Rats
Modèle expérimental de DMLA chez le rongeur
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles sensoriels
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Rats : 4600
Des tirs de laser sur la rétine sous anesthésie, ou une injection sous la rétine, provoquent une dégénérescence maculaire chez des souris et des rats, qui reçoivent ensuite jusqu'à huit gouttes oculaires par jour et des injections dans l'œil une à deux fois par semaine. 9 200 souris et rats vont être utilisés dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. Le porteur affirme que le développement de cette maladie n'est pas douloureux, tout en annonçant une altération permanente de la vision de l'œil traité. 8 390 animaux sont tués pour les évaluations histologiques, et 810 réutilisés dans d'autres procédures, ceux-là étant les individus écartés du protocole après la détection d'une anomalie de l'œil avant le début de l'étude.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de mettre en place dans l’établissement utilisateur, un modèle expérimental de DMLA (dégénérescence maculaire liée à l’âge) chez les rongeurs, dans le but de tester des traitements potentiels. La DMLA est la première cause de mal voyance chez les personnes de plus de 50 ans dans les pays industrialisés. Cette pathologie touche l'œil dans une zone particulière de la rétine : la macula, impliquée dans la vision fine et la vision centrale. La maladie est silencieuse pendant plusieurs années, puis la vision et la perception des détails baissent, des tâches sombres apparaissent au centre du champ de la vision. Elle existe sous plusieurs formes : la forme « humide » ou exsudative et la forme sèche (ou atrophie géographique). Dans la forme humide de la DMLA, plus grave qui évolue rapidement vers une perte importante de la vision centrale, de nouveaux vaisseaux sanguins poussent de façon anormale et endommagent la rétine. Les nouveaux vaisseaux sanguins poussent anormalement à partir de la choroïde (tissu situé sous la rétine), on utilise les termes de néovascularisation choroïdienne. La stratégie des traitements est de stopper la progression anarchique de ces vaisseaux délétères. La forme dite «sèche», ou atrophie géographique de la DMLA est la plus fréquente, elle évolue plus lentement que la forme humide mais il n’existe pas de traitement. Nous estimons pouvoir réaliser 7 études par an de test d’efficacité de molécules luttant contre la DMLA, comportant au maximum 6 groupes de 15 animaux (90 animaux maximum) en fonction des produits à tester, par an pendant 5 ans, chez le rat et la souris, il s’agit d’une prévision maximumselon nos capacités. Le nombre de groupe varie en fonction des produits à tester : soit 1 ou plusieurs doses d’une même molécule à comparer à l’effet d’un placébo, soit plusieurs traitements différents à comparer entre eux.
Bénéfices attendus
Ce projet contribuera au développement de médicaments luttant contre la DMLA et améliorant la vue des patients. La DMLA est la première cause de mal voyance chez les personnes de plus de 50 ans dans les pays industrialisés et la troisième cause dans le monde (1,5 millions de personnes en France, 196 millions dans le monde). Sa fréquence augmente avec l’âge et le nombre de patient augmentera compte tenu de l’allongement de l’espérance de vie.
Procédures
L’induction de la DMLA chez les rats et les souris se fait par des tirs de laser ophtalmiques sur la rétine sous anesthésie, ou par une injection sous la rétine. Les examens ophtalmologiques se feront à l'aide de techniques non invasives. Ces examens sont d’ailleurs réalisés chez l’homme en cabinet médical en ambulatoire sans anesthésie. Ces examens sont également régulièrement pratiqués sur l’animal en clinique vétérinaire dans le cadre des consultations. Pour notre projet, ces examens pourront se faire pour une partie sur animaux vigiles (examens en lampe à fente) mais certains qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie légère. Ces examens sont rapides et ne dureront pas plus de quelques minutes. Les administrations de produits se feront soit par instillations (gouttes oculaires), soit par injection au niveau de l'œil (injection intravitréenne, sous conjonctivale), soit par voie sous cutanée, soit par voie intramusculaire ou intrapéritonéale. Ces instillations ou injections nécessitent le maintien de l’animal afin de l’immobiliser. Ces procédures sont extrêmement rapides et ne prendront pas plus d’1 ou 2 minutes. Les gouttes oculaires peuvent être administrées plusieurs fois avec généralement une moyenne de 3 administrations et un maximum de 6 à 8 administrations par jour. Les administrations de produit par injection au niveau de l'œil se feront sous anesthésie locale et générale si besoin, leurs fréquences sont plus limitées, une à deux fois par semaine. Ces procédures sont aussi un peu plus longues et nécessitent de placer l’animal sous un microscope chirurgical. Il faudra compter quelques minutes (en général 5 minutes par animal) pour réaliser de telles administrations. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif du traitement administré ou tout autre marqueur d'intérêt. Ces prélèvements se feront sur animal vigile et le temps nécessaire aux prélèvements ne dépassera pas les 5 minutes par animal.
Impact sur les animaux
Le développement de la DMLA chez l’homme, et par transposition chez l’animal, n’est pas douloureux. Outre les nuisances dues aux manipulations de l'animal pour les observations, le stress dû aux contentions manuelles de l'animal pour les administrations de produits, les instillations ou la douleur éventuelle de la piqûre lors des injections de produits ou d'anesthésiant, la pathologie devrait entrainer une altération permanente de la vision sur l'œil ayant reçu l'injection. L'administration des produits devrait engendrer tout au plus une douleur légère et de courte durée notamment lors de l’anesthésie. Au cours de l’anesthésie jusqu’au réveil, une baisse de la température corporelle pouvant induire un stress est attendue, ce stress sera minimisé par l'utilisation de tapis, de lampe ou d'enceinte de réveil chauffants.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, tous les animaux qui auront suivi la totalité de la procédure expérimentale seront mis à mort pour permettre de réaliser les évaluations ex vivo (évaluations histologiques, dosage de produit...). Pour les études d’efficacité de traitement, les animaux n’ayant pas suivi la totalité de la procédure (estimé à environ 10%, hormis ceux exclus pour cause de points limites) pourront être réutilisés dans d’autres procédures expérimentales compatibles avec l’avis du vétérinaire. Ces animaux sont des animaux qui sont exclus de l'étude en raison d'un défaut anatomique ou physiologique détecté aux examens de baseline au niveau de l'œil avant le début de l’étude. Ces animaux n'auront pas reçu d'induction de la pathologie, ni d'administration de traitement, seulement des examens qui ne sont pas invalidants mais qui potentiellement nécessitent une anesthésie.
Remplacement
A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer l’œil dans son environnement et dans sa globalité fonctionnelle. Les lignées cellulaires ou les systèmes alternatifs comme les organoïdes ne permettent d’étudier qu’une partie des mécanismes. En effet, l’œil est composé de différents tissus (vasculaires, rétinien neuronal, vitréen, cornéen, humeur aqueuse ...) de physiologie différente et soumis aux variations environnementales, aux interactions des tissus et organes voisins. Les études in vivo permettent d’observer les réponses physiologiques d’un traitement dans un organisme vivant en tenant compte des pharmaco cinétiques, des métabolites générés. Compte tenu de la complexité de l’organe nous aurons donc recourt à des animaux.
Réduction
Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et tient compte des variations du métabolisme, de la robustesse des mesures et de notre expérience. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à l'aide des tests statistiques paramétriques ou non paramétriques suivant la distribution des données, avec possibilité d'effectuer des comparaisons multiples, chaque groupe traité sera comparé à celui du groupe témoin. Un calcul de l’effectif grâce à un test, sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. Des évaluations non invasives de la pathologie sont utilisées tout au long de l'étude pour éviter la mise à mort de l'animal.
Raffinement
Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les animaux seront hébergés en groupe, avec différents enrichissements adaptés à l'espèce. Les examens choisis pour évaluer les signes cliniques de la maladie sont non invasifs et semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet d'ophtalmologie ou chez l’animal en clinique vétérinaire. Afin de réduire le stress de l'animal lors d'examens nécessitant l'immobilisation de l'animal, une administration d'anesthésique sera réalisée. Lors des anesthésies des substituts de larmes sont régulièrement instillés sur les cornées pour éviter le dessèchement, un dispositif est prévu pour éviter l’hypothermie (enceinte chauffante, coussin, ou lampe). Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum.
Choix des espèces
Les espèces animales choisies ont une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée. De plus, les modèles expérimentaux concernant cette pathologie sont largement utilisés et décrits sur ces espèces dont les publications de référence sur laquelle le projet est basé. Pour ce projet, des souris et des rats ont été retenus pour tenir compte des particularités anatomiques et physiologiques de chaque espèce afin d’augmenter les chances de mener ce projet à terme. Le choix de l’espèce se fera en fonction des caractéristiques des produits à administrer. Les animaux seront de jeunes adultes à leur arrivée dans notre animalerie, âgés de minimum 5 semaines, conformément aux publications de référence qui servent de base à ce modèle. Ils entrent en étude après une période d’acclimatation d'un minimum de 5 jours.
Thérapie photodynamique interstitielle et glioblastome : étude d’efficacité en fonction du type cellulaire et de l’inhibition de transporteurs membranaires concernant la protoporphyrine IX
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Un guide vissé sur le crâne, saillant sous la peau, sert à injecter des cellules de glioblastome humain dans le cerveau de 152 rats athymiques, opération de deux heures sous anesthésie, tandis que 38 rats au système immunitaire intact reçoivent la même greffe. Les 190 animaux sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et tous tués à l'issue, la tumeur provoquant des troubles neurologiques dont la perte d'équilibre. Le porteur écrit que ce guide se trouve à un endroit que les pattes du rat ne peuvent pas atteindre, qu'aucune modification du comportement n'a été observée, et que "rien n'indique" que les séances d'imagerie hebdomadaires soient source d'inconfort. La mise à mort est fixée à trois semaines après le traitement, au motif qu'au-delà la tumeur serait trop grosse et que les animaux finiraient par en souffrir.
Objectifs
Le glioblastome (GBM) est la tumeur cérébrale la plus commune et la plus agressive avec une médiane de survie de 15 mois malgré les traitements de première ligne. Certaines tumeurs sont inopérables, diminuant d’autant les perspectives thérapeutiques. La thérapie photodynamique interstitielle (iPDT) est une procédure qui permettrait de cibler et traiter ces tumeurs profondes inopérables. Le principe de cette thérapie repose sur l’activation par la lumière d’une molécule qui s’accumule préférentiellement dans les cellules cancéreuses ce qui induit leur destruction. Les études antérieures du laboratoire nous ont permis de valider la faisabilité du projet, et de mettre en évidence des limites associés à la résistance à ce traitement : la variabilité des modèles cellulaires et l’export des molécules photosensibles. Outre un effet antitumoral direct, l’iPDT peut générer une réponse immunitaire spécifique et nous souhaitons en mesurer les paramètres. Ainsi, ce projet permettra (i) de réaliser une preuve de concept préclinique de l’efficacité de l’iPDT dans le GBM, indispensable à la mise en place de futurs essais cliniques chez l’Homme ; (ii) de proposer une revue des modèles cellulaires applicables en expérimentation animale du GBM humain (non disponible à ce jour dans la littérature), (iii) ouvrir des pistes pour améliorer l’efficacité thérapeutique en combinaison aux inhibiteurs d’ABCG2, et (iv) analyser le développement de la réponse immunitaire. Ce projet sera donc bénéfique à moyen/long terme pour les patients atteints de glioblastome (santé humaine) et pour la communauté scientifique travaillant sur le sujet (recherche fondamentale).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de cette étude sont multiples. Nous pourrons évaluer de l’effet de la thérapie photodynamique (PDT) sur les modifications de structure, de forme et de fonction des tumeurs, en corrélation avec la survie des animaux. Cet aspect permettra de mieux justifier l’utilisation de la PDT interstitielle dans le traitement du glioblastome, pour la mise en place d’un premier essai clinique en France. Elle nous permettra également de mesurer l’effet combinatoire du blocage chimique/médicamenteux du transport de la molécule photosensible sur le plan de la tolérance au traitement et de la survie globale des animaux. Cet aspect permettra, en cas de résultats favorables, de mettre en place dans un deuxième temps un essai clinique utilisant ce médicament. Nous pourrons évaluer l’effet de la PDT interstitielle sur les modifications du système immunitaire. Cet aspect permettra à la communauté scientifique de mieux comprendre l’implication du système immunitaire dans le processus de guérison, et d’éventuellement associer la PDT à des thérapies favorisant une réponse du système immunitaire pour révolutionner la prise en charge de cette maladie. Cette étude nous permettra de mieux documenter l'effet de la PDT interstitielle en fonction de la composition cellulaire des glioblastomes. A l'heure actuelle, seule la lignée cellulaire humaine de glioblastome est véritablement documentée, ainsi de plus amples expérimentations permettront d'étoffer la bibliographie sur le sujet et d’aider d’autres projets sans pour autant recourir à l’expérimentation animale inutilement.
