Rats
Evaluation préclinique de produits de santé pour la chirurgie des tissus mous
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Lapins : 1200
Cochons : 1800
Chèvres : 600
Moutons : 600
Des dispositifs de chirurgie des tissus mous, prothèses de renforcement abdominal, colles, poudres ou compresses contre les saignements, sont testés pour le compte d'un donneur d'ordre avant leur mise sur le marché. 4 500 animaux non-humains vont être utilisés, 300 rats, 1 200 lapins, 1 800 porcs, 600 chèvres et 600 moutons, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré ou menées sous anesthésie sans réveil. Chacun est opéré pendant une heure trente à deux heures trente pour recevoir le dispositif, et peut ensuite, selon les procédures, souffrir pendant quelques jours de vomissements, de diarrhées avec du sang dans les selles, de difficultés respiratoires ou d'un défaut d'hémostase. L'espèce dépend de la taille du produit : les petits dispositifs sont testés "préférentiellement" chez les rongeurs ou le lapin, les gros chez le porc, les ovins ou les caprins.
Objectifs
Il s’agit d’un projet de recherche et développement qui vise à étudier la performance (efficacité) de produits de santé utilisés en chirurgie des tissus mous et/ou d’en évaluer la tolérance (sécurité). Il peut s'agir de produits de renforcement abdominaux (prothèse de renforcement), de produits permettant d'arréter les saignements (colle, poudre, compresses...). Ces produits destinés à être mis en contact avec le corps humain doivent être préalablement testés pour garantir la sécurité des patients et l’efficacité lors de l'utilisation clinique. La réglementation exige de prouver l'efficacité des produits de santé et de réduire au minimum le risque de réactions indésirables avant de proposer un produit sur le marché. En ce sens, différents types d’essais peuvent être menés : - Essais de performance : - Essais de screening d’efficacité : Les essais de screening d’efficacité vérifient si la performance d’un produit mérite d’être approfondie ou s’il est nécessaire de mener d’autres études avant de passer aux essais de confirmation de performance. Ces essais sont essentiels dans la stratégie de réduction du nombre total d’animaux utilisés. - Essais de confirmation de performance : Les essais de confirmation de performance sont effectués après validation des essais de screening d’efficacité. Comme leur nom l’indique, ils visent à confirmer les résultats obtenus lors des essais préalablement menés sur un produit. - Essais de tolérance locale : Les essais de tolérance locale évaluent la réaction d’un organisme en contact avec un produit étranger. Dans ce projet, ces essais peuvent être réalisés en complément des essais de performance, sur les mêmes animaux. Les critères d’évaluation à prendre en considération sont définis lors de la rédaction du protocole d’essai. Ce projet pourra se conduire dans plusieurs EU partenaires, afin d'obtenir des résultats d'imagerie spécifique non disponible dans notre EU.
Bénéfices attendus
Ce projet permet d'obtenir des données de performance et de tolérance de produits de santé utilisés en chirurgie des tissus mous. En mimant au plus près l'implantation du dispositif chez les patients, ces études permettront de mieux appréhender la réaction de l’organisme au produit à tester, et ainsi améliorer la sécurité et/ou les performances du produit, avant sa mise sur le marché.
Procédures
Pour l'ensemble des procédures, tous les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale afin d'implanter le dispositif médical à tester (cette intervention chirurgicale peut durer entre 1h30 et 2h30). Cette intervention a toujours lieu sous anesthésie générale (chimique et gazeuse), et analgésie. L’antibiothérapie est ajoutée au cas par cas en fonction de l’invasivité de la chirurgie et des risques infectieux associés. Des prélèvements sanguins peuvent etre réalisés en cours d'étude (en général un prélèvement à la chirurgie et un prélèvement en fin d'étude, d'une durée de quelques minutes). Ceux-ci pourront se faire sous anesthésie ou non, selon le contexte de réalisation de cet acte (en cours de chirurgie, pendant le temps de l’étude ou juste avant l’euthanasie des animaux en fin d’étude). D'autres types d'interventions non douloureuses, de type IRM ou radiographies pour observer le dispositif en cours d'étude, peuvent être réalisées sous anesthésie légère (en général, en fonction de la durée de l'étude, 1 à 3 sessions d'imagerie peuvent etre envisagées en cours d'étude). L'IRM sera externalisé dans un EU partenaire, la durée de l'intervention est d'environ 1h30.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables pouvant survenir chez les animaux sont, selon les procédures, les suivants : - mise à jeun - stress liés à la chirurgie - perte de poids ou d’appétit liée aux effets de l’anesthésie et/ou de la chirurgie, pendant quelques jours - hématome ou oedème au niveau du site opératoire, pendant quelques jours - défaut d'hémostase (hypotension, pâleur muqueuse, apathie) - défaut d'oxygénation, d'étanchéité de la cage throracique, difficultés respiratoires pendant quelques jours - reflux gastrique, vomissements pendant quelques jours - diarrhées, présence de sang dans les selles pendant quelques jours. Les douleurs post-opératoires peuvent apparaitre et seront prises en charge par des mesures de raffinement. Les animaux recevront une anesthésie fixe afin de réaliser l'imagerie, pouvant induire un stress. Du produit de contraste pourra être injecté grâce à un cathéter en intraveineux. Une légère perte de poids (non systématique) pourrait être observée dans les quelques jours suivant l'anesthésie.
Devenir
Pour répondre aux objectifs de chacune des procédures du projet, des observations post-mortem sont nécessaires. En effet, la sécurité des produits est évaluée en observant la réaction des tissus au contact du dispositif à tester, et ceci se fait par prélèvements des tissus et organes entourant le produit, afin de réaliser des analyses microscopiques (histologie notamment, qui est la meilleure méthode d'évaluation des effets locaux induit par un produit étranger à l'organisme, comme l'inflammation par exemple). De même la performance peut, elle aussi, être évaluée par des tests spécifiques sur les organes et le dispositif prélevé (exemple : tests mécaniques sur des prothèses abdominales pour évaluer la résistance du dispositif). En raison des objectifs des procédures de ce projet, il n'est pas possible de maintenir en vie les animaux utilisés.
Remplacement
A ce jour, il n'existe pas de méthode alternative permettant d’évaluer la performance et la tolérance locale des produits de chirurgie des tissus mous en raison des interactions complexes s'établissant entre le tissus ciblé et le dispositif lui-même. De plus, l’utilisation d’animaux est requise dans la réglementation que doivent suivre les tests précliniques sur les dispositifs médicaux, avant de pouvoir lancer les tests cliniques.
Réduction
Le donneur d'ordre demandant la réalisation de ces tests s'engage à ne pas faire renouveler à l'identique un essai déjà mené précédemment. Par ailleurs pour réduire le nombre d'animaux inclus en étude, il est possible d'utiliser un même groupe "contrôle" (produit dont l'effet est déjà connu), pour plusieurs groupes "test" recevant des produits à tester différents. Les études de screening permettent également de sélectionner un produit test qui présente le plus d'intérêt à être développé, réduisant de ce fait le nombre de tests sur des produits ayant un intérêt moindre. Les études dites "pilotes" sur quelques animaux seulement, peuvent aussi servir à orienter les choix de poursuite de développement d'un produit ou le choix du modèle expérimental le plus approprié (matériel ou abord chirurgical le plus adéquat…), avant d'entamer les études réglementaires à plus grande échelle et devant répondre aux normes en vigueur pour l'élaboration du dossier pour la mise sur le marché (nombre d'animaux minimum, durée de mise en contact minimum, etc).
Raffinement
Pour limiter le stress des animaux, une période d’acclimatation pendant laquelle ils ne subissent aucune manipulation non indispensable est réalisée à leur arrivée dans l’EU. Ensuite, et avant la chirurgie, une période d’habituation aux actes spécifiques est réalisée si nécessaire pour réduire l’aspect anxiogène de ces manipulations (exemples : habituation aux pesées, habituation alimentaire). Des enrichissements sont présents dans l’environnement des animaux (exemple : jouets), et ces mesures sont renforcées en phase post-opératoire (ajout d’enrichissements : pommes dans la litière des porcs, ou friandises dans les jouets, et augmentation de la litière des ovins). Les transports des animaux vers les EU partenaires seront organisés dans le respect du bien-être animal et de la réglementation en vigueur (durée du transport jusqu'à 1h30 en fonction des EU avec ajout de litière et transport en groupe). Un contrôle clinique de chaque animal est réalisé par du personnel qualifié (vétérinaire, technicien ou zootechnicien) au départ et à l'arrivée. Lors des séances d'imagerie externalisées, afin de limiter le stress des animaux, une période de repos adéquate sera instaurée entre la réception des animaux et l'anesthésie et entre le réveil des animaux et le transport retour vers notre EU. La douleur des animaux : la chirurgie est réalisée sous anesthésie et analgésie (à base de morphiniques). En phase post-opératoire, les suivis quotidiens sont renforcés et des soins post-opératoires spécifiques peuvent être mis en place (désinfection des sites chirurgicaux à une fréquence adaptée). Les signes cliniques servant de points limites ont été définis, pour la prise de décision des mesures à mettre en place pour limiter les souffrances. Selon l'espèce, les prises de sang peuvent être réalisées sous anesthésie générale (injectable et/ou volatile, lors d'une phase de chirurgie par exemple), ou sous sédation légère (voir paragraphe sur la liste des médications) avec au besoin une analgésie, afin de maitriser le stress et la douleur potentielle. Les conséquences de l’anesthésie/chirurgie : du gel oculaire est appliqué au niveau de la cornée lors des anesthésies des animaux pour prévenir l'assèchement oculaire. Une attention particulière est portée à la lutte contre l'hypothermie : température de la salle, isolation du sol, couvertures, lampes chauffantes si besoin. En cas de doute, une mesure de la température rectale est réalisée.
Choix des espèces
L’espèce animale choisie est définie dans les textes de référence. Les produits de petite taille/miniaturisés seront testés préférentiellement chez les rongeurs ou le lapin. Les produits de taille importante seront préférentiellement testés chez le porc ou les ovins/caprins. Lorsque plusieurs espèces répondent aux critères, le choix est arbitré par la durée de l’essai (le long terme: espèces à longue durée de vie). Le stade de développement est exprimé en âge ou en poids. Dans la plupart des cas, l’utilisation d’animaux adultes est recommandée. Le stade de développement est pertinemment sélectionné en fonction de l'utilisation clinique du produit ou de sa taille par exemple. En l’absence d’exigence particulière, l’utilisation d’animaux au stade adulte est privilégiée. Cas particulier des porcs domestiques : étant donné les conditions d’hébergement, le comportement social et la manipulation des animaux, l’utilisation de porcs domestiques en croissance (âgés d’au moins 8 semaines) est la plus appropriée dans ce projet.
Évaluation de différentes approches thérapeutiques dans 2 modèles de diabète chez le rongeur (rat ou souris)
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
Rats : 755
Pour tester des implants abdominaux contre le diabète, 755 souris et 755 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue. 1 260 d'entre eux relèvent de procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, 210 d'un niveau modéré, 40 étant opérés sans réveil. Ils subissent une à deux chirurgies sous anesthésie gazeuse d'environ trente minutes, des soins post-opératoires de 48 à 72 heures, jusqu'à cinq prélèvements sanguins par 24 heures et des contentions répétées, avec le risque d'hypoglycémies et d'hyperglycémies provoquées. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne permet d'évaluer l'effet d'une molécule sur le diabète et décrit l'animal comme un "passage obligatoire" avant toute administration à l'être humain.
