Rats
Analyse de l’activité cellulaire dans un modèle de migraine par injection chez des animaux mâles et femelles
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Injectés cinq jours de suite sous la peau, 300 rats voient la sensibilité de leur face testée toutes les trente minutes pendant quatre heures, par application de filaments fins et par des jets d'air de trois secondes. Ces procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et se terminent par une chirurgie de quatre à six heures sous anesthésie profonde, sans réveil, comprenant une trachéotomie, la canulation de la carotide et de la jugulaire et une craniotomie. L'objet déclaré est de comparer les réactions des mâles et des femelles à une molécule qui déclenche des crises de migraine, la migraine touchant davantage les femmes alors que les études ont surtout porté sur des mâles. Cette molécule, dont le porteur affirme qu'elle provoque une douleur modérée à laquelle l'animal peut se soustraire puisqu'il n'est pas maintenu, n'est jamais nommée dans le résumé.
Objectifs
Ce projet vise à mieux comprendre le rôle d'une molécule capable de déclencher des crises de migraine. Cette molécule, présente dans certaines régions du cerveau et des vaisseaux sanguins, est impliquée dans l’inflammation et la sensibilisation des neurones liés à la douleur. Des études chez l’homme ont montré que l’injection de cette molécule peut déclencher des crises de migraine. Pour mieux reproduire ces conditions en laboratoire, nous utiliserons cette même molécule chez le rat afin d’étudier son impact sur le cerveau et le comportement. Grâce à des analyses biologiques et électrophysiologiques, nous comparerons les réactions des mâles et des femelles, en tenant compte des variations hormonales chez ces dernières. L’objectif est d’identifier d’éventuelles différences entre les sexes pour mieux comprendre les mécanismes de la migraine et, à terme, améliorer les traitements.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre la migraine en utilisant un modèle animal plus proche de la réalité clinique. La migraine touche plus souvent les femmes, mais les études ont surtout été menées sur des mâles, alors que des différences liées au sexe et aux hormones existent. En étudiant ces différences et le rôle des différentes zones du cerveau, nous espérons mieux comprendre cette maladie. Aujourd’hui, les traitements comme les triptans ne sont efficaces que chez environ 60 % des patients, ce qui suggère l’existence d’autres mécanismes. De récentes découvertes indiquent que le ciblage de certaines voies de la migraine pourrait être une nouvelle piste prometteuse pour développer de meilleurs traitements contre la migraine.
Procédures
Mesure de la sensibilité cutanée : les jours d’injection pendant 4h ; cette mesure se fait par l'application de filaments fins sur la peau de l'animal et par l’envoi d’un jet d’air toutes les 30 min pendant 4 h après l'injection des molécules en sous cutané (chaque application dure 3 secondes). Les jours entre les injections, la mesure se fait une fois. L'électrophysiologie (chirurgie de préparation du rat et enregistrements à proprement dit) n’est réalisée qu'une fois sur chaque rat, en fin de procédure et sous anesthésie générale profonde au 5ème jour d'injection (durée d’intervention : entre 4 à 6h, sans réveil). La chirurgie inclut une trachéotomie , une canulation de la carotide , une canulation de la jugulaire , une craniotomie , et l’exposition de la region d'enregistrement.
Impact sur les animaux
Nous utilisons un modèle de migraine qui provoque une douleur modérée de l’animal. Cette douleur est ressentie après les injections, mais n’empêche pas les mouvements de l’animal. Enfin, les stimulations mécaniques avec les filaments ou les jets d’air induisent un retrait de la face signe d’une douleur modérée. L’animal peut échapper à cette stimulation puisqu’il n’est pas en contention. Cette stimulation dure au maximum 3 secondes.
Devenir
La procédure ne permet pas de réutiliser les animaux. En effet, elle se termine par des études immunohistochimiques et électrophysiologiques : les animaux seront donc mis à mort à la fin de la procédure.
Remplacement
Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. En effet il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique simultanément.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe est fixé à un maximum de 10 pour assurer une étude fiable, en tenant compte des étapes clés comme l’habituation, les injections, les observations comportementales, les prélèvements, la préparation des échantillons et l'electrophysiologie. Les études comportementales étant un facteur limitant, nous prévoyons suffisamment d'animaux pour garantir des résultats solides pour ce modèle de migraine. Enfin, pour prendre en compte les différences entre mâles et femelles dues aux hormones, l’étude inclura les deux sexes.
Raffinement
Avant les études comportementales, les animaux sont placés dans des cages enrichies (tunnels et contacts sociaux) pendant une semaine, puis habitués au nouvel environnement pendant 5 jours pour réduire leur stress. Avant les injections, les rats sont anesthésiés, vérifié par l'absence de réflexe de retrait. La douleur est la principale nuisance identifiée, et pour les stimulations mécaniques, nous suivons les recommandations internationales pour limiter leur durée et intensité.
Choix des espèces
Le rat est couramment utilisé au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires. C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Les animaux seront âgés de 6-12 semaines pour la comparaison avec les autres données de la littérature.
Evaluation de la toxicité d’un candidat médicament après administration unique ou répétée chez le rongeur
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 1800
Le protocole suit la voie d'administration retenue par la société qui développe le candidat médicament, orale par gavage, intramusculaire, sous-cutanée ou intrapéritonéale, jusqu'à deux fois par jour pendant un mois. 3 600 souris et 1 800 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à sévère, tous tués à l'issue. La mise à mort suit un prélèvement sanguin terminal sous anesthésie profonde et permet de peser et d'examiner le cerveau, le cœur, le foie et les reins. Les effets attendus du produit vont de la prostration aux troubles digestifs et nerveux, et le porteur justifie ces essais par la nécessité de mesurer la toxicité sur un "organisme entier".
Objectifs
La société développe des médicaments pour l'homme avec différentes voies d'administration possibles et visant divers récepteurs, enzymes ou d'autres cibles. Il est important de connaître la toxicité et la distribution du candidat médicament dans le corps. Ainsi, l'objectif de ce projet est de déterminer la toxicité et l'exposition dans le temps d'un candidat médicament dans le sang et les organes dans différentes espèces animales rongeurs (rat ou souris), après un traitement unique ou répété (si répété :1 mois maximum, 2 administrations maximum par jour) par voie orale, ou par voie intramusculaire, sous-cutanée, ou intrapéritonéale. 1) L'observation clinique journalière des animaux permettra de détecter d'éventuels signes de toxicité. 2) Des analyses sanguines sur prélèvement sanguin terminal permettront de compléter le recueil d'informations. 3) L'autopsie terminale des animaux permettra un examen des organes (poids, aspects macroscopiques), leur recueil éventuel pour analyses histologiques. 4) Les mesures de taux de candidat médicament dans le sang et les organes nous donneront ainsi une bonne indication quant à l'exposition du candidat médicament dans le temps, nous aideront à relier les expositions aux effets toxicologiques. Ce projet d'utilisation des animaux s'intègre dans un projet de Recherche exploratoire plus global de ce candidat médicament au profit de la santé humaine et sera fait en complément des études in vitro.
Bénéfices attendus
L'implication des animaux dans ce projet va nous permettre d'avoir une meilleure connaissance du devenir du candidat médicament dans un organisme physiologiquement proche de l'homme sur une espèce (rat ou souris) qui sera utilisée dans toutes les études de toxicité réglementaires obligatoires avant le passage en clinique chez l'homme. Cette étude permettra 1) d'avoir une première approche de la gamme de doses sans effet toxique, de la comparer à la gamme de doses thérapeutiques efficaces et le cas échéant d'éviter d'engager un candidat médicament dans les études réglementaires de toxicité obligatoires qui sont lourdes et consommatrices d'animaux, 2) de déterminer d'éventuel(s) organe(s) cible(s) en termes de toxicité et 3) d'obtenir les expositions du candidat médicament dans le sang et les organes en fonction du temps. Ces expositions pourront être reliées aux effets pharmacologiques et toxicologiques du produit. Ce projet chez le rongeur aura un grand bénéfice dans le développement du candidat médicament car cette étude ne peut pas être substituée par des études cellulaires in vitro qui ne miment pas assez finement la complexité et la dynamique d'un modèle entier vivant et sa physiologie.
Procédures
Contention et administration du produit par voie orale (gavage) ou par injection intramusculaire, sous-cutanée, ou intrapéritonéale, l'ensemble durant moins de 30 secondes à chaque administration et ce pour l'administration aigue et pour l'administration répétée pendant 1 mois maximum (au maximum deux fois par jour). Anesthésie générale profonde pour prélèvement terminal sanguin suivi de la mise à mort de l'animal avant de réaliser des prélèvements d'organes.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont celles liées à la contention de l'animal, l'administration du produit à tester (gavage, injection), à l’anesthésie avant les prélèvements sanguins terminaux pouvant conduire à un stress de l’animal ainsi que les effets indésirables éventuels du produit. Les effets indésirables liés au produit pourront être de l'ordre : prostration, hyperlocomotion, ou hypolocomotion, des comportements anormaux induits, des troubles digestifs ), des troubles du système nerveux central, des perturbations du métabolisme.
Devenir
Chaque animal sera anesthésié pour prélèvement terminal sanguin pour analyses, avant une mise à mort suivie de prélèvements terminaux d'organes (cerveaux, coeur, foie, reins...) pour analyses.
Remplacement
L'utilisation d'animaux pour des évaluations de toxicité et de toxicocinétique d'un candidat médicament est justifiée par la nécessité de pouvoir déterminer les effets de la molécule à tester sur un organisme entier, reflétant physiologiquement l'humain. La complexité et la dynamique de l'organisme et des interactions organes-médicament ne nous permettent pas de se limiter aux seuls modèles in vitro ou ex-vivo car ils ne représentent pas assez finement l'ensemble des mécanismes physiologiques. Toutefois, les candidats médicaments qui seront testés auront déjà passé une série de tests en phases précliniques précoces (in vitro) et qui permettent d'identifier les molécules les plus sélectives pour nos récepteurs d'intérêt et sans effets sur des cibles non désirées (cardiaque par exemple).
Réduction
Pour les prélèvements destinés aux analyses toxicocinétiques, le nombre d'animaux par temps selon nos données historiques est au maximum de 5 individus afin d'avoir une fiabilité de résultat en tenant compte de la variabilité inter-individus. Pour les prélèvements destinés aux analyses de biochimie et de numération-formule sanguine, le nombre d'animaux par temps selon nos données historiques est au maximum de 10 individus afin d'avoir une fiabilité de résultat en tenant compte de la variabilité inter-individus et permettre une analyse statistique. Chaque animal sera analysé sur l'ensemble des paramètres à son temps de sacrifice avec mesures des taux du candidat médicament dans le sang et dans d’autres organes (par exemple cerveau, coeur, foie, rein...), détermination de la numération-formule sanguine, mesures des paramètres de biochimie sanguine, observation macroscopique et pesée d'organes clefs en termes de toxicologie comme le coeur, le foie, les reins... et leur conservation le cas échéant pour analyse histologique.
