Rats
Développements méthodologiques et formations à l’activité d’imagerie par bioluminescence et tomographie en fluorescence chez le rongeur
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
- Système respiratoire
Rats : 100
Jusqu'à quarante séances d'imagerie de deux heures sous anesthésie générale et quarante injections par animal : 500 souris et 100 rats vont être utilisés ainsi, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'objectif déclaré tient à la mise au point de protocoles d'imagerie par bioluminescence et par fluorescence, et à la formation de nouveaux utilisateurs de ces machines, en amont des projets scientifiques des équipes. Le porteur signale des phénotypes dommageables possibles, perte de motricité empêchant l'animal de s'alimenter, crises convulsives, amaigrissement, tumeur de plus d'un centimètre cube gênant l'alimentation ou provoquant une douleur permanente. Il présente ce projet de plateforme comme un moyen de réduire le nombre d'animaux utilisés ailleurs, en évitant de lancer de grandes études dont les résultats ne seraient pas satisfaisants.
Objectifs
L’imagerie par bioluminescence ou par fluorescence du petit animal sont des techniques non invasives qui permettent de suivre des cellules spécifiques en temps réel et au cours de plusieurs sessions (suivi longitudinal). Ce suivi longitudinal est notamment utilisé pour le suivi de la progression d'une maladie ou d'un traitement thérapeutique, la validation de nouveaux biomarqueurs, l’étude du trafic cellulaire, la surveillance des cellules transplantées et les modèles d’expression génique. L’objectif de ce projet consistera d’une part à mettre au point différents protocoles d’imagerie pour répondre par la suite aux besoins des équipes de recherche, et d’autre part à la formation des nouveaux utilisateurs à cette technique. Pour atteindre cet objectif, des expériences en conditions réelles sur animaux anesthésiés doivent être menées.
Bénéfices attendus
Du point de vue scientifique, ce projet permettra de proposer des techniques à la pointe de la technologie pour répondre à des questions scientifiques diverses (suivi au cours du temps de la progression d'une maladie ou d'un traitement, la validation de nouveaux marqueurs, la surveillance des cellules transplantées). Ce projet permettra de mettre en place ou d’optimiser des protocoles d’imagerie par bioluminescence ou par fluorescence sur des lots d’animaux pilotes. A la fin de chaque étude, nous pourrons estimer sa faisabilité avec la méthode choisie et l’équipement disponible, ce qui permettra de ne pas initier d’études impliquant un grand nombre d’animaux lorsque les résultats obtenus ne seront pas satisfaisants. Au contraire, l’acquisition de ces données préliminaires lorsqu’elles sont robustes et pertinentes pourraient être utilisées pour justifier les futures demandes d’autorisation de projets à portée scientifique.
Procédures
Les examens d’imagerie seront réalisés sous anesthésie générale. Nous réaliserons 40 séances maximum par animal (2h maximum par séance) avec minimum 48h entre chaque imagerie. Les injections de molécule pour détecter la bioluminescence seront réalisées sur animal éveillé ou endormi en fonction des nécessités : 40 injections maximum (durée inférieure à 1 minute), avec minimum 48h entre chaque injection. Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire
Impact sur les animaux
L’anesthésie générale nécessaire pour les examens d’imagerie sera associée à une hypothermie, un risque de difficultés cardiorespiratoires, et un risque rare de non-récupération de la vigilance suite à l’anesthésie. Les injections seront associées à une brève et légère douleur au point d’injection, avec un risque d’hématome possible très localement. En ce qui concerne les phénotypes dommageables, nous pourrons observer une perte de motricité empêchant l'alimentation, des crises convulsives, un amaigrissement, un développement d'une tumeur supérieur à1cm3 gênant l'alimentation et/ou l'hydratation et/ou entraînant une douleur permanente.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever puis analyser des tissus d’intérêt
Remplacement
Les développements méthodologiques et optimisations des protocoles existants seront réalisés dans un premier temps sur des échantillons de tissu ou de cellule. Seules les études nécessitant un organisme vivant complexe seront intégralement développées sur l'animal. En effet, les premières étapes permettent de valider des cibles d’intérêt puis l’utilisation d’un organisme vivant dans sa globalité permet d'étudier la complexité des échanges que ce soit au niveau cellulaire, structurel ou entres organes.
Réduction
Le nombre total d’animaux utilisé (600) est réduit au maximum. Selon les études, entre 5 et 10 animaux par lots pourront être utilisés pour valider les protocoles. Cinq animaux est le minimum nécessaire pour obtenir une preuve de concept en validant la faisabilité de la méthode. Un maximum de 10 animaux par lots sera utilisé pour avoir un échantillon suffisant et plus représentatif. L’imagerie par bioluminescence ou par fluorescence est de fait une méthode non invasive pouvant être répétée pour un suivi au cours du temps, évitant ainsi certaines euthanasies à des temps d’intérêt en récoltant les données par ce moyen. De plus afin de limiter le nombre d’animaux, les équipes seront formés avec les animaux utilisés pour les études pilotes quand cela sera possible. Ce projet permettra également de réduire le nombre d’animaux utilisés à une échelle plus globale en réalisant des études pilotes pour des projets scientifiques, ce qui permettra de n’engager qu’un faible effectif d’animaux pour la mise au point des imageries. Ainsi si les résultats ne s’avéraient pas concluants un plus nombre d’animaux ne seraient pas engagés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions contrôlées de température, hygrométrie et éclairage. Les cages sont enrichies (nids, bâtonnets de bois à ronger). Les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une semaine à leur arrivée. Ils sont laissés au calme pendant une demi-heure dans la salle d’expérimentation pour qu’ils s’habituent à ce nouvel environnement. Lors de l’anesthésie générale nécessaire pour réaliser l’imagerie, du gel oculaire sera appliqué sur les yeux des animaux pour éviter tout dessèchement oculaire. De plus, leur température corporelle sera maintenue durant toute la durée de l’anesthésie à l’aide d’une chambre d’induction et de réveil chauffées et d’un plateau chauffant intégré au système d’imagerie. Les animaux seront remis dans leur cage d’origine une fois qu’ils seront parfaitement réveillés. Ils seront à nouveau examinés sous 24 heures pour vérifier leur récupération et plus si le besoin s’en fait ressentir. Nous limiterons le nombre d’imagerie dans la vie de l’animal et nous assurerons d’un délai de récupération de 48h minimum entre chaque session tout en vérifiant au préalable son bon état de récupération. Les animaux seront observés quotidiennement par la zootechnie et une fois par semaine par un membre de l’équipe.
Choix des espèces
Les rongeurs (souris et rat) sont les seules espèces utilisées dans ce type de machine pour acquérir des images capables de donner des détails anatomiques et fonctionnels qui contribuent à répondre aux questions scientifiques posées. Dans notre contexte, les projets de recherche porteront sur l’étude des maladies neurodégénératives, les cancers ou les maladies du foie ou du poumon, pathologies pour lesquelles il existe de nombreux modèles de rongeurs déjà développés. Les animaux pourront être imagés entre 3 semaines et 18 mois, en fonction du protocole des équipes utilisatrices ou de la réutilisation au cours du temps des animaux. Nous essaierons donc de nous placer dans un stade physiologique similaire aux pathologies étudiées afin d’obtenir les meilleures chances de réussite de la transposition de nos résultats à l’Homme. Néanmoins, en l’absence de besoin spécifique pour le développement de la méthode, les animaux utilisés seront de jeunes adultes (âgés de 2 à 6 mois) afin d'avoir des conditions physiologiques les plus courantes possibles pour nos tests.
Mise en évidence du phénomène de désensibilisation hormonale: étude de la production de testostérone chez le rat mâle après traitement à l’hCG
- Enseignement supérieur
Faire manipuler un animal vivant à des étudiants de troisième année de licence : c'est la raison d'être de ce projet, qui utilise 320 rats mâles dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Chaque rat reçoit une injection d'hormone 48 heures avant la séance, subit une chirurgie de trente minutes avec pose d'un cathéter dans la carotide, puis quatre prélèvements sanguins espacés de quinze minutes. Le porteur signale que la pose du cathéter peut entraîner une insuffisance respiratoire, traitée le cas échéant par une trachéotomie réalisée par les enseignants, et que le volume de sang prélevé interdit de garder les rats en vie. La démonstration attendue, l'effet stimulant d'une hormone sur la production de testostérone, est établie de longue date, et l'effectif suit une règle d'organisation, un rat pour deux étudiants.
Objectifs
Le but de ce TP est l’occasion pour des étudiants en L3, engagés dans un cursus où la physiologie animale tient une part importante, de réaliser des expérimentations sur un animal vivant. Ceci est un point fort dans le cursus des étudiants en licence SDV spécialité physiologie animal. Ce TP permet également de mettre en évidence le rôle joué par l’hypophyse via l’hormone gonadotrope LH, sur la sécrétion de testostérone par le testicule adulte chez le rat et également d’illustrer le phénomène de désensibilisation. Ainsi pour de nombreuses hormones polypeptidiques, après une forte stimulation hormonale, l'organe cible devient incapable de répondre à une deuxième stimulation. Dans le cadre du TP, nous utilisons de l'hCG (gonadotrophine chorionique humaine) en remplacement de la LH (hormone lutéinisante) pour mimer cette désensibilisation. L’hCG (human chorionic Gonadotropin) est une hormone analogue de la Luteinizing Hormone (LH) capable comme la LH de stimuler spécifiquement la stéroidogénèse testiculaire. Le coût d’achat de l’hCG étant inférieur à celui de la LH recombinante, nous privilégions son utilisation lors des TP
Bénéfices attendus
Grâce à ce TP, le étudiants pourront apprécier l’effet stimulateur de la LH (hormone lutéinisante) sur la production de testostérone et mettront en évidence la notion de régulation endocrine (régulation hormonale via la circulation sanguine). Ils verront que cette réponse est rapide (quelques minutes). Pour le lot d'animaux désensibilisés, ils constateront que le testicule n’est plus capable de répondre à une deuxième stimulation ce qui illustre l’effet inhibiteur d’un stimulant sur sa propre cellule cible.
Procédures
Injection 48h avant le TP : 1 min. Procédure chirurgicale: 30 minutes. Prélèvements sang : 4 prélèvements de 5 secondes chacun espacés de 15 minutes.
Impact sur les animaux
Le jour du TP, la pose d'un cathétèr dans la carotide peut entrainer une insuffisance respiratoire. Lors du TP, 2 enseignants ayant validé la formation chirurgie sont présents. Si l'animal est en insuffisance respiratoire une trachéotomie est éffectuée par ces enseignants. L’injection d’hCG est sans incidence sur l’état général des animaux. Cependant, l'état des animaux est surveillé jusqu’au jour du TP. Les injections 48h avant le TP peuvent conduire à un stress lié à la préhension et la contention de l’animal plus qu’à la douleur induire par l’injection. Pour ces raisons, les injections sont réalisées par une personne expérimentée, limitant le temps de préhension. les animaux sont de plus manipulé quotidiennement pendant 1 semaine avant l'injection. D’autre part, dans de cas très rares pouvant conduire à la mort de l’animal (problème du site d’injection), l’animal peux montrer des signes de douleurs (prostation inhabituelle et emissions de vocalises).
Devenir
Les animaux sont euthanasiés car volume sanguin prélevé étant trop important pour pouvoir les garder en vie.
Remplacement
Le but de ce TP étant de faire découvrir des pratiques de chirurgie à des étudiants , il est impossible de remplacer les animaux par des systèmes ex vivo, in vitro. L'utilisation des animaux dans ce projet est justifiée par l'absence d'alternatives non animales capables de reproduire l'ensemble des phénomènes biologiques complexes observés lors de la stimulation répétée avec de l'hCG, ainsi que par la nécessité d'enseigner des gestes chirurgicaux pratiques aux étudiants. Les modèles in vitro et in silico ne peuvent pas remplacer un organisme vivant pour cette étude, car ils ne reproduisent pas les interactions physiologiques et systémiques nécessaires pour comprendre les mécanismes d'action de l'hCG et la réponse des cellules de Leydig
Réduction
Nombre d'animaux: Afin de pouvoir répondre à la question scientifique posée, 4 combinaisons d'injection sont réalisées et comparées nombre animaux (320 rats sur 5 ans). Afin de permettre une conclusion générale avec un nombre d’animaux suffisant, les résultats des différentes salles de TP sont mis en commun permettant d'éffectuer un test statistiques prenant en compte la variabilité interindividuelle. Ainsi, il nous est possible de limiter le nombre d'animaux à 1 rat (1 combinatoire de traitement) pour 2 étudiants.