Objectifs
Le diabète est une maladie chronique qui se caractérise par un excès de sucre dans le sang ou hyperglycémie. Il existe 2 principaux types de diabète, dus à des dysfonctionnements différents : le diabète de type 1 (Pas de production d’insuline par le pancréas) et le diabète de type 2 (Résistance à l'insuline). En France en 2015, plus de 3,5 millions de personnes étaient traitées pour un diabète. Ce chiffre est en constante augmentation. En 2022, le nombre de patients est passé à plus de 4,3 millions, soit 6,3 % de la population, 44,8 % de femmes et 55,2 % d’hommes. Au niveau mondial, le diabète de type 2, le plus fréquent (plus de 90 %), est en forte progression : 108 millions en 1980, 422 millions en 2014 et 537 millions en 2021. Ce projet consiste à évaluer de nouvelles thérapies sur un modèle de rongeur diabétique (rat et souris). Ces nouvelles thérapies consistent en des implants placés dans l'abdomen en comparaison avec une technique de référence.
Bénéfices attendus
A long terme, les bénéfices attendus sont la découverte de nouveaux médicaments ou dispostifs pour traiter le diabète, une pathologie humaine touchant plus de 5 millions de personnes en France et plus de 600 millions dans le monde. Du fait de la cible thérapeutique, ce composé pourrait avoir aussi une application en médecine vétérinaire. A court terme, les bénéfices attendus sont de démontrer que le composé testé est actif dans un modèle expérimental de la pathologie ciblée ou d’évaluer ses éventuels effets secondaires avant son passage en phases cliniques. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont une acquisition de connaissances sur l’espèce utilisée (rongeurs) par le développement d’outils de raffinement de plus en plus adaptés et le choix de l’espèce la plus prédictive en fonction de l’objectif scientifique attendus.
Procédures
Les souris de ce projet pourront subir une anesthésie gazeuse (1 à 2 fois, environ 30 min/chirurgie), des soins post-opératoire pendant 48 à 72h, des administrations de produits d’analgésie (1 ou 2 avant la chirurgie puis 3 ou 5 sur les 48 à 72h de soins post opératoires, environ 1 min par administration) ou des prélèvements sanguins [(maximum 5 prélèvements /24h, durée: moins de 30 sec/prélèvement)], une contention lors de suivis cliniques (2 à 3 fois/semaine, environ 1 min).
Impact sur les animaux
Les animaux pourront subir un stress lié à la chirurgie et aux soins post-opératoires, un stress lié aux administrations des produits d’analgésie et/ou aux prélèvements sanguins, un stress lié à la contention lors de suivis cliniques et un stress lié aux effets d'une potentielle hypo- ou hyperglycémie.
Devenir
Euthanasie des animaux pour réaliser des prélèvements d’organe/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal ou euthanasie des animaux suite aux effets indésirables provoqués par le(s) produit(s) ou le modèle chez les animaux.
Remplacement
Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments ou dispositifs, ce projet est réalisé chez la souris ou le rat car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur le diabète. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament ou dispositif. A ce jour, la souris et le rat sont les espèces qui sont les plus adaptées à ce type de modèle d’étude.
Réduction
Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques adaptées au modèle. Pour obtenir un nombre suffisant de données scientifiques, le nombre d’utilisation d’animaux est notifié dans le paragraphe portant sur le nombre estimé d'animaux utilisés. Cependant, une réutilisation des animaux, après avis du vétérinaire, est envisagée et permettra de réduire le nombre réel d’animaux utilisés.
Raffinement
Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : •La mise au point de procédures rigoureuses, •La formation du personnel, •Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, •Le recours à des procédures les moins invasives possibles, •Le suivi d’éventuel signes cliniques, •La détermination des points limites, •Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire •Un protocole anesthésique adapté pour la chirurgie, •Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, •La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, •La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales.
Choix des espèces
La souris et le rat sont des espèces animales pertinentes et les plus couramment utilisées notamment pour évaluer l’efficacité de traitements anti-diabétiques, de par leurs facilités d’entretien, de stabulation, de manipulation, et leurs similitudes physiologiques avec l’espèce humaine. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement. Les produits testés n'ont pas de visée pédiatrique.
Evaluation d’une nouvelle génération de microbulles pour la délivrance de médicaments dans le cerveau de rat par sonoporation.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
96 rats vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie générale, chaque animal étant tué avant tout réveil. Chacun reçoit cinq injections, dont celles de microbulles de gaz et d'un colorant, avant une exposition du cerveau aux ultrasons de trente secondes, et il est tué une heure plus tard pour mesurer la quantité de colorant passée dans le tissu cérébral et l'étendue des microhémorragies. Le projet compare quatre solutions de bulles de taille unique, l'application aux tumeurs cérébrales et aux maladies neurodégénératives restant une perspective. Le porteur décrit des mesures acoustiques et un modèle cérébral en trois dimensions déjà réalisés, et affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne reproduit la complexité du système cérébrovasculaire.
Objectifs
A ce jour, la délivrance de médicament dans le cerveau par ultrasons exploite principalement des solutions de bulles de gaz de taille très hétérogène. Lorsque nous appliquons une séquence ultrasonore donnée sur une telle population de bulles, nous constatons que nous activons seulement une fraction de ces bulles, limitant ainsi l’efficacité de la délivrance intracérébrale de médicaments par ultrasons. De plus, leur utilisation ne nous permet clairement pas de distinguer les deux principaux régimes ultrasonores responsable de la perméabilisation des tissus, à savoir celui qui est considérée comme le plus sûre pour les tissus et le régime, qui endommagerait les tissus. Dans ce contexte, nous proposons d’exploiter des bulles de taille unique. En effet, nos données préliminaires in-vitro ont montré qu’utiliser de telles bulles permet de solliciter l’ensemble de la population de bulles et de mieux contrôler les deux régimes ultrasonores précédemment cités. Ce projet vise à : Objectif 1 - Évaluer 4 solutions de bulles de taille unique à perméabiliser efficicament le tissu cérébral, en mesurant l’accumulation d’un colorant par histologie, et sans induire des dommages tissulaires (microhémorragies tissulaires), qui seront analysés en histologie, 1 heure après traitement. Objectif 2 - Comparer cette efficacité et cette inocuité à celle d’une solution de bulles de taille très hétérogène.
Bénéfices attendus
Les ultrasons ont émergé comme une stratégie prometteuse de délivrance intracérébrale de médicaments. Cependant, l’utilisation de bulles de gaz de différentes tailles ne permet pas de toutes les activer dans un régime ultrasonore pour assurer une délivrance sûre et efficace de médicaments par ultrasons. L’exploitation de bulles de taille unique pourrait ainsi permettre de contourner les limitations des bulles de différentes tailles et de développer ainsi des protocoles de délivrance sûre et efficace de médicaments dans le cerveau par ultrasons pour le traitement de tumeurs cérébrales et de maladies neuropsychiatriques, neurodégénératives et neurologiques.
Procédures
• Injection de la solution anesthésique, de la solution analgésique, du liquide physiologique, de bulles de gaz, de colorant – 5 injections - 2 min • Exposition du cerveau aux ultrasons – 30 s
Impact sur les animaux
Nuisance 1 – Manipulation des animaux est une source de stress. Nuisance 2 – Positionnement des animaux dans le cadre d'expérimentation est une source de stress. Nuisance 3 – Le point d’injection de la solution d’anesthésie est susceptible d'être douloureuse. Nuisance 4 – Le point d’injection du liquide physiologique, de bulles de gaz et du colorant est susceptible d'être douloureuse. Nuisance 5 – Perméabilisation du tissu cérébral est une source de stress. Nuisance 6 – Le point d’injection de la solution d’analgésie est susceptible d'être douloureuse.
Devenir
A l’issu de la procédure, les animaux seront mis à mort 1h post-injection de la solution de colorant afin de quantifier le colorant dans le tissu cérébral et de mesurer la présence de dommages tissulaires.
Remplacement
Dans une première approche expérimentale, nous avons caractérisé et comparé des solutions de bulles de gaz de taille unique et de taille hétérogène sur des bancs de mesures acoustiques. Nous avons ensuite validé leurs propriétés à perméabiliser le tissu cérébral sur un modèle 3D in-vitro. Ces deux approches ont permis de réduire le nombre de paramètres acoustiques et la concentration et la taille de bulles. Dans la continuité de ce projet, nous souhaitons évaluer la perméabilisation du tissu cérébrale par ultrasons en exploitant des bulles de taille unique in-vivo. Par conséquent, le modèle animal ne peut être substitué par un autre modèle d’étude in-vitro ou in-silico car à ce jour, aucun modèle d’étude in-vitro ou in-silico ne peut reproduire la complexité d’un système cérébrovasculaire in-vivo.
Réduction
Sur la base de nos études antérieures, cette étude nécessite 96 rats. Nous réaliserons une étude statistique pour déterminer l’efficacité de la délivrance intracérébrale de colorant et l’innocuité de la procédure. Par rapport au groupe contrôle, il sera considéré comme significatif : 1) Une augmentation de 20% de la quantité de colorant dans le tissu cérébral et 2) Une augmentation de 10% de la quantité de dommages tissulaires (microhémorragies cérébrales).
Raffinement
Le stress des animaux est minimisé par l’implication d’un personnel qualifié pour l’expérimentation animale. Lors de la semaine d’acclimatation, l’habituation à la préhension/contention en renforçant nos actes sera réalisée par l’administration de friandises. Ils seront hébergés en groupe (2/cage) avec présence d’enrichissement (bâton à ronger, papier absorbant). Les animaux seront observés une fois pour jour. Toutes les stratégies d’analgésie, d’anesthésie et de soins seront mises en œuvre pour réduire au maximum tout inconfort qui pourrait être induit par les procédures. Après une semaine d’acclimatation, les rats seront anesthésiés par une injection d’une solution d’anesthésie et placés dans une boîte pendant 5 min. Dès que les rats auront des signes d’endormissement, ils seront sortis de la boîte et placés sur une couverture chauffante dans un cadre d'expérimentation. Une protection occulaire sera appliquée. La respiration (capteur électronique), la température (sonde endorectale) et le poids (balance) seront mesurés pendant les procédures. Sous anesthésie générale, les animaux seront mis à mort par injection d’un agent euthanasiant vétérinaire.
Choix des espèces
Dans la littérature et dans notre laboraoire, les rats âgés de 6 semaines, physiologiquement mâture sont couramment utilisés pour le développement de protocole de délivrance intracérébrale de médicaments par ultrasons en raison de l’existence de modèles rongeurs de cancers cérébraux, de maladies neuropsychiatriques, neurodégénératives et neurologiques.
Etude de biocompatibilité et de néovascularisation d’un assemblage de biomatériaux chez le rat irradié.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Maladies animales
Un assemblage de biomatériaux est implanté chirurgicalement chez 54 rats sous anesthésie générale, et la moitié d'entre eux reçoit ensuite six séances d'irradiation réparties sur trois semaines. Ces procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré et le porteur y attend des douleurs postopératoires, une dermatite radio-induite, des difficultés d'alimentation, de l'anxiété et de l'agressivité. Le texte annonce 54 animaux puis décrit la moitié du groupe comme "25 rats", écart que rien ne vient expliquer. Trois mois après la dernière intervention, tous sont tués et le dispositif retiré, les analyses d'intégration ne se faisant pas sur animal vivant.