Raffinement
Afin de réduire le stress, les animaux seront hébergés en animalerie et acclimatés au minimum 5 jours avant toute expérimentation pour s'habituer au nouvel environnement (contrôlé en continue). Pour le bien-être de l'animal et lui éviter un stress, chaque cage dispose d'un bloc de lanières de papier pour la nidation et d'un enrichissement (igloo ou tunnel), et ce, dès leur arrivée au laboratoire. Tout mal être identifié aboutira à une surveillance accrue de l'animal et à des soins si besoin (exemple : désinfection d'une plaie). Le personnel zootechnicien est sensibilisé pour remonter tout comportement suspect d'un animal anxieux soit durant le temps d'acclimatation, soit le jour même de l'expérimentation au moment de sa manipulation. Les groupes sociaux resteront ceux formés depuis l'arrivage jusqu'à la fin de l'étude. Les animaux disposeront de nourriture et eau de boisson à volonté sous surveillance quotidienne. Les traitements (oraux, injections...) se feront par du personnel formé avec du matériel adéquat pour chaque espèce rongeur. La méthode de mise à mort avec initialement un grand prélèvement terminal sanguin sera préalablement précédée d'une anesthésie gazeuse de l'animal. Le contrôle de l'anesthésie se fera par un contrôle du réflexe de retrait de la patte et en s'assurant d'une respiration abdominale. Les animaux feront l'objet d'une surveillance accrue pendant l'expérimentation. Si les points-limites préalablement établis sont atteints, l'animal sera euthanasié de façon anticipée afin de lui éviter toute souffrance.
Choix des espèces
Le rat et la souris sont des espèces relativement proches de l'homme, les données obtenues seront pertinentes afin d'extrapoler les résultats. Ces espèces sont utilisées dans les études de toxicité/toxicocinétique réglementaires obligatoires avant de passer un candidat médicament en phase clinique chez l’homme. Ces espèces sont 2 espèces de petite taille pour lesquelles il est possible d’avoir des effectifs assurant une robustesse dans les résultats et limitant les quantités nécessaires en produit administré. Le choix de l'espèce entre la souris et le rat va s'orienter selon : 1/le type de candidat médicament, 2/ les organes d'intérêt (exemple : le rat ne présente pas de vésicule biliaire par rapport à la souris) et 3/ du profil métabolique de l'espèce rongeur comparé au profil métabolique humain déterminé au préalable par des tests comparatifs in vitro. Les animaux seront utilisés au stade adulte : cela permettra de refléter un organisme mature et métaboliquement développé (en particulier au niveau du foie).
Altération de la signalisation mitochondriale du NO et insuffisance cardiaque avec fraction d’éjection préservée.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Pour comprendre pourquoi le cœur diabétique répond mal à l'effort, 90 rats reçoivent pendant six semaines une eau de boisson additionnée d'un composé hypertenseur et une alimentation riche en graisses, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils courent ensuite vingt minutes sur un tapis motorisé, subissent une échocardiographie sous anesthésie pendant laquelle une molécule leur impose un stress cardiaque pouvant déclencher des arythmies, puis un test de tolérance au glucose de deux heures après mise à jeun. Tous sont tués pour prélever leur cœur et en isoler cardiomyocytes et mitochondries. Une grille de score remplie chaque jour tranche, selon un arbre de décision, entre l'administration d'un analgésique et la mise à mort de l'animal.
Objectifs
La réponse combat-fuite, ou fight or flight response, est une réaction permettant à notre organisme de faire face à une situation de danger. Au niveau cardiaque, cela se traduit par une augmentation de la fréquence et de la force de contraction des cellules du cœur. Il est bien établi que cette capacité d’adaptation du cœur à un stress est altérée dans le cadre de la maladie cardiaque associée au diabète de type 2 (DT2) et plus particulièrement dans la cardiopathie diabétique, caractérisée d'insuffisance cardiaque à fraction d'éjection préservée (HFpEF). Cette altération pourrait contribuer à expliquer l’intolérance à l’effort, les arythmies cardiaques et, potentiellement, le risque accru de mortalité en situation de stress chez les patients atteints d'insuffisance cardiaque diabétique. L’objectif de ce travail est de mieux comprendre le rôle de l’altération de la fonction mitochondriale — organite clé dans la production d’énergie du cœur — dans la réponse défaillante du cœur diabétique à un stress. Ce projet se concentrera plus particulièrement sur le rôle d’une petite molécule, le monoxyde d’azote (NO), dans la modulation de la réponse des mitochondries cardiaques face à une situation de stress.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre de mieux comprendre le rôle de cette petite molécule, le monoxyde d’azote (NO), au niveau des centrales énergétiques des cellules du cœur, les mitochondries, dans une pathologie cardiaque encore mal comprise et pour laquelle il n’existe à ce jour aucun traitement efficace : l’insuffisance cardiaque à fraction d’éjection préservée (HFpEF). Le développement récent de molécules capables de libérer du NO spécifiquement au niveau des mitochondries pourrait ainsi constituer une nouvelle piste thérapeutique prometteuse.
Procédures
Les animaux seront traités quotidiennement pendant six semaines avec avec un composé induisant de l'hypertension (dilué dans l’eau de boisson) et nourris avec un régime riche en graisses. L’association de ces deux traitements induira le développement d’une hypertension artérielle et de troubles métaboliques similaires à ceux observés dans le diabète de type 2. Les animaux seront ensuite soumis à différents évaluations pouvant générer des stress. Un test de course sur tapis motorisé d'une durée d'environ 20 minutes, une échocardiographie de stress sous anesthésie (environ 15 minutes) et enfin une mesure de la glycémie à jeun suivie d'un test de tolérance au glucose à partir de microprélèvements de sang au niveau de la veine de la queue (2h00).
Impact sur les animaux
Le traitement mélangeant régime gras (régime HFD pour high fat diet), afin d'induire des troubles métaboliques, et traitement avec un composé induisant de l'hypertension peut avoir des conséquences sur l’état de bien-être des animaux. Les animaux seront donc surveillés par un personnel habilité et formé pour ce type de procédure expérimentale. Une grille d'évaluation de la souffrance sera utilisée par le personnel qualifié. En cas de souffrance excessive, les animaux seront traités (antalgie ou euthanasie en cas de souffrance trop importante). Le traitement aigu avec un composé permettant de mimer un stress adrénergique, administré lors de l’échocardiographie, peut également affecter le bien-être des animaux. En effet, cette molécule va induire une situation de stress cardiaque (augmentation de la force et de la fréquence de contraction du coeur) pouvant être associé à des arythmies cardiaques. Les animaux seront donc étroitement surveillés et leur rythme cardiaque sera surveillé le temps de l'expérimentation. Un suivi particulier sera réalisé dans les heures suivant le stress, par un personnel formé et qualifié pour ce type d’interventions. Certains animaux seront soumis à un test d'effort sur tapis de course motorisé. Cette procédure peut être stressante pour les animaux mais afin de réduire le stress, une procédure d'habituation à la course ainsi qu'à l'environnement particulier du tapis de course sera mise en place lors des quelques jours précédant les tests. La mise à jeun des animaux pour la mesure de la glycémie se fera pendant la phase diurne (période pendant laquelle les animaux mangent peu) afin de réduire le stress. Le microprélèvement de sang au niveau de la veine caudale sera précédé d'une anesthésie locale de la zone de prélèvement avec un anesthésique en crème. Les autres expérimentations seront réalisées sur des organes, des cellules et des mitochondries isolées, nécessitant l’euthanasie des animaux avant le prélèvement des tissus.
Devenir
A la fin des procédures, les animaux seront euthanasiés afin de permettre le prélèvement du coeur et ainsi permettre l'isolement primaire de cardiomyocytes, de mitochondries ou des analyses biochimiques.
Remplacement
Il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle de substitution in vitro pour évaluer l’impact du stress métabolique (régime riche en graisse) et hypertensif (inhibition de la synthèse du NO) sur le remodelage pathologique du coeur. Par ailleurs, l’utilisation d’animaux permet d'étudier des mécanismes cellulaires qui ne peuvent être analysés chez le patient. Par conséquent l'utilisation de modèles animaux apparait comme indispensable à la réalisation de ce protocole.
Réduction
Un grand nombre d'expérimentations sera réalisé sur des cœurs, des cellules ou des mitochondries isolées. Cette approche permet, en contrôlant un grand nombre de paramètres et ainsi en réduisant la variablité d'une expérience à l'autre, de limiter le nombre d'animaux utilisés. De plus, la taille du cœur du rat permet de collecter une grande quantité de matériel biologique et permettra, à partir d'un même coeur de réaliser différentes évaluations (biochimie, immuno-précipitation, protéomique). Le nombre d'animaux utilisé par groupe a été préalablement determiné à l'aide d'un logiciel de statistique.
Raffinement
Les animaux sont stabulés une semaine après leur arrivée, avant toute procédure, afin de s’acclimater à leurs conditions d’hébergement. Afin de permettre la formation de groupes sociaux, les rats sont hébergés en cages de 3 individus avec un enrichissement du milieu (tubes, coton, bâtons à ronger). La nourriture est standard ad libitum et un accès à de l’eau fraiche. La température et l’hygrométrie sont contrôlées. Les animaux sont visités quotidiennement par un animalier formé qui contrôle le bien-être des animaux à l’aide d’une fiche intégrant les différents point limites. Ainsi, en se basant sur cette grille, un score sera attributé à chaque animal afin d'évaluer son état de bien être ou de souffrance. Les résultats de cette observation permettront, en se basant sur un arbre décisionnel, d'opter, si necessaire, soit pour une stratégie d'analgésie soit pour la mise de la mort de l'animal. Lors des différentes expérimentations (test de course, echocardiographie de stress, mesure du glucose sanguin) des mesures sont prises pour limiter le stress et la souffrance des animaux. Ainsi, les animaux seront préalablement familiarisé à l'environnement du tapis de course pendant 3 jours avant le test de course. L'échocardiographie de stress sera réalisée sous anesthésie et les animaux seront surveillés par enregistrement de leurs rythmes cardiaque et respiratoire ainsi que de leur température corporelle. Enfin, le microprélèvement de sang à la queue des animaux sera réalisé après anesthésie locale de la zone de prélèvement.
Choix des espèces
Le rat est un modèle de choix car la physiologie cardiaque des rongeurs présente de grandes similitudes avec celle de l’homme. Le modèle rongeur a l’avantage de permettre des investigations depuis l’étage cellulaire et moléculaire jusqu’aux mesures in vivo. L’utilisation des même tissus (coeur) ex vivo puis pour des analyses biochimiques permet de réduire le nombre d’animaux utilisés au cours du protocole expérimental. Les animaux seront utilisés à un stade jeune adulte (rats de 12-15 semaines) afin de pouvoir travailler sur un système cardiovasculaire mature et sans facteurs de complications
Etudes des méthodes de contentions, des voies d’administration et de prélèvements chez différentes espèces (souris, rat, lapin), ainsi que des fonctions physiologiques et de leur régulation pharmacologique chez le rat
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
Rats : 940
Lapins : 20
Achetés comme animaux "de réforme", 940 rats, 260 souris et 20 lapins vont être utilisés dans des travaux pratiques de premier cycle universitaire, devant jusqu'à 52 étudiants par promotion. Les gestes appris, classés en souffrance légère, se font une fois par animal : contention, piqûre, voies d'administration, prélèvements de très petits volumes. Les souris et les lapins sont réutilisés d'une séance à l'autre et les souris surnuméraires transférées à la faculté des sciences, tandis que les 940 rats, cathétérisés sous anesthésie générale pour mesurer pression artérielle, diurèse et glycémie, ne se réveillent jamais. Sur le remplacement, le porteur ne cite aucune alternative aux animaux et indique seulement que chaque séance est précédée d'un cours illustré de photos et de vidéos.