Procédures
Pendant 10 jours, les 190 animaux seront manipulés régulièrement pour les habituer au contact humain et réduire leur stress. Le projet se déroulera en deux phases. Dans la première, des cellules tumorales seront greffées dans le cerveau de 152 rats sans système immunitaire et de 38 rats avec système immunitaire. Cette opération, qui dure environ 2 heures, sera réalisée sous anesthésie et comprendra l'insertion d'un guide sur leur crâne pour permettre l'injection précise des cellules. Deux jours après l'implantation, une imagerie sous anesthésie générale d'une durée d'une heure sera effectuée pour vérifier la localisation et la taille de la tumeur. La seconde phase consistera à appliquer un traitement. 50 rats ne recevront pas de traitement, tandis que 140 recevront une molécule photosensible qui ira s'accumuler dans les cellules tumorales. Parmi eux, 70 auront également un médicament qui bloque la sortie de cette molécule des cellules tumorales. Cette phase de traitement dure environ deux heures. Elle est effectuée sous anesthésie générale. Une fibre optique sera placée pour activer la molécule à l’aide d’un faisceau lumineux, ce qui provoquera la mort des cellules tumorales. Les animaux seront suivis par imagerie (toujours sous anesthésie générale) chaque semaine, et du sang sera prélevé sur les rats avec système immunitaire pour suivre leur réponse au traitement. À la fin du protocole, les rats seront euthanasiés et leur cerveau sera analysé.
Impact sur les animaux
Le protocole de greffe est une opération chirurgicale risquant d'entraîner une douleur aiguë, en particulier cutanée. Celle-ci fera l’objet d’une analgésie. La procédure de greffe passe par l'implantation d’un guide fixé au crâne pour guider l'aiguille et la fibre. Ce guide dépasse de la peau du crâne mais à un endroit que les pattes du rat ne peuvent pas atteindre, l'empêchant de se blesser, et il n'a pas été observé de modifications du comportement précédemment. Rien n'indique que le passage en imagerie soit vecteur d'inconfort ou de douleur chez le rat. La procédure est, de plus, non-invasive, et les animaux sont anesthésiés. Concernant les effets de la tumeur induite : le grossissement de la tumeur peut provoquer des troubles neurologiques, le plus visible et fréquent étant la perte d'équilibre. La désorientation manifeste ou un trouble moteur sera considéré comme le début d’un processus n’ayant pas vocation à s’améliorer après analgésie et conduira à la mise à mort de l’animal. De même, la perte de poids de plus de 15% sur une période de trois jours sera également considérée comme un point limite, ainsi que tout trouble de l’alimentation ou prostration prolongés au-delà de 24h ; et conduiront à la mise à mort de l’animal.
Devenir
Le glioblastome étant une maladie cancéreuse incurable du cerveau, tous les animaux seront euthanasiés. Cette euthanasie sera effectuée : soit 3 semaines après le traitement (au-delà, la tumeur serait trop grosse et les animaux finiraient tôt ou tard à en souffrir) soit avant, si nous apercevons des signes de souffrance qui ne peuvent pas être résolus avec des soins simples. Cette euthanasie sera effectuée sous anesthésie générale, sans douleur ni inconfort.
Remplacement
Les méthodes de laboratoire ont déjà été employées pour restreindre les hypothèses de travail. De nombreuses expérimentations de thérapie photodynamique (PDT) ont été faites sur les cellules cancéreuses qui seront employées dans ce projet, mais la validation expérimentale du concept de PDT interstitielle (iPDT) stéréotaxique et de son évaluation à l’imagerie implique de travailler sur le vivant. Il est en effet nécessaire de se rapprocher au maximum des conditions dans lesquelles les patients humains sont diagnostiqués et seront traités. Il est important de prendre en compte à la fois les modalités de croissance de la tumeur et son lien avec l'environnement qui la voit croître ; il n'est, à l'heure actuelle, pas possible de mimer efficacement la croissance des vaisseaux sanguins, la mort spontanée des tissus tumoraux parfois observée, l'effet sur les tissus sains environnants des différents messagers chimiques libérés par les cellules, de l'effet d'un système immunitaire sur la croissance tumorale et sa réponse à la PDT. Les différents travaux déjà menés sur modèle murin sont intéressants et confirment l’efficacité de ce traitement et la possibilité d’obtenir des informations pertinentes à l’imagerie pour évaluer la réponse. Cependant, ces données sont encore imparfaites et l’approche multimodale, avec une confrontation des informations d’imagerie est ce qu’il y a de plus performant. La PDT antitumorale est en cours d’essai sur le glioblastome chez l’homme avec des résultats prometteurs mais tout changement ou ajout au traitement doit être validé par une étude préclinique, ce qui n'est possible efficacement que sur l'animal. De plus, les études précliniques permettent d’obtenir des informations histologiques et de corréler celles-ci à ce que l’on observe en imagerie.
Réduction
Le nombre d’animaux à utiliser est évalué au plus juste à 190 animaux. Nous avons pu définir que selon la procédure et les attentes en termes de résultats des groupes de 8 animaux seraient suffisants pour obtenir une puissance statistique élevé. Bien qu'insuffisante, l'expérimentation en laboratoire nous a permis de réduire les hypothèses de travail et, par conséquent, le nombre de groupes d'animaux à utiliser dans ce projet, réduit à 3. Les groupes ne seront pas formés dès le départ, mais les animaux seront commandés au fur et à mesure de l'avancement du projet. Ainsi, nous éviterons de générer de nouveaux modèles animaux qui ne seraient pas nécessaires ; la marge demandée concernant le nombre d'animaux par groupe doit rester une précaution, et les personnes affectées à ce projet mettront tout en œuvre pour qu'il soit inutile de les mettre à contribution. D'autre part, s'agissant de l'emploi de cellules tumorales peu répandues dans la littérature, la réduction ne se fera pas que sur notre projet : les résultats obtenus, une fois publiés, permettront à d'autres équipes travaillant sur des sujets similaires ou dans le même domaine de mieux s'orienter sans devoir utiliser autant d'animaux qu'il aurait été nécessaire en partant de rien. Une attention particulière sera portée à la réduction du risque de mortalité pendant les procédures, notamment dans la gestion de l'anesthésie. Si, au cours des procédures expérimentales, la méthode d'anesthésie s'avère poser problème, nous nous concerterons avec le personnel impliqué pour définir la meilleure option de remplacement. Nous ajoutons que l’utilisation, à la fois de rat avec ou sans système immunitaire permet en une procédure de répondre à la fois aux questions sur l’effet des molécules bloquant le transport du médicament, mais aussi d’analyser le système immunitaire, en éliminant un maximum de biais méthodologiques.
Raffinement
Les animaux seront acclimatés 10 jours dans leur salle d’hébergement. Ils seront inspectés quotidiennement pour déceler tout mal-être, blessure ou dommage comportemental, dès leur arrivée à l'animalerie par les personnes participant directement aux procédures (pour habituer et sociabiliser les rats). Un enrichissement est prévu dans les cages (tubes de cartons, carrés de cellulose). Durant les procédures, les animaux seront en anesthésie gazeuse profonde et sous analgésique ; en fonction de la durée des procédures, une seconde injection d'analgésique sera effectuée avant le réveil. En cas de mauvaise tolérance du traitement ou de l’évolution tumorale, un traitement symptomatique par anti-inflammatoires permettra de diminuer efficacement la souffrance de l’animal. S'il y a lieu, les personnes devant effectuer les gestes chirurgicaux ou de prélèvements seront formés ou remis à niveau en utilisant des rats de taille similaire mais fraîchement décédés ou bien sortant d'une procédure tierce dont ils ne doivent pas se réveiller. En cas de blessure physique, des soins seront apportés par le personnel. La sensibilisation du personnel au contact des animaux reste une de nos priorités, et tout sera mis en œuvre pour que les rats soient traités avec grand soin. Des points limites ont été définis avant l’expérimentation et dans le cas où ceux-ci seraient atteints ou que le traitement analgésique n’aurait pas d’effet, les animaux seront mis à mort selon la méthode définie à distance des autres animaux. Les points limites de notre étude concernent les conséquences de la chirurgie et celle de l’évolution du volume de la tumeur dans la boite crânienne du rat. Ainsi, l’activité motrice des animaux sera suivie en pré- et post-opératoire quotidiennement en cage ; s'agissant de tumeurs cérébrales, toute perte d'équilibre ou désorientation manifestes sera considérée comme le signe d'un dommage cérébral impossible à soigner efficacement et entraînera la mise à mort de l'animal. La mesure du poids de l’animal sera réalisée quotidiennement : une perte de poids de plus de 15% par rapport au poids avant greffe s’étalant sur plus de trois jours consécutifs, entrainera la mise à mort de l’animal. L’aspect général de l’animal (aspect du poil, couleur de l’œil) ainsi que son comportement : activité d’exploration, prostration, cris… seront observés, et corrélés entre eux pourront mener à la mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
Le choix s'est porté sur le rat pour des questions de gabarit de l'animal : le cerveau des souris est trop petit pour être pertinent, et de plus gros animaux poseraient un problème de logistique inutile. D'aute part, le rat est bien documenté pour ce type de protocoles, en termes de bibliographie expérimentale mais aussi anatomique. Nous avons choisi des animaux athymiques, unique espèce utilisée dans le cas de xénogreffes de cellules tumorales humaines, qui sont des rats nude mâles, âgés de 8 semaines au moment des greffes. Des rats âgés de 8 semaines sont utilisés, à un stade où leur conformation crâniene correspond à celle de l’atlas de stéréotaxie employé.
Réalisation des travaux pratiques d’une formation aux bases fondamentales de la chirurgie expérimentale avec utilisation de rongeurs vivants
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 300
Opérés du crâne en stéréotaxie pendant une heure trente au maximum, 900 souris et 300 rats sont utilisés dans des procédures menées sous anesthésie et tués sans avoir repris conscience. Chaque animal subit une intervention unique, précédée d'une injection d'analgésique et d'une injection d'anti-inflammatoire pratiquées par le stagiaire lui-même. La finalité déclarée est de former des concepteurs de projet et des expérimentateurs à la chirurgie du cerveau, l'apprentissage commençant sur des animaux morts avant de passer aux vivants. Le porteur classe la procédure en gravité sans réveil tout en décrivant une durée de chirurgie qui court jusqu'au réveil et une mise à mort intervenant après "observation des phases du réveil".
Objectifs
Cette formation a pour objectif d'acquérir les bases théoriques et pratiques nécessaires pour réaliser des interventions chirurgicales stéréotaxiques en neurosciences dans des conditions optimales de précision et d'asepsie, tout en garantissant une gestion éthique des ressources animales.
Bénéfices attendus
Ce programme progressif permet aux participants d'acquérir les bases de la chirurgie stéréotaxique, en débutant sur des animaux morts avant de passer aux modèles vivants, dans le respect des règles éthiques et des bonnes pratiques de laboratoire.
Procédures
Les animaux sont d’abord soumis à une anesthésie : Après contention de l’animal, le stagiaire effectue une injection intrapéritonéale unique d’un analgésique, et une injection sous-cutanée unique d’un anti-inflammatoire e afin de raffiner au mieux la technique et d’éviter toute douleur à l’animal. La durée de la chirurgie, depuis l’induction de l’anesthésie jusqu’au réveil est de 1h30 maximum. Chaque animal subit une seule intervention et à l'issue de la procédure l'animal est mise à mort
Impact sur les animaux
Les effets indésirables possibles pour les animaux sont :- une douleur suite à la stéréotaxie ou injection - une souffrance liée à une monitoring insuffisant de l’anesthésie Si un animal présente des signes de souffrance, la procédure en cours sera immédiatement interrompue et l’encadrant prendra la décision adéquate pour l’animal (euthanasie si nécessaire)
Devenir
Mise à mort
Remplacement
Diverses méthodes ont été mises en œuvre au cours des formations règlementaires sans animaux pour remplacer l’animal. Néanmoins, à ce stade l’observation des réactions physiologiques lors de l’anesthésie et l’apprentissage de la chirurgie des tissus vivants ne peuvent être reproduits par des méthodes alternatives et restent indispensables pour finaliser une formation efficiente. C’est pourquoi le remplacement de l’animal n’est pas envisageable pour cette partie des travaux pratiques.