Objectifs
La présente demande couvre une partie d’un large projet multidisciplinaire qui vise à développer une solution innovante pour résoudre un problème clinique pour lequel les solutions actuelles ne sont pas optimales : la reconstruction osseuse immédiate et personnalisée pour les cancers de la tête et du cou, tout en limitant la morbidité. Nous souhaitons modifier le procédé chirurgical standard de reconstruction des os du visage - qui consiste actuellement à utiliser un fragment d’os du patient - en proposant un dispositif idéal, combinaison de 4 biomatériaux. Le succès de ce projet permettra donc d'éviter le risque de séquelles esthétiques et morbides sévères aux patients atteints d’un cancer de la tête et du cou et ayant besoin d’une reconstruction osseuse, et ainsi d’améliorer leur qualité de vie et réduire le fardeau économique pour la collectivité. Le projet repose sur un consortium de 7 partenaires experts dans le domaine de la recherche clinique humaine et vétérinaire, du dispositif médical, et de la caractérisation des biomatériaux. Le dispositif médical mis au point sera constitué par un assemblage de 4 éléments distincts qui seront associés le jour de l’intervention. Plus particulièrement la partie du projet qui fait l’objet de cette présente demande d’autorisation a pour but d'évaluer l’efficacité de cet assemblage en termes de capacité à s’intégrer avec ou sans radiothérapie. La tenue du dispositif médical post-irradiation reste un challenge, compte tenu de l’impact de la radiothérapie sur les tissus environnant. La biocompatibilité sera évaluée par analyse du tissu autour de l’implant dans les différentes conditions. Cet essai est nécessaire avant l’essai clinique de reconstruction osseuse faciale par la procédure mise au point sur des animaux de compagnie souffrant de cancers de la cavité orale dans le cadre d’une médecine « One Health », puis sur des patients atteints de cancers de la tête et du cou.
Bénéfices attendus
A moyen terme, le projet permettra d'éviter le risque de séquelles esthétiques et morbides sévères aux patients atteints d’un cancer de la tête et du cou et aux animaux de compagnie ayant besoin d’une reconstruction osseuse, et ainsi d’améliorer leur qualité de vie et réduire le fardeau économique pour la collectivité. Le dispositif médical mis au point dans le cadre du projet pourra également bénéficier aux animaux de compagnie, pour lesquels il n’existe actuellement pas de solution de reconstruction des os de la face. Plus particulièrement, cette étude de chez le rat irradié est cruciale puisqu’elle permettra de donner les premières preuves de faisabilité d’utilisation du dispositif médical suite à une radiothérapie avant de passer à des essais cliniques sur des animaux de compagnie souffrant de cancer de la tête et du cou.
Procédures
Les 54 rats vont subir 1 chirurgie d’implantation du dispositif sous anesthésie générale d’environ 30 minutes. La moitié des animaux (25 rats) sera ensuite irradiée 2 fois par semaine pendant 3 semaines (soit 6 séances d’une heure maximum par animal à chaque fois), 4 semaines après l’implantation. 3 mois après la chirurgie (groupe contrôle),ou 3 mois après la dernière séance d’irradiation (groupe expérimental) seront mis à mort et explantés pour analyse.
Impact sur les animaux
Les animaux seront surveillés avec attention (comportement, prise alimentaire) et seront pesés de manière hebdomadaire durant toute l'expérience : 1. Douleurs post-opératoires qui seront prise en compte par une antalgie adaptée 2. Difficultés à l'alimentation 3. Infection du site opératoire 4. Mauvaise cicatrisation 5. Dermatite radio induite 6. Effets secondaires systémiques : tels que des effets sur le poids corporel, le métabolisme, ou d'autres paramètres physiologiques. 7. Problèmes de comportement tels que l'anxiété, la dépression ou l'agressivité.
Devenir
Tous les rats seront euthanasiés trois mois après la dernière intervention (implantation ou radiothérapie, selon le groupe). Les analyses qui seront faites pour vérifier l’intégration des DMs ne permettent pas de maintenir les animaux en vie.
Remplacement
Cette étude vise à évaluer l’intégration d’un nouveau dispositif médical (DM) dans un de tissu irradié (modèle de radiothérapie). Il n’existe à ce jour et à notre connaissance aucun modèle in vitro permettant une telle évaluation. Il est nécessaire de vérifier la tolérance du biomatériau dans une étude préalable à l’utilisation chez l’Homme
Réduction
Le projet s’inscrit dans la démarche One Health (une seule santé). En effet, il est prévu que le DM mis au point soit aussi testé chez des chats et chiens atteints de cancers oraux dans le cadre d’une étude clinique vétérinaire. Les données générées lors de cette étude permettent de réduire l’utilisation d’animaux de laboratoire tout en offrant une solution de reconstruction pour les animaux participant à cette étude clinique. Le nombre d'animaux nécessaire a été réduit par une analyse statistique optimale ainsi que le choix de modèles animaux et de protocoles déjà validés dans la littérature. Le protocole d’irradiation a été défini avec la société européenne d’oncologie vétérinaire .
Raffinement
Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux,. Les animaux ne seront jamais seuls en cage (sauf si un isolement est nécessaire, notamment en post-opératoire). Les animaux seront surveillés avec attention chaque jour (comportement, cicatrice) et seront pesés de manière hebdomadaire durant toute l'expérience. La douleur sera prise en charge dès que nécessaire. La taille des DM a été adaptée à la morphologie des animaux. Dans les jours suivants la chirurgie et les séances d’irradiation, une surveillance renforcée des animaux sera mise en place (Un enrichissement environnemental dans les compartiments sera réalisé avec mise en place de cachettes, de papier, coton pour réaliser des nids. Des points limites seront respectés pour éviter toute souffrance excessive. L'ensemble du personnel est qualifié et compétent en matière d'expérimentation animale, et l'animalerie possède l'agrément et le plateau technique nécessaires. A noter que les animaux ne pourront pas être réutilisés car l’évaluation de la régénération tissulaire nécessitera une autopsie.
Choix des espèces
Le rat est un modèle établi pour les tests de biocompatibilité.. De plus, comme nous cherchons à reproduire le protocole de soins, et en particulier la radiothérapie subit par les patients et les animaux de compagnie atteints de cancer de la tête et du cou. Le projet visant la mise au point d’un DM permettant la reconstruction faciale chez l’adulte, les procédures ne concerneront que des rats adultes.
Evaluation préclinique de produits de santé pour la cicatrisation
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Rats : 300
Cochons d'Inde : 150
Cochons : 360
Jusqu'à trois heures de chirurgie pour créer les plaies et y poser le produit à tester, 360 porcs, 300 rats, 200 souris et 150 cobayes vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sévère pour 60 des porcs. Les plaies sont ensuite observées et les pansements changés régulièrement, avec ou sans anesthésie selon les espèces, et des biopsies peuvent être prélevées. Le porteur compte parmi les effets attendus la mauvaise cicatrisation et l'infection des plaies lorsque l'article testé ne fonctionne pas comme prévu, et rappelle que la réglementation exige ces preuves avant une autorisation de mise sur le marché. Le choix des espèces suit des critères techniques, peau et cicatrisation proches de celles de l'être humain chez les porcs, plaies qui se referment par contraction chez les rongeurs, lignées diabétiques plus faciles à obtenir chez le rat et la souris.
Objectifs
Ce projet vise à évaluer la tolérance (ou sécurité) ainsi que la performance (ou efficacité) des produits de santé en cicatrisation (exemple : pansements, crèmes, sutures...). Ces produits destinés à être mis en contact avec le corps humain doivent être préalablement testés pour garantir le bon rétablissement des patients après chirurgie, et pour garantir leur efficacité lors de l'utilisation clinique. La réglementation exige de prouver l'efficacité des produits de santé et de réduire au minimum le risque de réactions indésirables avant de proposer un produit sur le marché. Compte-tenu de la complexité des mécanismes de régulation d'un organisme vivant, le recours au modèle animal est nécessaire pour répondre aux objectifs du projet.
Bénéfices attendus
Ce projet permet d'obtenir dans différents modèles animaux des données de performance et/ou de tolérance des produits de santé en cicatrisation. Ainsi, il est possible d'étudier ces produits en vue de répondre aux exigences des autorités réglementaires dans l'obtention d'une autorisation de mise sur le marché, élargissant l’offre et améliorant ainsi les chances de guérison et le confort des patients humains traités.
Procédures
Pour l'ensemble des procédures, tous les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale afin de créer les plaies et y appliquer le dispositif médical à tester (cette intervention chirurgicale peut durer entre 30 minutes et 3h). Cette intervention a toujours lieu sous anesthésie générale (chimique et/ou gazeuse) et analgésie. Des prélèvements sanguins peuvent être réalisés en cours d'étude. Ceux-ci pourront se faire sous anesthésie ou non, selon le contexte de réalisation de cet acte (en cours de chirurgie, pendant le temps de l’étude ou juste avant l’euthanasie des animaux en fin d’étude). Des observations des plaies et des changes de pansements auront régulièrement lieu, avec ou sans anesthésie selon les espèces. Plus rarement, des biopsies pourront également avoir lieu sous anesthésie générale si nécessaire.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables pouvant survenir chez les animaux sont, selon les procédures, les suivants : - douleur et stress liés à la chirurgie, contrôlés par la prise d’analgésique (morphinique) et par la réalisation d’une anesthésie générale. Un suivi a minima quotidien des animaux permet de détecter les signes de douleur et d’adapter le traitement analgésique en conséquence pour diminuer autant que possible ces nuisances. - mauvaise cicatrisation / infection des plaies liée à un article test ne fonctionnant pas comme prévu. - présence d’un pansement secondaire pour protéger les plaies et les articles appliqués ainsi que les risques d’infection. L’intégrité de ce pansement secondaire est vérifiée quotidiennement et peut éventuellement gêner l’animal. - perte de poids ou d’appétit liée aux effets de l’anesthésie et/ou de la chirurgie, pendant quelques jours, contrôlée par le suivi quotidien du transit et/ou de l’alimentation et la mise en place de mesures de soutien, jusqu’à la reprise d’un comportement alimentaire normal et spontané. Les mesures mises en place peuvent être par exemple : mise à disposition d’aliments plus appétant (friandises), distribution d’un aliment de convalescence (prise spontanée ou assistée) ...
Devenir
Pour répondre aux objectifs de chacune des procédures du projet, des observations post-mortem sont nécessaires. En effet, la sécurité des produits est évaluée en observant la réaction des tissus au contact du dispositif à tester, et ceci se fait par prélèvements des tissus et organes entourant le produit, afin de réaliser des analyses microscopiques (histologie notamment, qui est la meilleure méthode d'évaluation des effets locaux induit par un produit étranger à l'organisme, comme l'inflammation par exemple). De même la performance peut, elle aussi, être évaluée par des tests spécifiques sur les organes et le dispositif prélevé. En raison des objectifs des procédures de ce projet, il n'est pas possible de maintenir en vie les animaux utilisés.
Remplacement
L’utilisation d’animaux est requise dans la réglementation. A ce jour, il n'existe pas de méthode alternative permettant d’évaluer la performance et la tolérance locale des produits de santé en cicatrisation.