Raffinement
Les animaux sont habitués à la manipulation de sorte à réduire le stress. Les injections ne génèrent pas de souffrance pour l'animal. Cependant, les animaux sont observés durant 5 minutes après injections en cas de signes de douleur les animaux sont mis à mort avec du pentobarbital. Au cours de la chirurgie, suite à l'utilisation d'analgésie et d'anesthésie à isoflurane , l'hypothermie et une insuffisance respiratoire et cardiaque seront suivis. Durant tout le protocole nous avons mis en place des points limites.
Choix des espèces
Nous travaillons sur des rats mâles adultes puisque nous analysons la désensibilisation des cellules de Leydig adultes qui sont des cellules testiculaires. Les animaux sont à l'âge adulte (environ 3 mois) afin que l'axe gonadotrope soit mis en place. Les rats permettent d'obtenir un volume sanguin suffisant pour permettre le dosage de testosterone par dosage radio_immunologique.
Dérégulation du système nerveux choroïdien par les corticoïdes chez les rongeurs
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Injectés dans l'œil sous anesthésie, soumis à des angiographies, des tomographies et des électrorétinographies répétées jusqu'à trois fois, 2 020 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 180 d'entre eux et modéré pour 1 840. Une partie reçoit des corticoïdes pendant huit jours, une autre est soumise à un modèle de séparation postnatale. Le porteur écrit attendre de cette séparation des comportements de stress et de dépression chronique qu'il qualifie de nécessaires au bon déroulement de la procédure. Il présente par ailleurs les examens du fond de l'œil comme non invasifs, tout en indiquant que les injections intraoculaires peuvent laisser une gêne ou une douleur et, rarement, une infection de la surface oculaire.
Objectifs
La choriorétinopathie séreuse centrale (CRSC) est la 4ème cause de cécité rétinienne en France. C’est une maladie multifactorielle, mais la prise de glucocorticoïdes est reconnue comme l’un des principaux facteurs déclenchants de la maladie, par des mécanismes encore mal connus. La CRSC se manifeste par des décollements répétés de la rétine, secondaires à une atteinte de la choroïde. La choroïde est située en dessous de la rétine, c’est une couche richement vascularisée qui assure l’apport de l’oxygène et des nutriments aux cellules visuelles. Lors d’une CRSC, on observe notamment une forte dilatation des vaisseaux de la choroïde, dont la cause est inconnue. Alors que les glucocorticoïdes signalent soit via le récepteur glucocorticoïde ou le récepteur minéralocorticoïde, il a été montré que l’antagonisme de ce dernier était bénéfique dans la CRSC, démontrant l’implication de ce récepteur dans la physiopathologie de la maladie. Plus récemment, le laboratoire a montré que la surexpression du récepteur minéralocorticoïde chez la souris s’accompagnait d’une neuropathie du système nerveux choroïdien, qui est essentielle à la régulation vasculaire et immun de la choroïde. Cette neuropathie choroïdienne induite par les corticoïdes via le récepteur minéralocorticoïde pourrait constituer un mécanisme clé dans l’étiologie de la maladie et ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques. L’objectif de ce projet est d’étudier en profondeur les mécanismes et la physiopathologie qui lient corticoïde et système nerveux choroïdien chez des modèles murins afin de mieux appréhender la maladie humaine.
Bénéfices attendus
La choriorétinopathie séreuse centrale est une maladie multifactorielle dont l’étiologie et les traitements sont encore débattus. Alors que la majorité de la recherche se concentre sur les anomalies vasculaires/inflammatoires, personne n’a encore l’implication du système nerveux choroïdien et l’impact des corticoïdes sur sa pathophysiologie. Ce projet apportera non seulement des connaissances fondamentales et cliniques essentielles en ophtalmologie, à la compréhension de la choriorétinopathie séreuse centrale et d’autre pathologie impliquant la choroïde, mais pourrait rapidement ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques.
Procédures
Dans l’ensemble des parties de l’étude, y compris dans la première partie, l’anatomie du fond de l’œil sera évaluée par des examens cliniques sous anesthésie incluant l’angiographie, la tomographie par cohérence optique (OCT) et l’électrorétinographie. Ces trois examens sont couramment utilisés chez l’Homme en ophtalmologie pour évaluer le bon fonctionnement des vaisseaux sanguin (angiographie), l’anatomie de la rétine (OCT) et la réponse visuelle (électrorétinographie). Ces interventions sont courtes et non-invasives (généralement inférieures à 10min). Selon les parties, ces analyses seront répétées au maximum 3 fois et dans ce cas, elles seront espacées d’au moins 1 semaine pour éviter d’éventuelle complication. Dans une seconde partie de l’étude, les animaux recevront une injection intraoculaire de substance régulant l’activité des nerfs. Elles seront réalisées sous anesthésies générales et locales. Elles seront réalisées avec une durée très courtes, moins de 2 minutes par injection. Dans une troisième partie et une quatrième partie, les animaux recevront des injections de corticoïdes systémique, locales (au niveau de la conjonctive) ou de substance altérant l’épithélium pigmentaire de la rétine de façon systémique. Ces injections sont réalisées sur des animaux vigiles ou anesthésié selon si l’injection est systémique (vigile) ou conjonctive (anesthésié). Ces injections sont uniques excepté pour les corticoïdes systémiques, qui seront répétées sur 8 jours. Dans tous les cas, ces injections sont très courtes (inférieures à 1 minute) et n’entraineront qu’un léger stress par la manipulation des animaux. Dans une dernière partie, les animaux recevront sous-anesthésie une injection intra-oculaire unique de traceur pour visualiser les nerfs de l’œil in vivo. Cette injection est unique et courte, d’une durée inférieure à 1 minute. Le traceur sera naturellement éliminé dans la durée et n’est pas connu pour induire des complications.
Impact sur les animaux
La préhension des animaux vigiles ainsi que les contentions pour permettre les injections intrapéritonéales peuvent entraîner un stress. Ces injections peuvent également entraîner une douleur lors de la piqure et l’anesthésie peut induire des problèmes respiratoires, des comportements similaires à la dépression ou encore provoquer une hypothermie latente (malgré l’usage de tapis chauffants). Après les procédures impliquant des injections intraoculaires ou d’imagerie in vivo, les animaux sont également susceptibles de ressentir une légère gêne ou douleur au niveau de l’œil. Une infection de la surface oculaire est également possible bien que très rare. Dans le modèle de séparation postnatale, des comportements indiquant du stress et de dépression chronique sont attendus et nécessaires au bon déroulement de la procédure. Dans de rares cas, il est possible que ces comportements puissent induire une détresse physique/psychique qui mène l’animal aux points limites fixés préalablement (perte de poids, signes de souffrance prolongée). Enfin, concernant l’injection des traceurs, ces molécules sont connues pour être éliminer rapidement et n’entrainent aucune complication ou gêne dans la vision.
Devenir
Les animaux seront systématiquement euthanasiés à la fin de chaque procédure pour garantir la récupération des différents tissus et liquides biologique nécessaire à la poursuite de la procédure. Les analyses histologiques, moléculaires et l’analyse des sérums sont essentiels pour étudier et comprendre la dérégulation des processus physiologiques. Cette approche longitudinale permet non seulement une forte corrélation entre les études in vivo et ex vivo garantissant la fiabilité des données, mais participe également à la réduction du nombre d’animaux utilisés lors des procédures.
Remplacement
En parallèle des procédures expérimentales chez l’animal, nous réalisons de nombreuses études in vitro impliquant la culture cellulaire de cellules de Schwann, afin de tester les effets des corticoïdes sur la physiologie de ces cellules présentent dans le système nerveux choroïdiens des rongeurs et de l’Humain. De plus, nous travaillons avec de nombreux tissus oculaires humains provenant de donneurs, permettant d’étudier in vitro l’organisation du système nerveux choroïdien en condition normale et pathologique. Ces études nous permettent de remplacer l’utilisation des animaux pour répondre à un grand nombre de question sur le rôle des corticoïdes sur les cellules nerveuses ainsi que la caractérisation anatomique des structures choroïdiennes.
Réduction
Le nombre des animaux total (effectif de 2020) a été calculé au plus juste afin de non seulement valider l’efficacité de la procédure, mais également afin de permettre la réalisation de test statistique pertinents permettant de garantir la validité et la publication des résultats. De plus, nous privilégions dès que cela est possible les études longitudinales lors de nos procédures, permettant de réduire significativement le nombre d’animaux.
Raffinement
Les animaux seront hébergés conformément à la réglementation en rigueur. Ils seront maintenus dans un cycle lumière obscurité 12/12 avec boisson et nourriture ad libitum, en groupe de 2 animaux minimum par cages. Les animaux sont systématiquement habitués aux locaux de stabulation et à la manipulation afin de réduire le stress durant les procédures expérimentales. L’ensemble des interventions durant les procédures se font sous anesthésie et avec antalgique locale avant, pendant et après l’intervention. Un contrôle systématique des animaux est réalisé le jour même et le jour suivant les procédures afin de prévenir tous les signes de douleur, de dégradation éventuelle de la santé physique, perte de poids ou comportement anormale. Des points limites adaptés ont été définit pour chaque procédure, incluant notamment une perte de poids anormale, des signes de complication inflammatoire post-examen ou des signes de stress/souffrance prolongés. Les animaux seront contrôlés et monitorés sur toute la période de l’étude soit par les expérimentateurs ou les zootechniciens. Tout signe de souffrance ou de stress sera pallié par la mise en place immédiate d’un traitement adapté lorsque cela est possible. Par ailleurs, l’atteinte d’un des points limites correspondant résultera en l’euthanasie immédiate du ou des animaux concernés.
Choix des espèces
L'espèce Rattus norvegicus a été choisi car il s'agit d'un modèle établi pour le développement de différentes pathologies dont des maladies oculaires humaines du segment postérieur. De plus lors de nos précédents travaux, nous avons démontré que l’organisation du système nerveux choroïdien du rat est assez similaire à l’Humain tout comme leur réponse métabolique à la prise de corticoïdes exogènes. La taille des yeux de rats est également optimale pour permettre d’étudier convenablement l’œil et ses structures en ERG, OCT et angiographie. Enfin, la proximité génétique est satisfaisante pour permettre la transposition des résultats obtenues lors d’étude transcriptomique et protéomique à la clinique.Les animaux utilisés seront tous adultes, avec un âge minimum fixé à 3 mois, garantissant que l’œil et la rétine sont totalement développés.
Efficacités de produits rodenticides à action anticoagulante dans le cadre d’autorisations de mise sur le marché
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 500
Les rats et les souris qui montrent les premiers signes d'un empoisonnement aux anticoagulants sont mis à mort avant l'issue létale. 500 rats et 500 souris vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue, y compris ceux qui n'ont développé aucun signe clinique, leur coagulation restant fragilisée plusieurs mois. Chacun passe quatre jours seul en cage avec un appât empoisonné proposé en libre choix face à sa nourriture habituelle, puis vingt-huit jours de manipulations quotidiennes, le porteur indiquant qu'il est fort probable que la majorité des animaux soient apathiques et fatigués. Ces essais sont réalisés par une entreprise prestataire pour le compte de fabricants qui ont modifié la composition de leurs rodenticides, et aucun groupe témoin n'est constitué.
