Souris
Effets de la nutrition sur le renouvellement de l’épithélium intestinal chez la souris
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
8 106 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune pouvant subir une biopsie de la queue, un gavage hebdomadaire pendant douze semaines et cinq jours consécutifs d'injections intrapéritonéales de tamoxifène. Les procédures impliquent un niveau de souffrance léger pour 5 166 d'entre elles et modéré pour 2 940, avec un stress lié à la contention, une douleur modérée à la biopsie caudale et des pertes de poids possibles. Les intestins et les fèces sont prélevés après mise à mort, pour comprendre comment l'alimentation agit sur le renouvellement de l'épithélium intestinal, les souris non retenues pour les procédures étant elles aussi tuées. Le porteur affirme qu'il n'existe "pas de méthode de remplacement", tout en indiquant que certaines études pourront être menées sur des organoïdes issus de ces mêmes souris, et aucun effectif n'est avancé pour justifier les 8 106 animaux.
Objectifs
Ce projet de recherche a pour objectif de comprendre comment les tissus de l'intestin se renouvellent et d'identifier les mécanismes contrôlant ce renouvellement. Il propose d'étudier les effets de l’alimentation sur ce renouvellement. Il vise à identifier les protéines essentielles à la physiologie intestinale et pouvant être les médiatrices des effets de l'alimentation sur l’intestin. En outre, la contribution de la flore intestinale dans les effets de l'alimentation sur ce tissu sera étudiée.
Bénéfices attendus
À court terme, ce projet permettra d'identifier les mécanismes impliqués dans les effets bénéfiques (alimentation pauvre en calories) ou délétère (régimes riches en graisses) de l’alimentation sur l'intestin. Ces recherches devraient enrichir la compréhension de la biologie des cellules intestinales mais aussi ouvrir, à plus long terme, de nouvelles perspectives de traitements utilisant des approches nutritionnelles.
Procédures
• biopsie de queue : 10 secondes. • Contention pour gavage : 20 secondes (1X par semaine pendant 12 semaines)• Contention pour injection intrapéritonéale tamoxifène: 20 secondes, (1X/jour pendant 5 jours). Contention pour injection intrapéritonéale d’anesthésique: 20 secondes. Prélèvement sanguin : 30 secondes.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront un stress lors de la contention, des injections intrapéritonéales et des gavages. Potentiellement certains traitements peuvent conduire à une perte de poids temporaire. Une douleur modérée lors de la biopsie caudale.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour permettre le prélèvement de leurs intestins et de leurs fèces, nécessaires aux différentes analyses. Quant aux animaux issus de l’élevage qui ne seront pas inclus dans les procédures expérimentales, ils seront également mis à mort de manière éthique et appropriée.
Remplacement
L’utilisation de cultures de lignées cellulaires ne reflète pas la complexité de l’épithélium intestinal ni les dialogues intercellulaires et ne peuvent reproduire les effets systémiques de l’alimentation. Il n’existe pas de méthode de remplacement.
Réduction
Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques appropriés. Certaines études pourront être réalisées sur des organoïdes issus de ces animaux, permettant ainsi de tester plusieurs drogues à partir d’une seule souris.
Raffinement
Les animaux vivent en groupes sociaux dans un milieu enrichi et ils seront surveillés quotidiennement par les zootechniciens. Des grilles de points limites spécifiques sont établies. Le raffinement comprend l’utilisation d’anesthésiques avant le prélèvement sanguin. Pour les gavages des canules en inox adaptées à l'âge des souris sont utilisées.
Choix des espèces
Pour ce projet, l'espèce animale choisie est la souris. En effet cette espèce permettent d'étudier le rôle de différentes mutations géniques affectant le maintien et le renouvellement de l'épithélium. Des souris adultes âgées de 8 à 16 semaines, ayant un tractus digestif mature et un microbiote établi sont utilisées.