Réduction
Le donneur d'ordre demandant la réalisation de ces tests s'engage à ne pas faire renouveler à l'identique un essai déjà mené précédemment. Par ailleurs pour réduire le nombre d'animaux inclus en étude, il est possible d'utiliser un même groupe "contrôle" (produit dont l'effet est déjà connu), pour plusieurs groupes "test". Les études de screening précédemment citées permettent également de sélectionner un produit test qui présente le plus d'intérêts à être développé, réduisant de ce fait le nombre de tests sur des produits ayant un intérêt moindre. Les études dites "pilotes" sur quelques animaux seulement, peuvent aussi servir à orienter les choix de poursuite de développement d'un produit ou le choix du modèle expérimental le plus approprié (matériel ou abord chirurgical le plus adéquat…), avant d'entamer les études réglementaires à plus grande échelle et devant répondre aux normes en vigueur pour l'élaboration du dossier pour la mise sur le marché (nombre d'animaux minimum, durée de mise en contact minimum, etc).
Raffinement
Des mesures sont mises en place pour limiter : - Le stress des animaux : une période d’acclimatation pendant laquelle ils ne subissent aucune manipulation non indispensable est réalisée à leur arrivée dans l’établissement utilisateur. Ensuite, et avant la chirurgie, une période d’habituation aux actes spécifiques est réalisée si nécessaire pour réduire l’aspect anxiogène de ces manipulations. Des enrichissements sont présents dans l’environnement des animaux (en fonction de l'espèce : jouets, éléments de nidification…), et ces mesures sont renforcées en phase post-opératoire (ajout d’enrichissements alimentaires…) - La douleur des animaux : la chirurgie est réalisée sous anesthésie et analgésie (à base de morphiniques). En phase post-opératoire, ces suivis sont renforcés et des soins post-opératoires spécifiques peuvent être mis en place (surveillance et éventuellement réfection additionnelle des pansements (en plus de ceux prévus les jours de lecture), nettoyage des plaies à chaque réfection de pansement, prolongation du traitement analgésique post-opératoire). La douleur liée aux prises de sang éventuelle peut être maitrisée par la réalisation de la prise de sang sous anesthésie générale (injectable et/ou volatile, lors d'une phase de chirurgie par exemple), ou locale, ou encore sous sédation légère.
Choix des espèces
L’espèce animale choisie est définie en fonction des attentes du test et les similarités avec l’homme : - Structure de la peau et processus de cicatrisation similaires chez les porcins. - Plus d’exsudation des plaies chez les porcins que chez les rongeurs. - Processus normal de cicatrisation des rongeurs par contraction, comme certains types de plaies chez l’Homme (par exemple, plaies de brulures) - Lorsqu’un phénotype/génotype diabétique est nécessaire pour une étude, les espèces de petite taille, telles que les rats et les souris, sont privilégiées car ces lignées sont plus facilement générées et maintenues. - Les petits animaux (rat, souris, cobayes) sont souvent utilisés pour des raisons de facilité d’utilisation (actes techniques plus facilement réalisables car animaux moins lourds, hébergement de plus petite taille). Les critères pris en considération dans le choix du stade de développement sont les suivants : 1.Suivi des recommandations des textes de référence Le stade de développement est exprimé en âge ou en poids. Dans la plupart des cas, l’utilisation d’animaux adultes est recommandée. 2.Propriétés intrinsèques du produit à tester En l’absence de recommandation particulière dans le(s) texte(s) de référence et si la nature du produit le requière, le stade de développement est pertinemment sélectionné. En l’absence d’exigence particulière, l’utilisation d’animaux au stade adulte est privilégiée. 3.Cas particulier des porcs Pas de recommandation spécifique réglementaire d’où choix d’utiliser des porcs domestiques en croissance (âgés d’au moins 8 semaines). Etant donné les conditions d’hébergement, le comportement social et la manipulation des animaux, l’utilisation de porcs en croissance est la plus appropriée dans ce projet.
Détermination préliminaire de l’exposition d’une entité thérapeutique (chimique ou biologique) chez le rat
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Tués à l'issue parce que les données d'élimination des composés n'arrivent que bien après la fin des expériences, 11 500 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit des candidats médicaments par gavage, par voie intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée ou intrapéritonéale, jusqu'à trois fois par jour pendant dix semaines, avec jusqu'à huit prélèvements sanguins en vingt-quatre heures et des séjours de 48 heures en cage métabolique sans enrichissement. Le projet prévoit de tester 150 entités pour le compte du développement préclinique, en amont d'une première administration à l'être humain ou d'un médicament vétérinaire. Le porteur reconnaît que des tests in silico et in vitro prédisent déjà l'absorption et le métabolisme, avant de conclure que "seul un modèle animal" caractérise l'ensemble des paramètres.
Objectifs
L’objectif du projet est de déterminer les paramètres pharmacocinétiques et/ou les concentrations tissulaires d’entités thérapeutiques chimiques ou biologiques après administration chez le rat. Dans la recherche préclinique et la recherche de candidats, ces paramètres sont essentiels pour la sélection et l’évaluation des candidats médicaments. Les entités testées sont préalablement analysées lors de tests in-vitro. Une première sélection est ainsi réalisée pour n’administrer aux animaux que des entités avec des caractéristiques favorables en terme pharmacocinétique. Ces études préliminaires permettent d’objectiver les processus d’absorption, de dégradation, de distribution et d’élimination de chaque entité afin de prédire le comportement de ces entités chez l’homme ou l‘animal. Ce projet s’inscrit dans une stratégie globale de caractérisation de nouveaux composés en vue de la première administration chez l’homme mais aussi dans le développement de médicaments vétérinaires, c’est donc une étape clé dans le cycle de vie de tout médicament en développement. Il est envisagé de tester 1500 candidats-médicaments sur la durée du Projet.
Bénéfices attendus
A court terme, les expérimentations de ce projet permettront de déterminer les paramètres essentiels pour l’avancée du développement préclinique pour les entités testées. Ces résultats permettront de sélectionner les candidats potentiels ainsi que les doses et les voies d’administration les plus adaptées. A long terme, les entités sélectionnées constitueront la base pour un traitement applicable à l'Homme ou à l’animal dans le cadre de médicaments vétérinaires.
Procédures
Les gestes techniques concernent tous les animaux : • Pesées : Durée 30 secondes sur animal vigile, jusqu’à une fois par jour sur la durée des études. • Administrations des composés à potentiel thérapeutiques o Par voie orale (gavage à l'aide d'une sonde gastrique), intrapéritonéale, intramusculaire, sous-cutanée : Durée 30 secondes sur animaux vigiles. Unique ou répétée max 2 ou 3 fois par jour selon la voie, sur une durée maximale de 10 semaines o Par voie intraveineuse à la veine caudale sur animal vigile: Durée 30 secondes. Unique ou répétée max 2 fois par jour, sur une durée maximale de 10 semaines • Prélèvements de sang : o Via la veine saphène ou caudale en microsampling : Durée 30 secondes sur animal vigile. Maximum 8 fois sur 24h. o Via ponction cardiaque transcutanée en phase terminale : Durée 1 minute sous anesthésie générale gazeuse ou chimique. o Les volumes et la fréquence des prélèvements seront selon les critères de la consigne en vigueur. Les volumes seront généralement de 50 à 150 µL. Le volume total prélevé n'excédera pas 7.5% du volume estimé de sang total de l'animal sur une période de 24 heures. Des périodes de récupération seront mises en place entre les prélèvements. • Hébergement individuel: o Cage individuelle avec enrichissement complet (litière, tunnel et stick de bois) avec maintien du contact olfactif et visuel. Habituation pendant au moins 3 jours. Durée de l’hébergement individuel maximal de 72h. o Cage individuelle à métabolisme sans enrichissement avec maintien du contact olfactif et visuel. Habituation pendant au moins 3 jours. Durée de l’hébergement individuel maximal de 48h.
Impact sur les animaux
Au cours des études, les animaux peuvent être soumis à un certain stress (manipulation non invasive de l'animal, administration orale, hébergement en cage individuelle ou en cage métabolique) ou à une douleur passagère liée au geste lui-même (injection de l'administration de type intraveineux, intramusculaire ou sous cutanée ou réalisation du prélèvements). Ces nuisances sont de niveau de gravité léger, à modéré par leur cumul. Aucune dégradation de l'état de santé de l'animal n’est attendue par l’application des procédures de ce projet. Toutefois dans ces phases précoces de développement, des effets secondaires non prédictibles peuvent survenir : perte de poids, hypo- ou hyperthermie, comportement anormal (animaux hypo- ou hyperactifs), vocalisations. Tout effet observé sera noté selon une grille spécifique et donnera lieu à une action adaptée à la gravité des signes ; les points limites anticipés permettent de limiter la nuisance à un niveau de gravité modéré au maximum.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue des procédures. Les composés sont testés pour déterminer les profils d’élimination mais ces données ne sont disponibles que bien après la fin des phases in-vivo. De ce fait, il n’est pas possible de réutiliser les animaux pour de nouvelles études.
Remplacement
De nombreux tests in silico et in vitro existent et permettent de sélectionner les entités d'intérêt uniquement sur la base de leurs caractéristiques pharmacocinétiques, notamment l'absorption et le métabolisme. Il n'existe pas de modèles in silico ou in vitro qui permettent de déterminer l'ensemble des propriétés pharmacocinétiques d'un composé d'intérêt. Seul un modèle animal peut permettre de caractériser ces entités et discriminer celles qui pourront être envisagées pour un traitement chez l’homme ou l’animal.
Réduction
Les composés auront préalablement été évalués de manière extensive sur une batterie de tests in silico et in vitro. Ces tests permettent de prédire le profil pharmacocinétique du composé (ex : lipophilie, absorption, métabolisme), de déterminer les caractéristiques d'interaction du composé avec la cible d'intérêt (ex. un récepteur, un canal ionique, une enzyme). Cette approche préalable permet de réduire fortement le nombre d’entités à tester. Lors de l’administration de doses croissantes, les animaux seront traités de manière séquentielle afin de s’assurer de l’innocuité d’une dose avant de passer à une dose plus élevée. Cette organisation permet d’éviter l’administration à des doses où les nuisances seraient trop fortes, et ainsi de réduire le nombre d‘animaux. La forte sensibilité des méthodes analytiques permet la mise en œuvre de techniques de prélèvements sanguins de volumes réduits autorisant la réalisation de prélèvements répétés sur un même animal. Il est ainsi possible d’obtenir une cinétique complète à partir d’un seul animal. Cela augmente aussi la robustesse des données obtenues pouvant mettre en évidence une éventuelle variabilité inter-individuelle. Le nombre minimal d’animaux par cohorte de traitement est réduit au minimum scientifique, c’est-à-dire 3 animaux pour les études de pharmacocinétique. Ce nombre suffit pour avoir des données assez robustes pour présélectionner des candidats pour la phase pré-clinique. Ce nombre est augmenté à 5 dans le cas d’administration topique qui présente plus de variabilité.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions qui assurent leur bien-être. Ils seront groupés dans des cages contenant de l'enrichissement et des matériaux spécialisés pour faciliter la nidification. Quand un hébergement individuel est nécessaire pour les besoins des études,, ils seront hébergés dans des cages conformes à la réglementation, équipées d’enrichissement et matériaux adaptés. Une période d’habituation sera mise en place avant l'hébergement d'individuel pour permettre à l’animal de s’habituer à cet hébergement tout en maintenant les contacts visuels et olfactifs entre les animaux. Les animaux feront l'objet d'une surveillance clinique et sanitaire journalière sur la durée de la procédure. Les locaux d'hébergement font l'objet de surveillance sanitaire régulière par le biais de contrôles environnementaux, des systèmes d'hébergement et d'animaux sentinelles. Des soins adaptés seront donnés aux animaux affectés, par ou sous l'autorité du vétérinaire désigné, ou mis à mort selon les recommandations définies dans la consigne en vigueur. Un plan d'action sera établi et mis en place lors d'apparition d'évènements inattendus. Des critères d'arrêt anticipé seront mis en place pour chaque procédure afin de réduire tout inconfort, stress, souffrance ou douleur inutile. Les procédures potentiellement douloureuses ou source d'inconfort ou de stress se feront sous anesthésie gazeuse. Le nombre de manipulations sur l'animal sera réduit au strict nécessaire. Lors de l’administration de doses croissantes, les animaux seront traités de manière séquentielle afin de s’assurer de l’innocuité d’une dose avant de passer à une dose plus élevée. Cette organisation permet d’éviter l’administration à des doses où les nuisances seraient trop fortes pour les animaux. Le projet sera mis en œuvre par du personnel qualifié et habilité conformément à la réglementation en vigueur, expérimenté pour les techniques d’administrations et de prélèvements de liquides biologiques utilisées.
