Rats
Effet de l’inhibition d’un canal astrocytaire sur la douleur orofaciale chez le rat mâle et femelle
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Des tests de mesure de la douleur toutes les trente minutes pendant cinq heures, puis une fois par jour pendant cinq jours : 800 rats vont être utilisés, 600 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 200 opérés sous anesthésie profonde et tués avant tout réveil. Le protocole prévoit une injection directement dans le liquide céphalo-rachidien au niveau du tronc cérébral ou dans un ganglion nerveux, puis pour une partie des animaux une trachéotomie, une canulation de la carotide et de la jugulaire, une craniotomie et l'exposition de la zone d'enregistrement. Le porteur attend le développement d'une hypersensibilité douloureuse et décrit les mesures de sensibilité cutanée comme peu douloureuses, l'animal pouvant se soustraire au stimulus. Il retient le rat Sprague-Dawley parce que son système nociceptif est comparable à celui des humains, autrement dit parce que l'espèce ressent la douleur qu'on lui inflige de façon proche de la nôtre.
Objectifs
Lorsque la douleur est chronique ou persistante, elle devient alors pathologique car elle n’offre plus aucun avantage mais provoque au contraire une extrême souffrance. C’est notamment le cas de douleurs inflammatoires qui apparaissent suite à une inflammation du système nerveux. Parmi les symptômes douloureux, nous nous intéressons à l’allodynie qui correspond à une douleur provoquée par une stimulation normalement non douloureuse qui peut être déclenchée suite à l’inflammation. Ce phénomène provoque l’activation de plusieurs populations neuronales, mais fait également intervenir les astrocytes, un sous-type de cellules gliales. Cependant, les mécanismes astrocytaires impliqués dans la génèse de l’allodynie en condition inflammatoire sont peu connus. Des résultats préliminaires ont permis notamment de mettre en évidence que l’inflammation induisait une réactivité cellulaire et une dérégulation de canaux cellulaires. Cependant, la question de comment l’inflammation est capable d’entrainer cette dérégulation du canal reste toujours en suspend. Récemment, une étude a montré l’implication d'un nouvel inhibiteur dans l'inhibition spécifique des canaux. Ce projet aura donc pour objectif de tester, dans notre modèle animal, si cet inhibiteur agit sur la dérégulation des canaux par des approches comportementales, moléculaires, immunohistochimiques et électrophysiologiques in vivo. Ce projet sera réalisé sur des rats adultes mâles et femelles.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes centraux induisant la dérégulation du canal astrocytaire, impliquée dans les phénomènes d’hypersensibilité douloureuse. Au travers des résultats attendus, ce travail pourrait avoir des répercussions positives sur la recherche pré-clinique s’intéressant aux douleurs chroniques, et pourrait à terme mettre en lumière de nouvelles pistes thérapeutiques.
Procédures
Les différents gestes techniques utilisés lors de ce projet sont au nombre de 3 :•Prélèvements des cellules vaginales (1 fois par jour de test ou d'injection,
Impact sur les animaux
Nous nous attendons au développement d’une hypersensibilité douloureuse. Afin de diminuer le stress lié aux tests de comportement et aux injections, les animaux ont une période d’adaptation suite à la livraison, suivie d'une période d’habituation pour le comportement. Les mesures de sensibilité cutanée sont peu douloureuses, puisqu’elles consistent en la mesure d’un seuil, avec possibilité d’échappement et n'entrainent pas de réactions visibles, autre que le retrait moteur de la zone stimulée. Les rats doivent pouvoir continuer à se mouvoir, se toiletter, exercer leurs gestes habituels.
Devenir
A la fin des procédures , les animaux seront profondément anesthésiés et seront mis à mort: pour prélever les tissus nerveux d'intérêts afin de réaliser une analyse immunohistochimique, protéique ou électrophysiologique.
Remplacement
Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. Il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux aussi bien central que périphérique (fibres afférentes). Des études comportementales chez l’animal vivant sont donc nécessaires pour mettre en évidence l’installation d’une l’allodynie mécanique.
Réduction
Le nombre de rats par groupe a été évalué sur la base des travaux précédents en tenant compte des divers problèmes que nous pourrons rencontrer au cours des différentes phases expérimentales. Le nombre de 8 rats /groupe pour les études est d’après nos données antérieures au sein du laboratoire le minimum requis pour discriminer un effet statistique significatif . Cependant, plusieurs étapes sont limitantes donc il est préférable de prévoir 10 animaux maximum par groupe: habituation, injections ,comportement, prélèvements des tissus. Pour chaque procédure, nous allons adapter notre approche statistique aux données obtenues afin d'obtenir des résultats statistiquement fiables et pertinents avec une puissance d’analyse d’au moins 70%. Si lors des procédures, 8 animaux sont suffisants, nous n'utiliserons pas plus d'animaux. Des tests statistiques seront utilisés pour déterminer le nombre d'animaux suffisant et nécessaire. Afin de limiter le nombre d'animaux, les études électrophysiologiques in vivo et comportementales seront réalisées dans un premier temps et si nous n'obtenons pas de résultats significatifs les autres procédures ne seront pas réalisées.
Raffinement
Les animaux seront stabulés dans des pièces ventilées, thermorégulées (22±1 °C) avec hygrométrie contrôlée. Le cycle de lumière est inversé (lumière de 19h à 7h). L’accès à la nourriture et à l’eau se fait ad libitum et le changement de la litière se fait 2 fois par semaine. Les rats sont placés 3 par cage de 800 cm2 (enrichissement social). Les animaux seront utilisés avant d'atteindre un poids supérieurs à 300g. Des rouleaux de cartons sont ajoutés pour pouvoir se cacher et grignoter. La surveillance des animaux se fera quotidiennement par les personnes compétentes du laboratoire conformément à la législation en vigueur. L’expérimentation sera réalisée de 5 jours après réception (période d’adaptation) et après 5 jours d’habituation pour les expériences en comportement( Jour 1: habituation à l'expérimentateur et la box de comportement/ Jour 2: habituation à l'approche du filament de vF/ Jour 3: habituation à l'appui d'un filament de vF de faible calibre/ Jour 4 et 5: habituation et seuil de base) . Plusieurs critères seront surveillés quotidiennement durant tout le temps des procédures, et des points limites ont été établis par une grille de scores. Les animaux seront notamment surveillés quoditiennement lors des différentes procédures. Le poids est mesuré régulièrement jusqu'à la fin de l'expérimentation. La nourriture sera humidifiée pour faciliter son absorption. Nous regarderons également l’apparence et le comportement (poils ébouriffés, animal prostré, posture anormale, vocalisations, agitation, toilettage). Si, suite l'évaluation avec la grille de scores, l'état général de l'animal décroît, alors il sera mis à mort. Les tests électrophysiologiques seront réalisés sous anesthésie générale à l'isoflurane, avec un mélange d'oxygène et de protoxyde d'azote, et sans réveil.
Choix des espèces
La souche de rat Sprague-Dawley est un des modèles les plus couramment utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Nous utiliserons des animaux âgés de 5 à 8 semaines (125g à 300g). Les différentes études sur la douleur sont réalisées sur des animaux adultes. Les différents types de douleur trigéminale est majoritaire chez les personnes adultes. L'utilisation de rats dans les études comportementales sur la douleur est largement répandue et justifiée par plusieurs facteurs scientifiques et éthiques. Les rats partagent des similitudes biologiques et physiopathologiques avec les humains, en particulier dans le système nerveux et la réponse à la douleur. Leur système nociceptif (responsable de la détection de la douleur) est comparable à celui des humains, ce qui permet d'étudier des mécanismes de la douleur qui peuvent être extrapolés à l'homme.
Pratiques en experimentation animale (rat/souris) : formation initiale ou remise à niveau de gestes techniques.
- Formation professionnelle
Rats : 300
Pour former ou remettre à niveau le personnel technique d'un laboratoire aux gestes de prélèvement et d'administration, 450 souris et 300 rats subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal peut recevoir jusqu'à six gestes techniques au cours de sa vie, à raison d'une séance par semaine au maximum, prélèvements sanguins et gavages compris. Le porteur indique qu'un hématome peut se former au point de ponction et que certains animaux peuvent faire un choc hypovolémique ou souffrir d'anémie après un prélèvement de sang, les nuisances augmentant avec des expérimentateurs non aguerris. Tous sont tués une fois la technique validée, parce que les prélèvements répétés modifient leurs paramètres sanguins et rendraient leurs données inutilisables dans un autre projet.
Objectifs
L’administration de médicaments et/ou le prélèvement sanguin, dans le cadre d’études utilisant des animaux à des fins scientifiques, est une étape couramment utilisée en recherche et développement pharmaceutique. Selon les besoins, les voies ou les volumes d’administration ou de prélèvement peuvent varier grandement. À l’intérieur de ce cadre expérimental, il est primordial de viser en tout temps le maintien du bien-être de l’animal via la bonne formation des expérimentateurs. Ce projet concerne la formation interne de gestes techniques en expérimentation animale utilisés dans nos projets. Il s’agira de former ou de remettre à niveau le personnel technique intervenant dans le cadre de projets validés afin de garantir la qualité technique et la standardisation des procédures, et in fine augmenter la reproductibilité des études.
