Rats
Complications vasculaires associées à l’usage des inhibiteurs des points de contrôle immunitaire : une approche multidimensionelle
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Pour documenter les effets cardiovasculaires des immunothérapies anticancéreuses chez des individus déjà hypertendus, 450 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. L'hypertension leur est imposée par une mini-pompe implantée sous la peau, qui diffuse une molécule pendant vingt-huit jours. Viennent ensuite des anticorps deux fois par semaine pendant deux semaines, trois prélèvements de sang de dix minutes, des échographies du cœur et des carotides, une imagerie de l'œil, une imagerie du mésentère et des mesures de pression à la queue. Le porteur écrit avoir "soigneusement optimisé" le nombre de rats par groupe, sans donner de calcul de puissance, et arrive à un effectif d'environ 450 à partir d'un minimum de dix rats par groupe.
Objectifs
Documenter les potentielles toxicités cardio-vasculaires liés aux traitements par inhibiteurs des points de contrôles immunitaires utilisés dans le traitement des pathologies malignes. Comprendre les mécanismes de toxicités cardio-vasculaires liés aux traitements par inhibiteurs des points de contrôles immunitaires. Identifier les pistes de travail pour prévenir cette toxicité cardio-vasculaire.
Bénéfices attendus
La compréhension des conséquences cardio-vasculaires liés aux traitement par inhibiteurs des points de contrôles immunitaires, traitement des pathologies malignes, nous permettra d'appréhender au mieux ces complications. La compréhension des mécanismes physiopathologiques de ces complications et l'identification des cibles pour l'initialement d'une potentielle prévention avant l'apparition des complications cardio-vasculaires sont les enjeux de ce travail. L'incidence des pathologies malignes dans le monde augmente, de part notamment le vieillissement de la population. Aujourd'hui l'utilisation d’inhibiteurs de points de contrôles immunitaires est une pierre angulaire dans le traitement des pathologies malignes et l’amélioration des connaissances sur les effets indésirables potentiels de ces traitements est indispensable.
Procédures
Les rats seront soumis à la mise de place de mini-pompes sous la peau ( temps du geste 10 minutes) pour diffuser une molécule qui les rend hypertendus pendant une période de 28 jours. De plus, des traitements par anticorps qui modulent le système immunitaire seront administrés deux fois par semaine pendant 2 semaines afin d'évaluer la toxicité de ces traitements. Les rats bénéficieront de prélèvements sanguins à J1, J15, J28 jours soit 3 au total pour réaliser des analyses diverses (10 mn par prélèvement). Les rats bénéficieront de plusieurs examens in vivo : - Echographie trans-thoracique et carotidienne à J1 et J28 (temps d’intervention estimé à 10-20 min à J1 et à J28) – une imagerie oculaire à J28 (temps d’intervention estimé à 10 min à J28) – une imagerie du mésentère à J28 (temps d’intervention estimé à 5 min à J28) – la mesure de la pression artérielle au niveau de la queue du rat à J1 et J28 (temps d’intervention estimé à 10 min à J1 et à J28)
Impact sur les animaux
Pose de la mini-pompe sur un animal anesthésié : cette intervention entraîne une douleur post-chirurgicale ainsi qu’une gêne liée à la présence du capteur sous la peau. Injections : elles génèrent du stress lors de la contention de l’animal éveillé et peuvent également entraîner une gêne au niveau du point d’injection. Pléthysmographie sur un animal vigile : cette procédure induit un stress chez l’animal.
Devenir
A l'issu de chaque procédure, les animaux seront mis à mort afin de récupérer les différents organes pour des études biomoléculaires et histologiques. Ces tissus sont nécessaires pour valider les effets des traitements sur l'organisme.
Remplacement
Ce projet vise à étudier les effets cardiovasculaires des traitements par inhibiteurs des points de contrôle immunitaire dans des conditions de physiopathologie intégrées, autrement dit, chez des animaux présentant déjà un facteur de risque cardio-vasculaire, comme l'hypertension artérielle. De ce fait, l'utilisation de modèles cellulaires ou ex vivo n'est pas adapté pour répondre de façon pertinente aux questionnement scientifiques du projet.
Réduction
Le nombre de rats par groupe a été soigneusement optimisé afin de limiter l'utilisation d'animaux au strict nécessaire. Une stratégie spécifique a été mise en place pour réduire au maximum les prélèvements, que ce soit lors des analyses pharmacocinétiques ou au moment de la mise à mort. Cela permet de limiter à la fois le nombre d’animaux utilisés et les volumes prélevés sur chacun. Quelle que soit la conception des études exploratoires, nous nous engageons à utiliser le moins d’animaux possible. Pour garantir la robustesse des résultats, un minimum de 10 rats par groupe est requis. Au total, en incluant l’ensemble des procédures prévues dans ce projet, environ 450 rats seront utilisés.
Raffinement
Dans la mesure du possible, l'hébergement social est choisi afin de réduire le stress et l'angoisse, avec un enrichissement adapté à chaque espèce. Un suivi quotidien de l'état clinique des animaux est réalisé pendant toute la durée du projet. Tout au long de l’étude, les animaux seront nourris ad libitum et hébergés en groupes sociaux stables dans des portoirs conventionnés au nombre maximum de 3 à 4 par cage avec de l’enrichissement adapté à l’espèce. Les animaux seront maintenus avec un environnement contrôlé et stabilisé (température de 21°C, hydrométrie à 55% et luminosité à 100lux avec un cycle de lumière 12h/12h). Afin de limiter le stress occasionné par le transport, une période d’acclimatation d’une semaine après réception des animaux sera maintenue avant le début du protocole. Les conditions de soins et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommages durables que pourraient ressentir les animaux. Ainsi, un suivi des animaux sera réalisé quotidiennement durant toute la durée du protocole expérimental, ce qui permettra de déceler un éventuel signe de souffrance. Notre grille d’évaluation des point limites pour le bien-être animal est utilisée quand un animal présente un état de mal-être ou de souffrance, il est exclu de l'étude et euthanasié en fonction de son score et avis du responsable bien-être animal. L’anesthésie et l’analgésie sont rigoureusement respectées pour toutes les interventions effectuées sur les animaux tout au long de l’étude. À l’issue de chaque procédure, les rats seront euthanasiés conformément aux protocoles en vigueur.
Choix des espèces
Le choix d’espèces rongeurs est justifié par : - Les objectifs du projet : disponibilité d’un modèle de maladie déjà existant (hypertension artérielle par injection de traitement dans les mini-pompes sous cutanés) permettant d'étudier l'injection des traitements par inhibiteurs de points de contrôles immunitaires chez des animaux avec un facteur de risque cardio-vasculaire. - La comparaison possible avec d’autres études menées chez ces modèles animaux au laboratoire - Aspects pratiques de manipulation Des rats âgés de 12 à 18 semaines seront utilisés, car le protocole requiert des animaux adultes. Le choix de rats adultes permet d'établir un parallèle avec la situation humaine, dans laquelle les traitements sont généralement administrés à l'âge adulte. De plus, les individus adultes présentent un risque accru de développer des pathologies vasculaires, ce qui justifie l'utilisation de cette tranche d'âge dans notre modèle expérimental.
Etude de l’efficacité de candidats médicaments sur un modèle préclinique de dyskinésies induites par la L-DOPA chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rendus parkinsoniens par l'injection d'une neurotoxine directement dans le cerveau, 2 025 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après cette première chirurgie de trente minutes, certains reçoivent sous la peau une pompe à diffusion continue, puis des injections quotidiennes d'une molécule proche de la dopamine pendant six semaines, jusqu'à deux fois par jour, destinées à provoquer les mouvements anormaux involontaires que développent les patients. Ces mouvements sont ensuite observés une minute toutes les vingt minutes pendant trois heures, une fois par semaine. Le porteur annonce trois tests de comportement sous contention pour classer les rats selon la sévérité de leur atteinte, sans préciser lesquels, et jusqu'à huit prélèvements sanguins en 72 heures. Tous les rats sont tués à la fin, pour récupérer leur cerveau, après un prélèvement terminal de liquide céphalo-rachidien sous anesthésie.
Objectifs
Ce projet s’inscrit dans le cadre de l’étude de l’efficacité de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à réduire les effets secondaires induit par un des médicaments le plus utilisé dans la maladie de Parkinson (MP). La MP se caractérise par un syndrome moteur défini par une lenteur d’initiation des mouvements associée à un tremblement de repos, une rigidité musculaire et une instabilité posturale. La principale caractéristique de la maladie de Parkinson est la mort progressive et massive des neurones produisant la dopamine (un messager chimique permettant la communication entre les neurones) dans le cerveau, impliqués dans la coordination des mouvements. Les évènements qui sous-tendent cette mort restent mal connus. Ceci rend le diagnostic de la maladie de Parkinson difficile, d’autant que l’apparition des symptômes ne se produit qu’après une perte neuronale importante. À l’heure actuelle, le traitement de la maladie est donc essentiellement symptomatique et vise à compenser le déficit en dopamine par l’administration d'une molécule semblable. Néanmoins, à long terme l’efficacité de cette molécule s’atténue et des effets secondaires très invalidants, caractérisés notamment par des mouvements anormaux involontaires appelés « dyskinésies », apparaissent. Compte tenu de ces complications, des stratégies médicamenteuses visent à atténuer le caractère invalidant de ces dyskinésies. L’objectif du présent projet est de tester l’efficacité de ces nouvelles thérapies dans un modèle préclinique de la maladie de Parkinson chez le rat. Ce modèle repose sur une injection de toxine dans le cerveau en ciblant spécifiquement les neurones produisant la dopamine afin de mimer la mort des neurones entraînant la pathologie. Au cours du protocole, des tests comportementaux sont utilisés pour évaluer la sévérité des troubles moteurs « parkinsonien » et classer les animaux selon la sévérité de leur atteinte. Des injections journalières d’une molécule semblable à la dopamine sont ensuite effectuées sur plusieurs semaines pour reproduire les mouvements anormaux involontaires observés chez le patient en réponse à ce type de traitement. Ainsi, l’efficacité de chaque nouvelle molécule thérapeutique sera testée sur ces mouvements anormaux involontaires et pourra être comparée aux traitements de référence, c’est-à-dire à ceux déjà utilisés en clinique.
