Rats

9 000 rongeurs, soit 7 200 rats et 1 800 souris, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour mesurer les effets indésirables de molécules sur la respiration, le système nerveux et le cœur. Outre les administrations de la molécule et les prises de sang, ils sont isolés jusqu'à 12 heures dans un pléthysmographe, contenus éveillés pour des tests neurologiques non détaillés, et une partie des rats reçoit par chirurgie un émetteur de télémétrie. L'établissement, spécialisé dans les études réglementaires, produit pour chaque composé un rapport d'effets adverses, étape d'un dossier qui débouchera "potentiellement sur la commercialisation d'un nouveau médicament". Les rongeurs sont tués en fin de procédure, et une partie, en général des rats porteurs d'un émetteur, peut être réutilisée dans des procédures sans réveil, comme un prélèvement d'organes, 3 000 étant déclarés réutilisés. Le porteur affirme que "Seule l'expérimentation animale permet de définir leur innocuité".

Objectifs

L’établissement utilisateur est spécialisé dans la conduite d’études de toxicologie/pharmacologie réglementaires, lesquelles sont indispensables pour initier l’évaluation clinique d’un xénobiotique. La pharmacologie de sécurité est un élément réglementaire indispensable dans le développement préclinique d’un futur médicament. Préalablement aux études cliniques, les effets d’une molécule sur les fonctions vitales (respiratoires, neurologiques et cardiovasculaires) doivent être caractérisés chez l’animal en respectant les Bonnes Pratiques de Laboratoire. Du fait de la complexité des organismes vivants, il n’existe actuellement aucun modèle de remplacement pour prédire les effets pharmacologiques d’une molécule. Seule l’expérimentation animale permet de définir leur innocuité afin de sécuriser les premiers essais chez l’humain. Pour atteindre cet objectif, et en accord avec les recommandations internationales, la présente autorisation de projet permettra de caractériser les effets adverses de molécules sur les systèmes respiratoire, nerveux central et cardiovasculaire chez le rongeur. L’évaluation de la fonction respiratoire (rat/souris) se fera par pléthysmographie corporelle. Cette méthode permettra de déterminer les fréquences et volumes respiratoires.L'évaluation de la fonction neurologique (rat/souris) se fera par évaluation neurocomportementale. L'évaluation cardiologique (rat uniquement) se fera par électrocardiographie implantée ou externe (non invasive). La conduite de ces études de pharmacologie de sécurité conduira à la production d’un rapport décrivant les effets adverses du composé testé.

Bénéfices attendus

Actuellement dans le monde, les maladies cardiovasculaires font 17,9 millions (M) de morts par an, les cancers 10 M/an, les maladies neurologiques 9 M/an, les maladies infectieuses 7,7 M/an, les maladies respiratoires chroniques 3,9 M/an, le diabète 1,5 M/an. Pour un grand nombre de ces pathologies, il n’existe aucune solution thérapeutique satisfaisante. Cette demande d’autorisation de projet permettra de couvrir une étape importante, et indispensable sur le plan réglementaire, du développement de composés innovants. La pharmacologie de sécurité est un élément réglementaire indispensable dans le développement préclinique d’une molécule. Préalablement aux études cliniques, les effets d’un composé thérapeutique sur les fonctions vitales (respiratoires, neurologiques et cardiovasculaires) doivent être caractérisés chez l’animal en respectant les Bonnes Pratiques de Laboratoire. La conduite d’études de pharmacologie de sécurité permettra : 1. d’améliorer la qualité de vie des patients, en permettant à de nouvelles molécules d’entrer en clinique 2. d’améliorer la sécurité des patients, en identifiant et caractérisant les effets indésirables d’une molécule 3. d’optimiser les doses thérapeutiques en identifiant précocement les doses efficaces optimales et les effets secondaires 4. de contribuer à la recherche scientifique. Les résultats de ces projets enrichiront les connaissances scientifiques sur les mécanismes d'action et les profils de sécurité de nouvelles familles de molécules 5. de réduire les coûts de santé en améliorant la sécurité et l'efficacité des traitements 6. de répondre aux exigences réglementaires en matière de sécurité afin d’obtenir l’autorisation d’essais cliniques Donc, à court terme, le bénéfice premier de la mise en œuvre de ce projet sera l’établissement du profil toxicologique/pharmacologique d’une molécule. A plus long terme, les données obtenues au travers des études de pharmacologie de sécurité feront partie intégrante des dossiers règlementaires qui permettront de motiver une demande d’essai clinique qui débouchera potentiellement sur la commercialisation d’un nouveau médicament.

Procédures

Les animaux seront soumis à l'administration d'un composé thérapeutique par différentes voies selon les caractéristiques du composé testé ainsi que des prélèvements saugins. Les volumes et fréquences d'administration et de prélèvements sont établies en fonction des caractéristiques de chaque composé testé, dans le respect des recommandations des instances pharmacologiques et médicales internationales. Les animaux sont généralement anesthésiés pour ces prélèvements, mais peuvent être vigiable pour les administrations. Chaque geste dure généralement quelques minutes. Pour évaluer la fonction respiratoire, les animaux sont isolés dans un plesthymographe après une période d'habituation, au moins 30 minutes, et jusqu'à 12h maximum. Pour évaluer la fonction neurologique, des contentions et tests neurologiques sont effectués vigiles, pendant 10 environ. Pour évaluer la fonction cardiovasculaire, les animaux utilisés auront un émétteur télémétrique implanté par chirurgie avec la procédure décrite dans cette autorisation, ou bien auront un gilet (système non invasif) pouvant être porté en continue pusieurs jours d'affilée.