Réduction
Afin de réduire le nombre total d’animaux utilisés à des fins scientifiques, nous utilisons préférentiellement des animaux de réforme (sortis de procédures expérimentales légères ou modérées et dont l’état général n’est pas affecté, ou surnuméraires) ou de surplus d’élevage, qu’il est prévu d’euthanasier dans la semaine, issus de l’établissement d’accueil. Nous réduisons également au maximum le nombre d’animaux utilisés pour chaque stagiaire : au maximum 1 animal euthanasié 4 animaux vivants /stagiaire sur la semaine peuvent être requis pour le TP d’injection et pour s’entraîner à la chirurgie sur animal mort). Chaque animal est optimisé pour l’apprentissage de la stéréotaxie et injection
Raffinement
En termes de raffinement, nous nous efforçons toujours de limiter au maximum le stress des animaux en commençant les travaux pratiques sur animaux vivants que lorsque le stagiaire est prêt. Dans l’attente, les animaux sont gardés dans une salle d’hébergement et ne sont amenés en salle de travaux pratiques qu’au dernier moment (20 min avant début de l’intervention) Toutes les techniques enseignées font d’abord l’objet d’une démonstration et d’un apprentissage sur support inerte, vidéo et animal mort afin de remplacer l’animal vivant par des méthodes alternatives tant que l’apprentissage des gestes n’est pas suffisamment bien maîtrisé pour pratiquer sur animal vivant. Pour limiter toute douleur peropératoire, un analgésique adapté est administré aux animaux opérés dès l’induction de l’anesthésie et sa durée d’action couvre la totalité de la procédure chirurgicale. Les animaux sont euthanasiés dès la fin de la chirurgie et observation des phases du réveil, leur évitant ainsi toute douleur post-opératoire. Enfin, l’encadrant veille tout au long de la séance de travaux pratiques au respect de l’éthique et de la bientraitance des animaux, il sensibilise en continu les stagiaires au raffinement des techniques (manipulation atraumatique et aseptique des tissus, lutte contre l’hypothermie, soins post-opératoires…) Les personnes encadrant les travaux pratiques sont particulièrement attentives à tout signe de douleur ou de détresse. Si un animal présente des signes de souffrance, la procédure chirurgicale en cours sera immédiatement interrompue et une personne compétente prendra la décision adéquate pour l’animal (euthanasie si nécessaire).
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des mammifères. L’organisation du système nerveux central de cette espèce est proche de celle de l’homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l’espèce humaine a. De plus, ce modèle nous permet d'utiliser les modèles transgéniques d'intérêt une fois le stagiaire est formé. Les animaux sont au stade adulte, à partir de 8 semaines ou au delà, leur âge n’a pas d’importance pour ce projet.
Utilisation de modèles du syndrome des ovaires polykystiques spontané ou induit par surcharge androgénique chez les rongeurs, pour l’étude de composés pharmacologiques
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
Rats : 2680
2 680 souris et 2 680 rats vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une surcharge d'hormones androgènes leur est administrée chaque jour pendant une à vingt-quatre semaines, par voie orale, par injection ou par implant sous-cutané à libération prolongée, pour reproduire un syndrome des ovaires polykystiques. Les femelles subissent en plus un frottis vaginal quotidien pendant quatorze à vingt-huit jours consécutifs, des prélèvements de sang et d'urine hebdomadaires, et pour certaines une mise à l'accouplement de deux semaines suivie d'une gestation menée à terme. Provoquer l'infertilité ne devrait pas, selon le porteur, entraîner d'autres effets indésirables, et tous les animaux seront tués parce que le prélèvement des ovaires est jugé "indispensable" pour établir l'effet d'un traitement.
Objectifs
Le syndrome des ovaires polykystiques (SOPK) est la maladie hormonale la plus fréquente chez les femmes en âge de procréer, touchant environ une femme sur dix dans le monde. Il se caractérise par un dérèglement hormonal, une production excessive d’androgènes (comme la testostérone), des règles irrégulières et la formation de follicules inachevés dans les ovaires. Le SOPK est l’une des principales causes d’infertilité. L’origine du SOPK n’est pas clairement identifiée, mais elle est probablement multifactorielle (génétique, épigénétique, environnementale). Un lien est souvent rapporté entre l’excès d’androgènes, la résistance à l’insuline et l’obésité, avec environ 35 à 50 % des patientes avec un SOPK qui sont obèses. Les symptômes varient selon les personnes : pilosité excessive, perte de cheveux, acné, règles irrégulières ou absentes. Ces symptômes évoluent avec l’âge, l’hypersécrétion des androgènes aggravant la résistance à l’insuline. Le SOPK augmente aussi le risque de syndrome métabolique (surpoids, dyslipidémie, hypertension, troubles de la glycémie), conduisant à l’insulinorésistance, au diabète de type 2 et aux maladies cardiovasculaires. Il accroît également le risque de cancer de l’endomètre. Le SOPK est une maladie chronique, et actuellement incurable. La prise en charge des patientes vise à améliorer les symptômes par des changements de mode de vie et ou des traitements médicamenteux. La recherche médicale est donc très active, cherchant à comprendre les dysfonctionnements et à développer de nouveaux traitements, notamment des traitements curatifs. Des modèles animaux de SOPK sont décrits dans la littérature, principalement chez les rongeurs. Ceux-ci sont développés via des modifications génétiques, des manipulations environnementales (exposition au stress ou lumière constante) ou l’induction de taux élevés d’hormones sexuelles, parfois combinée à l’induction du diabète (lignée de rongeurs diabétiques ou alimentation riche en graisses (type Western ou High-fat-diet, HFD). Ce projet vise à développer des modèles animaux de SOPK spontané (certaine souche de rat) ou induit par surcharge androgénique, afin de mieux comprendre la physiopathologie du SOPK et de contribuer à la recherche de nouveaux traitements, curatifs ou symptomatiques. Ces modèles animaux chez les rongeurs sont décrits comme mimant le SOPK chez la femme, et répondant aux critères diagnostic de la maladie (critères de Rotterdam).
Bénéfices attendus
Selon l’Organisation mondiale de la santé, le SOPK est un problème de santé publique important et l’un des troubles hormonaux les plus courants chez les femmes en âge de procréer. La maladie touche environ 8 à 13 % des femmes en âge de procréer. Les effets biologiques et psychologiques du SOPK, en particulier ceux liés à l’obésité, à l’image du corps et à l’infertilité, peuvent entraîner des problèmes de santé mentale et une stigmatisation sociale. D’après l’Institut national de la santé et de la recherche médicale (Inserm, dossiers SOPK), un des enjeux de la recherche sur le SOPK est le développement de nouveaux traitements qui permettraient de résoudre toutes les complications à la fois, en s’attaquant à la cause du problème et non à chacun des symptômes séparément. Ce projet de recherche permettrait la mise en place d’un modèle robuste et valide de SOPK chez le rat et la souris. Ensuite, l’évaluation de nouveaux traitements du SOPK sur ces modèles animaux, donc une preuve de concept préclinique, avant les essais chez l’homme.
Procédures
Pour l’induction du SOPK, les animaux vont recevoir un traitement par des hormones sexuelles ou autres molécules entraînant un déséquilibre hormonal. Ce sera une administration par jour par voie orale ou parentérale, ou via un dispositif sous-cutané permettant une libération prolongée, pendant 1 à 24 semaines. En plus, les animaux vont aussi recevoir une administration (voie selon la molécule à étudier) du composé à analyser, d’un contrôle négatif (souvent le véhicule du composé à tester) et d’une molécule de référence. La fréquence et la durée du traitement dépendra du composé à tester (une ou plusieurs fois par jour pendant 1 à 24 semaines). Des frottis vaginaux seront réalisés chez les animaux, une fois avant le début des traitements, puis une fois par jour pendant au moins 14 jours consécutifs (28 jours au maximum) afin de déterminer la présence de SOPK. Un test de fertilité par accouplement peut être réalisé afin d’observer le déroulement de la gestation. Les femelles seront mis en accouplement pendant 2 semaines au maximum et la gestation sera mené à terme (environ 3 semaines). Enfin, si le protocole le requiert, des prélèvements de sang et d’urines pourront être envisagés jusqu’à une fois par semaine pendant la durée de l’étude. Chaque prélèvement, réalisé par des personnels tutorés, durera moins de 3 minutes
Impact sur les animaux
L’administration des composés, la réalisation des frottis vaginaux et les prélèvements sanguins peuvent entraîner un stress et/ou une sensation d’inconfort passager chez les animaux. L’excès d’hormones androgènes et la formation des petites follicules ovariens immatures entraîneraient une infertilité mais ne devraient pas provoquer d’autres effets indésirables chez les animaux. Le test d'accouplement peut engendrer un léger stress et anxiété au début, lors de l'acclimatation avec le mâle.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure. En effet, un prélèvement des ovaires est indispensable pour mettre en évidence le SOPK et l’efficacité ou non d’un traitement.
Remplacement
Il n’existe à ce jour aucun modèle in vitro pertinent permettant d’évaluer l’efficacité d’un principe actif sur le SOPK. En effet, le syndrome est le résultat d’un ensemble de désordres hormonaux et tissulaires, faisant appel à l’axe hypothalamo-hypophysaire et atteignant en même temps le cerveau et les organes.
Réduction
La réalisation des études se fera de façon à limiter le plus possible le nombre d’animaux utilisés. Une étude pilote sera réalisée pour la validation du modèle. L’évaluation d’un nouveau traitement se fera seulement lorsqu’un modèle robuste et valide sera obtenu. Comme utilisé par les autres équipes de recherche dans la littérature, le nombre d’animaux par groupe sera entre 5 et 8 au début du projet. Ce nombre sera ensuite affiné après la récolte des premières données avec des tests statistiques. Si un test d’accouplement est réalisé, les rats mâles seront réutilisés dans la mesure du possible afin de limiter leur nombre. Une réduction du nombre d’animaux en testant 2 composés à la fois sera mise en place lorsque cela s’avèrera possible, afin d’éviter des tests en doublon pour les groupes non traités ou traité par molécule de référence. Des tests statistiques seront aussi réalisés pour comparer les paramètres mesurés dans les groupes d’animaux étudiés. Pour une petite population, le t-test non apparié sera utilisé pour les comparaisons 2 à 2 et une analyse de variance à 1 ou 2 facteurs pour les comparaisons multiples.
Raffinement
Une réduction de la douleur, la souffrance et l’angoisse est mise en place dès que cela est possible. Les animaux sont hébergés en groupe dans les cages (2 rats et jusqu’à 5 souris) afin de favoriser leur interaction sociale et réduire leur stress. De plus, un suivi quotidien de tous les rats sera réalisé par les zootechniciens (observation comportement, état de santé général et état sanitaire de leur cage). Des points limites adaptés ont été fixés pour la réalisation du projet. L’atteinte d’un point limite sera signalé par le zootechnicien à un responsable des soins et au responsable du projet. Le cas échéant, si les symptômes sont réversibles, l’animal sera sorti de l’expérience et des procédures de soins peuvent être mis en place avant une éventuelle ré-inclusion dans l’étude. Si les symptômes sont irréversibles, l’animal sera euthanasié. Toute décision (sortie de la procédure en cours, soins ou euthanasie) sera prise en concertation avec le responsable du projet, le vétérinaire référent, et/ou le responsable de la structure du bien-être animal (SBEA) et/ou le responsable de la plateforme animalerie.
Choix des espèces
Le choix du modèle animal est guidé par le souci d’utiliser un nombre minimum d’animaux, les moins sensibles du point de vue neurophysiologique et présentant le maximum de chance d’obtenir des résultats satisfaisants. Les rongeurs, que ce soit le rat ou la souris, sont ainsi le modèle le plus utilisé en recherche dans les modèles de SOPK. En effet, les rongeurs ont aussi un axe hypothalamo-hypophysaire qui régule le taux hormonal, qui est essentiel dans l’étiologie du SOPK. Malgré l’absence de menstruation chez la femelle, le suivi du cycle œstral permet d’observer une perturbation de l’ovulation. De plus, le cycle oestral dure seulement 4 à 5 jours chez les rongeurs, permettant d’observer rapidement une perturbation ou l’efficacité d’un traitement. Les animaux seront utilisés à l’âge prépubère (3-4 semaines d’âge) ou à l’âge adulte. En effet, il a été décrit que l’excès d’hormones androgènes à l’âge prépubère, voire intra-utérin, reproduirait mieux les symptômes du SOPK qu’à l’âge adulte.