Objectifs
Le Bachelor Universitaire de technologie (BUT) est une formation technologique préparant des étudiants aux différentes missions du technicien. Les étudiants du parcours Biologie médicale et Biotechnologies (BMB) doivent acquérir des notions d’expérimentation animale qu’ils seront éventuellement amenés à mettre en oeuvre au cours de leur vie professionnelle. Au cours de la 1ère année, les différentes séances de TP réalisées in vivo leur permettent de se familiariser à l’étude des fonctions physiologiques en manipulant directement des animaux, en acquérant et analysant les données obtenues au cours des TPs. Cela concerne au maximum 52 étudiants en parcours Biologie Médicale et Biotechnologies (BMB). Au cours de la 2ème année, les étudiants sont sensibilisés aux régulations de ces fonctions par des agents pharmacologiques (notions d’agonistes, antagonistes, courbes effet-dose). Cela concerne au maximum 52 étudiants du parcours BMB. Les étudiants inscrits dans la formation leur permettant d'acquérir la compétence "Application des procédures en expérimentation animale sur les rongeurs et lagomorphes" suivent des séances supplémentaires de TPs sur la souris et le lapin, les étudiants adapteront les gestes appris sur le rat sur des animaux de plus petite et de plus grande taille. Ils apprendront aussi d’autres modes de contention, de prélèvement ou d’administration, toutes ces méthodes variant avec l’espèce considérée.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont que les étudiants acquièrent une première initiation en expérimentation animale avec la gestion et la surveillance d'un animal sous anesthésie, l'apprentissage de la pose de cathéters, l'acquisition d'un paramètre physiologique ainsi que sa modulation hormonale ou pharmacologique. Ainsi les étudiants sont à même d'acquérir des résultats pour ensuite les analyser et en faire la synthèse par des compte-rendus ou des présentations orales. Nous avons mis en place lae formation "Application des procédures expériementales chez les rongeurs et les lagomorphes" dans le parcours BMB depuis 2020, nous avons vu un nombre croissant d'étudiants intéressés par cette formation.
Procédures
Des prélèvements/administrations seront effectués sur les différentes espèces animales, rat, souris et lapin, une seule fois et pour de très petits volumes. L'étude de la pression artérielle, de la diurèse et de la glycémie se font sous anesthésie générale et conduiront à des procédures sans réveil.
Impact sur les animaux
Les animaux utilisés dans la Formation "Application des procédures en expérimentation" vont permettre l'apprentissage des différents gestes non invasifs (contention, piqûre) et repartiront à la fin de la séance en hébergement pour être réutilisés et seront surveillés afin de voir s'il n'y a pas eu d'imapact délétère (inflammation au niveau de la zone de piqûre) . Pour les procédures sans réveil, les animaux seront mis à mort à la fin de la séance.
Devenir
Les animaux, rats, souris, lapins utilisés pour la formation à l'Expérimentation animale 3application des procédures expérimentales" sont réutilisés dans d'autres séances de travaux pratiques réalisés à l'IUT (souris et lapins). Les animaux restants (souris) surnuméraires sont proposées à la Faculté des Sciences. Pour les rats utilisés dans l'étude des fonctions physiologiques, des gestes invasifs sont réalisés chez ces animaux obligeant à des procédures sans réveil.
Remplacement
Les séances de travaux pratiques font toujours l'objet d'une présentation en travaux dirigés ou en cours pour en expliquer le contenu et le but. Les différentes manipulations sont détaillées avec des photos pour illustrer ou des vidéos. Toutes les séances de TP sont encadrées par 2 enseignantes et 2 techniciennnes ayant les compétences en conception ou en application des procédures expérimentales.
Réduction
Réduction du nombre d’animaux : les animaux utilisés dans le cadre de la Formation "Application des procédures expérimentales" sont réutilisés dans les autres séances de travaux pratiques pour l'étude des fonctions physiologiques. Les étudiants travaillent par binôme pour réduire le nombre d'animaux.
Raffinement
Les animaux arrivent à l'animalerie une semaine avant le début des séances de travaux pratiques afin qu'ils bénéficient d'une période d'acclimatation à leurs nouveaux locaux d'hébergement. Les animaux sont hébergés dans des conditions de température, d'hygrométrie et de lumière adaptées. Ils disposent d'objets d'enrichissement dans leurs cages et sont observés quotidiennement. Les manipulations se font dans une salle de TP séparée de leur lieu de stabulation. Nous n'utilisons que des rat et souris de réforme pour les travaux pratiques.
Choix des espèces
Les rongeurs sont très utilisés en expérimentation animale et se prêtent à ce type de manipulations. Ce sont des animaux dociles, faciles à appréhender pour les étudiants et de taille adaptée à la préhension et à la contention. Les souris sont très utilisées en recherche biomédicale, du fait de leur taille et d’une excellente connaissance de leur génome. Le rat possède une taille adéquate pour la cathétérisation des vaisseaux sans utiliser des loupes binoculaires. C’est un animal résistant avec une physiologie proche de celle de l’homme permettant l’étude des grandes fonctions physiologiques. Il est très utilisé en recherche fondamentale et dans les essais pharmacologiques et toxicologiques. Le lapin est un animal docile, utilisé également en recherches fondamentale et appliquée. En le manipulant, les étudiants découvrent d’autres méthodes de préhension et de contention (utilisation d’une boîte de contention) et l’apprentissage de prélèvements sanguins non invasifs. Rats adultes, animaux de réforme de poids variable en fonction des disponibilités du fournisseur (> ou = à 350 grammes) Souris adultes, animaux de réforme de poids variable en fonction des disponibilités du fournisseur (entre 25 et 35 grammes) Lapins adultes (entre 2 et 2,2 kg)
Utilisation de la lumière multispectrale et hyperspectrale pour l’identification non invasive des glandes parathyroïdes chez le rat
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
60 rats vont être opérés sous anesthésie générale et tués avant tout réveil. L'intervention dure environ trente minutes, le temps d'exposer les glandes parathyroïdes du cou, de les éclairer avec différentes longueurs d'onde et de les prélever, avant l'injection létale. L'objectif est de repérer les couleurs de lumière qui distinguent ces glandes de la graisse voisine, pour éviter de les retirer par erreur au cours des thyroïdectomies humaines, complication qui touche 15 à 25 % des patients. Le porteur indique que des études existent sur des glandes déjà prélevées, mais que les bandes lumineuses cherchées ne s'évaluent que sur une glande vascularisée, donc sur un animal dont le cœur bat encore.
Objectifs
L’hypoparathyroïdie est une complication fréquente après l’ablation de la thyroïde, touchant 15 à 25 % des patients, et pouvant causer de graves problèmes rénaux, cardiaques et psychiatriques. Elle résulte principalement d’une ablation accidentelle des glandes parathyroïdes ou de la lésion de leurs vaisseaux, en raison de leur petite taille et de leur ressemblance avec la graisse environnante. Prévenir cette complication repose actuellement sur une meilleure identification de ces glandes lors de l’intervention chirurgicale. Des recherches récentes s’intéressent à l’utilisation de lumières spécifiques, adaptées à chaque chirurgie, pour améliorer la visibilité des parathyroïdes et de leurs vaisseaux. Cette méthode exploite les différences d’interaction de la lumière avec les tissus, dues à leur composition chimique. L’étude des propriétés fluorescentes des parathyroïdes chez le rat, très similaires à celles de l’homme, permet de développer cette technique innovante. Ce projet est mené par une équipe spécialisée en chirurgie thyroïdienne. À ce jour, l’identification directe des parathyroïdes reste la seule méthode efficace pour limiter le risque d’hypoparathyroïdie. L’optimisation de la visualisation peropératoire représente donc une avancée majeure dans la prévention de cette complication.
Bénéfices attendus
Cette étude sur le modèle rat permettra d’identifier des spectres d’intérêt permettant de distinguer les parathyroïdes des tissus avoisinants ainsi que les vaisseaux assurant leur vascularisation. Elle fournira de nouvelles pistes d’exploration en utilisant notamment des systèmes d’imageries différents sur des bandes spectrales identifiées dans l’étude. Les bénéfices attendus du projet sont de mieux comprendre le comportement lumineux de la glande parathyroïde et de ses vaisseaux afin de préserver sa fonction et ainsi diminuer le taux d’hypoparathyroïdie post-opératoire tout en utilisant des systèmes d’imagerie déjà à notre disposition. Cela permettra à moyen terme de réaliser une étude clinique afin d’établir de nouvelles pistes d’identification et de préservation des glandes parathyroïdes lors des thyroïdectomies.
Procédures
Une procédure chirurgicale sous anesthésie générale d’environ 30min. 2 injections seront réalisées avant l’intervention l’anesthésiant et l’analgésiant. En fin d’intervention les parathyroïdes seront prélevées avant la mise à mort.
Impact sur les animaux
Il est possible que les contentions et manipulations le jour de l’intervention engendrent un stress. Une douleur per opératoire est susceptible d’être ressentie en cas d’insuffisance analgésique L’injection intra-péritonéale de la « substance lumineuse peut induire un inconfort dû à l’injection.
Devenir
La mise à mort des rats se fait par injection létale IV. L’animal sera toujours sous anesthésie lors de ce geste.
Remplacement
Bien qu’il existe des études ex-vivo afin d’identifier des fluorophores présents dans la glande parathyroïde les bandes d’intérêt ne peuvent être évaluées que sur une glande vascularisée. En effet il existe des différences déjà connues d’émission entre des glandes bien vascularisées et non vascularisées. Ces différences imposent de réaliser l’étude sur des glandes vascularisées d’animaux conservant leur fonction cardiaque.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés par groupe est défini comme le nombre minimum nécessaire afin de mettre en évidence une différence significative entre les deux groupes. Compte tenu de la difficulté à évaluer ce nombre, étant donné le caractère novateur de cette étude, nous utiliserons le minimum de rat pour mettre en évidence une différence significative. Une phase de mise au point lumineuse a été faite en amont des expérimentations in vivo. Une étape préliminaire , sur animaux mis à mort au préalable, a été réalisé avant le début du projet afin de surmonter les difficultés techniques possibles (microchirurgie, conditions nécessaires à l’interprétation des images obtenus).