Impact sur les animaux

Trois catégories de nuisances peuvent être provoqués chez les animaux utilisés dans ce projet. Elles sont toutes prises de manière préventives pour réduire leur impact. 1) Liées aux manipulations vigiles : en cours d’étude, les observations cliniques, ainsi que certaines voies d’administration, peuvent nécessiter d’une manipulation et une contention manuelle des animaux. Elles sont faites selon les bonnes pratiques vétérinaires mais cela peut néanmoins engendrer un stress modéré. 2) Liées aux prélèvements/administration : la réalisation de prélèvements de sang et l’administration de la molécule testée peut provoquer des lésions locales et un stress des animaux en cas de réalisation incorrectes, d’individus plus fragiles ou bien de l’immobilisation nécessaire pour certaines voies d’administration. . 3) Liées à une toxicité de la molécule testée : ce projet vise à évaluer les effets pharmacologiques, y compris délétères, d’une molécule. Cependant, les recommandations internationnales des agences de santé qui sont appliqué par l'établissement sont de choisir une dose ne produisant que des effets indésirables au maximum modérés, il n’est donc pas attendu d’effets toxiques majeurs dans les études de pharmacologie.

Devenir

Afin d'éviter tout risque pour l'animal ou la santé publique, les animaux sont en 1er intention euthanasiés en fin de procédure. Une partie des animaux, généralement les rats disposant d'un émétteur télémétrique, peuvent être réutilisé dans des procédures sans réveil (ex : prélèvement d'organes). Dans certains cas, les animaux des groupes témoins peuvent être adopté, après avis vétérinaire et validation de la SBEA. La décision est prise au cas par cas, en fonction du protocole expérimentale de l'étude et du composé utilisé dans le groupe témoin.

Remplacement

La pharmacologie de sécurité étudie les interactions entre une molécule extérieur au corps et une ou plusieurs cibles en lien avec les systèmes respiratoires, neurologiques et cardiovasculaires. Ces interactions recouvrent les effets potentiels de la molécules, ou de ses produits de dégradation sur les fonctions étudiées. Une bonne compréhension des mécanismes de toxicité est donc indissociable d’une bonne connaissance des mécanismes physiologiques, développementaux, cellulaires et moléculaires. Actuellement, l’ensemble des cibles potentielles et les mécanismes conduisant à une toxicité ne sont pas complètement élucidés et ne peuvent donc pas être modélisés. Il n’existe donc pas de modèle de remplacement. C’est pour cela que la règlementation impose d’évaluer la toxicité potentielle d’un composé thérapeutique avant tout essais chez l’humain.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux dans les études de pharmacologie de sécurité : • nous nous assurerons de la validité et de la prédictivité des données acquises avant de démarrer toute expérimentation, pour ne pas évaluer des composés non pertinents • si nécessaire, des études pilotes seront réalisées. Elles auront pour objectif d’évaluer graduellement la toxicité des composés et de rechercher les doses les plus prometteuses sur un nombre limité d’animaux Concernant les études de pharmacologie de sécurité : le nombre d’animaux est fixé au minimum permettant de détecter statistiquement des effets adverses.

Raffinement

Le raffinement de nos procédures inclue : • la gestion du stress et de l’angoisse : les animaux seront acclimatés (animalerie, nouveaux congénères, environnements de test) pendant 5 à 15 jours selon le protocole, et habitués à la manipulation et à la contention. Ils seront également hébergés à 3 par cage au minimum, pour augmenter les interactions sociales, dans un environnement enrichi • la prise en charge précoce de la douleur : un même opérateur observera matin et soir chaque animal. La douleur sera objectivée en fonction de modifications de l'apparence, de la posture et du comportement . En parallèle, une échelle de douleur sera employée et un analgésique sera mis en place si nécessaire, après validation par un vétérinaire. • des soins vétérinaires adaptés seront mis en place si nécessaires : compléments alimentaires, sérum physiologique, antibiotique, analgésique • l’intégration de points limites stricts : une grille précise d’évaluation sera utilisée afin d’anticiper la mise à mort si nécessaire. Dans tous les cas, l’ensemble des animaux seront mis à mort à la fin de l’expérimentation, exception faite des animaux implantés avec un boitier de télémétrie. Spécifiquement pour les études de cardiologie, la méthode validée nécessite l'implantation chirurgicale d'un module de télémétrie. Afin de rendre cette technique moins invasive, l'utilisation d'un module externe avec des électrodes de surface placé dans un gilet est en cours d'évaluation.

