Rats

Des rates gestantes boivent chaque jour une eau additionnée de pesticides organophosphorés ou subissent une exposition quotidienne au bruit, puis l'audition de leurs 294 petits est testée à 21 jours, 3 mois et 6 mois. En parallèle, 90 souris porteuses d'une mutation responsable d'atrophie optique dominante reçoivent une injection dans l'oreille interne, et 45 autres, exposées à un bruit du niveau de ceux rencontrés au travail, reçoivent des injections à travers le tympan. 478 animaux au total, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, le porteur attendant chez les rates gestantes de l'agitation, une baisse d'activité et moins d'interactions sociales. Tous sont tués après les derniers tests, leurs cochlées prélevées.

Objectifs

La surdité représente un enjeu majeur de santé publique, avec des causes multiples telles que des facteurs génétiques, l'exposition au bruit, certains médicaments ototoxiques et le vieillissement. À ce jour, les mécanismes exacts responsables de ces pertes auditives demeurent insuffisamment compris, et aucun traitement curatif n'est disponible. Notre recherche se concentre sur trois axes principaux : 1. Développement de thérapies géniques : Nous utilisons un modèle murin simulant la maladie héréditaire d'Atrophie Optique Dominante, qui entraîne une déficience auditive ou visuelle progressive, liée à l’âge à partir de six mois, en comparaison avec les souris témoins. Nous explorons différentes stratégies visant à ralentir ou stopper l'apparition de la déficience auditive chez ces souris. 2. Utilisation des nanoparticules pour le transport de molécules thérapeutiques dans les cellules de l'oreille interne : Cette approche a pour objectif de favoriser la régénération des fibres nerveuses auditives chez des souris adultes ayant subi des lésions auditives dues à un traumatisme sonore. 3. Étude de l'impact de l'exposition au bruit et aux polluants environnementaux chez les rates gestantes : Nous investiguons les effets de ces expositions pendant la gestation sur l'audition des rats descendants.

Bénéfices attendus

Les implications cliniques, sociales et économiques de ce projet sont importantes. Le développement réussi d’une nouvelle technique innovante basée sur la thérapie génique pourrait être appliqué aux patients, offrant ainsi un nouvel espoir aux personnes souffrant d’atrophie optique dominante. Nous savons aujourd’hui que les synapses reliant les fibres nerveuses auditives aux cellules sensorielles de l'oreille interne sont particulièrement vulnérables aux effets du bruit, du vieillissement ou des substances ototoxiques. En démontrant qu’il est possible de traiter ces lésions précoces, nous pourrions proposer des solutions thérapeutiques pour améliorer la qualité de vie des personnes âgées et favoriser un vieillissement en meilleure santé. Enfin, il n'existe actuellement aucune législation européenne encadrant les risques d'exposition au bruit ou aux polluants sur l'audition du fœtus pendant la grossesse. Nos résultats obtenus de ce projet fourniront des données précieuses sur les troubles auditifs chez les descendants dont les mères ont été exposées au bruit ou aux polluants pendant la grossesse.

Procédures

1. Injection de molécules thérapeutiques génétiques dans l'oreille interne est une technique maîtrisée par notre équipe. Cette intervention, qui durera entre 10 et 20 minutes, nous permettra d'explorer différentes stratégies génétiques pour ralentir ou stopper les troubles auditifs (comme les bourdonnements d’oreille ou les difficultés à comprendre dans un environnement bruyant) causés par une mutation du gène . Pour mener à bien ces tests, nous aurons besoin de 90 souris présentant cette mutation. 2. Injection de traitements pharmacologiques pour traiter les troubles auditifs. Nous allons effectuer des injections intra-tympaniques de molécules thérapeutiques pharmacologiques chez des souris ayant subi des lésions nerveuses auditives, provoquées par une exposition à des bruits fréquemment rencontrés sur les lieux de travail. Cette injection durera environ 5 minutes. Pour cette étude, nous avons besoin de 45 souris exposées à ces bruits. 3. Effets du bruit et des pesticides sur les rats gestants: Des rates gestantes de 5 mois seront exposées quotidiennement à du bruit environnemental ou à des pesticides organophosphorés (dissous dans l’eau de boisson). Ces facteurs de pollution sont courants dans notre environnement quotidien. Nous évaluerons l’audition de leurs petits à l'âge de 21 jours, 3 mois et 6 mois, en utilisant des tests fonctionnels et morphologiques. Pour cette étude, nous avons besoin de 49 rates gestantes. Nous estimons obtenir environ 294 descendants. À la fin de chaque expérience, après les tests auditifs finaux (soit 6 mois après le traitement, soit 6 mois après la naissance), les animaux seront euthanasiés, et leurs cochlées seront prélevées pour des analyses morphologiques et immunocytologiques.

Impact sur les animaux

Lors de l’intervention chirurgicale pour l’administration locale de traitements dans la cochlée, les animaux pourraient éprouver une douleur modérée pendant leur réveil et durant les 12 heures suivant l’opération. Pendant les tests fonctionnels, une douleur légère pourrait être observée en raison de l'injection d'un médicament destiné à endormir l'animal. Selon les données publiées dans la littérature, aucune douleur ni perte de poids n'ont été observées chez les rates gestantes exposées aux doses autorisées de pesticides dans l'eau potable . Cependant, bien que le bruit utilisé dans cette expérience soit un bruit à un niveau conforme aux normes autorisées, il pourrait tout de même influencer la physiologie et le comportement des rates gestantes, qui sont plus sensibles aux changements de leur environnement. Nous nous attendons ainsi à observer des modifications de leur comportement, comme de l’agitation, une baisse de leur activité ou une diminution de leurs interactions sociales.

Devenir

A la fin des derniers tests d’exploration fonctionnelle soit à l’âge de plus 6 mois, tous les animaux participant à l'étude seront euthanasiés.

Remplacement

Dans le cadre de notre démarche visant à respecter la règle des 3R (Remplacer, Réduire, Raffiner) en matière d’expérimentation animale, nous avons déjà réalisé des études in vitro sur des cellules de patients atteints d’atrophie optique dominante ainsi que sur des cellules cochléaires provenant des souris, un modèle qui reproduit une perte de synapse de la cochlée. Cependant, pour prouver que nos stratégies thérapeutiques peuvent réellement restaurer la fonction auditive, il est indispensable d’utiliser des modèles animaux in vivo, qui sont plus proches des conditions réelles observées chez les humains. Nous avons également étudié l’effet toxique de certains fongicides sur des cellules cochléaires de souris, mais pour mieux comprendre l’impact de ces polluants sur l’audition, en particulier en lien avec des troubles comme l’autisme ou les maladies neurodégénératives, l’utilisation de modèles animaux plus complexes, tels que le rat, s’avère nécessaire. Ces études in vivo nous permettront de mieux comprendre les relations possibles entre une exposition prolongée au bruit ou à des polluants environnementaux pendant la grossesse et les troubles auditifs observés chez les descendants.

Réduction

Nous nous engageons à utiliser uniquement le nombre d’animaux strictement nécessaire pour atteindre nos objectifs scientifiques. Voici la répartition prévue : • Pour développer des traitements génétiques visant à ralentir ou stopper l’apparition des troubles auditifs liés à un défaut génétique : Nous tiendrons compte des différences individuelles dans la gravité et la progression des symptômes. Grâce à un calcul statistique, nous avons déterminé qu’un total de 90 souris serait nécessaire, réparties en 6 groupes de 15 souris. • Pour évaluer l’effet de deux traitements pharmacologiques contre une surdité induite par l’exposition au bruit : Afin de limiter le nombre d’animaux, un seul groupe témoin sera utilisé. En tout, 45 souris seront nécessaires, réparties en 3 groupes de 15 souris. • Pour étudier l’impact de l’exposition aux polluants de rates gestantes sur l’audition de leurs descendants : Nous réduirons également le nombre d'animaux en utilisant un groupe témoin de 15 rates gestantes non exposées, et deux groupes de 17 rates chacune, exposées soit à un cocktail de polluants, soit au bruit. Cela représente un total de 49 rates gestantes. Nous prévoyons d’obtenir environ 90 jeunes rats dans le groupe témoin, 102 dans le groupe exposé aux polluants , et 102 dans le groupe exposé au bruit. Ces effectifs sont suffisants pour mener à bien l’ensemble des évaluations fonctionnelles et des analyses morphologiques prévues dans le protocole expérimental. Pour les analyses morphologiques, nous envisageons d’inclure environ 5 à 6 jeunes rats par type d’analyse, à chaque point temporel (21 jours, 3 mois et 6 mois), et pour chaque sexe. Cela représente environ : 5 rats × 3 types d’analyse × 3 âges × 2 sexes = environ 90 rats par groupe. Ces choix ont été faits afin de minimiser l’utilisation d’animaux tout en garantissant des résultats scientifiques solides et fiables