Objectifs
La lutte contre les rongeurs est un enjeu de santé publique et un enjeu économique majeur pour l’industrie agroalimentaire. En plus des mesures classiques d’hygiène et de conception des bâtiments, la politique de lutte contre les rongeurs fait appel à des appâts anticoagulants (poison empêchant la cicatrisation et rendant le sang très liquide). Tous les anticoagulants ont le même mécanisme d’action, ils empêchent la coagulation du sang. Les appâts sont consommés par les rongeurs mais ne les tuent qu'après quelques jours ainsi, les rongeurs n'associent pas l'appât à un poison. C'est pour cela que l’utilisation de ces poisons est considérée comme étant la méthode chimique la plus efficace. La population de rongeurs diminue ainsi que les problématiques liées à une surpopulation de rongeurs. La toxicité de ces anticoagulants est connue et souvent déjà bien évaluée. Cependant, la réglementation exige de nouveaux tests sur animaux si la composition d’un traitement évolue (e.g. : concentration, appétence augmentée, passage d'une formulation liquide à une formulation solide). En effet, le changement de composition peut entraîner une modification du comportement des rongeurs face à l’appât. Selon la réglementation, ces produits modifiés doivent être obligatoirement testés conformément à des recommandations précises avant de pouvoir être mis sur le marché. L’entreprise à l’origine de ce projet est prestataire pour d’autres entreprises. Ces entreprises lui délèguent les tests nécessaires à l’homologation de leurs produits anticoagulants rodenticides (qui tuent les rongeurs) ou le cas échéant la ré-homologation imposée par la législation après 5 ans d'utilisation commerciale. Les procédures réalisées dans ce projet permettent de tester l’appétence et l’efficacité d’un rodenticide sur rat et/ou souris (mesure de la consommation et de ses effets). Les résultats de ces procédures permettront de juger quant à l'homologation du produit ou non. Cette demande d’autorisation de projet encadre différents produits et formulations de produits provenant de différents délégataires. Les principes actifs de ces produits sont tous des anticoagulants agissant sur le même processus biologique. Les résultats des procédures alimentent un dossier réglementaire très strict permettant de réaliser des demandes d’autorisation de mise sur le marché. Ces autorisations sont obligatoires et positivement bien encadrées.
Bénéfices attendus
La gestion problématique des déchets de consommation et des poubelles a intensifié un fait ayant toujours existé, la présence de rats et de souris en contact direct avec l’être humain. Comme pour beaucoup d’espèces vivantes, une prolifération intense engendre des conséquences négatives. Dans notre cas, la prolifération de rats et de souris peut avoir des conséquences sanitaires (droit de retrait pour le ramassage des containers poubelle, leptospirose, transmission de diverses bactéries et helminthes), cela peut entraîner des dégâts sur les ressources alimentaires (10% à 15% des pertes mondiales : consommés/contaminés/jetés) et les rongeurs sont à l'origine de dégâts matériels conséquents (en France : coût annuel des dégâts = environ 38 millions d'euros, galeries, accès aux bâtiments, sites de passage souillés, câbles rongés, accidents liés au dysfonctionnement). De plus, les proliférations de rongeurs ont un impact très négatif sur l'image des sites infestés et une répercussion économique et sociale importante sur ces sites (fermetures d'écoles, industrie agroalimentaire fermée par les autorités sanitaires, restaurants, boulangeries). Quant aux particuliers concernés par ces infestations, la répercussion psychologique n'est pas négligeable. Le développement de produits rodenticides plus performants est un élément important de la lutte contre la prolifération des rongeurs. L'utilisation d'anticoagulants est le moyen chimique le plus efficace pour diminuer la pression parasitaire. Ces anticoagulants doivent être homologués, aussi la réalisation de tests réglementaires est indispensable à la mise sur le marché de ces produits. De plus, les rodenticides ne présentant pas les résultats attendus par la réglementation ne seront pas autorisés. Donc ce projet permet d’empêcher la mise sur le marché de produits inefficaces. Or l'utilisation de produits inefficaces peut être à l’origine de résistances pour la cible (rongeurs) mais demeurer mortelle pour des espèces non-ciblées (eg. chien). Aussi, il est très important de tester ces produits afin d'écarter les produits inefficaces. En résumé, il y a des avantages économiques, écologiques, sociaux et sanitaires à la mise sur le marché de produits efficaces, or cette mise sur le marché nécessite la réalisation des tests décrits dans ce projet comme préconisé par la loi et la réglementation.
Procédures
Les animaux seront maintenus seul en cage durant 4 jours. Durant 4 jours, un produit anticoagulant est proposé à la consommation en libre choix en regard d’une alimentation habituelle. Quotidiennement durant 28 jours, les animaux sont sortis de leur cages et doucement manipuler durant moins de 10 minutes pour être auscultés et pesés.
Impact sur les animaux
Au regard de leur nature sociale, la mise en cage individuelle des animaux (rats et souris) durant 4 jours est une source de mal-être chez le rat et la souris. Il est à noter que les anticoagulants entrainent des hémorragies, pouvant occasionner différents maux et troubles significativement négatifs : - hémorragie interne - Saignements : faiblesses,angoisses et mal-être dues à l'anémie - anémie aigüe entrainant la mort. Il est fort probable que la majorité des animaux soient apathiques et fatigués. La sortie, auscultation et pesé régulière des animaux peut être une source d'angoisse surtout s'il se cumul avec un mal-être/souffrance existante.
Devenir
Attendre une intoxication létale aux anticoagulants est inenvisageable. Sont mis à mort les animaux montrant des signes précoces d’un empoisonnement aux anticoagulants. La mise à mort permet d’éviter des souffrances inutiles à l’animal. Si l'animal ne présente pas de signes cliniques permettant de juger quant à son empoisonnement, il est néanmoins victime d'une fragilité au niveau de la coagulation pouvant perdurer plusieurs mois. Cette fragilité de coagulation pourrait se révéler cliniquement en dehors du temps d'observation prévu par la procédure et engendrer des souffrances importantes si une mise à mort n'est pas réalisée à temps. Ce risque de fragilité de coagulation est trop important pour envisager une réutilisation des animaux. Aussi, les animaux ayant reçu l’anticoagulant sont euthanasiés à la fin des procédures.
Remplacement
Il n'y a pas de stratégie de remplacement possible. En effet, la réglementation impose de tester l'attractivité alimentaire du traitement (consommation) et les effets du traitement (mortalité). Ces critères ne peuvent être observés que sur animaux vivants, le comportement de consommation en particulier ne peut être simulé. De plus, la réglementation impose que ces produits soient testés sur les espèces cibles, c’est à dire rats et souris. il y a donc une obligation réglementaire empêchant ce remplacement par d'autre espèces animales.
Réduction
Dans le cadre d’une Autorisation de mise sur le marché (AMM) d’un produit biocide de type anticoagulant, les essais réglementaires soumis au législateur doivent être mis en place selon des recommandations strictes. Pour chaque formulation à l’étude, il est recommandé de tester à minima 10 animaux par espèce ciblée. Pour chaque formulation et selon la revendication du produit, des tests pourront être conduits sur les 2 espèces ou sur une espèce. Ainsi, si un produit à l’étude cible les rats et les souris alors 20 animaux sont utilisés dans la procédure (10 rats et 10 souris). La loi exige de tester un minimum de 10 animaux; nous souhaitons utiliser le moins d'animaux possible, aussi nous ne testerons que le minimum d’individus préconisé soit 10 animaux par procédure. Un test statistique sera réalisé afin de vérifier si la consommation et la mortalité sont identiques entre les 2 sexes, le cas échéant ces taux seront calculés en prenant en compte la population entière. Le nombre d’animaux défini suffira à déterminer la tendance statistique nécessaire pour voir si le produit testé est suffisamment consommé (≥20% de la ration alimentaire) et s’il permet une mortalité efficace (≥90% des animaux testés). Afin de ne pas inclure inutilement des animaux dans les procédures, nous ne testons pas d'animaux témoin. Nous nous basons sur une survie théorique de 100% des individus témoin en nous basant sur les périodes d'acclimatation et d'habituation qui précèdent le test. Afin d'éviter un biais de placement pour la mesure de la consommation, l'emplacement du produit est inversé quotidiennement avec l'emplacement de l'aliment de laboratoire habituel (aliment extrudé ou biberon d'eau).
Raffinement
Phase d'Acclimatation : durée = 7 jours minimum, acclimatation le cas échéant à la salle, à l’aliment, aux procédures d’hébergement, aux congénères. Phase d'Habituation : Durée = 7 jours. Afin d’individualiser les animaux, un signe distinctif est réalisé au marqueur indélébile sur leur queue. Afin d’habituer les animaux aux manipulations et au manipulateur, celui-ci réalise différentes actions sur les animaux. Quotidiennement, le manipulateur consigne pour chaque animal : l’état du pelage, des yeux et des oreilles et le comportement de l’animal. Pour chaque animal, le manipulateur saisit délicatement l'animal, le sort de la cage, réalise une brève observation et le pèse. Lors de la brève observation, le manipulateur vérifie l’état des différents orifices (bouches, oreilles, nez, anus, appareil génitale). La masse des animaux et la masse d’aliment non-consommé est consignée quotidiennement, puis une masse déterminée d’aliment est mise à disposition. Ainsi, le manipulateur prend connaissance du comportement et de l'apparance "normal" de chaque animal et pourra les comparer à celui de l'animal sous anticoagulant. De plus, l'animal habitué réagira moins aux manipulations lorsqu'il sera sous anticoagulant, ce qui évitera l'accumulation de contraintes. Phase d’isolement : durée = 4 jours. Lors de l’hébergement individuel, l’environnement est enrichi (cachette + coton). Les animaux sont placés dans des cages transparentes à proximité d’autres cages afin de maintenir un contact visuel, auditif et olfactif avec leurs congénères. Après ces 4 jours d'isolement, les rongeurs femelles sont regroupés. Les mâles non-agressifs seront regroupés suivant leur affinité et groupe de départ. Sinon, ils seront maintenus isolés. Phase d’observation de la mortalité (J+2 à J+21) : Signes précoces d’intoxication ou de morbidité = mise à mort. Afin d’éviter des souffrances inutiles aux animaux, l'observation des points limites en regard d'un score au-delà duquel les animaux sont mis à mort est mis en place. Les cages et éléments d’élevage sont adaptés à l’espèce et au nombre d’animaux. Si une baisse de poids supérieure à 10% est observée, alors de l’aliment humidifié et de l’eau gélifiée seront fournis à l’animal. À la suite de chaque réalisation de procédure, une analyse rétrospective sera réalisée pour le comité éthique afin d'améliorer d'un point de vue "éthique animal" la procédure (affinement des points limites, des observations...).
Choix des espèces
Les produits sont destinés à limiter la surpopulation indésirable de rongeurs en agriculture, en industrie ou en milieu urbain. La réglementation exige l’utilisation des espèces cibles comme modèle expérimental. L’utilisation de rongeurs est appropriée puisque les produits testés ont pour destination une utilisation sur rats et souris. Bien que les traitements anticoagulants ciblent les rongeurs « sauvages », nous utilisons des souches de laboratoire. En effet, en plus de la contrainte d’obtention, d’habituation et du risque sanitaire, la récupération d’individus sauvages est en soit une source de stress et de mal-être chez l’animal. Une souche de laboratoire « non résistante » nous permet de réaliser plus efficacement l’observation des points limites. Les souches testées sont quasiment identiques aux souches sauvages. Nous utiliserons des adultes afin de conserver une certaine homogénéité dans la consommation interindividuelle de produit à l’étude. Ainsi, nous conservons une relative maitrise de l'intensité et du délais avant apparition des effets toxiques. Ainsi, nous pouvons anticiper de manière plus fine et donc mieux gérer la souffrance et détresse. Dans un objectif de réutilisation, les animaux utilisés seront idéalement d’anciens reproducteurs issus des laboratoires d’élevage. Nous utiliserons des animaux âgés de plus de 6 mois et de moins de 1,5 an, cela correspondant à la fourchette d'âge observée dans la nature, de plus les individus sont de masses relativement homogènes et donc plus facilement comparables.