Thérapie génique de l’environnement tumoral pour forcer l’entrée et la destruction immunitaire des tumeurs pancréatiques
- Recherche appliquée
- Cancers
Toutes tuées pour que les tumeurs soient prélevées et l'efficacité du traitement vérifiée, 1 000 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 360 reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau du flanc et 640 dans le pancréas lui-même, 880 subissent deux à trois injections d'un produit d'imagerie suivies de 15 minutes d'anesthésie, environ 1 000 une injection de vecteur viral dans la tumeur et 600 une injection de lymphocytes. La croissance des tumeurs peut entraîner suppurations, nécroses, anémie légère et une perte de poids allant jusqu'à 20 % du poids maximal. Le porteur décrit les gènes thérapeutiques comme un "cheval de Troie" censé casser le "bouclier" du microenvironnement tumoral, et conclut que le recours au modèle in vivo est "indispensable" parce qu'aucune culture cellulaire ne reconstitue ces interactions.
Objectifs
Le cancer du pancréas est l’un des cancers les plus difficiles à traiter, avec un pronostic souvent très mauvais. Parmi les approches prometteuses, il y a l’immunothérapie cellulaire, une technique qui consiste à "reprogrammer" les cellules immunitaires du patient pour qu'elles puissent mieux attaquer la tumeur. Cette méthode a déjà donné d'excellents résultats contre certains cancers du sang. Mais pour le cancer du pancréas, c’est beaucoup plus compliqué. En effet, la tumeur s'entoure d'un microenvironnement (comme un bouclier) qui bloque à la fois les traitements et le système immunitaire du patient. Résultat : même les cellules immunitaires modifiées n’arrivent pas à atteindre leur cible. L'idée de notre projet est de casser ce bouclier protecteur. Pour cela, nous proposons une thérapie génique capable de transformer la tumeur de l’intérieur. Comment ? En utilisant des virus modifiés qui vont aller spécifiquement infecter les cellules cancéreuses pour y introduire des gènes thérapeutiques. Ces gènes agiront comme un cheval de Troie : ils seront portés par les cellules tumorales elles-mêmes et rendront la tumeur plus vulnérable aux attaques du système immunitaire et aux traitements. On ne cherche pas à toucher toutes les cellules tumorales (ce qui est très difficile), mais juste assez pour changer l’environnement local de la tumeur. Cela suffira pour attirer les cellules immunitaires tueuses et ouvrir la voie à l’immunothérapie. En résumé, on veut utiliser la thérapie génique pour affaiblir la tumeur de l’intérieur et permettre au système immunitaire de reprendre le dessus.
Bénéfices attendus
Les nouveaux traitements contre le cancer ne sont pas très nombreux, et ceux qui semblent prometteurs ne fonctionnent malheureusement pas pour tous les types de cancer. Le cancer du pancréas est particulièrement difficile à traiter. Seules certaines tumeurs opérables peuvent être guéries. Pour les autres, les options restent très limitées. Ce projet propose une nouvelle approche thérapeutique innovante. La thérapie génique, qui consiste à modifier génétiquement certaines cellules pour traiter une maladie, est encore très peu utilisée contre le cancer
Procédures
Greffe de cellules tumorales sous-cutanée dans les flancs : durée 10 minutes – 1 fois par animal, 360 animaux. Greffe de cellules tumorales dans l’organe d’origine afin de reproduire plus fidèlement la tumeur , et éventuellement injection de treatment experimental : durée 10 minutes – 640 animaux. Injection de une substance permettant l'imagerie : durée 1 minute – 2 à 3 fois par animal, 880 animaux. Anesthésie gazeuse durant l’imagerie : durée 15 minutes – 2 à 3 fois par animal, 880 animaux. Injection de LV (vecteur dérivé d’un virus inactif) dans la tumeur : durée 2 minutes – 1 fois par animal, ~1 000 animaux. Injection de lymphocytes par voie intraveineuse : durée 2 minutes – 1 fois par animal, ~600 animaux.
Impact sur les animaux
La greffe de lignées cellulaires tumorales et la croissance des tumeurs peuvent entraîner une altération de l’état général des animaux. Certaines complications, telles que des suppurations, des nécroses ou une légère anémie, peuvent survenir. Une perte de poids pouvant atteindre 20 % du poids maximal est également possible. Signes cliniques rares : abdomen gonflé ou apparition de micrométastases.