Bénéfices attendus
Le modèle de toxine utilisé dans ce projet apparaît comme un modèle élaboré, mimant la mort des neurones produisant la dopamine observée dans la maladie de Parkinson et permettant l’induction des mouvements anormaux involontaires retrouvés chez les patients à la suite d’un traitement chronique avec une molécule semblable à la dopamine. Il permet de tester l’efficacité des nouvelles molécules thérapeutiques sur les mouvements anormaux involontaires. Ainsi, à terme, l’utilisation de ce modèle animal permettra de sélectionner des composés présentant des bénéfices sanitaires significatifs en vue d’essais cliniques
Procédures
Les animaux subissent une première chirurgie afin d’injecter la neurotoxine dans le cerveau (durée environ 30 minutes). Une deuxième chirurgie pourra être réalisée afin d’implanter sous la peau un dispositif permettant de diffuser un traitement en continu (durée environ 15 minutes). Les animaux seront soumis à 3 tests de comportement effectués sous contention ou non (selon le test) par l’expérimentateur (durée totale : 20min) jusqu’à 2 fois au cours du protocole afin d'évaluer la sévérité de leurs troubles fonctionnels. Les animaux subiront des injections journalières (sur 6 semaines maximum, 2 fois par jours maximum, 1min par injection) sous la peau d'une molécule semblable à la dopamine pour induire des mouvements anormaux involontaires. Ces derniers pourront être analysés et quantifiés 1 fois par semaine sur 6 semaines. Chaque session d'observation inclut 1min d'observation toutes les 20min durant 3h. Des prélèvements répétés de sang pourront être réalisés sur animal vigile, à la veine de la queue (durée : 5min) ainsi qu’un prélèvement terminal sur animal anesthésié. Lors de prélèvements multiples, jusqu’à 8 prélèvements pourront être réalisés sur 72h, ou encore 4 prélèvements maximum par semaine tous les 28 jours (1min/prélèvement). Des administrations quotidiennes de molécules thérapeutiques ou de traitement de référence pourront être effectuées pendant toute la durée du protocole (8 semaines au maximum, 2 fois par jour au maximum). Un prélèvement terminal de liquide céphalo-rachidien (liquide entourant le cerveau) sous anesthésie pourra être réalisé. A la fin du protocole, les animaux seront mis à mort afin de prélever le cerveau.
Impact sur les animaux
Un des effets indésirables potentiel est lié à l'administration de la nouvelle molécule thérapeutique testée. Un problème lors du geste technique ou un effet secondaire du composé testé peut être observé surtout pour les nouvelles molécules innovantes avec peu de recul. -Les animaux seront soumis à une administration dans le cerveau de la toxine nécessitant une chirurgie. Cette étape peut engendrer des douleurs durant les 24-48h suivant la chirurgie et peut être source d'une infection. Une perte de poids des animaux peut être observée ainsi qu’une altération de la mobilité avec des rotations contraires au site d’injection pendant quelques jours après la chirurgie. -Une chirurgie d’implantation de pompe diffusant des subtances liquides sera réalisée nécessitant une anesthésie gazeuse pouvant être source de douleur et/ou une gêne au réveil. -Lors des sessions de tests de comportements ou d’évaluation des mouvements anormaux involontaires, les animaux devront être régulièrement placés en isolements pour de courtes durées et/ou être maintenus sous contentions pouvant générer du stress. -L’induction des mouvements anormaux involontaires, présents jusqu’à 3h après l’injection de la molécule semblable à la dopamine, entraine une altération de l’activité motrice des pattes et de la face et peut limiter l'alimentation/hydratation. -Des prélèvements de sang seront réalisés sur animal vigile soumis à une contention pouvant être à l’origine 1) d’une douleur légère de courte durée, 2) de stress et 3) d’un écoulement sanguin persistant. -Les rats subiront un prélèvement de liquide céphalo-rachidien sous anesthésie/analgésie générale pour effectuer une chirurgie et accéder à la zone ou se trouve ce liquide (sous les muscles de la nuque).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure car il est necessaire de récupérer le cerveau de l'animal pour faire des analyses sur ce dernier.
Remplacement
L’objectif du projet est d’obtenir une preuve de concept d’efficacité de nouveaux composé in vivo. Afin d’évaluer l’effet de nouveaux composé sur les mouvements anormaux involontaires, le recours à un modèle animal est nécessaire. En effet, le modèle in vitro ne permet pas d’induire et d’étudier les répercussions comportementales associées aux mouvements anormaux involontaires.
Réduction
Le nombre d’animaux prévu par groupe pour ce projet est basé sur des données préalables obtenues au sein de l’entreprise sur ce modèle préclinique (n=15-20 pour assurer n=12 animaux inclus dans l’analyse finale, nécessaires pour observer une différence significative entre les groupes). Ce nombre se justifie pour les raisons suivantes : après la chirurgie induisant la lésion, environ 20% des animaux ne présentent pas de lésion sévère, paramètre essentiel pour induire une réponse aux traitements permettant d'induire les mouvements anormaux involontaires. De plus, parmi les animaux sévèrement lésés, seulement 80% sont sensibles à ce traitement chronique et exprimeront ces mouvements anormaux involontaires. Cela nous assure donc d’avoir 12 animaux par groupe avec 5-8 animaux de sécurité par groupe.
Raffinement
Une importance particulière est portée au suivi des animaux pour prévenir et remédier à l’apparition de douleur ou de mal-être. Les points limites sont fixés avant le début des expérimentations. Les animaux seront hébergés par 2-3 par cage selon leur poids. Des enrichissements multiples leur sont proposés (batônnets en bois, carrés de cellulose, rouleaux en carton), en alternance, pour limiter l’habituation et l’ennui. Les actes pouvant générer de la douleur seront réalisés sous anesthésie et/ou analgésie. Par ailleurs, les animaux seront habitués à la manipulation par l'Homme ainsi qu’aux environnements nouveaux dans lesquels seront réalisés les tests comportementaux afin de réduire le stress relatif à cela. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie et analgésie et les animaux bénéficieront d’une surveillance accrue (minimum 2 fois par jour) en phase post-opératoire durant 48h. De la nourriture et/ou des gels enrichis seront déposés dans la cage afin de limiter la perte de poids des animaux après la chirurgie. Un tapis chauffant rétrocontrôlé est utilisé pendant toute la durée de l’anesthésie pour maintenir la température corporelle des animaux à 38°C. Les zones d’injections en sous-cutanée pour les traitements récurrents avec la molécule semblable à la dopamine seront alternées entre les flancs gauches et droits.
Choix des espèces
Les rongeurs, classiquement utilisés en laboratoire, présentent plusieurs similitude sur l'anatomie cérébrale et l'activité des neurones produisant la dopamine que celles que l'on retrouve chez l'Homme. Le modèle de lésion induite par l'injection dans le cerveau d'une toxine s'est rapidement imposé comme un modèle préclinique de référence pour le test de nouveaux médicaments car ils reproduisent la mort des neurones produisant la dopamine. Des rats adultes d'environs 7 semaines (pesant entre 250 et 320g) le jour de la chirurgie de la lésion seront utilisés dans ce projet car la grande majorité des résultats de la littérature concernant ce modèle a été obtenue sur des rats appartenant à cette gamme de poids. De même, les coordonnées exactes utilisées pour procéder à la lésion dans le cerveau proviennent de données issues d'un livre qui a également été réalisé sur la base d’observations faites sur des rats entre 250-300g. En fonction des objectifs de l’étude et des composés à tester, des rats mâles ou femelles pourront être utilisés puisque cette pathologie touche aussi bien les hommes que les femmes.
Etudes des effets toxiques de xénobiotiques chez le rongeur (rat, souris)
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 7600
Une partie des rats et des souris peut provenir d'autres procédures expérimentales, à condition d'y avoir subi une gravité réelle légère ou modérée, sans recevoir de substance en test, et après deux semaines de repos. 9 500 rongeurs, soit 7 600 rats et 1 900 souris, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, pour mesurer la toxicité de molécules avant leur mise sur le marché et tout essai chez l'humain. Aux prises de sang systématiques, sur rongeurs éveillés, s'ajoutent selon le produit l'administration répétée de la molécule, un isolement jusqu'à 16 heures pour recueillir l'urine, des prélèvements d'autres fluides jusqu'à une fois par semaine et des biopsies de peau sous anesthésie. Le porteur écrit que ce type de nuisances est "difficilement estimable", les effets toxiques pouvant être neurologiques, immunologiques, inflammatoires ou métaboliques, et indique que ces études "nécessitent généralement" une analyse pathologique et donc la mise à mort des rongeurs. Il affirme que le projet s'inscrit dans une "démarche d'amélioration continue du bien-être animal en appliquant les principes des 3R".
Objectifs
Ce projet vise à d’évaluer la sécurité et la toxicité de molécules avant leur utilisation, selon les recommandations internationales des instances médicales et pharmaceutiques, chez deux espèces de rongeurs : la souris et le rat. Leur évaluation est effectuée conformément aux exigences des autorités réglementaires et nécessaire pour leur mise sur le marché et avant tout utilisation chez l’humain. Pour chaque molécule, afin de caractériser ses potentiels effets toxiques, d’identifier ses organes cibles et de définir ses marges de sécurité, plusieurs études complémentaires et séquentielles sont nécessaires : - Des études préliminaires qui permettent d’identifier la dose appropriée pour les études réglementaires ultérieures. Elles aident également à déterminer les effets du xénobiotique afin de confirmer les études règlementaires et de garantir le succès du dépôt d'une demande d'autorisation de mise sur le marché. - Des études de toxicologie, qui ont pour objectif de déterminer le niveau sans effets toxiques ou le niveau sans effet indésirable observé, en fonction de la durée du traitement et de l’espèce animale. Elles permettent aussi de collecter des données de toxicité et de pharmacocinétique du xénobiotique avant que son utilisation soit autorisée. Le projet s’inscrit dans une démarche d’amélioration continue du bien-être animal en appliquant les principes des 3R. Les procédures sont optimisées pour limiter le nombre d’animaux requis, agir en étapes progressive pour raffiner le choix des doses et réduire la douleur et la contrainte, notamment par l’utilisation de techniques moins invasives et la validation d’approches alternatives.
Bénéfices attendus
Les études de toxicologie ont pour objectif de déterminer le niveau sans effets toxiques ou le niveau sans effet indésirable observé en fonction de la durée du traitement et de l’espèce animale, et de collecter des données de toxicité et de pharmacocinétique nécessaire à leur autorisation d’utilisation. Ces données sont des prérequis avant le passage aux essais cliniques chez l’humain ainsi que pour la constitution du dossier d’autorisation de mise sur le marché. Par ailleurs, le projet favorisera l’application des principes des 3R (Remplacer, Réduire, Raffiner), en optimisant les protocoles d’étude et en limitant l’impact sur le bien-être animal, ce qui renforcera la qualité scientifique des résultats et la conformité aux normes éthiques et réglementaires.
Procédures
Les animaux sont soumis dans ce projet : - des prélèvements de sang réguliers réalisés dans le cadre de recommandations vétérinaires, vigiles (sauf en cas d'anesthésie prévus pour d'autres prélèvements, cf ci-dessous). Chaque prélèvement dure quelques minutes, le nombre total est établi en fonction des caractéristiques du produit testé et limité en suivant les recommandations vétérinaires internationales. -des prélèvements d'urine, de manière passif (isolement jusqu’à recueil d'urine ou bien de 16h maximum), ou échoguidé sous sédations (quelques minutes). Généralement, un prélèvement au début et un prélèvement en fin d’étude sont suffisants. - prélèvement d’autres fluides biologiques (autres que le sang) : jusqu’à une fois par semaine, sous anesthésie d’une quinzaine de minutes environs - des biopsies de peau par ponction échoguidée (mini invasive), sous anesthésie (10 minutes environ) - des contention manuelle, notamment dans le cadre d'examen clinique pour détecter des effets toxiques, d’environ 10 minutes. Afin d’éviter la répétition d’actes anesthésiques, les prélèvements peuvent être réalisés au cours d’une même anesthésie, permettant, en 10 à 15 minutes, de recueillir plusieurs échantillons de tissus et liquides biologiques. A chaque étude, tous ces prélèvements ne sont pas effectués, à l’exception des prélèvements de sang qui sont systématiques. Ils sont choisis selon la nature du produit testé et les données préliminaires déjà connues (in vivo ou in vitro).