Choix des espèces

Les études de pharmacologie réglementaire in vivo sont régies par la ligne directrice ICH S7A. Ces études peuvent être réalisées sur des espèces rongeur et non rongeur. Le rat et la souris sont 2 espèces retenues pour ces études du fait de leur prédictivité et font l’objet de cette DAP. Les animaux sont utilisés à partir de 6 semaines. Les données récuillies sur les études de la fonction neurologique et la fonction respiratoire sont plus robuste sur des animaux de 6-8 semaines et 8-12 semaines respectivement.

Les rats utilisés portent une mutation qui affaiblit leur système immunitaire pour éviter le rejet du greffon, ce qui leur vaut une perte de poils, des poils qui s'accumulent sous les paupières et une sensibilité accrue aux infections. 180 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leur rétine est lésée au laser ou par injection d'un composé chimique, puis un fragment de rétine cultivé à partir de cellules souches humaines est greffé sous la rétine au cours d'une opération de quinze à vingt minutes, suivie d'imageries hebdomadaires et d'électrorétinogrammes sous anesthésie générale. Tous sont tués à la fin pour analyser la rétine et le devenir des cellules greffées, et tout signe d'infection de l'œil entraîne une mise à mort anticipée.

Objectifs

Les maladies choroïdiennes héréditaires et la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA), sont des pathologies qui entraînent une perte de la vision pouvant conduire jusqu’à la cécité. Elles affectent des millions de personnes dans le monde, et dans la plupart des cas aucun traitement disponible. Ce projet a pour objectif de démontrer que l'on peut rétablir la vue avec la transplantation d’un morceau de rétine fabriqué en laboratoire à partir de cellules souches humaines. Les transplantations seront réalisées dans un modèle de rats porteur d'une mutation qui altère le système immunitaire (pour éviter les mécanismes de rejet du greffon). Afin de mimer les pathologies humaines, la rétine des animaux sera lésée avec le laser ou avec l’injection d’un composé chimique. Le potentiel thérapeutique des greffons sera évalué par des approches comportementales et électrophysiologiques (sensibilité de la rétine à la lumière).

Bénéfices attendus

Il n'existe peu ou pas de traitement pour soigner les dystrophies rétiniennes (prévalence de 1 sur 3000) et la dégénérescence maculaire liée à l'âge (8 pourcent de la population française) ou pour restaurer la vision quand celle-ci est perdue. L 'objectif est de développer des approches de thérapie cellulaire à base de morceaux de rétine obtenus à partir de cellules souches humaines. Cette thérapie aura pour objectif de restaurer la vision dans ces maladies.

Procédures

Pour cette étude une lignée de rats immunodéprimés sera transplantée avec des cellules humaines. Afin de mimer la pathologie humaine, deux techniques seront testées : lésion de la rétine avec le laser (moins d'une minute) ou injections d’un composé chimique (injections d’une durée de quelques secondes) : 1 injection pour les animaux concernés. Chirurgie: Une procédure chirurgicale sous anesthésie générale sera réalisée chez les rats. De plus, la chirurgie sera réalisée sous analgésie en complément de l’anesthésie. La procédure chirurgicale consiste en une transplantation intraoculaire (sous la rétine) d’un tissus rétinien fabriqué en laboratoire. Cette opération dure 15 à 20 minutes et n’est réalisée qu’une seule fois. Tous les animaux feront l’objet de 3 types d’examen : 1/Un examen par imagerie permettant l’observation de l’anatomie et la structure de la rétine (tomographie par cohérence optique); cet examen qui nécessite l’immobilité de l’animal se fera sous anesthésie générale ; Les examens d’imagerie ont une durée de 10 à 15 minutes. Cet examen sera réalisé une fois par semaine pendant 2 mois pour mettre en place le modèle par injection de composé chimique (maximum 8 fois) ou 1 fois par mois (maximum de 3 fois pour les animaux greffés et gardés le plus longtemps). 2/ Un examen électrophysiologique (Electrorétinogramme) qui permettent l’étude de la fonction de ce tissu. Cet examen qui nécessite l’immobilité de l’animal se fera sous anesthésie générale. L’électrorétinogramme a une durée de 30 minutes environ. Cet examen sera réalisé une fois par mois (maximum de 3 fois pour les animaux gardés le plus longtemps). 3/ Un test comportemental à l’état vigil sans contrainte particulière (maximum de 3 fois pour les animaux gardés le plus longtemps). Ces tests de la fonction visuelle sont rapides (5 à 10 minutes environ). Cet examen sera réalisé une fois par mois (maximum de 3 fois). Analgésies et antidote anesthésie (injections d’une durée de quelques secondes): maximum 11 fois par animal au cours de l’étude qui dure jusqu'à 3 mois. Les rats seront euthanasiés à la fin de l'étude par une méthode réglementaire en vue d'une analyse histologique de l'œil.