Devenir
Nous voulons prélever les tumeurs induites afin de vérifier la bonne intégration du traitement expérimental, et son efficacité, qui implique une infusion de cellules immunitaires dans la tumeur. Pour cela, nous devons euthanasier les animaux.
Remplacement
Des tests sur des modèles cellulaires 2D et 3D in vitro nous ont déjà permis de déterminer certains effets de nos LVs (vecteurs dérivés d’un virus inactif) , aussi bien en termes de ciblage que de thérapie génique. Cependant, l’utilisation de modèles in vivo est indispensable, car elle permet à la tumeur de se développer dans le microenvironnement d’origine d’un cancer du pancréas, recréant ainsi des conditions proches de la pathologie humaine. À ce jour, il reste impossible de reconstituer in vitro une tumeur avec toutes ses interactions complexes avec le microenvironnement.
Réduction
Le nombre d'animaux par lot sera réduit au maximum afin d'obtenir des résultats statistiquement significatifs. Les experimentations se feront graduellement afin de pouvoir calculer le nombre d'animaux nécessaires en s'aidant d'outils statistiques. Lorsque les souris seront euthanasiées, des prélèvements de tumeurs seront effectués pour générer des échantillons qui pourront être utilisés dans des études ultérieures afin d'optimiser les études et de réduire le nombre d'animaux en évitant la répétition d'expérimentations pour obtenir des échantillons supplémentaires.
Raffinement
Le bien-être de l’animal au quotidien est nécessaire au bon déroulement de nos expériences, mais également à la reproductibilité de nos résultats. Des enrichissements (maisons rouges) sont présents dans les cages. Au cours de nos expériences, de la nourriture humidifiée sera accessible directement dans la cage pour éviter la déshydratation des souris. Des tapis chauffants seront également utilisés dès l’anesthésie des souris, pendant les injections, et lors de la phase de réveil. Des injections d'analgésique pré et postopératoire pourront être réalisées en fonction de l'expérience et de la souffrance de l'animal. Un suivi attentif quotidien par du personnel compétent et formé, weekend compris, sera également mis en place. . Au moindre doute, nous ferons appel aux conseils de notre vétérinaire ou de la structure du Bien-Etre Animal (SBEA). Des points limites ont été mis en place et seront appliqués
Choix des espèces
Nous choisissons la souris parce qu’elle partage l’essentiel de nos mécanismes biologiques, ce qui permet de recréer des cancers humains et murins pour tester rapidement de nouvelles thérapies. Les animaux seront utilisés adultes à 8 semaines de vie. En effet, les cancers modélisés sont des cancers de l'adulte.
Évaluation de nouvelles molécules à visée thérapeutique ou thérapies dans un modèle de sclérose en plaques chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
Les souris dont l'état dépasse les points limites définis par la grille de score sont tuées avant la fin du protocole. 870 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour prélever le sang et les tissus nerveux. Une encéphalomyélite auto-immune leur est induite par injection d'un peptide de myéline et d'un adjuvant, ce qui provoque une hypotonie de la queue puis une faiblesse voire une paralysie des membres postérieurs, un repli social et une réduction du toilettage, sur environ 30 jours dans les modèles aigus et jusqu'à 45 jours dans les modèles rémittents. Le suivi passe par des tests de sensibilité à la douleur d'environ cinq minutes, répétés selon la progression de la maladie, et le porteur justifie le recours à la souris par des raisons scientifiques et par un "intérêt pratique", faibles coûts, cycles de reproduction courts et facilité de manipulation.