Raffinement

Dans les groupes d'animaux utilisés pour développer des traitements génétiques et pharmacologiques : • Les animaux seront observés quotidiennement dès leur inclusion dans le protocole expérimental. • Ils seront hébergés dans un environnement enrichi, avec des copeaux, des rouleaux de cellulose, et des refuges en plastique pour améliorer leur bien-être. • Après l’opération, une injection sous-cutanée d'antibiotiques sera administrée pour prévenir les infections. Si des signes de douleur ou d'inconfort sont détectés, une euthanasie anticipée sera effectuée pour éviter toute souffrance. • Le réveil après l’opération aura lieu dans un espace isolé. Une fois réveillées, les souris seront remises avec d’autres souris qui étaient dans la même cage et opérées le même jour. • Une visite quotidienne, y compris les week-ends, sera assurée pour veiller à leur état de santé. • Les tests auditifs seront réalisés chez les animaux anesthésiés. Ces tests, non-invasifs, sont couramment utilisés chez l’humain sans anesthésie. Dans l'étude de l'impact de l’exposition aux polluants sur l’audition des descendants de rates gestantes : • Les rats gestants seront surveillés régulièrement tout au long de la grossesse et après la naissance de leurs petits. • Une grille de suivi sera utilisée pour évaluer l'état des animaux. • Pour réduire le stress lié à l’exposition au bruit, les femelles gestantes seront maintenues en groupes sociaux, favorisant ainsi les interactions positives entre elles pour diminuer le stress.

Choix des espèces

Pour évaluer la possibilité de restaurer la fonction auditive chez les patients atteints d'atrophie optique dominante (AOD), nous avons choisi d'utiliser des souris mutantes qui présentent une neuropathie auditive et optique, reproduisant la condition humaine AODplus. Nous testerons également des traitements pour favoriser la repousse des fibres du nerf auditif à l'aide de de petites molécules qui imitent le facteur de croissance, protégées dans de très petites particules. Ces traitements seront testés sur un modèle de souris ayant une synaptopathie auditive, causée par une exposition à un bruit rencontré dans le lieu de travail. Enfin, nous étudierons l'impact sur l'audition des jeunes rats dont les mères auront été exposées au bruit ou aux pesticides pendant leur grossesse. Les souris mutantes et les souris sauvages exposées au bruit auront entre 1 et 2 mois, et seront suivies pendant 1 à 6 mois après le traitement afin d'évaluer les effets protecteurs des traitements sur l'audition. Pour examiner l'impact des bruits et polluants sur l'audition fœtale, nous utiliserons des femelles rats gestantes. Les humains et les rats réagissent de manière similaire aux sons de basse fréquence, ce qui permet d’étudier les effets de l'exposition au bruit. L’audition des rats se développe après la naissance, tandis que celle des humains est déjà active avant la naissance. Cette différence permet de mieux comprendre comment le bruit et les polluants influencent le développement et la maturation de l'audition.

Tués douze semaines après leur première opération pour que leur mâchoire soit photographiée, scannée et découpée en coupes histologiques, 30 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les deux premières molaires du haut leur sont arrachées sous anesthésie, puis ils reçoivent du zolédronate en injection dans l'abdomen, éveillés, avant qu'un implant dentaire ne leur soit posé quatre semaines plus tard. Le porteur qualifie la douleur de modérée et les complications postopératoires de rares. Sur le remplacement, il indique qu'aucun modèle in vitro ne permet d'évaluer la cicatrisation osseuse autour d'un implant après la prise de ces médicaments, et présente son propre protocole comme un modèle réutilisable pour tester ensuite le tabagisme ou la maladie gingivale.

Objectifs

L'ostéonécrose des mâchoires associée aux médicaments est une complication potentiellement sévère qui affecte les patients atteints de pathologies concernant le tissu osseux, comme l'ostéoporose et certaines maladies oncologiques, en particulier les cancers du sein et de la prostate. Ces patients suivent des traitements médicamenteux qui modifient le renouvellement normal du tissu osseux, entraînant une augmentation de sa densité. Parmi ces médicaments, on retrouve les bisphosphonates De nombreux modèles précliniques ont été développés chez le rat, contribuant à des avancées significatives dans la compréhension de cette pathologie. Cependant, les mécanismes à l'origine du développement de la nécrose osseuse restent encore partiellement élucidés. La recherche animale a permis de mettre au point des modèles intégrant des facteurs de risque initialement observés chez l'humain. Il est clairement établi que la nature du médicament administré ainsi que le protocole de dosage influencent le risque de développer cette maladie chez les patients. En fonction de la dose administrée, les patients sous traitement avec ces médicaments sont classés en deux catégories : forte dose (patients oncologiques) et faible dose (patients atteints d’ostéoporose). Selon la littérature actuelle, outre les facteurs systémiques et médicamenteux, des facteurs locaux peuvent également favoriser le développement de cette maladie, notamment la chirurgie implantaire. Les recommandations scientifiques internationales contre-indiquent la pose d'implants chez les patients sous traitement à forte dose. En revanche, chez les patients sous faible dose, l'implantologie est autorisée, bien que le risque de développer une ostéonécrose des mâchoires reste incertain. LL'objectif de cette étude est de développer un modèle expérimental chez le rat afin d'évaluer l'effet de différentes doses de ces médicaments sur le processus d’ostéointégration dans un alvéole totalement cicatrisé. Plus précisément, le médicament choisi est le Zolédronate, qui appartient à la classe des bisphosphonates. Ce modèle exposera les animaux à deux dosages distincts, reproduisant ceux administrés chez l’humain pour le traitement de l’ostéoporose (faible dose) et des pathologies oncologiques (forte dose).

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une meilleure compréhension du processus de cicatrisation osseuse autour de l'implant dentaire après l’administration de traitements avec des médicaments qui altèrent le fonctionnement normal du tissu osseux. De plus, il aidera à évaluer la faisabilité de la pose d’implants chez les patients recevant une faible dose de ces médicaments (qui représentent la majorité des utilisateurs), ainsi qu'à analyser les risques liés à une administration à forte dose chez les patients oncologiques. Pour les recherches futures, cette étude constituera un modèle expérimental permettant d'explorer le rôle d'autres facteurs de risque (ex. : tabagisme, maladie gingivale, etc.) dans le processus de cicatrisation osseuse autour de l'implantau sein de cette population vulnérable.

Procédures

Pour tous les animaux, une période d’acclimatation (minimum 7 jours) est appliquée avant l’initiation du protocole T0 : Extraction dentaire Au début de l'expérience (T0), une extraction de la première molaire maxillaire gauche et droite sera pratiquée sur tous les animaux. Ils recevront une injection d’analgésique (quelques secondes), puis seront anesthésiés pendant 15 minutes sur un tapis chauffant. L'administration de l'analgésique (renouvelée 2 fois par jour) se poursuivra pendant les deux jours suivants. T1 : Administration des traitements Quatre semaines après, l'administration des traitements assignés ou l’absence de médicament débutera sur animal vigile par une injection intrapéritonéale de quelques secondes. T2 : Chirurgie implantaire Quatre semaines après administration médicamenteuse, la pose d'implants sera réalisée sous anesthésie générale. Cette intervention durera 15 minutes. Une couverture analgésique sera mise en place. Le même protocole pré- et post-opératoire que celui décrit pour l'extraction dentaire sera appliqué. T3 : Analyses post-mortem Quatre semaines après la chirurgie implantaire, les rats seront mis à mort.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sur les animaux : - L’extraction ainsi que la pose des implants peuvent entraîner une douleur modérée, qui peut être facilement contrôlée par l’administration d’analgésiques. Les complications post opératoires sont rares. - L’administration du traitement ou de l’analgésie peut induire une courte douleur (moins d’une minute) - Lors du reveil après les chirugies, les animaux peuvent être désorientés et stréssés

Devenir

Afin d’évaluer l'effet des traitements, il est necessaire • D’analyser le site avec l’implant et prendre des photographies. • De réaliser d'un scanner • De prélever des échantillons pour analyse histologique. Nous devons pour cela procéder à la mise à mort de tous les animaux du projet.

