Rats

14 080 rongeurs, 7 040 souris et 7 040 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les composés leur sont administrés par voie orale, intraveineuse, intrapéritonéale, intramusculaire, sous-cutanée ou intranasale, jusqu'à 120 administrations par animal, avec des prélèvements sanguins pouvant retirer 15 % de leur volume sanguin. Le porteur prévoit que certains animaux atteignent les points limites du fait des substances elles-mêmes, ce qui déclenchera leur mise à mort anticipée. Deux phrases suffisent au RNT pour exposer objectifs et bénéfices de cette évaluation toxicologique de candidats médicaments, sans nommer aucun composé ni justifier l'effectif de 14 080 animaux.

Objectifs

L’évaluation toxicologique de nouveaux candidats médicaments est une étape clé dans leur processus de développement. Ce projet vise donc à évaluer le profil toxicologique de nouveaux candidats médicaments.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’avancer dans la caractérisation de nouveaux candidats médicaments en s’assurant de leur innocuité chez l’animal avant toute administration chez l’Homme.

Procédures

1) L’administration des composés à tester ou de leur solvant en moins d’une minute par animal pendant la durée de l’étude pourra être réalisée via différentes voies d’administrations : - par voie orale (une administration pour la procédure 1 – jusqu’à 28 administrations pour la procédure 2 – jusqu’à 120 administrations pour la procédure 3) - par voie intraveineuse (une administration pour la procédure 1 – jusqu’à 14 administrations pour la procédure 2 – jusqu’à 24 administrations pour la procédure 3) - par voie intrapéritonéale (une administration pour la procédure 1 – jusqu’à 28 administrations pour la procédure 2 – jusqu’à 24 administrations pour la procédure 3) - par voie intramusculaire (une administration pour la procédure 1) – par voie sous cutanée (une administration pour la procédure 1 – jusqu’à 28 administrations pour la procédure 2 – jusqu’à 120 administrations pour la procédure 3) – par voie intranasale sous anesthésie gazeuse a l’isoflurane (1 administration pour la procédure 1) 2) De 1 à 3 prélèvements sur 24h pourront être réalisés jusqu’à 2 fois dans l’étude avec un volume total ne dépassant pas 15% du volume sanguin de l’animal avec un temps de récupération de 2 semaines minimum. Le prélèvement pourra être fait à la veine submentale, saphène (sans anesthésie). Les prélèvements se feront sur une durée de deux minutes par animal.

Impact sur les animaux

On pourrait observer des effets indésirables (stress, douleur de courte durée) liés à la voie d’administration des composés ou aux composés testés en eux même avec pour certains animaux l’atteinte potentielle des points limites. Des effets indésirables (stress, douleur de courte durée) liés aux prélèvements sanguins pourraient également être observés.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures expérimentales, des analyses sur les organes étant nécessaires pour évaluer l’innocuité des molécules testées.

Remplacement

A ce jour, aucun modèle cellulaire ne permet de rendre compte des potentiels effets indésirables in vivo des nouveaux candidats médicaments. De plus l’évaluation de la toxicité potentielle des candidats médicaments est une étape clé de leur développement.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’études, et donc le nombre d’animaux utilisés, les différents candidats médicaments seront préalablement testés in vitro. Ne rentreront dans les études in vivo que ceux ayant montré le plus d’efficacité ainsi qu’une absence de toxicité dans ces tests in vitro. Le nombre d’animaux utilisés par étude sera réduit au maximum de manière à pouvoir observer de potentiels effets indésirables et est adapté des recommandations de l’OCDE associées à la réalisation d’étude toxicologique chez le rongeur. Pour la détermination des doses maximales tolérées un groupe vehicule unique sera utilisé tout au long du processus afin de réduire le nombre d’animaux. De plus, l’administration des composés se fera séquentiellement ce qui permettra d’utiliser le nombre minimum d’animaux possible en n'incluant pas les reste des animaux prévu si le composé est toxique. Enfin, les études de toxicité chronique avec récupération ne se feront que sur les dose maximales testées la encore afin de réduire le nombre d’animaux. De ce fait, ce projet permet de réduire le nombre de composés qui seront testés dans les études d'éfficacité nécessaires aux études précliniques.

Raffinement

Afin de réduire le stress, une acclimatation d’au moins 4 jours sera réalisée avant l'entrée en étude. Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé en continu (température, pression, hygrométrie, renouvellement d’air, alternance jour/nuit) relié à un système d’alarme. La densité dans les cages sera en conformité avec les recommandations et autant que possible, les groupes d’animaux dans les études resteront ceux formés pendant l’acclimatation. Les animaux et leurs conditions d’hébergement (environnement, nourriture, eau de boisson) seront sous surveillance quotidienne. Enfin, si les points-limites préalablement établis sont atteints, l’animal sera mis à mort éthiquement et de façon anticipée afin d’éviter toute souffrance. En cas d’apparition de signes de souffrance animale, de la nourriture pourra être ajoutée dans les cages sous forme de nourriture humidifiée. Lors de la mise à mort les animaux seront placés sous anesthésie profonde à l’isoflurane. L’environnement des animaux sera enrichi à leur arrivée et pendant toute la période d’acclimatation (maisons en carton, carrés de coton, feuilles de cellulose, …).

Choix des espèces

L’évaluation toxicologique des candidats médicaments est une étape clé de leur développement qu’il est nécessaire de réaliser dans au moins une espèce de rongeurs. Pour cela ce projet sera réalisé chez la souris et/ou chez le rat qui sont les deux espèces de rongeurs les plus utilisées pour des études de toxicologie. Cela permettra également de définir les doses maximales pouvant être utilisées dans les futures études d’efficacité qui seront réalisées dans ces deux espèces. L’âge des animaux utilisé dans ce projet sera choisi en fonction de l’indication du nouveau candidat médicament.

Une injection de buprénorphine trente minutes avant, une anesthésie gazeuse de quarante-cinq minutes, un fémur entaillé pour y créer un défaut osseux, une plaque d'ostéosynthèse vissée, puis des injections d'analgésique deux fois par jour pendant trois jours : 32 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié d'entre eux reçoit en plus une greffe osseuse prélevée sur leur propre squelette. Le RNT annonce trente animaux dans sa rubrique consacrée à la réduction, quand le tableau des dommages attendus en déclare trente-deux. Tous sont tués, quatre semaines ou trois mois après la chirurgie, pour que leurs fémurs soient prélevés puis testés en traction et en flexion.