Objectifs
La sclérose en plaques est une maladie auto-immune chronique qui affecte le système nerveux central en détruisant la gaine de myéline entourant les axones. Cette démyélinisation entraîne l’apparition de lésions dispersées dans le cerveau et la moelle épinière, conduisant à une dégénérescence des neurones. Les symptômes varient selon les patients et les zones du système nerveux atteintes, et comprennent des troubles moteurs, sensitifs, visuels, urinaires ou encore des douleurs neurogènes pouvant être associées à des symptômes dépressifs. La maladie évolue souvent par poussées inflammatoires suivies de périodes de rémission plus ou moins marquées. Bien que des traitements existent, leur efficacité est parfois limitée et ils sont associés à des effets secondaires importants, ce qui souligne la nécessité de développer de nouvelles thérapies. Ce projet vise à évaluer de nouvelles approches thérapeutiques en utilisant un modèle murin bien établi d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale, qui reproduit plusieurs caractéristiques de la sclérose en plaques humaine. Les animaux reçoivent une injection d’un peptide dérivé de la myéline associé à un adjuvant, ce qui déclenche une réponse inflammatoire du système nerveux central entraînant des symptômes moteurs et sensoriels. L’évolution de la maladie est ensuite suivie par des tests comportementaux pour mesurer la sensibilité à la douleur et les troubles moteurs. Des analyses complémentaires, notamment histologiques et biochimiques, permettent de mieux comprendre les mécanismes en jeu. Le projet inclut également une approche d’imagerie in vivo, non invasive, permettant d’observer l’inflammation et la progression de la pathologie chez l’animal vivant. Cette stratégie globale permettra d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules et d’identifier des biomarqueurs associés à la maladie.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à évaluer le potentiel thérapeutique de nouvelles molécules ou associations de molécules dans un modèle murin de sclérose en plaques, en se concentrant sur la réduction des déficits moteurs et des douleurs neuropathiques associés à cette pathologie. En combinant des approches comportementales, biochimiques et d’imagerie non invasive sur l’animal vivant, il permettra de caractériser l’impact de ces traitements sur l’inflammation et la neurodégénérescence. Il s’inscrit dans une perspective de recherche translationnelle avec pour finalité l’identification de traitements plus efficaces et mieux tolérés pour les patients atteints de sclérose en plaques. À court terme, c’est-à-dire pendant la durée du projet, les bénéfices attendus concernent l’identification de molécules ou formulations prometteuses ainsi que l’évaluation comparative de leur efficacité dans des protocoles d’administration variés. Cela permettra de déterminer les doses optimales et les fenêtres thérapeutiques pertinentes, qu’il s’agisse d’une administration préventive ou curative. Le projet favorisera également la détection de synergies d’action entre composés, qui pourraient aboutir à des stratégies thérapeutiques combinées plus performantes. Par ailleurs, l’utilisation d’outils d’imagerie innovants sur l’animal entier contribuera à mettre en évidence de nouveaux biomarqueurs de la maladie, exploitables pour le suivi non invasif de la réponse au traitement. À long terme, les connaissances générées dans le cadre de ce projet pourraient contribuer au développement de nouveaux traitements destinés à améliorer la qualité de vie des personnes atteintes de sclérose en plaques. Ces avancées pourraient également être transposables à d’autres maladies neuroinflammatoires chroniques, pour lesquelles les approches thérapeutiques actuelles restent limitées. En affinant notre compréhension des mécanismes d’action des molécules testées et en enrichissant les modèles de suivi préclinique, ce travail vise à renforcer le lien entre la recherche fondamentale et les applications cliniques, dans le respect des principes éthiques de l’expérimentation animale et au service d’un enjeu de santé publique majeur.
Procédures
Dans le cadre de ce projet, les animaux seront soumis à un ensemble d’interventions techniques brèves, non chirurgicales, nécessaires à l’induction et au suivi du modèle EAE. Les interventions réalisées lors de l’induction du modèle EAE sont les suivantes : 2 injections sous-cutanées (1 minute au total) sous anesthésie gazeuse et 2 injections intrapéritonéales (15 secondes par injection). Les interventions réalisées lors du suivi du modèle EAE sont les suivantes : manipulation quotidienne des animaux (1 minute), test de la sensibilité à la douleur (animal vigile, sur une durée d’environ 5 minutes et répétée à différents temps selon la progression de la maladie), contention pour administrations de molécules à visée thérapeutique (durée d’intervention de 30 à 60 secondes en fonction de la voie d’administration et à une fréquence établie en fonction du protocole et du schéma thérapeutique choisi), examens d’imagerie non invasive par fluorescence sous anesthésie gazeuse (une à deux fois par animal ; injection du traceur par voie intraveineuse d’une durée de 30 secondes maximum ; durée de la session d’imagerie par fluorescence : 60 secondes maximum), un prélèvement sanguin sous anesthésie gazeuse (une fois par semaine maximum à partir du 18ème jour, durée d’environ 3 minutes). Chaque intervention est conduite par un personnel qualifié, en conditions contrôlées, afin de garantir à la fois le bien-être animal et la qualité des données produites.