Impact sur les animaux
Trois catégories de nuisances peuvent être provoqués chez les animaux utilisés dans ce projet. Elles sont toutes prises de manière préventives pour réduire leur impact. - Liées aux manipulations vigiles : en cours d’étude, les observations cliniques, ainsi que certaines voies d’administration, peuvent nécessiter d’une manipulation et une contention manuelle des animaux. Elles sont faites selon les bonnes pratiques vétérinaires mais cela peut néanmoins engendrer un stress. - Liées aux prélèvements/administration : la réalisation de prélèvements de tissus biologiques (principalement de sang) et l’administration répétée de la molécule testée peut provoquer des lésions et un stress des animaux en cas de réalisation incorrectes, d’individus plus fragiles ou bien de l’immobilisation nécessaire pour certaines voies d’administration. De plus,, les animaux sont placés en cage individuelle pendant la phase d’évaluation de prélèvement d’urine. - Liées à une toxicité de la molécule testée : les études de toxicologie visent à évaluer la toxicité d’une molécule. Ce type de nuisances est difficilement estimable : selon le mécanisme d’action (anticorps, anticancéreux, neurologique, etc), la voie d’administration, ou encore la biodistribution, divers effets toxiques sont possibles (neurologique, immunologiques, inflammation, métabolique, etc).
Devenir
Les études de toxicologie nécessitent généralement une analyse pathologie et donc la mise à mort des animaux d'après les recommandations des instances pharmaceutiques et médicales internationales.
Remplacement
Actuellement, il n'existe pas de méthodes alternatives permettant d'obtenir toutes les informations collectées grâce à ces études. Suivant les lignes directrices des instances médicales et pharmaceutiques internationales, il est nécessaire de recourir à des modèles in vivo.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe est fixé au minimum permettant de garantir la fiabilité des données obtenues d’après les lignes directrices des instances médicales et pharmaceutiques internationales. Ce nombre est considéré comme le minimum acceptable permettant une interprétation pertinente des données et la caractérisation correcte des effets toxiques potentiels. Afin de le réduire, des animaux peuvent faire plusieurs études préliminaires (ou de pharmacocinétique) après une période de repos (wash-out, dépendant de la demi-vie du xénobiotique testé), dans le cadre d’une utilisation continue. Des études pilotes sont menées, lorsque cela est pertinent, afin d’optimiser les conditions expérimentales et d’affiner les protocoles, ce qui permet de réduire le besoin en animaux pour les études principales. De plus, les tissus et échantillons biologiques collectés au cours des études sont réutilisés pour des analyses complémentaires (histopathologie, biomarqueurs, etc.), ce qui évite de recourir à des animaux supplémentaires pour des tests additionnels. L’ensemble de ces mesures s’inscrit dans une démarche proactive de réduction du nombre d’animaux, en accord avec les principes des 3R et les exigences des bonnes pratiques de laboratoire. La réutilisation d’animaux issus d’autres procédures expérimentales de gravité réelle ‘’légère’’ ou ‘’modérée’’ est possible tant que ces animaux n’ont pas reçu de xénobiotique en cours de test et après une période de repos d'au moins 2 semaines. Cela permet de réduire le nombre global d’animaux utilisé au sein de l’établissement et d’utilisés des animaux bien habitués aux manipulations liées aux études. Cette réutilisation est validée par un vétérinaire et la structure en charge du bien-être animale.
Raffinement
Une période d’acclimatation de 5 jours minimum pour les rongeurs est respectée à réception des animaux. Pendant cette période d’acclimatation, les animaux peuvent bénéficier d’un programme d’habituation adapté aux procédures qu’ils vont subir, afin de réduire leur stress et de favoriser leur coopération. Ce programme inclut des manipulations progressives et régulières, permettant aux animaux de s’habituer au contact humain et aux équipements utilisés. Un programme d’enrichissements validé par la structure en charge du bien-être animale. est appliqué quotidiennement pour garantir des conditions de vie optimales/minimiser les impacts des expérimentations.. Les animaux sont hébergés collectivement, sauf exceptions (bagarre, blessure), avec des enrichissements adaptés à leurs besoins. L’isolement est validé par un vétérinaire et fait l’objet d’un suivi structure en charge du bien-être animale.. Les animaux sont observés quotidiennement pour détecter tout signe clinique anormal et prendre rapidement les mesures nécessaires (réhydratation, isolement pour soin). Toute anomalie est rapportée au vétérinaire, qui prescrit un traitement si nécessaire. Un suivi clinique est en place, un fois par semaine pendant la phase d’administration du principe actif. L’examen clinique complet est effectué par un personnel formé pour évaluer les fonctions motrices, nerveuses, cardiaques, respiratoires, la température et l’état général des animaux. Un vétérinaire est présent aux heures ouvrées, et une astreinte vétérinaire est disponible 24h/24 et 7j/7. Une traçabilité des animaux/des actes est assurée pour permettre leur suivi et analyse. L’établissement développe des techniques les moins invasives possibles comme des gilets de télémétrie permettant d’analyser les fonctions cardiaques, respiratoires et l’activité sans contrainte physique ou pose d’implants par chirurgie. Les volumes prélevés/administrés respectent lesrecommandations vétérinaires.
Choix des espèces
D’un point de vue réglementaire, ces animaux sont des espèces reconnues pour leur aptitude à prédire les effets pharmacologiques, indésirables et/ou toxiques de xénobiotiques. Les lignes directrices instances médicales et pharmaceutiques internationales requièrent généralement deux espèces (rongeurs et non rongeurs) selon la nature du produit à tester (molécule chimique de synthèse, peptide, protéine, anticorps monoclonal ou produit de thérapie génique ou cellulaire). Des demandes d’autorisations de projet pour des espèces non rongeurs ont déjà été déposées par l’établissement. Selon ces lignes directrices, il convient d’utiliser de jeunes animaux sains après sevrage. Les rongeurs sont inclus en étude en général à partir de 6 semaines.
Prélèvements de tissu en routine pour la caractérisation de souris et de rats génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 840
Cinq à dix secondes de contention et l'extrémité de la queue coupée, parfois un second morceau prélevé à l'oreille : c'est ce que subissent 252 000 souris et 840 rats sur cinq ans. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance léger et le geste se pratique sur des animaux de cinq à dix jours, avant le sevrage. Il sert à lire leur patrimoine génétique et à garder ceux qui portent les mutations utiles aux travaux de l'institut sur les maladies du cerveau, les autres étant tués. Rien dans le résumé ne justifie ce total de 252 840 animaux, le porteur indiquant seulement que les accouplements sont "optimisés pour produire un maximum d'animaux avec des génotypes d'intérêt".
Objectifs
L'objectif direct du projet est de prélever du tissu de souris et de rats afin de caractériser génétiquement ces animaux pour des études de pathologies cérébrales.
Bénéfices attendus
Fournir des animaux aux génotypes d’intérêt pour les projets scientifiques (utilisation continue vers des DAP d’expérimentation) et caractériser génétiquement des lignées pour optimisation de la gestion des élevages.
Procédures
Prélèvement de l'extrémité de la queue, 1 fois de durée 5-10 secondes. Exceptionnellement, un deuxième prélèvement à l'oreille, 1 fois durée 10 secondes.
Impact sur les animaux
Douleur et stress légers de courte durée lors du prélèvement de tissu.
Devenir
Les animaux du génotype d'intérêt sont utilisés dans les projets de recherche de l'Institut. Les animaux qui n'ont pas le bon génotype sont mis à mort.
Remplacement
Préalablement à l'expérimentatio animale des méthodes alternatives dont les cellules en culture et organoïdes on été utilisées. Néanmoins, ces modèles ne permettent pas d'étudier le cerveau dans sa globalité et en interaction avec d'autres organes.
Réduction
La production des souris génétiquement modifiées est basée sur les besoins expérimentaux établis de façon statistique. Les schémas d’accouplement sont optimisés pour produire un maximum d’animaux avec des génotypes d'intêret. Quand cela est possible nous utilisons des schémas d’accouplement ne nécessitant pas de génotypage. Les élevages des lignées non utilisées sont arrêtés.
Raffinement
La méthode utilisée est éprouvée, précise, rapide et standardisée ce qui limite les effets indésirables, le stress et la douleur. Les animaux sont maintenus dans des groupes sociaux dans un environnement enrichi et des points limites ont été mis en place pour éviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
La souris est un modèle animal largement utilisé en recherche biomédicale en raison de sa facilité de manipulation, de la disponibilité d'un grand nombre de lignées génétiquement modifiées et des similarités avec l'homme, permettant des comparaisons pertinentes entre les deux espèces. Le rat aussi est une espèce proche de l'homme dont son intérêt comme modèle expérimental. Animaux de 5-10 jours jusqu'au sevrage ou à l'âge adulte si un second prélèvement est nécessaire.
Evaluation de stratégies vaccinales et des schémas d’immunisation dans des modèles murins et rats d’arthrites inflammatoires
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Rats : 100
Provoquer une arthrite chez des rongeurs pour voir si un vaccin l'empêche : 300 souris et 100 rats vont être utilisés dans ce but, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin pour analyse de leurs tissus. Les souris reçoivent deux doses de vaccin sous la peau, les rats une administration sous-cutanée et nasale, avec des prélèvements de sang et de salive sous anesthésie à trois reprises en un mois. Les rats sont ensuite exposés par la bouche à une bactérie, quatre jours sur sept pendant un mois, jusqu'à développer une inflammation articulaire que le porteur prévoit de traiter par anti-inflammatoires. Cette bactérie n'est jamais nommée, désignée d'un bout à l'autre du résumé par les seuls mots "cette bactérie".
Objectifs
Les objectifs de ce projet sont : -Determiner le meilleur schéma d’immunisation ainsi que la voie d’administration adaptée chez le rat et la souris -Determiner les conséquences cliniques de l’immunisation sur la survenue d’arthrites chez les rongeurs.
Bénéfices attendus
L’impact fondamental de notre étude est de montrer qu’une immunisation contre cette bactérie présente un avantage majeure dans la prévention des maladies articulaires inflammatoires via une vaccination anti-bactétien et une alternative aux biothérapies.
Procédures
Vaccination sous cutannée Prélèvements sanguins et t salivaires: J0, J15, J30 Les prélèvements sanguins et salivaires sont réalisés sous anesthésie 2 doses vaccinales seront effectués chez la souris sous cutané + intre nasale chez le rats 2 doses de vaccin, la voie sera determiné en fonction des résultats chez la souris. La durée des prelèvements salivaire est de 5 à 10 minutes maximum. L'administration des vaccins chez la souris et le rat dure pour chaque animal environ 1 minute. L'exposition à cette bactérie chez le rat est de 1 mois, il s'agit d'une administration orale (le rat lèche une solution contenant cette bactérie), le rat est exposé 4 jours sur 7 pendant 1 mois. La durée d'exposition quotidienne est d'environ 5 minutes par animal.
