Rats
Evaluation de la pharmacocinétique et de la biodistribution tissulaire d’un médicament chez le rat dans le contexte du traitement des fistules anales dans la maladie de Crohn
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
24 rats vont être utilisés pour répondre aux questions de l'Agence européenne du médicament, adressées à un prestataire qui travaille pour un client industriel. Une partie des procédures se déroule sans réveil, le reste à un niveau de souffrance modéré, et tous les animaux sont tués par prélèvement de sang terminal en intracardiaque pour mesurer où le produit s'est distribué dans les tissus. Ils reçoivent des vésicules extracellulaires radiomarquées destinées à traiter les fistules périanales de la maladie de Crohn, avec pesée quotidienne pendant quatorze jours et deux prises de sang sur animal vigile. Le porteur constitue cinq groupes de quatre animaux, deux mâles et deux femelles, et affirme qu'il "n'est néanmoins pas possible de descendre sous ce seuil".
Objectifs
Plus de 1,9 millions de personnes à travers le monde sont atteints de la maladie de Crohn. Une des manifestations fortement handicapante et fréquente de cette pathologie (un tiers des patients après 20 ans d’évolution) est l’apparition de fistules périanales, fissure pénétrant dans la paroi intestinale avec une forte inflammation environnante. La prise en charge est multidisciplinaire (médicale et chirurgicale) avec des taux de récidive allant jusqu’à 40% à 5 ans. Notre client a pour objectif de proposer une alternative thérapeutique à base de particules naturellement libérées par les cellules appelées vésicules extracellulaires (VEs) qui ont été obtenus à partir de cellules souches issues du tissu adipeux. Ce traitement sera proposé quand les fistules des patients ont montré une réponse inadéquate à une thérapie conventionnelle. Ces VEs seront administrés de manière concomitante par voie sous cutanée le long de la paroi de la fistule et au niveau de son orifice, et en locale à l’intérieure de la fistule. Pour l’administration locale, les VEs seront mélangées à un polymère (Poloxamère 407), une grosse molécule formant un gel à la température du corps et permettant ainsi de retenir les EVs dans le site de la lésion dans des zones peu accessibles et de prolonger la libération du médicament. L’efficacité du traitement de VEs combinées à ce polymère a déjà été montrée dans plusieurs modèles préclinique de fistules digestives et intestinales chez le rat et le cochon. Ces VEs diluées dans une solution saline (pour l’injection sous cutanée) ou mélangées au Poloxamère 407 (pour l’administration locale) n’ont pas montré d’effets délétères. Notre projet vise aujourd’hui à répondre à une des questions posées par l’Agence Européenne du Médicament en vue de compléter le dossier réglementaire d’une future demande d’autorisation d’essais cliniques, à savoir quantifier la persistance des VEs après une administration unique et d’évaluer son élimination de la circulation sanguine ainsi que sa distribution dans les tissus. Les VEs étant difficilement traçables dans l’organisme, elles seront couplées à un élément radioactif (iode-125) afin de pouvoir les suivre et ainsi de répondre à ces questions.
Bénéfices attendus
Cette étude vise à répondre aux questions scientifiques posées par l’Agence Européenne du Médicament notamment sur la persistance du produit de notre client au site d’intérêt, sur son élimination de la circulation sanguine et sa distribution dans les tissus ; et en cas de réponse positive de poursuivre le développement de ce médicament vers des études de toxicologie réglementaire. Le succès du développement de médicament permettrait une nouvelle solution thérapeutique pour les malades de la maladie de Crohn souffrant de fistules périanales récidivantes.
Procédures
Sur animal vigile : Pesée (une fois par jour, maximum 14 jours, 20 secondes) ; administration de composé analgésique (maximum 2 fois, 15 secondes) ; prélèvement de sang (2 fois maximum, 3 minutes). Sur animal anesthésié : Prélèvement de sang terminal en intracardiaque sous analgésie (1 fois, 5 min) ; Administration de composé thérapeutique (maximum 2 fois, 5 minutes)
Impact sur les animaux
Stress lié à l’anesthésie à l’isoflurane ; stress et douleur légère liés aux administrations sous cutanées vigiles; stress lié à la manipulation vigile pour les pesées ; stress et douleur légère liés aux prélèvements de sang vigiles
Devenir
Mise à mort de tous les animaux de chaque procédure lorsque l’une des conditions ci-après est remplie : Prélèvement d’organes, atteinte d’un point limite justifiant la mise à mort de l’animal, fin de l’étude.
Remplacement
Evaluer la pharmacocinétique, la biodistribution tissulaire nécessite d’être en présence d’un système biologique complexe et est impossible à faire in vitro. De plus, dans le cadre du développement du médicament de notre client, l’Agence du Médicament Européen a demandé que ces études soient complétées chez l’animal. L’animal est donc incontournable dans le cadre de cette étude.
Réduction
Les 5 groupes utilisés sont composés uniquement de 4 animaux (2 mâles et 2 femelles), la méthode de quantification par mesure radioactive étant très précise et répétable. Il n’est néanmoins pas possible de descendre sous ce seuil.
Raffinement
Afin de réduire la douleur, la souffrance et l'angoisse au maximum, les animaux seront surveillés quotidiennement et des points limites les plus précoces possibles seront mis en place. Les animaux sont également hébergés en groupes sociaux harmonieux de 2 par cage dans un environnement enrichi comme la réglementation l'exige. Les injections et les prélèvements de sang effectués sur l’animal vivant le seront selon les bonnes pratiques de bien-être animal en termes de volumes, de matériel utilisé, d’anesthésie et de préhension des animaux.
Choix des espèces
Le développement préclinique du traitement de notre client a été effectué dans cette espèce et cette espèce a été demandée par l’Agence Européenne du Médicament pour les études complémentaires. Les rats seront utilisés à un âge de 6-7 semaines lors de leur entrée en étude, âge auquel le système immunitaire de ces animaux est considéré comme mature.
Evaluation du comportement de dispositifs médicaux dermatologiques de comblement injectés chez le rat
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Injectés en sous-cutané avec un produit de comblement dermatologique, puis passés au scanner à rayons X jusqu'à trois fois le premier jour, une fois par jour les quinze jours suivants, une fois par semaine pendant deux mois, puis une fois par mois jusqu'à la fin de l'étude. 266 rats sont ainsi utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, chaque passage d'imagerie se faisant sous anesthésie gazeuse. Le porteur signale des pertes de poids liées aux anesthésies répétées, et une inflammation voire une nécrose possible du site d'injection. 252 rats sont tués pour prélever le site d'injection ou des organes, 10 sont réutilisés pour de la formation continue du personnel et 4 sont adoptés, l'objet réel du projet étant d'améliorer la persistance de produits de comblement du visage.
Objectifs
Les dermal fillers (remplisseurs cutanés) sont généralement utilisés pour des traitements peu invasifs, tels que la restauration du volume du visage dans des cas de dégradations physiques sévères (lésions post-accidentelles, restauration et correction des signes de perte de graisse faciale (lipoatrophie) chez les personnes atteintes du VIH, ... ). Certains produits de comblement se résorbent naturellement avec le temps nécessitant pour les patients de répéter les injections, il est donc nécessaire d'améliorer la persistance de ces produits. La recherche de nouveaux produits, performants et sains pour le patient, est donc un enjeux de santé publique. Ce projet a pour objectif de tester et d’évaluer des dispositifs médicaux injectables de comblement sur le modèle rat. Il comporte plusieurs protocoles visant à évaluer leur comportement (persistance) et la tolérance locale (potentielles réactions locales de type inflammatoire) après injections en sous-cutanée. Lors de ce projet, l'imagerie médicale sera utilisée afin de suivre l'évolution (volume, hauteur, étalement et forme) des produits injectés au cours du temps. Un effet inflammatoire des produits pourra également être mis en évidence par analyse histologique.
Bénéfices attendus
Ce projet contribuera aux développements de nouveaux produits dermatologiques de comblements et éventuellement à leur mise sur le marché dans le but de proposer des produits plus performants et persistants.
Procédures
Les animaux seront soumis à 1 ou maximum 2 injections en sous-cutanée des produits tests en respectant les volumes d’injections recommandés. Ces injections seront réalisées en environ 4 minutes pour les animaux vigiles et en maximum 10 minutes (anesthésie comprise) pour les animaux anesthésiés. Des examens scanners à rayons X seront réalisés sous anesthésie gazeuse. Un examen scanner dure jusqu’à 20 minutes (anesthésie comprise). La fréquence des examens scanners sera de maximum 3 acquisitions par jour le premier jour, puis maximum 1 acquisition par jour pendant les 15 jours suivants, puis maximum 1 acquisition par semaine pendant les 2 premiers mois puis maximum 1 acquisition par mois jusqu’à la fin de l’étude.
Impact sur les animaux
Les animaux seront manipulés régulièrement pour différents actes avec ou sans anesthésie susceptibles d’induire un stress (pesées, injection de produits et réalisation des acquisitions d’imagerie scanner à rayons X). Les animaux pourront présenter des réactions différentes selon les produits testés pouvant entrainer l’apparition de signes cliniques (pertes de poids liées aux éventuelles anesthésies répétées et/ou inflammation voire nécrose du(des) site(s) d’injection - probablité faible avec des produits de comblement classique).
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin du protocole car des prélèvements du site d’injection ou d’organe(s) doivent être réalisés pour analyse histologique. Dans la mesure du possible, les animaux réserves qui n’auront finalement pas été inclus dans les études pourront être réutilisés pour de la formation continue du personnel ou adoptés en fin d’étude selon la procédure d’adoption de l’EU.
Remplacement
Afin de répondre aux objectifs de ce projet ainsi qu’à des exigences réglementaires, le recours à l’expérimentation animale est nécessaire car il n’existe pas à l’heure actuelle de méthode alternative permettant de modéliser le comportement de produits injectés dans un organisme entier vivant de manière fiable. Ce comportement dépend de très nombreux facteurs tels que la zone d’injection, les tissus environnants, l’activité de l’animal, etc.
Réduction
Le suivi du comportement des produits injectés réalisé par imagerie médicale scanner à rayons X permet de suivre les mêmes animaux au cours du temps et donc de diminuer le nombre d’animaux utilisé par projet. Afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables permettant d’étudier la performance du produit au cours du temps, des groupes de minimum 6 sites d’injection par éléments d’essai seront constitués.