Remplacement

Il n'existe actuellement aucun modèle in vitro permettant d’évaluer le processus de cicatrisation osseuse autour de l'implant en simulant le métabolisme osseux après la prise de médicaments. Cette étude constituera un modèle expérimental permettant d'explorer le rôle d'autres facteurs de risque (tels que le tabagisme, etc.) dans le processus d'ostéointégration au sein de cette population vulnérable.

Réduction

Les lots ont été réduits au minimun pour obtenir toutefois des résultats significatifs. Pour cela, nous nous sommes appuyés sur la littérature et sur une analyse statistique.

Raffinement

Une semaine d’acclimatation sera observée avant le début du projet afin de réduire le stress des animaux. Avant l’extration dentaire et la chirurgie, les animaux seront analgésiés. Les interventions seront ensuite réalisées sous anesthésie médicamenteuse et sur tapis chauffant. Le bien-être des animaux sera évalué par du personnel compétent à l’aide d’une grille de score. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués. De même un arbre décisionnel ainsi que des critères d’arrêt sont définis si nécessaire.

Choix des espèces

Le rat représente une espèce appropriée pour cette expérience. En effet, la chirurgie d’implant dentaire est bien décrite dans la littérature, et les processus de cicatrisation et d’intégration d’implant sont largement documentés. Cependant, peu d’études se sont spécifiquement intéressées au risque associé à la chirurgie implantaire. Cette expérience pourrait ainsi offrir une opportunité de comparaison avec la littérature existante et d’apporter des données précieuses dans ce domaine. Les animaux utilsés auront de 8 semaines en début de projet. Les rats seront alors adultes, leur machoire ne se developpera donc plus.

Une entreprise teste des candidats médicaments contre la maladie de Parkinson sur des rats dont elle détruit, par une injection de toxine dans le cerveau, les neurones qui produisent la dopamine. 2 625 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués en fin de protocole pour prélever leur cerveau. Après cette chirurgie, une partie d'entre eux peut être réopérée pour l'implantation sous la peau d'une pompe de diffusion continue, et tous peuvent recevoir chaque jour, pendant six semaines au plus, le candidat ou le traitement de référence, avec des prises de sang répétées à la queue sans anesthésie. Environ 20 % des rats opérés ne présentent pas une destruction suffisante des neurones, et des tests de comportement réalisés deux semaines après l'injection doivent permettre de les écarter. Le porteur annonce trois tests de comportement sous contention, jusqu'à trois fois par protocole, sans préciser lesquels.

Objectifs

La maladie de Parkinson (MP) est, par sa prévalence de 1,5 pour mille, la plus fréquente des pathologies neurodégénératives, après la maladie d’Alzheimer. Elle touche environ 160 000 personnes en France. La MP se caractérise par un syndrome moteur défini par une lenteur d’initiation des mouvements associée à un tremblement de repos, une rigidité musculaire et une instabilité posturale. La principale caractéristique neuropathologique de la maladie de Parkinson est la mort progressive et massive des neurones en charge de la coordination des mouvements et qui produisent la dopamine. Les évènements qui sous-tendent cette mort restent mal connus. Ceci rend le diagnostic de la maladie de Parkinson difficile, d’autant que l’apparition des symptômes ne se produit qu’après une perte neuronale importante. À l’heure actuelle, le traitement de la maladie est donc essentiellement symptomatique et vise à compenser le déficit en dopamine (un messager chimique permettant la communication entre les neurones dans le cerveau) par l’administration d'une molécule semblable. Néanmoins, à long terme son efficacité s’atténue et des effets secondaires très invalidants (troubles moteurs, digestifs,cardiovasculaires, comportementaux, somnolence,…). Compte tenu de ces complications, des stratégies médicamenteuses alternatives sont en cours de développement et visent soit à retarder la prise de cette molécule soit à l’associer avec d’autres composés. L’objectif du présent projet est de tester l’efficacité antiparkinsonienne de nouveaux médicaments sur trois modèles précliniques de la maladie de Parkinson chez le rat. Ces modèles reposent sur une injection de toxines dans le système nerveux central en ciblant spécifiquement les neurones produisant la dopamine afin de mimer la mort des neurones entraînant la pathologie. Au cours du protocole, des tests comportementaux sont utilisés pour évaluer l’efficacité antiparkinsonienne des traitements testés. L’efficacité du nouveau médicament sera comparée aux médicaments actuels représentant le traitement de référence.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de tester l’effet antiparkinsonien des composés candidats pouvant avoir des bénéfices sanitaires significatifs en vue d’essais cliniques.

Procédures

Les animaux subissent une première chirurgie afin d’injecter la neurotoxine dans le système nerveux central (durée environ 30 minutes). Une deuxième chirurgie pourra être réalisée afin d’implanter sous la peau un dispositif permettant de diffuser un traitement en continu (durée environ 15 minutes). Des prélèvements répétés de sang pourront être réalisés sur animal vigile, à la veine de la queue (durée : 5min) ainsi qu’un prélèvement terminal sur animal anesthésié. Des administrations quotidiennes de candidat médicament ou de traitement de référence pourront être effectuées pendant toute la durée du protocole (6 semaines au maximum). Les animaux seront soumis à 3 tests de comportement en fin de protocole effectués sous contention par l’expérimentateur (durée totale : 20min) jusqu’à trois fois au cours du protocole. A la fin du protocole, les animaux seront mis à mort afin de prélever le cerveau.

Impact sur les animaux

Un des effets indésirables potentiel est lié à l'administration du nouveau médicament et des molécules de référence. Un problème lors du geste technique ou un effet secondaire du composé testé peut-être observé surtout pour les nouvelles molécules innovantes avec peu de recul. -Les animaux seront soumis à une administration dans le cerveau d'une toxine nécessitant une chirurgie réalisée sous anesthésie gazeuse. Cette étape peut engendrer des douleurs durant les 24-48h suivant la chirurgie minorées par des antalgiques. La peau du crâne sera ensuite suturée ce qui peut provoquer des démangeaisons lors de la cicatrisation,un risque de retrait du point par l'animal et un risque rare d'infection. Une perte de poids des animaux peut être observée ainsi qu’une altération de la mobilité avec des rotations contraires au site d’injection pendant quelques jours après la chirurgie. -Une chirurgie d’implantation de pompe diffusant des subtances liquides sera réalisée nécessitant une anesthésie gazeuse, avec une ouverture de la peau pouvant être source de douleur et/ou une gêne au réveil -Les animaux réaliseront des tests de comportements nécessitant des contentions et des isolements courts dans des espaces restreints pouvant générer du stress. -Des prélèvements de sang seront réalisés sur animal vigile soumis à une contention, impliquant parfois des piqures dans les vaisseaux à l’aide d’une aiguille pouvant être à l’origine 1) d’une douleur légère de courte durée, 2) de stress et 3) d’un écoulement sanguin persistant.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure car il est necessaire de récupérer le cerveau de l'animal pour faire des analyses sur ce dernier.

Remplacement

L’objectif du projet est d’obtenir une preuve de concept d’efficacité de nouveaux composé in vivo. Afin d’évaluer l’effet antiparkinsonien du composé sur le comportement de l’animal, le recours à un modèle animal est nécessaire. En effet, le modèle in vitro ne permet pas d’induire et d’étudier les répercussions comportementales associées aux déficits parkinsoniens ni d’évaluer la présence du composé dans les organes.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu par groupe pour ce projet est basé sur des données préalables obtenues au sein de l’entreprise sur ce modèle préclinique de la maladie de Parkinson induite par l’injection de toxines dans le cerveau en ciblant spécifiquement les neurones produisant la dopamine (n=15 dont n=12 inclus dans l’analyse finale). Ce nombre se justifie pour les raisons suivantes : après la chirurgie induisant la lésion, environ 20% des animaux ne présentent pas de lésion sévère (

Raffinement

Une importance particulière est portée au suivi des animaux pour prévenir et remédier à l’apparition de douleur ou de mal-être. Les points limites sont fixés avant le début des expérimentations. Des enrichissements multiples sont proposés aux animaux (batônnets en bois, carrés de cellulose, rouleaux en carton), en alternance, pour limiter l’habituation et l’ennui. Les actes pouvant générer de la douleur seront réalisés sous anesthésie et/ou analgésie. Les animaux seront également habitués à la manipulation et à la contention pour diminuer le stress lié à ces procédures. Après chaque prélèvement de sang, une réhydratation sera réalisée afin de compenser la perte du volume sanguin. Les chirurgies intracérébrales seront réalisées sous anesthésie et analgésie et les animaux bénéficieront d’une surveillance accrue (minimum 2 fois par jour) en phase post-opératoire durant 48h. De la nourriture et/ou des gels enrichis seront déposés dans la cage afin de limiter la perte de poids des animaux après la chirurgie. Par ailleurs, les animaux seront habitués aux environnements nouveaux dans lesquels seront réalisés les tests comportementaux afin de réduire le stress relatif à cela.