Impact sur les animaux
Effet indésirable : douleur lors de la réalisation des prélèvements sanguin et des vaccinations sous cutané : à cet effet une analagésie efficace sera mis en place lors de l’expérimentation En cas de survenue d'arthrite, une analgésie par anti inflammatoire non stéroidien (AINS) connus pour leurs effets efficaces sur les arthrites inflammatoires sera mis en place.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de l'expérience pour prélèvement de tissus afin d’effectuer des analyses histologiques.
Remplacement
Ce projet est une étude préclinique visant à évaluer l’efficacité vaccinale muqueuse et sous cutanée d’une nouvelle stratégie. Ces modèles animaux sont les modèles de référence pour l’évaluation de stratégies vaccinales anti-bactérienne. Ils sont l’étape indispensable avant le passage chez l'Homme. Il n’existe pas de méthodes alternatives in vitro pour étudier la réponse immunitaire induite par un vaccin.
Réduction
Ce nombre a été déterminé en tenant compte des différentes voies d’administrations des vaccins, en tenant compte du nombre de vaccins à tester (5 vaccins différents) et des groupes à tester. Nous avons utilisé le minimum possible par groupe afin de pouvoir mettre en évidence des différences significatives éventuelles. Nous avons aussi tenu compte du nombre de fois nécéssaire à répéter l’expérience afin de montrer que la mise en évidence d’un quelconque effet ne soit pas lié au hasard
Raffinement
Les animaux seront suivis régulièrement pendant toute la durée du projet (l’ensemble des éléments contenus dans la grille de scoring seront intégrés dans les points limites : -Des mesures en amont seront pris pour la douleur comme une analgésie et une sédation efficace, une surveillance accrue lors de la phase de réveil post prélèvement, ainsi qu’une surveillance du comportement et une analyse par echelle visuelle analogique, une surveillance pondérale sera effectuée les jours suivants et durant la permanance des animaux à l’animalerie. -Les éventuels effet indésirable des vaccins chez les animaux sains seront monitorés et si ces effets conduisent à un état douloureux important, une analgésie adéquate sera effectuée. Les différents modèles animaux sont par ailleurs connus pour developper une inflammation articulaire importante lors de l’exposition bactérienne. Une surveillance biologique et par imagerie régulière sera effectuée afin de détecter rapidement la survenue d’arthrite et de prendre en charge par des moyens thérapeutiques (exemple des analgésies) - Les animaux seront manipulés sans stress, par des personnes compétentes. Surveillance adaptée des animaux. Naturellement nous avons introduits dans ce projet une grille de points limites qui seront surveillés strictement dans la réalisation de notre expérimentation .
Choix des espèces
Les animaux choisis dans ce projet sont les modèles les mieux adaptés pour le développement de modèles immunologiques. Nous avons sélectionné ces deux espèces pour étudier l’immunogénicité des stratégies vaccinales (procédure expérimentale). En effet la souris représente le modèle idéal d'étude des schémas d'immunisation avec les différents voies d'administration, la production d'anticorps neutralisant et les différents vaccins contre cette bactérie. Après validation du schéma vaccinal et d'immunisation chez la souris, on passera à l'étude chez le rat, il présente la caractéristique intéressante de présenter une arthrite strictement inflammatoire, proche des arthrites inflammatoires humaines, quelques mois exposition gingivale à cette bactérie ainsi la réalisation d'un vaccin de vaccin sur la survenue de la maladie. Age souris 8 semaines - rats 4 semaines:il s’agit de modèle d’arthrite survenant précocement d’où l’intérèt d’un modèle immunisant juvénile.
Analyse des changements synaptiques induits par le lithium dans un modèle animal du trouble bipolaire.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Six heures de sommeil retirées chaque jour, onze jours de suite : une partie des rats de ce projet est mise ainsi dans un état censé reproduire la phase maniaque du trouble bipolaire. 400 rats vont être utilisés, la moitié dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, l'autre moitié un niveau modéré, tous tués pour prélever leurs organes. Chacun peut subir l'implantation chirurgicale d'une pompe à lithium, jusqu'à quatre séances d'imagerie d'une heure sous anesthésie générale et jusqu'à huit prises de sang par séance, l'ensemble visant à comprendre comment agit un médicament prescrit depuis soixante-dix ans. Le rat a été préféré à la souris parce que son cerveau est plus gros, son volume sanguin plus important et sa réponse comportementale plus régulière.
Objectifs
Le trouble bipolaire est un trouble psychiatrique chronique grave qui touche 1 % de la population adulte. Il se caractérise par des fluctuations de l'humeur tout au long de la vie, allant d'épisodes dépressifs à des épisodes maniaques. Le lithium en est le traitement de référence depuis 70 ans, grâce à ses propriétés stabilisatrices de l'humeur. Cependant, son mécanisme d'action est assez méconnu, tant au niveau moléculaire que cellulaire. Des études récentes montrent que le lithium peut modifier la façon dont les neurones communiquent entre eux. Ces effets pourraient aider à protéger les cellules nerveuses et favoriser leur croissance et leur équilibre. Notre objectif est d’étudier et comprendre les mécanismes moléculaires à l’origine de ces effets neuroprotecteurs du lithium. Pour y parvenir, nous souhaitons mener notre étude à l’aide de l’imagerie par tomographie par émission de positons (TEP) sur des modèles animaux du trouble bipolaire. Deux modèles animaux représentatifs et bien documentés du trouble bipolaire sont utilisés dans cette étude car ils apportent des informations complémentaires pour comprendre les troubles comportementaux et les altérations cellulaires et moléculaires qui sont impliquées dans ce trouble : un modèle « pharmacologique » obtenu par administration d’un inhibiteur de la dopamine ; et un modèle « environnemental » obtenu par privation temporaire de sommeil. Ces modèles reproduisent l’état maniaque, qui est la phase la plus sensible et caractéristique de la pathologie chez l'humain. Nous utiliserons plusieurs radiotraceurs TEP permettant de mettre en évidence des mécanismes moléculaires impliqués dans l’intégrité cérébrale et dans la plasticité synaptique. Ces études d’imagerie seront complétées par une analyse des comportements impliqués dans cette pathologie (mémoire, anxiété, préférence sociale) afin de les corréler aux données d’imagerie et ainsi d’analyser l’impact du lithium sur ces troubles aux niveaux cellulaires et moléculaires.
Bénéfices attendus
Comprendre les mécanismes d’action de lithium dans le cadre des troubles bipolaires augmenterait considérablement notre compréhension de la physiopathologie de cette maladie et du mode d'action thérapeutique du lithium. Nos résultats faciliteront le développement de nouveaux traitements. Ils doivent aussi permettre le développement de nouveaux marqueurs précoce de la pathologie et de la réponse au traitement et devrait améliorer la prise en charge des patients.
Procédures
Chirurgie pour l’insertion des pompes osmotiques pour la diffusion de lithium ; Cette opération sera effectuée sous anesthésie générale avec un temps d’intervention d’environ 10 minutes ; la pompe de diffusion est insérée dès le début de traitement au lithium et reste en place pendant toute la durée du protocole (3 semaines maximum) Prélèvement sanguin, une fois par semaine (3 prélèvements maximum ;10 min maximum pour la préparation de l’animal et le prélèvement), pour quantifier la concentration de lithium dans le sang. Examen d’imagerie TEP, sous anesthésie générale (4 examens maximum/animal ; 1h/examen, intervalle minimum entre 2 examens 24 à 48 h). Des prélèvements (n=8 maximum) de sang pour l’étude de métabolisme du radiotraceur seront réalisés sous anesthésie générale pendant l’examen TEP.
Impact sur les animaux
Mise en place du modèle animal « pharmacologique » : . L’injection peut provoquer un stress lié à la contention des animaux et à l’acte d’injection lui-même. Mise en place du modèle animal « environnemental » : Privation de sommeil (privation de 6h de sommeil par jour pendant 11 jours consécutifs). A la fin de la période de privation de sommeil, l’animal est remis chaque jour dans sa cage conventionnelle pour pouvoir récupérer. Les nuisances attendues sont une fatigue, un stress, une angoisse. Les deux modèles sont connus pour provoquer des signes d’hyperactivité qui mime l’état maniaque caractéristique des personnes atteintes de troubles bipolaires. Au réveil post-anesthésie des sessions d’imagerie, les rats peuvent être désorientés et stressés. En dehors de la mise en place des modèles, d’autres facteurs sont potentiellement sources de stress : la manipulation fréquente ou l'environnement de laboratoire. Les signes de stress peuvent inclure des changements comportementaux, une posture recroquevillée, et une réponse réduite aux interactions sociales. Le traitement de lithium pourrait engendrer une perte de poids.
Devenir
Les animaux seront mis a mort pour une récupération des organes et une analyse moléculaire des tissus prélevés.
Remplacement
Il n’existe pour l’instant aucun modèle alternatif, non animal, capable de mimer les signes cliniques neurologiques du trouble bipolaire et permettant d’étudier les mécanismes de la maladie aux niveaux cellulaires et moléculaires et de suivre à cette échelle les effets du médicament lithium. En raison de limitations techniques et règlementaires, il n’est pas possible d’effectuer ces études chez l’homme vivant
Réduction
En combinant des techniques d'imagerie non invasives, une analyse statistique et l'utilisation de logiciels spécialisés pour optimiser la taille des échantillons tout en garantissant des résultats fiables et reproductibles, nous minimisons l'impact sur les animaux. Notamment, la tomographie par émission de positons (TEP) permet de réaliser plusieurs examens d'imagerie sur le même animal au fil du temps. Elle permet de suivre la progression de la maladie et la réponse aux traitements chez le même sujet, augmentant ainsi la puissance statistique sans augmenter le nombre d'animaux.
Raffinement
Une semaine d’acclimatation est prévue après l’arrivée des animaux dans l’installation. De l'enrichissement sera ajouté dans les cages des animaux. Un suivi de l’état des animaux est pratiqué de façon régulière (tous les 36-48h). Tous les examens d’imagerie sont réalisés sous anesthésie générale afin de minimiser le stress de l’animal. Une anesthésie avec une analgésie sera appliquée avant la chirurgie. La perfusion de lithium par pompe osmotique a été préférée à l’administration de lithium dans la nourriture afin d’éviter une aversion alimentaire chez les animaux traités. Les animaux seront suivis quotidiennement. L’état de santé de l’animal est évalué selon des critères précis. Si l’un des paramètres n’est pas satisfaisant alors une prise en charge adaptée est mise en place. ,. Des points limites, sont définis et peuvent aboutir à l’exclusion de l’animal de l’étude si necessaire.