Raffinement
Lors de l’hébergement d’au moins une semaine dans le respect des conditions réglementaires, des manipulations quotidiennes de création de contact permettront d’habituer les animaux et de diminuer le stress lors de la procédure. La procédure sera réalisée intégralement sous anesthésie générale. L’intervention sera réalisée sur des tapis chauffants et prise en charge de la douleur adaptée par analgésique. Il sera également réalisé un contrôle visuel constant de vitalité et d’absence de réveil ou de souffrance pendant l’intervention. Des gouttes d’anesthésiques locales seront instillées avant la réalisation des prélèvements des glandes parathyroïdes afin d’éviter toute douleur. En cas de signes de souffrance pendant l’intervention une mise à mort (dans les mêmes conditions qu’en fin de procédure) sera immédiatement réalisée. Les injections de la substance lumineuse et du produit euthanasiant seront injectés directement en intraveineuse sur le site de la chirurgie ce qui est plus rapide et moins douloureux qu’une injection intrapéritonéale.
Choix des espèces
Pour notre étude, nous avons choisi d'utiliser le rat Wistar. C'est l'animal le plus couramment utilisé pour les recherches sur la chirurgie thyroïdienne, car il offre une base de connaissance déjà bien établie. Grâce à des méthodes d’exposition bien connues, on peut accéder facilement aux glandes parathyroïdes sans complications techniques supplémentaires. De plus, l'absence de graisse dans la région du cou des rats Wistar facilite l'observation directe de ces glandes et la capture d’image. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte soit à partir de 6 semaines. Ce stade de développement permet de réaliser les expérimentations sur des animaux avec des thyroïdes suffisamment volumineuse.
Toxicité cardiopulmonaire des microplastiques inhalés
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Rats : 220
Les poumons de chaque animal reçoivent des microplastiques trois fois par semaine, par un air pollué respiré pendant 25 minutes ou par instillation directe dans la trachée sous anesthésie. 220 souris et 220 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour l'examen histologique du cœur et des poumons, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. S'y ajoutent des tests d'effort sur tapis roulant, des mesures de fonction respiratoire sur animal éveillé et des échocardiographies sous anesthésie, quinze minutes chacune. Pour ces 440 animaux classés au niveau de souffrance le plus élevé, les atteintes attendues tiennent en une phrase, une difficulté respiratoire, une baisse d'activité physique et parfois une perte de poids.
Objectifs
La pollution de l’air s’intensifie et représente un risque croissant pour la santé. Parmi les polluants atmosphériques, les particules fines et les microplastiques suscitent des inquiétudes, car ils peuvent pénétrer profondément dans les poumons, perturber les défenses immunitaires et favoriser des maladies respiratoires comme la bronchopneumopathie chronique obstructive et l’asthme. En France, on inhale chaque jour 30 000 particules de microplastique, et dans le monde, ce chiffre peut atteindre 2,8 millions de particules par jour en Chine. Au-delà des poumons, ces particules peuvent passer dans la circulation sanguine et atteindre d’autres organes, avec des effets potentiels sur le système cardiovasculaire. L'impact des particules fines d'origine microplastique que l'organisme ne peut pas éliminer reste encore mal compris. Leur présence dans les tissus pulmonaires et lymphatiques suggère un risque de dissémination et de toxicité à long terme. Pour mieux comprendre comment ces particules de microplastique se disséminent dans l’organisme et comment elles impactent la fonction de certains organes comme les poumons, le cœur ou les vaisseaux sanguins, nous avons développé un modèle d’exposition aux microplastiques chez le rat et la souris qui imite cette exposition environnementale.
Bénéfices attendus
Ce travail vise à mieux comprendre des mécanismes de toxicité des particules fines de microplastiques sur les poumons et le coeur, en mettant l’accent sur les processus inflammatoires impliqués. L’analyse de ces interactions complexes permettra d’identifier les facteurs responsables des altérations observées après une exposition aux particules fines d’origine microplastique. Les résultats de ce modèle seront mis en perspective avec des données obtenues sur des biopsies pulmonaires de patients atteints de bronchopneumopathie chronique obstructive. Ces avancées pourraient contribuer au développement de nouvelles stratégies de prévention et d’amélioration de la prise en charge des maladies pulmonaires chroniques associées à cette pollution environnementale émergente.
Procédures
Les poumons des animaux seront soumis 3 fois par semaines à des microplastiques de petites tailles administrés soit par de l'air polué pendant 25 minutes sur animal vigile soit par instillation directe via la trachée sous anesthésie (5 minutes). Certains animaux subiront des explorations du coeur et des poumons soit sur animal éveillé pour de la fonction respiratoire (15 minutes par animal) et le test d’effort sur un tapis rouilant (15 minutes par animal) soit sous anesthésie l'échocardiographie (environ 15 minutes par animal).
Impact sur les animaux
Certains animaux pourraient présenter des symptômes tels que la difficulté respiratoire, une réduction de l'activité physique et, dans certains cas, une perte de poids.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure pour permettre des prélèvements d'organes. L'objectif principal de cette euthanasie est de réaliser une exploration histologique approfondie, mettant particulièrement l'accent sur des organes tels que le cœur et les poumons. Ce processus est essentiel pour une compréhension détaillée des éventuelles altérations histopathologiques et pour valider les atteintes pulmonaires et cardiaques.
Remplacement
Il n'existe actuellement aucun modèle in vitro capable de reproduire fidèlement ces conditions physiopathologiques. Les expériences sur les rongeurs demeurent indispensables pour mener des explorations in vivo et, surtout, ex vivo. Cette approche est essentielle pour mieux comprendre les mécanismes inflammatoires induits par une exposition aux microplastiques. Ces expérimentations, difficiles à réaliser chez l'homme, ne peuvent être remplacées par des modèles cellulaires, qui ne permettent pas de recréer des conditions comparables à celles observées chez l'humain.
Réduction
"Nous avons optimisé l'utilisation des animaux en adoptant une approche rationnelle et rigoureuse dans la conception des protocoles. Ainsi, les analyses hémodynamiques et biologiques sont réalisées sur un même animal, ce qui réduit le nombre de rongeurs nécessaires tout en optimisant l'interprétation des résultats. Afin de limiter davantage le nombre d'animaux et d'augmenter la puissance statistique, un maximum de paramètres sera mesuré sur chacun d'eux. Le nombre d’animaux inclus dans ce projet a été déterminé à l’aide d’outils statistiques afin de garantir des résultats robustes et significatifs.
Raffinement
Notre objectif est de réduire au strict minimum la détresse imposée aux animaux. Les rats et souris seront hébergés de manière appropriée, avec un enrichissement du milieu permettant de répondre à leurs besoins physiques et comportementaux. Les animaux seront surveillés de près et les points limites établis seront appliqués. Nous évaluerons les critères de souffrance animale (rythme cardio-respiratoire, reprise de mouvement, état de prostration, hydratation) ; en cas de détresse anormale, les animaux seront euthanasiés. Chaque jour, les animaux sont contrôlés par un zootechnicien formé lors de sa visite de zone.
Choix des espèces
Les modèles de souris (Mus musculus) et de rat Wistar sont largement utilisés et bien caractérisés sur le plan cardiovasculaire. Leur physiologie cardiaque présente de grandes similitudes avec celle de l’Homme, tant au niveau des régulations que de la structure morpho-fonctionnelle, permettant une exploration approfondie des mécanismes impliqués, de l’échelle moléculaire aux mesures in vivo. L’utilisation des deux espèces se justifie par les contraintes actuelles de l’appareil d'exposition par nébulisation (aérosol) des particules fines d’origine microplastique, actuellement adapté aux souris mais non encore aux rats. Des ajustements sont toutefois en cours afin d’étendre son utilisation aux rats, optimisant ainsi l’approche expérimentale tout en minimisant un potentiel stress sur les rongeurs. Les études sont réalisées sur des animaux adultes mâles et femelles âgés de 7 à 8 semaines. Nous utilisons le stade adulte car nous souhaitons étudier les effets extra-pulmonaires, notamment cardiovasculaires, dont le système est pleinement mature chez les rongeurs à l’âge adulte. Nous voulons également éviter les biais liés à la croissanceou au vieillisement, afin d’obtenir des résultats comparables aux autres études environnementales publiées, qui utilisent majoritairement des animaux adultes.
Effets de différentes matrices laitières sur l’intégrité de la barrière épithéliale intestinale après un stress de séparation maternelle.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Comparer l'effet de plusieurs matrices laitières fermentées sur la barrière intestinale suppose ici de séparer des ratons de leur mère trois heures par jour, à heure fixe, pendant quinze jours. 495 rats vont être utilisés, mères et petits, tous tués à l'issue pour prélever l'intestin, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les ratons reçoivent en plus un gavage quotidien pendant dix jours, geste dont le porteur reconnaît qu'il peut irriter le tube digestif, et la séparation maternelle peut leur faire perdre du poids. Le porteur indique que ce modèle a déjà été conduit avec le même partenaire industriel et que les produits fermentés font l'objet d'une "attention sociétale" pour leurs propriétés bénéfiques.
Objectifs
Le syndrome de l’intestin irritable est une maladie intestinale chronique impliquant des facteurs génétiques, environnementaux, nutritionnels. Chez les patients souffrant de ce syndrome sont observés des altérations de la barrière intestinale, une faible inflammation et des modifications de la flore bactérienne intestinale. Un stress psychologique chronique précoce comme le stress de séparation maternel induit des modifications de la fonction barrière de l’intestin durables et il est reconnu comme un important facteur de risque impliqué dans l’initiation et l’aggravation de symptômes du syndrome de l’intestin irritable. Des matrices laitières fermentées à base de lait de vache peuvent fournir un large nombre de peptides à action biologique bénéfique dans le tractus gastro-intestinal. Certains peptides peuvent agir sur les cellules productrices de mucus jouant un rôle crucial dans la protection de la barrière intestinale. De manière intéressante, il a été montré qu’un peptide à action bénéfique issu d’une matrice laitière fermentée était capable d’interagir avec les cellules intestinales en préservant l’équilibre intestinal et par conséquent de prévenir des effets néfastes dans un modèle expérimental de stress précoce. L’objectif de ce projet de recherche est d’évaluer et comparer les effets d’une consommation orale chronique de différentes matrices laitières fermentées (à base de lait de vache) contenant ce peptide et issues de technologie différentes, chez des jeunes rongeurs sur l’altération de la barrière intestinale ex-vivo induite par le stress de séparation maternel. Cette étude pré-clinique permettrait à terme d’identifier des matrices capables de réduire les perturbations intestinales et de proposer des solutions thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Les produits fermentés font l objet d'une attention sociétale du fait des propriétés bénéfiques pour la santé humaine. Leurs bénéfices potentiels pour la santé reposent sur l'apport des micro-organismes qui atteignent vivants l'intestin ou par l 'apport de métabolites spécifiques issus de l'activité des ces micro-organismes. Ce projet doit permettre d’identifier des matrices laitières intéressantes dans protection de la barrière intestinale dans un modèle de fragilisation de celle-ci qui reproduit les mêmes caractéristiques que le syndrome de l’intestin irritable . Ces travaux visent à développer des traitements préventifs et thérapeutiques pour ce syndrome.