Bénéfices attendus
La maitrise des gestes techniques du personnel intervenant lors les études en expérimentation animale est essentielle pour plusieurs points : -essentielle au bien-être animal (la maitrise d’une technique permet de minimiser la gène/douleur pour les animaux). La contrainte subie par l'animal lors d’un geste technique ne dépend pas seulement de la technique en elle-meme ou de l’animal mais aussi de l'habileté de la personne. qui l'exécute. Une bonne maitrise technique limite le stress de l’experimentateur lors des études limitant ainsi son stress transmis aux animaux. -essentielle pour la reproductibilité des études : une bonne maitrise des gestes techniques maximise la reproductibité intra et inter expérimenteurs des études.
Procédures
Les animaux de cette procédure pourront être soumis à des prélèvements de sang anesthésiés ou non selon la technique utilisée, 1 fois par semaine maximum. La durée de l’intervention dépendra de la voie de prélèvement, en général de 20 à 30 secondes. De même, pour les administrations (1 séance par semaine maximum), animaux si possible anesthésiés dans les premières séances, puis vigiles, selon la technique utilisée. La durée de l’administration dépendra de la technique utilisée. Par exemple, 15 à 20 secondes pour un gavage, jusqu’à 1 minute de contention pour une injection intraveineuse.
Impact sur les animaux
Les animaux seront réutilisés pour différentes techniques si besoin. La formation sera optimisée, dans le respect du bien-être des animaux, pour le nombre et les voies de prélèvements/administrations. Néanmoins, la multiplication des actes de même type ou différents, peut entrainer un stress cumulé. Les nuisances peuvent être induites par chaque geste technique : administration d’une solution saline, prélèvements sanguins, anesthésies prolongées (prélèvements) par exemples. Les nuisances / effets indésirables peuvent être augmentés dans le cadre de l’apprentissage de nouveaux gestes techniques par les expérimentateurs non aguerris. La douleur ressentie par les animaux peut se manifester, entres autres, par une hypo- ou une hyperactivité, des difficultés à se déplacer, une prostration, une modification des expressions faciales. Un hématome (épanchement sanguin généralement sous-cutané avec ecchymose et douleur) peut se former au site de ponction, certains animaux peuvent faire un choc hypovolémique ou souffrir d’anémie suite à un prélèvement sanguin.
Devenir
Une fois la technique validée par le formateur, les animaux ne pourront entrer dans un projet. En effet, les injections ou prélèvements répetés peuvent induire des modifications hématologiques et/ou biochimiques. Ces dernières, même légères, peuvent être délétères pour les analyses demandées dans le nouveau projet. Ils seront alors tous mis à mort.
Remplacement
La personne en formation aura accès, via des sites internet spécifiques, à des vidéos/articles/photos adaptées. Les premières séances de formation consisteront à la lecture de notre procédure technique, validée par notre vétérinaire référent. Elle contient les informations concernant chaque geste technique potentiel : volumes adaptés, nombre de réalisations tolérées, périodes de récupération, conditions de validation de la formation, etc L’apprentissage d’une nouvelle technique, qui ne nécessite pas obligatoirement des animaux vigiles (per os par exemple), suivra toujours le même process : 1-Expérimentation sur animal mort et/ou un mannequin 2-Expérimentation sur animal anesthésié sans réveil 3-Expérimentation sur animal avec réveil
Réduction
Après entrainement sur un mannequin et/ou un animal mort, les animaux seront réutilisés pour différentes techniques si besoin. La formation sera optimisée, dans le respect du bien-être des animaux, pour le nombre et les voies de prélèvements/administrations, afin de limiter l’impact de ces actes techniques que se soit sur l’homéostasie ou le stress cumulé. A la fin de la formation, le responsable de ce projet devra s’assurer que les animaux seront utilisés dans la mesure du possible pour des prélèvements finaux (souvent organes) pour la mise en place de techniques ex vivo (histologie par exemple) ou pour servir d’échantillons contrôles.
Raffinement
Les animaux hébergés en groupe bénéficierons d’une acclimatation de 5 jours minimum. Ils auront à leur disposition des carrés de ouate notamment pour la constitution du nid ainsi qu’un dôme en plastique rouge (souris) ou un tunnel en carton (rats) pour pouvoir se cacher. Leur comportement de rongeur sera encouragé par la présence de bâtons en bois dans la cage. Ils auront également libre accès à l’eau et la nourriture tout au long du projet. Les points limites associés à chaque technique en apprentissage seront recherchés après chaque séance. En cas d’atteinte, une décision sera prise avec le formateur et/ou le vétérinaire référent.
Choix des espèces
Les séances de formation se dérouleront avec des souris et/ou des rats, espèces utilisées dans notre animalerie pour les projets scientifiques validés par le Ministère. Les animaux seront au minimum du même âge que ceux couramment utilisés dans nos projets, c’est-à-dire entre 7 à 9 semaines en général. Ils pourront néanmoins être gardés plus longtemps si le technicien a besoin de beaucoup de séances de formation ou dans le cas d’une technique plus difficile à maitriser, tant que les animaux sont en bonne santé et peuvent rester dans ce projet, dans la limite de 6 gestes techniques reçus tout au long de leur vie.
Formations réglementaires destinées aux personnes appliquant et concevant des procédures expérimentales sur modèles rongeurs
- Formation professionnelle
Rats : 75
Saisis et immobilisés dix minutes chacun, puis piqués quatre fois pour des injections de sérum physiologique par des stagiaires qui apprennent le geste, 150 souris et 75 rats subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Tous sont tués à l'issue, le porteur indiquant qu'ils ne peuvent pas être réutilisés pour éviter un effet cumulatif. Ces séances forment la partie pratique d'une formation encadrée par l'arrêté du 1er février 2013, et le porteur les présente comme un moyen d'enseigner les gestes qui réduisent le stress animal. Il ajoute que diminuer le nombre d'animaux ne ferait qu'augmenter les nuisances subies par chacun, et la liste des effets indésirables mentionne le gavage par la bouche et le prélèvement sous la mâchoire, deux gestes absents de la description des procédures.
Objectifs
Les formations spécifiques pour les personnes appliquant/concevant des procédures expérimentales sont encadrées par l’arrêté du 1er février 2013 relatif à l’acquisition et à la validation des compétences des personnels des établissements utilisateurs, éleveurs et fournisseurs d’animaux utilisés à des fins scientifiques. Cet arrêté défini le programme de base et ce dernier doit comporter une partie : Procédure faiblement invasive : théorie et pratique. Ce projet décrit cette partie pratique.
Bénéfices attendus
Cette formation a pour objectif de former les personnes qui seront autorisées à utiliser des animaux à des fins scientifiques. Ces sessions de travaux pratiques ont pour but de leur enseigner les bonnes pratiques c'est à dire les gestes techniques qui permettent de réduire le stress animal. Il s'agit donc de raffiner les procédures de ces futurs utilisateurs et utilisatrices d'animaux à des fins scientifiques.
Procédures
Préhension, contention (dix minutes par animal) et injections sur animaux vigiles (quatre injections de sérum physiologique (deux minutes par injection), un prélèvement d'une goutte de sang (deux minutes) et une administration d'eau (cinq minutes) par souris, quatre injections de sérum physiologique (2 minutes) par rat).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sur les rongeurs peuvent être un stress généré par l’inexpérience des stagiaires. Cette hésitation peut être source de stress pour l’animal. Le stress généré n’est cependant que transitoire et de courte durée. Par ailleurs les injections et les prélèvements peuvent entrainer une douleur notamment lors de l’effraction cutanée. Les injections dans la cavité abdominale peut entrainer éventuellement dans de très rare cas une injection dans le début du gros intestin. Le gavage par la bouche peut également entrainer un inconfort pour l’animal et un risque de fausse route s’il n’est pas réalisé correctement. Le prélèvement sous la machoire peut entrainer éventuellement un risque d’hémorragie s’il n’est pas réalisé correctement.
Devenir
Les animaux ne pouvant pas être réutilisés afin d'éviter un effet cumulatif, ils seront mis à mort.
Remplacement
L’objectif de cette séance est d’une part de montrer aux stagiaires les bonnes pratiques en terme de contention et de prélèvements, puis de vérifier qu’ils mettent correctement en oeuvre ces pratiques. Il est important pour cela, qu’ils soient confrontés à des animaux vivants, tout comme dans les futures procédures expérimentales qu’ils et elles appliqueront.
Réduction
Le nombre d’animaux est choisi pour être réduit au minimum tout en gardant la possibilité à chaque apprenant de pouvoir effectuer les différents gestes techniques. Diminuer ce nombre ne ferait qu’augmenter les nuisances pour chaque animal, ainsi que le stress rendant les contentions plus difficiles et les apprentissages plus complexes. Des animaux de réforme pourront être utilisés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes sociaux, ils bénéficient d'enrichissement du milieu et d'une période d'acclimatation. Les manipulations se font sous le contrôle des intervenantes et intervenants qui veillent à l’exécution des gestes dans le respect du bien-être animal. Des points limites et critères d'arrêt sont définis. La préhension des souris en évitant la prise par la queue sera également enseignée (utilisation de tunnels et main en coupe).
Choix des espèces
La souris reste le modèle le plus utilisé en recherche (60% des utilisations d’animaux), le rat, bien que moins utilisé (environ 10%) reste néanmoins très utilisé notamment dans le cadre des neurosciences, discipline très représentée au CNRS. Les rats d’un poids de 250g et les souris de 7 semaines sont utilisés à cet âge de manière à ne pas rendre trop compliquée la préhension et la contention pour les apprenants.