Impact sur les animaux
Le modèle EAE utilisé dans ce projet entraîne inévitablement des effets indésirables, dont la nature, l’intensité et la durée varient selon la phase de la maladie induite et la sensibilité individuelle des animaux. Les premiers signes cliniques apparaissent généralement entre 8 et 14 jours après immunisation. Ils se traduisent initialement par une hypotonie de la queue, évoluant vers une faiblesse progressive voire paralysie des membres postérieurs, et dans les formes les plus sévères, des atteintes des membres antérieurs, voire un état prostré. Ces troubles neurologiques sont associés à une réduction significative de la mobilité, pouvant générer une inactivité prolongée. Des pertes de poids significatives sont régulièrement observées durant la phase aiguë de la maladie, liées à une réduction de la prise alimentaire et à l’état général affaibli de l’animal. Des troubles du comportement peuvent également apparaître, comme un repli social, une réduction de la toilette ou un stress accru lié à la manipulation ou à la douleur chronique. La durée des effets varie selon les procédures : dans les modèles aigus, les effets s’étendent sur environ 30 jours, tandis que dans les modèles rémittents, les effets peuvent s’étendre sur 45 jours avec une phase de rémission suivie d’une rechute. Tout au long de l’expérimentation, une surveillance clinique quotidienne est assurée selon une grille de score précise. En cas de dépassement des points limites prédéfinis, les animaux sont euthanasiés immédiatement. L’administration de molécules thérapeutiques peuvent engendrer des effets indésirables qui sont difficiles à anticiper. En effet, la plupart des molécules testées sont des molécules en cours de développement dont nous n’avons pas la connaissance. Les injections par voie sous-cutanée ou intrapéritonéale peuvent entraîner une douleur légère et transitoire. Une surveillance clinique étroite permettra d’en adapter les modalités en fonction des réponses observées. La manipulation, l’administration de la sonde fluorescente et l’anesthésie pour l’imagerie non invasive par fluorescence peuvent provoquer du stress chez l’animal.
Devenir
A l’issue du protocole, les animaux seront mis à mort pour prélever le sang total et/ou pour prélever les tissus nerveux d’intérêt.
Remplacement
L’objectif principal de ce projet est d’évaluer l’efficacité pharmacologique de nouvelles molécules ou formulations thérapeutiques dans un modèle murin de sclérose en plaques, en se concentrant sur les troubles moteurs et les douleurs neuropathiques associés à la pathologie. L’utilisation de modèles animaux de sclérose en plaques est incontournable pour atteindre les objectifs scientifiques du projet. De plus, si nous voulons préciser les mécanismes sous-jacents à son développement et l’efficacité de nouveaux développements ou molécules thérapeutiques, l’utilisation d’animaux vivants est, à ce jour, indispensable. Il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle in vitro, ex vivo ou mathématique capable de prendre en compte la complexité des mécanismes cellulaires sollicités et de considérer en même temps, l’évolution adaptative constante de l’organisme entier au cours du développement de la maladie chronique. Des approches alternatives sont toutefois intégrées dans la stratégie globale du projet : - Criblages préalables ex vivo (tests cellulaires sur lignées ou cultures primaires) sont réalisés pour évaluer la cytotoxicité, l’activité anti-inflammatoire ou neuroprotectrice des composés avant toute expérimentation in vivo. Ces tests permettent de réduire le nombre de candidats à tester chez l’animal. - Les données issues de modèles informatiques (in silico) et de banques de données moléculaires sont utilisées pour orienter la sélection des molécules candidates, en amont des procédures expérimentales. Cependant, ces approches ne permettent ni de reproduire l’interaction complexe entre système nerveux et système immunitaire, ni d’évaluer de façon fiable les manifestations cliniques fonctionnelles de la maladie (déficit moteur, sensibilité douloureuse, réponse à un traitement sur l’organisme entier). Ainsi, bien que la réflexion sur le remplacement des modèles animaux soit constante, les connaissances disponibles et les limitations techniques actuelles rendent l’utilisation de modèles murins vivants incontournable pour ce projet. Ces modèles sont, en outre, reconnus pour leur validité scientifique dans le domaine de la sclérose en plaques, et sont largement utilisés dans les recherches précliniques ayant conduit aux traitements aujourd’hui disponibles pour les patients.