Raffinement
Une période d’acclimatation de 5 jours minimum sera respectée. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux en cages sur portoirs ventilés (hors cas d’isolement des animaux pour agressivité ou blessure sur avis vétérinaire) avec les enrichissements appropriés (bâtonnets de bois, cell-sizzle et tube en bois). Les animaux seront observés quotidiennement afin de déceler précocement tout signe clinique anormal et ainsi mettre en place des mesures de prise en charge aussi rapidement que possible (mesures de soutien ou bien mise à mort en cas d’état de santé considérablement dégradé et irréversible). Des pesées régulières seront réalisées : minimum 1 fois par semaine et entre 24 et 72h post-administration des produits de comblement. La fréquence des pesées pourra être augmentée en fonction de l’état clinique des animaux : une pesée quotidienne sera réalisée si l’animal est en perte de poids égale ou supérieure à 15% de son poids maximal atteint durant l’étude (soit une perte de poids de 52.5g pour un animal de 350g). Dans les 24 à 72h post-administration des produits de comblement, une observation du(des) site(s) d’injection sera réalisée pour s’assurer qu’aucune anomalie (rougeur, plaie, nécrose, nécrose ulcérante) n’est visible. L’état général de l’animal sera également observé. Lors des anesthésies, du gel oculaire sera appliqué pour éviter le dessèchement cornéen et une attention particulière sera apportée à la lutte contre l’hypothermie (tapis chauffant et/ou lampe chauffante).
Choix des espèces
Le rat est l’espèce privilégiée pour les injections sous-cutanées de produit de comblement. Un volume plus important que chez la souris peut-être administré permettant un suivi par imagerie scanner à rayons X au cours du temps. De plus, le rat est très bien caractérisé et présente une similitude avec l’homme concernant sa réactivité au niveau de la peau et des tissus sous-cutanés permettant d’évaluer la biocompatibilité et l'efficacité des produits de comblement. Les rats seront utilisés entre 6 et 10 semaines lors des administrations. Pour ce type d’étude, il n’y a pas de contrainte spécifique lié à l’âge. A partir de 6 semaines, les rats ont un système immunitaire suffisamment développé pour répondre efficacement aux stimuli immunitaires, ce qui les rend appropriés pour ce type d’études.
Rôle protecteur de la progestérone contre la rechute à la cocaïne : dissection du rôle du cortex insulaire et du système mésolimbique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
La restriction alimentaire imposée aux rats ne doit pas leur faire perdre plus de 15 % de leur poids, seuil au-delà duquel le porteur rétablit l'accès à la nourriture. 1 920 rats vont être utilisés sur cinq ans, tous tués pour prélever leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit un cathéter dans la veine jugulaire posé en trente minutes, des injections intracérébrales et une fibre optique implantée en une heure et demie, et les femelles subissent un prélèvement vaginal quotidien pendant sept jours. Le projet cherche à savoir si la progestérone protège de la rechute à la cocaïne, un bénéfice thérapeutique pour l'humain que le porteur situe explicitement à long terme.
Objectifs
Les objectifs de ce protocole sont triples : - Premièrement, tester l’effet des hormones sexuelles sur la rechute à la cocaïne - Deuxièmement, étudier comment l’activité des neurones d'une partie du cerveau, appelée insula, est modulée par les hormones sexuelles lors de la rechute à la cocaïne - Troisièmement, étudier si la manipulation de l’activité des neurones de cette partie du cerveau influence la rechute à la cocaïne.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’étudier le rôle des neurones d'une partie du cerveaux (insula) dans l’effet protecteur des hormones sexuelles sur la rechute à la cocaïne chez les rats mâles et femelles. A long terme, ce projet a le potentiel d’identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques applicables à l’humain (homme et femme) pour prévenir la rechute à la cocaïne grâce à un traitement basé sur les hormones sexuelles qui sont déjà des molécules pharmacologiques approuvées par l’ANSM (Agence Nationale de la Santé et du Médicament).
Procédures
Les animaux subiront deux types d’intervention chirurgicales, la pose d’un cathéter dans la veine jugulaire qui durera 30 minutes et des injections intracérébrales ainsi qu’une implantation de fibre optique (durée 1h30) quand nécessaire pour enregistrer d’activité des neurones. Enfin, chez les femelles, le cycle hormonal sera suivi pendant 7 jours par un prélèvement vaginal (durée 10 secondes) quotidien. Les males seront manipulés de la même façon sans prélèvement pour éviter tous biais expérimentaux.
Impact sur les animaux
La chirurgie peut engendrer des douleurs post-opératoires au niveau des sites d’incision, l’injection, ou d’implantation de matériel (crâne, cou, abdomen). La prise de cocaïne peut engendrer une perte de poids lors des premières sessions, mais cette perte n’excède pas 3 ou 4 jours à l’issus desquels les animaux retrouvent un poids initial. La cocaïne peut également engendrer une hyperactivité des animaux qui disparaît 1 heure après la fin de la prise de drogue. La littérature ne montre pas de stress lié à la prise de cocaïne et il n’y a pas de syndrome de sevrage (tremblement, perte de poids) dans les modèles animaux de prise de cocaïne. La restriction alimentaire engendre une perte de poids de l’animal qui sera contrôlée quotidiennement par l’expérimentateur. Cette restriction ne devrait pas engendrer plus de 15% de perte de poids par rapport au poids initial, si la perte de poids dépasse 15% alors l’animal aura accès immédiatement à la nourriture ad libitum et ne subira pas d’autre privation tant qu’ils n’auront pas repris leur poids initial.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de procéder à des analyses sur les tissus cérébraux.
Remplacement
Le projet porte sur une analyse de la connexion des neurones et de leurs propriétés de transmission d’informations au cours du comportement. Par conséquent cette procédure doit être effectuée chez des animaux vivants. L’étude de ces phénomènes n’est donc pas possible sur des cellules isolées, car elles ne permettent pas la quantification des connections neuronales ou la mesure de l’activité en réponse à une stimulation sensorielle.
Réduction
Nous avons réduit au strict nécessaire le nombre d’animaux afin d’obtenir une analyse fiable (le nombre d’animaux estimé permet d’effectuer des tests statistiques) et complète de la connectivité et de l’activité de la région cérébrale d’étude. Nous avons utilisé un logiciel statistique pour calculer le nombre d’animaux nécessaires pour chaque procédure en prenant en compte la quantité de conditions expérimentales pour chacune d’elle. Nous utiliserons ainsi 1920 animaux sur cinq ans.
Raffinement
Hébergement en cages collectives pour limiter le stress de l’isolement. Réduction au strict minimum les animaux hébergés individuellement pour raisons expérimentales (dérogation 4.5). Les cages seront enrichies en nid cotonné et bois. Avant chirurgie et après anesthésie, un antalgique sera administré en sous-cutané (s.c.) afin d’éviter la souffrance opératoire. Un anesthésiant local en crème sera appliqué (en plus de l’anesthésie à l’isoflurane) 10 min avant l’incision. La chirurgie sera effectuée en conditions stériles. Si infection, le vétérinaire mettra en place un traitement antibiotique approprié. Après chirurgie, l’expérimentateur suivra quotidiennement l’animal (alimentation, qualité du poil, locomotion) et le pèsera 4 jours jusqu’à stabilisation. Du baume cicatrisant sera appliqué sur les sites d’incision si mauvaise cicatrisation. Si douleur post-opératoire : Points limites, critères d’arrêt : Stade 1 : Normal. Si perte de poids jusqu’à 10% du poids initial une injection s.c. de saline sera réalisée et de la nourriture humidifiée sera au sol. Stade 2 : Perte de poids persistante 24h post chirurgie avec signes de douleurs (prostration, mauvaise qualité de poil, hypoactivité). Injection s.c. d’antalgique et de saline et nourriture humidifiée au sol. Stade 3 : Perte de poids qui persiste 48h avec signes de douleurs (prostration, mauvaise qualité de poil, hypoactivité). Injection s.c d’antalgique, de saline, et intrapéritonéale de glucose 5% et nourriture humidifiée au sol. Une seconde injection d’antalgique et de saline pourront être réalisées à 72h si pas d’amélioration. L’animal sera euthanasié si état prolongé au-delà de 72h sans amélioration. Stade 4 : Etat de l’animal ne pouvant être pris en charge par médication et engendrant de la souffrance, ou état non amélioré voire dégradé au-delà de 72h même avec prise en charge. Euthanasie immédiate par décapitation ou exsanguination si animal a réalisé des tests comportementaux nécessitant le prélèvement du cerveau pour analyses histologiques. Dans les deux, injection s.c. d’antalgique puis i.p. d’euthanasiant avant sacrifice. Afin que la restriction alimentaire impacte au minimum le bien-être, si perte de plus de 15% du poids initial (mesuré pendant 3j avant début de restriction), accès immédiat à la nourriture ad libitum sans privation tant que les rats n’auront pas repris leur poids initial. Le poids des animaux sera suivi durant les 5j d’acquisition.
Choix des espèces
Les rats sont un modèle largement utilisé pour l’étude des neurones impliquées dans les troubles de la consommation de drogues. L’administration de cocaïne est utilisée depuis de nombreuses années et largement décrit dans la littérature, et l’injection d’hormones sexuelles est une manipulation facile à conduire. De plus, les régions cérébrales d’intérêt de notre étude possèdent la même structure chez le rat que chez l’humain. Les animaux seront utilisés au stade adulte, afin de travailler sur des neurones des aires cérébrales ciblées matures. Les procédures chirurgicales seront réalisées chez des animaux âgés de 10 semaines.
ETAP : Etude de tolérance et de transcriptomique chez le rat
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Gavés chaque jour pendant toute la durée de l'étude avec des molécules jamais testées auparavant dans leur espèce, 2 700 rats vont être utilisés sur trois ans, dont 450 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, 1 350 un niveau modéré et 900 un niveau léger. Le porteur énumère les signes de toxicité attendus : pertes de poids, salivation, convulsions, prostration, tremblements, variations de la mobilité et de l'agressivité. Il qualifie par ailleurs le gavage quotidien d'une simple "gêne légère lors de la contention". Tous les rats seront tués pour prélever les organes destinés aux analyses transcriptomiques, l'objectif immédiat étant de fixer la dose maximale tolérée avant des études plus longues.
Objectifs
Ce projet permet de fournir des informations sur les dangers pour la santé qui peuvent résulter d’une exposition à une substance d’essai par voie orale pendant une période courte. Il vise à mettre en application un type d’étude, recommandé par l’EPA (Agence de Protection Environnemental des Etats-Unis), qui a pour but d’évaluer le point de départ d’effet toxicologique via une approche Transcriptomique. La transcriptomique est la mesure à grande échelle des changements d’expression des gènes, son application à la toxicologie permet une caractérisation étendue des processus et voies biologiques qui peuvent être perturbés suite à une exposition à un produit chimique. Ce projet comprend un type d’études courtes, dénommées ETAP (pour EPA « Transcriptomic Assessment Products ») visant deux objectifs principaux : 1) L’évaluation de la dose maximale tolérée par les rongeurs. 2) L’identification de potentiel tissus cibles par une approche OMICs, et plus particulièrement transcriptomique, et la caractérisation de point de départ d’éventuels perturbations de l’homéostasie tissulaire. Ce projet vise à mettre en application cette recommandation. Ainsi, le projet est utilisé pour fournir des informations sur le potentiel toxique d’un produit au début de son développement, et dans une première phase de validation (preuve de concept) sur des produits de réferences ou des produits pour lesquels des données ont déjà été générées. Ces études de courtes durées permettent de cribler les molécules et d’arrêter le développement de molécules trop actives, évitant ainsi de les tester dans des études plus longues et plus demandeuses en animaux (réduction). De plus, elles permettent de mieux définir les doses qui pourront être utilisées dans des études sub-aigues et sub-chroniques requises par les autorités (raffinement).