Procédures
Les animaux recevront par voie orale, des matrices laitières ou du sérum physiologique à une fréquence de 1 fois par jour pendant 10 jours. Les gestes de l’administration orale sont de courte durée, (approximativement 30 sec) effectués par l’agent expérimenté en charge de ces études. Les ratons seront soumis au stress de séparation maternelle trois heures par jour sur une période de 15 jours à heure fixe le matin (9h-12h) puis replacés par portée avec leur mère respective.
Impact sur les animaux
Des nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux peuvent être : une mobilité réduite liée à la préhension pour le gavage, geste d’une durée inférieur à 1 minute ainsi qu’une douleur ou irritation du tube digestif d’administration. Le stress de séparation maternelle d’une durée de trois heures pendant quinze jours pourrait engendrer une perte de poids des ratons.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés afin d’effectuer des prélèvements de tissus post-mortem pour différentes analyses et dosages.
Remplacement
Le Syndrome de l 'intestin irritable est une pathologie dont l'origine est méconnue et dont la physiopathologie est complexe (ex. dysfonctionnement de l’axe intestin-cerveau, augmentation de la perméabilité intestinale, altération de la flore intestinale etc..), par conséquent, il n’est pas possible de reproduire cette pathologie en recherche pré-clinique sur un modèle in vitro. Ainsi dans l’objectif de tester des traitements en l’occurrence des matrices laitières sur les paramètres le plus caractéristiques pour cette pathologie comme l’altération de la barrière intestinale, le modèle animal semble l’approche la plus appropriée pour l’obtention de résultats transposables à l’homme.
Réduction
L’amélioration de la performance pour le bien-être animal acquise par les études précédentes a abouti à une réduction de la mortalité chez les ratons et permet l'utilisation du nombre d’animaux utilisés au plus juste. Le nombre calculé nécessaire, basé sur des études antérieures en prenant compte la variabilité inter-individuelle est de 10 animaux par groupe pour cette étude. Il a été calculé à l'aide de tests statistiques adaptés.
Raffinement
Pour assurer une fiabilité des résultats et limiter le nombre d’animaux utilisés, une attention particulière sera accordée au bien-être de l’animal (contrôle de l’environnement, respect du cycle jour nuit). A leur arrivée les animaux seront hébergés individuellement au calme et surveillés pendant une période d’acclimatation (7 jours). L’acclimatation permet de récupérer du stress lié au transport et de s’adapter aux nouvelles conditions de vie. Ce n’est qu’à l’issue de cette période que les animaux seront inclus dans l’étude. Dans le but d’améliorer le bien-être de ces animaux captifs, des bûchettes en peuplier et des nids de cellulose seront disposés dans chaque cage. Une surveillance quotidienne des animaux sera effectuée pour détecter à temps toute anomalie et minimiser la durée de toute souffrance constatée. Toute souffrance, toute détresse ou tout inconfort réels ou potentiels des animaux seront minimisés ou soulagés par le choix de points limites les plus précoces et compatibles avec notre objectif scientifique recherche.
Choix des espèces
La souche de rat utilisée présente une bonne analogie physiologique intestinale et pharmacologique avec celle de l’homme et est utilisé pour étudier les mécanismes impliqués dans le Syndrôme de l 'intestin irritable. Nous utiliserons cette espèce qui a fait l’objet d’études précédentes menées dans notre équipe (soumises à autorisation de projet) avec ce partenaire industriel et qui ont permis une bonne connaissance et conduite de ce modèle de stress de séparation maternelle. Le modèle de stress de séparation maternelle implique l’utilisation de femelles gestantes et de leurs descendants mâles et femelles en période néonatale, 5 jours après leur naissance et l’intégrité de la barrière épithéliale intestinale sera étudiée à l'issue du 24 ème jour de naissance, après euthanasie à partir de prélèvements intestinaux.
Modèle d’implantation (et réimplantation) prépéritonéal pour l’évaluation d’un produit de santé avec ou sans implantation (et réimplantation) sous-cutanée
- Formation professionnelle
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Pour satisfaire aux exigences réglementaires précédant la mise sur le marché d'un produit de santé, 3 700 rats sont utilisés, la moitié dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués pour autopsie. Chaque animal reçoit des implants placés entre la paroi de son ventre et la membrane qui entoure ses organes, jusqu'à quatre sites, plus six sites sous la peau, avec des réimplantations chirurgicales répétées, jusqu'à trois en prépéritonéal et cinq en sous-cutané sur un an. Le porteur décrit des cris à la manipulation et des morsures dues à la douleur, ainsi que des atteintes possibles à l'œil quand le sang est prélevé dans sa veine. L'étude est commandée par un client, qui garantit lui-même qu'elle ne double pas une étude déjà réalisée.
Objectifs
Le projet vise à respecter les exigences des autorités réglementaires et des normes en vigueur avant l’utilisation d’un produit de santé chez l’Homme. Il évalue la toxicité (i.e. les éventuels effets néfastes sur le corps) et/ou la tolérance locale (i.e. sécurité, toxicité/réaction locale) du produit de santé. L’évaluation de ces produits de santé doit mimer autant que possible l’utilisation clinique et ainsi considérer un mode d'administration similaire dans les modèles animaux (prépéritonéal et/ou sous-cutanée) et l’effet cumulatif (réimplantation(s)) lorsque cela est possible. Prépéritonéal signifie situé entre la membrane qui entoure les organes du ventre et la paroi du ventre. Sous-cutanée signifie situé sous la peau.
Bénéfices attendus
Ce projet permet de s’assurer avant sa mise sur le marché que le produit de santé est sûr pour les patient afin de répondre aux exigences des autorités réglementaires et des normes en vigueur. Il permet d’évaluer les risques éventuels liés à l’utilisation de ce produit et de s'assurer que les éventuels risques sont acceptables par rapport aux bienfaits/bénéfices apportés aux patients. Les résultats des études aideront à décider si le produit peut être mis ou maintenu sur le marché, conformément aux règles en vigueur.
Procédures
Lors de la chirurgie réalisée sous analgésie/anesthésie, un ou des sites prépéritonéaux (situés entre la membrane qui entoure les organes du ventre et la paroi du ventre) (environ 15 minutes) seront réalisés. Un ou des site(s) sous la peau (environ 8 minutes supplémentaires) pourront également être ajoutés sur les même animaux. Il est possible d'ajouter à cela des tatouages des sites pendant la procédure (10 minutes additionnelles). Selon la durée de l'étude, une ou plusieurs autres réimplantations chirurgicales (espacées de 4 semaines minimum) pourront avoir lieu pour réimplantation (implanter de nouveau des dispositifs). La durée de ces interventions est similaire aux durées précédemment mentionnées. Le nombre et la fréquence des réimplantations dépendent de l'utilisation clinique du produit à tester, de sa taille, du nombre maximum de sites possible (4 sites maximum en prépéritonéal et 6 sites au maximum sous la peau), de la durée d'étude, de la nature et de la durée de l'ensemble des procédures cumulées, et de l'avis vétérinaire en fonction de l'état général des animaux. Pour une étude 14 à 28 jours: pas de réimplantation possible (car espacement considéré insuffisant). Pour une étude de 13 semaines: maximum 2 réimplantations prépéritonéales et 2 réimplantations sous-cutanées. Pour une étude de 26 semaines à 1 an, maximum 3 réimplantations prépéritonéales et 5 réimplantations sous-cutanées. Pendant l'étude, selon une fréquence et un volume n'affectant pas l'animal, des prélèvements sanguins (environ 5 minutes) pourront être réalisés. La durée des interventions en fin d'étude est d'environ 10 minutes.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables pouvant être observés sont principalement dus à l’implantation prépéritonéale et/ou sous la peau. Cela peut engendrer un stress et ou une douleur localisé au niveau du site chirurgical (entrainant par exemple des réactions inhabituelles, des cris lors de la manipulation, une agressivité, des morsures dues à la douleur), faible perte de poids, baisse d’appétit. Si le produit est toxique, il peut causer des pertes des poids significatives et une baisse d’activité plus importante, des gonflements/blessures au niveau des sites. En cas de prélèvements sanguins se faisant au niveau de la veine de l'oeil, des effets indésirables sur l'oeil peuvent se produire.
Devenir
Pour les besoins de l'étude, une autopsie est nécessaire. Ceci permet d'évaluer les effets potentiels de toxicité systémique et/ou locale du produit de santé à tester. Ces analyses expliquent l'impossibilité en fin d'étude de maintenir en vie les animaux utilisés. De plus, l’analyse des paramètres sanguins ainsi qu'une évaluation des tissus au microscope (analyse histopathologique) est nécessaire.
Remplacement
L’utilisation d’animaux est requise dans la réglementation. Les méthodes alternatives existantes ne permettent pas d’évaluer les effets toxiques à court, moyen ou long terme des produits de santé en raison de la complexité des mécanismes de régulation d’un organisme vivant. Il n'existe pas de test in vitro validé ni de modèle simulé par ordinateur capable de reproduire la complexité d'une réaction tissulaire et/ou des effets systémiques. L’utilisation d’animaux est alors obligatoire pour y parvenir.
Réduction
A la constitution de l’étude, le nombre minimal d'animaux requis par les textes de références est considéré. Dans la mesure du possible, les animaux témoins sont mutualisés entre les différents essais (un même groupe d’animaux "témoin" pour plusieurs groupes d’animaux "test" recevant des produits à tester différents) et la tolérance locale est couplée à l’évaluation de la toxicité systémique. Pour chaque étude, le client pour lequel l'étude est conduite garantit que cette étude ne duplique pas une étude déjà réalisée. Les études dites "faisabilités/pilotes", sur un nombre restreint d’animaux, peuvent aussi servir à orienter les choix de poursuite de développement d'un produit avant d'entamer les études réglementaires à plus grande échelle et devant répondre aux normes en vigueur. De plus, dans le cadre d'essai de toxicité systémique subaiguë, subchronique et chronique, le nombre d'animaux doit être suffisant pour permettre une analyse statistique pertinente (i.e. nombre minimum d’animaux requis) et cela est défini dans la norme en vigueur Les analyses statistiques (exemple: Test de Mann & Whitney avec un risque de 5%) sont réalisées sur le poids des animaux, le poids des organes (absolus et relatifs) et les paramètres sanguins.
Raffinement
La stratégie de raffinement est établie afin de limiter le stress et la douleur des animaux. Elle repose sur la présence d’enrichissements du milieu en systématique, l’utilisation d’antalgiques, d’analgésiques et d’anesthésiques lorsque nécessaire, un suivi sanitaire et clinique renforcé pendant la/les phase(s) d’administration avec une visite vétérinaire en cas d’anomalie clinique, sanitaire ou comportementale, pour permettre une gestion adéquate de la douleur ou de l’anomalie constatée selon chaque cas. Un suivi des points limites spécifiques au projet sera mis en place.
Choix des espèces
L’espèce animale choisie est définie dans le(s) texte(s) de référence. De plus, il est largement utilisé, rendant disponibles de nombreuses données dans la littérature (données sur différents modèles - raffinement, données basales de pathologie…). Le choix du stade de développement est décrit dans les textes de référence qui recommandent généralement l'utilisation d'animaux adultes, âgés en général de 6 à 12 semaines. Lorsque la procédure le nécessite ou dans le cas des propriétés intrinsèques du produit à tester (ex : quantité et/ou taille du matériel à tester importante), des animaux d’un poids plus important (donc plus « âgés ») peuvent être utilisés.