Etude d’une maladie génétique rare vasculaire chez le rat
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Pour étudier une maladie génétique rare des vaisseaux, 192 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, tous tués pour analyse moléculaire et histologique. Le protocole se limite à une biopsie de l'oreille pour le génotypage, à des pesées et à des mesures mensuelles de pression artérielle au brassard sur la queue, entre deux et six mois. Les rats hypertendus se montrent stressés dès qu'on les saisit ou qu'on les immobilise, ce que le porteur relève sans en tirer de conséquence sur le nombre de mesures. Il justifie le passage de la souris au rat par le peu de matériel disponible chez la souris, volume d'aorte et d'artères, et par l'absence de lignée de souris hypertendue.
Objectifs
L'objectif de ce projet est l’étude physiopathologique de modèles rats d'une maladie génétique rare. Nous souhaitons étudier l’effet de la mutation créée dans un fond génétique pur normotendu et dans un fond génétique hypertendu.
Bénéfices attendus
A terme, les résultats de ce projet permettront de mieux comprendre les mécanismes moléculaires de cette maladie vasculaire et de proposer des thérapies ciblées pour améliorer le diagnostic, le traitement et le confort de vie des patients.
Procédures
La biopsie à l’oreille pour le génotypage dure quelques secondes et est pratiquée une fois. Les pesées et mesures de pression artérielle au brassard à la queue durent quelques minutes et sont pratiqués une fois par mois entre 2 et 6 mois. L'injection d'antalgie et le placement en cage pour l'anesthésie gazeuse avant la mise à mort sont pratiqués une fois et durent quelques secondes.
Impact sur les animaux
La biopsie à l’oreille pour le génotypage et la pose de bague induisent un léger stress et une douleur ponctuelle légère. Les pesées, les mesures de pression artérielle au brassard à la queue et la mise dans une cage d’induction à l’isoflurane en fin de procédure peuvent causer un léger stress. Les rats hypertendus présentent un stress lors de leur préhension ou contention.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux pour analyse moléculaire et histologique
Remplacement
L’étude sur cellules en culture ne permet que d’explorer des modifications limitées à un modèle cellulaire dans des conditions de culture particulière. L'étude sur animal entier est donc indispensable pour la compréhension physiopathologique et pour des tests thérapeutiques. Nous venons de montrer l’intérêt de cette recherche translationnelle de la souris à l’homme. L’étude de rats modèles sur fond normo et hypertendu pourra apporter des éléments supplémentaires à cette analyse.
Réduction
Le nombre d'animaux sera réduit au nombre nécessaire déterminé par les résultats d’analyses statistiques.
Raffinement
Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Des grilles de score de surveillance avec des points limites suffisamment prédictifs seront renseignées. Les rats hypertendus présentent un stress lors de leur préhension ou contention. La pression artérielle et la fréquence cardiaque seront mesurées de façon non-invasive par un brassard à la queue de l’animal placé sur un plateau chauffant dans une boite de contention adaptée. Afin de diminuer le stress de la contention et de la mesure, les animaux seront habitués chaque jour pendant 4 jours à l’âge de 8 semaines. A la fin de la procédure une exsanguination par prélèvement intracardiaque sans ouverture de la cage thoracique sera pratiquée sous surdosage d’anesthésie gazeuse et analgésie.
Choix des espèces
Même si l’analyse de souris transgéniques modèles a été très instructive dans cette pathologie, la limitation du matériel disponible (volume de l’aorte et des artères pour analyse immunohistologique et moléculaire, difficulté d’analyse in vivo par échographie) et l’absence de modèle de souris hypertendue nous a conduit à faire le choix de développer un modèle de rats. Les animaux seront étudiés à l'âge adulte entre 2 et 6 mois pour que le développement de l'organisme notamment au niveau hormonal soit finalisé.
Evaluation de candidats médicaments sur un modèle d’inflammation intestinale
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Rats : 600
Chaque animal peut recevoir jusqu'à quatre mois de traitement, deux injections par jour, et un inducteur d'inflammation dans l'eau de boisson une semaine sur deux, jusqu'à quatre fois. 1 600 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, 400 autres dans des procédures légères, tous tués à l'issue. Ils développent une inflammation intestinale reproduisant la maladie de Crohn ou la rectocolite hémorragique, avec perte de poids, douleurs abdominales et diarrhée. Le mode d'administration, la fréquence et la durée des candidats médicaments dépendent de "la demande du sponsor", ces molécules étant celles de clients du laboratoire.
Objectifs
Plus de 3 millions de personnes sont atteintes d'une maladie inflammatoire chronique intestinale en Europe, rendant toujours nécessaire le développement de médicaments plus efficaces et mieux tolérées. Lors des poussées inflammatoires, ces maladies se caractérisent le plus souvent par des douleurs abdominales, des diarrhées fréquentes, parfois sanglantes, ou encore une atteinte de la région anale (fissure, abcès). Ces symptômes font peser sur la maladie un certain tabou, rendant la vie des patients qui en souffrent particulièrement difficile. L’objectif du projet est donc de faire la preuve de concept pharmacologique de candidats médicaments sur un modèle d’inflammation intestinale induite chez le rongeur. Ces composés chimiques vont induire une inflammation de la paroi intestinale et reproduire les symptômes rencontrés chez des patients atteints de maladies inflammatoires chroniques de l'intestin comme la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique.
Bénéfices attendus
Le modèle animal utilisé dans cette étude, largement décrit dans la littérature, est pertinent pour évaluer de nouveaux candidats médicaments dans le traitement des maladies inflammatoires chroniques intestinales. Plusieurs voies d’administration des molécules seront employées afin de couvrir au mieux les possibilités d’amélioration des symptômes inflammatoires du modèle. Le bénéfice global de ce projet réside dans l'objectif d’optimisation de la formulation et de l’efficacité de médicaments candidats pour à terme mieux prendre en charge les patients et les traiter de façon durable.
Procédures
1) Dans le cadre de ce projet, la maladie sera induite soit par prise hydrique avec un inducteur d'inflammation intestinale pendant une période de 7 jours au maximum pour le modèle aigu ou en alternance de périodes où les animaux reçoivent l'inducteur pendant la première semaine puis de l’eau la seconde et ceci jusqu’à quatre fois pour le modèle chronique. Soit par délivrance dans le rectum (environ 20 secondes hors temps d'anesthésie) pour le modèle avec le 2ème inducteur. 2) Les animaux seront soumis aux candidats médicaments à tester dont le mode d’administration, la fréquence et la durée dépendent de la demande du sponsor ((intrapéritonéales : environ 2 fois 10 secondes par jour maximum, sous-cutanées environ 2 fois 10 secondes par jour maximum, gavage environ 1 fois 10 secondes par jour maximum, intradermiques environ une fois 3 min par jour maximum, intravasculaires environ une fois 2min par jour maximum) pour une durée totale de traitement de 4 mois maximum). 3) Tout au long de l'étude, les animaux seront attentivement suivis à l’aide d'une pesée quotidienne et d’un score clinique. 4) La perméabilité intestinale pourra être évaluée une fois au cours de l'étude. Pour cela, après 2 heures de mise à jeun, les animaux recevront un composé fluorescent par gavage (30 secondes). 4 heures après l'administration du composé, un prélèvement de sang sera effectué (durée : 1 min maximum), puis les animaux auront de nouveau accès à la nourriture. 5) D'autres prélèvements de sang pourront être effectués tout au long de la procédure (5 prélèvements maximum sur toute la durée du protocle avec 1minute maximum pour chacun chacun et en respectant un teps de récupération nécessaire entre 2 prélèvements).
Impact sur les animaux
Les principaux effets indésirables attendus sur ce modèle animal sont une perte de poids, des douleurs abdominales associées à de la diarrhée, l’administration répétée des molécules- clients à tester. Les modes d’administration considérés comme nuisibles incluent tous les types d’injections (intrapéritonéales : environ 2 fois 10 secondes par jour maximum, sous-cutanées environ 2 fois 10 secondes par jour maximum, gavage environ 1 fois 10 secondes par jour maximum, intradermiques environ une fois 3 min par jour maximum, intravasculaires environ une fois 2min par jour maximum) et peuvent engendrer un stress de même que la mise à jeun (2h). Pour pallier à cela, les cages seront enrichies et les animaux seront habitués à être manipulés par les expérimentateurs. Les aiguilles et les sondes de gavage seront adaptés au poids des animaux et au mode d’administration employé.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort dans le but d'étudier l'effet du composé testé sur l'inflammation et la résolution de l'inflammation.
Remplacement
Les modifications physiopathologiques nécessaires au développement des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin sont très complexes et nécessitent la mobilisation d'effecteurs moléculaires et cellulaires nombreux. Il n'est pas envisageable d'explorer l'ensemble de ces événements par une approche substitutive de culture cellulaire. Il est donc important de pouvoir disposer de modèles animaux pertinents pour permettre une recherche fondamentale et appliquée sur l’inflammation tout en évaluant l'efficacité de nouvelles molécules à visée thérapeutique, avant de passer aux essais cliniques chez l'Homme. L'utilisation des rats et des souris semble pertinent de par leur proximité avec l'Homme (mammifères). En effet, l'homologie entre les rongeurs et l'Homme facilite considérablement les procédés de modélisation des pathologies humaines et par conséquent, les interprétations qui en découlent.
Réduction
Le nombre de rats et de souris nécessaires a été défini ainsi pour pallier la diminution de la robustesse statistique lors de comparaisons multiples. Nous avons également estimé cette nécessité sur la base d’estimations statistiques. Lorsque cela est possible, les composés de nos clients seront screenés sur culture cellulaire ou organe isolé en complément des tests sur les animaux. Aucune étude pilote ne sera effectuée de part la robustesse du modèle utilisé.