Choix des espèces
Le rat est une espèce couramment utilisée dans les stratégies de sélection de candidat, en réalisant des essais de pharmacocinétique préclinique. Le choix de l’espèce est dicté par différents impératifs : - techniques : compatibilité de volume de prélèvement sanguin total chez un même sujet expérimental - scientifiques : comparaison de résultats pharmacodynamiques et pharmacocinétiques chez la même espèce animale, homologie de récepteur de l’espèce choisie avec le récepteur humain. Le stade adulte sera utilisé par défaut (à partir de 7 semaines) car c’est celui qui permet de déterminer les paramètres pharmacocinétiques de l’espèce pour une entité donnée. Toutefois, il sera possible d’utiliser des animaux à un stade plus précoce (âgés de 15 jours) pour établir des données d’exposition spécifique à un modèle ou une cible thérapeutique.
Role de l’acétylcholine sur l’attention
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
268 rats vont être utilisés et tués, dont 40 opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil pour enregistrer l'activité de leurs neurones. 180 subissent une chirurgie intracérébrale d'une heure, avec un stress au réveil, une perte de poids et des douleurs les premiers jours, et 48 réalisent chaque jour pendant soixante et onze jours un test d'attention d'une heure, sous restriction alimentaire pendant toute cette période. Le projet vise à comprendre comment l'acétylcholine agit sur la concentration dans le cortex frontal, avec l'idée lointaine de mieux traiter les troubles de l'attention. Tous finissent par une chirurgie terminale, leur cerveau étant récupéré pour analyse.
Objectifs
Le principal objectif de ce projet est de mieux comprendre comment une substance dans le cerveau, appelée l’acétylcholine participe à la concentration. Elle agit surtout dans une partie du cerveau appelée le cortex frontal, qui est important pour l’attention. Contrairement à ce que l'on pensait, ses projections vers le cortex frontal ne sont pas diffuses, mais bien organisées en sous-régions. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre comment ces différentes voies agissent et influencent l’attention, notamment en mesurant l’activité des neurones qui libèrent de l’acétylcholine. Une partie de l’étude se concentre sur l’établissement des conditions nécessaires pour tester l’attention de manière expérimentale chez des rats, avant de pouvoir manipuler ces voies pour étudier leurs effets dans des situations attentionnelles spécifiques.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice de ce projet est qu'il pourrait améliorer la compréhension de la manière dont certaines zones du cerveau, en particulier celles liées à l’attention, fonctionnent et interagissent entre elles. La compréhension de chaque région spécifique du cerveau contribuant à l’attention pourrait ainsi ouvrir la voie à de meilleures stratégies pour traiter des troubles attentionnels ou des problèmes liés à l’attention dans des pathologies psychiatriques.
Procédures
48 animaux vigiles réaliseront 1 test comportemental : d’une durée de 1heure tous les jours pendant maximum 71 jours. 180 animaux anesthésiés auront une chirurgie intracérébrale d'une durée d'1 heure. 40 animaux anesthésiés 1 chirurgie sans réveil pour l’enregistrement des neurones. 268 animaux auront une chirurgie terminale.
Impact sur les animaux
Les tests comportementaux peuvent induire un léger stress transitoire dû à l'isolement de l'animal au cours de la réalisation du test. La chirurgie peut induire un stress au réveil des animaux ainsi qu'une légère perte de poids et des douleurs/un inconfort au cours de premiers jours suivant l'acte chirurgical. Lors du suivi post chirurgical, l’animal peut ressentir un inconfort lors de l’injection d’analgésique en sous cutané. La restriction alimentaire durant 71 jours lors du test peut induire un stress.
Devenir
Tous les animaux de la procédure seront mis à mort en fin afin de récupérer les cerveaux pour analyse.
Remplacement
Les approches de modélisations informatiques ou basées sur des cultures cellulaires sont impossibles à mettre en place dans ce projet puisque nous nous intéressons aux modifications de réseaux neuronaux et aux comportements associés.
Réduction
Le nombre d’animaux dans chaque groupe expérimental a été calculé à l'aide d'un test statistique qui tient compte de la variabilité du vivant et permet d'obtenir des résultats robustes. La standardisation des conditions expérimentales et la maitrise des facteurs environnementaux décrits dans le paragraphe raffinement contribuent à limiter la variabilité.
Raffinement
Les expérimentations sont réfléchies de façon à minimiser au maximum l’inconfort, la douleur, la détresse ou l’angoisse des animaux au cours des différentes procédures de ce projet. Lors de la chirurgie nous aurons recours à l’anesthésie générale (gazeuse, facilement modulable et permettant un réveil rapide et plus confortable) avec surveillance de la température corporelle, additionnée d’une anesthésie locale en présence d’antalgique. Le traitement antalgique sera poursuivi au lendemain de la chirurgie soit 48heures de couverture antalgique. Des points limites gradés, précis et adaptés ont été définis de façon à obtenir un arbre décisionnel en fonction des observations faites et aboutir à une gestion optimale de ceux-ci. Des critères d'arrêt de souffrances sont définis. Les animaux sont hébergés deux par cage avec eau et nourriture ad libitum. Un enrichissement avec des bâtons de bois est mis dans les cages d'hébergement permettant aux rats d'assouvir leur besoin de ronger. Les animaux sont manipulés au minimum de façon hebdomadaire tout au long du projet permettant une habituation à un binôme d’expérimentateurs, qui reste le même tout au long de l’étude.
Choix des espèces
L’espèce animale utilisée est le rat. La lignée de rat a été choisie en raison des données déjà disponibles pour les tâches attentionnelles. De plus, ces rats viennent de croisements entre différentes familles, ce qui réduit la consanguinité (ils ne sont pas tous très proches génétiquement). Cela permet de maintenir une diversité génétique, offrant ainsi un meilleur reflet de la variabilité observée chez l’Homme. Les animaux utilisés seront des animaux adultes (7 semaines) puisque nous avons besoin d'avoir des circuits et systèmes neuronaux entièrement développés.
Etude de l’effet anti-hyperalgésique d’une molécule dans un modèle de neuropathie chimio-induites par injections répétées de Paclitaxel chez le rat suivi en Pression de patte
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Injectés de paclitaxel de façon répétée jusqu'à développer une neuropathie, 1 950 rats sont ensuite soumis à un test de pression de patte, jusqu'à six mesures par jour, trois jours par semaine sur trois semaines. Ils reçoivent en parallèle les composés à évaluer, parfois plusieurs fois dans la journée, et jusqu'à vingt-cinq prélèvements de sang en théorie. 1 625 d'entre eux relèvent d'un niveau de souffrance sévère, avec une allodynie tactile, une constipation, une alopécie et une déshydratation possibles, et tous sont tués à la fin, le porteur écrivant qu'un anticancéreux administré de façon systémique rend impossible d'évaluer l'impact réel sur l'animal. Le test s'arrête à une valeur de cut-off, la pression maximale que le laboratoire s'autorise à exercer sur la patte.
Objectifs
Les patients atteints de tumeur solide (sein, ovaire, poumon...) sont souvent traités avec une chimiothérapie à base de paclitaxel. Le paclitaxel (Taxol) est un agent anti-néoplasique issus de l'écorce d'un arbre (Taxus brevifolia), qui entraine le développement d’une neuropathie périphérique chez 50-90% des patients dès une injection de paclitaxel à forte dose ou après plusieurs injections à plus faibles doses. La laboratoire a mis au point un modèle de neuropathie chimioinduite par injections répétées de paclitaxel. L’allodynie mécanique induite par ce modèle a été mesurée en Pression de patte et la réversion par des antalgiques de référence a été réalisée. Ce modèle doit permettre l’évaluation des propriétés analgésiques de candidats médicaments. Le but, à long terme, étant de mieux traiter les patients souffrant de douleurs neuropathiques et de limiter les effets secondaires des composés utilisés.
Bénéfices attendus
Le but est de permettre le développement d’analgésiques ciblés sur les mécanismes de ces douleurs neuropathiques causées par l’administration de paclitaxel. Actuellement seul des antidépresseurs et des opiacés sont prescrits pour soulager les patients. Ces molécules ne sont pas efficaces à long terme et présentent de nombreux effets secondaires. Le but de ce projet est donc de permettre une meilleure prise en charge des neuropathies due à l’administration de paclitaxel chez les patients atteints de cancer. A plus court terme, la publication de posters/articles scientifiques pour mettre en évidence certains résultats encourageants sera envisagée.
Procédures
Induction du modèle : injection afin d’induire le modèle. Tests : stimulation mécanique d’une durée inférieure à 1 min par stimulation. La stimulation est stoppée dès réaction de l’animal. Les tests peuvent être répétés plusieurs fois sur une même journée dans la limité de 6 points de mesure par jour. Ils peuvent être réalisés sur plusieurs jours, pour un maximum de 3 tests par semaine sur 3 semaines différentes. Les animaux recevront des traitements de composés par injection. Ces actes durent quelques secondes. Ils pourront être réalisés une seule fois, ou plusieurs fois par jour espacé de 0min (simultanément) à plusieurs heures (2-4-6-8-12) ou même de plusieurs jours (une fois par semaine, un jour sur deux) Ceci est dépendant de la pharmacocinétique du composé testé. De plus, les animaux pourront subir des prélèvements de sang répétés ou en prélèvement unique afin de suivre la pharmacocinétique du composé testé. Les prélèvements de sang durent maximum 3 minutes et les animaux peuvent être sous anesthésie pendant 5minutes. Les prélèvements sont limités à un maximum par jour selon les limites de volume et de fréquence imposées par les recommandations en vigueur (maximum théorique :25 prélèvements).