Exploration de la neuroinflammation dans la neuropathie périphérique chimio-induite : étude sur modèles animaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
Diarrhée, pâleur des extrémités, déshydratation, perte de poids, état du pelage, prostration : une grille de score décide à quel moment le rat quitte l'étude pour être tué au CO2. 288 rats sont soumis à des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour des prélèvements sanguins et tissulaires. Chacun reçoit jusqu'à huit injections intraveineuses d'anticancéreux sur 25 jours et jusqu'à vingt gavages quotidiens de la molécule testée, avec des tests hebdomadaires mesurant l'allodynie tactile et thermique, c'est-à-dire le seuil auquel un contact non douloureux devient douloureux. Le porteur reconnaît que des rats plus âgés seraient mieux corrélés à la clinique humaine, le cancer étant une maladie du sénior, mais indique qu'ils coûtent cher et sont rarement utilisés dans la littérature.
Objectifs
La neuropathie périphérique chimio-induite est un effet indésirable caractéristique des anticancéreux neurotoxiques. Cette neuropathie est la conséquence d'une altération des nerfs des patients et se caractérise par des fourmillements, des picotements et des douleurs distales et symétriques, altérant la qualité de vie des patients, et pouvant perdurer longtemps après la fin des traitements anticancéreux. La prise en charge thérapeutique est très limitée (aucun traitement préventif recommandé et un seul médicament modérément recommandé pour les douleurs associées). Des travaux récents ont mis en évidence l’activation de processus inflammatoires sur des modèles animaux de neuropathies périphériques chimio-induites, avec notamment des modifications de la concentration de marqueurs sanguins pro- ou anti-inflammatoires chez des rats exposés à des anticancéreux neurotoxiques. Ces perturbations ouvrent la piste de la neuroinflammation dans le contexte de ce type de neuropathie. La neuroinflammation et le système immunitaire sont des pistes particulièrement explorées aujourd’hui dans le contexte de la douleur neuropathique contribuant à son maintien au cours du temps, et représentant de nouvelles cibles thérapeutiques. Une nouvelle molécule ciblant ces processus neuro-inflammatoires représenterait un candidat médicament intéressant. De plus cette molécule a déjà été testée dans le contexte de la douleur chez la souris et du cancer chez le rat, et représente ainsi un ligand particulièrement intéressant pour évaluer le rôle du système immunitaire dans le contexte de la douleur neuropathique. L’objectif du projet sera de mesurer l’effet préventif et analgésique de cette molécule chez l’animal vivant (modèles de neuropathies périphériques chimio-induites).
Bénéfices attendus
Ce projet propose d’étudier de nouvelles cibles de traitement des neuropathies périphériques chimio-induites chez l'animal ciblant la neuroinflammation. Rappelons qu’à ce jour la prise en charge de ces neuropathies chez les patients est très limitée, avec aucune stratégie préventive recommandée et un seul médicament modérément recommandé pour le traitement des douleurs neuropathiques associées. Ainsi ce projet pourrait ouvrir de nouvelles perspectives de traitement et de prévention des neuropathies périphériques chimio-induites.
Procédures
Tous les animaux recevront des injections d’anticancéreux. Le nombre total d’injections sera de 8 sur 25 jours pour deux modèles animaux et de 5 sur 9 jours pour un autre modèle animal, par voie intraveineuse, et durée des injections de 10 secondes (max). Tous les animaux recevront des gavages oraux quotidien de la molécule à l’étude pour une évaluation des effets préventifs (20 gavages sur 25 jours pour deux modèles animaux, et 8 gavages sur 9 jours pour un modèle animal), et pour une évaluation des effets analgésiques (3 gavages sur 3 jours pour tous les animaux). Tous les animaux seront suivis par des tests comportementaux hebdomadaires et jusqu’à la fin des injections. Les tests comportementaux dureront au maximum 60 minutes pour un animal.
Impact sur les animaux
La neuropathie induite par les anticancéreux sera associée à des douleurs modérées de type allodynie (stimulus non douloureux chez l'animal sain, ex : sensibilité tactile et thermique). Les administrations répétées d’anticancéreux seront responsables d’une diminution du gain de poids des animaux par rapport aux animaux contrôles. Pour chaque animal, les points limites seront contrôlés à l’aide d’une grille (voir annexe), et explorant : diarrhée, pâleur des extrémités, déshydratations, point d’injection, perte de poids par rapport à la dernière mesure, yeux, pelage, activité spontanée, et locomotion. Selon le score obtenu par l’animal (points limites), l’animal sera retiré du projet pour une euthanasie rapide par inhalation de CO2.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue des études afin d’effectuer des prélèvements sanguins et tissulaires.
Remplacement
Ce type d'étude sur modèle animal de neuropathie périphérique chimio-induite n'est pour le moment pas encore remplaçable par des modèles in vitro. Des travaux sont en cours sur cellules souches humaines de neurones ou organoïdes. Mais ces modèles in vitro ne permettent pas encore d'appréhender la complexité de la physiopathologie de ces neuropathies, qui n'est-elle même pas encore complètement élucidée. Enfin, s'agissant d'une étude sur la douleur neuropathique, l'animal vivant est encore nécessaire pour explorer, évaluer et valider les troubles nociceptifs par le biais de tests comportementaux.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire pour ce projet sera réduit au minimum. Généralement nous travaillons avec des groupes de n=12 animaux. Dans ce type d'étude exploratoire, il est difficile de réduire le nombre d'animaux au risque de ne pas pouvoir conclure (perte du bénéfice de l'étude et utilisation inutile des animaux). L'approche statistique reposera sur une méthodologie en bloc d'animaux (n=12). Cet effectif tiendra compte de la variance des paramètres étudiés et de la puissance des tests statistiques. Avec ces effectifs, sur les tests comportementaux, des tailles d’effet importantes supérieures à 1 sont attendues (différence des moyennes entre les groupes de l’ordre de 20 points pour un écart-type de 10), assurant une bonne qualité des résultats.
Raffinement
Les tests comportementaux utilisés dans ce projet sont eux aussi bien maitrisés par le personnel technique de notre unité de recherche. Les troubles nociceptifs seront explorés chez l’animal au moyen de tests comportementaux mesurant les seuils d’allodynie tactile ou thermique (stimulus non douloureux perçu comme douloureux), plutôt que des seuils d’hyperalgésie (stimulus douloureux). L’allodynie est un symptôme plus proche de la clinique humaine, et offre une démarche de raffinement et éthique vis-à-vis de l’animal de laboratoire (stimulation nociceptive moins intense). Les animaux seront stabulés dans des conditions standards de 3 animaux par cage (800 cm²), dans une salle climatisée (température 22+/-2°C et hygrométrie 50+/-10%) avec un cycle 12:12 et un libre accès à la boisson et à la nourriture. Pour chaque animal, les points limites seront contrôlés à l’aide d’une grille, et explorant : diarrhée, pâleur des extrémités, déshydratations, point d’injection, perte de poids par rapport à la dernière mesure, yeux, pelage, activité spontanée, et locomotion. Selon le score obtenu par l’animal (points limites), l’animal sera retiré du projet pour une euthanasie rapide par inhalation de CO2.
Choix des espèces
Le rat Sprague-Dawley est habituellement utilisé pour ces travaux portant sur les neuropathies périphériques chimio-induites. D’autres travaux de l’équipe sur cette thématique ont eu recours à la même espèce et souche, ce qui permet de bénéficier d’une expertise et de données antérieures. Enfin, le rat Sprague-Dawley possède une activité et un comportement spontanée tout à fait adaptés à l’étude de la douleur au travers de tests comportementaux. Les animaux seront agés de 8 semaines à la réception à l'animalerie, et ils auront 1 semaine d'acclimatation, pour avoir un âge d’environ 9 semaines au début des expérimentations. L’âge de 6-9 semaines est communément choisi pour ce type de projet. A noter que des animaux plus âgés (voire « âgés ») pourraient être pertinents car mieux corrélés à la clinique humaine (cancer = maladie du sénior), mais ces animaux âgés ont un coût important et sont rarement utilisés dans la littérature scientifique.
Evaluation de la capacité de l’hespéridine à moduler les fonctions biologiques des vésicules extracellulaires après un repas
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Cinq prises de sang de six gouttes, une par heure, puis six autres prélèvements et une injection intraveineuse tous les quatre jours pendant deux semaines : 368 rats sont soumis à des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, et tous tués pour prélever leur sang, leur aorte et leur cœur. La question posée porte sur les vésicules extracellulaires libérées après un repas et sur la capacité d'un polyphénol, l'hespéridine, à en modifier la quantité et le contenu. Le porteur reconnaît que les ponctions répétées de la queue peuvent laisser des bleus et une irritation, et qu'une manipulation excessive de cette queue perturbe la régulation de la température de l'animal. Le choix de rats de 8 à 12 semaines est présenté comme un geste éthique, l'argument étant que des individus physiologiquement stables réduisent la variabilité et donc le nombre d'animaux non-humains à utiliser.
Objectifs
Le stress nutritionnel après le repas est connu pour être à l’origine d’altérations transitoires dans le fonctionnement normal du métabolisme, mais que répétées dans le temps, sont associées au développement des maladies métaboliques et cardiovasculaires. D’autre part, il est connu que des petites vésicules libérées par toutes les cellules de l’organisme peuvent se retrouver dans le sang et sont impliquées dans le bon fonctionnement du corps. De plus, une augmentation du taux circulant de ces vésicules est associée avec l’apparition de maladies métaboliques et cardiovasculaires. Cependant, l’effet des vésicules produites après un repas sur les fonctions cardiovasculaires est peu connu. Des approches nutritionnelles à base d’aliments végétaux riches en composés naturels appelés polyphénols, connus pour leurs bienfaits sur la santé, se sont avérées capables de réduire l’élévation du taux de ces vésicules extracellulaires lors de désordres cardio-métaboliques. Toutefois, l’impact quotidien de notre alimentation et de ces constituants végétaux sur la libération des vésicules extracellulaires après un repas et leurs activités biologiques n’est pas connu. Ce projet fait l’hypothèse selon laquelle les polyphénols apportés par la composante végétale de notre alimentation peuvent impacter favorablement la biologie des vésicules extracellulaires après un repas notamment en réponse à un stress nutritionnel. Pour répondre à cela, le premier objectif est de caractériser de façon fine les vésicules extracellulaires libérées (origine cellulaire et contenu) à la suite d’un stress après un repas et de déterminer les constituants permettant d’identifier spécifiquement les vésicules extracellulaires post-repas. Le projet a également pour but de déterminer le rôle biologique des vésicules extracellulaires post-repas, notamment sur certaines fonctions cardio-métaboliques. À partir des connaissances ainsi générées, nous pourrons évaluer la capacité de certains polyphénols à moduler la libération, le contenu et les fonctions biologiques des vésicules extracellulaires produites après un repas.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet est un prérequis à la compréhension du rôle des vésicules extracellulaires post-repas dans les effets de notre alimentation, et tout particulièrement de la composante en polyphénols des produits végétaux, sur notre physiologie et notre santé. Dans son ensemble, le projet permettra d’apporter un éclairage nouveau sur la réponse post-repas et son rôle primordial dans la mise en place des désordres cardiométaboliques.
Procédures
- Gavage (1 fois/animal, < 1 minute), - Prélèvement de sang pour doser les vésicules extracellulaires (5 prélèvements de 6 gouttes de sang par animal, 1 prélèvement/heure, durée de chaque prélèvement < 1 minute). - Supplémentation de la nourriture avec de l’hespéridine (durée acte : 4 semaines), - Injection intraveineuse (1 injection tous les 4 jours pendant 2 semaines, durée de chaque injection < 5 minutes), - Prélèvement de sang pour étude métabolique (6 prélèvements d’une goutte de sang par animal, durée de chaque prélèvement < 1 minute).
Impact sur les animaux
1. Gavage : Les animaux peuvent ressentir une gêne passagère lorsqu’un petit tube est introduit dans leur gorge pour administrer une substance. Cette procédure peut être un peu stressante, car elle nécessite de tenir l’animal immobile pendant un court moment. Si elle n’est pas faite correctement, elle pourrait provoquer de petites irritations internes. 2. Injections dans la queue : Les injections dans une veine de la queue peuvent provoquer une légère douleur au moment de la piqûre. Si plusieurs tentatives sont nécessaires, cela peut être un peu plus désagréable pour l’animal et entraîner une légère irritation ou un petit bleu. Dans certains cas, l’animal peut lécher ou mordiller la zone concernée. 3. Prises de sang dans la queue : Comme pour les injections, cette procédure nécessite de maintenir l’animal immobile, ce qui peut être stressant. La piqûre peut provoquer un léger inconfort, et des bleus ou une irritation peuvent apparaître si les prélèvements sont répétés trop souvent. Une manipulation excessive de la queue peut aussi perturber la régulation naturelle de la température chez l’animal.