Raffinement
Les expérimentateurs et les animaliers sont formés aux différentes manipulations garantissant le bien-être animal. Le suivi des compétences est reporté de manière individuelle sur un livret de compétence mis à jour régulièrement. Le projet étant classé à un grade sévère, la Structure en charge du Bien-Etre Animal sera impliquée et ce projet fera l'objet d'une évaluation rétrospective. Les rongeurs seront hébergés selon les conditions de la réglementation 2010/63, en unités ventilées: Tous les animaux bénéficient d’un logement, d’un environnement, d’une alimentation, d’un apport en eau et de soins appropriés à leur santé et à leur bien-être. Les conditions d’environnement et les paramètres d’ambiance dans lesquels les animaux sont utilisés font l’objet de vérifications quotidiennes. Un cycle jour/nuit de 12h/24h est assuré de façon automatique et la température est maintenue constante à 22°C. Tous les animaux disposeront d’un espace suffisant présentant une complexité adéquate pour leur permettre d’exprimer un large répertoire de comportements normaux. Les normes d'hébergement appliquées prenent en compte le nombre, le poids des animaux et la dimension de la cage. Leur environnement sera enrichi (igloo, petite buchette, neslet pour les souris et tunnel, grande buchette, neslet pour les rats) afin d'éveiller leurs sens, leur curiosité, leur activité physique. Il n'est pas prévu d'administrer de molécule autre que celle du client. Il n'y a donc pas de possibilité́ de réaliser un traitement anti-inflammatoire ou anti-douloureux sans compromettre les résultats de l'étude car le but du modèle est d'étudier l'effet de nouveaux composés sur le développement des maladies intestinales inflammatoires dont l'inflammation est une composante majeure. Ainsi, un traitement anti-inflammatoire ou analgésique pourrait interférer avec le composé testé et biaiser le score établi pour caractériser la maladie ainsi que les paramètres mesurés (masure de la production de cytokines inflammatoires, recrutement de cellules immunitaires…). En effet, ces composés utilisent les mêmes voies de signalisation que celles des composés clients à tester. Les animaux seront tout de même pesés et leur aspect général sera suivi quotidiennement après l'induction de la maladie et jusqu'à l'euthanasie par les expérimentateurs ayant connaissance du modèle (grilles de score spéifiques permettant de définir les points limites).
Choix des espèces
D'une part, l’utilisation de modèles animaux dans l’étude des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin est très largement documentée dans la littérature scientifique. D'autre part, l'utilisation de rats et de souris se justifie par leur proximité avec l'Homme (mammifères). En effet, l'homologie entre les rongeurs et l'Homme facilite considérablement les procédés de modélisation des pathologies humaines et par conséquent, les interprétations qui en découlent. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (à partir de 7 semaines), lorsque toutes leurs fonctions biologiques sont matures, afin d’obtenir des paramètres d’induction de la maladie reproductibles.
Mise au point de modèles de migraine par injection de neuropeptides chez des animaux mâles et femelles
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Choisi parce qu'il est "couramment utilisé au sein du laboratoire depuis de nombreuses années", le rat est l'espèce retenue pour ces deux modèles de migraine. 600 rats, mâles et femelles, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin pour prélever leur cerveau. Ils reçoivent une injection de neuropeptide directement dans un ganglion nerveux sous anesthésie, puis leur sensibilité cutanée est mesurée pendant quatre heures, par application de filaments fins et jet d'air toutes les trente minutes. Le porteur annonce des points limites fixés par une grille de scores sans dire lesquels, tout en identifiant la douleur comme la principale nuisance du protocole.
Objectifs
Dans notre étude, nous utilisons deux modèles de migraine chez le rat en injectant deux neuropeptides qui jouent un rôle dans les migraines mais agissent différemment. L'un est déjà une cible pour des traitements car il provoque l'élargissement des vaisseaux et augmente la sensibilité aux douleurs dans la tête. Le second, lui, agit autrement et pourrait aider les patients qui ne répondent pas aux traitements ciblant le premier. En comparant ces deux substances, nous cherchons à mieux comprendre leurs effets dans les migraines, et à voir comment elles influencent différemment les mâles et les femelles. Cela pourrait mener à des traitements plus adaptés aux besoins individuels.
Bénéfices attendus
À court terme, ce projet va nous permettre de développer un modèle animal de migraine plus proche de la réalité clinique. Cela nous aidera à mieux comprendre les mécanismes de la migraine, à identifier des différences entre mâles et femelles, et à découvrir de nouvelles options de traitement. La migraine touche plus souvent les femmes, mais la plupart des études ont été faites sur des mâles, alors qu’on sait que le sexe et les hormones influencent la façon dont la migraine se manifeste. À moyen terme, comprendre ces différences et le rôle de différentes zones du cerveau dans ce modèle nous permettra d’approfondir nos connaissances sur la migraine. Par ailleurs, bien que les triptans soient les médicaments spécifiques de la migraine, ils ne fonctionnent que pour environ 60 % des personnes, ce qui laisse penser qu'il existe d'autres mécanismes en jeu.
Procédures
Mesure de la sensibilité cutanée : le jour de l'injection pendant 4h ; cette mesure se fait par l'application de filaments fins sur la peau de l'animal et par l’envoi d’un jet d’air toutes les 30 min pendant 4 h après l'injection des molécules en intra-ganglionnaire (chaque application dure 3 secondes).
Impact sur les animaux
Les injections de neuropeptides induisent une douleur modérée. Une gêne est observée après injection, sans entraver les mouvements. Les injections intra-ganglionnaires provoquent un stress et une inflammation locale modérés. L’anesthésie constitue une nuisance légère, avec un risque de perturbations respiratoires ou cardiovasculaires. Les stimulations mécaniques (filaments de Von Frey, AirPuff) entraînent une douleur modérée. Les manipulations répétées induisent un stress modéré.
Devenir
Les procédures ne permettent pas de réutiliser les animaux. En effet, elles se terminent par des études transcriptomiques, protéiques et immunohistochimiques qui nécessitent de prélever le cerveau : les animaux seront donc mis à mort à la fin de la procédure.
Remplacement
Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. En effet il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique simultanément.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe est fixé à un maximum de 10 pour assurer une étude fiable, en tenant compte des étapes clés comme l’habituation, les injections, les observations comportementales, les prélèvements et la préparation des échantillons. Les études comportementales étant un facteur limitant, nous prévoyons suffisamment d'animaux pour garantir des résultats solides pour ce modèle de migraine. Enfin, pour prendre en compte les différences entre mâles et femelles dues aux hormones, l’étude inclura les deux sexes.
Raffinement
Avant les études comportementales, les animaux sont placés dans des cages enrichies (tunnels et contacts sociaux) pendant une semaine, puis habitués au nouvel environnement pendant 4 jours pour réduire leur stress. Avant les injections, les rats sont anesthésiés, vérifié par l'absence de réflexe de retrait. La douleur est la principale nuisance identifiée, et pour les stimulations mécaniques, nous suivons les recommandations internationales pour limiter leur durée et intensité. Plusieurs critères seront surveillés quotidiennement durant tout le temps des procédures, et des points limites ont été établis par une grille de scores.
Choix des espèces
Le rat est couramment utilisé au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires. C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Les animaux seront âgés de 6-8 semaines pour la comparaison avec les autres données de la littérature. Etant donné que les réponses neurobiologiques aux migraines peuvent différer entre les sexes, mâles et femelles seront inclus dans cette étude.
Identifier les mécanismes responsables des maladies autoimmunes ciblant les nerfs périphériques
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
Une chirurgie d'une heure pour implanter une canule, une immunisation sous-cutanée et deux injections dans l'abdomen : 180 rats Lewis vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, 140 d'entre eux en gravité sévère. Les rats développent une faiblesse musculaire et des difficultés à se mouvoir, le protocole cherchant à reproduire une neuropathie inflammatoire humaine. Le porteur écrit ne pas s'attendre à des signes de douleur, au motif que les patients n'en présentent pas, alors que la gravité déclarée est sévère pour la grande majorité des animaux. Un rat qui devient hémiplégique est mis à mort.
Objectifs
La neuropathie inflammatoire est une maladie rare affectant les nerfs périphériques et pouvant entraîner des paralysies importantes. Au cours des dernières années, nous avons identifié chez certains patients la présence d'autoanticorps (anticorps ciblant le soi). Ces autoanticorps sont associés à des formes très sévères de la maladie pouvant nécessiter un séjour en unité de réanimation. A l'aide de modèles animaux, nous avons montré au cours des cinq dernières années que certains anticorps sont responsables de la pathologie. Ces modèles ont été très importants et ont permis de motiver l'utilisation de traitements spécifiques qui se sont avérés très efficaces chez les patients. Les mécanismes par lesquels ces anticorps entraînent les paralysies n'ont pas encore été identifiés. L'objectif de ce projet sera d’utiliser des modèles animaux afin d’élucider comment ces anticorps agissent et trouver des traitements ciblés. Un deuxième objectif sera de tester une nouvelle stratégie thérapeutique.
Bénéfices attendus
La compréhension des mécanismes responsables des paralysies chez les patients est indispensable pour permettre la sélection des traitements chez les patients. Aujourd’hui de nombreux médicaments sont disponibles, par contre il est difficile de savoir quel médicament est le plus efficace pour un type de pathologie. Nos travaux auront pour but de montrer comment les autoanticorps agissent et d’identifier les thérapies ciblant ces mécanismes d’action. Ensemble, ces données feront avancer les connaissances sur les maladies rares invalidantes et permettront de faire émerger de nouvelles thérapies.