Evaluation pré-clinique de thérapies innovantes dans des modèles précliniques de glioblastome chez les rongeurs
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
Rats : 705
4 215 rongeurs, 3 510 souris et 705 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, et chacun subit jusqu'à 28 prises de sang, certains aussi jusqu'à 51 séances d'imagerie sous anesthésie et 56 injections sans anesthésie. Tous reçoivent une greffe de tumeur, dans le cerveau lors d'une chirurgie de 30 minutes ou sous la peau, et la tumeur peut provoquer des troubles neurologiques ou des difficultés à se déplacer. Selon les traitements testés s'ajoutent jusqu'à huit ouvertures de la barrière hémato-encéphalique d'une heure au plus, une ablation de la tumeur ou une radiothérapie, et tous sont tués à un temps défini ou dès qu'ils atteignent les points limites, pour des prélèvements après la mort. Le porteur présente les rongeurs greffés comme "en quelque sorte des avatars de patients", et renvoie à des études cliniques ultérieures l'évaluation chez l'humain des traitements qu'il espère identifier.
Objectifs
Les tumeurs cérébrales primitives et en particulier les glioblastomes sont des cancers très résistants aux traitements anti-tumoraux conventionnels (chirurgie, radiothérapie et chimiothérapie cytotoxique). En effet, la survie globale médiane des patients est comprise entre 12 et 24 mois. De nouveaux traitements sont donc indispensables pour améliorer le pronostic des patients souffrant de glioblastome. Les traitements candidats sont évalués dans le cadre d’essais cliniques longs et coûteux, et le plus souvent négatifs, avant leur approbation pour une utilisation en pratique clinique chez les patients. Compte tenu du nombre important de traitements candidats, notre projet vise l’accélération de l’évaluation de ces traitements innovants candidats et leur hiérarchisation en vue d’essais cliniques chez l’Homme. En effet, une évaluation préclinique rigoureuse permet de réduire le taux d’attrition des essais cliniques.
Bénéfices attendus
Les gliomes et en particulier les glioblastomes (GBM) sont les cancers cérébraux les plus fréquents et les plus graves chez l’adulte. Le pronostic des patients souffrant de glioblastome est réservé (12-24 mois de survie médiane) malgré des traitements lourds. De nouveaux traitements sont donc nécessaires. Le projet présenté ici vise donc à évaluer de nouvelles thérapies dans un contexte le plus biologiquement pertinent grâce à nos modèles de glioblastome qui sont en quelque sorte des avatars de patients atteint de cette maladie. Ultimement, nous visons à identifier de nouveaux traitements actifs contre le glioblastome qui pourront être évalués dans le cadre d'études cliniques chez l'homme.
Procédures
Les animaux auront tous une greffe tumorale cérébrale (30minutes, 1x, animal anesthésié et analgésié) ou une greffe tumorale cutanée (1minute, 1x, animal anesthésié). Tous les animaux auront un suivi par prélèvement sanguin (2minutes, 28x maximum, animal vigile ou anesthésié et analgésié si l'animal est en fin de procédure) et certains par imagerie également (5minutes, 51x maximum, animal anesthésié). Une partie des animaux auront également des traitements administrés par injections simples (1min, 56x maximum, animal vigile) ou par injections nécessitant une chirurgie (30min maximum, 1x, animal anesthésié et analgésié). Les administrations pourront être couplées à une ouverture de la barrière hémato encéphalique (pour que le traitement atteigne le cerveau) (1h maximum, 8x, animal anesthésié) ou à une résection tumorale (30 minutes, 1x, animal anesthésié et analgésié) et;ou à de la radiothérapie (10 minutes, 1 fois, animal anesthésié).
Impact sur les animaux
La greffe de cellule tumorale induit une croissance tumorale qui peut donner des troubles neurologiques ou des difficultés de déplacement. Les chirurgies pourront engendrer une douleur modérée post opératoire ainsi que des risques d’infection. Les anesthésies peuvent engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse respiratoire. Les traitements pourront avoir des effets secondaires comme des diarrhées ou des inflammations aux sites d’injection engendrant une perte de poids. Les piqûres peuvent induire une douleur légère de courte durée au point d’injection. Les prélèvements sanguins pourraient induire une douleur légère de courte durée ainsi qu’un hématome. Les imageries pourront induire un léger stress chez les animaux. Le phénotype dommageable des animaux immunodéficients ou immunodéprimés induit une sensibilité accrue aux infections.
Devenir
Pour toutes les procédures, tous les animaux sont euthanasiés à un temps défini (ie quelques jours/heures post traitement etc) ou dès qu’ils atteignent les points limites décrits afin de faire des prélèvements post mortem.
Remplacement
Chez l’Homme, les tumeurs cérébrales sont des tumeurs complexes. Il existe, en plus des cellules tumorales, un microenvironnement qui joue un rôle clé dans le comportement spontané ou sous traitement des cellules tumorales. Ce microenvironnement est lui-même dépendant du macroenvironnement c'est-à-dire de l’organisme hôte. Il est impossible de reconstituer ce contexte (microenvironnement et macroenvironnement) interagissant avec les cellules tumorales in vitro ; que ce soit par le biais de cultures de cellules tumorales issues de patients ou bien de culture 2D ou encore 3D. Ces approches in vitro sont réalisées en amont des procédures in vivo pour justifier l'intérêt scientifique. De plus, cet environnement module la biodisponibilité d’une molécule thérapeutique au sein de la tumeur. Aussi, positionner les cellules tumorales cérébrales chez l’animal, dans un microenvironnement tissulaire et moléculaire complexe (cérébral) constitue un modèle d’étude pertinent. Ce dernier se rapproche au maximum des conditions observées chez les patients souffrant de tumeur cérébrale et chez qui les cellules cancéreuses prolifèrent dans du tissu nerveux central complexe.
Réduction
4215 animaux seront utilisés dans ce projet. Les efforts fournis afin de réduire le nombre d'animaux utilisés sont: i) Seuls les composés efficaces in vitro par rapport aux traitements standards, seront testés in vivo. ii) Les cellules tumorales cérébrales greffées chez l’animal sont visibles par fluorescence ce qui permet de suivre le développement tumoral, cela évite l'euthanasie à différents temps et réduit donc le nombre d’animaux utilisé (iii) La fluorescence des tumeurs permet également de suivre l’efficacité des traitements testés en temps réel ce qui apporte une information supplémentaire à la survie. (iv) Une étude statistique détermine le nombre d’animaux nécessaire minimum pour atteindre un niveau de significativité acceptable. Cela permet de limiter le nombre d’animaux et d’éviter les études ne permettant pas de répondre à une question posée par manque de puissance statistique.
Raffinement
Durant toute la durée de leur vie, les animaux sont logés en groupe afin de favoriser leur bien-être social, l’isolement étant évité autant que possible. Cette approche groupée est cruciale, car les souris, comme de nombreux rongeurs, sont des animaux sociaux et leur isolement peut entrainer un stress psychologique et des comportements anormaux. Elles sont hébergées sur des portoirs ventilés, qui permettent une circulation d'air optimale et un environnement propre. Chaque cage est équipée d’un système d'abreuvement automatique garantissant un accès constant à l’eau et d’un approvisionnement ad libitum en nourriture, ce qui répond à leurs besoins nutritionnels et hydriques tout en permettant une gestion optimale des ressources. Le milieu de vie est enrichi avec au moins deux éléments, tels que des objets manipulables ou des matériaux permettant d'explorer et de satisfaire les comportements naturels des souris, comme le grattage, le fouissage ou la nidification. Cet enrichissement environnemental est essentiel pour prévenir l’apparition de comportements stéréotypés liés à l'ennui ou au stress et pour assurer une qualité de vie optimale tout au long de l’étude. Les animaux sont suivis quotidiennement par des vétérinaires et du personnel qualifié. Lors de procédures susceptibles de provoquer des douleurs modérées à sévères, comme des interventions chirurgicales, les animaux reçoivent une anesthésie générale appropriée et en complément, un analgésique leur est administré en préopératoire et postopératoire pour prévenir toute douleur et minimiser l'inflammation. Pour prévenir les risques d'infections des souris immunodéprimées, les animaux sont hébergés dans des cages propres avec litière, aliment et enrichissement irradiés ainsi que de l'eau osmosée pour boisson. Les injections seront toujours réduite au minimum suivant le composé testé (fréquence et volume), l'alternance des sites sera privilégiée quand cela est possible et les animaux seront anesthésiés si nécessaire pour leur bien être. Un système de points limites est mis en place pour évaluer leur bien-être et détecter rapidement tout signe de souffrance ou d’inconfort, tant à court qu'à long terme. Ces points limites prennent en compte des critères variés : l’observation du comportement, l'aspect général de l’animal, son niveau d'activité, ainsi que son poids corporel. Si un animal présente des signes de détresse, des mesures immédiates sont prises pour garantir son confort et sa santé.
Choix des espèces
Les souris sont choisies dans nos études thérapeutiques en raison de leur petite taille et de leur poids faible. Cette caractéristique permet l’utilisation de quantités réduites de composés cytotoxiques. De plus, ces modèles permettent l’utilisation de volumes expérimentaux limités, facilitant ainsi les études tout en respectant les principes de réduction des animaux dans la recherche. Les souches de rongeurs telles que les souris immunodéficientes sont particulièrement utiles pour leur incapacité à rejeter les cellules tumorales humaines. En parallèle, les souches immunocompétentes sont indispensables pour étudier la croissance tumorale dans un contexte immunologique complet. Les modèles animaux immunodéprimés sont utiles pour explorer l’impact d’un système immunitaire humanisé dans les réponses thérapeutiques contre les cancers. Enfin, les rats, sont choisis ici pour des scénarios nécessitant une plus grande précision chirurgicale. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte entre 8 semaines et 15 mois car le glioblastome est une tumeur de l’adulte chez l’Homme.
Evaluation des effets des substances sur la fonction respiratoire
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 3000
Cochons d'Inde : 2000
Placés jusqu'à vingt-quatre heures dans des chambres en plexiglas après administration d'une substance, 500 souris, 3 000 rats et 2 000 cobayes subissent un enregistrement de leur fonction respiratoire, certains après une heure de chirurgie de cathétérisme. Les 5 500 animaux sont soumis à des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur ramène les effets à un "léger stress" lié à la contention et à l'isolement, tout en énumérant bronchospasmes, bronchoconstrictions, toux, hyperventilation et douleurs après l'opération. Quatre cents cobayes seront réutilisés, les 5 100 autres tués, ces tests servant à établir le profil de sécurité de candidats médicaments avant leur passage chez l'humain, conformément aux exigences réglementaires européennes, américaines et japonaises.
Objectifs
L’objectif du projet est d’évaluer les effets de substances en cours de développement sur la fonction respiratoire et de collecter des données précises pour répondre à des questions essentielles liées à la sécurité, l'efficacité, et le mécanisme d'action de la substance. Ces tests permettent de vérifier si une substance améliore la fonction respiratoire dans des maladies comme l'asthme, la bronchopneumopathie chronique obstructive,... et permettent également de déterminer si une substance est en mesure de réduire les symptômes respiratoires tels que la dyspnée ou la toux. Les substances, même non destinées à traiter directement les maladies pulmonaires, peuvent avoir des effets sur le système respiratoire (bronchospasmes, hypoxie, etc.). Tester leur impact est donc crucial pour garantir la sécurité du patient et établir le profil de sécurité du candidat médicament avant son passage chez l’homme, et ce dans le cadre des recommandations européennes, américaines ou japonaises en vue de l’obtention des autorisations de mise sur le marché. Les documents réglementaires (CPMP, FDA et MHW) s’accordent pour considérer le système respiratoire comme une des fonctions vitales à explorer dans le cadre des études de pharmacologie de sécurité (ICH S7A guideline, 2001).
Bénéfices attendus
Ces modèles seront mis en place et utilisés afin de tester l’efficacité des médicaments et de s’assurer qu’ils n’induisent pas d’effets secondaires ou inattendus chez les patients traités pour des affections respiratoires. Ils entrent également comme prérequis règlementaires pour obtenir les autorisations de commercialisation des nouveaux médicaments. La mesure des paramètres ventilatoires (fréquence respiratoire, volume courant, minute volume, temps d’inspiration, d’expiration et de relaxation, débits aux pics d’inspiration et d’expiration) ou dynamiques (résistance ou pause augmentée) permet de différencier les substances affectant le contrôle de la respiration de celles agissant sur la dynamique du poumon (obstruction ou dilatation des voies aériennes, resistance pulmonaire).