Devenir
A la fin du protocole, des prélèvements de tissus (sang, aorte, cœur) seront effectués sur les animaux euthanasiés afin d’analyser les effets cardiovasculaires et métaboliques de l’étude.
Remplacement
Il n’existe pas actuellement d’autres méthodes permettant d’obtenir les mêmes informations sans utiliser d’animaux vivants. Pour comprendre comment le stress après un repas agit sur l’organisme, et comment certains composés comme les polyphénols peuvent influencer la circulation de petites particules appelées vésicules extracellulaires, il est nécessaire d’observer ces réactions directement dans un organisme vivant. Cela permet d’étudier des phénomènes complexes qui ne peuvent pas être reproduits en laboratoire autrement.
Réduction
Nous avons réduit le nombre d’animaux à celui requis pour obtenir une validation statistique des résultats en utilisant des données préliminaires de notre laboratoire pour une procédure similaire de gavage chez le rat. Le nombre d’animaux à inclure dans chaque groupe expérimental a été déterminé à l’aide d’un logiciel statistique pour déterminer le minimum numéro d’animaux nécessaire pour assurer la validité des résultats obtenues.
Raffinement
Pour favoriser la socialisation des animaux, nous placerons au maximum trois animaux par cage. Nous avons raffiné nos approches afin de minimiser la détresse imposée aux animaux, qui seront hébergés dans un environnement enrichi répondant à leurs besoins physiques et comportementaux. Dans la cage, les animaux auront à leur disposition des tubes en plastique opaque pour se cacher, grimper et faciliter leur accès à la nourriture. L’état de santé des animaux sera évalué régulièrement par l’expérimentateur (au moins une fois par semaine) pendant toute la durée du protocole, en observant leur comportement. Si une douleur est anticipée ou si les animaux présentent des signes pouvant suggérer du stress ou de la douleur après une manipulation, une grille de scoring spécifique avec des seuils prédéfinis sera appliquée. Le cas échéant, des médicaments appropriés (anesthésiques ou analgésiques) seront administrés, conformément aux recommandations vétérinaires et aux bonnes pratiques en expérimentation animale. Le suivi de ces animaux sera alors effectué quotidiennement dès l’apparition de ces signes. Si l’animal se rétablit, le suivi régulier sera repris jusqu’à la fin de la procédure. En revanche, si son état se détériore, le seuil limite sera appliqué et une euthanasie sera réalisée.
Choix des espèces
Le choix de l'espèce est basé sur notre connaissance de ce modèle, ainsi que sur la disponibilité de données dans la littérature associées à un stress après un repas de courte durée. Les rats âgés de 8 à 12 semaines sont dans une phase de développement adulte jeune, ce qui les rend physiologiquement plus stables et donc plus fiables pour les expériences. À cet âge, ils ont dépassé les changements hormonaux liés à la puberté et ne sont pas encore affectés par les effets du vieillissement, ce qui permet d'obtenir des résultats plus cohérents et précis. D'un point de vue éthique, cette tranche d'âge respecte les principes de la science responsable. En effet, les rats à ce stade sont plus stables physiologiquement, ce qui permet de réduire les variations entre les individus et de mieux contrôler les expériences. Cela permet aussi de réduire le nombre d'animaux nécessaires tout en obtenant des résultats fiables. Choisir des rats à ce stade évite l'utilisation d'animaux trop jeunes, plus vulnérables, ou trop âgés, susceptibles de présenter davantage de risques. En résumé, l'utilisation de rats adultes jeunes garantit des résultats plus fiables tout en assurant leur bien-être et en réduisant le nombre d'animaux utilisés pour l'expérience.
Tutorat sur les gestes techniques peu invasifs utilisés dans les procédures expérimentales sur le modèle rongeur
- Formation professionnelle
Rats : 10
Nés dans l'élevage de l'établissement avec un génotype inutilisable pour ses projets de recherche, 350 souris et 10 rats étaient de toute façon promis à la mise à mort. Ils vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, pour entraîner du personnel aux gestes techniques, et tués à l'issue. Chaque animal peut recevoir jusqu'à trois types de gestes différents sur des jours distincts pendant trois semaines, administration orale, injections sur animal vigile ou anesthésié, deux prélèvements sanguins au maximum, et jusqu'à trente minutes d'anesthésie pour l'apprentissage de l'échographie. Le porteur indique qu'un apprentissage préalable sur mannequins sera proposé aux apprenants pour fixer la technique, sans le rendre obligatoire avant le passage sur les animaux.
Objectifs
Ce projet est consacré à l’entrainement du personnel sur les gestes techniques nécessaires à la bonne réalisation des procédures expérimentales, sur les espèces déclarées dans les projets de recherche de l’établissement. En complément de la formation, initiale le programme du tutorat permet d’assurer le niveau de compétence requis pour la qualification au poste de travail. Ce programme inclut la formation aux aspects pratiques et aux gestes techniques sur les espèces concernées par le poste de travail. Un entrainement régulier et une bonne compétence du personnel sont indispensables à une réalisation efficace des études, augmentant la fiabilité des résultats, et respectant le bien-être animal par la pratique de gestes maitrisés. La formation aux différents gestes techniques peu invasifs sera mise en place dans ce tutorat. Les tutorés seront supervisés dans l’accomplissement de leurs tâches par un tuteur présentant les qualifications et l’expérience adéquates, jusqu’à ce qu’ils aient démontré qu’ils possèdent les compétences requises. Ce programme de tutorat sur différents gestes techniques permettra de 1-donner les éléments théoriques sur la bonne réalisation du geste en respectant le bien-être des animaux, 2-réaliser des démonstrations par le tuteur, 3-mettre en pratique sous surveillance rapprochée, 4-valider la compétence et l’autonomie du tutoré.
Bénéfices attendus
Ces sessions de formation sur l’animal permettront une amélioration de l’apprentissage des concepteurs et applicateurs concernant les gestes de base et puis secondairement plus complexes sur le vivant. Les enseignants seront présents pour parfaire les gestes des apprenants, discuter et faire un « debriefing » à chaque fin de séance. Ces sessions viendront compléter les formations reçues au préalable par l’apprenant. L’avantage de la formation par tutorat est de pouvoir acquérir des gestes plus assurés et efficaces pour améliorer le confort des animaux avec une diminution du temps d’exécution des gestes, une contention ou anesthésie d’une plus courte durée et une meilleure récupération des animaux qui seront utilisés dans les futurs projets. Un entrainement régulier et une bonne compétence du personnel, sont indispensables à une réalisation efficace des études, augmentant la fiabilité des résultats, et respectant le bien-être animal par la pratique de gestes maitrisés.
Procédures
Les gestes concernés par ce tutorat seront des techniques d'administrations avec le geste d'administration orale, les techniques d'injections sur animaux vigiles ou anesthésiés et l'apprentissage du suivi des animaux en echographie. Trois types de gestes techniques peu invasifs pourront être réalisés au maximum sur un même animal sur des jours différents. Un interval de minimum 3 jours sera à respecter entre les séances de formation. Les prélèvements de sang seront limités à un prélèvement par semaine pour un maximum de 2 prélèvements par animal. Les animaux entrant en procédure pourront être utilisés pendant 3 semaines. Ils seront pesés avant de commencer la procédure et chaque geste technique. Les gestes d'administration et injection peuvent occasionner un stress ou douleur de faible intensité de trés courte durée (quelques secondes). Pour l'acquisition en echographie, il n'y a aura pas de douleur car aucune injection mais les animaux peuvent rester sous anesthésie 30 minutes.
Impact sur les animaux
L'ensemble des procédures seront légères, les gestes qui le nécessitent seront réalisés sous anesthésie pour limiter le stress des animaux. Lors des contentions les animaux même habitués peuvent avoir un léger stress. L’introduction d’une aiguille lors des gestes d’injection et prélèvements peut occasionner une très légère douleur de courte durée.
Devenir
Les animaux utilisés dans cette procédure de formation sont des animaux surnuméraires d'élevage ayant un génotype non adéquat pour les projets de recherche de l'établissement et sont donc destinés à l'euthanasie. Ils ne pourraient pas être réutilisés pour d'autres études ni être replacés.
Remplacement
Ce projet consiste à former les personnels aux gestes techniques sur animaux vigiles, il ne sera donc pas possible de remplacer completement le modèle animal dans ce projet. Mais il sera proposé aux apprenants de débuter par un apprentissage théorique sur des mannequins pour fixer la technique avant de passer à la réalisation des gestes sur animaux. Ainsi des entrainements sur supports inertes pourront être réalisés afin que les apprenants puissent se concentrer ensuite sur les gestes techniques
Réduction
Un nombre minimal d'animaux est prévu pour assurer un bon enseignement à chacun des participants et la possibilité de renouveler les phases de tutorat. En effet, l’acquisition des compétences nécessite de pouvoir répéter les gestes techniques pour que la personne atteigne le niveau de compétence requis. Ce niveau de compétence est évalué par le formateur, lors des séances de tutorat. Le nombre d’apprenants choisi sera fait avec soin et limité pour un meilleur apprentissage, suivi et maintien des compétences. Des essais sur mannequins pourront être faits avant de passer sur l'animal pour réduire le nombre d’animaux utilisés. Plusieurs procédures pourront être réalisées sur le même animal pour limiter le nombre d’animaux. Les animaux utilisés pour ce projet ne seront pas générés pour ces études car nous réutiliserons des animaux de nos élevages destinés à l’euthanasie.
Raffinement
Les animaux de ce projet seront acclimatés à leur salle d’expérimentation et hébergement et habitués à la présence des apprenants au minimum 5 jours avant le début des procédures pour limiter le stress généré lors de leur préparation. Une étape cruciale avant de réaliser les gestes techniques peu invasifs sera d'apprendre et de maitriser la préhension et la contention des animaux. En effet la contention correcte des animaux est déterminante pour la qualité des administrations à réaliser ensuite chez les animaux. Une première partie du tutorat pourra être réalisée sur modèles inertes pour fixer la technique des apprenants avant de passer sur l'animal. L’apprentissage du maintien de l’anesthésie, de l’analgésie et du monitoring sera également enseignée et à maîtriser avant de passer à une procédure complète d’acquisition sur animaux vivants anesthésiés ou vigiles. Une attention particulière sera également faite sur le suivi des animaux et leur observation (reconnaissance des signes de douleurs, pesée à l'aide d'une grille de score). En effet le suivi des animaux en expérimentation repose sur la capacité à savoir reconnaitre des signes de souffrance et remplir correctement une grille de score. Cette étape sera donc vérifiée en tutorat.
Choix des espèces
Les apprenants seront formés sur les rats ou souris en fonction du modèle d’étude choisi dans leurs procédures expérimentales. Les animaux utilisés pour ce tutorat seront des adultes à partir de 8 semaines. Ce seront des animaux surnuméraires d'élevage sevrés et ayant effectués une période d'habituation avant de débuter les formations. Attendre un âge de 8 semaines permettra d'avoir des animaux aldultes suffisamment habitués et manipulés avec un poids correct pour débuter les formations.
Administration intrathécale et prélèvement de LCR chez le rongeur, dans le cadre de formations, et d’études de toxicologie, pharmacologie et pharmacocinétique.
- Formation professionnelle
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 965
965 souris et 965 rats vont être utilisés, chacun subissant une chirurgie de vingt à trente minutes pour poser un cathéter au contact de la moelle épinière. Le niveau de souffrance déclaré est sévère et tous sont tués à l'issue. Le porteur indique que l'intervention peut provoquer une hémorragie pendant l'opération, une infection, une douleur prise en charge à la buprénorphine, ainsi qu'une paraplégie ou une parésie qui conduira à la mise à mort de l'animal, risque qu'il rattache en particulier aux séances de formation. Le chiffre de trois milliards de personnes atteintes d'une maladie neurologique ouvre la justification d'un projet qui sert d'abord à entraîner des opérateurs et à conduire des études de toxicologie réglementaire.