Procédures
Tous les prélèvements seront réalisés post-mortem. Les animaux recevront trois types différents d'intervention. 1) Deux injections intrapéritonéales espacées de trois jours et qui dureront moins de trente secondes. 2) Une immunisation réalisée grâce à une injection sous-cutanée. La procédure dure 15 minutes et est réalisée une fois sous anesthésie. 3) Une procédure chirurgicale qui consistera à permettre des injections journalières d'anticorps sans douleur. La procédure dure 1 heure et n'est réalisée qu'une seule fois. Elle n'entraîne pas de gênes par la suite.
Impact sur les animaux
Les modèles que nous développerons sont censés mimer une maladie neuromusculaire invalidante. Les patients ne présentent pas de signes de douleur, et les anticorps utilisés n'entraînent pas d'inflammation. Donc nous ne nous attendons pas à voir des signes de douleur chez les animaux. Par contre, les animaux devraient développer une faiblesse musculaire et donc des difficultés à se mouvoir. Pendant cette période, l'environnement sera adapté à l'état de l'animal et les nuisances seront prises en charge. Les animaux seront observés et manipulés tous les jours afin d'éviter un stress ou une détresse des animaux lors des procédures. Pour la procédure 2, les nuisances seront légères. Les procédures entraîneront une douleur lors de la piqûre et un stress lié à cette procédure, mais de courte durée. Pour la procédure 1, la procédure chirurgicale va entraîner une nuisance modérée pouvant durer deux jours après l'opération. Pendant cette période, les animaux peuvent présenter des gênes qui seront prises en charge avec des anti-douleurs et une adaptation de l'environnement à l'état de l'animal.
Devenir
Les animaux impliqués dans les procédures seront tous euthanasiés à l'issue de chaque procédure, car notre étude porte sur les nerfs périphériques.
Remplacement
Malheureusement, il n'existe pas d'autres stratégies permettant de remplacer ce modèle. Il n'existe que des modèles animaux pour cette pathologie soit chez la souris soit chez le rat. Ces modèles de pathologies neuroimmunes sont trop complexes pour pouvoir être recréés in vitro.
Réduction
Nous avons déjà mis en place une étude semblable dans le passé. Grâce à nos études précédentes, nous connaissons la taille des effets attendus et nous pouvons estimer la taille minimale de la cohorte d'animaux dont nous aurons besoin. La taille des cohortes a également été déterminée par une approche statistique. La neuropathie inflammatoire est une pathologie hétérogène, il faut au moins des groupes de 20 animaux pour pouvoir déterminer avec certitude si les résultats sont significatifs ou non. L’étude de groupe de 10 animaux n’est pas suffisante et peut engendrer des conclusions erronées. De plus, il nous faut pouvoir réaliser toutes les études morphométriques, électrophysiologiques et biochimiques.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera suivi de façon journalière afin de nous assurer de leur état réel de bien-être et nous avons établi un score pour évaluer les nuisances. Les animaux seront placés dans un environnement enrichi et seront manipulés tous les jours. Les observations journalières ont pour but de suivre les atteintes locomotrices, mais permettront également l'application des points limites. Si un animal présente une hémiplégie, il sera euthanasié. La douleur sera prise en charge en per-opératoire et post-opératoire. Pour éviter que les procédures entraînent un stress, tous nos animaux seront manipulés à la main plusieurs fois par semaine avant les procédures afin qu'ils soient accoutumés aux manipulations. Les animaux seront élevés dans un environnement calme et propice à l’expression des comportements naturels. Si les animaux ont des difficultés temporaires à se nourrir ou boire, nous introduirons de la nourriture sous forme de gel dans les cages. Lors de la procédure chirurgicale, l'anesthésie sera induite et maintenue grâce à un anesthésique gazeux, l'isoflurane, et une injection sous-cutanée de lidocaïne sera réalisée au niveau du site opératoire afin de diminuer la douleur. Pour éviter les problèmes de déshydratation lors des procédures chirurgicales, les animaux recevront une ou des injections sous-cutanées de solution saline.
Choix des espèces
Nous avons choisi de travailler sur des rats Lewis, car les neuropathies ne peuvent être induites que dans cette souche de rats. De plus, cette lignée est moins agressive. Nous utilisons des animaux adultes uniquement (de 2 à 4 mois) pour trois raisons : 1) La neuropathie inflammatoire est plus difficile à déclencher chez des animaux trop âgés (>6 mois) et trop variables chez des animaux trop jeunes. On préfère donc de jeunes adultes de 2 à 4 mois. 2) Nous nous intéressons à des atteintes des nerfs, il nous faut donc des animaux chez lesquels les nerfs sont bien développés (plus de 2 mois). 3) Pour l’implantation des canules d'injection, il faut des animaux de plus de 2 mois, car les implantations peuvent générer des traumatismes chez des animaux trop jeunes.
Etude de l’architecture fonctionnelle thalamocorticale dans la prise de décision adaptative
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
408 rats vont être utilisés, chacun soumis à des sessions de tâche comportementale de vingt minutes à une heure quinze par jour pendant quatre mois, sous un rationnement alimentaire qui maintient leur poids à 90 ou 95 % du poids initial pendant trois mois. Une partie d'entre eux subit une chirurgie cérébrale d'une heure et demie, avec injection de composés et implantation à demeure d'une fibre de verre. Tous seront tués pour vérification histologique, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le porteur décrit la faim ainsi entretenue comme une "légère sensation" garantissant la motivation, et renvoie les retombées pour les pathologies mentales à une "perspective translationnelle".
Objectifs
La prise de décision est un processus essentiel du comportement humain. Ce processus complexe nécessite d’apprendre de son environnement afin d’emmagasiner des connaissances mais également de s’adapter aux changements. Une prise de décision adaptée nécessite ainsi un équilibre entre les comportements d’exploitation (utilisation des connaissances acquises) et d’exploration (recherche d’options plus favorables) qui peuvent être fidèlement modélisés chez le rat afin d’en établir les bases neurales. Le projet vise à étudier les circuits cérébraux qui permettent une prise de décision adaptée dans un environnement changeant chez le rat. Nous souhaitons dans ce projet étudier la connectivité de voies connues pour être impliquées dans la prise de décision mais dont le rôle précis n’est pas encore décrit. Dans un premier temps nous réaliserons une étude descriptive de la connectivité entre les différentes régions, puis nous testerons leur implication fonctionnelle en procédant à des déconnexions réversibles, afin de déterminer leur rôle précis.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de préciser la connectivité des voies impliquées dans la prise de décision ainsi que de préciser le rôle d’une population neurone de cette voie. Une hypothèse majeure actuelle est que la prise de décision mal adaptive qui caractérise un grand nombre de pathologies mentales (par exemple la schizophrénie) est associée à un syndrome de dysconnectivité de ces régions, ce projet fondamental a donc une claire perspective translationnelle.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à une tâche comportementale dont les sessions durent entre 20mn et 1h15 par jour pour une durée maximale de 4 mois. Ils seront soumis également à un rationnement alimentaire léger (permettant de conserver 90-95% de leur poids initial) qui durera maximum 3 mois. Les animaux de la procédure 2 subiront une chirurgie d’injection intra cérébrale de composés et d’implantation à demeure d'une fibre de verre très fine d’une durée maximale d’une heure et demie.
Impact sur les animaux
Les chirurgies du cerveau présentent un risque de diminution du bien-être animal dans les moments/jours qui suivent la chirurgie (inconfort, fatigue et parfois douleur). Afin de garantir la motivation des animaux pour la tâche comportementale ils seront mis en régime alimentaire spécifique (90 à 95% de maintien du poids), ce qui impacte très peu leur bien-être (légère sensation de faim garantissant la motivation des animaux à obtenir une récompense alimentaire). Certains animaux recevront des injections d’un produit ne provoquant pas de douleur. L’animal subit ainsi une restriction de mouvements ainsi que l’introduction d’une aiguille, l'ensemble peut provoquer un léger stress ainsi qu'une légère douleur.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de procéder aux vérifications histologiques et à l'étude de marqueurs neuronaux
Remplacement
Etudier le fonctionnement du cerveau, et dans notre cas la prise de décision ne peut, par définition, s’étudier que chez des organismes entiers. L’approche expérimentale chez l’homme n’autorise pas la manipulation fine des circuits neuronaux qui est nécessaire à la compréhension de leur fonctionnement. De même, les approches alternatives faisant appel à la modélisation sont utiles mais restent complémentaires des approches expérimentales sur les animaux qui permettent de valider ces modèles.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été calculé comme étant le nombre minimum nécessaire pour être en mesure de mettre en évidence une différence statistique significative sur les paramètres étudiés grâce à l’utilisation de tests robustes. Ainsi, 12 animaux par groupe seront nécessaires. Cependant le nombre de groupes pourra être réduit en cours de projet : si une des voies étudiées ne montre pas de résultats significatifs sur les premiers lots elle ne sera pas étudiée sur les lots suivants.
Raffinement
Le bien-être animal étant essentiel pour garantir des données comportementales exploitables, toute souffrance sera évitée. Les animaux bénéficieront d’un enrichissement adapté (matériel de nidification, tunnel et barre à ronger) et seront hébergés en cage collective, même après les chirurgies. Les protocoles de chirurgie ont été optimisés afin de garantir des conditions optimales (analgésie centrale, locale, gel oculaire, tapis chauffant, scoring post-opératoire). Des points limites généraux et spécifiques ont été identifiés et des mesures conservatoires mises en place afin de permettre une prise en charge optimale de la douleur et de l’inconfort.