Bénéfices attendus
Ces études conduites avec un nombre minimal d’animaux permettent de déterminer la dose maximale tolérée par le rongeur. Cette dose sera utilisée ultérieurement dans d’autres études plus longues ou comprenant plus d’animaux et doit générer des effets toxicologiques modérés. Ces études permettent également de déterminer et d’évaluer le potentiel toxique d’un composé pour chercher des effets ou constater l’absence d’effets toxiques, déterminer la concentration sans effet nocif observé, identifier des organes cibles et évaluer les changements biologiques provoqués par l'administration du produit, évaluer la concentration plasmatique du produit et de ses métabolites, et de certains biomarqueurs, évaluer le profil de bioaccumulation du produit dans certains organes, apporter des informations sur la sélection des doses pour les études ultérieures ainsi que de potentielles informations sur le mode d'action de la molécule. En outre, l’approche transcriptomique, permet l’identification de potentiels tissus cibles via la caractérisation de point de départ de perturbations de l’homéostasie tissulaire. Ce type d’étude très précoce permet de mettre en évidence le profil toxicologique du produit afin de pouvoir arrêter le développement de molécules qui pourraient présenter des alertes importantes et ainsi éviter des études plus longues avec plus d'animaux.
Procédures
Un gavage journalier sur animaux vigiles, se faisant en 15 secondes, tout au long de l'étude à l'aide de sondes souples adaptées à la taille et à l'âge des animaux. Des prélèvements sanguins réalisés en moins de 2 minutes par animal.
Impact sur les animaux
Les effets toxiques attendus sur les animaux peuvent être sévères car les molécules n’ont jamais été testées (en administration repétée) au préalable dans l’espèce, à l’âge et aux doses choisies. Les signes de toxicité pouvant apparaitre en cours d'étude incluent des pertes de poids, une diminution de la consommation de nourriture ou des signes cliniques de type augmentation de salivation, convulsion, prostration, augmentation ou diminution de la mobilité et de l'agressivité, tremblement ou impact sur la température corporelle. Les animauxsont soumis à des gavages journaliers à l'aide de sonde souple qui peuvent induire une gène légère lors de la contention. En cours d’étude, plusieurs échantillons de sang peuvent être prélevés au cours d’une période de 24h. Les prélèvements peuvent être faits via la veine caudale ou la veine saphène. Ces derniers peuvent induire une douleur légère et de petits hématomes qui disparaissent rapidement.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de collecter des organes destinés à être analysés en transcriptomique
Remplacement
Avant d’avoir recours aux études animales, de nombreux essais in vitro sont utilisés pour identifier/confirmer des mécanismes d’action (par exemple l'activation d'un récepteur, l'inhibition / activation de certaines enzymes clés). Mais ils ne peuvent prendre en compte l’intégralité des mécanismes conduisant ou pas à l’induction d’effets toxiques (par exemple, les changements histopathologiques dans les organes cibles), ni la gravité des effets induits par l'exposition au produit. En outre, certains paramètres ne peuvent pas être mesurés in vitro. Différents paramètres doivent donc être mesurés chez l’animal. Les études décrites dans ce projet servent à préparer la réalisation des études règlementaires indispensables à leur homologation. De même, pour comprendre le mode d'action d'une toxicité spécifique, un enchaînement d’évènements biologiques au niveau moléculaire et tissulaire doit être identifié et caractérisé.
Réduction
Ce projet pourra permettre à terme de réduire le nombre d'études de tolerabilité et de screening biocinétique, en couvrant les données de toxicité fournis par ces deux types d'études tout en fournissant des informations précoces complémentaires. Ces études se font dans le respect des 3Rs avec un nombre restreint d'animaux. Un total estimé de 900 rats pourra être utilisé chaque année, pour tester environ 15 molécules différentes pour un total de 2700 rats sur 3 années pour ce projet. Le nombre d'animaux est justifié par la recommandation de l'EPA, permettant une analyse statistique suffisante (par exemple signification inférieure à p≤5%). Les tests statistiques utilisés ont été définis par un statisticien interne ou par un consultant externe spécialisé et correspondent aux tests classiquement utilisés et acceptés en toxicologie.
Raffinement
Dans ces études, les animaux sont hébergés en groupe avec un enrichissement du milieu adapté à leur âge et leur espèce. Les animaux sont alimentés par une nourriture contrôlée et adaptée, les certificats concernant cette nourriture sont archivés par le laboratoire. Les animaux sont observés quotidiennement y compris les week-ends. Ils sont pesés à intervalle régulier pour vérifier leur croissance et leur bien-être. La consommation de nourriture peut également être mesurée à intervalle régulier. Toutes ces mesures sont réalisées par des techniciens confirmés qui suivent des périodes de reformation régulière. Des points limites ont été identifiés qui peuvent nécessiter la mise à mort précoce de l’animal qui sera demandée par le directeur d’étude. En cas de problème un vétérinaire est présent sur le site pour assurer un traitement. En cours d’étude si besoin des prélèvements sanguins seront réalisés en fonction des recommandations du NC3R National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research). A la fin de chaque étude, un résumé et une évaluation sur le bien-être animal sont réalisés par la structure du bien-être animal et le comité d’éthique et permet de mettre en place des actions correctives, si nécessaire, avant la fin du projet et son analyse rétrospective.
Choix des espèces
Les études sur les animaux décrites dans ce document ont été validées chez le rat (mâle et femelle). Cette espèce est utilisé par la suite dans les études demandées par les lignes directrices internationales. Il y a suffisamment de données pour indiquer que le rat est l’espèce la plus appropriée pour étudier les aspects abordés dans le projet actuel. Ces rongeurs sont les modèles expérimentaux choisis en raison de leur utilisation fréquente dans les études toxicologiques et de la disponibilité de souches suffisamment caractérisées. Ces caractéristiques permettent d'obtenir une grande quantité d'informations sur la physiologie et la pathologie de ces animaux. Jeunes adultes (de 6 à 12 semaines). Le guide de l’EPA recommandant que les animaux en début d’étude soient âgés de 8 à 10 semaines au démarrage du traitement.
Acquisitions des données in vivo pour le développement d’une plate-forme innovante d’enseignement de la physiologie expérimentale dans l’enseignement supérieur (LEARN « L3Rn »)
- Enseignement supérieur
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Un rat qui montre des signes de mal-être est retiré de l'étude, ce qui n'empêche pas sa réutilisation dans un autre projet. 108 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, aucun tué dans le cadre de ce projet, tous destinés ensuite soit à des expériences sur organes isolés, soit à des travaux pratiques et à la formation à la chirurgie. Ils subissent une à six anesthésies gazeuses pour être rasés des flancs, portent un gilet à capteurs enregistré jusqu'à vingt-quatre heures d'affilée sur une période allant jusqu'à six mois, sont parfois séparés visuellement et olfactivement de leurs congénères, et courent sur un tapis roulant jusqu'à trente minutes à 80 % de leur capacité, stimulés à la queue. Le porteur annonce que ces données serviront à construire des vidéos et une plateforme de simulation pour l'enseignement de la physiologie, et reconnaît qu'un risque de détresse cardio-respiratoire "ne peut être exclu" lors des anesthésies.
Objectifs
Bien que prenant en compte le contexte sociétal, l’enseignement de la physiologie à l’université continue d’inclure des animaux principalement en raison de l’absence de méthodes alternatives satisfaisantes. Les systèmes de simulation actuellement disponibles restent rares, rudimentaires, peu évolutifs et restreints à des conditions basiques. Ce projet vise à acquérir de façon non-invasive des données physiologiques de la fonction cardio-respiratoire, de la mobilité et des vocalisations chez le rat pour construire un ensemble de supports d’enseignement incluant des vidéos de démonstrations et une plate-forme digitale permettant de simuler différentes conditions en lien avec la vie quotidienne. Cela permettra à terme de réduire au maximum l’utilisation d’animaux en enseignement à l’université et d’envisager son remplacement dans certaines filières où l’acquisition de gestes pratiques n’est pas nécessairement obligatoire.
Bénéfices attendus
De tels outils pédagogiques permettront d’envisager à terme un remplacement de l’utilisation d’animaux pour les filières générales et une réduction significative de leur nombre et un raffinement des procédures pour les formations professionnalisantes.
Procédures
Les animaux seront soumis à une à six anesthésies générales volatiles durant quelques minutes en vue d’être rasés sur les flancs. Par la suite ils seront habillés avec un gilet contenant des capteurs physiologiques ; les enregistrements parfois quotidiens, pourront durer jusqu'à 24h pour une période allant jusqu'à 6 mois. Les rats seront observés en condition de vie quotidienne ou suivront un protocole d’exercice physique. Certains rats seront hébergés individuellement sans pour autant être isolés socialement (isolement visuel et olfactif), cet isolement des congénaires n'exédant pas 24h. D'autres rats seront contraints à une course sur tapis roulant n'exédant pas 30 minutes à maximum 80 % de leur capacité physique. Ils y seront encouragés par stimulation physique non douloureuse.
Impact sur les animaux
L'ensembre des rats subira des contraintes de niveau léger : notament trois brèves anesthésies générales volatiles pendant laquelle le risque de détresse cardio-respiratoire ne peut être exclu. Certains rats peuvent ne jamais s’adapter au protocole : port du gilet et surtout course contrainte. Ceci engendrerait un mal être et une prostration.
Devenir
L’ensemble des procédures du projet permet d’envisager la réutilisation totale des animaux. A ce jour, deux types de réutilisation sont envisagées : soit une réutilisation pour la réalisation d’experience sur organes isolés, soit une réutilisation en enseignement universitaire (Formation à la chirurgie, TP de licence professionnelle).
Remplacement
Ce projet n’offre pas une alternative complète à l’utilisation d’animaux puisqu’il nécessite l’utilisation des animaux vigiles pour la production initiale des données et la création de la base. En revanche il contribue de façon significative à chacun des 3R puisque les résultats du projet permettront d’envisager la réduction du nombre d’animaux utilisé en formation et en enseignement, de remplacer l’utilisation d’animaux en enseignement dans certaines filières générale et d’envisager le raffinement des procédures expérimentales par un suivi de paramètres physiologiques de façon non-invasive. C’est sur ces éléments que les acteurs du projet axeront leur communication (communication dans des conférences sur le bien- être animal) auprès de tous les acteurs du domaine.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été réduit au minimum afin de permettre d’avoir un nombre suffisant d’animaux pour obtenir des statistiques descriptives (moyenne, écart-type,) pour chacune des conditions expérimentales et a été fixé à 5 à 24 rats par sexe. S'agissant d'études physiologiques et comportementales, l’effet du sexe et de l'âge doit être pris en compte. Le nombre d'animaux permettra de réaliser les supports didactiques à utiliser en TP ou en formation professionnelle. Un nombre minimal (inferieur à 5) sera utilisé pour la mise au point du dispositif de suivi et la finalisation des réglages techniques.