Impact sur les animaux

Le phénotype immunodéprimé entraine une perte de poils à 3 ou 4 semaines avec une réapparition par touffes au cours de la vie du rongeur. Ces poils peuvent s’accumuler dans l’œil sous les paupières et cela nécessite donc un soin particulier pour éliminer cette accumulation. Les animaux sont plus susceptibles de développer des infections opportunistes du fait de leur statuts immunodéficient. Un léger stress et une brève douleur localisée au moment de l’introduction de l’aiguille peuvent être induits par les injections des différents médicaments en intrapéritonéale ou sous cutané. L’anesthésie peut entrainer un risque cardio-respiratoire et d’hypothermie. La photocoagulation au laser et les greffes sous-rétiniennes peuvent provoquer des lésions temporaires comme des décollements localisés de la rétine et de petites hémorragies oculaires. Une douleur et/ou un risque infectieux peuvent survenir pendant ou après les greffes. Un léger stress peut être engendré lors du changement d’environnement des animaux (mise en chambre noire la veille de l’électrorétinogramme).

Devenir

A la fin de chacune des procédures, les animaux sont euthanasiés par une méthode réglementaire pour permettre des analyses histologiques ou fonctionnelles (électrophysiologies) des tissus (rétine). Ces explorations sont nécessaires pour évaluer le bénéfice de la transplantation au cœur du projet et le devenir des cellules transplantées (intégration aux tissus de l’hôte, etc…).

Remplacement

Le projet consiste à évaluer la capacité d’une greffe de cellules à permettre une préservation de la fonction visuelle. Cette évaluation ne peut donc pas être faite par des approches in vitro. Les approches in vitro ne permettent d’évaluer que des paramètres isolés de culture et non pas des interactions avec une rétine. Il n’est ainsi pas possible de démontrer la fonctionnalité d’un produit de thérapie cellulaire de la rétine autrement que in vivo. Ce projet ne peut être réalisé que chez l’animal.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, les transplantations seront réalisées dans un seul œil ; l’œil controlatéral servira de contrôle évitant d’utiliser d’autres animaux dans ce but. Par ailleurs, la majorité des actes peuvent être réalisés sur les mêmes animaux permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Nous avons réduit le nombre d’animaux par groupe au minimum requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables en tenant compte de la variabilité plus importantes des mesures effectuées (en raison d’un taux d’échec évalué à 20-30 pour cent (chirurgie, rejet de greffe, opacification du cristallin, etc..). Le nombre a été calculé sur la base des données de la littérature pour des approches similaires et en fonction du devenir post-mortem des animaux. Pour limiter le nombre d’animaux, les résultats seront analysés à l’aide de tests statistiques non-paramétriques adaptes aux petits effectifs. Au final, 180 animaux seront utilisés dans le projet.

Raffinement

Les animaux seront examinés quotidiennement par les expérimentateurs et/ou le personnel qualifié de l’animalerie et seront hébergés avec enrichissement de nourriture et boisson à volonté. Les animaux utilisés dans ce projet ont une perte de poils dans la 3-4 semaines avec une réapparition par touffes au cours de la vie du rongeur. Ces poils peuvent s'accumuler dans l'œil sous les paupières nécessiter un soin particulier pour éliminer cette accumulation. Pour les expérimentations qui le nécessitent, les rats bénéficieront d’une anesthésie générale. Le risque de douleur généré par la transplantation de tissus est géré en pré-opératoire et post-opératoire par l’injection d’analgésiques. Les animaux feront l’objet d’une surveillance plus accrue pendant les 24h suivant les différents actes (réveil post-anesthésie, état de la surface oculaire après les électrorétinogrammes, signe d’inflammation, etc…). Tout signe d’inflammation ou d’infection de l’œil entrainera l’euthanasie de l’animal.

Choix des espèces

Les rats sont couramment utilisés dans les études précliniques. La taille de l’animal rend le geste technique (transplantation sous-rétinienne) moins difficile que chez la souris par exemple, ce qui réduira significativement le risque d’échec de la procédure et donc le nombre d’animaux nécessaire à l’étude. Rats immunodéficients : Ces rats possèdent une modification génétique qui affaibli le système immunitaire (pour prévenir le rejet de greffe). Les différentes analyses seront réalisées chez le rat adulte sur une durée maximum de 3 mois après greffe, le stade le plus tardif prévu per l’étude. Le choix de l'âge adulte est lié au fait que les greffes sont plus aisées à réaliser dans l'oeil adulte (plus grand) de même que les traitements lasers. De plus , la DMLA est une maladie qui touche les adultes.

Une grille de cotation de la douleur fixe le seuil au-delà duquel un rat sera mis à mort avant terme. 80 rats porteurs d'une mutation analogue à celle de la maladie de Huntington vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Chacun subit une neurochirurgie d'environ une heure pour implanter des électrodes non amovibles, puis des enregistrements de douze à quarante-huit heures deux fois par mois pendant dix mois, des stimulations sonores mensuelles, et vit seul en cage pendant neuf mois avec un accès à la nourriture contrôlé. L'objet déclaré est de trouver des marqueurs électriques cérébraux transposables entre le rat et le patient, pour servir de test dans la mise au point de médicaments.