Objectifs

La distraction ostéogénique est une procédure permettant un allongement osseux par allongement d’un cal, qui est la substance fibreuse liant initialement les deux fragments d’une fracture, à la suite d’une ostéotomie, qui est le geste consistant en la réalisation de cette fracture. Cette technique est utilisée pour corriger entre autres des défauts de croissance osseuse ou pour combler les défauts osseux en traumatologie. Afin de faciliter l’activation de la distraction, nous avons développer un distracteur mandibulaire activé magnétiquement. Ce projet est un exemple parmi d'autres de dispositifs médicaux utilisant les propriétés mécaniques et magnétiques des aimants Néodyme. Ces dispositifs induisent la présence d'un champ magnétique statique de l'ordre du Tesla sur des tissus biologiques sains ou en cours de reconstruction, notamment, dans le cas qui nous concerne ici, sur de l'os. Cependant, si le champ statique généré par l’aimant intégré dans un dispositif se situe dans les limites normatives d’innocuité, des articles de la littérature ont observé qu’il pourrait avoir des effets bénéfiques sur le remodelage osseux. La plupart des études ont été menées sur des lignées cellulaires d'ostéoblastes. D'un point de vue macroscopique, des études ont montré que la densité des os augmente en présence de champs magnétiques à tel point qu'un usage thérapeutique est envisagé. L’analyse des caractéristiques biomécaniques, histologiques et volumétriques d’os soumis à un champ magnétique statique permettra une meilleure compréhension et caractérisation de cet effet. Confirmer et identifier le mécanisme clair de cet effet, à savoir le rôle de l'intensité et de la topologie du champ, est la principale motivation du projet dont cette expérimentation animale fait partie. La greffe est une technique très répandue et simple pour traiter les pertes de substance osseuse. L’utilisation in vivo de greffon osseux soumis à un champ magnétique statique permettra d’analyser ces caractéristiques, en s’apparentant le plus à un cal osseux formé lors d’un procédé de distraction. Les fixateurs internes utilisés lors des temps opératoires intègreront ou non des systèmes d’aimants permanents afin d’étudier l’influence d’un champ magnétique statique sur la consolidation osseuse.

Bénéfices attendus

Le bénéfice montré sur une étude in vivo, évaluant l’effet de l’application d’un champ magnétique statique interne sur un greffon osseux protégé par un manchon périosté permet d’envisager le développement de nouveaux dispositifs utilisables en pratique clinique courante entraînant une amélioration de cicatrisation osseuse et donc diminuant le risque d’échec de procédure et le temps de convalescence. Cette recherche s’applique particulièrement à la reconstruction osseuse de patients fragiles ne pouvant bénéficier de procédés de reconstruction lourds (d’un point de vue chirurgical ou anesthésique) en leur proposant une solution alternative sûre et produisant un os de bonne qualité. Par ailleurs, la fabrication de plaques d’ostéosynthèse interne nouvelle génération magnétisées pourrait voir son utilité étendue dans toutes ostéosynthèses avec une accélération du processus de consolidation, même en l’absence de défect osseux.

Procédures

Chaque animal sera soumis une fois à une injection sous-cutanée (moins d'une minute) de buprénorphine 30 minutes avant l’anesthésie, à une anesthésie générale par isoflurane d’une durée de 45 minutes avec administration durant cette période d’une injection (moins d'une minute) sous-cutanée d’antibiotique type céphalosporine, à une intervention chirurgicale avec pour 14 rats la réalisation d’un défaut osseux non critique sur un fémur et pour 16 rats la réalisation d’un défaut osseux critique avec mise en place d’un greffon osseux autologue sur un fémur, et dans tous les cas une fixation par plaque d’ostéosynthèse interne. Au réveil de l’animal, il bénéficiera d’une injection de buprénorphine (moins d'une minute) à 6 heures de la chirurgie puis de manière bi-quotidienne durant les 3 jours post-opératoire. Des injections supplémentaires d’analgésique (moins d'une minute) de manière biquotidienne pourront être réalisés sur signes d’appels. Pour 14 rats, la mise à mort sera faite par une injection intrapéritonéale (moins d'une minute) à 4 semaines de la chirurgie, pour les 16 autres, la mise à mort sera faite par la même technique à 3 mois de la chirurgie. Les animaux seront manipulés quotidiennement afin de vérifier l’état de la cicatrice jusqu’à confirmation d’une bonne cicatrisation et seront pesés trois fois par semaine jusqu’au sacrifice.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à une anesthésie gazeuse par isoflurane, une intervention chirurgicale, une injection sous-cutanée d’antibiotique et une injection d’analgésique 30 minutes avant l’intervention, une injection d’analgésique à 6h de la chirurgie et de manière biquotidienne sur les trois jours post-opératoire ainsi qu’une mise à mort médicamenteuse par injection intra-péritonéale. En cas de signes de douleurs, les animaux pourront être soumis à de nouvelles injections d’analgésiques dans les jours suivants. La manipulation des animaux pour leur contrôle clinique peut générer un stress bien que celui-ci soit minime. L’intervention chirurgicale avec défaut osseux stabilisé par ostéosynthèse interne peut induire un stress et entrainer l'apparition d'une légère boiterie, bien que la mise en charge immédiate soit recommandée. La cicatrisation cutanée peut être responsable de démangeaison ou de douleur en cas d’inflammation locale.

Devenir

Pour évaluer l'intérêt de la présence d'un champ magnétique statique dans la réparation osseuse, les os doivent être prélevés, dans ce cas les fémurs, et les animaux mis à mort.

Remplacement

Les méthodes alternatives in vitro ne permettent pas l’analyse des caractéristiques structurelles mécaniques par des tests biomécaniques de traction et de flexion. Elles ne rendent pas compte non plus des modifications osseuses de l’architecture histologique et volumétriques en condition réel avec présence d’inflammation à la suite d’une intervention chirurgicale et de contrainte de pression par remise en charge. L’utilisation des animaux est nécessaire pour cette étude car il est impossible de vérifier in vitro ou par d’autres moyens nos hypothèses. Seuls les prélèvements osseux sur animaux (analyse ex vivo) nous permettront d’étudier simultanément l’effet du champ magnétique sur l’architecture et la mécanique osseuse. Le recours à un modèle animal est indispensable afin d’évaluer les effets du champs magnétiques sur la consolidation osseuse.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est optimisé pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Leur nombre a été restreint au minimum indispensable de façon à obtenir des données nécessaires à l’étude comparative des deux techniques. L’analyse de la littérature nous a permis de définir u nombre d’animaux réduit mais suffisant (n=30 : 14 pour la phase 1 et 16 pour la phase 2) de telle sorte à exploiter statistiquement les résultats obtenus avec les différents outils d’analyses (microCT, test mécanique, examen histologique). La comparaison des valeurs moyennes et des déviations standards obtenues pour chaque paramètre (microstructural, spectral…) fera l’objet de tests statistiques.