Choix des espèces
D’une façon générale les rongeurs sont un bon modèle d’étude du système nerveux. Les principes fonctionnels à l’œuvre dans ces circuits sont transposables à l'homme. De plus, de nombreuses épreuves comportementales spécifiques permettent de modéliser chez le rat des aptitudes cognitives complexes. Les animaux utilisés pour ce projet seront des jeunes adultes âgés d’environ 3 mois au début des expériences afin de limiter la variabilité de taille entre individus.
Étude d’une rectification du statut vitaminique dans le cadre de l’inflammation intestinale et de troubles psychiques induits par une carence précoce en vitamines B9 & B12 (lien intestin-cerveau)
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
Carencées en vitamines B9 et B12 un mois avant l'accouplement et jusqu'au sevrage, quinze rates reproductrices donnent naissance à 50 femelles qui reçoivent des injections tous les deux jours, de 21 à 60 jours d'âge. Les 65 rats seront tous tués pour prélèvements de tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. L'objectif déclaré est de vérifier si une supplémentation vitaminique corrige les comportements de type dépressif observés chez la descendance lors d'une thèse antérieure, avec l'imipramine comme comparateur. Le porteur annonce neuf tests comportementaux répartis sur six semaines et ne nomme que le test de la nage, dont il indique avoir ramené la durée de dix à cinq minutes.
Objectifs
Ce projet fait suite aux résultats obtenus lors des travaux d’une thèse récente où nous avons montré que la descendance de mères carencées en vitamines B9 et B12 pendant la gestation et la lactation, présentait des comportements de type dépressif, une augmentation de l’anxiété ainsi qu’une diminution des interactions sociales. Par ailleurs, les femelles semblent plus sensibles et nous avons montré une corrélation des mécanismes biologiques interstinaux et du cerveau. Les mâles eux, ne présentaient que très peu des paramètres biologiques modifiés. Fort de ces résultats, ce projet vise donc à évaluer l’intérêt d’une compensation vitaminique B9/B12. L’hypothèse est d’observer une compensation, puis un rééquilibrage des mécanismes intestinaux et cérébraux, en parallèle d'une diminution des symptômes liés aux troubles psychiques, et de proposer une alternative aux traitements pharmacologiques. Cette évaluation sera comparée notamment avec un traitement de référence « anti-dépresseur » pharmacologique (l’imipramine). Nous proposons de nous concentrer dans un premier temps sur les femelles, en raison de la présence chez elles (au contraire des mâles) de l’ensemble des marqueurs qui suggèrent ces mécanismes. Ce projet de courte durée est tout à fait pertinent pour une étude de niveau Master; mais nous prévoyons déjà d’investiguer les mâles dans un projet plus conséquent (Doctorat de trois ans) en parallèle de l’investigation d’autres mécanismes suggérés par nos travaux récents.
Bénéfices attendus
Du fait qu'il est établi un lien fort entre des troubles de l’humeur (stress, anxiété…) ou encore des maladies psychiques (dépression, autisme…) et la prévalence concomitante de troubles intestinaux chroniques inflammatoires, les bénéfices attendus sont (1) l’éventualité de traiter certains patients par une voie non-pharmacologique et (2) de proposer un nouvel axe mécanistique pour les patients non-répondeurs aux traitements classiques qui ne prennent pas en compte les aspects intestinaux dans les troubles psychiques.
Procédures
Des femelles adultes reproductrices seront soumis à une carence alimentaire en vitamines B9 et B12 un mois avant l'accouplement et jusqu'à la fin de l'allaitement, mais celle-ci n’engendre pas de nuisance physique notable d’après nos précédentes études de mêmes type au laboratoire. Les rats descendants des mères reproductrices seront soumis à des injections répétées tous les deux jours de 21 jours à 60 jours d'âge, mais de très courtes durée (quelques secondes). Ces descendants subiront aussi deux prélèvements sanguins à 21 jours et 60 jours d'âge, sous anesthésie pour un recueil d’un petit volume (quelques gouttes ce prélèvement dure moins d'une minute). Les descendants passeront neuf tests comportementaux observationnels dans des dispositifs simples standardisés et déjà connus et maîtrisés. Chaque test est court de 2 à 5 minutes maximum et ils sont répartis de 19 jours à 60 jours d'âge. Ces tests comportementaux ont pour objectif l'évaluation des capacités locomotrices, cognitives et psychiques (stress, anxiété et marqueurs de dépression).
Impact sur les animaux
Les injections sur les individus peuvent être considérées comme inconfortables, cependant elles sont de très courtes durée (quelques secondes). Les prélèvements sanguins peuvent être considérés comme inconfortables mais ces prélèvements seront effectués sous anesthésie et le recueil ne sera que d’un petit volume (quelques gouttes). Les animaux passeront des tests comportementaux standardisés en neurobiologie. Ils sont observationnels plutôt que interventionnistes sur l’animal et ne génèrent pas ou très peu de stress ou inconfort. Seul le test de la nage peut générer un stress ponctuel, mais il a été aménagé par rapport à la description originelle de ce test (réduction du temps total de 10 minutes vers 5 minutes et empêchement total de tout effet physique ou psychique négatif majeur).
Devenir
Les 15 mères reproductrices seront euthanasiées pour prélèvements tissulaires au sevrage de leurs descendants. Les 50 descendants femelles objet de l'étude seront euthanasiées pour prélèvements tissulaires à 61 jours d'âge.
Remplacement
Ce projet est centré sur les mécanismes biologiques de communication entre cerveau et intestin, aussi il n’est pas possible d’investiguer par un autre moyen que des animaux vivants. Une approche globale sur "animal entier" est nécessaire pour étudier la dynamique et l’intégralité du dialogue intestin-cerveau
Réduction
De précédents travaux sur le même sujet indiquent que les femelles sont particulièrement affectées par les mécanismes intestinaux perturbant le fonctionnement cérébral en lien avec l’anxiété et la dépression. Aussi, nous proposons de ne travailler dans un premier temps que sur des femelles (réduction du nombre de lots et donc d’individus). Les mâles présentent également quels marqueurs biologiques dérégulés, mais pas dans les mêmes proportions que les femelles. Les résultats issus du présent projet pourront orienter nos hypothèses pour les mâles et nous proposerons l’étude sur les mâles à l’issu du présent projet. Afin d’évaluer le nombre de rats nécessaires pour ce projet nous utilisons un logiciel spécifique, qui permet un calcul prédictif au plus juste scientifiquement. 5 groupes expérimentaux seront comparés entre eux, et nous obtenons par calcul un effectif total de 50 animaux; d’où 10 rats femelles par groupe. A ceci s'ajoutent 15 femelles adultes reproductrices qui génèreront les 50 animaux de l'étude.
Raffinement
Dès leur réception, les animaux auront une période d’acclimatation de deux semaines pour s’adapter à leur nouvel environnement. Ils seront hébergés dans une animalerie dotée de la régulation de tous les paramètres nécessaires (température, hygrométrie, filtration de l’air, …) à leur bien-être. Un enrichissement des conditions d'hébergement est prévu avec buchettes de bois et du papier absorbant pour faire un nid. Un suivi quotidien sera effectué pendant toute la procédure et jusqu’à la mise à mort. Les points limites considérés seront : Les points limites sont fixés selon une grille d'évaluation des signes de mal-être établie dans notre EU et validée par notre vétérinaire référent (isolement, yeux fermés, dos voûté, poils hérissés, immobilité, perte de poids de plus de 20% du poids corporel total ou de 15% entre deux pesée consécutives, déshydratation, yeux et abdomen creux). Les animaux seront anesthésiés sous isofluorane (3,5% induction, 5% maintien) préalablement à l’euthanasie.
Choix des espèces
Le projet de recherche nécessite le recours à des analyses physiologiques, cellulaires, biochimiques et moléculaires en lien avec des régimes nutritionnels spécifiques. Les rats sont classiquement utilisés pour la recherche sur la physiologie et le métabolisme. De plus, il a été montré dans la littérature que les rats constituent un bon modèle d’étude de l’axe intestin-cerveau notamment pour l’étude des troubles psychiques (stress, dépression et anxiété) et de l’hypersensibilité intestinale. Les femelles adultes génitrices seront reçues du fournisseur entre 6 et 8 semaines d'âge et gardées jusqu'au sevrage de leurs descendants, puis mises à mort pour prélèvements tissulaires. Les descendants objet principaux de l'étude seront suivis de leur naissance jusqu'à 61 jours d'âge, puis mis à mort pour prélèvements tissulaires.
Neurostimulation des voies dopaminergiques in vivo par des ultrasons de basse énergie chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Le crâne est ouvert pour y descendre une microélectrode en fibre de carbone et un émetteur d'ultrasons, au cours d'une chirurgie de trois à quatre heures menée sous uréthane. 50 rats vont être utilisés, opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil, le porteur indiquant que le réveil après une chirurgie du crâne entraînerait des souffrances inutiles. L'objectif est de vérifier si des ultrasons de basse énergie déclenchent une libération de dopamine dans un cerveau intact, étape que le porteur juge nécessaire avant tout essai chez l'humain. Il écrit par ailleurs que l'uréthane est difficile à manipuler, avec un risque de variation de l'état de conscience des animaux, et retient précisément le réveil de l'animal comme point limite de la procédure.