Objectifs
L’établissement utilisateur est spécialisé dans la conduite d’études de toxicologie/pharmacologie réglementaires, lesquelles sont indispensables pour initier l’évaluation clinique d’un xénobiotique. Ce projet a pour objectif : • d’administrer par voie Intrathécale (IT) des composés ne passant pas, ou peu, la Barrière Hématoencéphalique (BHE), ou pour lesquels l’information n’est pas connue • prélever du liquide Céphalo-Rachidien (LCR) 1. Les maladies neurologiques : un important besoin médical non satisfait En 2023, plus de 3 milliards de personnes dans le monde étaient atteintes d’une maladie neurologique pour lesquels il n’existe aucun traitement satisfaisant. Elles constituent la principale cause de problèmes de santé et de handicap dans le monde, et provoquent un véritable drame humain, social et économique. 2. Le projet Du fait de la complexité des organismes vivants, il n’existe actuellement aucun modèle de remplacement pour prédire la toxicité d’un xénobiotique. Seule l’expérimentation animale permet de définir leur innocuité avant les premiers essais chez l’homme. De nombreux xénobiotiques, ne passant pas la BHE, doivent être administrés au contact direct du Système Nerveux Central (SNC) pour atteindre des concentrations efficaces. De même, le prélèvement de LCR est indispensable pour suivre un composé dans ce compartiment, et également comme outils de diagnostic (examens cytochimiques). Enfin, l’administration IT et les prélèvements simultanés de LCR et de sang permettent de caractériser le passage au travers de la BHE d’un composé, afin de déterminer si une autre voie d’administration, plus conventionnelle, est envisageable. A. Les techniques mises en œuvre Traitement IT : chez le rongeur, du fait de la petite taille des structures médullaires, l’administration intrathécale est réalisée à l’aide d’un cathéter sous-dural introduit après laminectomie et incision de la dure-mère. Prélèvement de LCR : il est réalisé par ponction percutanée dans la cisterna magna. B. Livrables Ce projet a deux composantes : 1- conduire un plan de formation initiale et continue pour des collaborateurs réalisant des administrations intrathécales et des prélèvements de LCR rat/souris 2- conduire des études nécessitant l’utilisation de ces voies d’administration ou de prélèvement chez le rat et la souris
Bénéfices attendus
En 2023, plus de 3 milliards de personnes dans le monde étaient atteintes d’une maladie neurologique pour lesquels il n’existe aucun traitement satisfaisant. Elles constituent la principale cause de problèmes de santé et de handicap dans le monde. Elles provoquent un véritable drame humain, social et économique. Le SNC est isolé du reste de l’organisme par la BHE, laquelle contrôle étroitement les échanges entre les compartiments sanguin et SNC. Cette barrière filtre et empêche le passage de nombreuses molécules thérapeutiques potentielles. De ce fait, les composés ne passant pas la BHE, doivent être administrés au contact direct du SNC pour atteindre des concentrations efficaces. La voie IT est le plus souvent privilégiée dans ce contexte. En parallèle des études d’efficacité, la toxicologie règlementaire permet de caractériser les effets toxiques d’un xénobiotique afin de sécuriser les essais chez l’homme. C’est l’objet premier de cette demande d’autorisation de projet. En effet, l’établissement utilisateur est spécialisé dans la conduite d’études de toxicologie/pharmacologie réglementaires. Dans ce contexte, la voie d’administration IT sera privilégiée afin de mimer la voie d’administration qui sera utilisée chez l’homme ou étudier les propriétés pharmacocinétiques d’un composé. Concernant les prélèvements de LCR : ils sont utilisés pour suivre le composé au cours du temps et établir son profil pharmacocinétique, déterminer son passage au travers de la BHE, mais aussi comme outils de diagnostic (examens cytochimiques). Donc, à court terme, le bénéfice premier de la mise en œuvre de ce projet sera l’établissement du profil toxicologique et pharmacocinétique d’un composé, après formation du personnel. A plus long terme, les données obtenues au travers des études de toxicologie réglementaire feront partie intégrante du dossier Européen IMPD (Investigational Medicinal Product Dossier), lequel permettra de motiver une demande d’essai clinique qui débouchera peut-être sur la commercialisation d’un nouveau médicament.
Procédures
Les animaux seront soumis à une chirurgie pour l'administration intratéchale d'un xénobiotique, ainsi que pour des prélèvements de liquides céphaloréchidiens (20 à 30 minutes d'intervention). Des prélèvements de sang pourront être effectué sous anesthésie légère ou vigiles dans le respect des recommandations (5 minutes par prélèvements environ).
Impact sur les animaux
Pratiqué correctement, l’administration IT et le prélèvement de LCR n’induisent pas de mortalité. Néanmoins, cela reste possible dans le cadre de la formation. Mais un apprentissage graduel, sous la supervision d’un tuteur, permettra de limiter au maximum ce risque. La chirurgie, nécessaire à l’implantation d’un cathéter sous dural, peut induire une hémorragie peropératoire. La pratique permettra de réduire, voire de supprimer ce risque. Ces techniques (administration/prélèvement) sont réalisées au contact de la moelle épinière. Il existe donc un risque de paraplégie/parésie qui conduiront à l’euthanasie des animaux. Comme tout acte invasif, un risque d’infection est présent. Il sera géré par l’asepsie locale et l’administration d’une antibiothérapie prophylactique. Une douleur peut également émerger. Elle sera gérée par anticipation à l’aide de buprénorphine. Le stress est inhérent à toute manipulation d’animaux. Il sera limité grâce à une phase d’habituation/acclimatation, un hébergement collectif et l’ajout d’enrichissements. En cas de signes d’infections, de signes neurologiques, ou d’effets toxiques importants liés à l’administration (perte de poids importante, inflammation sévère, douleur sévère, paraplégie) l’animal sera euthanasié afin de procéder à un examen anatomopathologique dans le cadre de l’étude de toxicité réglementaire, selon les recommandations de l’ICH/EMA.
Devenir
Les animaux seront euthansiés à la fin des procédures.
Remplacement
La toxicologie étudie les interactions entre un agent toxique potentiel (xénobiotique) et une ou plusieurs cibles. Ces interactions recouvrent les effets du xénobiotique, ou ses produits de dégradation, sur la ou les cibles, mais aussi l’action de la ou les cibles sur l’agent toxique. Une bonne compréhension des mécanismes de toxicité est donc indissociable d’une bonne connaissance des mécanismes physiologiques, développementaux, cellulaires et moléculaires. Actuellement, l’ensemble des cibles potentielles et les mécanismes conduisant à une toxicité ne sont pas complètement élucidés et ne peuvent donc pas être modélisés. Il n’existe donc pas de modèle de remplacement. C’est pour cela que la règlementation (lignes directrices Ides instances médicales et pharmacologiques) impose d’évaluer la toxicité potentielle d’un composé thérapeutique sur 2 espèces animales avant tout essais chez l’homme. Concernant la formation : l’utilisation d’animaux est nécessaire afin de s’assurer de la bonne maîtrise des gestes techniques qui seront exécutés pendant les études de toxicologie. Cela permet également de suivre l’état clinique des animaux après traitement intratéchal et prélèvement de LCR, et de s’assurer l’absence de biais expérimental. De plus, le manque actuel de modèle mimant de manière satisfaisante l'anatomie des animaux implique le recours à l’animal.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux dans les études de toxicologies : • nous nous assurerons de la validité et de la prédictivité des données acquises avant de démarrer toute expérimentation, pour ne pas évaluer des composés non pertinents • des études pilotes sont réalisées, de deux types : études MDT - dose maximale tolérée ; études DRF ou dose rang findings, pour détermine la plage de doses appropriée). Elles ont pour objectif d’évaluer graduellement la toxicité des composés et de rechercher les doses les plus prometteuses sur un nombre limité d’animaux (1/dose pour une MTD, de 3 à 5 pour une DRF) Concernant les études de toxicologie règlementaires : le nombre d’animaux par groupe est fixé dans les lignes directrices des instances médicales et pharmacologiques. Ce nombre est considéré comme le minimum acceptable permettant une interprétation pertinente des données et la caractérisation correcte des effets toxiques potentiels. Pour la formation : le nombre d’animaux utilisé sera le minimum suffisant pour garantir la maîtrise et la reproductibilité des gestes. Afin de réduire le nombre d’animaux à commander spécifiquement, ils seront autant que possible réutilisés d’autres procédures expérimentales (légère à modérée).
Raffinement
Le raffinement de nos procédures inclue : • la gestion du stress et de l’angoisse: les animaux seront acclimatés (animalerie, nouveaux congénères, environnements de test) pendant 7 jours, et habitués à la manipulation et à la contention. Ils seront également hébergés à 3 par cage au minimum, pour augmenter les interactions sociales, dans un environnement enrichi • la prise en charge précoce de la douleur : un même opérateur observera matin et soir chaque animal. La douleur sera objectivée en fonction de modifications de l'apparence, de la posture et du comportement. En parallèle, une échelle de douleur Grimace Scale sera employée. Dès les premiers signes de douleur, les animaux seront traités à la buprénorphine pendant 7 jours. • 2 évaluations cliniques quotidiennes : activité, poids, hydratation, transit, activité vésicale/infections urinaires, cicatrisation • des soins vétérinaires adaptés : compléments alimentaires, sérum physiologique, antibiotique, analgésique • l’intégration de points limites stricts : une grille précise d’évaluation sera utilisée afin d’anticiper la mise à mort si nécessaire. Dans tous les cas, l’ensemble des animaux seront mis à mort à la fin de l’expérimentation
Choix des espèces
Les études de toxicologie réglementaire in vivo sont régies par les lignes directrices des instances médicales et pharmacologiques. Ces études nécessitent l’utilisation d’au moins 2 espèces animales (rongeur et non rongeur). Le rat et la souris sont 2 espèces retenues pour ces études du fait de leur prédictivité. Les espèces non rongeurs font l'objet d'un projet particulier. A partir de 6 semaines, en accord avec les lignes directrices des instances médicales et pharmacologiques
Impact au cours du temps de la stimulation du nerf vague sur la pression artérielle, intracrânienne, la neuro-inflammation et la récupération motrice dans un modèle de lésion cérébrale chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Soumis à une lésion traumatique du cortex moteur et à une dissection du nerf vague, parfois accompagnées de la pose d'une électrode sur ce nerf et de capteurs de télémétrie, 720 rats mâles et femelles seront tous tués pour des prélèvements, notamment de leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Pour 80 d'entre eux, cela fait trois chirurgies et trois heures d'opération, et tous passent, avant et après la lésion, trois tests de motricité : le test du cylindre, le stepping et l'open field. 80 rats reçoivent chaque jour, pendant 3 à 31 jours, une stimulation du nerf vague, seuls dans le dispositif le temps de la séance, et 160 voient leur pression artérielle et leur rythme cardiaque enregistrés chaque jour pendant 31 jours, pour mesurer l'effet de la stimulation sur la récupération motrice et l'inflammation du cerveau. Le porteur pose comme question "à long terme" l'effet de cette stimulation sur l'efficacité d'une thérapie cellulaire, et aucune greffe de cellules ne figure parmi les procédures.
Objectifs
Chaque année en France, environ 150 000 personnes sont victimes d’un traumatisme crânien. 30% d’entre elles sont hospitalisées pour des lésions cérébrales consécutives à un choc. Par sa position anatomique, le cortex moteur est plus exposé aux lésions traumatiques que d’autres régions corticales. Les dommages dans cette région cérébrale vont entrainer des déficits moteurs avec une récupération fonctionnelle limitée. Chez la souris ayant subi une lésion cérébrale traumatique dans le cortex moteur, la transplantation cellulaire est une approche thérapeutique prometteuse. Néanmoins, l’efficacité de la greffe et la survie des neurones greffés nécessitent d’être optimisées. De plus, durant ces 10 dernières années, la stimulation du nerf vague (utilisée depuis plus de 20 ans en tant que traitement non pharmacologique de l’épilepsie chez l’Homme) est également apparue comme une thérapeutique prometteuse pour le traumatisme crânien. La question est donc de savoir, à long terme si une stimulation du nerf vague permet d’améliorer l’efficacité de la thérapie cellulaire dans un modèle de lésion corticale traumatique afin d’envisager une transposition de cette approche chez l’humain. La question à moyen terme est d’évaluer l’impact de stimulation du nerf vague sur la récupération motrice et cérébrale. Après un traumatisme crânien, la surveillance de la pression intracrânienne et artérielle est cruciale pour évaluer l'état neurologique du patient. Ainsi, en mesurant simultanément la pression artérielle et le rythme cardiaque par électrocardiogramme, nous pourrons déterminer si leurs fluctuations pendant la stimulation du nerf vague sont prédictives de la récupération motrice et cérébrale L’objectif de ce projet est donc de tester, chez le rat, les effets de la stimulation du nerf vague sur la lésion corticale traumatique tout en mesurant en continu la pression artérielle, l’activité cardiaque grâce à la télémétrie. Nous mesurerons les fluctuations de ces paramètres ainsi que des différents paramètres cérébraux afin de tester leur implication dans la récupération motrice après une lésion traumatique corticale.