Procédures
Les animaux sont placés dans des chambres en plexiglas pour une période de 30 min à 3 h de stabilisation jusqu’à 24h après l’administration selon le modèle pour évaluer la fonction respiratoire. Le traitement unique avec les candidats médicaments se fait par différentes voies (administration quelques secondes) ou par aérosols (administration pendant quelques minutes). Pour certaines administrations, les animaux subissent une chirurgie de courte durée (1 heure) quelques jours avant le test. A la fin de la procédure, ces animaux seront soumis à des prélèvements de sang (quelques secondes), d’organes ou de liquide bronchoalvéolaire sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Dans ce projet, les phases d'administration et de prélèvement peuvent induire un léger stress chez l'animal, notamment du fait de la contention de ce dernier. La phase d’enregistrement peut engendrer un stress léger chez l’animal dû fait de l'isolement. Certaines conditions d’enregistrement et/ou substances de références peuvent entrainer du bronchospasme, de la bronchoconstriction, de la bronchodilatation, de la toux, de l’hyperventilation. La phase de chirurgie par cathétérisme peut induire une douleur post-opératoire chez l'animal.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, s’il y a un prélèvement, les animaux sont tous euthanasiés. S’il n’y a pas de prélèvement, les animaux ayant reçu des substances dont l’effet à long terme n’est pas connu sont euthanasiés. Les animaux n’ayant pas reçu de substances dont l’effet à long terme n’est pas connu sont remis en stock.
Remplacement
Les tests/modèles que nous souhaitons développer et valider dans ce projet ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car ils impliquent l’observation des effets de substances pharmacologiques sur la fonction respiratoire des animaux vigiles. Les techniques, décrites et validées dans ce projet, sont utilisées dans divers modèles animaux qui ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car ils impliquent l’observation des effets de substances pharmacologiques sur le comportement, le système immunitaire, les paramètres physiologiques, le métabolisme ou l’interaction entre différents organes ou systèmes.
Réduction
Les mesures de réduction s'intégrant à la règle des 3Rs vont consister à utiliser le plus petit nombre d’animaux possible pour chaque étude permettant d'obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte et d’éviter ainsi une répétition inutile des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet et la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif, et éventuellement à un contrôle positif (substance de référence ou de comparaison) si cela s'avère pertinent. Les données de la littérature indiquent qu’un effectif de 8 animaux en standard par groupe (nombre de groupes variables, selon l’objectif de l’étude) est généralement nécessaire pour atteindre une sensibilité correcte du test. Si cela est pertinent et afin de réduire le nombre d’animaux, tous les prélèvements d’échantillons biologiques seront réalisées à la fin des évaluations pharmacologiques (et non sur des animaux surnuméraires satellites).
Raffinement
Un soin particulier dans le raffinement des méthodes est assuré et garantit l’utilisation systématique du modèle apportant le maximum de réponses scientifiques et le minimum de souffrance pour l’animal. La pléthysmographie corps entier permet de suivre les paramètres respiratoires sur l’animal vigile en leur laissant une liberté de mouvements. Dans le cas de mesures sur plusieurs heures ou jours, les animaux sont regroupés dans leur cage d'hébergement suite aux premières mesures et seront remis dans les chambres de pléthysmographie pour effectuer la mesure. De l'eau de boisson est à disposition et une poche de complément alimentaire est mis à disposition pour des mesures dépassant 12h. Les animaux peuvent se voir d’une chambre à l’autre. Dès la fin de l’expérience, les animaux sont regroupés ou immédiatement euthanasiés. Dans le cadre du projet, les mesures de raffinement qui s'intègrent dans la règle des 3Rs, vont consister en un suivi des points limites permettant d'euthanasier précocement tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids, des yeux, la posture, les réactions de l'animal quand il est approché ou stimulé, la respiration, l'appétit, l'état d'hydratation, les tremblements ou convulsions), afin d’assurer d’une part, un bon suivi des animaux et d’autre part, une fin sans souffrance ou angoisse lorsque nécessaire. De plus, les animaux sont suivis par le vétérinaire et manipulés fréquemment par des techniciens préalablement formés et attentifs, prêts à agir lorsque les critères d'interruption prédéfinis sont atteints (détresse respiratoire). Par ailleurs et au quotidien, un enrichissement complet est fourni aux animaux, celui-ci inclut dans leur hébergement litiére, objets de nidification et à ronger, présence de congénéres. Losque nécéssaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. le progarme d'anesthésie et d'analgésie est défini par un vétériniare afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. Lors de la phase de récupération post-chirurgicale, une attention particulière est apportée (surveillance des cicatrices, état général, poids, température corporelle, appétit). Les méthodes d’euthanasie choisies, le cas échéant, sont sélectionnées pour supprimer toute forme d’angoisse, de stress ou de douleur).
Choix des espèces
L’impact de substances pharmacologiques sur les paramètres respiratoires des espèces choisies est prédictif de leurs effets chez l’Homme. La substance est généralement administrée à dose unique. Les études des effets de substances sur la fonction respiratoire sont réalisées par pléthysmographie, principalement chez le Rat, le Cobaye ou la Souris. Les tests décrits dans l’ensemble des procédures utilisées dans ce projet ont été caractérisés de façon extensive dans la littérature scientifique et sont mis en oeuvre au sein du laboratoire. Par ailleurs, la méthode de pléthysmographie peut également être un outil de choix pour l’étude de la fonction respiratoire sur des modèles animaux physiopathologiques tels que les souris transgéniques ou des modèles de bronchoconstriction ou d'asthme chez le Rat, le Cobaye ou la Souris. Principalement rongeurs sevrés, âge variant entre 3 semaines et 2 ans, conformément aux données historiques et à la bibliographie scientifique
Etude de l’effet de la kétamine sur la potentialisation à long-terme in vivo du cortex préfrontal chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Quarante-cinq minutes de chirurgie du cerveau, puis deux heures d'enregistrement de l'activité neuronale : 96 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Répartis en huit groupes de douze, ils reçoivent d'une à quatre injections de kétamine avant l'enregistrement. L'objet déclaré est de comprendre comment la kétamine module l'activité du cortex préfrontal, dans l'espoir d'ouvrir des pistes contre la dépression résistante aux traitements. Le porteur retient le rat parce que son usage est "généralisé" en neurosciences et que les résultats pourront être comparés à la littérature existante.
Objectifs
La découverte des effets antidépresseurs rapides de la kétamine a changé notre compréhension des troubles dépressifs majeurs et éveillé l’espoir de nouveaux traitements à efficacité accélérée. En effet, alors que les antidépresseurs classiques mettent plusieurs semaines à agir et sont inefficaces chez plus de 30% des patients, l’injection d’une seule dose de kétamine provoque des effets antidépresseurs rapides et robustes chez les patients atteints de dépression pharmaco-résistante. Mieux comprendre les mécanismes à l’origine du pouvoir antidépresseur de la kétamine est donc une étape clé pour identifier de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement des troubles dépressifs majeurs. En effet, la kétamine pourrait soulager les symptômes de la dépression en modulant l'activité cérébrale contrôlant l’humeur. Les objectifs du projet sont donc de tester l'effet d'une dose unique ou de doses multiples de ketamine sur la modulation de l'activité cérébrale.
Bénéfices attendus
Ces expérience permettront de mieux comprendre le rôle modulateur exercée par la kétamine sur l'activité du cerveau contrôlant l'humeur et d'identifier de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitements des troubles dépressifs.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à une chirurgie du cerveau qui dure 45 minutes. Deux groupes de 12 rats sont soumis à une injection du composé (5 min) ainsi que l'enregistrement de l'activité neuronale (2 heures) et une euthanasie (10 min). Deux groupes de 12 rats sont soumis à deux injections du composé (5 min par injection) ainsi que l'enregistrement de l'activité neuronale (2 heures) et une euthanasie (10 min). Deux groupes de 12 rats sont soumis à trois injections du composé (5 min par injection) ainsi que l'enregistrement de l'activité neuronale (2 heures) et une euthanasie (10 min). Deux groupes de 12 rats sont soumis à quatre injections du composé (5 min per injection) ainsi que l'enregistrement de l'activité neuronale (2 heures) et une euthanasie (10 min). Tous les animaux sont hébergés en cage collective ée (2 rats par cage) pour une dureé maximum de 6 semaines.
Impact sur les animaux
Les animaux sont soumis à une chirurgie et traitements successifs dont le degré de gravité va de léger à modéré. Les nuisances attendues sont celles associées à la chirurgie , en effet l'animal est anesthésié puis opéré. Bien que toutes les mesures soient prisent pour réduire douleur et risque d’infections, cette procédure représente la plus importante nuisance pour l'animal. Les autres types de nuisances envisagées sont l'euthanasie même si l'animal est sédaté au préalable.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de prélever le cerveau et effectuer des analyses imunohistochimiques sur ce dernier.
Remplacement
La procédures décrite a recours exclusivement à des rats de laboratoire (Sprague Dawley) pour les raisons suivantes : 1. Il est interdit de mettre en œuvre chez l’homme des techniques neurobiologiques invasives telles que celles décrites ici et qui permettent d’établir des liens de causalité tels que ceux que nous cherchons à tester, 2. Il n ’existe pas encore de modélisation mathématique (pharmacologiques) des effets que nous cherchons à comprendre. Pour comprendre les mécanismes de la plasticité in vivo, nous devons utiliser des méthodes permettant de mesurer et de manipuler l'activité de neurones spécifiques avec des résolutions spatiales et temporelles élevées sur un cerveau intact et vivant. Il n'existe donc pas de méthodes alternatives.
Réduction
Des outils statistiques sont utilisés pour calculer au plus juste le nombre d'animaux nécessaires à la validation de l'expérience. Ce nombre s'élève à 12 animaux par groupe expérimental.
Raffinement
Le confort de l’animal est pris en compte tout au long de sa vie au moyen d’une grille d’évaluation et la définition de points limites et critères d’arrêt de l'expérience. Un soin particulier est porté à la formation des expérimentateurs pour qu'ils sachent détecter tout signe de mal-être et ne soient pas eux-mêmes source de mal-être par une manipulation inadaptée. Les soignants qui s’occupent de nos animaux sont encadrés par ou sont eux-mêmes des personnels diplômés soigneurs animaliers. Les expériences se déroulent quand les animaux sont actifs et leur sommeil est ainsi respecté. Les animaux sont pris en main de façon appropriée [jamais par la queue, les pattes reposant sur un support (bras, main...) pour éviter la sensation du vide]. L’anesthésie pour les chirurgies et la douleur post -opératoire sont gérées avec des molécules adaptées comme des antidouleurs. Une pommade cicatrisante est appliquée sur les sutures. Pour prévenir l’hypothermie, les chirurgies sont pratiquées sur couverture chauffante puis l’animal est placé dans une chambre post-opératoire jusqu’à ce qu’il se redresse sur ses pattes. Les animaux sont hébergés collectivement tout au long de l'expérience. Pour enrichir l’environnement, des nids végétaux sont placés dans chaque cage et renouvelés systématiquement lors du change.
Choix des espèces
Cette espèce est un bon modèle pour les études pharmacoloqiques. Son utilisation est généralisée dans le domaine des neurosciences. Nous utiliserons des rats jeunes adultes. Ce stade de développement a été choisi afin de correspondre aux données de la littérature afin de pouvoir comparer nos données.
Mise au point et utilisation d’un modèle de circulation extracorporelle chez le rat pour l’étude de la clairance pulmonaire de l’hydrogène
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Pour mesurer la vitesse à laquelle les poumons éliminent l'hydrogène, 45 rats sont opérés sous anesthésie générale et tués avant tout réveil. Chaque animal subit jusqu'à trois heures de chirurgie : intubation, ouverture du thorax et de l'abdomen pour poser des capteurs sur le cœur et le foie, puis incision du cou pour brancher les deux artères carotides à un circuit sanguin extérieur. Le porteur signale un risque d'hémorragie et de détresse cardio-respiratoire au moment de la mise en circulation extracorporelle. Il indique que le réveil ne peut être envisagé, les lésions infligées étant irréversibles, et justifie l'ensemble par la perspective de proposer un jour l'hydrogène comme médicament aux autorités de santé.