Objectifs

Les patients atteints de la maladie de Huntington, souffrent, en plus des symptômes moteurs et d'une altération de certaines capacités intellectuelles, de troubles du cycle veille-sommeil, ces perturbations du sommeil pouvant déjà être présentes au stade précoce (présence de symptômes avant-coureurs) de la pathologie. L'électroencéphalographie (EE) représente un outil de choix lors des tests précliniques en raison de son caractère transposable entre le rat et l’Homme car les activités cérébrales de base sont largement conservées dans l’évolution des mammifères ce qui permet donc l’application chez le rongeur d’observations faites chez le patient et inversement. Un modèle de rat porteur d’une mutation analogue à celle identifiée chez les patients atteints de la pathologie est disponible et a été caractérisé d’un point de vue comportemental. Il présente des troubles moteurs proches de ceux décrits chez l’Homme. Il est donc pertinent d’explorer les autres caractéristiques de la maladie décrites chez le patient afin de confirmer la pertinence de ce modèle dans l’étude de la maladie et la recherche de nouvelles solutions thérapeutiques. Dans ce projet, nous étudierons donc les phases de veille-sommeil et les oscillations cérébrales spontanées et évoquées dans un modèle de la maladie de Huntington.

Bénéfices attendus

La découverte et l’optimisation de nouveaux médicaments nécessite d’identifier des signes de la maladie dans le cerveau et des tests transposables entre les études cliniques et précliniques. Ils doivent permettre d’évaluer de façon fiable et robuste l’efficacité des molécules testées. Les activités électriques cérébrales sont largement conservées à travers les mammifères permettant ainsi une transposition fiable entre l’humain et le rongeur. Dans ce projet, nous utiliserons des rats modélisant la maladie de Huntington et chercherons à mettre en évidence des marqueurs de la maladie qui pourront par la suite être applicables à l’Homme et permettre de tester de nouvelles molécules thérapeutiques.

Procédures

L’ensemble des animaux de ce projet vont subir une neurochirurgie d’environ une heure, réalisée sous anesthésie générale. Les animaux seront tous soumis à des enregistrements longs (12 à 48 heures) qui seront réalisés sur l’animal éveillé de façon bimensuelle avec un intervalle minimum d’une semaine, sur une durée de 10 mois maximum. Les animaux pourront être soumis à des stimulations sonores qui seront réalisées sur l’animal éveillé une fois par mois (durée de quelques heures) sur une durée de 10 mois maximum (entre l’âge de 6 mois et de 15mois). Les stimulations sonores intermittentes dureront au maximum 2h. Les animaux sont hébergés de façon individuelle sur la totalité du projet à partir de la chirurgie (9 mois maximum). L’accès à la nourriture est contrôlé pendant la totalité du projet à l’exception des 2 semaines suivant la chirurgie.

Impact sur les animaux

Suite à la chirurgie, une diminution de l’activité locomotrice et une déshydratation passagère pourront être observées. Une douleur modérée pourra apparaître dans les heures suivant l’intervention chirurgicale. Les stimulations sonores utilisées seront limitées à une intensité en dessous de l’intensité dommageable et qui n’induit pas de réaction de stress sur les animaux. Après implantation des électrodes, les animaux seront hébergés en cages individuelles, avec un contact social réduit (plusieurs semaines) ce qui peut engendrer du stress. Des troubles de la démarche et de la coordination sont décrits dans la littérature sur cette lignée.

Devenir

Ce projet implique l’implantation de dispositifs d’enregistrement de signaux électriques du cerveau qui ne sont pas amovibles. De plus, des analyses des tissus cérébraux sont nécessaires pour compléter la caractérisation du modèle et vérifier le positionnement des électrodes les animaux doivent donc être mis à mort à la fin du projet.

Remplacement

Cette étude nécessite l'utilisation de modèles animaux car elle étudie des mécanismes physiopathologiques complexes, comme le sommeil, qui ne peuvent pas être représentés par des modèles plus simples (ex. modèle cellulaire ou informatique).

Réduction

Les études sur le long terme présentent un avantage significatif en permettant à chaque animal de servir de contrôle pour lui-même, réduisant considérablement le nombre d'animaux nécessaires par groupe. Cette approche méthodologique nous a permis de déterminer le nombre d'animaux de manière à minimiser celui-ci, tout en veillant à préserver la validité scientifique et la fiabilité des résultats des expériences menées. Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires à nos études, les protocoles combineront un ensemble de recueil de mesures permettant de faire un suivi et d’obtenir plusieurs informations chez le même rat.

Raffinement

Le raffinement a été appréhendé à travers les conditions d'expérimentation et d'hébergement qui sont optimisées afin de s'assurer du bien-être des animaux tout au long des procédures expérimentales. Les rats qui entrent dans ce projet ont au minimum une semaine d’acclimatation à la zone d’hébergement. Les animaux seront regroupés dans une grande enceinte lors d’une session hebdomadaire afin de favoriser les contacts. Le projet prévoit des recueils des mesures engendrant des douleurs post-opératoires modérées. Toutefois, les animaux recevront un protocole de soins post-opératoires comprenant une évaluation clinique quotidienne, des antidouleurs et des anti-inflammatoires. Une échelle de cotation de douleur basée sur des signes indicatifs de gêne sera utilisée afin d’évaluer l’état général de chaque animal et de définir le point limite, permettant ainsi de prendre le plus rapidement possible des mesures nécessaires pour préserver le bien-être de l’animal. De plus, nous appliquerons des actes expérimentaux les moins invasifs possibles aux rats testés comme le choix d’une anesthésie gazeuse (par rapport à une injection). L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long des expériences et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de douleur et les points limites adaptés. Cela nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. La prise en compte de ces points permettra de juger du bien-être et d'éviter l'inconfort des animaux au cours de l'expérimentation de manière à garantir la qualité des résultats. Les stimulations sonores utilisées seront limitées à une intensité sonore en dessous de l’intensité dommageable.