Choix des espèces

Les rongeurs, classiquement utilisés en laboratoire, présentent plusieurs similitude sur l'anatomie cérébrale et de l'activité des neurones produisant la dopamine que celles que l'on retrouve chez l'Homme. Les modèles de lésion induite par l'injection dans le cerveau de toxines se sont rapidement imposés comme des modèles précliniques de référence pour le test de nouveaux médicaments car ils reproduisent la mort des neurones produisant la dopamine. Des rats adultes d'environs 7 semaines (pesant entre 250 et 320g) le jour de la chirurgie de lésion dopaminergique seront utilisés dans ce projet car la grande majorité des résultats de la littérature concernant ce modèle a été obtenue sur des rats appartenant à cette gamme de poids. De même, les coordonnées exactes utilisées pour procéder à la lésion dans le cerveau proviennent de données issues d'un livre qui a également été réalisé sur la base d’observations faites sur des rats entre 250-300g. En fonction des objectifs de l’étude et des composés à tester, des rats mâles ou femelles pourront être utilisés puisque cette pathologie touche aussi bien les hommes que les femmes.

Placés jusqu'à trois fois par jour pendant six semaines dans un tube de contention, un manchon serré autour de la queue, 192 rats reçoivent aussi des composés hypertenseurs ou hypotenseurs par gavage deux fois par jour ou par injection trois fois par semaine. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré. Le porteur présente pourtant le dispositif de mesure comme "un raffinement en lui-même" parce qu'il est non invasif et indolore, tout en décrivant des hypotensions et des hypertensions provoquées pendant six heures d'affilée, une à deux fois par semaine. Aucun rat n'est déclaré tué dans ce projet, tous étant annoncés comme réutilisables dans d'autres protocoles après avis vétérinaire, ce qui prolonge leur exploitation au-delà de ces six semaines.

Objectifs

L’une des causes principales du retrait anticipé du marché ou de l’arrêt dans le développement d’un candidat médicament est la toxicité cardiovasculaire, quelle que soit sa classe thérapeutique. Pour répondre aux besoins des patients le plus rapidement possible en leur proposant des traitements les plus sécurisés, il convient de mettre en place des techniques d’évaluation de l’impact de ces candidats sur la fonction cardiaque. Dans les études nécessaires au développement d’un candidat médicament, le rat est un bon modèle pour l’évaluation précoce in-vivo de la fonction cardiaque car il présente une forte homologie physiologique et anatomique avec l’Homme Des systèmes ont été perfectionnés pour pouvoir mesurer la pression sanguine de manière non invasive et avec une précision importante chez le Rat. Parmi les différentes approches, la méthode d’oscillométrie consiste en un manchon placé sur la queue de l’animal et relié à un logiciel d’acquisition qui permet d’analyser la pression sanguine (similaire à la méthode utilisée classiquement en médecine humaine). La pression sanguine par oscillométrie n’est pas encore mesurée dans notre laboratoire chez le rat. Afin d’évaluer si un nouveau système d’oscillométrie (choisi car non invasif, indolore et ayant démontré de bons résultats dans la bibliographie) peut être utilisé dans nos études de sécurité non clinique pour déceler précocement in-vivo d’éventuels impacts de nos candidats médicaments sur la fonction cardiovasculaire, il faut le tester et le valider. Après une première étape de mise au point consistant à de la recherche bibliographique (synthèse des données de la littérature) et comparaison avec les données obtenues avec le système en faisant varier certains paramètres influençant la pression (non détaillé ici car en dessous du seuil réglementaire), ce projet aura donc pour objectif : - d’évaluer l’impact d’une administration (eau ou sérum physiologique) sur la pression sanguine : nécessaire pour différencier l’impact éventuel de l’administration en elle-même de celui des composés administrés dans la deuxième étape - puis de valider le système en comparant les données de pression sanguine obtenues sur des rats traités avec des composés de référence ayant un effet direct hypertenseur ou hypotenseur connu ou indirect par modification de l’hémodynamique.

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans le cadre de la recherche et du développement de nouvelles entités à visée thérapeutique. En mettant au point et en validant une méthode d’investigation précoce de la pression sanguine chez le rongeur, le bénéfice escompté par ce projet est l’optimisation du développement de candidats médicaments. En incluant cette méthode d’investigation, qui plus est non invasive et non douloureuse, dans les études de sécurité non clinique, un profil de sécurité plus complet du candidat médicament pourra être déterminé. En effet, l’investigation de toxicité cardiovasculaire est déjà réalisée mais seulement à des étapes ultérieures du développement. Grâce à ce projet, si le candidat médicament devait avoir un effet sur la fonction cardiovasculaire, celui-ci pourra être décelé très précocement. Cette approche permettra ainsi de réduire les contraintes auxquelles les animaux sont soumis dans les études de sécurité non clinique ultérieures en s’assurant de la bonne tolérance des candidats médicaments. Cette technique contribuera à sélectionner les meilleurs candidats ou arrêter les candidats les moins prometteurs, réduisant ainsi le nombre d’études réalisées et donc le nombre d’animaux utilisés pour un projet, en utilisant qui plus est une méthode non invasive d’investigation. De plus le dispositif nous permettra d’accéder à des données de contractilité (paramètre qui définit la performance de contraction du muscle cardiaque) sans avoir à réitérer de mesure dédiée : ces données seront comparées à des données in vitro obtenues après test des mêmes composés hypotenseurs ou hypertenseurs sur des cellules cardiaques. Ainsi, l’un des autres bénéfices du projet est d’apporter des données pour développer un modèle de corrélation vitro-vivo de la contractilité, pour à terme mettre au point des méthodes alternatives vitro plus précoces pour évaluer l’impact des candidats médicaments sur la contractilité cardiaque.

Procédures

A l’administration de composés par voie orale (2 fois par jour max pendant 6 semaines) ou par injection (intraveineuse, intramusculaire ou sous-cutanée 3 fois/semaine max pendant 6 semaines) sur animal vigile. - A des mesures de pression artérielle non invasive nécessitant une contention légère de quelques minutes dans un tube à contention au maximum 3 fois par jour pendant 6 semaines.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, des nuisances ou douleurs peuvent survenir : • Administration orale : la contention d’une durée de moins de 15sec et le passage de la sonde de gavage dans l’œsophage (moins de 10sec) peuvent générer du stress chez l’animal (maximum 1 fois par jour pendant 6 semaines) (Degré de sévérité modéré). • Administration intraveineuse : le passage dans une enceinte thermorégulée (38 degrés maximum) (nécessaire pour dilater les veines et réaliser le geste dans de bonnes conditions) d’une durée maximale de 5min, la contention dans une boite adaptée au rat (2min maximum) peuvent générer du stress ; l’injection peut générer de la douleur due à la piqure (maximum 3 fois par semaine pendant 3 semaines) (Degré de sévérité modéré). • Autres administrations par injection : la contention d’une durée maximale de 15s peut générer du stress et l’injection (moins de 10 sec) de la douleur due à la piqure (maximum 3 fois par semaine pendant 6 semaines). Degré de sévérité léger pour une administration unique ou modéré si l’administration est réitérée. • Les composés administrés pourront induire des effets hypotenseurs ou hypertenseurs transitoires modérés (6 heures maximum 1 à 2 fois par semaine, pendant 6 semaines) et donc une nuisance pour l’animal

Devenir

Les animaux de l’étape de mise au point pourront être inclus dans les études de la deuxième étape utilisant des composés hyper ou hypotenseurs. Tous les animaux pourront être réutilisés dans un autre projet si la gravité réelle des procédures expérimentales sont au maximum de classe modérée, et après récupération complète de l’animal et avis favorable du vétérinaire

Remplacement

Ce projet va permettre de mettre au point une technique non invasive de mesure de la pression artérielle et nécessite l’utilisation d’animaux pour mimer au mieux les processus physiologiques retrouvés chez l’Homme. En effet, il n’existe pour le moment pas de méthode alternative suffisamment complexe pour mimer de manière optimale les paramètres de pression sanguine. Ce projet permettra aussi d’apporter des données pour développer un modèle de corrélation entre les données mesurées chez l’animal in vivo et des données in vitro de contractilité des cellules cardiaques, pour à terme mettre au point des méthodes alternatives plus précoces pour évaluer l’impact des candidats médicaments sur la contractilité, et remplacer l’utilisation d’animaux.