Objectifs
Actuellement présenté comme une alternative écologique aux énergies fossiles, l'hydrogène (H2) possède également un potentiel thérapeutique important, notamment pour le traitement des maladies cardiovasculaires, neurodégénératives, métaboliques ou encore des cancers. Toutefois, avant de pouvoir proposer cette molécule peu coûteuse et facile à produire comme candidat médicament aux authorités de santé, il est nécéssaire de décrire son comportement quand il est administré à un mammifère. Il est notamment important de comprendre comment il se distribue dans l'organisme, quel(s) organe(s) il peut atteindre en fonction de son mode ou de sa voie d'administration et surtout comment il est éliminé de l'organisme et à quelle vitesse. Les études réalisées jusqu'à aujourd'hui ont permis de confirmer que l'élimination de l'H2 est essentiellement pulmonaire et que le mode d'administration qui permet d'atteindre les concentration sanguines les plus élevées est l'inhalation. Notre projet propose de mettre au point un systéme permettant de détourner le sang artériel d'un rat à l'extérieur de son organisme (circulation extracorporelle artério-artérielle (CEC-AA)) pour permettre une hydrogénation du sang qui soit équivalente à l'administration par inhalation, mais qui n'interfére pas avec l'élimination pulmonaire d'H2. Cette approche permettra de mesurer précisément l'élimination pulmonaire d'H2 en maîtrisant son administration au niveau artériel. Cette demande concerne une phase de mise au point de la CEC-AA chez le rat et une phase de mesure de l'élimination pulmonaire d'H2 quand il est directement dissous dans le sang d'un animal par l'intermédiaire de la CEC-AA.
Bénéfices attendus
Le présent projet de recherche permettra de compléter les données pharmacocinétiques de l'hydrogène administré dans le sang artériel et de mettre au point un modèle de l'élimination (clairance) pulmonaire d'H2 chez un mammifère vivant. Ces données sont un prérequis nécéssaire pour proposer, à terme, l'hydrogène comme médicament aux autorités de santé.
Procédures
Chaque animal subira un protocole chirurgical sous anesthésie générale volatile avec analgésie (injection sous-cutanée unique), d'une durée maximale de 3 heures, pendant lequel il subira une intubation, une ouverture thoracique et une ouverture abdominale pour la mise en place de capteurs (coeur et foie), puis une incision cutanée au niveau du cou pour introduire des tubulures dans les deux artères carotides pour la mise en place d'un système de circulation extracorporelle. A l'issue de la chirurgie et toujours sous anesthésie générale, une injection léthale sera administrée.
Impact sur les animaux
Une anesthésie générale profonde avec une couverture analgésique comporte un risque de détresse cardio-respiratoire, particulièrement au moment de la mise en place de la circulation extracorporelle. Par ailleurs, la chirurgie vasculaire présente des risques hémorragiques qui peuvent mettre en danger la vie de l'animal.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure. Le protocole chirurgical mis en oeuvre induisant des lésions irréversibles à l'animal, le réveil ne peut être envisagé sans l'exposé à des douleurs sévères post-opératoires.
Remplacement
Des études d'efficacité de traitements à l'hydrogène ont été réalisées, sur des modèles cellulaires et sur organes isolés, qui ont confirmé le potentiel thérapeutique de cette molécule. La présente étude a pour objectif de définir un modèle préclinique précis pour permettre l'analyse de l'élimination pulmonaire de l'H2 suite à une administration aiguë dans le sang. Nous disposons également de données concernant la distribution dans l'organisme d'H2 suivant différents modes d'administration chez le rat in vivo. Les résultats de cette étude permettront de les compléter pour construire un modèle physiologique du devenir de H2 qui pourra être appliqué chez l'homme. Le contexte physiologique ne peut donc pas être remplacé par un modèle in-vitro ou in-silico.
Réduction
Un lot de 25 rats est prévu pour la mise au point du système de CEC et pour sa caractérisation. Ce nombre est un maximum qui pourra vraisemblablement être inférieur. De plus, certains des animaux utilisés pour cette phase de mise au point pourront provenir d'autres protocoles (réutilisation). Un total de 20 rats (2 groupes de 10 animaux) sera utilisé pour l'étude de l'élimination pulmonaire d'H2. Afin de réduire le nombre d'animaux pour cette étude chaque animal constituera son propre contrôle. Le nombre d'animaux dans chacun de ces 2 groupes expérimentaux a été établi en tenant compte du risque de mortalité avant la fin du protocole (2 animaux par groupe) de façon à garantir un nombre total de 8 animaux par groupe. Ce nombre est justifié sur un plan statistique rigoureux.
Raffinement
Le protocole expérimental sera réalisé sans réveil et l'intégralité des gestes sera réalisée sous anesthésie générale complémentée par une analgésie. L'animal sera placé sur un matelas chauffant et sous une couverture de survie pour garantir le maintien de sa température coroprelle qui sera monitorée par l'intermédiaire d'une sonde rectale. Les paramtère vitaux seront suivis en continu par l'intermédiaire de 3 électrodes électrocardiographiques et deux capteurs de pression artérielle, placés aux points d'entrée et de sortie de la CEC.
Choix des espèces
L'objectif de l'étude est d'établir un modèle physiologique de la distribution dans l'organisme et de l'élimination de l'H2 qui soit transposable à l'homme. Les études in vivo précentes sur l'hydrogène ont été réalisées jusqu'à présent sur le rat, notre modèle doit donc être complété par des données obtenues sur la même espèce pour pouvoir mettre les résultats en cohérence avec l'existant et construire le modèle qui sera par la suite paramétré avec des données humaines. Nous utiliserons des animaux adultes d'un poids corporel minimum de 300 grammes pour qu'ils soient adaptés à la mise en place de la CEC.
Evaluation de l’efficacité de composés sur les réseaux neuronaux et sur l’activité cellulaire après une administration unique ou répétée par voie entérale et / ou parentérale chez des rongeurs
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 1500
Cinquante molécules par an, deux cent cinquante sur la durée du projet, envoyées par des clients : 4 000 rongeurs, 2 500 souris et 1 500 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent les composés par gavage, injection intrapéritonéale, sous-cutanée ou intraveineuse, subissent des prélèvements sanguins à la queue ou en submandibulaire, et une ponction de liquide céphalorachidien. Tous sont tués pour découper leur cerveau en tranches et y enregistrer l'activité électrique. Le porteur qualifie ce travail de projet scientifique mené sur sa plateforme, alors que les composés, leur toxicité évaluée en amont et le calendrier des tests relèvent de ses clients.
Objectifs
Les maladies neurodégénératives liées au vieillissement ou à des troubles spécifiques, constituent un enjeu majeur de santé publique. Ce projet scientifique, réalisé sur notre plateforme d'électrophysiologie, vise à étudier l'efficacité de composés en développement sur l'activité neuronale, grâce à la technique d'électrophysiologie ex vivo sur coupes cérébrales de rongeurs sains. Ce projet servira de base pour le développement futur de stratégies thérapeutiques, dans les modèles pathologiques spécifiques associés et qui seront décrits dans un autre projet. Pour cela, nous analysons les effets de ces composés sur les mécanismes neuronaux fondamentaux à travers des expériences réalisées sur des rongeurs sauvages. Nos études seront réalisées soit sur la souris soit le rat selon la pathologie étudiée et la disponibilité des modèles animaux de la pathologie. Ces modèles offrent une base physiologique robuste, essentielle pour comprendre les processus fondamentaux dans un système neuronal non altéré. Les différentes structures cérébrales seront étudiées pour étudier la mémoire, la régulation émotionnelle, les circuits de récompense, pour analyser la coordination motrice et les interactions sensorimotrices, pour évaluer les fonctions motrices et certaines dimensions cognitives. Les composés sont administrés par voie orale ou parentérale selon des protocoles adaptés, avec des effets mesurés après des périodes d’exposition définies. Ce projet a pour but de fournir des données fondamentales pour orienter le développement de thérapies innovantes. On estime à 50 le nombre de molécules testées par an soit 250 pour la durée du projet.
Bénéfices attendus
En complément des recherches menées par nos clients, cette étude permettra de mieux comprendre les mécanismes d’action de ces composés et de contribuer au développement de nouvelles approches thérapeutiques contre les maladies neurodégénératives. Les résultats obtenus serviront de base pour la mise en place de stratégies thérapeutiques futures, qui seront approfondies à travers des études spécifiques sur des modèles pathologiques.
Procédures
Administrations : intrapéritonéale : 5 secondes, orale : 5 secondes, sous cutanée : 5 secondes, intraveineuse : 10 secondes, Sur animaux sous anesthésie et sous antalgie : prélèvements sanguins 5 secondes. prélèvements liquide céphalo rachidien 20 secondes, chirurgie terminale sans réveil 1 minute.
Impact sur les animaux
Les administrations et prélèvements sanguins peuvent induire un stress, dont l’intensité et la durée dépendent du type d’administration et de sa répétition. Les procédures uniques provoquent un stress aigu et transitoire, tandis que les administrations répétées, même sur une période prolongée, ne génèrent pas de stress prolongé si les techniques sont maîtrisées. Pour les administrations aiguës, les signes d’inconfort restent limités. Cependant, des administrations répétées peuvent entraîner une sensibilisation locale ou des modifications comportementales, telles qu’une réduction de l’activité spontanée ou des altérations dans l’interaction avec l’environnement. La toxicité des composés administrés a été évaluée en amont par nos clients, de manière à minimiser les risques d'effets indésirables. L’administration par gavage peut entraîner une gêne légère à modérée (gavage chronique), transitoire, due à la contention et à l’introduction de la sonde. Les produits administrés par cette voie peuvent induire des modifications dans la consistance des selles, ainsi qu’une baisse de la prise alimentaire. L’injection sous-cutanée entraîne une douleur légère et brève, due à la piqûre et au produit injecté. Une irritation ou une inflammation locale peuvent persister plusieurs minutes selon le composé administré. L’injection intrapéritonéale provoque un inconfort temporaire et une douleur légère. L’injection dans la veine caudale induit une douleur légère au moment de la piqûre et un stress bref lié à l’immobilisation. Une rougeur peut persister plusieurs minutes selon le composé administré. Un prélèvement sanguin à la veine caudale entraîne une douleur légère au moment de la piqûre et un stress transitoire lié à l’immobilisation. Le prélèvement submandibulaire provoque une douleur légère à modérée de courte durée en raison de la ponction. Les prélèvements terminaux de sang par la méthode du sinus rétro-orbitaire ainsi que celui du liquide céphalorachidien sont réalisés sous anesthésie. Un stress temporaire peut être associé à l’anesthésie.
Devenir
Les animaux seront tous euthanasiés afin de réaliser les coupes cérébrales et procéder aux enregistrements de l’activité cérébrale sur ces coupes.
Remplacement
L’étude des réseaux neuronaux et de l’activité cellulaire est réalisée sur des coupes cérébrales de rongeurs à l’aide de techniques d’électrophysiologie. Ces préparations ex vivo conservent certaines propriétés fonctionnelles des circuits neuronaux, permettant d’étudier l’activité synaptique et la dynamique des réseaux à une échelle locale. Les approches non animales, telles que les modélisations in silico, les cultures cellulaires ou les modèles in vitro, apportent des informations précieuses en phase exploratoire, notamment sur les mécanismes moléculaires et cellulaires. Dans ce projet, les composés testés ont d’ailleurs déjà été évalués par nos clients sur des modèles in vitro, permettant d’identifier des effets initiaux sur l’activité neuronale à un niveau cellulaire. Cependant, ces modèles in vitro ne permettent pas d’étudier les interactions au sein d’un réseau neuronal fonctionnel, ce qui justifie le recours aux coupes cérébrales ex vivo pour approfondir ces analyses dans un cadre plus proche de la physiologie neuronale.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit autant que possible, tout en étant suffisant pour l'obtention de résultats exploitables. L'évaluation du nombre d'animaux nécessaire a été effectuée par un programme adapté. Les résultats seront analysés par des tests statistiques.