Objectifs
La neurostimulation par ultrasons de basse énergie (low-energy ultrasound ou LEUS) est une méthode prometteuse pour stimuler des régions cérébrales de façon non-invasive et avec grande sélectivité spatiale limitée à quelques mm3 de tissu nerveux. La neurostimulation par les LEUS a déjà été testée chez l’animal, et a été capable d’évoquer des mouvements des membres, des vibrisses chez le rongeur, voire des yeux. Cependant, les effets cellulaires des LEUS et les mécanismes biologiques de cette stimulation demeurent largement inconnus. Un verrou important consiste à comprendre comment les LEUS affectent la neurotransmission, le mécanisme fondamental par lesquels les neurones libèrent des neurotransmetteurs et transmettent des signaux chimiques à leurs voisins. In vitro, les LEUS sont capables d’induire des libérations de calcium intracellulaire et d’évoquer une libération de dopamine par des neurones en culture. Cependant, la pertinence de ces effets in vivo au sein d’un cerveau intact reste inconnue. Ce projet se focalisera sur les neurones dopaminergiques du rat. La libération de dopamine peut être monitorée en routine par la technique de voltamétrie cyclique rapide à l’aide de microélectrodes en fibre de carbone. L’objectif de ce projet est de tester in vivo l’hypothèse selon laquelle la stimulation par LEUS des voies dopaminergiques induit une libération de dopamine dans le cerveau, démontrant ainsi que les LEUS ont bien la capacité d’exciter les neurones in vivo et de stimuler la libération de neurotransmetteurs.
Bénéfices attendus
L'ensemble de ce projet permettra d'évaluer le potentiel des LEUS pour stimuler le cerveau de façon non invasive et localisée chez l’homme à des fins curatives. Il s’agira de la première évaluation de ce type in vivo et cette approche apportera des informations cruciales sur les mécanismes biologiques mis en jeu par la stimulation par LEUS dans le cerveau. Il existe déjà des pathologies neurologiques humaines dont les traitements utilisent la neurostimulation. Par exemple, les patients atteints de maladie de Parkinson et ne répondant plus aux traitements pharmacologiques peuvent recevoir une électrode de stimulation pour compenser la perte de dopamine dans leur cerveau. D’autre pathologies humaines pourraient bénéficier d’une approche thérapeutique par neurostimulation mais les développements de ces thérapies sont limités par les risques liés à l’implantation d’électrodes invasives dans le cerveau. La technique de neurostimulation par LEUS pourrait offrir une alternative prometteuse pour remplacer les méthodes de neurostimulation invasive dans la maladie de Parkinson et peut-être ouvrir la voie vers de nouvelles thérapies à base de neurostimulation.
Procédures
Procédures chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie sans réveil d'une durée de 3-4 h.
Impact sur les animaux
L’ensemble des procédures expérimentales seront effectuées sur l’animal anesthésié sans réveil. L’uréthane est difficile à manipuler , avec un risque de variation d’état de conscience des animaux. L'utilisation longue peut entrainer un risque de dégradation des fonctions physiologiques difficiles à maitriser.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux en fin de chirurgie car le réveil de l'animal après une chirurgie du crâne entrainerait des souffrances inutiles.
Remplacement
La technique de neurostimulation par les LEUS a déjà été testée in vitro sur des neurones en cultures ainsi que sur des explants de cerveau. L'étape in vivo chez l'animal est maintenant nécessaire avant de passer chez l'homme afin de vérifier l'efficacité de la stimulation et son innocuité.
Réduction
Les effectifs des groupes ont été réduits au maximum afin de permettre une mise au point sérieuse des procédures : 10 rats pour la mise au point de la détection de dopamine, 10 rats pour la mise au point des paramètres d'angulation des électrodes, 20 rats pour l'optimisation des paramètres de la stimulation LEUS. Nous pourrons procéder à des comparaisons statistiques de différents paramètres de stimulation par LEUS à partir d'un effectif de 6 animaux par groupe. Par exemple, la comparaison entre les paramètres LEUS optimaux et la stimulation électrique de référence pourra être menée à bien avec ces effectifs.
Raffinement
Concernant la douleur, un traitement analgésique est prévu avant la chirurgie. La chirurgie est pratiquée sous anesthésie générale en appliquant les points limites définis par (1) un réveil de l'animal et (2) l'apparition d'une hemorragie incontrôlée au niveau du scalp. Concernant l'angoisse infligée à l'animal, elle est réduite par un hébergement par groupes de deux à six dès l’arrivée au laboratoire et par l’insertion d’un enrichissement dans les cages d’hébergement (tuyau en PVC transparent, matériau de nidification).
Choix des espèces
Le rat est une espèce qui a été largement caractérisée pour la libération de dopamine dans le cerveau évoquée par une stimulation électrique. Les procédures permettant de réaliser cette mesure ont été décrite dans la littérature et serviront de base à notre approche expérimentale. Les données de la litérature semblent indiquer que le rat permet une détection de dopamine plus robuste que la souris. Rats adultes de 6-10 semaines pour bénéficier d'une taille maximale
Rôle du système sérotoninergique dans la physiopathologie des douleurs neuropathiques
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une grille de score quotidienne et un arbre décisionnel peuvent conduire à la mise à mort avant terme, cas que le porteur estime à moins de 2 % des animaux. 1 834 rats vont être utilisés, dont 1 738 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Après un diabète déclenché chimiquement, ils développent pendant toute la durée de l'étude une allodynie et une hyperalgésie déclarées sévères, une soif et des urines abondantes également sévères, une fonte musculaire modérée, et subissent entre neuf et onze injections ainsi que des tests de sensibilité répétés toutes les trente minutes pendant trois heures. La raison de la mise à mort tient en une ligne du RNT, l'état douloureux chronique de l'animal, état que le protocole a lui-même installé pour évaluer des antalgiques.
Objectifs
La neuropathie diabétique est une des complications les plus fréquentes du diabète de type 1 (DT1, insulino-dépendant) et de type 2 (DT2, insulino résistant) touchant jusqu’à 50% des patients diabétiques et responsable de neuropathie douloureuse pour 50% d’entre eux. Ses principaux symptômes associent des douleurs évoquées (hyperalgie, allodynie), spontanées (décharges électriques, sensation d’étau, …), une perte de la sensibilité thermique. Les neuropathies douloureuses sont difficiles à traiter et, en raison de leur chronicité, elles sont fréquemment associées à des comorbidités anxieuses, dépressives et cognitives. Ces co-morbidités peuvent interférer avec les actes de la vie courante et avoir un impact important sur la qualité de vie des patients. A l’heure actuelle, trois classes pharmacologiques sont recommandées en 1ère intention dans cette indication : les antidépresseurs tricycliques, les inhibiteurs de la recapture de la sérotonine et de la noradrénaline et les anti-épileptiques ligands des canaux calciques voltage-dépendants. Néanmoins, ils ont une efficacité limitée d'où un besoin urgent d’innovation thérapeutique. Sur la base de ce constat clinique, la modélisation de la neuropathie diabétique douloureuse est une nécessité. Le modèle de neuropathie diabétique chimiquement induite reproduit les mécanismes lésionnels métaboliques du DT1 associés aux symptômes de d'hypersensibilité et aux co-morbidités cognitives. Nous proposons d’étudier dans ce modèle animal à haute valeur translationnelle, l’implication de récepteurs de la sérotonine, dans les mécanismes physiopathologiques de la douleur neuropathique afin de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques permettant d’améliorer la prise en charge des douleurs neuropathiques. Les données précédemment acquises indiquent que cet objectif, pourrait être atteint en modulant l’activité de récepteurs de la sérotonine. Ce projet, qui mettra en œuvre des approches comportementales, pharmacologiques et moléculaires a pour but d’identifier les mécanismes spinaux sous-tendant les effets bénéfiques des modulateurs testés sur la douleur neuropathique diabétique.
Bénéfices attendus
Si l’administration des agents pharmacologiques permet de soulager les symptômes douloureux et les co-morbidités associées, alors on peut espérer i) soit le repositionnement de certains de ces agents déjà introduits dans des essais cliniques pour une autre indication (troubles cognitifs associés à la maladie d’Alzheimer), ii) soit le développement de nouveaux agents. Au vu du nombre croissant de patients atteints de diabète dans le monde, de la sévérité des douleurs neuropathiques, de l'efficacité très limitée et des nombreux effets indésirables des traitements disponibles, le développement de thérapeutiques médicamenteuses efficaces dans le traitement des douleurs neuropathiques est fortement attendu.
Procédures
Les animaux vigiles sont soumis à des tests comportementaux de sensibilité 21 jours après l'induction du diabète puis, après l'administration de l'agent pharmacologique ou du véhicule, 1 fois toutes les 30 min pendant 3 h maximum (au total entre 5 et 7 mesures). Le test de cognition est réalisé une seule fois, 21 jours après l'induction du diabète, il dure 10 minutes. Les animaux rentrant dans deux procédures ne subissent qu'un seul test de sensibilité et le test cognitif. Entre leur arrivée et leur mise à mort, les animaux subissent: entre 9 et 11 injections. La durée totale de chaque injection (qui comprend l'immobilisation du rat dans la main de l'opérateur et l'injection) est de 10 secondes. Pour mesurer la glycémie, une goutte de sang est recueillie par piqûre de l'extremité de la queue du rat, une ou deux fois pendant toute la durée de l'étude (piqûres espacées de 7 jours). La piqûre et le recueil de la goutte de sang durent 5 secondes.