Choix des espèces
Le modèle de trouble bipolaire chez les rongeurs est validé dans la littérature scientifique et largement utilisé. Le rat a été préféré à la souris car : - Le volume de son cerveau est plus important et adapté à l’imagerie cérébrale ; - Son volume sanguin plus important facilite les prélèvements sanguins ; - Une variabilité dans la réponse comportementale a été rapportée chez les modèles souris de troubles bipolaires (pharmacologique ou environnemental), mais pas chez le rat. Les animaux utilisés sont des jeunes adultes (6 à 8 semaines ±une semaine), ce qui correspond à la période de la vie où la maladie est le plus souvent diagnostiquée chez l’humain Les animaux utilises sont des jeunes adultes (6 à 8 semaines ±une semaine). Le TB est souvent diagnostiqué à cet âge chez l’homme. .
Etude de l’efficacité d’un candidat médicament sur des modèles de la maladie de Parkinson chez le rat.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Une neurotoxine leur est injectée dans le cerveau au cours d'une chirurgie d'une trentaine de minutes, pour détruire les neurones qui produisent la dopamine. 2 625 rats vont être utilisés ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour que leur cerveau soit prélevé. Certains reçoivent une seconde chirurgie d'implantation de pompe sous la peau, puis un traitement quotidien pendant six semaines, des prises de sang à la queue sur animal éveillé et un prélèvement de liquide céphalorachidien. Le porteur annonce trois tests de comportement sous contention, répétés jusqu'à trois fois, sans dire lesquels, et prévoit d'écarter les 20 % de rats dont la lésion cérébrale se révélera insuffisante.
Objectifs
La maladie de Parkinson (MP) est, par sa prévalence de 1,5 pour mille, la plus fréquente des pathologies neurodégénératives, après la maladie d’Alzheimer. Elle touche environ 160 000 personnes en France. La MP se caractérise par un syndrome moteur défini par une lenteur d’initiation des mouvements associée à un tremblement de repos, une rigidité musculaire et une instabilité posturale. La principale caractéristique neuropathologique de la maladie de Parkinson est la mort progressive et massive des neurones en charge de la coordination des mouvements et qui produisent la dopamine. Les évènements qui sous-tendent cette mort restent mal connus. Ceci rend le diagnostic de la maladie de Parkinson difficile, d’autant que l’apparition des symptômes ne se produit qu’après une perte neuronale importante. À l’heure actuelle, le traitement de la maladie est donc essentiellement symptomatique et vise à compenser le déficit en dopamine (un messager chimique permettant la communication entre les neurones dans le cerveau) par l’administration d'une molécule semblable. Néanmoins, à long terme son efficacité s’atténue et des effets secondaires très invalidants (troubles moteurs, digestifs,cardiovasculaires, comportementaux, somnolence,…). Compte tenu de ces complications, des stratégies médicamenteuses alternatives sont en cours de développement et visent soit à retarder la prise de cette molécule soit à l’associer avec d’autres composés. L’objectif du présent projet est de tester l’efficacité antiparkinsonienne de nouveaux médicaments sur trois modèles précliniques de la maladie de Parkinson chez le rat. Ces modèles reposent sur une injection de toxines dans le système nerveux central en ciblant spécifiquement les neurones produisant la dopamine afin de mimer la mort des neurones entraînant la pathologie. Au cours du protocole, des tests comportementaux sont utilisés pour évaluer l’efficacité antiparkinsonienne des traitements testés. L’efficacité du nouveau médicament sera comparée aux médicaments actuels représentant le traitement de référence.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de tester l’effet antiparkinsonien des composés candidats pouvant avoir des bénéfices sanitaires significatifs en vue d’essais cliniques.
Procédures
Les animaux subissent une première chirurgie afin d’injecter la neurotoxine dans le système nerveux central (durée environ 30 minutes). Une deuxième chirurgie pourra être réalisée afin d’implanter sous la peau un dispositif permettant de diffuser un traitement en continu (durée environ 15 minutes). Des prélèvements répétés de sang pourront être réalisés sur animal vigile, à la veine de la queue (durée : 5min) ainsi qu’un prélèvement terminal sur animal anesthésié. Des administrations quotidiennes de candidat médicament ou de traitement de référence pourront être effectuées pendant toute la durée du protocole (6 semaines au maximum). Les animaux seront soumis à 3 tests de comportement en fin de protocole effectués sous contention par l’expérimentateur (durée totale : 20min) jusqu’à trois fois au cours du protocole. Un prélèvement terminal de liquide céphalo-rachidien sous anesthésie pourra être réalisé. A la fin du protocole, les animaux seront mis à mort afin de prélever le cerveau.
Impact sur les animaux
Un des effets indésirables potentiel est lié à l'administration du nouveau médicament et des molécules de référence. Un problème lors du geste technique ou un effet secondaire du composé testé peut-être observé surtout pour les nouvelles molécules innovantes avec peu de recul. -Les animaux seront soumis à une administration dans le cerveau d'une toxine nécessitant une chirurgie réalisée sous anesthésie gazeuse. Cette étape peut engendrer des douleurs durant les 24-48h suivant la chirurgie minorées par des antalgiques. La peau du crâne sera ensuite suturée ce qui peut provoquer des démangeaisons lors de la cicatrisation,un risque de retrait du point par l'animal et un risque rare d'infection. Une perte de poids des animaux peut être observée ainsi qu’une altération de la mobilité avec des rotations contraires au site d’injection pendant quelques jours après la chirurgie. -Une chirurgie d’implantation de pompe diffusant des subtances liquides sera réalisée nécessitant une anesthésie gazeuse, avec une ouverture de la peau pouvant être source de douleur et/ou une gêne au réveil -Les animaux réaliseront des tests de comportements nécessitant des contentions et des isolements courts dans des espaces restreints pouvant générer du stress. -Des prélèvements de sang seront réalisés sur animal vigile soumis à une contention, impliquant parfois des piqures dans les vaisseaux à l’aide d’une aiguille pouvant être à l’origine 1) d’une douleur légère de courte durée, 2) de stress et 3) d’un écoulement sanguin persistant.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure car il est necessaire de récupérer le cerveau de l'animal pour faire des analyses sur ce dernier.
Remplacement
L’objectif du projet est d’obtenir une preuve de concept d’efficacité de nouveaux composé in vivo. Afin d’évaluer l’effet antiparkinsonien du composé sur le comportement de l’animal, le recours à un modèle animal est nécessaire. En effet, le modèle in vitro ne permet pas d’induire et d’étudier les répercussions comportementales associées aux déficits parkinsoniens ni d’évaluer la présence du composé dans les organes.
Réduction
Le nombre d’animaux prévu par groupe pour ce projet est basé sur des données préalables obtenues au sein de l’entreprise sur ce modèle préclinique de la maladie de Parkinson induite par l’injection de toxines dans le cerveau en ciblant spécifiquement les neurones produisant la dopamine (n=15 dont n=12 inclus dans l’analyse finale). Ce nombre se justifie pour les raisons suivantes : après la chirurgie induisant la lésion, environ 20% des animaux ne présentent pas de lésion sévère (
Raffinement
Une importance particulière est portée au suivi des animaux pour prévenir et remédier à l’apparition de douleur ou de mal-être. Les points limites sont fixés avant le début des expérimentations. Des enrichissements multiples sont proposés aux animaux (batônnets en bois, carrés de cellulose, rouleaux en carton), en alternance, pour limiter l’habituation et l’ennui. Les actes pouvant générer de la douleur seront réalisés sous anesthésie et/ou analgésie. Les animaux seront également habitués à la manipulation et à la contention pour diminuer le stress lié à ces procédures. Après chaque prélèvement de sang, une réhydratation sera réalisée afin de compenser la perte du volume sanguin. Les chirurgies intracérébrales seront réalisées sous anesthésie et analgésie et les animaux bénéficieront d’une surveillance accrue (minimum 2 fois par jour) en phase post-opératoire durant 48h. De la nourriture et/ou des gels enrichis seront déposés dans la cage afin de limiter la perte de poids des animaux après la chirurgie. Par ailleurs, les animaux seront habitués aux environnements nouveaux dans lesquels seront réalisés les tests comportementaux afin de réduire le stress relatif à cela.
Choix des espèces
Les rongeurs, classiquement utilisés en laboratoire, présentent plusieurs similitude sur l'anatomie cérébrale et de l'activité des neurones produisant la dopamine que celles que l'on retrouve chez l'Homme. Les modèles de lésion induite par l'injection dans le cerveau de toxines se sont rapidement imposés comme des modèles précliniques de référence pour le test de nouveaux médicaments car ils reproduisent la mort des neurones produisant la dopamine. Des rats adultes d'environs 7 semaines (pesant entre 250 et 320g) le jour de la chirurgie de lésion dopaminergique seront utilisés dans ce projet car la grande majorité des résultats de la littérature concernant ce modèle a été obtenue sur des rats appartenant à cette gamme de poids. De même, les coordonnées exactes utilisées pour procéder à la lésion dans le cerveau proviennent de données issues d'un livre qui a également été réalisé sur la base d’observations faites sur des rats entre 250-300g. En fonction des objectifs de l’étude et des composés à tester, des rats mâles ou femelles pourront être utilisés puisque cette pathologie touche aussi bien les hommes que les femmes.
Troubles endocriniens et métaboliques : diabète et obésité
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
Rats : 1100
Pour évaluer l'activité de substances en développement sur le métabolisme et leurs effets secondaires sur le système endocrinien, 1 100 souris et 1 100 rats vont être rendus diabétiques ou obèses, par injection d'un réactif ou par un régime riche en graisse. Les procédures impliquent un niveau de souffrance léger pour 800 d'entre eux et modéré pour 1 400. Les substances leur sont administrées par voie orale, veineuse, sous-cutanée, abdominale ou musculaire, en une fois ou en perfusion de plusieurs heures, répétée pendant des jours ou des semaines, avec jusqu'à huit prises de sang sur une séance de huit heures et un isolement pouvant durer vingt-quatre heures. Le porteur indique que les animaux ayant subi des procédures légères ou modérées peuvent être réutilisés après accord du vétérinaire, et que les autres sont tués pour prélever leurs organes.
Objectifs
La prévalence mondiale du diabète et de l’obésité n’a cessé d’augmenter au cours de ces dernières décennies et a atteint des proportions pandémiques (463 millions de personnes atteintes en 2019). Ces troubles métaboliques exposent les personnes atteintes à un risque de pathologie bien plus grave, en effet une glycémie constamment élevée provoque des lésions vasculaires généralisées affectant le cœur, les yeux, les reins et les nerfs. Elle expose les personnes atteintes à une incidence accrue de maladies athérosclérotiques cardiovasculaires. A l’heure actuelle, toutes les thérapies disponibles traitent les conséquences du diabète de type 2 en se focalisant principalement sur la régulation glycémique, mais ne ciblent pas le mécanisme biologique sous-jacent qui cause la maladie. Par ailleurs, certaines molécules médicamenteuses en cours de développement peuvent avoir des effets secondaires sur le système endocrinien et favoriser l’apparition d’hyperglycémie et de diabète. Ainsi le présent projet aura pour objectif d’une part d'évaluer l’efficacité préclinique de nouvelles substances susceptibles de lutter contre les troubles métaboliques et endocriniens (diabète, obésité, syndrome métabolique), d’autre part, de déterminer si de nouvelles substances en développement peuvent avoir une répercussion sur le système endocrinien. Quel que soit le contexte de l’étude, l’effet des substances pharmacologiques est évalué sur des modèles biologiques suffisamment sensibles et prédictifs, capables de mimer la physiologie endocrinienne humaine et sa complexité, afin de garantir la pertinence et la validité des résultats expérimentaux obtenus.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'évaluer l’activité pharmacologique de substances en développement sur le métabolisme glucidique et lipidique. Ce projet permettra également d’étudier les effets secondaires possibles d’autres substances bioactives sur le système endocrinien.