Raffinement
A leur réception, les rats bénéficieront d'une semaine d'acclimatation. Le milieu de vie de chaque rat sera enrichi le plus possible suivant les protocoles de la SBEA. La tonte des flancs est systématiquement réalisée sous brève anesthésie générale volatile. Les rats bénéficieront tous d'une phase individualisée d'acclimatation/habituation au port du gilet et aux phases d'enregistrement. L’utilisation de la technologie de télémétrie consistant en un dispositif radio non invasif maintenu dans un gilet ergonomique porté par l'animal, permet une surveillance combinée de l'activité cardiaque, de la fonction respiratoire et de l'activité locomotrice au cours de l’exercice physique. Ce dispositif couplé aux enregistrement vidéo et audio permet l'acquisition des données sans contrainte supplémentaire pour l'animal. Les séances d'exercice physique (course sur un tapis roulant) nécessitent le recours à une stimulations physique non douloureuse au niveau de la queue des animaux. Dans tous les cas, nous veillerons à ce que les exercices soient réalisés avec le moins de stimulations possibles. Si l’objectif d’apprentissage de la 1ère semaine n’est pas atteint, l’animal ne suivra pas la seconde semaine de conditionnement, il sera retiré du projet mais pourra être réutilisé dans d’autres projets. Tout signe de mal être d’un animal conduira à son retrait de l’étude, et ce même pendant la période initiale de stabulation.
Choix des espèces
L’espèce choisie est le rat adulte, qui constitue le modèle le plus utilisé en enseignement de la physiologie experimentale à l’université et qui présente une taille compatible avec le dispositif de suivi de la fonction cardio-respiratoire utilisé dans ce projet. Nous utiliserons des rats adultes d’un poids corporel de 250 à 450g (c’est-à-dire entre 8 et 24 semaines). Les animaux compris dans cette gamme de poids sont les plus utilisés dans le domaine cardiorespiratoire et en adéquation avec la taille de la version actuelle du dispositif. De plus, l’utilisation d’animaux de poids différents permet de valider la continuité des mesures même lors du changement de gilet lié à la taille des animaux.
Formation aux techniques de transgénèses et de cryoconservation chez le rat et la souris
- Formation professionnelle
Rats : 500
Quatre injections dans la même journée pour une rate, dont trois sous contention, avant une chirurgie de transfert d'embryons de cinq minutes. 500 souris et 500 rats vont être utilisés ainsi, 700 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 300 un niveau modéré, 900 tués à l'issue et 100 remis "dans le stock" pour être réutilisés. Ces gestes servent à former des techniciens, ingénieurs, chercheurs et étudiants aux techniques de transgenèse et de cryoconservation, à raison de cinq sessions par an pendant cinq ans. Les femelles donneuses d'ovocytes sont prépubères, trois à quatre semaines pour les souris et cinq à six pour les rates, parce qu'elles "répondent mieux aux traitements hormonaux", et les femelles opérées sont tuées faute de pouvoir être réutilisées.
Objectifs
Notre institut a pour mission de créer des lignées de rats et de souris génétiquement modifiées et de les cryoconserver pour permettre leur pérennité et leur distribution aux chercheurs. Ces lignées génétiquement modifiées peuvent devenir des modèles de maladies humaines et vont permettre de mieux comprendre leurs processus de développement. Ces modèles peuvent également répondre à d’autres intérêts scientifiques tout aussi importants (comme par exemple devenir des modèles de choix pour la recherche fondamentale). Ces rongeurs, en tant que modèle de maladies humaines, vont également permettre de tester des médicaments et de valider (ou d’invalider) des cibles thérapeutiques. Notre objectif ici, est de former les gens de la communauté scientifiques aux activités expérimentales de transgénèses et de cryoconservation sur les rats et les souris, dans les conditions optimales. Ces formations pratiques sont destinées aux techniciens, ingénieurs, chercheurs et étudiants de l'institut ou d'un centre partenaire. Notre établissement envisage de réaliser 5 formations maximum par an, soit environ 100 rats et 100 souris par an sur 5 ans. Le nombre d'animaux utilisés dépend directement du type de formation souhaitée. Pour certaines techniques, une vingtaine d'animaux seront nécessaires et pour d'autres seulement 5. Ces formations pratiques auront lieu sur demande directe des collaborateurs pour la technique souhaitée parmi celles proposées.
Bénéfices attendus
Etant un institut pilote et certifié pour nos activités, nous souhaitons transmettre nos savoir-faire et connaissances en transgénèse et cryoconservation sur nos modèles animaux, partager nos expériences et aussi permettre par la formation d'améliorer le bien-être animal et le raffinement des techniques qui seront mise en œuvre par d'autres membres de la communauté scientifique sur ce sujet. Ces formations sont destinées aux techniciens, ingénieurs, chercheurs et étudiants.
Procédures
1) Dans la première procédure, il s'agit de 2 injections d'hormones réalisées à 48h d'intervalle. Les injections sont réalisées sous simple contention rapide de 5 secondes, puis l'animal est relaché dans sa cage avec ses congénères. 2) Dans la seconde procédure, les rates seulement recevront une injection, sous simple contention rapide de 5 secondes, afin de synchroniser leur cycle pour devenir mères porteuses. 4 jours plus tard, les animaux recevrons une injection d'antidouleur sous simple contention rapide de 5 secondes, puis 40 minutes plus tard, ils seront anesthésiés par une autre injection, là encore sous simple contention rapide de 5 secondes. Une fois endormis, les animaux vont subir une petite chirugie de transfert d'embryons ou de sperme. La chirurgie dure environ 5 minutes. Juste après la chirugie, pendant que les animaux dorment encore, afin de limiter le stress, elles recevront un réhydratant et un anti-infammatoire en injectable. Ainsi, une rate recevra un total de 3 injections en contention rapide et une dernière lorsqu'elle sera endormie. Donc 3 injections au cours de la journée d'anesthésie/chirurgie et 4 injections au total. Pour la souris, elle recevra 2 injections en contention rapide et une dernière lorsqu'elle sera endormie. Donc 3 injections au cours de la journée d'anesthésie/chirurgie au total. Les injections et chirurgies sont pratiquées ou encadrées par du personnel compétent et donc présentent un risque très limité pour l'animal.
Impact sur les animaux
Les injections (hormones diverses, anesthésique ou antalgique) sont réalisées sous contention rapide qui peut engendrer une légère douleur et un stress de courte durée. La chirurgie, d'une durée de 10 minutes maximum va engendrer une plaie chirurgicale qui pourra être à l'origine d'une douleur ou un inconfort temporaire pour l'animal. La prise en charge de la douleur va fortement limiter ces nuisances.
Devenir
Dans le première partie, il s'agit de femelles donneuses d'ovocytes ou d'embryons. Nous avons besoin de les mettre à mort pour collecter les ovocytes / embryons pour réaliser nos expérimentations dans le cadre de la formation. Les souris n'ayant pas été accouplées peuvent être réutilisées. Ceci vise à réduire le nombre d'animaux utilisés. De même, dans la seconde procédure, les animaux non utilisés en chirurgie sont remis dans le stock pour être réutilisés. Les femelles opérées seront mises à mort car nous ne pouvons pas les réutiliser.
Remplacement
Les rongeurs, principalement les rats et les souris représentent près de 90% des animaux utilisées en expérimentation animale. Ce sont de très bons modèles expérimentaux puisqu'ils possèdent une très forte homologie avec les gènes Humains et ont un taux de reproduction rapide . Il n'y a pas d’autre possibilité que le recours à l’animal vivant pour la formation à la création de lignées transgéniques et leur cryoconservation.
Réduction
L'objectif de cette saisine est de nous permettre de former les personnes désireuses de le faire aux techniques expérimentales de transgénèses et de cryoconservations chez le rat et la souris. Dans ce projet, ne seront commandés dans des établissements éleveurs que les animaux que nous n'avons pas en stock pour les besoins de la formation. Il ne sera pas acheté de mâles spécifiquement pour les besoins de formation, nous nous servirons des animaux utilisés pour nos activités de service. Les femelles seront au maximum des animaux recyclés au sein de notre animalerie. Il n'y aura que peu de commandes spécialement dédiées aux formations. Notre établissement envisage de réaliser 3 formations par an, soit environ 100 rats et 100 souris par an (soit au maximum 1.000 animaux sur la durée du projet). Le nombre d'animaux utilisés dépend directement du type de formation souhaitée (de 5 à 20 animaux). Nous n'aurons pas d'approche statistique dans cette étude car c'est un projet à visé de formation.
Raffinement
Nous souhaitons transmettre nos savoir-faire et connaissances, partager nos expériences et aussi permettre par la formation d'améliorer le bien-être animal et le raffinement des techniques qui seront mise en oeuvre par d'autres membres de la communauté scientifique sur ce sujet. La petite chirurgie s'effectue sous anesthésie et analgésie avec une compensation de la potentielle perte hydrique pour les aider à récupérer au mieux. Du gel oculaire sera placé sur les yeux des animaux anesthésiés afin de prévenir tout dommage de la cornée. Nous serons particulièrement vigilants sur la surveillance des points d'injections, l'aseptie pour la partie chirurgicale et la surveillance post opératoire des animaux pour déceler tout signe d'inconfort (prostration, dos voûté, difficultés locomotrices, expressions faciales) ou d'infection (rougeur, gonflement, supuration). Puisqu'il s'agit de formation, les animaux inconfortables seront mis à mort immédiatement pour éviter toute souffrance inutile. Les animaux sont surveillés quotidiennement à l'animalerie. De l'enrichissment sera placé dans les cages pour leur bien-être.
Choix des espèces
Les rongeurs sont de petits mammifères à reproduction rapide qui sont très largement utilisés par la communauté scientifique. Ce sont de très bons modèles expérimentaux puisqu'ils possèdent une très forte homologie avec les gènes Humains. Les rats et les souris sont utilisés dans notre laboratoire en routine pour la création et l'archivage de lignées. Les mâles proviendront tous de nos activité de service, et ne seront pas achetés spécialement pour les formations. - Les mâles vasectomisés sont utilisés à l’âge de jeunes adultes à adultes(10 semaines à 1 an) et renouvelés tous les 9 mois (souris) et 12 mois (rats). - Les mâles fertiles sont de jeunes adultes en âge de procréer (10 semaines à 1 an) pour fournir du sperme ou être mis en accouplement pour fournir des embryons à différents stades. - Les femelles utilisées pour produire les embryons/ovocytes sont prépubères (3-4 semaines pour les souris et 5-6 semaines pour les rats) car elles répondent mieux aux traitement hormonaux. (réduit le nombre de femelles donneuses utilisées) - Les mères-porteuses utilisées sont de jeunes adultes à adultes (10 semaines à 8 mois), elles doivent être en âge de procréer.