Impact sur les animaux
Ce modèle entraine le développement d’une allodynie tactile (nuisance modérée) mais peut également entrainer une non prise de poids, de la constipation, de l’alopécie, de la piloérection et de la déshydratation (nuisances modérées à sévères). Les nuisances liées aux tests sont liées à l’application d’un stimulus douloureux (mécanique) qui sera stoppé suite à la réaction de l’animal. Pour la pression de patte,les tests sont pratiqués avec les animaux en contention pour des durées d’environ une minute par rat par point de cinétique (nuisance légère). Le test peut être répétés plusieurs fois sur une même journée dans la limite de 6 points de cinétique par jour. Ils peuvent être réalisés sur plusieurs jours. (nuisance légère). De plus, l’ensemble des animaux pourra subir des nuisances liées à l’administration unique ou répétée de composés (lésion superficielle). Les composés administrés peuvent induire des effets secondaires listés dans les points limites. Enfin, les animaux peuvent subir des prélèvements de sang unique ou répétés afin d’évaluer la pharmacocinétique du composé (nuisances légères).
Devenir
Les animaux sont induits de manière systémique par administration d’un agent anticancéreux. Il peut donc avoir un impact sur l’ensemble des mécanismes biologiques de l’animal. Il est donc impossible de déterminer l’impact réel. Pour cette raison, il n’est pas concevable de les replacer. De ce fait, dès la fin de la phase expérimentale, les animaux sont euthanasiés par le personnel habilité
Remplacement
L’objectif de ce projet est le développement de modèles permettant de tester l’efficacité de candidats médicaments analgésique. Les modèles in silico et in vitro permettent seulement d’étudier les effets de ces molécules sur la nociception, c’est-à-dire les mécanismes biologiques encodant les stimuli endommageant, ou susceptibles d’endommager les tissus. Selon sa définition par IASP(International Association for the Study of Pain), la douleur est une « expérience sensorielle et émotionnelle ». L’étude de potentiels traitements analgésiques doit donc être conduite dans des modèles restituant à la fois la composante sensorielle et émotionnelle et permettant l’analyse du comportement en plus de la physiologie ; faute de quoi c’est la nociception et non la douleur qui est étudiée. L’étude des candidats médicaments analgésiques chez l’animal vigile reste la seule option pour démontrer l’efficacité sur la douleur avant le passage chez l’homme.
Réduction
Pour chaque étude, le nombre d'animaux utilisé est réduit à un minimum acceptable pour l’obtention d’informations robustes et statistiquement pertinentes. Le nombre d’animaux par groupe de traitement a été fixé à n=10 en se basant sur les données bibliographiques disponibles et les données de la mise au point du modèle. un test statistique sera réalisé en fonction du design de chaque étude (groupes appariés ou indépendants, mesures répétées ou non) et de la distribution des valeurs (conformité à la loi normale),suivi si nécessaire d’un test post-hoc approprié
Raffinement
Les animaux ont accès dès leur arrivée dans l’animalerie à de l’enrichissement (tunnel en polycarbonate rouge transparent, briquettes en bois) et sont habitués à la salle d’expérimentation afin de limiter leur stress. Les animaux sont surveillés chaque jour, et un suivi spécifique (suivi pondéral, suivi de la consistance des fèces, suivi si présence d’alopécie) est réalisé tous les jours jusque J10 après la première induction puis une fois par semaine. Des croquettes sont déposés dans le fond de la cage pour stimuler la prise alimentaire des animaux. Lors des tests, des valeurs dites de cut-off sont fixées et correspondent à la stimulation maximale que peut subir l’animal. Ceci permet d’éviter les lésions dues au test ou les stimuli plus douloureux que nécessaire. Une anesthésie est appliquée avant chaque acte le nécessitant et le permettant : prélèvements, traitements particuliers, … Une surveillance accrue des animaux est mise en place au vu de la thématique de la recherche. Des points limites sont clairement établis et des mesures sont mise en place suite aux inductions des modèles : aliments placés dans la cage de l’animal si difficultés à se nourrir, injectionde NaCl ou de Glucose en cas de déshydratation. Un système de fiche de scoring est également mis en place afin de donner une vision objective des paramètres à suivre. Des points limites, précoces et spécifiques pour chaque protocole d’étude sont définis et résumés en un arbre décisionnel qui conduit si nécessaire l’interruption des expérimentations si les critères d’arrêts sont atteints.
Choix des espèces
La question du remplacement des rongeurs par des espèces « moins évoluées » est critique et suivie avec attention au sein du laboratoire. Chez ces espèces la démonstration de la capacité à ressentir la douleur telle que définie par l’IASP (International Association for the Study of Pain) est récente et les modèles d’étude de la pharmacologie de la douleur à visée clinique ne sont pas encore développés. Le rat a été sélectionnée pour ce projet en se basant sur plusieurs critères : a) sensibilité aux stimuli nociceptifs utilisés dans ce projet ; b) large caractérisation du comportement et des modèles dans la littérature ; c) efficacité dans cette espèce des médicaments utilisés chez l’homme sont efficaces pour soulager une douleur équivalente suggérant l’existence de mécanismes biologiques communs. Des rats pesants entre 200-250g pour les males et 150-200g pour les femelles, le jour de l’induction vont être utilisés. Cette gamme de poids correspond à un âge de cinq à six semaines. Ceci a été choisi en accord avec les données bibliographiques sur lesquels nous nous sommes basées pour choisir nos critères d’induction.
Comparaison des effets de différents extraits de Rosmarinus officinalis sur la cardioprotection et la cytoprotection
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Gavés deux fois par sonde, vingt-quatre heures puis une heure avant d'être tués, 92 rats sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Leur sérum et leur cœur servent ensuite à mesurer, sur cellules et ex vivo, l'effet protecteur d'extraits de romarin issus de l'agriculture régionale. Une grille de score de 0 à 18 est prévue, la mise à mort étant décidée au-delà de 15, pour une procédure qui se réduit à deux gavages. Le porteur écrit que ces traitements ne devraient pas avoir de conséquences néfastes aux doses choisies, après avoir indiqué que le gavage peut être à l'origine de douleurs modérées ou de stress.
Objectifs
Explorer le rôle protecteur cellulaire des phytonutriments issus d'extraits de Romarin (Rosmarinus officinalis), plante issue de l’agriculture régionale, sera intéressant dans le cadre de la prise en charge préventive de patients à risque d’infarctus du myocarde. Notre but sera d’évaluer les effets protecteurs cellulaires de la prise préventive d'extraits de Romarin. Notre approche est novatrice puisque les extraits ne seront pas disposés directement sur les cellules, mais le seront indirectement : après passage dans l’organisme, via le contact avec le sérum des rats traités par voie orale. Ainsi nos cellules seront mises en contact avec des extraits de Romarin, mais également avec leurs formes métabolisés ayant eux-aussi des propriétés anti-oxydantes. Notre objectif sera d’étudier des effets protecteurs cellulaires de sérum issus de rongeurs ayant eu un traitement oral avec des extraits de Romarin et leurs implications sur le stress oxydant. Nous évaluerons également ex vivo la cardioprotection induite par ces extraits suite à un test mimant l'infartus du myocarde. Ce projet a reçu un financement.
Bénéfices attendus
Explorer le rôle protecteur cellulaire des phytonutriments issus de Romarin, plante issue de l’agriculture régionale, sera donc intéressant dans le cadre de la prise en charge préventive de patients à risque d’infarctus du myocarde. Notre approche permettra de déterminer quelle formulation est la plus efficace pour protéger les cellules endothéliales ainsi que le cœur. Des stratégies préventives cardio-vasculaires ne sont pas très nombreuses et sont très attendus pour certains patients ne pouvant pas réaliser le traitement préventif de référence (activité physique).
Procédures
Les animaux subiront chacun deux traitements par voie orale (intervention évaluées à moins de 15 minutes) 24h puis 1h avant le sacrifice. Ces traitements ne devraient pas avoir de conséquences néfastes sur les animaux aux doses choisies.
Impact sur les animaux
Le traitement oral peut être à l’origine de douleurs modérées ou de stress pour l’animal. Néanmoins, toutes ces procédures seront réalisées par des personnels expérimentés. Les animaux seront surveillés tout au long de la procédure pour s’assurer de leur bien-être. Par ailleurs, les prélèvements de sang seront réalisés seulement après pré-anesthésie puis anesthésie léthale.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de permettre le prélèvement d'organes cibles.
Remplacement
Des expérimentations sur cellules sont actuellement conduites pour évaluer les différents mécanismes qui impactent la fonction des cellules cardiaques et endothéliales. Cependant la question posée ici est complexe et l’évaluation de l’effet des molécules et de leurs extractions sur modèle animaux vivants est nécessaire afin d’évaluer la biodisponibilité et l’efficacité biologique. L’intégration de l’expérimentation animale apparait donc comme nécessaire afin de compléter ce projet de recherche.
Réduction
Le nombre d'animaux a été établi pour permettre d'obtenir des résultats statistiques robustes et fiables. Ceci en se basant sur des résultats de la littérature scientifique et une analyse statistique permettant de déterminer le nombre minimum d'animaux à inclure pour démontrer une différence entre nos groupes.
Raffinement
Le protocole a été conçu pour limiter au maximum le stress subit par les animaux. Les animaux seront acclimatés 7 jours après leur arrivé à l’animalerie avant toute procédure. Afin de permettre la formation de groupes sociaux, les rats sont hébergés en cages de 3 individus avec un enrichissement du milieu (tubes, coton, bâtons à ronger). La nourriture est standard ad libitum et un accès à de l’eau fraiche. La température et l’hygrométrie sont contrôlées. Les animaux sont visités quotidiennement par un personnel formé qui contrôle le bien-être des animaux à l’aide d’une fiche intégrant les différents point limites. Afin d’éviter toute douleur, les prélèvements seront réalisés post mortem suite à une anesthésie et une euthanasie. Durant toute la procédure expérimentale (gavage avec utilisation d'aiguille en plastique souple), les animaux seront suivis et en cas de douleur une injection d'analgésique est prévue. Au cours de la procédure expérimentale, le bien-être des animaux sera évalué par un personnel formé à l’aide d’une fiche intégrant les différents points limites (cf annexe). Sur la base de cette grille, un score est attribué (de 0 à 18). Si le score est compris entre 5 et 9, l’animal sera alors observé attentivement (deux observations par jour), et une prise en charge antalgique pourra être envisagée. Si le score est compris entre 10 et 14, un soulagement de la souffrance sera systématiquement envisagé (même protocole d’analgésie), l’animal sera surveillé de façon renforcée (plusieurs observations par 1/2 journée afin de s'assurer des effets de l'antalgie), et un second avis pourra être demandé en vue d’une éventuelle euthanasie. Enfin, si le score est compris entre 15 et 18, l’animal sera euthanasié.
Choix des espèces
Le rat est un modèle de choix car la physiologie cardiovasculaire des rongeurs présente de grandes similitudes avec celle de l’homme. Le modèle rongeur a l’avantage de permettre des investigations depuis l’étage cellulaire et moléculaire jusqu’aux mesures in-vivo. L’utilisation du même animal pour différentes analyses permet de réduire le nombre d’animaux utilisés au cours du protocole expérimental. De plus, notre équipe est spécialisée dans l’étude des effets cardiovasculaires ce qui facilitera nos expériences d’ischémie-reperfusion ainsi que nos analyses biochimiques. Afin d’éviter des modifications liées au développement des animaux, les rats seront utilisés à un stade mature (12semaines) pour être représentatif d’une population adulte.