Impact sur les animaux
Chez les rats diabétiques, un arrêt de la croissance pondérale (sans perte de poids par rapport au poids initial), une polydypsie (sévère), une polyurie (sévère), une perte de la masse musculaire (modérée), une apparition d’une allodynie et/ou d'une hyperalgésie (sévère) persistant pendant toute la durée de l’étude sont attendus. Injections réalisées sur animal vigile : stress (modéré) lié à l’immobilisation du rat dans la main de l’opérateur et douleur (légère) liée à la piqure. Tests comportementaux réalisés sur animal vigile : stress (modéré) dû au changement de salle (salle de stabulation vers salle d’expérimentation). Stress (modéré) lors des tests de sensibilité dû à l’immobilisation du rat entre les mains de l’opérateur (durée 15 sec). Aucun effet indésirable majeur n’est attendu après administration des agents pharmacologiques.
Devenir
Mise à mort en raison de l'état douloureux chronique de l'animal.
Remplacement
Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole : ces études, menées chez l’animal vigile, sont nécessaires pour appréhender des mécanismes intégrés et pour évaluer la pertinence de traitements antalgiques potentiels sur la douleur et les co-morbidités associées. Le modèle de diabète induit chimiquement fait référence dans la communauté scientifique. Sa répétition est nécessaire afin d’évaluer l’effet de nouveaux composés pharmacologiques sur les symptômes douloureux de la neuropathie et les co-morbidités cognitives associées.
Réduction
n= 8 rats/condition (traitement); la taille de l’échantillon a été définie selon la variabilité (10%) des paramètres étudiés (hyperalgie, allodynie ; troubles cognitifs) grâce à une approche statistique. Les rats diabétiques ayant reçu le véhicule lors du test de stimulation thermique seront introduits dans le test de cognition. Ainsi, 160 rats (80 mâles et 80 femelles) seront concernés sans pour autant augmenter la durée de vie de l'animal. Les rats ne développant pas d'hyperglycémie sont systématiquement réinjectés 7 jours plus tard avec la même dose de l'agent inducteur. S'ils demeurent résistants alors ils seront écartés de l'étude pharmacologique. Ceci permet de limiter à 10% la proportion de rats non diabétiques.
Raffinement
Le protocole mettant en jeu un modèle de douleur chronique, une attention particulière est portée aux animaux, aux conditions de stabulation et aux soins post-induction du diabète. Les rats sont observés tous les jours et évalués à l’aide d'une grille de score spécifique au modèle; des points limites adaptés au modèle et un arbre décisionnel sont mis en place , pouvant conduire à la mise à mort de l'animal (très rare < 2%). En raison de polydipsie et de polyphagie développées après l'induction du diabète, les personnels veillent à ce qu’il y ait un apport en eau suffisant et permanent (2 biberons de capacité double/cage) ainsi qu’en granulés dans la mangeoire. Les rats diabétiques sont stabulés à raison de 3 rats/cage maximum, le milieu des cages est enrichi par des tunnels en matière plastique, des morceaux de bois à ronger, du coton pour construire un nid et les litières sont partiellement changées quotidiennement en enlevant une partie de la sciure souillée et en apportant de la sciure fraiche afin de conserver l'environnement olfactif du rat.
Choix des espèces
Le choix du rat est justifié par i) sa pertinence physiologique (nombreuses similarités structurelles et fonctionnelles de son système nerveux avec l’humain) pour permettre des extrapolations ; ii) la richesse de ses comportements facilement observables et mesurables, reproductibles, pour l’étude des fonctions cognitives et de la douleur ; iii) sa facilité de manipulation et sa docilité, iv) son cycle de vie court (permettant d’étudier en quelques semaines les effets d’une pathologie chronique qui évolue sur plusieurs mois chez l’homme) ; v) la possibilité de développer des modèles de maladies humaines, dont le diabète de type 1, permettant de tester de nouvelles thérapies potentielles avant de passer aux essais cliniques chez l’humain. Rats jeunes adultes (âgés de 7-8 semaines): des jeunes adultes sont préférés car le taux de létalité est plus bas (3 % chez les 6-11 semaines et 220-400 g) que chez des rats plus âgés (83 % chez les rats de 12-17 semaines).
Mise au point de virus adéno-associés ciblant les cellules souches du muscle squelettique à des fins de thérapie génique
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Chaque rat reçoit une injection dans le muscle sous anesthésie, puis deux jours d'analgésie, avant d'être tué pour des prélèvements histologiques et moléculaires. 480 rats vont être utilisés dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. L'objectif est de tester des séquences d'ADN censées limiter l'expression d'un gène thérapeutique aux seules cellules souches du muscle, en vue de thérapies géniques contre les myopathies. Le porteur indique utiliser à la fois des rats sauvages et des rats porteurs d'une mutation du gène Dmd, qui reproduit la dystrophie de Duchenne, sans dire combien d'individus relèvent de chaque groupe, et précise que ces rats seront tués vers l'âge de deux mois, avant l'apparition des atteintes les plus marquées.
Objectifs
Les cellules souches du muscle squelettique (aussi appelées cellules satellites) sont essentielles dans le processus de la régénération musculaire, et pourraient être la population cellulaire clé pour les thérapies géniques pour lutter contre des myopathies. Par contre, ces cellules sont entourées par plusieurs autres types de cellules. Les thérapies géniques pour certaines maladies musculaires pourraient être améliorées en utilisant des vecteurs de gènes ciblant spécifiquement ces cellules souches, et en évitant ainsi l’expression des gènes apportés (transgènes) dans d’autres populations cellulaires, qui pourraient déclencher des réponses immunitaires. Nous allons utiliser des virus adéno-associé (AAV) pour tester des séquences régulatrices de gènes seulement exprimés dans les cellules satellites, afin de créer des vecteurs qui peuvent cibler les cellules souches du muscle squelettique. Des rats sauvages ou avec une dystrophie musculaire provoquée par mutation du gène Dmd, responsable de la production de la dystrophine, seront injectés par voie intramusculaire avec les AAVs. Le ciblage des cellules souches sera examiné par analyse en immunofluorescence sur coupe histologique et cytométrie en flux.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à identifier des séquences d’ADN qui permettent une expression spécifique des transgènes dans les cellules souches du muscle squelettique. De telles séquences ne sont pas connues à ce jour, donc cette identification représentera une avancée importante dans notre connaissance du ciblage et de la régulation génique dans les cellules souches. Du point de vue clinique, ces séquences seraient essentielles pour des thérapies géniques ciblées pour les cellules souches, pour éviter des effets non-ciblés et des réponses immunitaires.
Procédures
Dans ce projet, les animaux recevront une injection intramusculaire sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Nous attendons une douleur légère liée avec l’injection intramusculaire, qui sera traitée avec des analgésiques pendant deux jours suivant l’injection. Les rats DMD ne présentent pas des effets délétères majeurs du phénotype avant l’âge de 10 mois, et dans ce projet, ils seraient mises à mort à l’âge de 1,5-2 mois.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires.
Remplacement
Nous réalisons des cultures de myoblastes en première intention pour tester nos séquences d’intérêt. Malheureusement, ces cultures restent loin de la situation in vivo puisque les vraies cellules souches du muscle sont quiescentes chez l’adulte, se divisant rarement, ce qui rend impossible la mise au point d'un système d'étude représentatif in vitro. De plus, nos expériences antérieures ont montré que certaines séquences prometteuses en culture n’avaient pas toujours une activité spécifique in vivo. Compte tenu de ces contraintes, il reste nécessaire de valider les séquences selectionnées dans un modèle animal.
Réduction
Le calcul de puissance statistique nous recommande d’utiliser 8 rats par AAV et point de temps. Ce nombre a été validé avec d’autres projets similaires terminés pour lesquels nous avons pu conclure de façon significative.
Raffinement
Les animaux sont stabulés en portoirs à cages ventilées, dans des pièces dont la température et l’hygrométrie sont contrôlées, monitorées et fidèles à la règlementation. Pour le bien-être des rats, nous avons fait le choix des plus grandes cages disponibles sur le marché, de sorte qu’ils peuvent marcher, courir et se dresser sur leurs pattes arrière. Cet exercice spontané quotidien est pleinement justifié pour des rats dont nous évaluons les capacités locomotrices. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères, à l’âge d’un mois. L’isolement n’existe jamais et le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft, des bâtons de bois à ronger, des balles rondes, des tunnels ou des carrés de coton compacté. Pour éviter une réponse de stress induite par les divers tests, les animaux seront habitués dès leur plus jeune âge à être manipulés régulièrement, le plus en douceur possible. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel par ailleurs compétent pour reconnaître, quantifier, atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux. Une grille d’évaluation critériée de la douleur et des points limites pour cette lignée a été établie. Les rats seront constamment évalués en observant individuellement les animaux, week-ends et jours fériés inclus. Toute atteinte des points limites sera suivi d’une action correctrice précisée sur la grille. En cas d’absence de bénéfice (trouble irréversible), nous procéderons à la mise à mort compassionnelle de l’animal avant qu’il ne souffre.
Choix des espèces
Nous avons choisi le rat pour des raisons multiples. D’abord, nous utilisons un modèle de la dystrophie musculaire de Duchenne dans le rat, qui récapitule le phénotype humain. Le rat est aussi un mammifère, et beaucoup des séquences d’ADN que nous allons mettre dans les AAVs sont conservées chez l’humain. Donc si une séquence a une activité forte dans des cellules de rat, il est probable que cette activité sera maintenue dans les cellules humaines. Pour les rats utilisés en procédure 1, les AAVs seront injectés à 4 semaines d’âge, quand le muscle se forme toujours, parce que les cellules souches du muscle sont plus accessibles au virus à ce stade.