Procédures
Les troubles métaboliques sont induits par une administration unique d'un réactif (durée d'environ 1 minute), ou par un régime riche en graisse, ou la combinaison des deux. Les substances-test peuvent être administrées par bolus (voie orale, intraveineuse, sous-cutanée, intra-péritonéale, intramusculaire), durée de quelques secondes ou par perfusion lente (intraveineuse) de quelques minutes à quelques heures. Les administrations peuvent être uniques ou répétées pendant plusieurs jours (le plus souvent) ou plusieurs semaines, et cela en fonction de l’objectif de l’étude. Les tests de tolérance au glucose et à l’insuline nécessitent une administration unique (durée d’environ 1 minute) suivie de prélèvements d'une goutte de sang (durée de quelques secondes, 8 maximum, sur 4 ou 8h de test). Par ailleurs, des prélèvements de sang (8 maximum, sur 4 ou 8h) peuvent être réalisés, chaque prélèvement durant quelques secondes à 3 minutes. Enfin, un hébergement individuel (durée max 24 h) peut être réalisé au cours de l'étude pour prélèvement d'urines ou de fèces.
Impact sur les animaux
Bien qu’un certain nombre de procédures appliquées dans ce projet n’induisent pas de nuisance ou d’effets indésirables sur les animaux, quelques procédures peuvent induire un stress lié à un isolement (
Devenir
Pour les procédures légères et modérées, les animaux peuvent être réutilisés après l’approbation du vétérinaire. Pour procédures nécessitant des prélèvement d’organes les animaux sont euthanasiés.
Remplacement
Dans le cadre du développement des médicaments testés de nombreux tests ex vivo (in vitro et in silico) ont déjà eux lieu avant l'utilisation de l'animal. Ceux-ci constituent un point de départ permettant de générer des données préliminaires et d’effectuer un tri moléculaire pour ne retenir que les molécules présentant une certaine efficacité. Bien que ces tests permettent une réduction significative du nombre de substance à tester (et donc du nombre d’animaux), ils ne reflètent pas la complexité de l’environnement biologique et du système endocrinien chez l’Homme. De même, il n'est pas possible de prédire les effets secondaires des substances utilisées. Ainsi, les modèles d'animaux restent indispensables pour valider et optimiser de nouvelles thérapies pour leur utilisation en toute sécurité chez l'Homme.
Réduction
Les mesures de réduction s'intégrant à la règle des 3Rs vont consister à utiliser le plus petit nombre d’animaux possible pour chaque étude permettant d'obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte et d’éviter ainsi une répétition inutile des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet et la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif et éventuellement à un contrôle positif (substance de référence ou de comparaison) si cela s'avère pertinent. Quand le protocole d'étude le permet, un groupe traité est utilisé comme son propre contrôle négatif permettant ainsi d’utiliser un nombre d’animaux réduit. Par ailleurs et dans la mesure du possible (en fonction de la durée d'action de la substance-test), plusieurs doses d'une même substance peuvent être testées chez le même animal et à des jours différents, réduisant ainsi le nombre d'animaux utilisés. Nos données historiques ainsi que celles de la littérature indiquent qu’un effectif 8-10 animaux ( rats et souris) en standard par groupe (nombre de groupes variables, selon l’objectif de l’étude) est généralement nécessaire pour atteindre une sensibilité correcte du test. L' analyse statistique prévue repose sur des tests paramétriques. Par ailleurs, des prélèvements terminaux peuvent être ajoutés en fin de procédure pour éviter une répétition inutile de l'étude. Dans le but de réduire le nombre d’animaux, certains animaux issus des procédures réalisées sur l’animal éveillé sont également réutilisés aux strictes conditions qu’ils n’aient pas subi de procédure sévère et après accord du vétérinaire.
Raffinement
Les mesures de raffinement s'intégrant à la régle des 3Rs vont consister en un suivi des points limites permettant l'euthanasie précoce de tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont suivis par le vétérinaire et manipulés fréquemment par des techniciens préalablement formés et attentifs, prêts à agir lorsque les critères d'interruption prédéfinis sont atteints. Par ailleurs, et au quotidien, un enrichissement complet est fourni aux animaux, celui-ci inclut dans leur hébergement : litière, objets de nidification, objets à ronger ou à mastiquer, présence de congénères (sauf cas contraire imposé par la procédure). Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance.
Choix des espèces
L’impact de substances pharmacologiques sur le métabolisme de rongeurs (rats, souris), est prédictif de leur efficacité et/ou sécurité en clinique. En effet, le rongeur s'est avéré être un modèle fiable pour découvrir et valider de nouveaux traitements du diabète, il presente une physiologie proche de celle de l'Homme. Les études sont principalement menées sur des jeunes rongeurs adultes sains dont l'âge est compris entre minimum 4 semaines (correspond à la fin du sevrage des animaux) et maximum 20 semaines (correspond à l'apparition du processus de sénescence).
Biodisponibilité cérébrale des xénobiotiques et intégrité des interfaces sang-cerveau chez le rongeur en développement.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 216
Tués entre 5 et 90 minutes après une injection unique dans l'abdomen, 144 souris et 216 rats âgés de 3 à 30 jours vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les portées entières y passent, à des âges échelonnés, pour mesurer la vitesse à laquelle des molécules franchissent les barrières entre le sang et le cerveau en développement. Le porteur signale une douleur possible à l'injection et une mise à mort immédiate en cas d'hémorragie au point de piqûre. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire propre à ces stades n'existe et que la combinaison du métabolisme, du flux sanguin et des mouvements liquidiens du cerveau n'est pas "appréhendable in vitro".
Objectifs
Les interfaces sang-cerveau protègent le système nerveux central (SNC) mais empêchent également certains médicaments d’atteindre leurs cibles cérébrales. Les mécanismes neuroprotecteurs associés à ces barrières au stade périnatal sont mal définis. Ces barrières sont altérées au cours des pathologies périnatales. La pharmacocinétique cérébrale de nombreux médicaments du SNC n’est pas connue chez le nouveau-né ou l’enfant. L’objectif du projet est de mesurer le degré de perméabilité de ces interfaces à différents stades de développements, afin d’identifier des stratégies pharmacologiques visant à restaurer ou renforcer la neuroprotection assurée par ces interfaces, et de connaître la perméabilité sang-cerveau de xénobiotiques tels les molécules pharmaceutiques au stade périnatal pour améliorer les données disponibles sur l’usage des xénobiotiques et les risques encourus par exposition à ces molécules au sein de la population pédiatrique.
Bénéfices attendus
Ce projet couvre les activités d’une plateforme qui teste la permeabilité des interfaces sang-cerveau à divers composés, traceurs inertes (pour tester l'intégrité de ces interfaces), et xénobiotiques auxquels l'homme est exposé , tels les médicaments. Ces données de pharmacocinétique cérébrale sont indispensables à la compréhention des facteurs qui régissent la susceptibilité du cerveau des nouveau-nés et des enfants aux médicaments et pour identifier des médicaments susceptibles d'améliorer la neuroprotection au niveau des interfaces sang-cerveau.
Procédures
Les animaux sont soumis à une seule intervention : injection intrapéritonéale d'une molécule d'intérêt sous anesthésie gazeuse, puis euthanasiés entre 5 et 90 minutes suivant l'injection, pour prélèvement de tissus, après anesthésie létale, pour analyse de la distribution du traceur. Durée maximale de l’intervention : 95 minutes.
Impact sur les animaux
L'injection intrapéritoneale peut induire une douleur, qui sera limitée par le choix du véhicule utilisé et le contrôle de son pH.
Devenir
Tous les animaux des portées ayant subi la procédure sont mis à mort à différents temps post-natals afin de collecter les tissus pour analyses.
Remplacement
Il n’existe pas de modèles cellulaires des interfaces sang-cerveau qui soient spécifiques de différents stades de développement. Il n’est donc actuellement pas possible de modéliser ces interfaces aux stades périnatal et postnatal in vitro ou in silico. La concentration intracérébrale d’un médicament dépend des caractéristiques des interfaces sang-cerveau mais aussi du métabolisme (rénal, hépatique, cérébral) du médicament, du flux sanguin et des mouvements liquidiens dans le cerveau. La résultante de ces facteurs n’est pas appréhendable in vitro.
Réduction
Nous limiterons le nombre d’animaux en réalisant les expérimentations sur des animaux issus d’une même portée lors de la mesure des concentrations sanguines au cours du temps afin de limiter les variations interindividuelles .Le nombre d’animaux nécessaire par analyse a été déterminé par une approche statistique.
Raffinement
Toutes les mesures de perméabilité cérébrale seront suivies d’une euthanasie terminale. Si une molécule pharmacologique est susceptible d’avoir un impact douloureux sur l’animal, celui-ci sera maintenu sous anesthésie gazeuse (isoflurane) jusqu’à sa mise à mort. Si le point limite défini par une hémorragie au point d’injection est atteint, l’animal est mis à mort immédiatement.
Choix des espèces
- La perméabilité sang-cerveau dépend principalement du type de jonctions serrées, des transporteurs d’efflux, et du métabolisme enzymatique présent au niveau des interfaces sang-cerveau. Des études préalables ont montré qu’il existait une corrélation au niveau de ces mécanismes entre les rongeurs aux stades post-natals et l’homme au stade périnatal - Les rats ou souris ont des portées de 10-12 petits en moyenne : il est possible de réaliser plusieurs expérimentations sur une même portée pour réduire la variabilité interindividuelle. - Le rat et la souris sont actuellement des espèces utilisées dans les études précliniques. Nous disposons de beaucoup d’informations concernant les interfaces sang-cerveau chez ces espèces, évitant ainsi des étapes de mise au point de ces expérimentations. Le choix de l’espèce (rat, souris) sera également défini en fonction des données pharmacologiques et pharmacocinétiques déjà collectées par le laboratoire demandeur sur la molécule à tester. - Les animaux seront utilisés entre 3 et 30 jours après la naissance, puisque le but de la procédure est de mesurer la perméabilité des interfaces sang-cerveau à des stades de développement spécifiques. 30 jours après la naissance correspond à la fermeture de la fenêtre de plasticité cérébrale.
Effet d’une exposition alimentaire à trois pesticides seul ou en mélange sur les paramètres reproducteurs chez les rats femelle et mâle et les descendants
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
Exposés chaque jour par leur alimentation à un herbicide et deux fongicides, seuls ou en mélange, à des concentrations dix fois supérieures à celles mesurées dans les fluides biologiques humains, 100 rats vont être utilisés quatre semaines pour les femelles et huit pour les mâles, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. Les femelles subissent en plus un frottis vaginal quotidien pendant quinze jours, puis deux injections à trente-quatre heures d'intervalle pour hyperstimuler l'ovaire. Trois prises de sang sous anesthésie gazeuse ponctuent l'exposition, avant, pendant et après. La mise à mort est, selon les mots du porteur, le sort des 50 mâles et des 50 femelles, dont les organes sont prélevés pour des études ultérieures.