Evaluation des effets antinociceptifs de plusieurs molécules injectées par voie intrathécale à l’aide d’un cathéter dans chez le rat
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
945 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Un cathéter leur est implanté par une chirurgie du dos, puis une injection de formol sous la peau de la patte provoque une inflammation que le porteur décrit comme une douleur locale intense, avec des gonflements et jusqu'à vingt-cinq prélèvements de sang possibles par animal. Les retombées annoncées pour les patients, des antalgiques efficaces sans les effets secondaires des opiacés, sont renvoyées au long terme, l'attente à court terme se limitant à des posters et des articles. Sur le remplacement, le porteur affirme que les modèles in silico et in vitro n'atteignent pas la douleur comme "expérience sensorielle et émotionnelle" et conclut au recours au rat.
Objectifs
La douleur est encore dans les principales causes d’arrêt maladie. Très mal soignée ou avec de nombreux effets secondaires, il est important de continuer la recherche pour développer de nouvelles pharmacologies de références. La douleur inflammatoire est associée à des phénomènes d’inflammation qui perdurent anormalement. Dans des conditions normales, l’inflammation aiguë est essentielle pour protéger l’organisme contre les agents pathogènes ainsi que pour favoriser la réparation des tissus. À l’inverse, une inflammation chronique, qui dure 6 semaines ou plus, entraîne des lésions tissulaires et des douleurs indésirables. Les modèles in vivo, aident à comprendre les mécanismes physiopathologiques responsables de la génération de douleurs inflammatoires chroniques et permettent l’identification de nombreux candidats médicaments analgésiques. L’implantation de cathéter permettra l’évaluation de l'efficacité de composés administrés en perfusion directement au niveau central. elle sera évaluée par le test du formol, qui est couramment décrit dans la littérature et est réalisé dans le laboratoire depuis plusieurs années. L’objectif de ce projet est donc de proposer une méthode pertinente qui permettra l’évaluation de l’efficacité de nouvelles molécules à visée analgésique qui pourront ensuite être utilisées en clinique. Le but, à long terme, étant de mieux traiter les patients souffrant de douleurs et de limiter les effets secondaires des composés utilisés.
Bénéfices attendus
Les molécules de référence dans le traitement de la douleur sont soit peu efficaces, soit avec de nombreux effets secondaires (Opiacés : Impact sur le transit, tolérance…). Le but de ce projet est de tester de nouveaux candidats médicaments dans des tests de douleur reconnus. Ils seront comparés aux molécules de références testées en cliniques. Le bénéfice à long terme de ce projet est donc la mise au point de nouveaux composés antalgiques efficaces et avec peu d’effets secondaires destinés à l’évaluation en étude clinique puis à la mise à disposition des patients mais aussi à destination du domaine de la santé animale A plus court terme, la publication de posters/articles scientifiques pour mettre en évidence certains résultats encourageants sera envisagée.
Procédures
L’implantation du cathéter nécessaire pour le traitement se fait via une chirurgie au niveau dorsale qui dure 10-15min sous anesthésie avec un traitement local de la douleur. La stimulation chimique induisant une douleur locale intense. Les animaux seront également isolés dans des compartiments le temps des tests. Les animaux recevront des traitements de composés par injection. Ces actes durent quelques secondes. Ils pourront être réalisés une seule fois, ou plusieurs fois par jour espacé de 0min (simultanément) à plusieurs heures (2-4-6-8-12) ou même de plusieurs jours (une fois par semaine, un jour sur deux pendant 3 semaines maximum) Ceci est dépendant de la pharmacocinétique du composé testé. De plus, les animaux pourront subir des prélèvements de sang en répétés ou en prélèvement unique afin de suivre la pharmacocinétique du composé testé. Les prélèvements de sang durent maximum 3 minutes et les animaux peuvent être sous anesthésie pendant 5minutes. Les prélèvements sont limités à un maximum par jour selon les recommandations en vigueur (nombre maximum théorique: 25 prélèvements)
Impact sur les animaux
Le modèle du formol est un modèle de douleur inflammatoire. Des nuisance liées à l’inflammation sont donc attendues notamment des gonflements ( nuisances modérées à sévères selon l’inflammation). Les nuisances liées aux tests sont dues à l’application d’une injection unique d’un agent inflammatoire (stimulation chimique) en sous-cutanée plantaire (nuisance légère < 1 min). Les tests sont pratiqués sur animal dans une boîte en plexiglass avec une mobilité possible mais réduite (nuisance légère, 1h maximum) De plus, l’ensemble des animaux pourra subir des nuisances liées à l’administration unique ou répétée de composés (lésion superficielle : nuisance légère < 1 min, administration répétée : nuisance modérée). Les composés administrés peuvent induire des effets secondaires listés dans les points limites (posture anormale, sédation). Enfin, les animaux peuvent subir des prélèvements de sang en répétés ou unique afin de suivre la pharmacocinétique du composé (nuisance légère < 3 min). Les nuisances liées à la pose du cathéter et du système de perfusion sont : le risque d’infection, l’apparition de tissu cicatriciel et l’anesthésie.
Devenir
La douleur induite par ce test ne permet pas un retour à l’état physiologique de base. Les animaux ne peuvent donc pas être gardés. De ce fait, dès la fin de la phase expérimentale, les animaux sont euthanasiés par le personnel habilité du laboratoire.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de candidats médicaments analgésiques. Les modèles in silico et in vitro permettent seulement d’étudier les effets de ces molécules sur les mécanismes biologiques encodant les stimuli endommageant, ou susceptibles d’endommager les tissus, mais pas sur la douleur dans sa globalité. Selon sa définition par l’IASP (International Association for the Study of Pain), la douleur est une « expérience sensorielle et émotionnelle ». L’étude de potentiels traitements analgésiques doit donc être conduite dans des modèles restituant à la fois la composante sensorielle et émotionnelle et permettant l’analyse du comportement en plus de la physiologie; faute de quoi la douleur n'est pas étudiée dans toute sa complexité.
Réduction
Ce test est couramment mis en place au sein de la structure. De nombreuses données ont été générées afin de calculer au mieux le nombre d’animaux minimum nécessaire pour réaliser des analyses statistiques à postériori. Pour chaque étude, le nombre d'animaux utilisé est réduit à un minimum acceptable pour l’obtention d’informations robustes et statistiquement pertinentes. Le nombre d’animaux par groupe de traitement a été fixé à n=12 en se basant sur les données disponibles. Il est attendu que le nombre d’animaux effectivement nécessaire soit inférieur aux prévisions de cette demande d’autorisation de projet. Classiquement une étude est composée de 5 à 6 groupes.
Raffinement
Les animaux ont accès dès leur arrivée dans l’animalerie à de l’enrichissement (tunnel en polycarbonate rouge transparent, briquettes en bois) et sont habitués à la salle d’expérimentation et aux tests (enceinte) afin de limiter leur stress. Un système de surveillance de l’état général des animaux associé à des points limites est mis en place au laboratoire. Lors de ce test un temps maximal d’observation est en place afin de limiter la douleur. Une anesthésie est appliquée avant chaque acte le nécessitant et le permettant : prélèvements, pose de cathéter. Une surveillance accrue des animaux est mise en place au vu de la thématique de la recherche. Des points limites sont clairement établis et des mesures sont mise en place suite à la pose de cathéter : aliments placés dans la cage de l’animal si difficultés à se nourrir, injection de solutions hydratantes en cas de déshydratation.
Choix des espèces
La question du remplacement des rongeurs par d’autres espèces est critique et suivie avec attention au sein du laboratoire. Chez ces espèces la démonstration la capacité à ressentir la douleur telle que définie par l’IASP est récente et les modèles in vitro d’étude de la pharmacologie de la douleur à visée clinique ne sont pas encore développés. Le rat a été sélectionné pour ce projet en se basant sur plusieurs critères : a) sensibilité aux stimuli nociceptifs utilisés dans ce projet ; b) large caractérisation du comportement et des modèles dans la littérature ; c) efficacité dans cette espèce des médicaments utilisés chez l’homme sont efficaces pour soulager une douleur équivalente suggérant l’existence de mécanismes biologiques communs. Les animaux utilisés pour l’ensemble des procédures sont des animaux juvéniles (4-7semaines). Ce stade a été choisi car il permet un suivi sur plusieurs semaines des animaux, évitant d’avoir des animaux âgés pour lesquels des pathologies liées à l’âge pourraient interférer avec nos résultats.
Travaux pratiques du BUT Génie Biologique 1ere année : clairance renale et telemetrie ECG pharmaco chez le rat,
- Enseignement supérieur
Déjà utilisés quinze jours plus tôt dans une séance de télémétrie cardiaque, 120 rats sont repris pour une seconde séance de travaux pratiques, où ils sont opérés sous anesthésie et tués sans réveil. 165 rats mâles de 250 à 350 grammes vont ainsi être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour les unes, menées sous anesthésie sans réveil pour l'autre. Ils reçoivent une injection d'un agent qui ralentit le cœur puis, une heure après, d'un agent qui l'accélère, avant que des cathéters posés par les enseignants ne permettent de prélever sang et urine pendant quarante-cinq minutes en moyenne. Cette réutilisation d'un même animal dans deux séances est présentée au titre de la réduction, et le porteur juge "nécessaire" que la formation intègre les méthodes in vivo en plus des méthodes alternatives déjà enseignées.
Objectifs
Le projet s'inscrit dans le progamme pédagogique de la formation universitaire des techniciens supérieures en biologie médicale en accord avec le programme pédagogique national de la dite formation. Il correspond à la realisation de travaux pratiques (2 ) de physiologie sur animaux vivants : la mesure de la clairance rénale chez le rat anesthésie et l'étude des effets cardiovasculaires de l'administration systémique ( sous cutanée) d'agents cardio-inhibiteur et cardio-excitateur (par enregistrement télémetrique non invasif) chez le rat vigile. Ces TPs visent à mieuxcomprendre la physiologie renale et les régulations du systeme nerveux autonome sur l'activité cardiaque. La transmission télémétrique de l'electrocardiogramme sera effectué via le port par chaque rat de gilets permettant un recueil et un enregistrement non invasif des données. Les animaux sont des rats de 250-350 g (mâles).
Bénéfices attendus
Outre les benefices dans la comprehension des mécanismes de regulation de la physiologie rénale et cardiovasculaire , le projet permettra de potentialiser l'apprentissage pour les futurs techniciens des methodes d'étude et d'analyse des parametres physiologiques sur des modèles utilisant des animaux vivants.
Procédures
Les animaux de la procedure 2 seront soumis à 2 injections et seront tous réutilisés 15 jours plus tard dans la procédure 1 pour laquelle il subiront une chirurgie ( en vue de prélèvements urinaire et sanguin) sans reveil ( mise à mort par injection d'un euthanasiant). La durée de la procedure 1 sera de 45 minutes en moyenne. Cette dernière procedure necessitera un lot d'animaux supplementaire car elle s'adressera à 2 groupes d'étudiants supplémentaires.
Impact sur les animaux
Dans le cas de la procédure 1, les animaux subiront l'injection (douleur légère de courte durée) d'un anesthésique précédée de celle d'un sedatif. Dans le cas de la procedure 2 , les animaux subiront une injection d'un agent cardioinhibiteur suivie une heure plus tard de celle d'un agent cardioexcitateur (sévérité modérée car effets cardiovasculaires épisodiques de courte durée sur animal éveillé).
Devenir
A l'issue de la procedure 2 les 120 animaux sont gardés en vie en vue de leur utilisation ultérieure ( Reduire) dans la procédure 1 Tous les animaux de la procedure 1 seront mis à mort ( Sans reveil) car les prelevement invasifs et les cathéterismes rendent impossible la récupération.