Caracterisation de la contribution efficace des cellules souches au processus de reparation musculaire dans un contexte de dystrophie.
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Une lésion musculaire est provoquée chez 240 rats porteurs d'une dystrophie, par injection intramusculaire ou rétro-orbitaire sous sédation puis anesthésie gazeuse. Ils reçoivent ensuite un antidouleur deux fois par jour pendant au moins deux jours, certains des injections intrapéritonéales deux fois par jour pendant trois à six jours, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et tous sont tués entre six et huit mois pour que leurs muscles soient prélevés. L'objet est de comparer les cellules souches des muscles qui bougent les yeux, épargnés par la maladie, et celles des muscles des membres, qui se détériorent. Le porteur affirme que jusqu'à six mois aucune entrave majeure à une qualité de vie autonome n'a été constatée, après avoir décrit une douleur inflammatoire modérée qui exige un morphinique.
Objectifs
Les dystrophies musculaires sont des myopathies génétiques rares qui touchent principalement les muscles et le cœur. Certaines dystrophies sont causées par des changements dans le gène codant pour la dystrophine (porté par le chromosome X), générant la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD), que touche surtout les garçons. Chez les patients, la production anormalement faible ou absente de dystrophine induit une détérioration progressive des muscles, provoquant une faiblesse musculaire. La forme la plus sévère (absence de dystrophine) apparaît dès l'enfance et entraîne un déclin progressif de la mobilité et du fonctionnement cardiaque, fatale de façon prématurée. Pour autant, les muscles qui contrôlent le mouvement des yeux conservent leur capacité de régénération, contrairement aux muscles des membres. Ce projet vise ainsi à comparer le comportement des cellules souches musculaires, responsables de la réparation du muscle, entre ces deux types de muscles. L’objectif est d’identifier les facteurs clés permettant le maintien de la capacité régénérative des cellules souches épargnées par le vieillissement précoce, ce qui permettrait d'ouvrir une nouvelle piste de traitement pour traiter l'ensemble des myopathies dystrophiques.
Bénéfices attendus
Nous comptons identifier les mécanismes protecteurs du vieillissement précoce des cellules souches. Avec ce projet, nous comptons in fine identifier de nouvelles molécules pour moduler les mécanismes identifiés en vue d'empêcher ou de retarder le vieillissement précoce des cellules souches musculaires dans certaines maladies et ainsi, favoriser la réparation musculaire par le maintien des capacités régénératives des cellules souches.
Procédures
Dans ce projet, tous les animaux seront sédatés une fois par injection sous-cutanée puis anesthésiés par inhalation de gaz. Une injection sera réalisée par voie intramusculaire ou rétro-orbitaire. Les animaux seront injectés 2 fois par jour avec un traitement anti-douleur par voie sous-cutanée pendant un minimum de 2 jours. Certains recevront des injections intrapéritonéales 2 fois par jour pendant 3 ou 6 jours.
Impact sur les animaux
L'expérience de réparation musculaire induite qui constitue la base de ce projet cause une douleur modérée d’origine inflammatoire que l'on peut efficacement contrer avec une un antalgique puissant ou un morphinique qui sera systématiquement administrée aux animaux. Les animaux seront mis à mort entre l’âge de 6 à 8 mois. Jusqu’à 6 mois, aucune entrave majeure à une qualité de vie autonome en animalerie confinée n’a été constatée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires.
Remplacement
Nous avons déjà réalisé tous les essais approfondis sur les cellules souches musculaires en culture. Ces expériences in vitro ne peuvent pas reproduire toutes les interactions et réponses cellulaires observées de façon chronologique dans un organisme vivant. Ainsi, la validation chez l'animal est maintenant indispensable pour évaluer de manière complète et précise les mécanismes de coopération entre les cellules dans la réparation musculaire et dans un contexte physiologique qui respecte la complexité des contributions nerveuses et endocrines.
Réduction
De nombreuses données ont été cumulées sur les modèles animaux utilisés dans ce projet. Nous avons optimisé la correction des données avant analyse statistique et le calcul de puissance statistique nous recommande d'utiliser 8 animaux par groupe. Ce nombre a été validé avec d’autres projets similaires terminés pour lesquels nous avons pu conclure qu'il était suffisant et approprié pour conclure de façon non ambiguë.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des pièces avec contrôle continu de la température et de l'humidité de l'air ambiant. Le cycle d'éclairage des pièces respecte une alternance jour/nuit fondée sur les besoins naturels des animaux. Nous avons choisi de les élever dans les plus grandes cages disponibles sur le marché, leur permettant de marcher et de se dresser sur leurs pattes arrière. Cet exercice spontané quotidien est adapté à l'évaluation de leur capacité locomotrice. Dans les cages, les animaux ont un accès libre à la nourriture et à l'eau fournies à volonté. Nos animaux sont sociaux. Aussi, nous les hébergeons avec des congénères dans la même cage. Leur environnement est par ailleurs enrichi avec des lanières de papier Kraft, des bâtons en bois à ronger, des balles, des tunnels et des carrés de coton compacté. Pour éviter toute réponse de stress, les animaux sont habitués dès leur arrivée à être manipulés régulièrement, de la manière la plus douce possible. Le suivi des animaux est assuré par un personnel capable de reconnaître, quantifier, atténuer ou supprimer les signes de douleur chez les animaux. Nous avons établi une grille d'évaluation de la douleur, avec des points limites définis et affichés dans les pièces d'hébergement. Les animaux sont constamment évalués en observant chaque individu, 7 jours sur 7. En cas d'anomalie, des mesures correctives sont prises. En cas d'absence de bénéfice suite au traitement prescrit, nous pratiquons une mise à mort compassionnelle. Elle permet d'éviter toute souffrance à l'animal. La survenue d'une éventuelle douleur modérée chez l'animal est anticipée et prévenue par l'administration préalable de molécules anti-douleur très efficaces sur ce type de procédures. Les molécules utilisées dans ce projet sont toutes des médicaments pour lesquels les risques de toxicité sont faibles, connus et anticipables.
Choix des espèces
Nos animaux appartiennent à une espèce de mammifère évolutivement proche de l'humain, ce qui en fait un modèle apprécié pour la recherche. Grâce aux récents outils de modification du génome, cette espèce est devenue un choix privilégié pour l'étude des troubles musculosquelettiques. Nos modèles reproduisent fidèlement les myopathies humaines et sont appréciés en recherche médicale. Les animaux seront âgés de 6 à 8 mois, ce qui correspond au stade où la maladie progresse le plus et les muscles sont de plus en plus impactés, fonctionnellement et morphologiquement.
Evaluation chez le rongeur, de la biodistribution de composés chimiques ou biologiques par des méthodes froides ou radioactives
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Rats : 12500
Hamsters dorés : 300
Gerbilles de Mongolie : 200
Administrations par voie intranasale, intratrachéale, intramusculaire, intradermique, intracérébrale, intravésicale ou par minipompe posée chirurgicalement, jeûnes pouvant durer seize heures, phase expérimentale allant jusqu'à douze mois : 25 500 rongeurs vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. L'effectif se répartit entre 12 500 souris, 12 500 rats, 300 hamsters dorés et 200 gerbilles de Mongolie, pour une prestation de mesure de la biodistribution de composés chimiques ou biologiques, parfois radiomarqués. La plupart seront tués pour récupérer les organes et de grands volumes de sang, 10 400 pouvant être gardés vivants et réutilisés s'ils sont restés moins d'une semaine en procédure après une administration unique. Le porteur écrit qu'un phénotype dommageable "n'affectera pas le bien-être animal", tout en précisant dans la même phrase que les animaux concernés pourraient boire davantage ou devenir obèses.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer in vivo l’absorption, la distribution, la métabolisation et l’excrétion de composés biologiques ou chimiques après une ou plusieurs administrations chez le rongeur. Les paramètres de distribution et d’excrétion des composés seront si possible déterminés préalablement in vitro, ce qui conditionnera le choix de l’espèce rongeur (souris, rat, hamster, gerbille) et de la souche à utiliser pour évaluer la biodistribution in vivo dans le sang, les urines, et les différents organes. Dans certains cas, il sera possible d’avoir recours à une forme radiomarquée des composés afin de faciliter leur dosage et l’identification de leur distribution. Ce projet permettra d’une part de révéler la pharmacocinétique des composés testés in vivo, par administration unique ou répétée (dans le respect des recommandations vétérinaires concernant les voies, volumes et fréquences) de la molécule froide. Une seconde partie du projet aura recours à la forme radiomarquée de la molécule. Dans certains cas, les administrations nécessiteront une pose chirurgicale d’implant (de diffusion prolongée sous cutanée, intraveineuse ou intrapéritonéale). Ces chirurgies seront réalisées stérilement, sous anesthésie avec analgésie couvrant toute la durée de la chirurgie et dans le respect des recommandations de la SBEA. Des prélèvements divers (sang, urines, fèces, liquide cérébro spinal etc., dans le respect des recommandations vétérinaires) pourront être effectués in vivo afin de doser le composé dans ces fluides, ou des paramètres métaboliques (insulinémie, glycémie) et des prélèvements d’organes pourront avoir lieu, exclusivement post mortem. Dans le cas de l’insulinémie et de la glycémie ou d’autres paramètres métaboliques, une injection de glucose en IP ou SC ou une administration PO pourront être réalisées au préalable des prélèvements sanguins.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer la pharmacocinétique in vivo de composés biologiques ou chimiques après une ou plusieurs administrations chez le rongeur, sur une période allant de 1 jour à 12 mois. Cette évaluation est critique afin de pouvoir ensuite réaliser des études d’efficacité.
Procédures
Des composés chimiques ou biologiques froids ou radiomarqués peuvent être administrés aux animaux par toutes les voies possibles : intranasale et intratrachéale, sous anesthésie générale d’environ une heure; intramusculaire, intradermique et intracérébrale sous anesthésie générale d’environ une heure avec analgésie; orale sur animaux vigiles (acte bref d’une minute environ); sous cutanée et intrapéritonéale sur animal anesthésié ou vigile (acte bref d’une minute sur animal vigile, anesthésie d’environ une heure sinon); injection intraportale ou par minipompe (intraveineuse, sous cutanée ou intrapéritonéale) posée lors d’une chirurgie sous anesthésie générale avec analgésie au préalable (chirurgie d’environ 15 minutes, anesthésie d’environ une heure). Les implants pourront être retirés au plus tôt une semaine plus tard (chirurgie d’environ 15 minutes, anesthésie d’environ une heure). Des administrations intravésicales (par cystocentèse ou cathéter) pourront être réalisées (anesthésie générale de moins d’une heure) après privation d’eau sur maximum 4h et vidange de la vessie par pression légère sur le ventre. Pour les administrations orales et oro-gastriques où l’alimentation pourrait biaiser la pharmacocinétique, les animaux pourront être mis à jeun au maximum 16h. Ils seront pesés avant et après le jeûne. Les volumes administrés et les fréquences d’administration respecteront les recommandations de la SBEA. La phase in vivo pourra durer jusqu’à 12 mois dans le cas de composés froids et 2 mois pour les composés radiomarqués. Des prélèvements de sang ou d’urine pourront être réalisés. Les prélèvements de sang sur animal vigile prendront environ deux minutes. En cas d’anesthésie, celle-ci durera au maximum une heure. Pour les prélèvements individuels d’urine et/ou de fèces, il pourra être nécessaire d’héberger individuellement les animaux en cages, sans enrichissement. En fin de projet, la plupart des animaux seront euthanasiés pour récupération des tissus, organes, et du sang. Avant euthanasie, sous anesthésie générale profonde avec analgésie, une perfusion pourra être réalisée pour rincer les organes. Cela durera moins d’une heure avant euthanasie. Dans le cas particulier d’animaux ayant subi une administration unique de produit non radioactif et ayant été gardés en procédure au maximum une semaine, ils pourront être gardés en vie sur avis du vétérinaire.