Choix des espèces

Nous utiliserons une lignée de rats dont la mutation est similaire à celle présente chez les patients de la maladie de Huntington. Le choix de l’espèce est donc directement lié à cette similarité : la mutation de ce même gène chez l’homme et le rat induit en effet des troubles similaires dans les deux espèces. Les animaux sont manipulés au minimum à l’âge de 6 mois puisque nous souhaitons évaluer les modifications des activités électriques chez des animaux adultes. Les animaux seront gardés jusqu’à l’âge de 15 mois maximum. A ce stade, le cerveau est mature et présente des caractéristiques intéressantes pour reproduire les troubles observés chez le patient humain.

12 000 souris et 500 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal peut recevoir jusqu'à trente administrations d'un composé en dix jours et subir jusqu'à seize prélèvements de sang, dont le dernier est terminal. Il s'agit de mesurer ce que l'organisme tolère avant les études d'efficacité, le porteur annonçant une possible dégradation de l'état de santé, une perte de poids, une hypothermie ou une hyperthermie, une prostration et des vocalisations. L'effectif se déduit d'un maximum de 50 études de tolérabilité prévues sur la durée du projet, chiffre lui-même tiré d'une analyse rétrospective des trois dernières années.

Objectifs

Dans le cadre du développement de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le domaine de l’oncologie, il est nécessaire de tester l’efficacité de nouveaux composés dans les conditions mimant au mieux la pathologie. Malgré les efforts réalisés pour mettre en place de robustes modèles in vitro et des études de modélisation sur ordinateur, le développement de modèles in vivo ayant recours à des animaux de laboratoire sont nécessaires au développement, à l’évaluation et à la sélection de nouvelles molécules candidates à de futures études cliniques(1,2). Lorsque la molécule est sélectionnée sur des critères de sélectivité et d’activité in vitro, ainsi que sur les paramètres pharmacocinétiques et pharmacodynamiques acceptables chez l’animal, il est crucial d’évaluer la tolérance de la molécule suite à une administration unique ou répétée afin d’identifier sur de petits groupes d’animaux l’innocuité de la molécule à des doses et régimes d’administration précis dans le but de supporter les futures études d’efficacité. Le nombre estimé d'études pour l'ensemble du projet est estimé sur la base d'une analyse rétrospective qui a évalué le nombre d'études de tolérance menées au cours des trois dernières années. Au total, nous prévoyons de réaliser au maximum 50 études de tolérabilité pendant toute la durée du projet.

Bénéfices attendus

A l’origine de plus de 10 millions de décès par an, le cancer est l’une des principales causes de mortalité dans le monde. Les principaux traitements aujourd’hui consistent en la chirurgie et la chimiothérapie, souvent associées à une radiothérapie. Malgré ces options thérapeutiques, le nombre important de décès par an souligne l’inefficacité de ces traitements et la nécessité de développer de nouvelles thérapies. La procédure qui constitue ce projet s'inscrit dans le cadre du développement de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes. A court terme, elles permettront d’évaluer la tolérabilité des animaux pendant les futures études d’efficacité de nouveaux candidats médicament dans le domaine de l’oncologie.

Procédures

Les gestes techniques concernant les animaux sont : - Administrations des composés à potentiel thérapeutique : une à trois fois par jour selon voie d’administration et nature du composé, sur maximum 10 jours, soit maximum 30 traitements. - Prélèvements sanguins : Sur la totalité d’une étude, un animal reçoit au maximum soit 15 prélèvements de microsampling + 1 prélèvement terminal, soit 6 prélèvements standards + 1 prélèvement terminal. o Prélèvements de sang sur animal vigile par microsampling (durée 30 secondes) : jusqu'à 5 prélèvements sur 24 heures, et maximum 15 fois par animal sur toute la durée de l’étude. o Prélèvement de sang standard sur animal vigile ou anesthésié: durée 1 minutes, maximum 6 fois par animal . o Un prélèvement sanguin terminal sous anesthésie (1 min., une fois).

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent être stressés par les manipulations liés aux traitements et aux prélèvements auxquels ils sont soumis et peuvent ressentir une légère douleur au site d'injection ou de prélèvement sanguin. De plus, les animaux reçoivent pour la première fois un traitement à moyen terme avec de nouvelles molécules qui peuvent parfois être mal tolérées. Ces effets apparaissent potentiellement au fur et à mesure des jours de traitement : dégradation de l'état de santé de l'animal pouvant se traduire par une perte de poids, une hypo- ou hyperthermie, un comportement anormal (animal prostré, ne répondant pas aux stimuli), des vocalisations, limité à une gravité modérée par l'application de points-limites anticipés.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue des procédures pour effectuer des prélèvements de sang et de tissus qui feront l’objet d’analyses ultérieures (ex : dosage de biomarqueurs, dosage des concentrations des composés à potentiel thérapeutiques dans différents organes).