Réduction

Les études incluses dans ce projet visent à développer un système de mesure précoce de la pression sanguine chez le rat. Elles aideront à l’inclusion d’un examen paraclinique supplémentaire dans les études de sécurité non clinique, visant à réduire le nombre total d’animaux utilisés : si un effet d’un candidat médicament sur la pression sanguine est décelé à l’aide du système d’acquisition mis au point dans ce projet, cela pourra contribuer à l’arrêt anticipé du candidat médicament évitant ainsi de réaliser les études suivantes comportant un effectif d’animaux plus important. Un nombre important de mesures de la pression sanguine pourra être réalisé sur un même animal, le système étant non invasif, réduisant ainsi le nombre d’animaux nécessaire dans chaque procédure de ce projet pour générer des données consolidées. Dans les procédures, chaque animal sera son propre contrôle. Les composés de référence utilisés sont connus pour avoir une élimination rapide de l’organisme (quelques heures). De cette manière et après avoir respecté une période de récupération entre chaque administration, un animal donné pourra recevoir plusieurs composés différents ou des doses différentes d’un même composé, ce qui évite de multiplier le nombre d’animaux utilisés dans ce projet. Les rats pourront ainsi être utilisés dans plusieurs études ou procédures successives. De plus, de la mixité male/femelle sera intégrée dans chaque groupe sans avoir à doubler le nombre d’animaux. Une fois l’étude réalisée, nous utilisons uniquement des statistiques descriptives (calcul de médiane, variance, écart-type, comparaison aux valeurs basales et aux données de la littérature) et au cas par cas de tests statistiques avec le support du service de biostatistiques.

Raffinement

Le système de mesure de la pression sanguine est un raffinement en lui-même car non invasif et pouvant être appliqué plusieurs fois sur un même animal vigile ce qui limite les contraintes pour l’animal par rapport à d’autres techniques plus invasives (cathétérisation artérielle par exemple). Les animaux sont manipulés et seront habitués à la mesure de pression sanguine (augmentation progressive du temps passé dans le tube de contention). L’ensemble du personnel technique sera formé pour générer le moins de stress possible lors des actes expérimentaux. Les recommandations de la SBEA sur les voies volumes et fréquences des administrations chez le rat seront appliquées. Les rats seront surveillés tous les jours et de manière très approfondie durant les phases d’activité des agents hypertenseurs ou hypotenseurs nécessaires aux mesures. Seules des doses provoquant des hypertensions ou hypotensions modérées et transitoires (quelques heures maximum) seront administrées. Dès que des signes cliniques sont observés, une décision rapide est prise en concertation entre le vétérinaire, le responsable scientifique, la Structure de bien-être animal et les équipes en charge des animaux. Selon les signes cliniques observés, une prescription de soins, un arrêt de traitement, une diminution de doses ou une euthanasie peut être mise en place, tout en tenant compte de l’objectif de l’étude. Une liste de points limites standards est mise à disposition. Tous les animaux sont stabulés en groupes avec de l’enrichissement adapté aux besoins du rat (matériel de nidification, matériel à ronger). Pendant l’habituation et après chaque mesure, une récompense (type graine de tournesol) sera distribuée à chaque animal.

Choix des espèces

Le rat est l’un des modèles les plus représentés car il présente une forte homologie physiologique et anatomique avec l’Homme et est ainsi considéré comme un modèle prédictif en toxicologie (modèle rongeur utilisé dans les études règlementaires). De plus, le rat est un excellent modèle pour l’évaluation de la fonction cardiovasculaire car il mime les processus physiologiques de la pression sanguine retrouvés chez l’Homme. C’est ainsi le modèle le plus adapté pour mesurer la pression sanguine de manière non invasive et générer des données consolidées et reproductibles. Les rats utilisés seront des jeunes adultes et adultes, correspondant à l’âge des animaux utilisés communément dans les protocoles de recherche de candidat médicament et dans les études ultérieures dans lesquelles seront mise en place le suivi de la pression sanguine.

Le canal biliaire ligaturé au cours d'une laparotomie de quinze minutes, 760 rats reçoivent ensuite jusqu'à cinquante-six administrations de composés, par gavage, sous la peau, en intraveineuse ou dans le nez, ou quatre séances de dialyse péritonéale suivies de drainages, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Tous sont tués pour l'examen du foie, des reins et du cerveau. Le porteur qualifie le modèle de modéré parce qu'il "ne va pas jusqu'au seuil critique" de l'encéphalopathie hépatique, tout en énumérant des vocalises spontanées, une incapacité à se retourner, une absence de réflexe pupillaire et une pâleur prononcée qui "conduiront à la mort des animaux". Il annonce aussi un volume de liquide de dialyse "beaucoup plus important que celui recommandé", et renonce aux tests comportementaux poussés au profit d'une simple observation de la léthargie et de l'ataxie.

Objectifs

L'encéphalopathie hépatique (EH) est un problème cérébral qui survient à cause d'une maladie du foie, qu'elle soit aiguë ou chronique. Elle peut se manifester par des changements de comportement ou des troubles de l’esprit, allant de symptômes légers à un coma. Cette maladie est sérieuse et peut entraîner des complications graves, nécessitant des soins médicaux importants. Bien que l’on ne comprenne pas encore complètement les causes de l'EH, on sait qu’elle est liée à des substances inflammatoires et toxiques dans le corps, comme l’ammoniaque. L’ammoniaque provient en grande partie du métabolisme des protéines par les bactéries dans l’intestin. Normalement, le foie transforme l’ammoniaque en une autre substance, l’urée, qui est ensuite éliminée par les urines. Mais lorsque le foie ne fonctionne pas bien, il ne peut plus effectuer cette transformation correctement. En plus de la transplantation du foie, il existe des traitements comme le lactulose ou la rifaximine, mais ils peuvent avoir des effets secondaires, et certains patients ne répondent pas bien aux traitements. Ce projet vise à reproduire cette maladie dans différents modèles expérimentaux, afin de tester de nouveaux traitements pour l’encéphalopathie hépatique, quel que soit le mode d’administration (par voie orale, intraveineuse, par injection dans l’abdomen, ou même par dialyse péritonéale).

Bénéfices attendus

La prévalence de l’encéphalopathie hépatique (EH ou HE) clinique concerne 30 à 45 % des patients cirrhotiques avec une incidence de 20 % par an. La prévalence de l’EH minime est plus difficilement estimable mais elle pourrait toucher plus de 2/3 des malades. La prévalence de la cirrhose est d’environ 2000 à 3500 cas par million d’habitants, soit en France 700000 cas avec 10 à 15 000 décès par an. Le passage d’une cirrhose compensée vers une cirrhose décompensée est associé à une diminution de la survie à court terme (3-5 ans). La survenue d’une EH constitue un facteur majeur de mauvais pronostic. En effet, le développement d’un premier épisode d’EH au cours de la cirrhose est un facteur de risque indépendant de mortalité avec un taux de survie cumulée à 1 an et 3 ans de respectivement 42 % et 23 %. Ce projet vise donc à bloquer et reverser le processus qui conduit à la mise en place de l’encéphalopathie hépatique et de lui permettre d’avoir accès à une transplantation hépatique (seul recours actuel à la décompensation hépatique).

Procédures

La chirurgie passe par une laparotomie et ligature des voies biliaires sous anesthésie générale avec couverture analgésique pré et post opératoire (durée 15 minutes). Un prélèvement de sang (durée 1 minute) de randomisation sous anesthésie à l'isoflurane (durée 3 minutes).cas de la dialyse : 4 administrations des composés à raison d’une fois par jour pendant 4 jours consécutifs (durée 1 minute) sous anesthésie (3 minutes) et 4 Drainages du dialysat à raison d’une fois par jour pendant 4 jours consécutifs (15 minutes) sous anesthésie générale. Autres types de traitement : au maximum 56 administrations par gavage, en sous-cutanée, en intraveineuse, en intranasale (durée une minute) ou en administration intraveineuse lente (durée 30 minutes). 6 prélèvements de sang intermédiaires (durée 1 minute) sous anesthésie (durée 3 minutes) . Un prélèvement de sang final (durée 1 minute) sous anesthésie (durée 3 minutes).