Formation aux approches expérimentales de chirurgie sur rongeurs
- Formation professionnelle
Rats : 360
Vasectomies, ovariectomies et injections dans les ventricules cérébraux sont pratiquées par des stagiaires sur des souris et des rats anesthésiés. 1 440 souris et 360 rats sont utilisés, 720 opérés sans jamais se réveiller et 1 080 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Aucune connaissance n'est attendue de ces opérations, elles servent à remplir l'obligation réglementaire de formation des personnels qui interviendront ensuite sur des animaux, à raison de six sessions de douze participants par an pendant cinq ans. Le compte des animaux opérés sans réveil varie selon les rubriques, 20 % dans la description des procédures, 50 % dans celle du raffinement, quand les chiffres déclarés en donnent 720 sur 1 800.
Objectifs
La mise en œuvre des réglementations portant sur l’expérimentation animale inscrites dans le droit français depuis février 2013 précise les obligations réglementaires de formations pour les chercheurs qui souhaitent utiliser des approches chirurgicales sur des rongeurs. Dans ce contexte, une formation à la chirurgie sur rongeurs (rats, souris) a été mise en place. Cette formation est réservée aux titulaires d’une formation initiale en expérimentation animale de niveau concepteur ou applicateur (doctorants, chercheurs, ingénieurs, techniciens) afin que les participants puissent satisfaire aux obligations légales dans le cadre de projets de recherche.La maitrise des gestes de base (préhension, contention, injections intrapéritonéales et sous-cutanées) attesté dans le livret de compétences est un pré-requis à la participation à cette formation. La formation combine des approches théoriques (travaux dirigés incluant des photos, films, images, modèles plastiques etc..) et la mise en pratique sur l’animal. Cette approche pratique, sur des actes courants est indispensable pour acquérir les gestes de base nécessaires à la réalisation d'actes chirurgicaux dans les conditions optimales, en veillant à la bonne utilisation des médicaments anesthésiques et analgésiques et au respect des règles d’asepsies, ainsi qu’au suivi post-opératoire des animaux. Un encadrement soigné et vigilant est assuré pour accompagner au mieux les participants afin d’assurer le bien-être des animaux durant les chirurgies et lors du suivi post-opératoire. Cette formation ouvre de deux à six sessions par an et accueille au maximum 12 participants par session.
Bénéfices attendus
La formation pratique à la chirurgie des participants garantie une acquisition des gestes de base nécessaires à la réalisation d'actes chirurgicaux dans les conditions optimales, en veillant à la bonne utilisation des médicaments anesthésiques et analgésiques et au respect des règles d’asepsies. Nous avons mis en évidence que la mise en pratique est primordiale pour la compréhension du rôle, de l’intérêt et des conséquences de chaque geste. Elle assure la transmission des bonnes pratiques au sein de leurs divers établissements d’accueil. Leur vigilance sur l’état de l’art est alors un levier important pour une évolution positive des pratiques dans les établissements utilisateurs.
Procédures
Les animaux seront soumis à des injections pour l'administration d’anesthésiques, d’analgésiques, et de colorant vital. Un prélèvement de sang terminal sera effectué sur 20 des animaux. 60% des animaux seront soumis à une vasectomie, une ovariectomie ou une injection ICV et un suivi post-opératoire durant 48H maximum et 20% seront soumis à une ovariectomie sans réveil.
Impact sur les animaux
La manipulation et la contention des animaux entrainent un stress léger et de courte durée. Les injections entraînent une douleur légère de courte durée. L’anesthésie entraine une désorientation temporaire des animaux durant les premières heures suivant le réveil. Les chirurgies (ovariectomie et vasectomie) entrainent une douleur modérée sur le site d’incision qui peut conduire les animaux à se gratter ou à lécher les points de sutures. Cependant, une couverture analgésique est mise en place pour prévenir ces douleurs potentielles.
Devenir
Les animaux ayant été utilisés dans le cadre d'une formation à la chirurgie, ils sont tous mis à mort à l'issue des procédures, ceux-ci ne pouvant pas être réutilisés dans une autre procédure.
Remplacement
La partie théorique qui précède la partie pratique utilise différents supports et méthodes alternatives à notre disposition (vidéos, modèles plastiques, sutures sur ailes de poulet) afin que les stagiaires appréhendent et visualisent au mieux les manipulations et étapes d’une opération avant de débuter la pratique sur l’animal. La mise en œuvre de ces manipulations en situation réelle est nécessaire à la formation et les méthodes alternatives ne peuvent remplacer totalement la mise en œuvre pratique. En effet, ces méthodes sont utiles pour acquérir l’enchainement des étapes, les recommandations, les limites et anticiper l’approche pratique (gestes) mais elles ne permettent pas de mettre l’expérimentateur en condition réelle pour faire face à la pression implicite de réussir à effectuer l’opération sur un animal vivant sans lui occasionner une quelconque souffrance. Ces modèles ne peuvent retranscrire toute la finesse des signes physiologiques et comportementaux à repérer par la vision et le toucher pour identifier les signes de confort opératoire satisfaisant ou les prémisses d’éveil, voire de mal être, chez l’animal. Aucun modèle n’est suffisamment intégré et complexe pour reproduire les textures, la fragilité des tissues, les variations anatomiques et l’ensemble des fonctions biologiques (circulation sanguine, respiration, fonction rénale, système nerveux et immunitaire…) qui réagissent et interagissent lors d’une procédure opératoire. Il est indispensable aux participants de les visualiser, de les appréhender et de les surveiller pour intégrer les conséquences de leurs actions et leurs choix sur la réussite de la procédure opératoire et la récupération rapide et entière de l’animal. Ces apprentissages dans un cadre propice, dirigé et à la veille des évolutions et raffinement techniques assurent une formation initiale de qualité indispensable pour stimuler leur esprit critique et s’assurer que l’acquisition, dans leurs structures, de leurs futures compétences techniques soit l’occasion d’identifier les pratiques inadaptées et de les améliorer.
Réduction
Le nombre d’animaux est réduit au maximum grâce à la partie théorique de la formation qui précède la partie pratique utilise différents supports et méthodes alternatives pour permettre aux stagiaires d’appréhender au mieux les manipulations avant de débuter la partie pratique et ce afin de limiter au maximum le nombre d’animaux nécessaires à la formation. Lors de cette formation, le nombre d'animaux (rat/souris) sera réduit au maximum (un animal par atelier et par participant ou par binôme). S’agissant d’une formation à des techniques chirurgicales, aucune statistique ne sera réalisée. En revanche, l’expérience de l’équipe de formation établit la nécessité d’avoir recours à 5 souris et 1 ratte pour une acquisition complète des techniques (prise en charge pré- et post anesthésique, laparotomie, ablations, sutures) et du suivi des animaux. D’après notre expérience antérieure et l’évolution des pratiques, nous estimons qu’un maximum de 6 sessions de formations impliquant 12 participants seront réalisées chaque année sur une période de 5 ans. De plus, il est important de préciser que la totalité des animaux utilisés lors de ces formations sont des animaux de réforme destinés à être mis à mort.
Raffinement
Les procédures expérimentales sont conçues pour garantir le bien-être de l’animal et réduire au maximum l’inconfort, le stress et la souffrance. La souris et le rat étant des animaux sociaux, ils seront maintenus en groupes sociaux, dans des cages enrichies d’un tube de change, de matériaux de « nidification » et de bâtonnets à ronger. Une période d'acclimatation et d'habituation de 2 semaines sera respectée mais pourra exceptionnellement être ramenée à une semaine en cas de contraintes temporelles (délai de livraison, occupation de l’animalerie…). Le bien-être des animaux sera pris en compte tout au long de la formation, avec un suivi journalier des animaux qui permettra de détecter rapidement tout changement de comportement associé ou non aux procédures. Les souris seront anesthésiées et recevront une administration d’anti-inflammatoire, d’anesthésique local et seront placées sur un tapis chauffant afin de prévenir une hypothermie durant l’anesthésie puis le réveil. Trois des 6 procédures sont effectuées sans réveil (50% des animaux). La douleur liée aux injections est une douleur ponctuelle réversible qui fera l’objet d’une surveillance de l’animal. Les animaux seront particulièrement surveillés après leur réveil, pour mettre en évidence tous signes de douleur qui nécessiterait la mise à mort de l’animal. Aucun animal ne sera maintenu en vie s’il présente des signes de douleur ou d’inconfort.
Choix des espèces
La souris et le rat sont les 2 espèces les plus présentes au sein des établissements utilisateurs des participants. Leur choix est donc dicté par la nécessité de former les manipulateurs pour ces espèces pour les études menées dans leur établissement. Pour ce projet de formation, les rats et les souris seront utilisés à un stade adulte afin de faciliter l’apprentissage des gestes techniques (organogenèse terminée, taille adulte) et de pouvoir utiliser des animaux de réforme initialement destinés à être mis à mort chez l’éleveur.
Le rôle de l’intégrine dans l’hypercoagulabilité de l’hypertension pulmonaire
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Des rats de quatre semaines, pesant une centaine de grammes, reçoivent un traitement qui leur provoque une hypertension des artères pulmonaires. 176 rats sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin pour prélèvement des poumons, du cœur, du foie et de la rate. Chacun subit deux échographies cardiaques sous anesthésie et une injection intrapéritonéale par jour pendant deux à trois semaines, certains recevant en plus une minipompe posée chirurgicalement. Le porteur invoque un "besoin médical critique" et des options thérapeutiques limitées, quand le projet consiste à tester chez le rat des inhibiteurs d'une protéine repérée en culture cellulaire.
Objectifs
L'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est une maladie vasculaire rare et progressive caractérisée par un rétrécissement des petites artères pulmonaires, entraînant une augmentation de la pression artérielle dans la circulation pulmonaire. Dans ce projet, nous allons tester de nouveaux médicaments susceptibles de ralentir ou corriger les anomalies à l’origine de cette maladie. Pour cela, nous utiliserons des modèles expérimentaux chez le rat qui reproduisent les principales caractéristiques de l’HTAP humaine. L’objectif est de mieux comprendre comment la maladie se développe et d’identifier les mécanismes biologiques sur lesquels les traitements agissent. Cela permettra d’envisager, à terme, de nouvelles approches pour soigner les patients atteints d’HTAP.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à répondre à un besoin médical critique en explorant de nouvelles approches thérapeutiques pour l’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP), une pathologie grave et complexe pour laquelle les options actuelles sont limitées. Avancées thérapeutiques : L’étude permettra d’évaluer si l’intégrine αvβ3 constitue une cible thérapeutique pertinente pour l’HTAP. L’efficacité des inhibiteurs de αvβ3 sera testée afin de déterminer leur impact sur la réduction du remodelage vasculaire pulmonaire et l’amélioration des paramètres hémodynamiques. Compréhension des mécanismes : Les résultats attendus contribueront à une meilleure compréhension des voies de signalisation impliquées dans l’action des inhibiteurs de αvβ3. En particulier, ils permettront d’analyser leur effet sur la prolifération cellulaire, l’inflammation et la dysfonction endothéliale associées à l’HTAP. Impacts translationnels : Ce projet fournira une base scientifique solide pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant l’intégrine αvβ3 dans le traitement de l’HTAP. Les résultats obtenus pourraient également ouvrir des perspectives pour élargir l’utilisation de ces inhibiteurs à d’autres pathologies impliquant des mécanismes similaires. En se focalisant sur les mécanismes fondamentaux de l’HTAP, ce projet pourrait non seulement améliorer les résultats cliniques des patients, mais aussi contribuer à l’élargissement des connaissances sur cette maladie. Ces bénéfices attendus représentent une avancée importante vers des traitements plus ciblés et efficaces.