Impact sur les animaux
Dans le cas de phénotypes dommageables, celui-ci n’affectera pas le bien-être animal, bien que les animaux pourraient boire plus d’eau et/ou être obèses. Il ne peut toutefois pas être exclu que les composés administrés causent de la toxicité (diarrhée, perte de poids, douleur, signes neurologiques), ce qui sera surveillée. Une douleur transitoire modérée pourrait être générée par les chirurgies. Un stress de courte durée et une douleur légère sera générée par les administrations de produit. Les mises à jeun pourraient générer un stress léger et une déshydratation légère.
Devenir
Les animaux seront la plupart du temps mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de grands volumes de sang, nécessaires pour évaluer l’effet des composés testés. Les animaux ayant reçu une administration unique de composé non radioactif et étant restés en procédure moins d’une semaine pourront être gardés en vie pour réutilisation.
Remplacement
Les molécules chimiques ou biologiques dont la pharmacocinétique sera évaluée dans ce projet auront été si possible au préalable sélectionnées dans des tests in vitro (tests sur hépatocytes, microsomes etc) afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. Ces données sont souvent insuffisantes pour prédire la biodistribution in vivo des molécules. La pharmacocinétique réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée chez le rongeur en choisissant le modèle animal.
Réduction
Le nombre d’animaux par lot a été déterminé sur la base des expériences passées dans notre centre, pour choisir le nombre minimum permettant d’obtenir une puissance statistique suffisante pour conclure. Dans le cas de prélèvements terminaux à différents points de temps (collecte d’organes/tissus, ex collecte de peau à plusieurs points de temps), un groupe d’animaux devra être inclus pour chaque point de temps. Dans le cas de screening de nouvelles molécules, au maximum 5 animaux par groupes seront inclus. Le nombre sera adapté en fonction de la variabilité attendue de la pharmacocinétique du composé. Dans le cas où la bioanalyse suite aux prélèvements nécessiterait un volume trop important de fluides, le nombre d’animaux devra être augmenté, jusqu’à au maximum 15 animaux. Des analyses statistiques seront réalisées sur les paramètres mesurés.
Raffinement
Les animaux seront pesés au minimum 2 fois par semaine : A partir de 10% de perte du poids, les animaux seront pesés quotidiennement des capsules d’eau gélifiées seront mises à disposition dans les cages. De plus, les animaux seront réhydratés une fois par jour avec avec du Ringer Lactate. Une perte de poids de plus de 15% ou se maintenant plus de 3 jours au-delà de 10% constituera un point limite. En cas de suspicion de toxicité du composé chimique ou biologique administré, un arbre décisionnel validé par la SBEA sera utilisé pour décider de l’arrêt du traitement, de traitements de support et/ou de l’euthanasie de l’animal. Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance, les expérimentateurs seront formés pour reconnaître ces signes. Les poses et retraits d’implants seront réalisées sous anesthésie générale avec analgésie pré-, per- et post-opératoire. Il ne sera possible de réaliser qu’une pose et un retrait dans la vie de l’animal. Les voies intracérébrale, intrathécale et intraportale ne pourront être réalisées que maximum une fois dans la vie de l’animal. Les voies chirurgicales et poses et retraits d’implants seront réalisés par du personnel extensivement formé à la technique. Les implants (pose et retrait) ne pourront pas être combinés avec d’autres administrations nécessitant une chirurgie. A la suite de chirurgies, les animaux seront suivis quotidiennement le temps de la cicatrisation de la plaie, des soins locaux seront apportés si nécessaire. La fréquence de changement des litières sera augmentée si nécessaire et de la nourriture sera placée en fond de cage pour faciliter l’alimentation. Le comportement des animaux sera surveillé pour évaluer la nécessité de mettre en place une collerette. Les administrations IM et ID seront réalisées après administration d’un analgésique. Les administrations oro-gastriques via un dispositif de gélules ne pourront être réalisées uniquement sur des rats de plus de 150g et les animaux devront être anesthésiés. Ces administrations pourront être pratiquées à une fréquence maximale d’une fois par jour avec le matériel adapté à la taille de l’animal. De plus, un lubrifiant inerte devra être utilisé afin de faciliter le passage de la canule dans l’œsophage. Les variations de poids seront enregistrées quotidiennement à la suite des administrations oro-gastriques. Les perfusions IV de plus de 15 minutes et de 30 minutes maximum devront être réalisées sur des animaux anesthésiés.
Choix des espèces
Si le profil pharmacocinétique in vitro est adéquat dans cette espèce, la souris sera privilégiée pour évaluer la pharmacocinétique des nouveaux composés in vivo, car c’est l’espèce mammifère la plus décrite dans les modèles d’évaluation de molécules chimiques ou biologiques. La souris sera aussi préférée dans le cas d’une administration d’un composé ou d’un traceur radioactif, si le mécanisme d’action de la molécule le permet, pour des raisons pratiques de gestion de la radioactivité et de ses déchets. Pour certaines études pré-réglementaires comme l’étude de l’élimination d’un composé radiomarqué in vivo, le rat sera l’espèce préférée. Des hamsters et des gerbilles pourront être occasionnellement utilisés si besoin, en cas d’études préalables à la mise en place d’un modèle particulier bien décrit dans ces espèces (exemple : hamster pour une étude préalable à une étude d’infection au SARS-CoV2). Seuls des animaux sevrés seront utilisés (jeunes adultes et adultes, 6 semaines minimum), tel que référencé dans la littérature.
Etude exploratoire de l’effet préventif d’un apport oral quotidien en extrait d’olivier pendant trois semaines sur le désentraînement physique chez le rat.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Prévenir le surpoids des animaux de compagnie en valorisant un déchet de l'industrie oléicole : c'est la finalité annoncée pour laquelle 24 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Ils courent trente minutes par jour, cinq jours par semaine, pendant trois à cinq semaines, reçoivent vingt et une administrations orales d'extrait de feuilles d'olivier, subissent deux tests d'effort maximal que le porteur classe lui-même en gravité sévère, trois passages de quarante minutes en enceinte hermétique et une série de sept prélèvements sanguins rapprochés sous anesthésie. Le porteur note que les modèles de sédentarisation décrits dans la littérature "impactent le bien-être" des animaux non-humains, et propose le désentraînement physique comme protocole de substitution. Il décrit par ailleurs le rat comme un animal "doué et intelligent" pouvant être conditionné à l'activité physique, et retient cette espèce pour la taille de ses vaisseaux et la quantité de sang qu'elle permet de prélever.
Objectifs
En dehors d’une activité physique régulière et d’une régulation de la consommation alimentaire, l’utilisation de composés naturels à base de plantes a émergé comme une approche prometteuse pour la prévention du surpoids chez les animaux de compagnie. L’extrait de feuilles d'olivier (OE), considéré comme un déchet de l’industrie oléicole, contient une combinaison naturelle de composés très intéressante. Chaque composé pris indépendamment possèdent des propriétés bénéfiques pour la santé et limite la croissance du tissu adipeux. Ces effets bénéfiques ont été démontrés in vitro, in vivo chez l’animal et chez l’homme. Cependant les avantages de cette combinaison naturelle de composés dans l’OE n’est pas complètement explorée, en particulier au niveau vasculaire. En effet, ces composés pourraient avoir un effet bénéfique en agissant sur la vasomotricité vasculaire (capacité d’un vaisseau sanguin à se dilater et à se relâcher spontanément), dont le dysfonctionnement est fortement associé à des facteurs de risques tels que la sédentarité et le surpoids/obésité. Cercle vicieux, la sédentarisation, induite par la forte proximité avec l’humain, peut entraîner une prise de poids chez les animaux de compagnie et générer une dysfonction vasculaire. Les modèles de sédentarisation proposés dans la littérature chez les animaux impactent leur bien-être. Comme les mécanismes physiopathologiques de la sédentarisation s’apparentent aux mécanismes du désentraînement physique, nous souhaitons : 1 - valider un modèle de désentraînement physique chez le rat, permettant d’évaluer les altérations physiologiques qui apparaissent au niveau vasculaire, musculaire et inflammatoire. 2- si ce modèle est validé, évaluer la capacité de l’OE à limiter les altérations physiologiques du désentraînement en prévention primaire.
Bénéfices attendus
Tous les résultats obtenus au cours de cette procédure contribueront à une meilleure compréhension des mécanismes physiologiques au niveau vasculaire et musculaire lors d’un désentraînement physique. Ce désentraînement à un lien direct avec la sédentarité, facteur de risque du surpoids. Nous souhaitons également mieux comprendre l’impact d’une supplémentation en un extrait de feuille d’olivier riche en composés naturels sur ce modèle. À terme, l'objectif final serait de proposer une stratégie de prévention primaire reposant sur l'extrait d'olivier, suffisamment efficace pour réduire l'inflammation systémique et les altérations des vaisseaux sanguins afin de transposer cette stratégie chez d'autres animaux.
Procédures
Les 24 rats subiront : - une supplémentation orale en vigile à l’aide d’une micropipette pendant 3 semaines (21 supplémentations), durée de la supplémentation : 1 minute. -un prélèvement de sang, à jeun, trois fois, à 3 puis 2 semaines d’intervalle sous anesthésie, d’une durée de 6 minutes. -un prélèvement de sang, à jeun, une fois avant la procédure terminale sous anesthésie, d’une durée de 6 minutes. -7 prélèvements de sang espacés de 5 fois 15 minutes et deux fois 30 minutes, une seule fois à l’âge de 11 semaines, sous anesthésie. - deux anesthésies espacées de 2 semaines pour réaliser une échographie, méthode non invasive d’imagerie vasculaire, d’une durée de 1 heure. - trois mesures de dépense énergétique dans une enceinte hermétique permettant de mesurer les échanges gazeux, tous les 15 jours, d’une durée de 40 minutes. - deux mesures de leur capacité maximale aérobie (VO2 max) à 6 et 11 semaines, d’une durée de maximum 20 minutes chacune. -une course quotidienne pendant 3 ou 5 semaines (en fonction des groupes) d’une durée de 30 minutes à une intensité modérée.