Bénéfices attendus
La comparaison des effets d’une stimulation chronique ou aiguë du nerf vague sur l’inflammation cérébrale et périphérique, ainsi que sur la récupération motrice fonctionnelle et ananatomique et cérébrale permettra à moyen terme la mise au point d’un protocole efficace pour le traitement d’une lésion corticale traumatique. De plus, les paramètres cardiovasculaires évalués par télémétrie après stimulation constitueront, à moyen terme des marqueurs prédictifs précieux, qui pourront être utilisés à des fins de diagnostics précoces et de traitements personnalisés.
Procédures
240 rats subiront une lésion traumatique corticale et une dissection du nerf vague (2 chirurgies, 45 minutes). 80 subiront une lésion traumatique, une dissection du nerf vague (2 chirurgies, 45 minutes) et une implantation de capteurs de télémétrie (1 chirurgie, 1h30). 240 rats subiront une lésion traumatique corticale, une dissection du nerf vague et une implantation d'une éléctrode sur le nerf vague gauche (2 chirurgies,1h30) . 80 rats subiront une lésion traumatique corticale, une dissection du nerf vague, une implantation d'une éléctrode sur le nerf vague gauche et une implantation de capteurs de télémétrie (3chirurgie, 3 heures). Les 720 rats du projets subiront 3 tests de motricité allant de 3 à 30 minutes, qui seront réalisés sur 2-3 jours. Ils subitont ces tests une fois avant et une fois après la lésion traumatique. 80 rats subiront une stimulation du nerf vague tous les jours minimum durant 3 jours jusqu'à maximum 31 jours. 160 rats subiront un enregistrement de leur fréquence cardiaque et leur pression artérielle pendant 5 minutes, tous les jours, pendant 31 jours.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables seront ceux induits par l’anesthésie générale, la chirurgie crânienne et la chirurgie de placement des électrodes et des capteurs. La chirurgie entraine une douleur modérée, diminuée par l’utilisation d’antalgique. L’anesthésie générale pourra entrainer un inconfort transitoire au réveil et une légère perte de poids ponctuelle. La lésion du cortex moteur entraine potentiellement une légère diminution de la capacité de préhension de la patte antérieure droite. D’autres nuisances pourront également être produites comme durant les tests de motricité où les animaux seront placés seuls dans ces dispositifs, ce qui pourrait générer un léger stress transitoire pendant 30 secondes (pesée) et 10 minutes (test du cylindre, stepping, open field). a stimulation est indolore mais pourrait occasionner une légère gêne. Lors des stimulations du nerf vague et des mesures de télémétrie, les animaux seront isolés pendant la durée de la stimulation (15min) et les mesures télémétriques (5 minutes). Les animaux stimulés de manière chronique s’habitueront au dispositif, le stress devrait donc diminuer au cours des jours d’expérimentation.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort par des méthodes réglementaires pour des prélevements notamment de cerveau.
Remplacement
L’objectif du projet est d’analyser dans le temps les effets in vivo (grâce à des mesures de paramètres tels que la pression artérielle, et l’électrocardiogramme par la technique de télémétrie et des analyses comportementales) d’une stimulation du nerf vague après une lésion traumatique du cortex moteur. Ceci ne peut être actuellement modélisé ni in vitro ou ni in silico. De ce fait, cette étude pourra être réalisée uniquement sur l’animal entier et vivant afin de visualiser l’effet bénéfique de cette approche thérapeutique.
Réduction
Nous minimiserons le nombre d'animaux utilisés par des méthodes expérimentales validées et reproductibles, en ayant recours à des analyses statistiques, nous avons calculé qu'il est nécessaire d’avoir 20 animaux par lot. Nous avons 36 lots, soit un total de 720 rats. Des lots sont équivalents (même groupe expérimental) avant la mise à mort. On pourra donc regrouper leurs résultats comportementaux, le nombre d’animaux par lot est donc défini par les analyses post-mortem (histologie et biologie moléculaire, 20 animaux par lot). De nombreuses études ont montré un impact du cycle hormonal féminin sur l’activité du nerf vague, donc chaque lot sera constitué de 10 mâles et 10 femelles,or si des analyses préliminaires avec 5 mâles et 5 femelles par lot, ne montrent pas de différence entre les 2 sexes, les lots seront alors réduit à 10 animaux (5 mâles et 5 femelles). De plus, des lots permettront de contrôler l’impact de la répétition du test sur la motivation des animaux. Si avec le lot, pour lesques il y a 10 jours d’écart entre les test comportementaux pré et post-lésion, on n’observe pas d’effet « répétition du test », les autres lots ne seront pas utilisés.
Raffinement
Avant l’expérimentation les animaux seront acclimatés à l’animalerie et à l’expérimentateur afin de réduire le stress le jour de l’expérimentation. L’expérimentateur manipulera les animaux les jours précédant l’expérimentation. Les animaux seront mis habituation dans la pièce avant toute expérience de comportement. Puis, durant toute l’expérimentation, le bien-être des animaux sera respecté en réduisant au maximum l’inconfort, la douleur, la détresse ou le stress. Les conditions d’élevage et d’hébergement seront optimisées (hébergement en groupe de 2 dans des locaux adaptés avec enrichissement du milieu adapté à l'espèce : stick de bois à ronger et tunnel). Lors de la chirurgie nous aurons recours à l’anesthésie générale avec analgésie et monitoring de la température corporelle et utilisation d’un coussin chauffant. De plus, les chirurgies seront réalisées par des expérimentateurs compétents et expérimentés à la fois pour la lésion Corticale Traumatique, la dissection du nerf vague et l’implantation de l'électrode et des capteurs de télémétrie afin que les gestes soient précis et efficaces permettant une chirurgie dans les meilleures conditions possibles pour l’animal. Un traitement antalgique sera poursuivi pendant 3 jours post-opératoire. Durant toute la procédure, le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape par une surveillance régulière selon une grille de score (évaluation journalière durant les 7 jours post-chirurgie, évaluation hebdomadaire en pré-chirurgie et 7 jours après la chirurgie) qui permet le suivi des points limites gradés, stricts et précis et qui définit également des critères d’intervention et d’arrêt suffisamment précoces. Un animal atteignant un des points limites définis nécessitant une intervention sera pris en charge sans délai.
Choix des espèces
Le rat est le meilleur modèle de rongeurs pour l’implantation d’une électrode de stimulation dans le nerf vague. En effet, la plupart des études de stimulation du nerf vague ont été réalisées chez cette espèce pour des raisons techniques de localisation et d’isolement du nerf vague. De par sa taille et sa stabilité cardiovasculaire plus importante par rapport à la souris, les résultats obtenus varient peu d’un individu à l’autre, ce qui permet de réduire le nombre d’individus à utiliser pour les études statistiques. Des rats mâles et femelles seront utilisés car la lésion corticale traumatique touche aussi bien les hommes que les femmes. De plus, de nombreuses études ont mis en évidence un impact du cycle hormonal féminin sur le fonctionnement du nerf vague, c’est pourquoi il semble important d’étudier et de comparer les 2 sexes.
Étude du potentiel thérapeutique de l’inhibition pharmacologique d’Orai1 dans le développement de l’insuffisance ventriculaire droite induite par banding de l’artère pulmonaire chez le rat.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Soumis à un rétrécissement chirurgical de l'artère pulmonaire destiné à provoquer une insuffisance cardiaque droite, 400 rats vont tous être tués pour analyse du cœur et des poumons. 320 d'entre eux subissent des procédures d'un niveau de souffrance sévère, les 80 autres un niveau modéré. Chaque animal passe une échocardiographie sous anesthésie par semaine pendant quatre ou huit semaines, puis un prélèvement sanguin à la queue et un cathétérisme cardiaque. Le porteur annonce que le projet permettra "à court terme" de lancer des essais cliniques chez les patients atteints d'hypertension pulmonaire, quand l'essoufflement et la fatigue infligés aux rats sont donnés pour la conséquence attendue du protocole.
Objectifs
L'insuffisance cardiaque droite est la principale cause décès de patients atteints d'hypertension pulmonaire (représentant 1 % de la population globale). Cependant, aucun traitement n'existe pour réduire l'apparition de l'insuffisance cardiaque droite. Nos résultats suggèrent qu'une protéine d'un canal calcique serait impliquée dans le développement de la dysfonction ventriculaire droite aussi bien chez l'homme que chez le rat. L'objectif de cette étude est donc de déterminer si l’inhibition de ce canal calcique par un inhibiteur spécifique, in vivo chez le rat, est bénéfique pour réduire le développement de l’insuffisance ventriculaire droite.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet permettrait de valider l'intérêt de notre cible thérapeutique pour réduire le développement de l’insuffisance ventriculaire droite. Les patients atteints de cette pathologie n'ayant actuellement aucun traitement spécifique, ce projet représenterait une utilité majeure dans la prise en charge de ces malades. A court, terme ce projet permettra l'initiation d'essais cliniques ciblant Orai1 chez les patients atteints d'hypertension pulmonaire.
Procédures
Le début de protocole commence par l'induction de l'insuffisance ventriculaire droite, qui sera réalisée par chirurgie sous anesthésie générale et analgésie (25 min par animal). Tous les animaux subiront des échocardiographies, une fois par semaine pendant 4 ou 8 semaines selon le protocole. Ces échocardiographies seront réalisées sous anesthésie générale gazeuse(20 min par animal). A la fin des procédures, tous les animaux subiront un prélèvements sanguins à la veine caudale ainsi qu'un cathétérisme cardiaque sous anesthésie générale (25 min par animal, J28 ou J56).
Impact sur les animaux
Comme décris précédemment, la chirurgie de Banding de l'artère pulmonaire conduira au développement d'une insuffisance cardiaque droite. Les effets secondaires importants et les atteintes cardiaques (essoufflement à l'effort, fatigue) conséquences de la mise en place de l'insuffisance cardiaque droite.
Devenir
Euthanasie de tous les animaux à la fin des procédures pour analyses post-mortem sur le coeur et les poumons.
Remplacement
Le recours à des animaux se justifie par la nécessité d’étudier la fonction cardiovasculaire dans un contexte physiologique et physiopathologique. Il se justifie par l'impossibilité de simuler ex vivo la mise en place de l'insuffisance ventriculaire droite qui est un processus complexe.
Réduction
Les fonctions cardiovasculaires seront étudiées par des méthodes non invasives (échocardiographie) permettant de limiter le nombre d'animaux utilisés. Un dernier bilan (cathétérisme) de leur fonction cardiaque est réalisé à la fin de l'expérimentation afin de collecter un maximum de données. Le nombre total de rats utilisés sera de 400 sur l'ensemble de l'étude en combinant plusieurs approches expérimentales par différents expérimentateurs sur le même animal. Des expériences de biochimie et de biologie moléculaire à partir des différents tissus collectés et des études sur cellules isolées seront effectuées afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. Afin de déterminer le plus précisément possible le nombre nécessaire et suffisant d'animaux, nous avons utilisé un test statistique adéquat.
Raffinement
Toutes les procédures seront pratiquées en utilisant des anesthésiques et des analgésiques. Les animaux seront au nombre de 2 par cages. De l'enrichissement, comme du coton, un morceau de bois ou encore un tunel en carton seront ajoutés dans les cages des animaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement (évaluation de la présence de points limites) et leur entretien sera effectué dans des conditions soigneusement contrôlées pour s'assurer que les animaux ne subissent aucun stress. La procédure conduira à une insuffisance cardiaque droite, les animaliers surveilleront quotidiennement l'apparition de points limites, notamment la perte de poids. L'eau ainsi que la nourriture sera en illimité pour les animaux. À la fin des expérimentations, les animaux seront sacrifiés pour prélèvement d’organes.
Choix des espèces
Les rats sont des modèles standards de maladies cardiovasculaires. Ils présentent une anatomie vasculaire et des caractéristiques hémodynamiques similaires à celle de l’homme. De plus notre équipe travaille en routine avec des modèles expérimentaux utilisant les rats pour l’étude de l'hypertension pulmonaire. Nous avons donc l’expérience et le matériel adapté pour travailler sur ce modèle. De plus, dans un but d'étude préclinique il est crucial de pouvoir tester nos molécules pharmacologiques sur l'animal entier afin de déterminer la présence d'effets secondaires non désirés. Les rats utilisés seront des jeunes adultes (8 semaines, 200g à 250g). En effet, à ce stade de développement (pleine phase de croissance) l’induction de l’insuffisance ventriculaire droite est plus rapide. De plus, chez l'Homme, l'hypertension pulmonaire se développe chez les jeunes adultes.