Raffinement

La chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale. L'anesthésie sera gazeuse avec une induction et un entretien par isoflurane. Une dose d’antalgique est administrée 30 minutes avant la chirurgie en sous cutanée renouvelé ensuite 6 heures après le réveil et de manière bi-quotidienne sur les trois jours post-opératoire. L’animal sera placé dans une enceinte chauffée et surveillé jusqu’à son réveil. Le personnel de l’animalerie et les expérimentateurs assureront une surveillance quotidienne. De la nourriture gélifiée sera placée dans la cage des rats en post-chirurgie pour faciliter la prise alimentaire. Pour éviter les potentiels points limites (perte de poids>20%), les rats seront suivis quotidiennement par la mesure de la prise alimentaire et la mesure du poids corporel sera réalisé 3 fois par semaine (lundi, mercredi et vendredi). S’il y a apparition de points limites, les mesures décidées seront immédiatement mises en œuvre.

Choix des espèces

Le modèle du rat est bien décrit dans la littérature comme le modèle de choix en première intention pour les études animales visant à évaluer la consolidation et la ré ossification des défauts critiques osseux. Les procédures expérimentales sont bien codifiées et maîtrisées au laboratoire. Ces raisons justifient pleinement le choix de ce modèle. Les animaux utilisés seront utilisés à 10-12 semaines.

1 500 rats et 1 000 souris vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie d'entre eux passant trois semaines enfermés dans un caisson à atmosphère appauvrie en oxygène. Les autres reçoivent une injection destinée à déclencher une hypertension pulmonaire en quatre semaines. Viennent ensuite une échographie, une thermodilution, une mesure de pression artérielle pulmonaire et un prélèvement sanguin, tous sous anesthésie, avant le prélèvement du cœur et des poumons. Le porteur indique que les animaux deviennent essoufflés et inactifs mais estime la souffrance modérée puisqu'ils ne seront pas soumis à l'effort, et renvoie les éventuels essais cliniques à un horizon "plus long terme".

Objectifs

L’hypertension pulmonaire (HTP) est une maladie grave, caractérisée par une élévation de la pression artérielle pulmonaire qui conduit à une hypertrophie cardiaque droite, puis à une insuffisance cardiaque droite, à l’origine du décès des patients. Les traitements disponibles actuellement ne sont pas curatifs. La recherche est donc très active dans l’identification de nouvelles cibles afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques à visée curative. Pour cela, des modèles animaux pertinents sont indispensables. L’objectif de ce projet est donc d’utiliser des modèles animaux (rats, souris) d’HTP expérimentale classiquement utilisés dans la littérature et au laboratoire de façon à pouvoir s’appuyer sur de nombreuses données déjà acquises. Il existe différents type d’HTP chez l’Homme et nous allons donc utiliser deux modèles animaux pour étudier d’une part l’HTP associée à une hypoxie chronique (HC) similaire aux HTP associées aux maladies respiratoires hypoxémiantes (asthme, bronchite chronique, fibrose…) et d’autre part, l’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) induite par une injection d'une substance pharmacologique pour étudier l’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) idiopathique (de cause inconnue). A ce jour aucune lignée cellulaire ne rassemble toutes les caractéristiques pathophysiologiques de l’HTP donc nous avons besoin d’utiliser des animaux notamment pour mieux connaitre les mécanismes de cette pathologie ce qui permettra ensuite de tester de potentiels nouveaux traitements et d’évaluer leurs potentiels effets bénéfiques et/ou effets secondaires.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra à court terme de mieux comprendre les mécanismes associés à la pathologie de l’HTP/HTAP. Cette étude permettra également de mettre en évidence l’effet thérapeutique de substances pharmacologiques sur ces divers mécanismes mis en jeu. L’efficacité de traitements préventifs versus curatifs seront mis en évidence ainsi que d’éventuels effets secondaires. Si les études sont positives, des études cliniques pourront être envisagées à plus long terme sur les substances bénéfiques identifiées de façon à mettre en place un traitement plus efficace avec un rapport bénéfice-risque minimum pour les patients et adapté au type d’hypertension pulmonaire HTP et/ou HTAP.

Procédures

Pour obtenir le modèle de rat ou souris hypoxiques chroniques, les animaux sont maintenus dans un environnement où l’air contient moins d’oxygène pour une durée de 3 semaines. Pour le modèle d’HTAP idiopathique chez le rat, une seule injection d’une substance pharmacologique appropriée sur animal vigile va induire au bout de 4 semaines de l’HTAP idiopathique. Le potentiel thérapeutique de substances pharmacologiques sera testé sur animal vigile. La fréquence d’injection et donc le nombre d’injections sera ajustée en fonction de la substance considérée. Lorsque l’HTP/HTAP est installée, des mesures in vivo sont effectuées sur chaque animal : -des mesures échographiques sous anesthésie (1 fois sur chaque animal, durée 10 minutes) -des mesures de thermodilution sous anesthésie (1 fois sur chaque animal, durée 15 minutes) -des mesures de pressions artérielles pulmonaires sous anesthésie (1 fois sur chaque animal, durée 20 minutes) -un prélèvement de sang sous anesthésie (1 fois sur chaque animal, durée 5 minutes) -après euthanasie, prélèvement du cœur et des poumons (1 fois sur chaque animal, durée 5 minutes)

Impact sur les animaux

Chez l’homme, l’HTP/HTAP n’induisent pas de souffrances élevées mais plutôt une gêne respiratoire exacerbée lors d’un effort. Chez l’animal il a été noté une légère dyspnée et les rats/souris sont généralement assez inactifs. Etant donné que les animaux ne seront pas soumis à l’effort, la souffrance est considérée comme modérée dans ce type de protocole d’induction d’une maladie. Bien qu’il n’y ait pas de perte de poids, il y a une prise de poids moindre lors de la mise en place de l’HTP/HTAP chez les animaux. Les points d’injection des substances et solvants peuvent développer une inflammation locale. Ils seront donc contrôlés.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés de façon à récupérer le cœur et le poumon pour faire diverses analyses.

Remplacement

Il est indispensable de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeu dans cette maladie afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, et seules des expérimentations in vivo chez l’animal pourront permettre d’atteindre ce but. Il est très difficile d’obtenir du tissu de patient souffrant d’hypertension pulmonaire. De plus, étant donné qu’il existe de nombreux types d’HTP associées à diverses maladies (respiratoires hypoxémiantes notamment), il est très difficile d’obtenir des résultats reproductibles sur ce type de tissu (provenant de patients ayant subis une greffe de poumon). Les cellules en culture nous apportent des informations qui doivent être vérifiées in vivo ou in vitro sur des cellules ou des tissus fraichement isolés car le phénotype des cellules change avec les conditions de culture. De plus, cette pathologie implique plusieurs organes et seul l’animal entier permet les interactions entre ces différents organes.