Raffinement
À leur arrivée, les animaux seront hébergés en groupes sociaux dans des cages adaptées, enrichies d’éléments tels que des bûchettes de bois à grignoter, de la frisure papier, et des carrés de coton. Des tunnels en carton seront fournis pour les rats, tandis que des dômes transparents rouges seront utilisés pour les souris afin de faciliter les transferts entre cages tout en réduisant le stress. Des interactions quotidiennes avec les humains, combinées à une transition progressive de la lumière, amélioreront encore leurs conditions d’hébergement. Après chaque intervention technique, les réactions seront étroitement surveillées afin de minimiser toute souffrance animale. En cas de détérioration de leur état général, une surveillance renforcée sera mise en place, avec des soins appropriés prodigués en concertation avec le responsable du bien-être animal. Les fiches d’observation et les points limites établis pour le projet seront scrupuleusement respectés pour détecter et traiter précocement tout signe de souffrance ou de détresse. Les animaux seront pesés au moins une fois par semaine après l’acclimatation et avant le début des traitements. En cas de traitements répétés et consécutifs, des pesées 2 fois par semaine permettront d’ajuster précisément les volumes administrés. Les animaux seront toujours sous anesthésie générale / analgésie pour les procédures le nécessitant.
Choix des espèces
Nos expérimentations sont réalisées chez la souris et le rat, deux modèles largement utilisés en neurosciences pour l’étude des mécanismes cérébraux. Ces espèces présentent des similitudes importantes avec le cerveau humain. Ces similitudes en font des modèles de choix pour étudier les bases du fonctionnement normal du cerveau et les processus qui peuvent être perturbés dans les maladies neurodégénératives. Les animaux seront utilisés à partir de l'âge de 4 semaines, (groupe de référence) correspondant au stade adolescent chez l'humain, jusqu'à 95 semaines, afin de couvrir toute la gamme des âges, du stade jeune (adolescent) à l'adulte âgé.
Etude des processus de décision et de la balance excitation inhibition chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Trois mois de restriction alimentaire, ramenant les rats à dix pour cent en dessous de leur poids pour les motiver à travailler contre une récompense : 200 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 70 d'entre eux et modéré pour 130, tous tués à l'issue pour prélever leur cerveau. S'y ajoutent une chirurgie d'implantation d'électrodes crâniennes, trois séances d'imagerie cérébrale, des enregistrements de vingt-quatre heures et des injections de kétamine destinées à reproduire des symptômes psychotiques. Le projet cherche à modéliser la prise de décision et à tester l'hypothèse d'un déséquilibre entre excitation et inhibition dans la schizophrénie. Le porteur retient le rat Long Evans pour ses capacités cognitives et visuelles, et prévoit d'écarter quinze pour cent des animaux qui n'atteindront pas les critères d'apprentissage.
Objectifs
Les troubles neuropsychiatriques sont aujourd'hui la principale cause d'invalidité et de coûts de santé dans les pays développés. L’objectif de ce projet est de développer une tâche comportementale permettant d’étudier chez l’animal les processus inférentiels et d’explorer l’hypothèse clinique mettant en cause un déséquilibre excitation/inhibition
Bénéfices attendus
Le projet produira de nombreux résultats aux niveaux fondamental, clinique et pratique. Au niveau fondamental, il dévoilera le rôle des systèmes glutamatergique (excitateur) et GABAergique (interneurones parvalbumine inhibiteurs) dans les processus de prise de décision et remettra en question la théorie de l'inférence circulaire, en mettant en lumière la manière dont les croyances/priorités peuvent être créées et propagées au niveau des microcircuits. Sur le plan clinique, cela ouvrira la voie à des traitements pharmacologiques dans le domaine des troubles neuropsychiatriques tels que la schizophrénie, visant à rétablir l'équilibre de l'excitation cérébrale.
Procédures
Concernant l’analyse comportementale 200 rats seront soumis à un apprentissage cognitif et une série d’évaluation d’une durée allant de 1 à 3 mois à raison de 30 min à 1h de test quotidien. Pendant ces tests, les animaux seront soumis a une restriction alimentaire de 10% de leur poids sur une période de 3 mois, afin des les motiver à la récompense. Des imageries cérébrales in vivo (imagerie par résonnance magnétique et tomographie par émission de positrons) seront réalisées à 3 temps sans dépasser 1h15 par rat. Afin de mener les enregistrements cérébraux sur une partie des animaux, une chirurgie sera réalisée permettant l’implantation d’électrodes. Celle-ci ne dépassera pas 45min durant 4 sessions d'enregistrement. Les enregistrements seront réalisés sur animaux vigiles au repos (acquisition de 24h) ou en cours de tâche comportementale. Sur certains animaux, des injections (au nombre de 5) seront réalisées pour moduler la balance excitation/inhibition et observer les impacts sur le comportement des rongeurs. Enfin sur l’ensemble des animaux, trois prélèvements sanguins seront effectués sous anesthésie, d’une durée maximale de 10min par rat.
Impact sur les animaux
La kétamine est un agent pharmacologique couramment utilisé pour modéliser les symptômes psychotiques et présente une bonne tolérance à la dose qui sera utilisée dans ce projet. Aucun effet indésirable n’est attendu. Lors des chirurgies (implantation des électrodes) ou durant les acquisitions en imagerie, l’induction et le maintien de l’anesthésie peuvent provoquer des détresses respiratoires et une hypothermie pouvant conduire à la mort soudaine des animaux. Concernant l’évaluation comportementale, une habituation à la manipulation sera réalisée à l’arrivée des rats pour réduire le stress. La principale nuisance est la restriction alimentaire qui sera maintenue sur une période relativement longue (3 mois maximum) afin de motiver les animaux dans les tâches de conditionnement opérant.
Devenir
L'ensemble de ces animaux seront évalués sur le plan comportemental et d'imagerie du vivant ou Eléctroencéphalographie avant leur mise à mort afin de permettre le prélèvement du cerveau pour en étudier les modifications au niveau cellulaire et moléculaire. Dans un souci de réduction du nombre d'animaux utilisés au cours de ce protocole, nous avons intégré dans la mesure du possible, les animaux a toutes les procédures mises en oeuvre dans ce projet.
Remplacement
Ce projet s’inscrit dans une démarche de recherche translationnelle assurant le lien entre la recherche fondamentale et la recherche clinique et permettant le transfert des connaissances vers des applications thérapeutiques au bénéfice du patient. Cherchant à évaluer le bénéfice comportemental et fonctionnel de stratégies thérapeutiques pro-cognitives, il est indispensable de se reposer sur un modèle intégré et le remplacement des rats par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans ce contexte. Toutefois l’ensemble des molécules pharmacologiques utilisées dans ce travail ont fait l’objet d’études préalables permettant de valider les propriétés recherchées pour cette étude.
Réduction
Le projet a été conçu avec un nombre minimal d’animaux nécessaire à sa validité scientifique et statistique. Les animaux qui seront utilisés pour effectuer l'évaluation comportementale seront également utilisés pour étudier les marqueurs fonctionnels d’imagerie. En termes de comportement des groupes de 20 animaux par groupe sont nécessaires pour garantir la fiabilité des résultats. Un taux d’exclusion de 15% de l’effectif initial doit toutefois être considéré. Ce chiffre a été défini sur la base de notre expérience dans l’utilisation de la tâche de discrimination visuelle et correspond au pourcentage de rats qui ne parviennent pas à atteindre les critères de validation de l’étape de conditionnement/apprentissage.
Raffinement
Les rats seront hébergés dans des portoirs ou armoires ventilées sous un cycle de lumière 12h/12h selon la réglementation, avec nourriture et accès à l'eau ad libitum. Le raffinement est assuré par un hébergement collectif, de l’enrichissement dans les cages, des sessions d’acclimatation aux expériences, une manipulation expérimentée des animaux. De plus, un suivi quotidien du bien-être des animaux sera effectué pour surveiller l'apparition éventuelle de souffrance ou de points limites pour lesquels des décisions adaptées seront prises. Selon les critères observés et la cause identifiée, les animaux seront soit isolés et soignés, et/ou recevront un traitement analgésique, ou seront euthanasiés par dose létale de pentobarbital dans une salle dédiée.
Choix des espèces
L’espère de rat Long Evans est choisie pour ses capacités cognitives et visuelles adaptées. Les animaux seront utilisés dès 2 mois et suivis jusqu’à 6-7 mois, car il a été montré que c'est pendant cette période du dévelopement que les animaux présentent les meilleures facultés d'apprentissage, nécessaire pour les procédures comportementales.
Evaluation de la pharmacocinétique et de la pharmacodynamie de vecteurs viraux administrés en topique ou par injection intra-neurale, chez le rongeur.
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Rats : 685
Jusqu'à dix acquisitions d'imagerie par jour le premier jour, puis trois par jour pendant trois jours, puis une par jour jusqu'au dixième : 1 370 rongeurs, 685 souris et 685 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère pour 450 d'entre eux, modéré pour 900 et léger pour 20. Les animaux subissent des abrasions ou scarifications de la voûte plantaire, de la lèvre ou de la cornée et des injections dans le nerf sciatique sous anesthésie pouvant durer une heure, avec douleurs, inflammation, gêne pour s'alimenter, difficultés locomotrices et troubles visuels annoncés. Le projet sert à établir le profil pharmacologique de vecteurs de thérapie génique, données destinées à un dossier européen de médicament expérimental puis à une éventuelle demande d'essai clinique. Dix animaux seront réutilisés et les témoins pourront être gardés en vie pour la formation continue du personnel ou servir de contrôles dans d'autres études, tous les autres étant tués pour prélèvement des ganglions.
Objectifs
Les aires thérapeutiques majeures (oncologie, neurologie, cardiologie, urologie…) demeurent sans solution thérapeutique satisfaisante. Elles constituent les principales causes de mortalité et de handicap dans le monde, et provoquent de véritables drames humains, sociaux et économiques. Mais au cours des deux dernières décennies, la thérapie génique est devenue un outil thérapeutique clé qui constitue un véritable espoir pour les patients. Actuellement, les vecteurs viraux sont devenus le principal système d'administration de gènes pour la médecine génétique. L’objectif est d’introduire des gènes dans des cellules pour soigner une maladie. Au départ, cette approche a été conçue pour suppléer un gène défectueux en cas de dysfonction. Mais au cours des deux dernières décennies, l’évolution rapide des connaissances et des technologies a permis de démultiplier les stratégies possibles et d’élargir leur utilisation à de très nombreuses indications. L’objectif de ces vecteurs est de traiter les maladies neurologiques grâce à la thérapie génique. En fonction de la voie d’administration, les vecteurs vont coloniser différents ganglions puis exprimer le transgène d’intérêt pour la maladie cible. Dans ce projet, différentes voies vont être testés afin de déterminer la voie la plus pertinente et la plus efficace dans la colonisation des neurones sensoriels cibles. Les études de pharmacodynamie et pharmacocinétique chez l’animal sont nécessaires pour caractériser le potentiel thérapeutique d’une molécule. Dans ce contexte les administrations topiques (cutanées et cornéennes) et intra-nerveuse avec suivi de la molécule par imagerie, permettront d’étudier l’absorption et la distribution de ces vecteurs. L’objectif sera d’aider à la détermination de la voie d’administration optimale et du régime posologique le plus adapté. Ce projet a pour objectif de caractériser l’absorption, la distribution et l’excrétion de vecteurs viraux chez le rongeur. Il se décompose en 2 phases : l’administration de composés en topique et intra-neurales et l’évaluation de la bio-distribution.
Bénéfices attendus
A court terme, le bénéfice premier de la mise en œuvre de ce projet sera l’établissement du profil pharmacologique d’un composé. A plus long terme, les données obtenues au travers ces études précliniques feront partie intégrante du dossier Européen IMPD (Investigational Medicinal Product Dossier), lequel permettra de motiver une demande d’essai clinique qui débouchera peut-être sur la mise sur le marché d’un nouveau médicament.