Impact sur les animaux
Au cours de cette procédure, plusieurs effets indésirables peuvent être notés. - le stress lié à la manipulation quotidienne : acte de gravité légère, tous les jours, pendant 5 semaines consécutives. - l’angoisse liée directement au temps d’endormissement lors de l'anesthésie de l’échographie : durée de 2 à 4 min d’intensité légère. - le stress lié à la contention lors de l’anesthésie pour permettre la réalisation des prélèvements sanguins à jeun : acte de gravité légère, 3 fois sur l’ensemble du projet aux âges de 7, 10 et 12 semaines, durée estimée de 6 minutes. - le stress lié à la contention et aux prélèvements sanguins sous anesthésie pour réaliser le test oral d’hyperglycémie provoquée : 7 prélèvements de sang de 0.2ml maximum espacés de 15 à 30 minutes et d’une durée de 1 minute chacun. Acte de gravité légère. - le stress lié à la mesure de la dépense énergétique de repos dans un milieu confiné : acte de gravité légère, durée maximale de 40 minutes. - le stress lié au test d’évaluation des capacités maximales du rat (VO2 max) : acte de gravité sévère, durée entre 5 et 20 minutes en fonction des capacités maximales des individus. Ce test est réalisé 2 fois dans le projet avec un repos de 4 semaines entre les tests. - le stress lié à la course journalière sur le tapis de course : acte de gravité modérée, durée 30 min par jour, 5 fois par semaine, pendant 3 à 5 semaines consécutives en fonction des groupes. -le stress lié à la contention pour l’anesthésie avant la mise à mort.
Devenir
Nous devons travailler sur des prélèvements d’organes et c’est la raison pour laquelle, à l’issue de notre projet, tous les animaux sont mis à mort.
Remplacement
En amont de ce projet, nous réalisons des tests de toxicité in vitro, à la fois sur les molécules principales pures isolées contenues dans l’extrait et sur l'extrait pure d’OE, en utilisant des lignées cellulaires.Nous examinons également le potentiel effet anti-inflammatoire et anti-oxydant de cet extrait in vitro. Cette approche nous permet de prédire les effets toxiques en fonction des doses, et de déterminer l’extrait (OE) le plus efficace pour nos études intégratives.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux au maximum, le nombre de rats requis par groupe expérimental a été calculé, à l’aide d’outils statistiques dédiés. Nous arrivons à un nombre minimal de 8 rats par groupe pour détecter des différences significatives dans cette étude.
Raffinement
Nous mettrons en place plusieurs mesures visant à assurer le bien-être et à minimiser les dommages causés aux animaux. - La supplémentation orale est effectuée avec une nouvelle méthode qui ne contraint pas l’animal et sans sonde de gavage. - toutes les pertes de fluides au moment des prélèvements sanguins seront compensés. - Chaque acte réalisé sera récompensé par une friandise (solide ou liquide) afin d’associer la contrainte à une satisfaction. Cette récompense permettra également au rat de boire le glucose de manière spontanée au moment du test oral d’hyperglycémie provoquée. - Le test de capacité maximale aérobie (VO2 max) est toujours réalisé le vendredi pour que les animaux soient au repos pendant 2 jours avant de reprendre l’entraînement ou les manipulations le lundi suivant.
Choix des espèces
Le rat est un animal doué et intelligent qui peut être conditionné à l’activité physique. Les mécanismes physiologiques du désentraînement seront explorés sur ce modèle. Le rat a été préféré au modèle souris pour la taille de ses vaisseaux, des muscles squelettiques et du cœur qui sont plus gros, ainsi que pour la quantité de sang nécessaire à nos dosages. Nous travaillons sur des rats jeunes en pleine croissance, qui prennent de la masse musculaire très vite d’autant plus qu’ils sont actifs. Autour de l’âge de 12 semaines, les rats « adolescents » sont globalement minces sauf s’ils deviennent inactifs. C’est cette phase « adolescente » qui nous intéresse dans nos projets où nous ciblons les populations jeunes chez qui il est possible de mettre en place de la prévention primaire.
Circuits neuronaux des apprentissages de haut niveau chez le Rat
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Une injection dans le cerveau au cours d'une opération pouvant durer deux heures, une canule fixée au crâne, une fibre optique branchée sur la tête pendant des séances d'une heure : 696 rats passent par là, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré pour 624 d'entre eux, tous tués pour que leur cerveau soit prélevé. La majorité subit en plus un rationnement alimentaire pouvant durer douze semaines. Le projet cherche à cartographier les circuits cérébraux des apprentissages complexes, avec la schizophrénie et les addictions citées comme horizon translationnel. Le porteur écrit que maintenir les rats entre 90 et 95 % de leur poids "impacte très peu leur bien-être", tout en présentant cette faim comme ce qui garantit leur motivation à travailler pour la nourriture.
Objectifs
Ce projet vise à étudier les circuits cérébraux qui permettent les apprentissages de haut niveau chez le rat. Nous souhaitons dans ce projet étudier la connectivité de plusieurs régions connues pour être impliquées dans ces apprentissages mais dont le rôle précis n’est pas connu. Dans un premier temps nous réaliserons une étude descriptive de la connectivité entre les différentes régions impliquées en utilisant des produits permettant de les visualiser (traceurs). Ensuite nous inactiverons certaines structures pendant les tests d’apprentissage afin de mieux comprendre leur rôle.
Bénéfices attendus
Ce projet de Neurosciences permettra de comprendre le fonctionnement des réseaux neuronaux dans les processus d’apprentissage. Outre son intérêt en recherche fondamentale, ce projet devrait fournir des indications précieuses en recherche translationnelle dans la mesure où des dysfonctionnements dans ces circuits ont été décrits dans plusieurs maladies du cerveau (ex : Schizophrénie, addictions)
Procédures
Dans ce projet, les rats subiront une seule intervention chirurgicale pour une injection intracérébrale et certains seront implantés avec une petite canule fixée au crâne. Cette intervention durera maximum 2h. Pour certains de ces rats, une source lumineuse (fibre optique) sera attachée à leur tête pendant la tâche comportementale, ce geste durera quelques secondes et le rat restera connecté tout le long de la séance qui dure 1h. La majorité des rats recevront également un entraînement comportemental, qui nécessite une restriction alimentaire légère pour une durée maximale de 12 semaines.
Impact sur les animaux
Deux points de vigilance sont à noter. Le premier concerne la chirurgie. Les chirurgies du cerveau présentent un risque de diminution du bien-être animal dans les moments/jours qui suivent la chirurgie (inconfort, fatigue et parfois douleur). Le second concerne les procédures comportementales. Le stress de manipulation, lorsque l’on place les rats dans les cages opérantes ainsi que celui de contention pour les injections i.p. (juste avant la tâche) est faible puisqu’il est limité par l’habituation et par le côté appétitif de la tâche. Durant la tâche comportementale, les animaux seront mis en rationnement alimentaire léger pour les maintenir à 90-95% de leur poids corporel initial, ce qui impacte très peu leur bien-être (légère sensation de faim garantissant la motivation des animaux à obtenir une récompense alimentaire). Cette restriction temporaire est en partie compensée par la nourriture obtenue au cours des tâches comportementales (environ 5g par jour).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever le cerveau pour les études tissulaires
Remplacement
Elucider les bases neuronales de fonctions cognitives complexes ne peuvent, par définition, s’étudier que chez les organismes entiers. L'utilisation d'animaux dans ce projet est nécessaire car nous ne pouvons pas mener ces expériences sur des sujets humains. De plus, les espèces d'invertébrés n'ont pas la capacité pour les comportements décisionnels étudiés dans ce projet et, à l'heure actuelle, ces comportements n'ont été démontrés que chez les mammifères et les corvidés. De même, l’approche neurocomputationelle faisant appel à la modélisation est utile, mais complémentaire des approches invasives in vivo permettant de vérifier la véracité des modèles prédictifs. Dans ce contexte il demeure nécessaire d’avoir recours à l’expérimentation animale
Réduction
Nous cherchons à utiliser le nombre minimal d’animaux permettant d’obtenir des données exploitables lors de l'utilisation des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les rats sont hébergés dans des cages collectives avec un milieu enrichi (un tunnel, matériel de nidation, et un bâton à ronger), dans des conditions optimales de température, humidité et lumière. Pour les procédures chirurgicales, des protocoles appropriés d’analgésie et d’anesthésie seront appliqués. Le suivi postopératoire sera effectué quotidiennement pour s’assurer de la récupération complète des rats. Des points limites généraux et des points limites gradés spécifiques aux procédures ont été déterminés, associés à des actions conservatoires de prise en charge de la douleur et de l’inconfort. Les animaux seront inspectés une fois par jour par l’expérimentateur durant 5 jours consécutifs à l’opération chirurgicale. Une grille de scorage a été mise en place pour adapter le suivi post opératoire et prendre en charge tout inconfort ou douleur des animaux. Tous les expérimentateurs et soigneurs sont formés et compétents dans les procédures requises pour ce projet et ont suivi les formations obligatoires.
Choix des espèces
D’une façon générale les rongeurs sont un bon modèle d’étude du système nerveux. Les principes fonctionnels à l’œuvre dans ces circuits sont transposables à l'homme. De plus de nombreuses épreuves comportementales spécifiques permettent de modéliser chez le rat des aptitudes cognitives complexes. Les animaux utilisés pour ce projet seront des jeunes adultes âgés d’environ 3 mois au début des expériences afin de limiter la variabilité de taille et garantir une constance dans les coordonnées stéréotaxiques.
Circuits préfrontaux de l’adaptation comportementale chez le Rat
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
1 052 rats vont être utilisés, tous tués pour prélèvement du cerveau, 908 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, chacun passant par une chirurgie crânienne d'environ une heure trente et jusqu'à douze semaines de restriction alimentaire. Une canule est fixée sur le crâne pour injecter dans le cerveau, et une fibre optique est attachée à la tête de certains pendant la tâche comportementale. Le rationnement les maintient à 90 ou 95 % de leur poids, ce que le porteur décrit comme une "légère sensation de faim garantissant la motivation" à obtenir la récompense. Ce que le projet promet en retour reste indirect, comprendre des réseaux de la prise de décision, avec des indications jugées précieuses pour la schizophrénie et les addictions, sans qu'aucune application soit avancée.