Impact sur les animaux

Les modèles d’étude ne présentent pas de douleur ou d’inconfort pendant la phase d’induction de la fibrose ou de la cirrhose. Sur cette phase, le seul inconfort serait l’intervention chirurgical associée à la ligature des voies biliaires, celui-ci est géré par l’utilisation préventif d’un analgésique et en curatif pendant les deux jours qui suivent la période post-opératoire. L’encéphalopathie est une pathologie très lourde pouvant conduire au décès du patient. La décompensation « spontanée » peut inéluctablement conduire à la mort. Nous reproduirons ces évènements qui surviennent chez les patients cirrhotiques qui décompensent spontanément. Des signes comme des vocalises spontanées, des difficultés respiratoires, une incapacité à se retourner, une absence de réflexe pupillaire, du larmoiement et une pâleur prononcée conduiront à la mort des animaux et à un réajustement du modèle. Il est cependant à noter que l'administration du liquide de dialyse devra être réalisée par des personnes maitrisant parfaitement le geste (dans les règles de l'art). IL est aussi à noter que dans ce cadre le volume d’administration est beaucoup plus important que celui recommandé. Ce volume a déjà été testé dans une précédente autorisation et n’a entrainé ni douleur ni inconfort.

Devenir

L'évaluation histologique des organes majeurs (foie, reins et cerveau) et une investigation approfondie des biomarqueurs plasmatiques circulants imposent la mise à mort des animaux

Remplacement

Les modèles développés et décrits dans ce projet tentent de reproduire une cascade d’événements conduisant à la défaillance successive de plusieurs organes comme cela se produit chez le patient cirrhotique en phase de décompensation. Il n’existe pas de modèle in vitro permettant de reproduire la globalité ni la chronologie de la progression de la rupture multi organe. Les premières étapes du programme de recherche seront réalisées dans des tests in vitro pour évaluer les activités intéressantes sur des paramètres connus jouant un rôle dans l’évolution de la pathologie étudiée (par exemple l’inflammation, le stress oxydatif, ou la prolifération ou mort cellulaire etc.).

Réduction

Le nombre d’animaux estimé pour chaque procédure tient en compte de l’hétérogénéité associée aux modèles d’induction de la défaillance hépatiques. Cette estimation s’appuie sur nos expériences antérieures durant de nombreuses années du modèle BDL chez le rat et de l’hétérogénéité de variance de nos paramètres d’efficacité (biomarqueurs plasmatiques circulants qui sont assez labiles). A l’aide de ces données, un calcul de puissance et la déduction par le calcul théorique des effectifs est possible. Un test statistique est réalisé pour permettre de définir cet effectif théorique permettant d’atteindre la significativité recherchée. Cette approche statistique permet d’affiner les plans d’expérience pour lesquelles une étude pilote préalable par exemple a permis d’approcher un résultat très proche de la significativité.

Raffinement

L’encéphalopathie hépatique à son stade terminale est une pathologie sévère, qui chez l’humain entraîne de nombreux décès dans un délai de 1 à 3 ans. Notre modèle expérimental ne va pas jusqu’au seuil critique de la pathologie et est donc modéré. Un certain nombre de signes cliniques sans gravité associés à la mise en place de la pathologie seront observés. Sans mettre en place de tests comportementaux poussés, des changements notables seront observés chez les animaux : léthargie, apathie (perte progressive de l’exploration , de la curiosité à l’ouverture de la cage), une diminution de la prise alimentaire (sans risque pour l’état général de l’animal), des altération de la coordination (ataxie). D’autres signes nous conduiront à une plus grande vigilance dans l’observation tels que des crises de tremblements légers ou des spasmes musculaires, des réactions excessives aux stimuli extérieurs, de l’agitation. Ces signes individuellement ne seront pas des critères de mise à mort des animaux, mais nous permettront de juger de l’évolution de la pathologie. Certains signes cliniques comme l’absence de réaction ou des crises de convulsions seront par contre des points limites à nos études. La liste de ces points limites pourra être réajustée au fur et à mesure de nos observations, afin d’éviter toute souffrance non nécessaire à l’établissement des résultats. Les procédures se feront avec un hébergement adapté au bien-être des animaux avec un enrichissement du milieu (morceaux de bois à ronger, tunnel et éléments de nidification). Au cours des procédures, nous appliquerons pendant les périodes qui suivent les prélèvements sanguins, un apport d’aliment gélifié enrichi qui favorise la récupération des animaux suite à l’anesthésie. Une partie des observations étant de nature comportementale, les études requiert l’utilisation d’animaux et ne peuvent être remplacées par des expérience in vitro.

Choix des espèces

Sur la base de la littérature scientifique, aucun modèle invertébré ne permet à ce jour de développer une encéphalopathie associée à une atteinte hépatique et donc de valider l’efficacité d’un traitement dans cette pathologie. Le génome des rongeurs et celui de l'homme ont 90% d’homologie, cela en fait un modèle de choix dans les études pharmacologiques. Le choix de l'espèce Rat a été fait en se basant sur la littérature scientifique et sur nos connaissances des caractéristiques des molécules à tester. Les études seront réalisées sur des jeunes adultes Les traitements induits aux animaux affectent essentiellement la fonction hépatique et produisent des modifications métaboliques. Il est nécessaire de les appliquer sur un organisme développé, qui puisse mettre en place des mécanismes de réparation et de défense. L’animal au stade de jeune adulte qui a un système immunitaire compétent (microbiote bien établi) et des mécanismes de réponse à des stress inflammatoires correspond au stade de vie requis pour développer notre modèle expérimental. Les études seront réalisées sur des animaux de 6 semaines (250-275 gr) à l'arrivage afin de permettre une phase d'habituation et d’avoir des animaux d'environs 400g au moment de la chirurgie. Pour les études dont la chirurgie sera faite en externe, nous utiliserons des animaux de 8 semaines (375-400 gr) au moment de la chirurgie.

Anesthésiés puis opérés pendant 30 minutes à 2 heures selon l'espèce, 2 400 rats, 250 chiens, 320 ouistitis et tamarins et 225 macaques à longue queue, des primates, soit 3 195 animaux non-humains, reçoivent un système d'enregistrement de paramètres physiologiques ou un cathéter veineux. Après l'opération, ils restent isolés jusqu'à 24 heures et reçoivent des antidouleurs pendant 2 à 3 jours, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec des risques d'infection, d'inflammation et de douleurs post-opératoires. Les chiens sont inclus dès 6 mois, les ouistitis dès un an, les macaques dès deux ans, et des juvéniles peuvent être opérés, à titre exceptionnel, pour des produits à visée pédiatrique. Une fois implantés, ils sont intégrés à des projets de toxicologie et de pharmacologie précliniques, dans ce que le porteur décrit comme une "utilisation continue des animaux" sur des projets liés à la même question scientifique.

Objectifs

L’objectif du projet est de réaliser des chirurgies d’implantation de système de mesure, d’administration ou de prélèvements de différents paramètres physiologiques, produits d’études ou fluides biologiques. Ces systèmes sont nécessaires à la réalisation d’études de toxicologie et pharmacologie réglementaire suivant les lignes directrice ICH/EMA afin d’évaluer la sécurité, l’efficacité et la toxicité de candidats médicaments ou substances chimiques chez différentes espèces animales avant leur utilisation chez l’humain ou l’animal.

Bénéfices attendus

Ces chirurgies permettent de : - Faciliter et sécuriser le traitement des animaux et donc diminuer leur stress induit par des manipulations invasives répétées. - Faciliter les prélèvements de sang et limiter le nombre de site de prélèvement - Evaluer de manière fiable certains paramètres physiologiques comme la fréquence cardiaque, des bio-potentiels comme l’électroencéphalogramme, des températures comme la température corporelle ou l’activité motrice. - Collecter des données sur la sécurité, l’efficacité et/ou la toxicité, de candidats médicament avant administration chez l’Homme ou chez l’animal.

Procédures

Les animaux se verront implantés par chirurgie un système d'enregistrement des paramètres physiologies et/ou un système de cathétérisation veineuse afin de pouvoir administrer des molécules testés dans le cadre d'essais pré-cliniques de développement de médicaments. La pose de ces implants prends de 30 minutes à 2h, selon l'espèce. Si un prélèvement sanguin est nécessaire, il est fait vigile, en quelques minutes.

Impact sur les animaux

La chirurgie représente un risque de nuisance modérée pour les animaux. Les risques sont une inflammation ou un gonflement des zones de chirurgie, d’infection, de douleurs opératoires et post opératoire. L’isolement post opératoire, bien que limité à 24h maximum, représente aussi une source de stress pour les animaux.

Devenir

Les procédures décrites dans ce projet permettront d'intégrer les animaux dans des projets de toxicologie et pharmacologie pré-cliniques dans le cadre du développement de médicaments. Cette intégration se fait dans le cadre d'une utilisation continue des animaux sur des projets liés à la même question scientifique.