Procédures
Dans le cadre de cette étude, les animaux seront soumis à plusieurs interventions expérimentales. Deux échographies cardiaques non invasives seront réalisées sous anesthésie générale légère, chacune durant environ cinq minutes. Ces examens permettront de suivre l’évolution de la maladie et d’évaluer l’effet des traitements. Un sous-groupe d’animaux subira une courte chirurgie (environ 15 minutes) sous anesthésie générale pour l’implantation d’une minipompe osmotique permettant l’administration continue d’un traitement. Les animaux seront surveillés durant la phase de réveil post-opératoire. Chaque animal recevra une injection sous-cutanée unique en début de protocole, puis une injection intrapéritonéale par jour pendant 2 ou 3 semaines selon la procédure suivie (à l’exception des animaux porteurs de minipompe). Chaque injection est réalisée sous anesthésie locale et dure moins d’une minute.
Impact sur les animaux
Les traitements administrés ont déjà été testés et présentent un bon profil de sécurité, avec une toxicité minimale. Les effets indésirables attendus dans ce projet concernent les interventions expérimentales ainsi que les manifestations liées aux pathologies induites : • Les injections sous-cutanées peuvent provoquer une douleur modérée et transitoire au point d'injection • La chirurgie abdominale peut entraîner une douleur postopératoire modérée, localisée dans la zone opérée. • Les échographies peuvent générer un stress léger et temporaire dû à la contention et à l’anesthésie. • Les procédures terminales sont réalisées sous anesthésie générale et ne génèrent pas d’effet indésirable postérieur. • Les modèles d’hypertension pulmonaire peuvent provoquer une fatigue progressive et une réduction de la prise de poids.
Devenir
À la fin de l’étude, les animaux sont euthanasiés par dislocation cervicale sous anesthésie, garantissant l'absence de souffrance. Des prélèvements d'organes (poumons, cœur, foie et rate) seront réalisés afin de valider l'efficacité des traitements dans les tissus biologiques. De plus, comme décrites dans notre demande, différentes expérimentations biologiques seront réalisées au laboratoire pour démontrer les mécanismes mis en jeu.
Remplacement
Ce projet repose sur des résultats prometteurs obtenus à partir d’études in vitro sur des cultures cellulaires. Ces travaux ont permis de mettre en évidence des altérations dans des voies de signalisation clés impliquées dans le remodelage vasculaire pulmonaire. Le traitement par des inhibiteurs ciblant cette intégrine a montré une réduction significative de la prolifération des cellules musculaires lisses d’artère pulmonaire (CML-AP) induite par le Facteur de von Willebrand (vWF). Ces résultats suggèrent un rôle crucial de l’axe vWF/LRP4/αvβ3 dans la prolifération cellulaire associée à l’HTAP. Toutefois, pour valider l’impact de cette inhibition sur le remodelage vasculaire pulmonaire dans un contexte physiologique intégré, l’utilisation de modèles animaux est nécessaire. Les modèles SuHx et MCT d’hypertension pulmonaire ont été choisis pour leur aptitude à reproduire les altérations pathologiques observées chez l’Homme, notamment le remodelage vasculaire, la prolifération des CML-AP et l’élévation de la pression artérielle pulmonaire. Ces modèles permettent d’induire ces modifications et constitue une approche préclinique pertinente pour tester l’efficacité de traitements. Ces modèles expérimentaux offrent une plateforme robuste pour évaluer les effets des traitements sur la progression de la maladie, mesurer la réduction du remodelage vasculaire et déterminer les implications thérapeutiques potentielles. L’étude des interactions entre les voies de signalisation impliquées dans l’action des inhibiteurs d'intégrine fournira également des informations essentielles sur les mécanismes sous-jacents de cette approche thérapeutique.
Réduction
Les effectifs ont été soigneusement calculés en utilisant des outils statistiques avancés, en tenant compte des données issues de nos études préliminaires et des résultats disponibles dans la littérature sur l’hypertension pulmonaire. Les critères hémodynamiques, tels que la pression artérielle pulmonaire moyenne et l’évaluation du remodelage vasculaire, sont les principaux paramètres retenus pour évaluer l’efficacité des traitements. Cette approche permet de cibler les analyses sur des mesures précises et pertinentes, limitant ainsi la nécessité d’effectuer des évaluations multiples ou prolongées. De plus, les animaux témoins utilisés dans cette étude seront, lorsque cela est possible, réutilisés pour des analyses complémentaires afin d’optimiser leur usage et éviter l’expérimentation supplémentaire sur de nouveaux individus. Egalement, nous avons inclut dans la procédure 1 une étude pilote afin de déterminer le meilleur candidat médicament pour poursuivre le reste de l'étude avec une seule molécule. Cette stratégie vise à maximiser l’exploitation des données obtenues tout en réduisant le nombre total d’animaux nécessaires au projet. Par ailleurs, les résultats issus de ces expérimentations pourront être valorisés dans le cadre d’autres recherches sur l’HTAP et les mécanismes moléculaires associés, garantissant ainsi une utilisation optimale des ressources animales disponibles
Raffinement
Les animaux bénéficieront d’un enrichissement de leur environnement avec des matériaux adaptés tels que du coton, des rouleaux de carton et des bâtonnets en bois, leur permettant de réaliser des comportements naturels. Ils seront toujours hébergés en groupes pour éviter l’isolement, et une période d’acclimatation de 2 semaines sera respectée avant le début des procédures. Pour garantir leur bien-être, un système de surveillance basé sur des points limites sera appliqué afin de détecter rapidement tout signe de souffrance. Une attention particulière est portée à la gestion de la douleur : une analgésie est administrée avant les interventions douloureuses, notamment avant la chirurgie, et toutes les interventions sont réalisées sous anesthésie adaptée (anesthésie générale pour la chirurgie, anesthésie locale pour les injections). Cela permet de réduire efficacement toute douleur ou stress potentiel. L’ensemble des procédures sera réalisé dans le strict respect des principes éthiques, afin d’assurer des conditions optimales pour les animaux tout au long de l’étude.
Choix des espèces
Les rats sont des modèles standards et bien établis pour l’étude des maladies cardiovasculaires, notamment l’hypertension pulmonaire. Des rats âgés de 4 semaines et pesant environ 100 grammes seront utilisés, conformément aux standards expérimentaux des modèles validés d’hypertension pulmonaire. Cet âge est requis pour assurer l’induction efficace et reproductible de la maladie dans les protocoles utilisés, tout en permettant une comparaison directe avec les données existantes dans la littérature préclinique. Ce choix permet également d’optimiser la transposabilité des résultats vers des approches translationnelles ultérieures.
Test et quantification de l’effet anticonvulsivant de dispositifs (électroniques) prototypes de neuromodulation chez le rat épileptique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Soumis à une crise d'épilepsie déclenchée volontairement, 39 rats subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et sont tués dans les cinq minutes qui suivent. La crise dure une seconde et demie, l'animal étant maintenu dans les mains de l'expérimentateur pendant qu'elle survient, après deux heures de chirurgie sous anesthésie et trente minutes d'enregistrement électrique. Tout cela sert à mesurer si des prototypes électroniques délivrant un faible courant bloquent la crise, première étape annoncée vers un dispositif destiné aux personnes épileptiques en impasse thérapeutique. Des simulations numériques ont servi aux premières phases de développement, le porteur concluant qu'elles ne permettent pas d'évaluer l'effet recherché et écartant les modèles in vitro.
Objectifs
Le projet vise à étudier la capacité antiépileptique de dispositifs injectant de faibles quantités de courant électrique sur des rats épileptiques. Ces dispositifs modifient l’activité du système nerveux grâce à une stimulation électrique contrôlée. L’objectif ultime de ces travaux est de développer un nouveau dispositif médical utilisable sur des patients épileptiques.
Bénéfices attendus
Le dispositif testé a pour vocation le développement d’un futur dispositif médical pour traiter des patients épileptiques. La première étape du développement de ce futur dispositif médical, décrite dans ce projet, vise à démontrer l’activité antiépileptique, en aigu, des dispositifs. En cas de succès, nous pourrons poursuivre le développement du dispositif médical. Sur le long terme, nous attendons un bénéfice pour les environ 30% de patients épileptiques en impasse thérapeutique, en leur proposant un dispositif supérieur aux thérapies actuelles. Sur le court terme, ce projet nous permettra d’affiner le protocole des futures procédures expérimentales. Ces dernières permettrons, outre le fait de permettre le développement d’un nouveau dispositif médical, de mieux comprendre le mécanisme d’action de ce type de thérapies modulant l’activité du système nerveux.
Procédures
1/ Chirurgie sous anesthésie et antidouleur (2h sur tous les animaux) : Douleurs légères ; 2/ Enregistrement de données à partir d’électrodes (30 min sur tous les animaux) : Stress léger ; 3 / Déclenchement d’une crise d’épilepsie (1,5 seconde, une seule fois sur tous les animaux) : douleur sévère.
Impact sur les animaux
1/ Douleurs légères liées à la chirurgie 2/ Stress et douleurs durant les procédures de déclenchement de crise d’épilepsie
Devenir
En raison du déclenchement de crises d’épilepsie, ces animaux sont rapidement euthanasiés à la fin du test (dans les 5 minutes). Lorsqu’une convulsion est observée, l’animal est euthanasié immédiatement.
Remplacement
Les modèles in vitro ne permettent pas de tester nos dispositifs. Des simulations numériques ont été utilisées lors des premières phases de développement des dispositifs mais ne permettent pas de tester l’activité antiépileptique.
Réduction
Des simulations numériques ont été utilisées lors des premières phases de développement des dispositifs afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. Nous comparerons nos résultats avec les données historiques du laboratoire qui remplaceront les groupes contrôles.
Raffinement
La douleur de la chirurgie est prise en compte en injectant un antidouleur avant de la démarrer. Les animaux sont euthanasiés rapidement après les tests de déclenchement de crise d’épilepsie pour éviter toute séquelle et douleurs. Les animaux sont maintenus dans les mains de l’expérimentateurs pendant la survenue des crises pour éviter toute chute et choc. Des points limites précoces (perte de poids, défaut d’alimentation ou d’abreuvement, attitude prostrée) seront appliqués pour éviter toute souffrance. En cas de dépassement de ces seuils, une euthanasie éthique sera pratiquée par exposition à une concentration croissante de CO₂.