Procédures
Les abrasions/scarifications et la chirurgie du nerf sciatique seront faites sous anesthésie générale. L’anesthésie pourra durer jusqu’à 1h du fait du temps de pénétration/séchage des produits administrées (sur les zones scarifiées/abrasées) ou de la chirurgie du nerf sciatique. Des examens scanner ou d’imagerie optique pourront également être réalisés sous anesthésie générale. Un examen micro-scanner peut aller jusqu’à 20 minutes, celui de fluorescence est d’en moyenne 5 minutes, la fréquence des examens sera de : - maximum 10 acquisitions par jour le premier jour puis, - maximum 3 acquisitions par jour pendant les 3 jours suivants puis, - maximum 1 acquisition par jour jusqu’au 10ème jour puis, - maximum 2 acquisitions par semaine jusqu’à la fin de l’étude. Pour les examens de bioluminescence, la durée est d’en moyenne 5 minutes, les fréquences seront de : - maximum 2 acquisitions par jour les 3 premiers jours puis, - maximum 3 acquisitions par semaine jusqu’au 30e jour puis, - maximum 2 acquisitions par semaine jusqu’à la fin de l’étude. Des prélèvements sanguins pourront être réalisés sur animaux anesthésiés au maximum 1 fois par semaine jusqu’à la fin de l’étude. Un prélèvement s’effectue en moyenne en 1 à 2 minutes.
Impact sur les animaux
Le stress est inhérent à toute manipulation d’animaux. Les méthodes d’administration topiques par abrasion et scarification, et les administrations intra-neurales peuvent induire des douleurs et une inflammation. La scarification de la lèvre peut entrainer une douleur entrainant une gêne pour s’alimenter. Des difficultés locomotrices pourront être observées chez les animaux ayant eu une scarification/abrasion de la voute plantaire ou une injection intra-neurales. La scarification peut entrainer une douleur et des troubles visuels.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin du protocole. Tout organe pertinent pourra être prélevé après mise à mort de l’animal afin de réaliser une quantification des produits par imagerie ex-vivo (micro-scanner ou imagerie optique) ou par d’autres techniques in-vitro. Les ganglions de la racine dorsale ou les ganglions trijumeaux seront prélevés pour des analyses histologiques. Les animaux contrôles pourront être gardés en vie et utilisés pour de la formation continue du personnel ou, dans la mesure du possible et en fonction des projets, ils pourront être réutilisés pour des études comme animaux contrôle.
Remplacement
La pharmacologie étudie les interactions entre un xénobiotique et une ou plusieurs cibles endogènes. Ces interactions recouvrent les effets du xénobiotique, ou ses produits de dégradation, sur la ou les cibles, mais aussi l’action de la ou les cibles sur l’agent toxique. Une bonne compréhension des mécanismes est donc indissociable d’une bonne connaissance des mécanismes physiologiques, développementaux, cellulaires et moléculaires. Actuellement, l’ensemble des cibles potentielles et les mécanismes conduisant à un effet pharmacologique ne sont pas complètement élucidés et ne peuvent donc pas être modélisés. Il n’existe donc pas de modèle de remplacement. C’est pour cela qu’il est impératif d’évaluer les effets potentiels d’un composé thérapeutique sur des modèles animaux avant tout essais chez l’homme.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux dans les études de pharmacologie nous nous assurerons de la validité et de la prédictivité des données acquises avant de démarrer toute expérimentation, pour ne pas évaluer des composés non pertinents • en cas de doute, des études pilotes pourront être réalisées. Elles auront pour objectif d’évaluer graduellement les composés et de rechercher les doses les plus prometteuses sur un nombre limité d’animaux L’avantage de l’imagerie médicale est de suivre les mêmes animaux au cours du temps et donc de diminuer le nombre d’animaux utiles au projet. Afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables permettant d’étudier la biodistribution du produit testé, des groupes d’au moins 5 animaux seront constitués. Si nécessaire, des études pilotes pourront être réalisées sur un nombre limité d’animaux (3 par groupe minimum) afin de confirmer la visualisation d’un produit marqué in-vivo par exemple.
Raffinement
Le raffinement de nos procédures inclue : • la gestion du stress et de l’angoisse: une période d’acclimatation de minimum 5 ou 7 jours (si les animaux sont transportés par avion) sera respectée. Ils seront également hébergés collectivement durant toute la durée de l'étude pour augmenter les interactions sociales, dans un environnement enrichi • la prise en charge précoce de la douleur : Les animaux seront observés quotidiennement afin de détecter tout signe clinique anormal et ainsi prendre le plus rapidement possible les mesures nécessaires : mesure de soutien (désinfection de plaies, réchauffement, injection d’analgésie, etc…) ou la mise à mort des animaux ayant un état clinique jugé moribond. • des évaluations cliniques quotidiennes (état général des animaux, détection d’état moribond) et régulières (pesée et scoring des signes cliniques au moins 1 fois par semaine, fréquence augmentée en fonction de l’état clinique des animaux et de la sévérité des actes réalisés), • des soins vétérinaires adaptés aux voies d’administrations des vecteus viraux et en fonction de l’état clinique des animaux, • l’intégration de points limites stricts : une grille précise d’évaluation des signes cliniques généraux et spécifiques à la voie d’administration sera utilisée afin d’anticiper la mise à mort si nécessaire.
Choix des espèces
Le rat et la souris sont 2 espèces retenues pour les études de pharmacocinétique et pharmacodynamique du fait de leur prédictivité. Étant fond génétique international, ces souches permettent de travailler sur des lots homogènes (âge et sexe fixés). Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte (6 à 8 semaines) afin de s’affranchir de la période de forte croissance de l’animal. Cet âge est également en accord avec les lignes directrices pour garantir une homogénéité entre les phases précliniques.
Formation aux techniques in vivo standards en Recherche et Développement (R&D)
- Formation professionnelle
Rats : 80
Cochons d'Inde : 80
Hamsters dorés : 70
Hamsters de Chine : 10
Lapins : 80
Cochons : 20
Former le personnel aux gestes techniques d'une activité de recherche et développement, sur des animaux vivants, constitue l'objet de ce projet. 1 340 animaux non-humains vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 1 000 souris, 80 lapins, 80 rats, 80 cochons d'Inde, 70 hamsters dorés, 10 hamsters de Chine et 20 cochons. Chaque séance comporte une à trois interventions par animal sur trente minutes, injections, prises de sang, anesthésies parfois répétées, lavages broncho-alvéolaires avec chute de la saturation en oxygène, le porteur reconnaissant que les personnes à former ne maîtrisent pas les gestes et peuvent provoquer saignements et douleurs par erreur technique. Quarante animaux seront réutilisés et vingt lapins ou cochons placés en adoption quand les conditions le permettent, les 1 280 autres étant tués, et le porteur justifie l'ensemble par une obligation réglementaire de formation qu'il qualifie d'"indispensable".
Objectifs
- Educatif : La formation sur animaux est indispensable pour la qualification du personnel et la maitrise des gestes techniques et ainsi pouvoir observer que ceux-ci correspondent bien aux règles de l’art et qu’aucun impact clinique n’est constaté suite à la réalisation des gestes techniques. - Réglementaire : La formation du personnel avec démonstration de la compétence est une obligation réglementaire (décret 2013-118, section 6, sous-section 4, paragraphe 2).
Bénéfices attendus
La formation du personnel aux gestes techniques permet d’avoir des personnes parfaitement formées et compétentes, et travaillant de façon harmonisée avec du matériel optimisé. Les bénéfices sont principalement éthiques : pour le bien-être de l’animal manipulé (raffinement), ainsi que pour consolider la reproductibilité du geste et donc éviter d’avoir à refaire l’étude (réduction). Des gestes maitrisés permettent également de limiter le risque de blessure pour l’opérateur
Procédures
Les animaux sont soumis à des sessions de formation à l’administration de produits non irritants et/ou de prélèvements de sang. Par séance de formation, ils vivront entre 1 et 3 interventions ; pour une durée totale de 30 minutes
Impact sur les animaux
Les nuisances sont : - la sensation de piqûre de l’aiguille pour les injections et prélèvements. - l’anesthésie potentiellement répétée notamment pour certains types de prélèvements sanguins - la chute de la saturation en oxygène du sang pendant quelques minutes dans le cas des lavages broncho-alvéolaires. Par définition, les personnes à former ne maitrisent pas complètement les gestes techniques. Bien qu’une formation théorique préalable et un accompagnement par une personne compétente soit assurés, il est possible que des erreurs techniques surviennent induisant des effets indésirables comme des saignements de faible intensité et de courte durée lors des prélèvements sanguins, ou de légères douleurs induites par une injection dans un compartiment non adéquate (péri-veineux ou intra-intestinal par exemple).
Devenir
Lorsque cela est possible (pas de formation au prélèvement terminal, pas de procédure invasive, bon état de santé de l’animal, pas d’hébergement dans un milieu bioconfiné, statut sanitaire compatible, structure d’accueil identifiée et disponible), des démarches de réutilisation, de replacement et/ou d’adoption sont enclenchées. Lorsque toutes les conditions ne sont pas réunies, les animaux sont euthanasiés en fin de procédures expérimentales.
Remplacement
Lorsque cela est possible, les gestes sont réalisés sur des matières non vivantes (plastique, textile, tissus morts, ou composition diverse) afin de s’entrainer au geste avant de pratiquer sur animal vivant. Des dispositifs ont déjà été testés, tous n’ont pas été retenus (ex : des animaux en plastique trop rigides pour s’entrainer à de la contention). Une veille scientifique est assurée par notre équipe (vétérinaires, managers, techniciens) via les publications, le réseau, la visite d’un centre de formation aux gestes techniques sans animaux, les formations (ex : ComEd), etc. afin de ne rater aucune opportunité à la formation sans animaux vivants.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est raisonné selon le nombre de personnes à former, l’expérience de ces personnes, le nombre de techniques à apprendre, la difficulté technique, le nombre de techniques réalisables sur un même animal et sur la base des expériences terrain comme étant le minimum pour s’assurer qu’une personne maîtrise un geste technique. Aucune approche statistique n'est envisageable pour ce projet, le nombre d'animaux utilisé étant tributaire du nombre de personnes à former et de leur niveau initial. Dans la mesure du possible, des animaux d’autres procédures pourront être utilisés pour cette formation. Pour qu’ils soient réutilisés, il faut que la procédure précédente soit considérée comme « légère ou modéré» et qu’ils soient en bon état de santé. Aucun animal ayant subi une procédure sévère ou ne présentant pas un bon état général ne pourra être utilisé pour la formation. Enfin, un effort de réduction est appliqué chez les rongeurs par l’utilisation d’un appareil d’imagerie qui permet de visualiser la localisation de l’injection (IC, IP, IM, ICe ou SC) -et donc valider le geste technique sans avoir à euthanasier l’animal - permettant ainsi de réutiliser l’animal par la suite.
Raffinement
Moyens entrepris au niveau du projet ou de la procédure pour réduire le niveau de souffrance : une formation théorique est dispensée à l’arrivée des personnes avec du texte, des supports visuels (photos, vidéos). Avant maitrise des gestes de prélèvements et d’administration (hors IP), les animaux sont anesthésiés.
Choix des espèces
La formation du personnel doit prendre en compte toutes les espèces sur lesquelles il est amené à réaliser des gestes techniques dans le cadre des projets de recherche. Ces espèces sont définies et justifiées dans les protocoles des procédures de R&D. Le programme est développé en lien avec le responsable du suivi des compétences et le manager. D’autres aspects techniques sont aussi à prendre en compte : taille des animaux (voie ou volume des administrations, volume de prélèvement,…). Ces espèces correspondent aux espèces déclarées et validées dans l’agrément d’établissement utilisateur, ainsi qu’aux espèces déclarées dans les projets de recherche et développement. Ce sont donc les espèces pour lesquelles le personnel doit être formé s’il ne l’est pas déjà Les animaux utilisés sont ceux demandés dans les protocoles d’étude de la R&D. Les souris peuvent être utilisées nouveau-nés dans le cadre de besoin projet (ex : développement de candidat vaccin pour des nouveau-nés). Si des souriceaux âgés entre 24h et