Remplacement

Les chirurgies préparatoires menées dans le cadre de ce projet permettent la réalisation d’études règlementaires évaluant l’efficacité, la sécurité et la toxicité de candidats médicament ou de substances chimiques en vue de leur mise sur le marché. Ces études réglementaires sont des prérequis aux essais cliniques de phase I, II et III et sont réalisées en suivant des guidelines nationales et internationales (ICH/EMA). Selon ces guidelines, ces études doivent être effectuées sur des modèles animaux, il n’est donc pas possible actuellement de remplacer les modèles in vivo par des modèles in vitro ou in silico.

Réduction

Une fois les animaux implantés ils participent à plusieurs études, ce qui permet d’en réduire le nombre nécessaire. De plus, pour les études réglementaires le nombre d’animaux est réduit au minimum pour permettre la détection d’effet indésirables/toxicologique/pharmacologique en accord avec les lignes directrices ICH/EMA.

Raffinement

Afin de réduire les nuisances liées à la chirurgie, un protocole anesthésie/analgésie est avec une prémédication (qui permet de rendre plus rapide et plus stable l’anesthésie et d’apporter une analgésie), une application d’anesthésique locale avant l’incision et générale en fin de chirurgie et une anesthésie générale gazeuse avec inhalation d’isoflurane sont mis en place pour permettre une chirurgie et un réveil rapide et sans douleur. Le suivi post-opératoire sera quotidien, et inclus l’administration d’analgésie injectable et/ou par voie orale systématiquement durant 2 à 3 jours. Des points limites ont été définies afin de mettre en place des actions correctives afin d'éviter tout souffrance.

Choix des espèces

Toutes les espèces retenues pour ce projet sont des espèces reconnues pour leur aptitude à prédire les effets pharmacologiques, indésirables et/ou toxiques de candidats médicament ou substances chimiques. Les lignes directrices requièrent deux espèces (rongeurs et non rongeurs) selon la nature du produit à tester (molécule chimique de synthèse, peptide, protéine, anticorps monoclonal ou produit de thérapie génique ou cellulaire). Ce projet utilise des rongeurs à partir de 6 semaines, des chiens à partir de 6 mois, des macaques à partir de 2 ans et des marmousets à partir d’un an. Exceptionnellement, ce projet pourra être menées sur des animaux juvéniles pour des produits à visée pédiatrique afin de révéler des effets toxiques dépendant de l’âge (retard de croissance, effet sur la maturation sexuelle, effet toxique lié à l’immaturité de certaines fonctions physiologiques). La ligne directrice suivie est : “guideline on the need for non-clinical testing in juvenile animals of pharmaceuticals for paediatric indications - EMEA/CHMP/SWP/169215/2005”.

80 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié est irradiée neuf minutes aux rayons X puis reçoit en intraveineuse la moelle osseuse prélevée sur les autres, et la moitié subit un prélèvement de sang derrière l'orbite de l'œil. Une lignée porte la mutation humaine du syndrome de DAVID, une maladie rare associant immunodéficience sévère et auto-immunité, ce que le porteur nomme un "phénotype dommageable". Il écrit que les études in vitro ont "largement validé" l'effet de cette mutation sur les lymphocytes, puis conclut que le recours aux rats reste "indispensable".

Objectifs

Des mutations sur le gène étudié ont été identifiées chez des patients atteints du syndrome de DAVID, maladie autosomique rare associant des syndromes d'immunodéficience sévère et d'autoimmunité, ainsi que des déficits de certaines hormones hypophysaires. Nous disposons au laboratoire d'un modèle rat porteur d'une des mutations identifiées chez des patients atteints du syndrome de DAVID. L'objectif est d'utiliser ce modèle pour analyser l'impact de cette mutation dans la fonction et la différenciation des lymphocytes, dans les phénomènes auto-immuns sévères et dans les mécanismes de "tolérance centrale thymique", mécanismes qui permettent à ces lymphocytes de ne pas attaquer le corps lui-même.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'évaluer si la transplantation de cellules souches hématopoïétiques (cellules spécialisées qui se trouvent dans la moelle osseuse, l'organe responsable de la production de toutes les cellules sanguines : globules rouges, globules blancs, et plaquettes) serait susceptible de réduire la sensibilité aux infections récurrentes et de réduire les symptômes d'autoimmunité chez les patients porteurs de cette mutation dans le gène étudié.

Procédures

- 1 irradiation de 9 min aux rayons X (la moitié des animaux du projet) - une injection en intraveineuse de cellules de la moelle osseuse d'animaux donneurs. Les animaux seront ensuite placés sous lampe chauffante et surveillés jusqu’à leur réveil (la moitié des animaux). - Un prélèvement de sang derrière l'orbite de l'œil sous anesthésie et analgésie locale (gel ophtalmique) (la moitié des animaux). En cas d’atteintes de points limites avant la fin de la procédure, les animaux seraient mis à mort pour abréger leur souffrance.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont principalement 1. légère douleur liée à l'injection de cellules de la moelle osseuse ; 2. douleur légère et de courte durée, ainsi qu’un stress lié au prélèvement sanguin réalisé derrière l'orbite de l’œil.

Devenir

Mise à mort de l'ensemble des animaux à la fin de l'expérimentation pour effectuer des prélèvements de tissus post-mortem.

Remplacement

Des études "in vitro" ont largement validé l'impact de la mutation du gène étudié dans la fonction et la différenciation des lymphocytes. Néanmoins, ces études in vitro ne sont pas suffisantes pour répondre au défaut de "tolérance centrale thymique" (mécanismes qui permettent aux lymphocytes de ne pas attaquer le corps lui-même) à l'origine des troubles auto-immuns sévères observés chez les patients atteints du syndrome de DAVID. Des études chez l'animal en utilisant ce modèle de rats génétiquement altéré sont donc indispensables.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe est réduit au nombre nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Quatre-vingt rats maximum ont été estimés pour réaliser ce projet. Ce chiffre pourra être revu à la baisse, pour: - les donneurs de moelle osseuse si la quantité de cellules obtenues est bien au-delà de la quantité nécessaire. Le surplus de cellules sera congelé pour être utilisé dans une autre expérience. - le nombre d'expériences indépendante pourra être réduit à 3 si les résultats sont fiables et assez reproductibles pour en tirer des conclusions solides.

Raffinement

Les animaux seront surveillés à chaque étape critique de la procédure: - suite à l'irradiation des animaux aux rayons X, - suite à l'injection de cellules de la moelle osseuse - suite au prélèvement de sang. Si un signe clinique sévère est observé et/ou un point limite atteint, l’animal sera sacrifié pour des raisons éthiques. Afin de réduire le stress, différents types d'enrichissement (briquettes de bois, tunnel en carton) sont placés dans les cages et les rats seront à 2-3 par cage pour éviter leur isolement. Si un animal présente des signes de faiblesse mais sans atteintes de points limites, il pourra faire l'objet d'un isolement temporaire pour éviter tout comportement agressif de ses congénères. Les animaux à phénotype dommageable seront suivis comme les autres : suivi de poids, surveillance de prostration éventuelle.

Choix des espèces

Les rats sont de bons modèles d'étude de par leur facilité d’entretien, de stabulation, de manipulation, et leurs similitudes physiologiques avec l’espèce humaine. L'utilisation préalable de ces animaux par des équipes scientifiques internationales permet à d’autres travaux de recherche de débuter avec une base solide (connaissances théoriques, modèles, équipement, …). De plus, le modèle rat a été choisi car nous disposons de 2 lignées de rats génétiquement modifiés pour ce projet: - une lignée de rats exprimant constitutivement une protéine fluorescente verte, utilisée comme donneurs de moelle osseuse - une lignée de rats porteurs de la mutation d'intérêt dans le gène étudié, utilisée comme receveurs de moelle osseuse. Nous utilisons cette lignée à phénotype dommageable parce que ces animaux sont porteurs d’une mutation dans le gène étudié, comme celle présente chez les patients atteints du syndrome de DAVID, et qui est à l'origine des troubles auto-immuns sévères observés chez ces patients. Les rats utilisés auront entre 6 et 7 semaines.