Objectifs
L’Homme utilise de nombreux produits de synthèse dans les domaines de l’agriculture. Ces produits et/ou leurs dérivés et métabolites ont contaminé ou contaminent encore notre environnement (eau, sol et air) et semblent avoir pour certains d’entre eux des conséquences néfastes sur la santé des populations sauvages et humaines. La question des effets de ces produits, seuls ou en combinaison, sur la santé humaine est une préoccupation sociétale majeure en France. Dans une étude récente de notre laboratoire, nous avons détecté trois pesticides majeurs dont deux fongicides et un herbicide dans les fluides biologiques humains. Un des deux fongicides n’est plus autorisé en Europe depuis plusieurs années mais il est encore retrouvé dans l’environnement. Plusieurs études in vivo ont déjà montré des effets néfastes de l’herbicide sur la fertilité de animaux, en revanche ses effets en association avec les deux fongicides restent à démontrer. Des études in vitro sur des cellules ovariennes actuellement en cours dans le laboratoire montrent des effets négatifs des deux fongicides sur la prolifération et la synthèse des stéroïdes. Cependant, il n’y a pas de données sur leurs effets sur la fertilité des animaux. Les objectifs de ce projet de recherche sont donc de tester l’effet d’une exposition alimentaire des trois pesticides, seul ou en mélange après sevrage jusqu’à l’accouplement chez les rats femelles et à l’âge adulte chez les mâles mais aussi chez les descendants. Les concentrations choisies de chaque substance sont 10 fois celles retrouvées dans les fluides biologiques chez l'Homme.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de connaître les effets de 3 pesticides retrouvés dans des fluides biologiques humains sur les paramètres reproducteurs des rongeurs. Il permettra aussi de répondre à une inquiétude sociétale sur l’exposition humaine aux polluants environnementaux. Il pourra être un support d’aide à la prise de décision politique et en santé publique en cas d’effets toxiques identifiés expérimentalement.
Procédures
Les rats femelle et mâle seront exposés quotidiennement à des pesticides seuls ou en mélange pendant 4 semaines chez les femelles et 8 semaines chez les mâles. Chez les femelles pendant 15jours, un suivi du cycle oestrien sera réalisé l’aide d’un frotti qui dure une dizaine de secondes. Chez les mâles comme chez les femelles, trois prélévements de sang de quelques secondes seront réalisés sous anesthesie gazeuse avant, milieu et apres exposition. Pour les femelles, à la fin de l’exposition, 2 injections à 34h d’intervalle seront réalisées afin d’hyperstimuler l’ovaire. L’euthanasie sera réalisée sous anesthesie gazeuse.
Impact sur les animaux
Les animaux pourront ressentir du stress lié à la contention lors de la pesée, des prises de sang ainsi que des frottis vaginaux et des injections pour la stimulation ovarienne concernant les femelles. La prise de sang peut engendrer une légère douleur et un éventuel hématome au niveau du site de prélèvement, les injections peuvent également engendrer une légère douleur au niveau du site d’injection et le gavage, si effectué, peut entrainer une irritation de l’œsophage voir des voies respiratoires supérieures.
Devenir
La mise à mort est le sort des 50 mâles et des 50 femelles. L’ensemble des animaux sera euthanasié et les organes seront prélevés pour des études ultérieures.
Remplacement
Des études in vitro sur des cellules ovariennes et hypophysaires actuellement en cours dans le laboratoire montrent des effets négatifs sur la prolifération et la synthèse des stéroïdes. Toutefois, l'étude des effets in vivo de ces polluants sur la reproduction, nécessite de recourir à un modèle animal complexe tel que le rat. En effet, ce modèle nous permettra d’évaluer les réponses physiologiques et la fonction de reproduction qui impliquent plusieurs organes interagissant finement entre eux et ne peuvent donc être analysés qu’au niveau de l’animal entier. Nous pourrons mesurer l’évolution du poids et l’engraissement des animaux exposés et leurs descendants et enfin la fertilité par des marqueurs des fonctions gonadiques.
Réduction
Nous avons un effectif total de 50 femelles et 50 mâles qui seront divisés en 5 groupes (contrôle, herbicide, fongicide 1, fongicide 2 et le mélange des 3 molécules) soit 10 animaux par groupe pour chaque sexe. Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire pour être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Ainsi, il ressort que 10 animaux/groupe seront nécessaires. Les analyses statistiques seront réalisées à l’aide d’un test ANOVA one way.
Raffinement
Nous raffinerons nos expériences avec d’une part l’utilisation des deux sexes et d’autre part en soulageant l’inconfort ou le stress potentiel subi par les animaux tout au long du protocole expérimental. Nous logerons les rats par 2 dans une cage et les animaux disposeront de plusieurs enrichissements (frisotis et tubes en carton). Les rats seront manipulés avec précaution, la prise de sang sera réalisée sur un animal anesthésié sous isoflurane. L’acte dure moins de 5 min par animal et par prélèvement. Après le prélèvement, un point de pression sera alors effectué pour assurer l’hémostase et les animaux seront surveillés jusqu’à leur réveil. Enfin, nous assurerons une auto administration orale grâce à un substrat appétent, le lait concentré non sucré, qui évitera un gavage.
Choix des espèces
Les rats sont des mammifères dont la physiologie est très bien connue. De plus, ce sont des animaux qui présentent une cyclicité rapide (5jours) et peuvent ovuler plusieurs ovocytes, ce qui va limiter le temps d’exposition pour observer un effet. Des altérations ou amélioration de l’activité gonadique seront plus facilement analysables sur un temps court. D’autre part, nous souhaitons utiliser des rats et non des souris, puisque les effets de ces polluants seront testés en collaboration dans un deuxième temps sur un modèle de rate développant spontanément le syndrome des ovaires polykystiques. Pour les femelles, nous les exposerons aux pesticides après le sevrage et nous les étudierons au cours de la puberté et au stade adulte pour étudier la fertilité. Pour les mâles, ils seront exposés au stade adulte afin d’étudier les paramètres reproducteurs.
Imagerie fonctionnelle par IRM du cerveau chez le rat (Rattus norvegicus) lors de tests comportementaux de résolution de problèmes : contribution à l’étude de l’évolution des fonctions cognitives de haut niveau chez les vertébrés.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Tués à la fin de l'acquisition IRM parce que le manganèse qui leur a été injecté les exposerait à une dégradation rapide de leur état de santé, 60 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal est hébergé seul, entraîné jusqu'à vingt sessions d'une heure à ouvrir une boîte munie de loquets, puis contenu pour recevoir l'injection de manganèse avant deux heures d'IRM sous anesthésie générale. Un rat qui montre des signes de douleur reçoit un antidouleur mais sort alors de l'expérience, l'analgésie faussant les résultats d'imagerie. L'effectif, lui, ne vient d'aucun calcul exposé ici, seulement d'études d'imagerie antérieures que le porteur ne cite pas.
Objectifs
De nombreuses espèces de mammifères, d’oiseaux, et même de poissons, possédant des cerveaux bien différents, présentent des capacités cognitives complexes comme la résolution de problème. Ces capacités sont apparues dans un petit nombre d’espèces de chaque groupe de façon indépendante au cours de l’évolution. Cette étude, utilisant le rat comme modèle mammifère, nous servira de point de comparaison avec les données chez les oiseaux et les poissons, et permettra ainsi de mieux comprendre comment les cerveaux de rongeurs, d’oiseaux et de poissons, bien différents morphologiquement, peuvent posséder des capacités cognitives similaires Notre projet consiste à identifier les régions du cerveau impliquées dans ces comportements. En parallèle d’un projet en cours visant à étudier la résolution de problèmes chez les oiseaux et les poissons téléostéens (un très grand groupe de poissons osseux), nous souhaitons étudier les bases neuroanatomiques de la résolution de problèmes chez les mammifères en utilisant le rat (Rattus norvegicus) comme modèle. En effet, ces rongeurs sont connus comme étant capables d’accéder à des sources de nourriture pourtant bien protégées, notamment en utilisant leur intelligence. Pour tester ces capacités, nous avons mis au point un test comportemental (ouverture de boite puzzle munie de plusieurs loquets pouvant être assemblés les uns aux autres pour augmenter la complexité de la tâche ; et nécessitant la manipulation fine de ces objets ainsi que la compréhension du lien logique entre chaque élément de la boite pour résoudre le problème). Nous voulons désormais identifier les régions cérébrales activées chez le rat lors de la résolution de plusieurs versions, plus ou moins complexes, de ce test, en utilisant l’IRM fonctionnelle comme modalité d’imagerie.
Bénéfices attendus
Les projets sur la neuroanatomie fonctionnelle de la résolution de problèmes chez les oiseaux et les poissons téléostéens montrent qu’il existe plusieurs organisations cérébrales différentes susceptibles de produire des comportements similaires. En élargissant notre étude à un modèle rongeur, le rat, nous complèterons les connaissances fondamentales sur l’évolution du cerveau et de la cognition chez les vertébrés, en identifiant les structures cérébrales impliquées dans la résolution de problèmes chez les mammifères. Cette étude sera à mettre en miroir avec des études similaires chez les primates (y compris l’Homme) pour identifier les potentielles différences entre les rongeurs et les primates.
Procédures
Entrainement à la tache de comportement : jusqu’à 20 sessions (1 heure par session, une session par jour). Contention puis injection de manganèse (moins de 5 minutes), indispensable pour l’acquisition d’images d’IRM fonctionnelle, test comportemental (une session d’1 heure) et, à la suite de la session de comportement, imagerie par résonance magnétique (IRM) sous anesthésie générale durant environ 2 heures. Chaque animal est soumis à la procédure une seule fois.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont le stress lié à l’hébergement individuel, de l’injection de manganèse et à l’anesthésie, ainsi qu’à la douleur potentielle liée à l’injection de manganèse
Devenir
Etant donné la toxicité potentielle à moyen terme du manganèse, les animaux sont euthanasiés à la fin de l’acquisition IRM. Leur réutilisation, adoption ou replacement n’est pas possible, le risque d’une dégradation rapide de l’état de santé de l’animal dans les semaines suivant la fin de la procédure étant très important.
Remplacement
Dans le cadre de notre projet, l’usage d’animaux est essentiel, puisque nous étudions l’évolution du système nerveux et de la cognition. Le rat est un modèle rongeur adapté à notre question scientifique, étant donné ses capacités cognitives (capable de résoudre le test comportemental) et la possibilité de réaliser de l’imagerie fonctionnelle par résonance magnétique.
Réduction
Pour ces expérimentations, le nombre d’animaux utilisés sera limité aux stricts besoins de nos analyses statistiques. Des études IRM précédemment publiées chez les rongeurs nous ont permis de déterminer le nombre d’individus nécessaire et suffisant.