Objectifs
Ce projet vise à étudier les circuits cérébraux qui permettent une prise de décision adaptée chez le rat. Nous souhaitons dans ce projet étudier la connectivité de plusieurs régions connues pour être impliquées dans la prise de décision mais dont le rôle précis n’est pas connu. Dans un premier temps nous réaliserons une étude descriptive de la connectivité entre les différentes régions impliquées en utilisant des produits permettant de les visualiser (traceurs). Ensuite nous inactiverons certaines structures pendant le comportement de prise de décision afin de mieux comprendre leur rôle.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de comprendre le fonctionnement de certains réseaux neuronaux de la prise de décision. Outre son intérêt en recherche fondamentale, ce projet devrait fournir des indications précieuses en recherche translationnelle dans la mesure où ces dysfonctionnements ont été décrits dans plusieurs maladies du cerveau (ex : Schizophrénie, addictions)
Procédures
Dans ce projet, les rats subiront une intervention chirurgicale pour une injection intracérébrale et seront implantés avec une petite canule fixée au crâne. Cette chirurgie durera environ 1h30. Pour certains de ces rats, une source lumineuse (fibre optique) sera attachée à leur tête pendant la tâche comportementale. La majorité des rats recevront également un entraînement comportemental, qui nécessite une restriction alimentaire légère pour une durée maximale de 12 semaines.
Impact sur les animaux
Deux points de vigilance sont à noter. Le premier concerne la chirurgie. Les chirurgies du cerveau présentent un risque de diminution du bien-être animal dans les moments/jours qui suivent la chirurgie (inconfort, fatigue et parfois douleur). Le second concerne les procédures comportementales. Durant la tâche comportementale, les animaux seront mis en rationnement alimentaire léger pour les maintenir à 90-95% de leur poids corporel initial, ce qui impacte très peu leur bien-être (légère sensation de faim garantissant la motivation des animaux à obtenir une récompense alimentaire). Cette restriction temporaire est en partie compensée par la nourriture obtenue au cours des tâches comportementales (environ 5g par jour).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de prélever le cerveau pour les études tissulaires.
Remplacement
Elucider les bases neuronales de fonctions cognitives complexes ne peuvent, par définition, s’étudier que chez les organismes entiers. L'utilisation d'animaux dans ce projet est nécessaire car nous ne pouvons pas mener ces expériences sur des sujets humains. De plus, les espèces d'invertébrés n'ont pas la capacité pour les comportements décisionnels étudiés dans ce projet et, à l'heure actuelle, ces comportements n'ont été démontrés que chez les mammifères et les corvidés. De même, l’approche neurocomputationelle faisant appel à la modélisation est utile, mais complémentaire des approches invasives in vivo permettant de vérifier la véracité des modèles prédictifs. Dans ce contexte il demeure nécessaire d’avoir recours à l’expérimentation animale.
Réduction
Nous cherchons à utiliser le nombre minimal d’animaux permettant d’obtenir des données exploitables lors de l'utilisation des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les rats sont hébergés dans des cages collectives avec un milieu enrichi (un tunnel, matériel de nidation, et un bâton à ronger), dans des conditions optimales de température, humidité et lumière. Pour les procédures chirurgicales, des protocoles appropriés d’analgésie et d’anesthésie seront appliqués. Le suivi postopératoire sera effectué quotidiennement pour s’assurer de la récupération complète des rats. Des points limites généraux et des points limites gradés spécifiques aux procédures ont été déterminés, associés à des actions conservatoires de prise en charge de la douleur et de l’inconfort. Les animaux seront inspectés une fois par jour par l’expérimentateur durant 5 jours consécutifs à l’opération chirurgicale. Une grille de scorage a été mise en place pour adapter le suivi post opératoire et prendre en charge tout inconfort ou douleur des animaux. Tous les expérimentateurs et soigneurs sont formés et compétents dans les procédures requises pour ce projet et ont suivi les formations obligatoires.
Choix des espèces
D’une façon générale les rongeurs sont un bon modèle d’étude du système nerveux. Les principes fonctionnels à l’œuvre dans ces circuits sont transposables à l'homme. De plus de nombreuses épreuves comportementales spécifiques permettent de modéliser chez le rat des aptitudes cognitives complexes. Les animaux utilisés pour ce projet seront des jeunes adultes âgés d’environ 3 mois au début des expériences afin de limiter la variabilité de taille et garantir une constance dans les coordonnées stéréotaxiques. Pour la procédure 5 les animaux seront plus jeunes : 45 jours
Étude pilote pour reproduire chez le rat sain l’action d’une combinaison d’antibiotiques comparable à l’Homme
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Anesthésiés une heure trente, cathétérisés dans une veine et une artère, équipés d'un bouton fixé à travers la peau, 20 rats sont ensuite perfusés en continu pendant trente heures, seuls dans leur cage. Neuf prélèvements sanguins de 250 microlitres sont effectués pendant cette perfusion, sur animal éveillé. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré, l'isolement de trente heures étant lui-même compté par le porteur comme facteur de stress. Le projet cherche à reproduire chez le rat sain des concentrations d'antibiotiques comparables à celles obtenues chez l'humain, étape présentée comme intermédiaire avant une étude d'efficacité. Tous les rats sont tués à la fin, pour vérifier post-mortem l'état du système de perfusion.
Objectifs
La résistance aux antibiotiques est un problème de santé majeur. Bien que de nouvelles options de traitement pour les infections graves causées par des bactéries résistantes aient émergé récemment, les résistances continuent d’apparaître. Il est donc essentiel d’étudier de nouvelles combinaisons d’antibiotiques et d’optimiser les traitements pour mieux combattre ces infections. Ce projet vise à tester une combinaison prometteuse d’antibiotiques, identifiée pour son efficacité contre des bactéries résistantes en laboratoire. Avant d’envisager des essais chez l’homme, il est nécessaire de vérifier son efficacité chez l’animal infecté. Une première étude a permis de développer un modèle d’infection rénale fiable chez le rat. Cette nouvelle phase se concentre sur la mise en place des meilleures modalités d’administration de ces antibiotiques. Traditionnellement, les études sont menées sur des souris avec des doses souvent supérieures à celles utilisées chez l’homme, ce qui limite leur pertinence. Ce projet cherche donc à créer un modèle plus réaliste chez le rat, où les concentrations d’antibiotiques ressemblent à celles obtenues chez l’homme. Pour cela, les rats reçoivent une perfusion continue d’antibiotiques à des débits ajustés, afin de compenser l’élimination plus rapide des médicaments chez eux par rapport aux humains. Ce modèle pourrait rendre les études sur l’efficacité des traitements plus proches de la réalité clinique.
Bénéfices attendus
Ce projet pilote permettra d'evaluer les conditions de perfusion continue (débits, durée de perfusion à un débit donné) chez l'animal sain afin de mettre en place une étude de pharmacocinétique humanisée chez le petit animal. Ce projet est une étape intermédiaire nécessaire intervenant dans une étude pharmacocinétique -pharmacodynamique in vivo évaluant de nouveaux schémas posologiques de la combinaison d’antibiotiques qui pourront être, par la suite testés en clinique, afin d’améliorer la prise en charge d' infections sévères chez les patients.
Procédures
Tous les animaux recevront 3 injections sous cutanée d'analgésique et une injection sous cutanée d'anesthésique local . Les animaux seront maintenus sous anesthésie générale pendant 60 à 90 minutes pour l'implantation de cathéters veineux et artériel et pour la pose d'un bouton transcutané permettant de connecter les cathéters de prélèvements . Les animaux vigiles seront perfusés en continue d'une solution d'antibiotique pendant 30h . Au cours de la perfusion, 9 prélèvements de 250µL de sang sur 30 secondes seront réalisés sur l'animal vigile et libre de ses mouvements .
Impact sur les animaux
- Chirurgie : inconfort transitoire au réveil - Implantation de cathéters intraveineux et artériel à demeure : gêne légère pendant la durée de la perfusion intraveineuse et pendant les prélèvements - une légère perte de poids inférieure à 5 pour cent attendue au lendemain de la chirugie. - Douleur minimisée par traitement antalgique pendant et après la chirurgie et pendant toute la durée de l'étude pharmacocinétique - Isolement de l'animal pendant 30h qui engendre un stress modéré.
Devenir
Tous les animaux du projet seront mis à mort pour évaluation post-mortem du système de perfusion.
Remplacement
Des résultats préliminaires in vitro ont montré l’efficacité de la combinaison d’antibiotiques étudiée à des schémas posologiques innovants. A notre connaissance, aucun modèle in vitro ou in silico ne permet aujourd'hui de reproduire ce type d'outils d'évaluation des médicaments incluant la variabilité pharmacocinétique mais aussi dans la réponse aux traitements que l'on va observer avec ce modèle in vivo à terme.
Réduction
Ce projet in vivo a nécessité au préalable de réaliser des simulations nous permettant de déterminer de manière fiable des débits de perfusion ainsi que les durées de perfusions visant à reproduire de manière la plus exacte possible les concentrations humaines chez le rat. En effet, l'élimination des médicaments est plus rapide chez les rats que chez les humains. Des perfusions continues successives à des débits de perfusion variables d'antibiotiques doivent être réalisées afin de compenser cette perte. Ces simulations sont basées sur des données pharmacocinétiques chez le rat et chez l'homme de ces antibiotiques retrouvés dans la littérature, ce qui fait que une idée très précise des débits est connue pour être au plus près des concentrations attendues. A ce titre, le nombre de rats utilisés pour chaque lot (6 au total, dont 3 males et 3 femelles) est le nombre minimal d'animaux permettant de décrire de manière fiable la pharmacocinétique humanisée de chacun des antibiotiques en monothérapie et de leur combinaison en tenant compte d'une éventuelle variablité intersexe qui pourrait être observée, sachant qu'au vu de la pharmacocinétique et notamment de l'élimination exlcusivement rénale de ces médicaments, aucune influence du sexe n'est attendue dans les résultats. Deux animaux supplémentaires ont été ajoutés pour prévenir les éventuels problèmes techniques comme un cathéter qui se bouche, ne permettant pas de réaliser l'expérimentation.
Raffinement
Les rats sont élevés dans des cages standards sur portoir ventilé avec enrichissement (tunnels pour se cacher et des batonnets à ronger) limités à 2 animaux par cage jusqu’à l’étape de la chirurgie. La souffrance des animaux sera évitée ou réduite au maximum. Les techniques chirurgicales seront réalisées sous conditions aseptiques et thermorégulées sous anesthésie générale avec analgésie opératoire et postopératoire. Cette couverture antalgique sera maintenue en continu sur toute la durée du projet. Une grille de suivi du bien-être animal est mise en place pour suivre les animaux tout au long du projet. Des points limites strictes et bien identifiés ont été établis. Le système de perfusion utilisé au cours de cette procédure est un système commercial, validé, sécurisé er robuste permettant à l’animal de se mouvoir librement dans sa cage-bol avec accès à l’eau et nourriture. Il permet une perfusion continue et la réalisation de prélèvements sanguins sans toucher l’animal, réduisant ainsi son stress.
Choix des espèces
La lignée "Sprague-Dawley" est une lignée de rats non-consanguins permettant d’obtenir une variabilité génétique inter-individuelle qui permet de se rapprocher de la variabilité inter-individuelle présente lors d'études cliniques. Cette lignée, qui n'est pas une lignée génétiquement modifiée, est la plus utilisée dans le domaine biomédical et sera donc utilisé dans le cadre de ce projet.