche Suivi Clinique » sera « ouverte » dès l’apparition d’un premier signe d’inconfort chez un rat. En fonction de l’évolution du score cumulé, les rats pourront recevoir des traitements analgésiques/anti-inflammatoires ou être mis à mort.

Choix des espèces

Le rat est retenu pour nos études du fait de la richesse de la littérature dans le domaine de l’exposition à des métaux radioactifs chez cette espèce de rongeur. Sa taille, supérieure à celle de la souris, permet des prélèvements biologiques suffisants pour obtenir des niveaux de métaux mesurables dans les prélèvements. Pour être en accord avec le fait que les travailleurs du nucléaire sont adultes, les rats en expérimentation seront adultes. Ils seront livrés à l’âge de 6 à 8 semaines, et utilisés aux âges de 7 à 9 semaines. Ils seront donc de jeunes adultes pour que leur taille soit plus adaptée à leur hébergement en cage à métabolisme, et ainsi limier l’inconfort. .