Diplôme Universitaire de microchirurgie
- Enseignement supérieur
Jusqu'à cinq artères, deux veines et deux nerfs suturés sur un même animal : 960 rats vont être opérés sous anesthésie pendant trois heures au maximum, puis tués avant tout réveil. Les nuisances annoncées comprennent des thromboses, des lésions accidentelles de tissus et une mort par hémorragie, plus fréquentes sur les premiers rats confiés à un étudiant qui débute. Chaque étudiant dispose de seize rats. Ces sutures servent à valider un diplôme universitaire de microchirurgie, dont le porteur décrit la formation pratique comme "primordiale".
Objectifs
La microchirurgie est une discipline chirurgicale qui permet de réparer les petits vaisseaux ou les nerfs des doigts, de la main ou du poignet. Ces techniques permettent, en urgence, de réimplanter les doigts, de suturer les nerfs ou les artères lésés à la main ou au poignet ou de réaliser des reconstructions complexes de la main (lambeaux de couvertures, greffe d’orteil pour reconstruire le pouce par exemple). Ces sutures des vaisseaux et des nerfs doivent être réalisées par un chirurgien spécialisé. Ces gestes doivent être parfaitement maitrisés car ils sont réalisés en urgence et le temps est un facteur primordial pour la survie du membre traumatisé et pour le bon rétablissement du patient. Cette compétence s’acquiert par un Diplôme Universitaire de microchirurgie dans le cadre de la formation initiale du chirurgien de la main, ainsi que par une pratique de la microchirurgie au quotidien. Les éléments à réparer sont extrêmement fins, et nécessitent une grande habileté micro chirurgicale. Le diamètre des artères digitales est de l’ordre du millimètre. Le chirurgien utilise une loupe binoculaire qui va grossir la zone à réparer. Par une chirurgie minutieuse, il va isoler une artère collatérale de doigt, un nerf collatéral de doigt ou une micro veine. Il va relier les éléments sectionnés sur un clamp microchirurgical, puis va suturer bout-à-bout le nerf, l’artère ou la veine afin de rétablir la continuité de ces éléments. Dans le cadre de ce DU, la formation pratique est primordiale. Les entrainements se font d’abord sur un support d’entrainement à l’anastomose pour apprendre à faire les sutures sous la binoculaire, une fois cette étape validée, les étudiants se forment sur des rats de laboratoire car les vaisseaux et les nerfs du rat ont une dimension proche de ceux des doigts humains. La suture du vaisseau est validé grâce à un teste d'étanchéité appelé test de Patency qui permet de voir si le sang passe et donc si l'anastomose est réussie. Il n’est donc pas nécessaire de garder le rat en vie, le rat est mis à mort avant son réveil. Il s’agit d’une procédure réalisée sous anesthésie générale avec emploi d’analgésique où les étudiants sont encadrés par du personnel compétent en expérimentation animale. Le DU est validé avec un examen pratique.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet est la formation de chirurgiens compétents en micro-chirurgie qui vont ensuite réaliser ces gestes sur l'Homme, souvent dans des situations d'urgences où les techniques doivent être parfaitement maitrisées.
Procédures
Les animaux seront soumis à une seule chirurgie sous anesthésie générale d'une durée de 3h00 maximum.
Impact sur les animaux
Puisqu'il s'agit d'apprentissage il peut y avoir des effets indésirables sur les rats. Les nuisances possibles sont : le stress généré lors de l'anesthésie (contention, injection), des thromboses sur les vaisseaux, une mort accidentelle par hémorragie, des tissus lésés accidentellement pouvant provoquer de l'inconfort ou un peu de douleur notamment sur les premiers rats lorsque l'étudiants n'est pas encore très habitué ou un problème avec l'anesthésie.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés à la fin de la chirurgie avant leur réveil car il n'est pas nécessaire de garder les animaux vivants pour vérifier l'efficacité des sutures, un test d'étanchéité est réalisé directement sur les vaisseaux suffit. Le fait de garder les animaux après la chirurgie pourrait provoquer plus de gêne et d'éventuelles douleurs post-opératoires non-anticipables avant le réveil, n'aurait aucun bénéfice et serait contraire au bien-être animal.
Remplacement
L'apprentissage des sutures sur les vaisseaux ne peut se faire que sur un être vivant avec un circulation sanguine afin de valider l'efficacité de la suture.
Réduction
Avant de passer sur le rat les étudiants s'entrainent sur un support en silicone afin de maitriser la manipulation des instruments et du fil avant de commencer à travailler sur le rat. Le support ne permet pas le remplacement total de l'animal mais permet d'en réduire le nombre. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, jusqu'à 5 artères (2 carotides, 2 fémorales, 1 caudale), 2 veines (fémorales) et 2 nerfs (sciatiques) pourront être suturés par rat. De plus le nombre de rats est limité par étudiants, chacun a droit à un maximum de 16 rats.
Raffinement
Les rats sont hébergés par 2 avec des enrichissements (bout de bois, tunnel...), la nourriture et l’eau de boisson sont fournies à volonté. Les animaux ont au minimum une semaine d’acclimatation avant le jour de la chirurgie. Les animaux sont sous anesthésie générale avec analgésie et anesthésiant local (pour le nerf) pour qu'ils ne ressent aucune douleur pendant l'opération.
Choix des espèces
Le rat adulte (500-600g) est utilisé car la taille des vaisseaux et des nerfs les plus gros chez le rat est proche de la taille des vaisseaux et nerfs des doigts humains.
Conséquences épigénétiques de la compétition entre la lactylation et l’acétylation des histones sur les adaptations du tissu musculaire.
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Deux à dix-sept séances de course sur tapis de vingt à soixante minutes, avec un critère d'arrêt fixé à cinq stimulations électriques ou plus en une minute : 74 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués vingt-quatre heures après la dernière séance pour prélever leurs organes. Ils subissent aussi quatre à dix-huit gavages d'une molécule ou d'eau, et des prises de sang à la queue. Le porteur attend des blessures musculaires ou tendineuses liées à la répétition de l'exercice et des irritations de l'œsophage dues aux gavages. Il indique avoir demandé un financement pour développer en parallèle un modèle de contraction de cellules musculaires in vitro, les données obtenues sur les rats devant servir à valider ce modèle cellulaire.
Objectifs
Le tissu musculaire est essentiel pour la santé et est même lié à la longévité. Cependant, les effets de l’exercice physique varient beaucoup d’une personne à l’autre, notamment à cause de différences dans l’expression des gènes influencés par l’environnement. Des travaux récents ont montré que le lactate, qui est produit en grande quantité par le muscle lors de l’exercice intense, est capable d'influencer l'expression des gènes en se fixant sur des protéines associées à l’ADN. Ce marquage par le lactate est activement étudié dans le cancer, mais son rôle dans l’adaptation musculaire à un protocole d’entrainement reste inconnue. L’objectif de ce projet est d’étudier les effets de l’exercice intermittent intense, connu pour induire une forte augmentation de la concentration en lactate, sur le marquage des protéines de l'ADN pour comprendre ses conséquences sur l’adaptation musculaire à l’entrainement.
Bénéfices attendus
Ce travail pourrait permettre de mieux comprendre les mécanismes de régulation de l'expression des gènes impliqués dans l'amélioration des performances musculaires, afin de développer des approches personnalisées — comme des conseils en nutrition ou une approche pharmacologique — dans le but d’améliorer les effets de l’entraînement physique chez chacun, y compris pour les patients ayant des difficultés à répondre à l’exercice.
Procédures
Voici les interventions qui seront réalisées sur les animaux: i) course sur tapis (2 à 17 séances de course de 20-60min) ; ii) prise de sang à la queue; iii) administration d'une molécule ou d'eau de boisson par gavage oral (4-18 gavages, 1min par gavage).
Impact sur les animaux
En fonction des phases du projet, différents effets indésirables ou nuisances sont attendus : 1) un test d'évaluation de la vitesse maximale aérobie des animaux est nécessaire pour pouvoir ajuster l'intensité des séances d'exercices sous maximaux des animaux en fonction de leur capacité individuelle. Ce test peut être une source de stress pour l'animal du fait de l'environnement (e.g. bruits, odeurs) et de l'effort en lui-meme 2) Comme cela est le cas chez l'homme, les séances d'exercice répétés pouvant être à l'origine de blessures musculaires et/ou tendineuses pour les animaux. 3) L'administration du traitement par gavage oral répété peut induire des irritations bégnines au niveau de l'œsophage des animaux.
Devenir
Vingt-quatre heures après la fin de la dernière séance d’exercice, les animaux seront mis à mort pour prélèvement d'organes.
Remplacement
A l’heure actuelle seul le modèle animal permet d’étudier de manière intégrée les effets de l'exercice sur le muscle en prenant en compte la signalisation systémique, l’irrigation sanguine et les interactions tissulaires. En effet, les modèles cellulaires actuels, comme les cultures de cellules musculaires, ne reproduisent pas fidèlement l'organisation complexe du muscle in vivo, incluant l’interaction entre les fibres musculaires, les nerfs et les vaisseaux sanguins. De plus, ils ne permettent pas de simuler les contraintes mécaniques réelles de l'exercice, comme la charge, l’étirement et la contraction dynamique, qui sont essentielles aux adaptations musculaires. En parallèle de ce projet, une demande de financement a été faite afin de développer au laboratoire un modèle de contraction de cellules musculaires in vitro, dans le but, à terme, de réduire l'utilisation du modèle animal. Les données qui seront récoltées durant ce projet seront donc d'un intérêt majeur pour nous permettre de comparer les résultats obtenus in vivo avec nos résultats in vitro, validant ainsi la pertinence de notre modèle cellulaire dans l'étude des voies de régulation du muscle.
Réduction
Pour ce projet, nous prévoyons d'utiliser 2 fois (i.e. aigu et chronique) 4 groupes de 8 rats pour nos différentes conditions expérimentales : contrôle non-traité; contrôle traité, exercice non-traité; exercice traité. Nous voulons 8 animaux par groupe car d'après nos précédents protocoles d'étude des effets de l'entrainement, la taille d'effet observé sera suffisante pour obtenir une amélioration significative des performances de course des animaux à l'issue des 5 semaines d'entrainement.
Raffinement
Dans un objectif de raffinement, plusieurs mesures seront mises en place tel que l'observation régulière (pesée, prise alimentaire, comportement, aspect, détection de toute souffrance et blessure), ce qui nous permettra d'évaluer le bien-être des animaux selon une grille précise et adaptée et de déterminer si les animaux atteignent l'un des critères d'arrêt. De plus, pour réduire le stress lié à la course sur tapis, un soin particulier sera apporté au protocole d'habituation à l'exercice sur tapis de course, qui sera effectué au début de l'étude. L’expérimentateur en charge des séances de course sur tapis sera également attentif à bien respecter le critère d’arrêt des animaux (5 stimulations électriques ou plus sur 1 minute) pour éviter toute fatigue excessive des animaux. La motricité des animaux sera également observée attentivement avant et pendant toute la durée des séances d'entraînement pour détecter toute blessure qui pourrait induire de la douleur au repos comme à l’exercice. Afin de réduire le risque de blessure, toutes les séances de course sur tapis débuteront par une phase d'échauffement des animaux de 2 paliers à de 5min à 10 et 20 m/min. Si malgré ces précautions un animal développe une blessure ne lui permettant plus de suivre le protocole de course sans douleur, celui-ci sera mis à mort. Afin d’éviter tout problème qui pourrait découler du gavage, l'olive des canules de gavage sera lubrifié avec de l'huile de paraffine (vaseline liquide) et la procédure d'administration sera supervisée par l'animalière du laboratoire, qui possède une solide expérience dans la réalisation de ce geste. La prise alimentaire des animaux sera effectuée de manière hebdomadaire pour détecter toute modification du comportement qui pourrait être lié à une irritation due l'œsophage des animaux. Enfin, pour éviter toute douleur, la mise à mort terminale sera effectuée après anésthésie des animaux.
Choix des espèces
Nous avons choisi d'utiliser un modèle de rats car celui-ci est classiquement utilisé dans les études sur les effets de l'exercice physique aigu et chronique. L'utilisation de ce modèle nous permettra donc de comparer nos résultats aux données de la littérature ainsi qu'à de précédents résultats du laboratoire. Cette espèce permet l'obtention de quantités de tissu musculaire nécessaires pour toutes les études à réaliser, limitant la nécessité de cumuler plusieurs animaux d'espèces plus petites (souris par ex.). Les animaux utilisés seront âgés de 4 mois au début de l'étude, car cela permet de limiter les effets liés à la croissance d'animaux plus jeunes et d'éviter les défauts de réponse à l'entraînement qui peuvent être observés chez des rats plus âgés.