Réduction

Pour limiter le nombre d'animaux : (1) les rats contrôles utilisés seront les mêmes pour les deux type d’HTP, (2) une partie des utilisateurs utiliseront le poumon droit et l’autre partie des utilisateurs utilisera le poumon gauche (dans tous les cas les deux poumons seront utilisés), (3) une planification des expériences sera établie au long de chaque année d’expérimentation pour optimiser au mieux les techniques réalisées sur chaque animal avec utilisation de cellules en culture et enfin, (4) parallèlement à ce protocole, des études seront réalisées sur des cellules d’artères pulmonaires humaines exposées à l’hypoxie et étirées in vitro pour simuler l’HTP hypoxique. Quatre statutaires (et leurs étudiants) travaillent sur ce projet donc l’utilisation des animaux sera optimisée et en concertation avec tous les utilisateurs. Des précautions seront prises pour éviter les biais expérimentaux (travail en aveugle, partage des tissus et/ou cellules issues de ces tissus). L’estimation du nombre d’animaux est basée sur les analyses des études préalablement menées au laboratoire, en accord avec les données de la bibliographie, compte tenu des quantités de tissu nécessaires et de la taille requise des échantillons pour une analyse statistique pertinente dans ce type de recherche.

Raffinement

Des points limites ont été mis en place et seront appliqués. Le caisson hypobare sera ouvert 3 fois par semaine afin de renouveler l’eau et la nourriture, et d’effectuer le change de la litière une fois par semaine. Un système automatisé permet de modifier la pression atmosphérique progressivement et automatiquement pendant 45 minutes pour le retour à la pression atmosphérique normale ou la mise en hypobarie. Le caisson et les cages sont transparents ce qui permet de surveiller les animaux. Les animaux contrôles seront juste placés dans leurs cages habituelles. A l’occasion de l’ouverture du caisson (3 fois par semaine), tous les animaux seront pesés. Si le décès survenait avant la fin du protocole, le protocole serait également modifié ou arrêté. En cas de détection de signe de douleur, dans un premier temps, une administration d’antalgique sera réalisée. Lors de l’anesthésie un tapis chauffant sera utilisé pour le bien-être de l’animal. Le degré d’anesthésie sera surveillé en permanence.

Choix des espèces

Le rat et la souris sont des espèces classiquement utilisées pour le développement de modèles d’HTP. De plus, le laboratoire utilise ces espèces depuis plusieurs années, et dispose donc de nombreuses données sur lesquelles s’appuie le présent projet. Le choix du rat est également justifié par le fait que le modèle d’HTAP fonctionne difficilement chez la souris. Néanmoins, l’utilisation de la souris permet d’envisager l’utilisation de modèles transgéniques qui sont moins nombreux chez le rat et qui sont nécessaires à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires. L’HTP/HTAP sont des pathologies de l’adulte donc nous utilisons des animaux adultes en fin de protocole.

Jusqu'à 800 séries de sons par session d'enregistrement, jusqu'à 20 administrations dans la vie de l'animal, deux à dix mois en cage individuelle avec contrôle alimentaire : 400 rats porteurs d'une mutation du gène de l'X fragile vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Chacun subit d'abord une neurochirurgie d'environ une heure sous anesthésie générale, qui laisse un connecteur fixé à son crâne dont la cicatrisation doit être surveillée. Les prélèvements sanguins, jusqu'à trois par semaine, se font sous anesthésie générale quand le protocole l'exige. L'objet est d'évaluer par électroencéphalographie des candidats médicaments en cours de développement, le porteur présentant le recours à un modèle animal comme le moyen d'optimiser un développement pharmaceutique qu'il décrit comme long et coûteux.

Objectifs

L’objectif du projet est d’évaluer des signaux électroencéphalographiques (EEG) dans un modèle animal de syndrome du chromosome X fragile, qui est une maladie génétique entrainant un déficit intellectuel, des troubles du comportement et des anomalies physiques. Les patients présentant le syndrome de l’X fragile présentent des troubles mentaux approchant ceux du spectre autistique : anxiété sociale, hypersensibilité sensorielle, retard mental. Ce syndrome est causé par la mutation d’un gène unique. Un modèle de rat porteur d’une mutation analogue du même gène est disponible, et ce rat mutant présente des caractéristiques qui rappellent fortement le syndrome de l’X fragile. L'électroencéphalographie est un outil de choix pour aborder l’activité cérébrale, en raison de son caractère transposable entre le rat et l’homme. En effet, les activités cérébrales de base sont largement conservées chez les mammifères. Les observations effectuées chez le rongeur permettent donc de prédire des résultats chez l’homme. Il est donc intéressant d’utiliser ce rat mutant pour évaluer des candidats médicaments en cours de développement et visant à améliorer la qualité de vie des patients victimes du syndrome X fragile. Ces candidats médicaments seront évalués sur le rat mutant, et leurs effets seront évalués à travers l’électroencéphalographie. Des marqueurs biologiques mesurés permettront d’évaluer l’impact sur les rats mutants, et permettront de prédire une efficacité chez le patient. Ces marqueurs biologiques seront de deux types. Des marqueurs spontanés seront évalués : les animaux seront laissés libres, éveillés et dans des conditions calmes, sans intervention dans leur environnement. Les différences spontanées entre les rats mutants et contrôles pourront être comparées, et les effets des candidats médicaments sur ces différences seront évalués. Des marqueurs évoqués seront également évalués : les animaux seront toujours laissés libres et éveillés, et des stimulations sonores leur seront présentées. Ces stimulations sonores induiront des réponses neuronales qui seront mesurées et quantifiées. A nouveau, les différences entre les deux types de rats seront comparées, et les effets des candidats médicaments seront évalués.

Bénéfices attendus

Le développement de nouveaux médicaments est très coûteux et prend beaucoup de temps. Afin d’optimiser ce développement et ainsi fournir aux patients des traitements efficaces, l’utilisation d’un modèle animal pertinent est nécessaire. L’utilisation d’une lignée de rats mutants, modélisant le syndrome X fragile humain, permettra de mettre en évidence de nouvelles molécules thérapeutiques susceptibles d’améliorer la qualité de vie des patients victimes de ce syndrome.