Remplacement

Deux approches sont principalement utilisées pour mimer les événements biologiques associés à des pathologies : une approche in vitro, basée sur l’utilisation de lignées cellulaires et des approches in vivo, basées sur l’utilisation d’animaux de laboratoire, chez lesquels des cellules issues de pathologies d’intérêt sont inoculées. Les modèles in vitro sont utilisés autant que possible en amont pour limiter le recours à l’animal. Cependant, les modèles in vitro ne recréent ni la diversité de l’environnement de la pathologie dans son ensemble, ni la difficulté pour une molécule testée d’atteindre les cellules cibles. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques. De plus, à notre connaissance, il n’existe pas de modèles in silico ou in vitro qui permettent de modéliser/simuler la tolérabilité d’un animal à un composé. L’écosystème nécessaire pour la tolérabilité intègre de nombreux tissus et organes : système digestif, système circulatoire, système rénal, système immunitaire intégral, système nerveux périphérique et central. Seul un modèle animal peut permettre d’étudier les interactions entre des composés à potentiel thérapeutique et ces différents systèmes biologiques très complexes.

Réduction

Des tests in silico, in vitro et de pharmacocinétique in vivo permettent de sélectionner les molécules disposant d’une bonne sélectivité, activité in vitro et exposition avant d’évaluer leur innocuité et leur activité in vivo. De nombreux composés auront donc été éliminés du fait de leur faible performance sur ces tests. La probabilité d'observer une activité sur les modèles qui font l’objet des procédures de ce projet sera par conséquent élevée. Le nombre d'animaux prévu pour ce projet se base sur les données de la littérature. Des analyses de puissance statistique seront utilisées pour la détermination de la taille des groupes expérimentaux. Des analyses rétrospectives seront conduites pour s'assurer de la bonne adéquation du nombre d'animaux par groupe et de la puissance statistique recherchée et si possible voir pour réduire encore le nombre utilisé.

Raffinement

Le nombre de manipulations sur les animaux sera réduit au strict nécessaire. Les procédures les plus invasives, plus susceptibles d’engendrer un inconfort ou un stress seront réalisées sous anesthésie. Les animaux feront l’objet d’une surveillance clinique et sanitaire quotidienne. Leur état de santé sera évalué à l’aide d’une grille de score basée sur des critères cliniques et comportementaux, associée à un arbre décisionnel permettant l’application de points limites adaptés. En fonction de l’évolution de l’état de l’animal, des mesures seront mises en place, telles que l’intervention du vétérinaire, l’administration d’analgésiques supplémentaires, l’ajout d’enrichissements ou d’alimentation spécifique, voire la mise à mort de l’animal si nécessaire, afin de prévenir toute souffrance prolongée.

Choix des espèces

La grande majorité des modèles et techniques utilisés dans la recherche médicale et pharmaceutique ont été décrits chez le rongeur. De nombreuses données sur les modèles ectopiques de cancer chez la souris et le rat existent dans la littérature et peuvent être utilisées pour la mise en place des modèles et aider à l’avancement des projets (doses de cellules, effets de molécules de références, etc…) Les données de la littérature indiquent clairement que les rats et les souris adultes représentent des modèles fiables pour l'évaluation de l'efficacité de composés dans le domaine du cancer. Les études de tolérabilité en amont seront donc elles-aussi réalisées avec des rongeurs adultes.

120 rats non consanguins de six à huit semaines vont être utilisés, tous tués au plus tard quatorze jours après le début de la procédure, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit une administration unique du composé, en intraveineuse ou par sonde de gavage, puis subit huit prélèvements sanguins à la veine saphène sous anesthésie. Le protocole se déroule sur des animaux sains et mesure où va la molécule dans l'organisme, combien de temps elle y reste et comment elle en sort. Le porteur situe ce passage chez le rat dans une séquence qu'il décrit comme classique, la première étape sur "organisme entier" avant "d'envisager éventuellement d'autres études plus avancées chez le chien ou le primate".

Objectifs

Les cancers hématologiques comme les leucémies, les myélomes et les lymphomes, sont des cancers qui se développent à partir de cellules du sang. En France chaque année, 33 000 personnes sont touchées par ces pathologies, en particulier les enfants, jeunes adultes et personnes âgées. Ils représentent 7% des cancers. Le traitement des cancers hématologiques repose en grande majorité sur la chimiothérapie à l'heure actuelle. Ces options thérapeutiques entrainent un certain nombre d’effets indésirables et leur efficacité diffère selon les patients. Malgré ces traitements, l’espérance de vie des personnes touchées par ces types de cancer varie de 2 à 5 ans après le diagnostic. Nous nous intéressons dans ce projet à un potentiel nouvel agent anticancéreux : une enzyme en tant que voie prometteuse dans les thérapies alternatives contre le cancer. Cette enzyme offre un avantage unique, sa capacité à cibler sélectivement et à inhiber la croissance des cellules cancéreuses sans nuire aux cellules saines.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine à moyen terme. En effet, il y a encore aujourd’hui des patients atteints de cancer hématologiques réfractaires aux traitements sur le marché. L’étude va permettre de développer de manière préliminaire une nouvelle molécule qui permettra au mieux de guérir les patients atteints de ce type de cancers, ou au moins de ralentir la progression tumorale.