Choix des espèces
Les rats et souris sont les modèles de référence pour le développement de nouvelles thérapies antiépileptiques, qu’elles soient médicamenteuses ou basées sur des dispositifs. Il n’est pas possible de s’affranchir de ces modèles pour observer l’effet antiépileptique de nos dispositifs. Concernant la souris, elle n’est pas répandue pour tester des dispositifs compte tenu de sa trop petite taille pour certaines chirurgie. Le rat est donc le modèle de choix aujourd’hui. En termes de stade de développement, nous utiliserons des rats de 200-300g, soit des rats adolescents ou jeunes adultes, afin de pouvoir comparer nos résultats avec des données historiques contrôles obtenues sur des rats de ce stade de développement. Il s’agit aussi du stade utilisé dans les études scientifiques avec lesquelles nous souhaitons comparer nos résultats. Enfin, nous avons besoin d’utiliser des rats suffisamment grand pour faciliter la chirurgie sans qu’ils ne soient trop âgés car ils développent du tissus adipeux, gênant pour la chirurgie, avec l’âge
Imagerie cérébrale comme nouvel outil d’étude des troubles du spectre autistique chez le rat (EU 1/2) – Modification
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Gavées quotidiennement avec un retardateur de flamme pendant les 42 jours de leur gestation et de leur allaitement, douze rates mettent bas des portées dont les ratons surnuméraires sont déplacés vers d'autres portées ou tués. Les jeunes passent ensuite quatre tests comportementaux, sensibilité sensorielle, activité et anxiété, interactions sociales et comportements répétitifs, destinés à repérer ceux qui présentent le phénotype autistique recherché. Les rats retenus subissent quatre séances d'imagerie cérébrale sous six anesthésies, pour mettre au point une mesure du métabolisme et de l'inflammation du cerveau. 148 rats sont utilisés au total, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, 37 ayant été ajoutés après l'échec des premières gestations. Seuls 16 resteront en vie, réaffectés à d'autres projets ou "placés en retraite".
Objectifs
Les Troubles du Spectre Autistique se caractérisent par des difficultés de communication et des comportements répétitifs. La génétique n'explique que 25 % des cas, ce qui suggère que des facteurs environnementaux, comme les polluants chimiques, jouent un rôle important. Les retardateurs de flamme sont identifiées comme substances préoccupantes en raison de leurs effets toxiques pour le cerveau. Des recherches précédentes ont montré que l'exposition à ce polluant pendant la gestation et la lactation provoque des comportements autistiques et des altérations cérébrales chez les jeunes rats, comparables à ceux observés dans un modèle autistique médicamenteux de référence. Ces dommages comprennent une inflammation du cerveau et des changements dans la façon dont les cellules nerveuses communiquent entre elles, observés après la mort des animaux. Pour étudier plus en détail ces effets, ce projet a pour objectif à court terme de valider une technique d'imagerie chez des jeunes rats exposés à ce polluant. Deux traceurs seront utilisés pour mesurer l'activité métabolique du cerveau et son inflammation afin d’à plus long terme mieux comprendre les mécanismes cérébraux associés à ces troubles. Ce projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs (EU). L’EU1 sera en charge de la mise en place du modèle et l’EU2 de l’imagerie cérébrale. Un problème expérimental au cours du déroulement du projet nécessite l'ajout de 37 animaux par rapport à la demande initiale.
Bénéfices attendus
Pour la première fois, ce projet utilisera l'imagerie cérébrale pour étudier comment le métabolisme et l'inflammation du cerveau sont affectés par un polluant chimique de l'environnement, en lien avec les Troubles du Spectre Autistique. Il aidera à définir et valider les paramètres de la méthode d’imagerie (comme l’anesthésie et la durée du protocole d’imagerie) pour voir, à l’échelle du cerveau entier, où et comment les dommages se produisent et à établir un lien potentiel entre ces dommages.
Procédures
Femelles gestantes : Administration unique par gavage avec le polluant ou le véhicule (huile neutre) quotidiennement pendant 42 jours, couvrant les périodes de gestation et de lactation, injection avec le médicament de référence ou le véhicule (eau stérile) une seule fois au 12ème jour de gestation et suivi régulier du poids (EU1). Jeunes rats : suivi régulier du poids et tests comportementaux après sevrage. Chaque jeune rat passera 4 tests comportementaux (sensibilité sensorielle, niveaux d’activité et d’anxiété, interactions sociales, comportements répétitifs) pour sélectionner ceux qui présentent des signes d’autisme, en vue des études d’imagerie (EU1). Imagerie cérébrale : À partir de 60 jours, certains rats passeront des séances d'imagerie cérébrale (4 fois en tout sur 2 semaines) sous anesthésie (6 fois), pour mesurer l’activité métabolique cérébrale et pour détecter l’inflammation. La durée de chaque session (1 à 2 h) sera définie pendant cette phase de mise au point (EU2).
Impact sur les animaux
Les nuisances/effets indésirables attendus sont les suivants : Pour les femelles gestantes : - La piqure d’aiguille pour l’injection intrapéritonéale de VPA, d'une durée de quelques secondes, entraine un stress physique mineur et une douleur légère de courte durée (1 fois). - L’administration du polluant par gavage (42 fois) entraine un stress physique mineur de courte durée (quelques secondes). Pour les descendants : - L’existence d’un phénotype comportemental de type autistique entraine notamment un risque d’anxiété accru. - La réalisation des tests comportementaux (au nombre de 4, d'une durée de moins de 30 min chacun) entraine un stress physique mineur de courte de durée.
Devenir
Douze femelles gestantes seront réparties en trois groupes. Elles seront maintenues en vie jusqu'au sevrage de leurs petits à 21 jours, puis euthanasiées. Le sang et les tissus seront utilisés notamment pour l’analyse des hormones. En cas de portées trop importantes (supérieures à 10 ratons), la portée sera réduite par placement des ratons surnuméraires dans d’autres portées plus faibles ou euthanasie. Dans ce cas, les tissus seront prélevés pour des analyses. L’ensemble des ratons (10 par portée soit 120) réaliseront 4 tests comportementaux afin de s’assurer qu’ils présentent le phénotype autistique recherché et de pouvoir en sélectionner pour les études in vivo par imagerie (dix-huit mâles et femelles maximum). A l’âge adulte, l’imagerie sera réalisée sur 3 rats par groupe et par sexe. Si nécessité de renforcer les résultats, un deuxième raton de chaque sexe et de chaque portée sera ajouté à chaque groupe pour augmenter la taille de l’échantillon. L’ensemble des rats nés dans cette étude sera euthanasié pour des analyses en histologie et biologie moléculaire ou des ajustements de techniques en vue de la phase 2 du protocole qui fera l’objet d’une future demande d’autorisation. Enfin les 16 rats (8 femelles et 8 mâles) ayant participé aux tests de sociabilité seront maintenus en vie et pourront être réaffectés à d’autres projets ou placés en retraite.
Remplacement
L'utilisation d'animaux est essentielle pour reproduire la complexité des Troubles du Spectre Autistique observés chez l'Homme. Les modèles autistiques utilisés dans ce projet, reconnus et validés chez les rongeurs, permettent de créer des troubles comportementaux et cérébraux similaires à ceux de l'Homme. Ils permettront d’utiliser l'imagerie cérébrale pour étudier les effets d'un polluant et comprendre le lien avec le développement de l’autisme. Cette imagerie nécessite l'étude de l'activité cérébrale d'animaux vivants.
Réduction
Chaque portée sera considérée comme une unité statistique. Dans chaque portée, un raton mâle et un raton femelle seront sélectionnés pour réaliser des analyses par imagerie in vivo. Comme il y a peu de données sur l'utilisation des deux radiotraceurs de l’étude, cette première phase vise à tester la faisabilité de l'imagerie sur un échantillon de 3 ratons par groupe et par sexe, pour 3 groupes. Si besoin, un deuxième raton de chaque sexe et de chaque portée sera ajouté pour augmenter la taille de l'échantillon. Ainsi, cette phase exploratoire inclura un total de 9 rates gestantes, 90 jeunes et 12 autres rats adultes pour un test de sociabilité. Au total, 111 animaux seront impliqués dans cette étude, avec un minimum de 9 rats mâles et 9 rats femelles (jusqu'à un maximum de 18 de chaque sexe) utilisés en imagerie. Les première femelles n’ont pas permis d’obtenir des descendants pour réaliser les analyses d’imagerie. Trois femelles gestantes ainsi que de leurs descendants, c’est-à-dire 30 jeunes, seront donc ajoutées à ce projet afin de pouvoir obtenir le nombre final d’animaux nécessaire pour l’imagerie. Par ailleurs, en raison du décalage dans la réalisation des tests, les animaux nécessaires au test de sociabilité ne correspondront plus à l'âge idéal pour réaliser ce test, nécessitant l'ajout de 4 rats adultes. Au final, en sus des 111 déjà demandés et approuvés, nous souhaiterions ajoutés 37 animaux, soit un nouveau total de 148 animaux.
Raffinement
Les animaux seront élevés dans l’EU1 dans des conditions standards, respectant les réglementations en vigueur. Les femelles gestantes et allaitantes seront hébergées avec leurs petits jusqu'à 21 jours après la naissance. Ensuite, les jeunes rats resteront ensemble sans leur mère entre 21 et 28 jours pour maintenir leurs liens sociaux. À 28 jours, les rats seront séparés par sexe. Les tests comportementaux seront effectués durant la nuit, période d'activité naturelle des rats. Les animaux seront surveillés quotidiennement pour s'assurer de leur bien-être, et manipulés par le même personnel entraîné pour réduire le stress. À 50 jours, les rats seront transportés dans des cages prévues à cet effet vers l'animalerie de la plateforme d'imagerie EU2, avec des conditions similaires à leur habitat précédent (cycle lumineux, nourriture, enrichissements environnementaux) pour minimiser les perturbations. Les examens d’imagerie seront réalisés sous anesthésie générale, en suivant des protocoles rigoureux adaptés à chaque animal. Les radiotraceurs seront injectés par du personnel qualifié, avec des doses précises. Pendant l’imagerie, l'anesthésie sera surveillée en temps réel pour assurer la sécurité des animaux. Après la procédure, les rats seront surveillés attentivement dans un environnement calme pour une récupération rapide et sans complications.
Choix des espèces
Les modèles de Troubles du Spectre Autistique médicamenteux ou après exposition des mères au polluant ont été développés et sont reconnus chez le rat dont le comportement social est proche de celui des humains, ce qui en fait un bon choix pour étudier ces troubles. Les femelles adultes utilisées pour la reproduction auront entre 12 et 13 semaines, comme dans les études précédentes, pour assurer la comparabilité des résultats. Les petits seront étudiés de la naissance jusqu'à 80 jours pour suivre leur croissance, évaluer leur comportement (entre 36 et 43 jours) et analyser les modifications métaboliques et inflammatoires par imagerie (entre 60 et 80 jours). Cette période permettra de définir les protocoles d'imagerie.