Procédures

L’ensemble des animaux de ce projet vont subir une neurochirurgie d’environ une heure, réalisée sous anesthésie générale. Les animaux pourront être soumis à des stimulations sonores une à deux fois par semaine. Une diminution de l’activité locomotrice et une déshydratation passagère pourront être observées. Une douleur modérée pourra apparaître dans les heures suivant l’intervention chirurgicale. Les animaux pourront être soumis à des stimulations sonores qui seront réalisées sur l’animal éveillé une à deux fois par semaine. Les pulsations sonores individuelles dureront un maximum de 100 ms à une intensité de 90 dB maximum. Ces pulsations sonores seront regroupées soit en paires avec 1 seconde d’écart entre les 2 sons, soit en train de 2 secondes avec un son toutes les 25 ms. Chacune de ces séries de sons pourront être répétées jusqu’à 800 fois au cours d’une session d’enregistrement : jusqu’à 400 fois avant administration et jusqu’à 400 fois après administration. Lors des tests pharmacologiques le nombre d’administrations (durée d’une minute en moyenne) sera limité à 20 dans la vie de l’animal, avec un minimum de 3 jours entre chaque jour d’administration. Lors des tests pharmacologiques en administrations répétées, les injections pourront être réalisées jusqu’à deux fois par jour, sur une durée maximum de 28 jours. Différents prélèvements sanguins pourront être faits au cours des procédures expérimentales. Ils seront conduits sous anesthésie générale si nécessaire, en fonction du protocole établi dans chaque étude (durée : moins de 20 min par prélèvement). Le nombre de prélèvements sanguins sera limité à 3 par semaine. Les animaux seront hébergés en cage individuelle tout le long du projet (entre 2 à 10 mois) et seront soumis à un contrôle alimentaire tout au long de leur hébergement (quelques mois).

Impact sur les animaux

Le modèle de rats utilisé ne présente pas d’effets indésirables aboutissant à une mortalité précoce des animaux. La chirurgie aboutira à la présence d’un connecteur attaché au crâne de l’animal. La cicatrisation autour de ce connecteur devra être surveillée et soignée. Des administrations pharmacologiques nécessiteront la manipulation des animaux, induisant un stress. Au point d’injection, des indurations ou des inflammations locales et temporaires pourront apparaître. Les prélèvements sanguins induiront un stress de contention, une douleur brève au point de prélèvement. Malgré les études toxicologiques préalablement conduites et exigées avant tout test de composé sur nos animaux, certains effets indésirables non attendus peuvent survenir, notamment une perte de tonus musculaire, une somnolence ou à l’inverse une excitation du fait des mécanismes d’action des molécules testées. Un stress pourra être induit par l’hébergement individuel et le contrôle alimentaire.

Devenir

Ce projet implique l’implantation de dispositifs d’enregistrement de signaux électroencéphalographiques. De plus, dans certains cas, une vérification d’exposition aux molécules testées et une caractérisation histologique des tissus cérébraux seront nécessaires. Les animaux seront donc tous mis à mort à la fin du projet.

Remplacement

Cette étude nécessite l'utilisation de modèles animaux car elle cible des mécanismes physiopathologiques complexes, produit par le cerveau dans son ensemble qui ne peut pas être modélisé par un système plus simple (ex. culture cellulaire ou informatique).

Réduction

Le nombre d'animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe sans compromettre les objectifs du projet. Il a été estimé selon notre expérience antérieure nous ayant permis d'obtenir un nombre suffisant d’animaux enregistrés pour réaliser les tests statistiques précédents et garantir la prédiction d’effets transposables à l’humain.

Raffinement

Le raffinement a été appréhendé à travers les conditions d'expérimentation et d'hébergement qui sont optimisées afin de s'assurer du bien-être des animaux tout au long des procédures expérimentales. Le projet prévoit des procédures engendrant des douleurs post-opératoires modérées. Toutefois, les animaux recevront un protocole de soins pré et postopératoires comprenant une anesthésie, des antidouleurs, des anti-inflammatoires et une évaluation clinique quotidienne. Des critères d’arrêt anticipé de l’expérimentation en cas de survenue d’une complication ont été identifiés. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long des expériences et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de douleur et définissant les points limites adaptés. Cela nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. Pour les expériences d’enregistrement EEG en réponse à des stimulations sonores , ces stimulations seront limitées à une intensité sonore en dessous de l’intensité dommageable et qui n’induit pas de réaction de stress sur les animaux.

Choix des espèces

Nous utiliserons une lignée de rats mutants, dont la mutation est similaire à celle présente chez les patients du syndrome de l’X fragile. Le choix de l’espèce est donc directement lié à cette similarité : la mutation de ce même gène chez l’homme et le rat induit en effet des troubles similaires dans les deux espèces. Les animaux sont manipulés au minimum à l’âge de 8 semaines puisque nous souhaitons évaluer les modifications des activités électriques chez des animaux adultes. A ce stade, le cerveau est mature et présente des caractéristiques intéressantes pour reproduire les troubles observés chez le patient humain.

Six échantillons de biomatériau sont implantés sous la peau de chaque rat, ce qui permet de limiter l'effectif à 15 animaux sur trois ans. Ces 15 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour l'analyse histologique des échantillons implantés. L'intervention dorsale dure une trentaine de minutes et peut provoquer une douleur modérée, l'évaluation de cette souffrance étant confiée au personnel de l'animalerie. L'étape sert à vérifier la biocompatibilité de matrices osseuses avant leur implantation en site osseux, le porteur indiquant que les produits destinés à l'humain doivent "nécessairement" être testés sur des animaux non-humains avant tout essai clinique.

Objectifs

Les pertes de substances osseuses représentent un défi en chirurgie orale et orthopédique. En clinique, l'utilisation de greffe où le patient est son propre donneur est très répandue mais présente certains inconvénients (chirurgie additionnelle, morbidité du site donneur...). Ainsi, le développement de biomatériaux en régénération osseuse est indispensable pour pallier ces limitations. Ce projet vise à évaluer de nouveaux matériaux réalisé par une technique de fabrication spécifique (moulage dynamique). Cette nouvelle technologie de fabrication permet de créer des matériaux avec plusieurs tailles de porosités (interne et externe) afin de d'améliorer les propriétés de la matrice, et dont le design peut être adapté à l’indication clinique ciblée. L'objectif de cette étude est d'évaluer la biocompatibilité des biomatériaux étudiés grâce au modèle d'implantation sous-cutané chez le rat. Il s'agit d'un modèle animal déjà développé et maîtrisé au sein de notre unité qui a l'avantage d'être facile à mettre en œuvre et reproductible.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à s'assurer de la biocompatibilité de ces nouvelles matrices avant de les implanter en site osseux pour évaluer leur potentiel pour la régénération osseuse. A plus long terme, ce projet permettrait le développement de nouveaux dispositifs médicaux (matrices pour la régénération osseuse) dans la perspective d’une utilisation en clinique. La technique de fabrication (par moulage dynamique) pourrait permettre de fabriquer des matériaux sur mesure pour les patients.

Procédures

Les animaux auront une chirurgie cutanée au niveau dorsal. L’intervention a lieu une seule fois et dure environ 30 mn par animal.