Raffinement
Dès leur arrivée, les animaux sont pris en charge et leur bien-être est évalué régulièrement par des zootechniciens compétents. La température de la pièce est surveillée. Aussi, la communication entre le personnel de zootechnie et les expérimentateurs est optimisée pour permettre un suivi adéquat des animaux. Pour cela nous utilisons une grille d'évaluation des points limites qui prend en compte des comportements ou signes visibles tels que la présence d’un pelage sale, de posture anormale ou de comportements susceptibles d’indiquer une douleur. En cas de douleur, une analgésie est appliquée (injection d’antidouleurs), mais l’animal devra être sorti de la procédure, l’analgésique pouvant impacter les résultats d’imagerie fonctionnelle Enfin, la présence de lésions visibles (plaies, fracture) sera également surveillée. De nombreux éléments permettant la construction de nids seront ajoutés à l'hébergement pour fournir de l'enrichissement. Les animaux étant isolés afin de suivre la performance individuelle de chaque rat (la boite puzzle ne doit être accessible qu’à un seul rat à la fois), les cages seront placées les unes à côté des autres pour permettre un contact visuel entre les animaux et réduire les effets du stress qu’un isolement serait susceptible de causer. De plus, il sera possible aux animaux d’entendre les vocalisations de leurs congénères, ainsi que de sentir leur odeur. Les IRMs, non invasives et indolores, seront réalisées sous anesthésie par un opérateur qualifié.
Choix des espèces
Nous utilisons des rats pour plusieurs raisons : d’une part, il s’agit d’une espèce connue pour son intelligence et la facilité avec laquelle elle peut être entrainée à réaliser une tâche comportementale. D’autre part, notre scanner IRM est adapté aux rongeurs et plusieurs articles précédemment publiés attestent de la possibilité d’utiliser ce type d’imagerie chez le rat. Enfin, des atlas et outils de traitement d’images IRM spécialement développés pour le rat nous permettent d’analyser nos résultats de façon optimale et de les comparer facilement aux données de la littérature. Nous travaillons sur des animaux adultes, car il nous est nécessaire d’étudier un cerveau pleinement développé.
Rétinopathie diabétique chez le rongeur
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles sensoriels
Rats : 740
Jusqu'à huit instillations oculaires par jour et des injections dans l'œil une à deux fois par semaine sous microscope chirurgical : 740 souris et 740 rats rendus diabétiques vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Au bout d'un mois de diabète, les rats malades ne pèsent plus que 50 à 60 % du poids des rats témoins du même âge, boivent et urinent davantage, perdent leur tonus et se voûtent. Presque tous sont tués à l'issue pour les analyses histologiques, 80 animaux écartés avant l'étude pour un défaut de l'œil pouvant être réutilisés ailleurs. Le porteur retient le rat et la souris pour la rapidité d'apparition des signes de rétinopathie, et annonce un modèle destiné à tester des traitements, dont la mise au point occupera la première des cinq années du projet.
Objectifs
L’objectif du projet est d’utiliser un modèle de rétinopathie chez le rat et la souris diabétique afin de tester l'efficacité de traitements potentiels. La rétinopathie diabétique est une complication du diabète qui atteint l'œil au niveau de la rétine et serait la première cause de cécité avant 65 ans. Le taux élevé de sucre dans le sang entraine une cascade d’évènements qui conduisent à la dégradation des cellules neuronales et des petits vaisseaux sanguins de la rétine. Ces vaisseaux deviennent poreux, ils perdent leur étanchéité ce qui conduit à des hémorragies et des exsudats qui lèsent la rétine. La maladie peut évoluer vers une rétinopathie proliférative avec une production anormale de nouveaux vaisseaux peu fonctionnels, des décollements de la rétine et des saignements dans le vitré. Un œdème au niveau de la macula, zone de la rétine responsable de la bonne acuité visuelle, peut survenir à tout moment et entrainer la perte de la vision. Le diabète a également des conséquences sur la cornée et le cristallin, structures dont la transparence est nécessaire pour la vision. Le projet s'étale sur 5 ans, après une période de mise en place des modèles dans notre établissement pendant la première année, nous estimons que pourront se dérouler des études de test d'efficacité de traitement. Ces études comporteront au maximum 5 groupes de 10 animaux, pour comparer l'efficacité de plusieurs concentrations d'une molécule ou plusieurs molécules entre elles par rapport à un traitement placebo. Nous estimons pouvoir réaliser 2 études par an, pendant 4 ans.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est de proposer un modèle expérimental pour évaluer l'efficacité de nouveaux traitements des complications du diabète au niveau de la rétine qui sont invalidantes pour les patients et peuvent aboutir à la cécité. La recherche de traitement est en constante évolution, pour intervenir à différents stades de la maladie et préserver au mieux la visions des patients.
Procédures
L’induction du diabète chez les rats et les souris se fait par injection d’un produit qui agit sur le pancréas. Le taux de glycémie sera contrôlé sur bandelette une à deux fois dans l'étude par le prélèvement d'une goutte de sang à la queue de l'animal. Les examens ophtalmologiques qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie, ce type d'examen ne dure que quelques minutes. Les administrations de produits se feront soit par instillations (gouttes oculaires), soit par injections. Ces instillations ou injections nécessitent le maintien de l’animal afin de l’immobiliser. Ces procédures sont extrêmement rapides et ne prendront pas plus d’1 ou 2 minutes. Les gouttes oculaires peuvent être administrées plusieurs fois avec généralement une moyenne de 3 administrations et un maximum de 6 à 8 administrations par jour. Les administrations de produit par injection au niveau de l'œil se feront sous anesthésie locale et générale si besoin, leurs fréquences sont plus limitées, une à deux fois par semaine. Ces procédures sont aussi un peu plus longues et nécessitent de placer l’animal sous un microscope chirurgical. Il faudra compter quelques minutes (en général 5 minutes par animal) pour réaliser de telles administrations. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif du traitement administré ou tout autre marqueur d'intérêt. Ces prélèvements se feront sur animal vigile et le temps nécessaire aux prélèvements ne dépassera pas les 5 minutes par animal.
Impact sur les animaux
Les animaux sont rendus diabétiques, leur glycémie augmente. L’hyperglycémie altère les vaisseaux sanguins et les nerfs avec une répercussion sur différents organes, ce qui peut entrainer notamment des troubles cardiovasculaires, au niveau des reins, et au niveau de l’œil. Les animaux diabétiques ont un besoin de boire et des urines accrus, et perdent du poids. Ils perdent du tonus et prennent un aspect vouté au cours du temps. Les animaux n’ont plus ou peu de gain de poids malgré une consommation d’eau et de nourriture accrue. Au bout d’un mois de diabète, le poids des rats malades représente 50 à 60 % du poids des rats contrôles du même âge, la différence semble moins importante chez la souris qui serait plutôt autour de 80% du poids des souris contrôles non induites au bout d'un mois de diabète. Les examens qui seront pratiqués pour la réalisation du projet ou les administrations de produit par instillations (gouttes oculaires), ou par injections seront rapides (quelques minutes) et ne devraient pas porter atteinte au bien-être de l'animal, elles impliquent le maintien de l'animal manuellement afin de l'immobiliser, cette manipulation est transitoire et sans impact sur sa locomotion future. Certains examens ou administration de produits, notamment au niveau de l'œil, nécessitent l’immobilisation complète pendant plusieurs minutes de l'animal, seront pratiqués sous anesthésie légère. L’animal est replacé rapidement dans son environnement habituel, sans conséquences majeures sur son état, si ce n’est la gêne transitoire due à l’injection de produits. Des prélèvements pourront être réalisés sur animal vigile et la durée de l'action ne dépassera pas les 5 min, le volume sera adapté au minimum pour ne pas nuire à l’animal. Le stress dû au maintien de l'animal, à la piqûre de l'aiguille, une rougeur peut apparaitre au site de prélèvement, ne doit pas impacter le mode vie de l'animal une fois l'action finie.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, tous les animaux qui auront suivi la totalité de la procédure expérimentale seront mis à mort pour permettre de réaliser les évaluations ex vivo (évaluations histologiques, dosage de produit...). Pour les études d’efficacité de traitement, les animaux n’ayant pas suivi la totalité de la procédure (estimé à environ 10%, hormis ceux exclus pour cause de points limites) pourront être réutilisés dans d’autres procédures expérimentales compatibles avec l’avis du vétérinaire. Ces animaux sont des animaux qui sont exclus de l'étude en raison d'un défaut anatomique ou physiologique détecté aux examens de baseline au niveau de l'œil avant le début de l’étude. Ces animaux n'auront pas reçu d'induction de la pathologie, ni d'administration de traitement, seulement des examens qui ne sont pas invalidants mais qui potentiellement nécessitent une anesthésie.
Remplacement
Compte tenu des particularités physiologiques et anatomiques de l’organe concerné et l’absence pour l’instant de modèle alternatif pour ce type de projet, nous aurons recours à des animaux. Les lignées cellulaires ou les systèmes alternatifs comme les organoïdes ne permettent d’étudier qu’une partie des mécanismes. L’œil est un organe complexe soumis à de nombreuses interactions. En effet, l’œil est composé de différents tissus (vasculaires, rétinien neuronal, vitréen, cornéen) de physiologie différente soumis aux variations environnementales, aux interactions des tissus et organes voisins. Les souris permettent d’étudier les effets systémiques de la maladie sur les structures de l’œil. Les études in vivo permettent d’observer les réponses physiologiques d’un traitement dans un organisme vivant en tenant compte des pharmaco cinétiques, des métabolites générés. Les souris et les rats permettent de suivre l’évolution de la maladie au cours du temps.
Réduction
Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et tient compte des variations du métabolisme, de la robustesse des mesures et de notre expérience. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à l'aide des tests statistiques paramétriques ou non paramétriques suivant la distribution des données, chaque groupe traité sera comparé à celui du groupe témoin. Un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures.
Raffinement
Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les animaux seront hébergés en groupe avec de l’enrichissement adapté à l'espèce. En raison de la polydipsie et de la polyurie des animaux diabétiques, une couche plus épaisse de litière sera déposée dans la cage et elle sera changée plus fréquemment, un biberon supplémentaire sera ajouté ; Les examens non invasifs pour évaluer la pathologie sont semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet ophtalmologique ou en cabinet vétérinaire. Les examens de l'œil qui requièrent un immobilisme de l'animal pourront être réalisés sous anesthésie pour son confort. Afin de réduire le stress de l'animal lors d'examens nécessitant l'immobilisation de l'animal, une administration d'anesthésique sera réalisée. Lors des anesthésies des substituts de larmes sont régulièrement instillés sur les cornées pour éviter le dessèchement, un dispositif est prévu pour éviter l’hypothermie (enceinte chauffante, coussin, ou lampe). Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum.
Choix des espèces
L’apparition des signes cliniques recherchés de la rétinopathie est rapide selon les articles de la bibliographie. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée. Dans la littérature, les rats et les souris ont une sensibilité durable dans le temps à la perméabilisation vasculaire rétinienne en réponse au diabète. Les animaux, rats et souris, seront de jeunes adultes à leur arrivée dans notre animalerie, âgés de 6 semaines minimum à l'induction du diabète conformément aux publications de référence qui servent de base à ce modèle. Ils entrent en étude après une période d’acclimatation d'un minimum de 5 jours.