Procédures

Administration des traitements : contention et injection des composés en intraveineuse (une fois unique, geste d'une durée de 30 secondes) ou en gavage (une fois unique, geste d'une durée de 30 secondes). Les prélèvements de sang seront effectués à la veine saphène (anesthésie et prélèvement d’une durée de 30 secondes).

Impact sur les animaux

Lors du traitement, les animaux vont subir un stress à la contention et une douleur de quelques secondes due à l'aiguille lors de l'injection intraveineuse. Les administrations par voie orale avec sonde de gavage génèrent un stress de quelques secondes lors de la contention. Les prélèvements de sang répétés vont générer un stress lors de l’anesthésie et du prélèvement (8 prélèvements au total par animal). Aucun signe de toxicité particulière lors de l'administration du composé aux doses testées dans ce projet n’a été observé chez le rat lors de l'étude préalable de tolérance.

Devenir

Tous les animaux auront été mis à mort au plus tard 14 jours après le début de la procédure si aucun point limite n’a été atteint avant ce délai afin de pouvoir réaliser les prélèvements de sang puis d’organes prévus dans la procédure.

Remplacement

Avant le passage chez l’animal, de nombreuses manipulations de caractérisation de notre composé d’intérêt ont été réalisées (études de cytotoxicité) ayant permis de sélectionner les types de cancers sur lesquels il serait le plus efficace. Ensuite, le passage chez le rat a permis l’évaluation de sa tolérance sur un organisme entier. Par ailleurs plusieurs paramètres impactant l’élimination, le métabolisme et la diffusion du médicament dans l’organisme nécessitent d’être étudiés et définis sur l’organisme vivant sain avant de tester dans de futurs projets son efficacité sur organisme malade. Pour cette raison nous devons effectuer cette étude chez le rat.

Réduction

Les procédures seront réalisées sur le nombre minimal d’animaux nécessaires pour permettre de conclure de manière fiable sur cette étude préliminaire qui permettra de définir le cheminement du composé dans l'organisme. Pour la comparaison des quantités maximales du composé dans le plasma entre chaque groupe traité, nous utiliserons un test statistique fiable à multiple comparaisons. Pour le choix du nombre de rat par groupe qui nous permettra de pouvoir observer des différences entre les groupes et de choisir la dose ainsi que le mode d'administration les plus adéquats chez le rat, nous avons utilisé des logiciels statistiques reconnus. Les résultats de ce projet seront évalués pour déterminer la nécessité de poursuivre les expériences et la stratégie à adopter, afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Avant toute manipulation, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation et d’habituation au(x) manipulateur(s) pendant 7 jours. Après la période d’acclimatation et avant le début des procédures nous habituerons les animaux à la manipulation en les pesant et en les contentionnant une fois par jour pendant 5 jours. Les rats seront observés tous les jours par le personnel de l'animalerie qui remplit une fiche de suivi de l’état général des rats afin de détecter rapidement une souffrance, et 7 jours sur 7 dans le cadre de ce protocole par les expérimentateurs qui remplissent un scoring plus détaillé si nécessaire afin d’identifier l’atteinte d’un point limite. L’état général des rats sera ainsi suivi et annoté dans le cadre de l’expérimentation grâce à une grille de scoring détaillée. Les expérimentateurs sont expérimentés et sont à même de détecter très rapidement le moindre signe de douleur afin d’appliquer les meilleures mesures. Les animaux seront hébergés en groupe de 3 rats par cage et chaque cage présentera des enrichissements (coton de nidation, bâtonnet à ronger, tunnels pour jeux). Pour les groupes dont le composé sera administré par voie orale en gavage, des sondes de gavages en plastique flexibles évitant l'irritation et à usage unique seront utilisées.

Choix des espèces

Afin de plus tard développer cette molécule thérapeutique chez l'Homme, nous devons au préalable observer son devenir dans l'organisme chez l’animal, la première étape sur organisme entier étant classiquement réalisée chez le rat ou la souris avant d’envisager éventuellement d’autres études plus avancées chez le chien ou le primate. Pour ce faire, nous souhaitons étudier les paramètres pharmacocinétiques qui correspondent à : son absorption, sa distribution, sa métabolisation et son élimination en analysant les quantités de celui-ci dans le sang à différents temps après injection, dans les deux sexes chez le rat non consanguin. Les rats non consanguins sont utilisés pour l’évaluation toxicologique et pharmacologique des candidats-médicaments. Ainsi, les rats non consanguins présentent une plus grande diversité génétique, et sont donc plus intéressants pour les études de tolérance. Les animaux seront utilisés à l’âge de 6 à 8 semaines afin que les animaux soient jeunes et en bonne santé.