Impact sur les animaux

L'implantation en site sous-cutané peut entraîner une douleur modérée. De rares complications post-opératoires sont à envisager. L’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de réaliser des analyses histologiques des échantillons implantés

Remplacement

L'absence de toxicité cellulaire des matériaux utilisés aura au préalable était évaluée in vitro selon la norme en vigueur. En suivant, les produits destinés à être implantés chez l'humain doivent nécessairement être testés chez l'animal avant les essais cliniques. Les matériaux doivent être d'abord testés dans modèle de rat, et si les résultats obtenus sont satisfaisants, d'autres essais seront envisagés permettant de valider tous les aspects nécessaires à une future application chez l'Homme. Ces différentes phases ne peuvent être remplacées actuellement dans le processus de validation d'un nouveau dispositif médical.

Réduction

Ne seront testés in vivo que les matériaux ayant démontré une absence de toxicité cellulaire in vitro, et une seule lignée de rats sera utilisée. De plus, afin de réduire le nombre de rat, 6 échantillons seront implantés par animal. Enfin, la même lignée de rats que celle déjà utilisée au sein de notre unité est choisie, afin de diminuer le nombre de conditions à évaluer et d'éviter l'ajout de rats supplémentaires pour cette évaluation.

Raffinement

Pour réduire l’angoisse : une période d’acclimatation de deux semaines sera respectée avant le début des expérimentations afin d’obtenir une meilleure récupération post-opératoire. Une cage après l’autre sera amenée à la salle de chirurgie, séparée de la zone d’hébergement des animaux pour éviter toutes sources de stress des animaux opérés et des animaux à opérer. Avant la chirurgie, les animaux recevront une dose d'analgésique afin de prévenir toute douleur lors de l'opération. Ils seront ensuite anesthésiés et placé sur un tapis chauffant. Après la chirurgie, chaque rat se réveille dans une cage à part pour éviter le contact avec des congénères non anesthésiés. Après le réveil complet, le rat sera réintégré à sa cage d’origine. Les animaux seront ensuite observés sur une semaine. Toutes les modifications de comportement et d’aspect seront consignées dans un fichier informatique par les personnes impliquées directement dans ce projet. Des critères stricts permettront d’évaluer le bien-être des animaux. Un raffinement est également mis en place lors de l'hébergement : les animaux sont avec leurs congénères avec présence de litière en copeaux de peupliers et de jouets, ainsi que des bâtons à ronger qui sont régulièrement mis dans les cages.

Choix des espèces

Le Rat est une espèce adaptée à la première étape de validation chez l'animal de matériaux destinés au traitement des pertes osseuses. Le rat permet de valider la biocompatibilité du produit. De plus, il est utilisé dans de nombreuses études. La lignée choisie est d’ailleurs volontairement identique à celle utilisée par d’autres travaux réalisés également au sein de notre unité, permettant la comparaison des résultats ainsi que la diminution du nombre d’animaux nécessaires, par la reprise de données déjà disponibles. En cas de résultats satisfaisant et supérieurs à ce qui est obtenu avec les produits de référence actuellement sur le marché, une validation chez le gros animal sera nécessaire. Des rats adultes de 9 à 10 semaines, d'un poids d'environ 350 g seront utilisés. En effet les animaux utilisés doivent avoir achevé leur développement et leur croissance.

112 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun commençant par une heure trente de chirurgie pour l'implantation d'un cathéter et d'un émetteur dans une artère. Soixante d'entre eux passent ensuite seize séances d'auto-administration de cocaïne ou de nicotine, quinze séances où l'appui sur le levier ne délivre plus rien, et huit séances de rechute, à raison de deux heures par séance en cage individuelle. Les cinquante-deux autres reçoivent vingt-deux injections, dont la moitié sous anesthésie. Les bénéfices annoncés, de nouvelles voies thérapeutiques contre l'addiction, restent à l'état de perspective, l'objectif immédiat étant de vérifier une hypothèse sur le rôle du rythme cardiaque et de la pression artérielle dans le déclenchement de la rechute.

Objectifs

L’addiction aux drogues est un trouble chronique aux conséquences très préjudiciables. La caractéristique déterminante de l’aspect chronique, quelle que soit la drogue, est la très forte probabilité de rechute dans la consommation même apres de longues périodes d’abstinence. Ainsi une nouvelle consommation après abstinence peut être suffisante pour faire rechuter l’individu et ceci quelquesoit la drogue reconsommée. Cette vulnerabilté permanente à rechuter vient du fait que toutes les drogues agissent sur le même circuit cérébral de la récompense et de la motivation. Néanmoins, à côté de ces effets centraux cérébraux, la drogue produit également des modifications du rythme cardiaque, du péristaltisme intestinal, de la pression artérielle…etc. Notre hypothèse de travail stipule que ces signaux périphériques perceptibles très rapidement par l’individu et spécifiques à chaque drogue (ici cocaïne et nicotine) peuvent participer à précipiter la rechute.Le projet à trois objectifs : L’objectif 1 vise à identifier et dissocier les effets périphériques des substances étudiées en utilisant leurs analogues qui ne passent pas dans le cerveau et en mesurant l’activité du cœur via l’implantation d’un capteur en intra-artériel. Nous comparerons leurs effets avec ceux des drogues elles-mêmes. Nous comparerons un état de conscience anesthésié et un état vigile et nous comparerons mâles et femelles. L’objectif 2 vise à démontrer que la cocaïne et la nicotine induisent la rechute dans la consommation de drogues, mais pas leurs analogues qui ne passent pas dans le cerveau. Pour cela nous utiliserons un modele de rechute chez le rat tres proche de ce qui se passe chez l’Homme. L’objectif 3 vise à relier l’absence de rechute observée avec les analogues qui ne passent pas dans le cerveau avec des mesures du cœur très différentes et spécifiques à chaque substance lors de l’absence de rechute. Au niveau opérationnel ces trois objectifs se déclinent en deux procédures.

Bénéfices attendus

D’un point de vue de santé publique, les résultats de ce projet apporteront des informations essentielles pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques des addictions aux drogues en mettant en évidence le rôle crucial des signaux périphériques de ces drogues dans le risque de rechute. Il sera alors possible de proposer de nouvelles voies thérapeutiques.