40 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tués à la fin sous une anesthésie sans réveil pour analyse histologique du trajet fistuleux. Chacun subit une chirurgie d'une heure et quart combinant une opération anti-obésité et la création d'une fistule entre l'estomac et la peau, puis une seconde intervention où un patch d'un centimètre carré est suturé sur l'ouverture, puis une IRM. Le porteur annonce des douleurs temporaires, une perte de poids et un risque d'infection au point de suture, tout en écrivant que les animaux ne souffrent généralement pas de douleurs persistantes après la chirurgie. Il affirme qu'il n'existe aucun modèle alternatif satisfaisant et que ces tests sur des animaux non-humains sont "indispensables" à une éventuelle application chez l'humain, l'étape suivante annoncée restant une étude pilote conditionnée aux résultats.

Objectifs

Les fistules digestives sont des complications graves qui surviennent lorsqu’un passage anormal se forme entre deux organes internes ou entre un organe et la peau. Ces problèmes peuvent être causés par des maladies comme la maladie de Crohn ou des interventions chirurgicales, notamment les opérations pour traiter l’obésité. Par exemple, en France, 35 000 sleeves (chirurgie de l’obésité) sont réalisées chaque année, et dans 1 à 3 % des cas, des fistules peuvent se développer. Dans 20 % de ces cas, les fistules deviennent chroniques et difficiles à soigner. Le traitement des fistules est complexe : il peut inclure des soins locaux, un drainage, et parfois une nouvelle opération, souvent risquée et associée à un taux de mortalité élevé. Des recherches récentes explorent une solution prometteuse : la gelée de Wharton. Ce matériau, issu de cordons ombilicaux humains, possède des propriétés uniques qui favorisent la régénération des tissus et réduisent l’inflammation. Notre équipe travaille à développer un nouveau traitement combinant la gelée de Wharton et une matrice spéciale dérivée d’œsophage de porc, afin de favoriser la cicatrisation des fistules. La matrice, un support biologique préparé à partir de tissus animaux, est enrichie avec la gelée de Wharton pour être appliquée directement sur la fistule. Ce processus est soigneusement testé dans des conditions de laboratoire avant de pouvoir être utilisé chez l’humain. Les tests actuels utilisent un modèle animal (chez le rat), car il est essentiel d’observer l’évolution de la cicatrisation sur une période prolongée, ce que les études sur des cellules isolées ne permettent pas. Objectifs : 1. Évaluer l’efficacité du traitement pour refermer les fistules chroniques. 2. Étudier comment la gelée de Wharton agit sur l’inflammation, la formation de nouveaux vaisseaux sanguins et la réparation des tissus. 3. Optimiser l’adhésion et la rétention de la gelée de Wharton sur la matrice utilisée. Nous espérons que ce traitement novateur permettra de soigner plus efficacement les fistules digestives post-opératoires. Si les résultats des tests sont concluants, une étude pilote chez l’humain pourra être envisagée. Grâce à ces avancées, notre objectif est d’offrir une alternative moins invasive et plus efficace pour traiter une complication souvent dramatique.

Bénéfices attendus

Nous voulons démontrer qu’il est possible d’utiliser un nouveau matériau, composé d’une matrice biologique enrichie en gelée de Wharton, pour traiter des fistules digestives chez le rat. Ce matériau devra être à la fois sûr (sans causer d’infections ou d’inflammations) et efficace pour favoriser la cicatrisation. Pour cela, nous vérifierons l’absence de complications grâce à des observations cliniques et radiologiques. L’efficacité sera mesurée en comparant le nombre de fistules guéries entre différents groupes de traitement. Ces tests chez l’animal sont indispensables pour une éventuelle application chez l’humain. Afin de rendre cette transition possible, toutes les étapes de fabrication respectent déjà les normes médicales en vigueur. Les fistules digestives sont des complications fréquentes, graves, et difficiles à soigner. Elles ont un impact majeur sur la qualité de vie, surtout lorsqu’elles deviennent chroniques. Les traitements actuels sont invasifs, nécessitent de longues hospitalisations et ne réussissent pas toujours à guérir les patients. Grâce à ce projet, nous espérons offrir une solution innovante, plus efficace et moins lourde, pour améliorer la prise en charge des personnes touchées par cette maladie.

Procédures

1. Une première opération d’une heure et quart sera réalisée sous anesthésie générale. Elle consistera à effectuer une chirurgie anti-obésité et à créer une fistule entre l’estomac et la peau. 2. Une deuxième intervention durant 15-30 minutes sera réalisée sous anesthésie générale. Un patch de 1 cm², issu du traitement innovant, sera suturé sur l’ouverture de la fistule au niveau de la peau. 3. Une phase concernant 3 rats comprendra une IRM supplémentaire visant à optimiser et valider le protocole d’IRM prévu en phase 4. 4. Enfin, une dernière phase sous anesthésie sans réveil permettra d’évaluer visuellement et avec une IRM si la fistule s’est refermée.

Impact sur les animaux

Les principales gênes attendues incluent des douleurs temporaires après l’opération pour créer la fistule, ainsi qu’une possible perte de poids liée à la chirurgie et à la fistule. Le traitement appliqué au jour 15 pourrait entraîner des infections locales ou des démangeaisons dues aux points de suture, mais les expériences précédentes montrent qu’après la chirurgie, les animaux ne souffrent généralement pas de douleurs persistantes.

Devenir

A la fin de la procédure, les rats seront euthanasiés dans une procédure d’anesthésie sans réveil pour analyse histologique du tractus fistuleux et des tissus environnants afin d’étudier les phénomènes de cicatrisation à l’échelle microscopique.

Remplacement

Les fistules mettent plusieurs semaines à se former, et leur cicatrisation ne peut être observée qu’après un mois de traitement. Cela ne peut pas être étudié en dehors d’un organisme vivant. Actuellement, il n’existe pas de modèle alternatif satisfaisant pour remplacer les expériences sur les animaux. Cette recherche vise à développer un traitement qui pourra, à terme, être utilisé chez l’humain, car les options actuelles sont insuffisantes. Le rat est un modèle pertinent pour ce type d’étude : sa biologie tissulaire et ses réactions immunitaires et inflammatoires sont proches de celles de l’homme, comme le confirment des études scientifiques. Cela permet de prédire les résultats humains de manière fiable et d’étudier la biocompatibilité des matériaux utilisés.

Réduction

Pour analyser les résultats : Nous utiliserons un test statistique pour comparer les groupes d’animaux selon la fermeture ou non des fistules et un autre pour mesurer les différences sur les données continues. L’étude inclura 4 groupes de 9 rats chacun, avec un rat supplémentaire par groupe pour compenser d’éventuels décès ou problèmes techniques. Ce nombre est le minimum nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Nos calculs sont basés sur une étude précédente, qui a utilisé un modèle similaire. Le taux de fermeture des fistules y était de 82,5 % avec traitement, contre 12,5 % sans traitement. Les calculs statistiques ont été réalisés avec un logiciel dédié (G*POWER), en fixant une puissance de 80 % et un risque d’erreur de 5 %. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés (principe des 3R), la procédure sera réalisée par des experts en microchirurgie. Un membre de notre équipe, spécialiste des chirurgies digestives chez le rat, supervisera ces opérations.

Raffinement

- Du personnel qualifié, dont un chirurgien expérimenté, sera mobilisé avant, pendant et après les interventions. - Les rats s’habitueront à leur environnement pendant 7 jours avant l’opération. - Les animaux seront logés en cages ventilées et stérilisées, avec un accès normal à l’eau, à la nourriture et à des enrichissements (nidification, maison en cas d’isolement). - L’environnement est conçu pour préserver leur bien-être : aucun stress visuel, sonore ou olfactif entre les rats opérés et ceux à opérer. - Les animaux recevront des analgésiques avant et après la chirurgie (tramadol, carprofène). - Des protocoles précis encadrent l’anesthésie, les soins post-opératoires et, si nécessaire, l’euthanasie pour minimiser toute souffrance. - Des limites éthiques strictes seront suivies tout au long du projet pour garantir le bien-être des animaux.

Choix des espèces

Nous avons choisi le rat Wistar car : -Son anatomie digestive est proche de celle de l’Homme, ce qui permet de reproduire la pathologie humaine. -Les modèles de rats avec fistules post-chirurgie gastro-œsophagienne sont validés et reconnus comme fiables pour les études précliniques. -L’équipe impliquée est experte dans la gestion et les soins des rats. -Ces rats sont facilement disponibles auprès d’éleveurs agréés. Caractéristiques des rats Wistar pour l’étude -Les rats seront tous âgés de 12 semaines, pour garantir des résultats comparables et des plaies proportionnelles à leur taille. Le choix de rats adultes réduit les risques liés à l’anesthésie et facilite les opérations chirurgicales. -À cet âge, la qualité des tissus permet une cicatrisation optimale.