Remplacement
L"analyse de la clairance rénale requiert une quantité suffisante d'urine et de sang qui necessite le prelevement in vivo de ces fluides ( via cathétérismes) donc l'utilisation d'animaux vivants et anesthésiés. L'étude telemétrique de l'activité cardiaque necessite l'utilisation d'animaux vivants et de plus les effets des substances pharmacologiques étudiées ne peuvent raisonnablement être évaluées que sur un organisme entier intégrant tous les paramètres physiologiques. Enfin, mêmes si les étudiants du parcours sont formés aux methodes alternatives, il est necessaire que cette formation intègre aussi les méthodes in vivo.
Réduction
Le nombre d’animaux est réduit au maximum ( 1 rat par binôme participant) tout en restant dans des limites pédagogiques efficaces. De plus une partie des animaux seront réutilisés (ceux de la procédure de télémétrie) dans la procedure clairance rénale (sans reveil).
Raffinement
Afin de favoriser au maximum le bien être de l'animal ( limiter les nuisances , la douleur, le stress,...) différentes actions sont mises en place. Pour ce faire, une periode d'habituation de quelques heures à la salle /poste de manipualtions pour les animaux est systématiquement respectée. Les animaux sont anesthésiés pour la procedure sans reveil qui a une durée tres limitée pour le recueil des fluides (sang et urine). La mise à mort survient en moyenne 45 minutes après le debut de l'anesthésie. La chirurgie et les cathétérismes sont effectués par les enseignants compétents. Les caractéristiques du matériel (aiguilles cathéters) sont adaptées à l'espece rat afin de garantir la résussite de l'acte en limitant la douleur ( légère pour l'administration du mélange anesthésique) ou le risque physiologique (volume d'injection ou de prélévement ). Dans le cas de la procedure d'étude télémétrique des effets cardiovasculaires d'agents phamacologiques, la methode est tres peu invasive car elle evite une implantation chirurgicale. En effet les animaux sont habitués à porter un gilet qui enregistre l'activité cardiaque et respiratoire du rat (éveillé et libre de ses mouvements) et la transmet à un ordinateur à distance (sans fil). Les injections des agents pharmacologiques sont realisées avec des aiguilles les plus fines possible pour limiter la douleur (légère) et les doses sont calculées de manière à éviter les effets secondaires. Une surveillace de chaque animal est effectuée apres chaque injection le jour meme de la procedure mais également le lendemain dans l'animalerie. En dehors des procedures, les animaux sont hébergés dans les conditions standard (cage enrichies dans des salles thermoregulées et en cycle lumière J/N inversé ) mais beneficient en plus d'un espace de jeux ( game room )en dehors des manipulations. Cette game room est un espace de jeu pour les rat ou souris qui leur permet ,en groupe , d'interagir avec différents objets ( tunnels, boites à trous, grelots hamacs ...), en dehors de leurs cages, et ce pendant 1h par jour (2 à 3 fois par semaine).
Choix des espèces
Les rats Sprague Dawley sont les animaux modèles les plus utilisés dans l’expérimentation in vivo pour l'étude de la physiologie animale et la pharmacologie Animaux adultes pour faciliter les manipulations des étudiants et répondant au mieux pour le but des TP réalisés, notamment pour l'utilisation des gilets de telemetrie non adaptés pour des animaux trop jeunes ( taille trop petite).
CARC2025: Etudes de toxicité chronique et de cancérogénèse d’une nouvelle molécule avant sa mise sur le marché
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 480
960 rongeurs, 480 souris et 480 rats, vont être exposés pendant toute leur vie, jusqu'à 24 mois environ, à une nouvelle molécule chimique, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour l'examen de leurs organes. Les prélèvements prévus à 3, 6, 12, 18 ou 24 mois comprennent trois prises de sang dans la même journée sans anesthésie, une autre sous anesthésie, et un isolement de 16 heures au plus pour recueillir les urines, à jeun pour les rats. Le résumé ne précise pas par quelle voie la molécule leur est administrée. Les souris et les rats porteurs de tumeurs sont gardés en vie tant que celles-ci n'entravent pas leurs déplacements ou leur capacité à boire et à manger et ne s'ulcèrent pas, et le porteur indique que la molécule peut provoquer chez le rat une opacité de la cornée et une cécité. Il présente ces études comme "une obligation avant la mise sur le marché", et précise que les groupes supplémentaires des lignes directrices chinoises ne seront pas constitués, la molécule n'étant pas destinée à ce marché.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer les risques pour la santé liés à l’exposition à un produit chimique spécifique tout au long de la vie de l’espèce considérée, avant sa mise sur le marché. Pour cela, nous réaliserons une étude combinée de toxicité chronique et de cancérogénicité. Ce projet permet de recueillir des informations sur les effets toxiques de la substance, y compris son potentiel cancérogène, tout en identifiant les potentiels organes cibles et la possibilité d’accumulation du produit dans ces derniers. De plus, il peut fournir une estimation de la dose sans effet nocif observé pour les effets toxiques, ainsi que, dans le cas de substances cancérogènes non génotoxiques, des réponses tumorales. Ces estimations sont cruciales pour établir des critères de sécurité concernant l'exposition humaine et donc le potentiel effet cancérogène pour l’homme. Pour caractériser et évaluer la cancérogénicité potentielle ainsi que la toxicité chronique de ce produit chimique, l’installation d’essai intègre toutes les informations disponibles sur la substance à tester.
Bénéfices attendus
Les études d’exposition chroniques et de cancérogenèse vont permettre : l’identification des propriétés cancérogènes d'un produit chimique susceptible d'augmenter les risques de tumeurs, la fréquence de survenue de tumeurs bénignes ou malignes ou la diminution du temps nécessaire à leur apparition, par rapport au groupe témoin non traité ; l’identification de la toxicité chronique d’un produit chimique ; l’identification d'un ou de plusieurs organes cibles de la toxicité chronique et de la cancérogenèse ; la caractérisation de la relation dose-effet ; l’identification d’un niveau de dose sans effet nocif observé ou du point de départ de l’effet pour l’établissement d'une dose de référence ; l’extrapolation des effets cancérogènes aux niveaux d’exposition humaine correspondant à de faibles doses ; la prévision des effets de toxicité chronique aux niveaux de doses représentatifs de l'exposition humaine ; l’obtention de données permettant de vérifier les hypothèses concernant le mode d’action de la molécule. Toutes ses données seront rapportées, soumises aux autorités internationales et serviront à l’analyse du risque pour l’homme.
Procédures
Aprés 3, 6, 12 et 18 et/ou 24 mois environ, 3 prélèvements sanguins sont réalisés au cours d'une même journée en moins de 2 minutes sur animaux vigiles. Aprés 3, 6, 12 et 18 et/ou 24 mois environ, 1 prélèvement sanguin est réalisé en moins de 2 minutes sur animaux anesthésiés. Aprés 3, 6, 12 et 18 ou 24 mois environ au cours de l’étude, les animaux peuvent être isolés pour une durée maximale de 16h (avec mise à jeun pour les rats) pour le recueil de leurs urines. La mise à mort précédée par une administration d'un analgésique et d'une anesthésie.
Impact sur les animaux
Les niveaux de doses sont fondés sur les résultats des études précédentes. Le choix de la forte dose doit permettre l’évaluation d’une dose bien tolérée par les animaux et induisant une toxicité légere à modérée. Les prelevements de sang peuvent induire une douleur légère et de légers hématomes au point de prelevement. Pour la mesure et le prelevement d’urines, les animaux sont isolés pendant 16h maximum (avec mise à jeun pour les rats). La veille des autopsies prévues, les rats n’ont plus accès à la nourriture pendant 16 h maximum ce qui peut induire un stress léger ainsi qu’une baisse de poids. Compte tenu de l’objectif de l’étude et de sa durée, des tumeurs bénignes ou non , spontanées ou induites par le produit peuvent apparaitre, les animaux seront gardés en vie tant que la taille des tumeurs ne remet pas en cause leur déplacement, et leur capacité à boire ou à s'alimenter(
Devenir
En raison du but de l’étude qui est d’évaluer l’atteinte au niveau des tissus, des organes de l’animal et l’apparition de tumeurs, tous les animaux seront mis à mort pour prelevement d'organes .
Remplacement
Malgré les nombreux tests in silico ( évaluation grace à des calculs/modéles complexes informatisés), in-vitro (essais réalisés sur micro-organismes, organes ou cellules) , et in-vivo conduits lors du developpement de cette molecule qui ont permis de mettre en évidence le mode d’action et les organes cibles de la molécule, ces études animales restent une obligation avant la mise sur le marché d’une nouvelle molécule chimique. Il n’existe pas aujourd’hui de tests substitutifs validés et acceptés par les autorités relatifs à l’évaluation de tumeurs après une exposition chronique.
Réduction
L'essai combiné dans l’étude rat ou l’ajout d’un sous-groupe pour mise à mort intermédiaire (phase chronique) dans l’étude souris permet une meilleure efficacité en temps et en coûts, et un moindre recours aux animaux, par rapport à la conduite de deux essais séparés, et ne compromet pas la qualité des données de la phase chronique ou de la phase de cancérogenèse. La taille des groupes est la taille minimale requise par la ligne directrice. La molecule n’étant pas destinée au marché chinois, les groupes supplémentaires requis par les guidelines chinoises (2 groupes de 10 animaux par doses et par sexes mis à mort après 6 et 18 mois d’exposition) ne seront pas nécessaires.
Raffinement
Compte tenu de la durée de l’étude, une observation quotidienne de l’état clinique des animaux sera assurée et une attention particulière sera portée à l’apparition de tumeurs spontanées ou induites par le produit. Ces tumeurs seront recherchées, observées et mesurées au moins 1 fois/semaine afin de suivre leur progression et/ou l’apparition de zone de nécrose. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués. Lors des prises de sang en cours d’étude l’usage d’un tapis chauffant pourra être utilisé pour maintenir la température corporelle des animaux sous anesthésie. Des micro prélèvements seront utilisés pour l’évaluation des paramètres toxicocinétiques. Le jour précédent leur mise à mort les animaux sont déplacés dans une salle proche de la salle de nécropsie pour éviter le stress du transfert le jour même. Les prélèvements de sang sont réalisés dans une salle séparée et différente de celle utilisée pour la mise à mort. Afin d’éviter toute douleur, les animaux seront mis à mort après une analgésie à l’aide d’un opioïde de type méthadone suivi d’une anesthésie gazeuse à l’isoflurane.
Choix des espèces
Les rats et les souris sont les modèles expérimentaux choisis en raison de leur durée de vie relativement courte, de leur utilisation fréquente dans les études pharmacologiques et toxicologiques, de leur sensibilité à l'induction de tumeurs et de la disponibilité de souches suffisamment caractérisées. Les rongeurs sont recommandés par la communauté scientifique et les instances réglementaires. Des données historiques issues des études précdemment conduites sont disponibles dans le laboratoire avec les espèces et souches choisies (Rat Wistar et souris C57Bl6J). Ces caractéristiques permettent d'obtenir une grande quantité d'informations sur la physiologie et la pathologie de ces animaux. Les animaux utilisés sont de jeunes animaux sevrés à l’arrivée sur le lieu de l’expérimentation dont l’âge après la période d’acclimatation doit être inférieur à 8 semaines compte tenu de l'objectif et de la durée de l'étude (exposition pendant toute la vie de l'animal). Cet age est requis par les lignes directrices internationales.