Procédures

112 animaux subiront une chirurgie de 1h30 avec implantation d’un cathéter et d’un implant télémétrique. Parmi ces 112 animaux, 52 animaux recevront par l’expérimentateur 11 injections (1/jour/ pendant 3 sec) en état vigile et 11 injections (1/jour/pendant 3 sec) avec 3 injections maximum par semaine en état anesthésié avant d’être euthanasiés. Soixante autres animaux s’auto administreront volontairement (durée de chaque autoadministration est de 3 sec) des drogues (cocaïne pour le groupe Cocaïne et nicotine pour le groupe Nicotine) dans des cages spécifiques en hébergement individuel au cours de 16 séances quotidiennes de 2h par jour, 5 jours sur 7. Ensuite, une procédure d’extinction sera imposée sur 15 séances quotidiennes (2h/ jour sans drogues) dans les mêmes cages, en hebergement individuel à raison de 5 jours sur 7. Chaque animal subira ensuite 8 sessions de rechute en hébergement individuel de 2 heures chacune avec injection soit de cocaïne soit de nicotine soit de leurs analogues respectifs sur une période de 13-14 jours à raison de 5 jours sur 7 et avec une séance extinction entre chaque jour d’injection de drogue. Ils seront ensuite euthanasiés. 112 animaux subiront une chirurgie de 1h30 avec implantation d’un cathéter et d’un implant télémétrique. Parmi ces 112 animaux, 52 animaux recevront par l’expérimentateur 11 injections (1/jour/ 3 secondes) en état vigile et 11 injections (1/jour) avec 3 injections maximum par semaine en état anesthésié avant d’être euthanasiés. Soixante autres animaux s’auto administreront volontairement (durée de l’auto administration est de 3 sec) des drogues (cocaïne pour le groupe Cocaïne et nicotine pour le groupe Nicotine) dans des cages spécifiques au cours de 16 séances quotidiennes de 2h par jour, 5 jours sur 7. Ensuite, une procédure d’extinction sera imposée sur 15 séances quotidiennes (2h/ jour sans drogues) dans les mêmes cages à raison de 5 jours sur 7. Chaque animal subira ensuite 8 sessions de rechute de 2 heures chacune avec injection soit de cocaïne soit de nicotine soit de leurs analogues respectifs sur une période de 13-14 jours à raison de 5 jours sur 7 et avec une séance extinction entre chaque jour d’injection de drogue. Ils seront ensuite euthanasiés.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront une chirurgie longue pouvant induire des douleurs modérées traitées par l’utilisation d’analgésiques. Ils seront ensuite soumis à la possibilité de s’auto-administrer des drogues puis à des sessions d’extinction. Ces sessions où l’animal appuiera sur le levier sans recevoir de drogues peut créer un stress modéré. Enfin la nicotine et la cocaïne peuvent provoqués des effets secondaires sur l’organisme comme des problèmes cardiovasculaires modérés. Lors de ces séances d'autoadministration et d'extinction les animaux sont placés dans des cages spécifiques et en hébergement individuel pendant 2 heures /séances ce qui peut créer un stress modéré. Ils sont ensuite remis en cages collectives jusqu'à la prochaine séance.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour réaliser des prélèvements de cerveau et récupérer le capteur de télémétrie intra-artériel.

Remplacement

Remplacer les animaux dans ces expériences est difficile car ces expériences mettent en jeu des systèmes biologiques complexes et des comportements spécifiques, comme la recherche de drogue et la rechute. Les interactions entre le cerveau, les organes et les signaux corporels ne peuvent pas être reproduites avec des modèles in vitro ou informatiques actuels. De plus, ces études nécessitent d’observer les effets simultanés et globaux des drogues sur l’organisme entier, ce qui est impossible avec des alternatives. Malgré les progrès dans les modèles alternatifs, les animaux restent indispensables pour comprendre ces mécanismes.

Réduction

L’utilisation d’implants télémétriques permet de multiplier les injections de molécules dans des expérimentations de screening de molécules. Cette technique permet de réduire le nombre d’animaux car il n’est plus utile de multiplier celui-ci par le nombre de molécules. de plus les tests statistiques qui seront fait pourront être pairés réduisant la variabilité inter-individuelle et permettant des tests plus puissants avec moins d’individus.

Raffinement

L’utilisation de la télémétrie permet de raffiner les protocoles éthiques en réduisant le stress et les manipulations des animaux, en permettant des mesures non invasives en continue et en augmentant la qualité des données. Non seulement elle évite d’utiliser beaucoup d’animaux comme dit précédemment mais elle évite aussi les procédures répétées invasives. La chirurgie d’implantation télémétrique est faite sous anesthésie et analgésie. Les animaux sont surveillés minimum 2 fois par jour pendant 3 jours post-opératoire puis quotidiennement. Grâce à cette technique, les animaux sont ensuite laissés libres de leurs mouvements dans la cage d’hébergement. Les animaux seront hébergés par deux minimum afin de respecter leur caractère grégaire, dans des cages de taille réglementaire avec un milieu enrichi (tunnel, matériel de nidification). Une feuille de scoring pos-opératoire a été faite : elle comporte des points limites généraux et spécifiques permettant une intervention des expérimentateurs en fonction du niveau de gravité

Choix des espèces

Le rat est le modèle le plus communément utilisé pour les expérimentations d’autoadministration. Les connaissances sur celui-ci sont solides et sa physiologie reste, malgré ses différences, proches de celle de l'humain. Enfin, le rat est particulièrement compatible avec notre projet car sa taille supérieure à celle de la souris permet de faciliter les chirurgies (pose de capteur télémétrique et cathéter intre-veineux). Nous utiliserons des animaux à l’âge adulte soit entre 7 et 8 semaines. Ils devront faire 225/250gr afin d’avoir le poids recommandé pour l’implantation des capteurs télémétriques.

Deux heures d'IRM sous anesthésie, la tête maintenue par des barres d'oreilles : 240 souris et 40 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour confronter les images aux analyses histologiques. Avant cela, chaque animal subit une chirurgie stéréotaxique de 45 minutes pour recevoir dans le cerveau un vecteur viral ou une protéine pathologique, avec douleur et perte de poids possibles pendant un à trois jours. Une lignée de souris présente en outre un risque de crises d'épilepsie vers l'âge de deux mois. Le porteur défend le choix des rongeurs en concédant que ces modèles des maladies d'Alzheimer et de Parkinson sont "imparfaits", tout en les qualifiant d'"indispensables".

Objectifs

La maladie d’Alzheimer, la maladie de Huntington ou la maladie de Parkinson appartiennent à une classe de maladies neurodégénératives (les protéinopathies) causées par des protéines mal repliées ou mal dégradées qui s’agrègent dans le cerveau. Outre leur perte de fonction initiale due au mauvais repliement, ces protéines solubles acquièrent des fonctions toxiques, notamment en s’agrégeant et se propageant dans le cerveau. De plus, il existe actuellement un débat scientifique sur la nature des agrégats de ces protéines qui présentent des degrés variables de toxicité et des caractéristiques de propagation conduisant à différentes formes de maladies. De plus en plus de personnes âgées souffrent de protéinopathies, et en particulier de la maladie d’Alzheimer et de la maladie de Parkinson. Il est d’un intérêt considérable de pouvoir distinguer les formes solubles et agrégées des protéines impliquées dans les maladies d’Alzheimer et de Parkinson, de quantifier leur agrégation précocement et de surveiller leur propagation de manière non invasive. Cela permettra de mieux comprendre la physiopathologie de ces maladies neurodégénératives en recherche fondamentale et préclinique, et à terme, de disposer d’un outil de diagnostic et de suivi. Une modalité d'IRM relativement récente appelée CEST (Chemical Exchange Saturation Transfer) a été proposée pour imager les protéines avec une excellente résolution spatiale. Elle pourrait notamment permettre de distinguer les protéines solubles des agrégats de protéines. Ainsi, l'objectif principal de notre projet est d'établir un outil de surveillance et de diagnostic des maladies d’Alzheimer et de Parkinson reposant sur l'imagerie non invasive d'agrégats protéiques spécifiques impliqués dans ces maladies neurodégénératives. Notre deuxième objectif est de mieux comprendre les voies pathologiques (agrégation, propagation à travers les structures cérébrales) de chaque type de protéines, et comment celles-ci, selon leurs propres caractéristiques, peuvent provoquer des formes de maladies différentes.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de faire de l’IRM-CEST une nouvelle modalité diagnostique pour les maladies neurodégénératives. Cette approche offrirait des avantages significatifs à la recherche fondamentale et préclinique pour une meilleure compréhension des processus pathologiques impliqués dans ces maladies et en fournissant des biomarqueurs pertinents pour l’évaluation des traitements futurs. Elle profiterait également à la recherche clinique, puisque toutes les méthodes développées sont transférables sur des scanners cliniques.

Procédures

- Tous les animaux (280) seront scannés à l’IRM sous anesthésie (durée : 2h00). - L’injection d’un vecteur viral (qui permet d’introduire dans les cellules cérébrales un gène codant pour la protéine pathologique) sous anesthésie profonde (durée de la chirurgie : 45 min) sera réalisée sur 40 animaux et sous conditions stériles. - L’injection de la protéine d’intérêt ou d’un liquide contrôle sous anesthésie profonde (durée de la chirurgie : 45 min) sera réalisée sur 240 animaux et sous conditions stériles. L’analgésie est toujours utilisée avec l’anesthésie lors des chirurgies.

Impact sur les animaux

Nous nous attendons à ce que certaines chirurgies puissent causer de la douleur, du stress ou une perte de poids temporaire. Des effets indésirables (stress ou douleur) peuvent durer pour un temps variable d’une journée à 3 jours après l’opération. Un risque de stress cardio-respiratoire est aussi présent lors de l’anesthésie. Cetrtaines souris peuvent présenter un risque de crise d’épilepsie vers l’âge de 2 mois.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin de confronter les mesures in vivo aux résultats histologiques.

Remplacement

Ce projet fait appel à deux modèles de souris de la maladie d'Alzheimer ainsi qu’un modèle rat de la Maladie de Parkinson déjà caractérisés. A l’heure actuelle, ce projet ne peut pas être réalisé à l’aide de modèles cellulaires, ni être simulé par des techniques informatiques. En effet, les symptômes neurologiques cognitifs de la maladie ne peuvent être répliqués que chez l’animal. Par ailleurs, les régulations hormonales ou les réactions inflammatoires liées aux maladies d’Alzheimer et de Parkinson ne peuvent pas être reproduites dans des modèles cellulaires 2D ou des organoïdes. Enfin, l’étude de la diffusion des protéines Tau dans le cerveau requiert toute la complexité des réseaux neuronaux qui se mettent en place au cours de la maturation et du vieillissement du cerveau. Il est donc nécessaire de réaliser ce projet sur des espèces modèles mammifères comme la souris et le rat, présentant le plus possible de similitudes avec la physiologie humaine, c’est-à-dire possédant un cerveau complexe permettant d’exprimer des comportements sophistiqués.

Réduction

Le nombre maximal d’animaux utilisés pour ce projet (280 animaux dont 240 souris et 40 rats) a été défini au plus juste pour atteindre les objectifs scientifiques et être statistiquement pertinent compte-tenu de nos connaissances au début du projet. Pour définir statistiquement la taille des lots d'animaux à tester, nous nous appuyons sur des travaux publiés, ainsi que sur l'utilisation d’un logiciel in vivo, approprié pour l'évaluation statistique du nombre d’animaux requis. Par ailleurs, les techniques de neuro-imagerie développées dans ce projet permettent un suivi des animaux au cours du temps. Ceci permet d’augmenter la puissance statistique et de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre l’objectif scientifique.

Raffinement

- Examens IRM (sous anesthesie) : la douleur liée à l’utilisation de barres d’oreilles pour stabiliser l’animal est minimisée par application locale d'analgesie 5 minutes avant. - Stéréotaxies (sous anesthésie) : Un analgésique est administré 30 min avant la chirurgie ainsi qu’en post-opératoire. Une analgésie locale est mise en place 5 minutes avant l’incision chirurgicale et la douleur liée à l’utilisation de barres d’oreilles pour stabiliser l’animal est minimisée par application locale d'analgésie 5 minutes avant. Les animaux sont thermorégulés durant toute l’anesthésie jusqu’au réveil complet après réversion de l’anesthésie. - Points limites établis pour réduire la souffrance et le stress des animaux. En cas de perte de poids des animaux, une administration d’eau gélifiée enrichie en vitamines et glucose sera mise en place. - Des points limites spécifiques sont également prévus pour couvrir le risque de crise convulsive d'une lignée souris . Une surveillance quotidienne sera également mise en place pour minimiser les risques de crises d’épilepsie non détectées. - Les animaux sont hébergés en groupe, dans environnement à température contrôlée, avec un cycle diurne-nocturne de 12h. L’eau et la nourriture sont fournies à volonté. Les animaux sont examinés quotidiennement par les donneurs de soin, sous supervision permanente du vétérinaire du centre, également en charge du bien-être animal. L’environnement est enrichi par un système de nidification périssable renouvelé lors du change hebdomadaire.

Choix des espèces

Les modèles rongeurs sont pertinents car ils peuvent être observés in vivo par des scanners IRM à haute performance et ce, malgré la petite taille de leur cerveau. Par ailleurs, le projet de recherche est basé sur des modèles reconnus de la maladie d’Alzheimer et de la maladie de Parkinson. Bien qu'imparfaits, les modèles rongeurs de ces maladies neurodégénératives permettent d'étudier certains aspects de la pathologie et sont indispensables pour progresser dans la compréhension des mécanismes qui lui sont associés. Les animaux seront adultes afin de se placer dans des conditions expérimentales qui permettent de reproduire l’évolution de la maladie qui touche des adultes.