Réduction
La stratégie d’expérimentation proposée est basée sur des expériences en mesures répétées (études longitudinales). Cette approche permet à chaque animal d’être son propre contrôle et d’être évalué à plusieurs reprises au cours du temps. Une approche statistique est envisagée par une comparaison des groupes d’animaux. Le nombre d’animaux sera de 10 par groupe de traitement (groupe d’animaux recevant une molécule à tester ou un traitement thérapeutique) et permet dans ces conditions d’obtenir une significativité suffisante pour conclure. L’utilisation d’imagerie sur animal vivant en suivi longitudinal permettra de préciser la nature des modifications physiologiques qui se mettent en place lors du développement de la pathologie et de limiter de manière significative le nombre d’animaux utilisés sur la durée. Les analyses post mortem des tissus prélevés en fin d’étude permettront d’optimiser les résultats obtenus in vivo et d’éviter les répétitions d’expériences. Cette stratégie globale vise à garantir une recherche de haute qualité scientifique tout en respectant les principes éthiques d’utilisation raisonnée des animaux.
Raffinement
Le principe de raffinement est intégré à chaque étape du protocole expérimental et repose sur une combinaison de mesures préventives, d’adaptations techniques et de suivi quotidien individualisé. Avant le début de la procédure les animaux bénéficient de séances d’habituation à l’environnement expérimental, au matériel et aux expérimentateurs. Ces périodes d’adaptation permettent de réduire le stress induit par les manipulations et de faciliter les évaluations comportementales. L’environnement d’hébergement est enrichi avec des matériaux adaptés (igloo, coton, accès facilité à la nourriture) afin de favoriser le confort, le repos et les comportements naturels, en particulier pour les animaux présentant un score clinique élevé. Les animaux sont suivis quotidiennement selon une grille d’évaluation fondée sur des critères comportementaux et physiologiques précis incluant l’état d’hydratation, la posture, la mobilité, la réactivité, l’aspect du pelage et la perte de poids. Cette grille permet une détection précoce des signes de souffrance et une prise de décision rapide quant à la poursuite de la procédure ou à l’application des points limites conduisant à l’euthanasie. La nourriture est adaptée à la condition de l’animal et fournie sous forme de gel pour faciliter la prise alimentaire même en cas de mobilité réduite. L’induction de la maladie et les prélèvements sanguins sont réalisés sous anesthésie gazeuse afin de limiter la douleur et le stress. La manipulation est effectuée par un personnel expérimenté et formé spécifiquement aux procédures utilisées dans le cadre du modèle EAE. L’évaluation de la douleur neuropathique est restreinte aux animaux présentant des scores cliniques faibles afin de ne pas surcharger ceux qui présentent déjà un état avancé de la maladie. L’utilisation de techniques non invasives d’imagerie permet de limiter le nombre d’interventions et d’examens post mortem en suivant les mêmes individus tout au long de l’étude. Cette stratégie contribue à réduire l’inconfort global tout en préservant la qualité des résultats. Un comité de pilotage interne est chargé du suivi scientifique et éthique du projet. Il permettra d’intégrer de nouvelles méthodes de raffinement en fonction des avancées techniques ou des recommandations éthiques récentes. Une veille méthodologique active sera assurée afin d’adapter les procédures en continu et d’améliorer le bien-être animal sans compromettre les objectifs scientifiques.
Choix des espèces
La souris s’est rapidement imposée au cours du temps comme des modèles fondamentaux dans la recherche biomédicale. Dans le domaine particulier de la recherche fondamentale et appliquée sur la sclérose en plaques et les pathologies associées (déficit moteurs, douleurs neurogènes...), l’essentiel de la littérature est obtenue chez ces deux espèces, (majoritairement chez la souris) pour diverses raisons (i) scientifiques, les mécanismes moléculaires et cellulaires décrits dans ces espèces sont retrouvés chez l’homme et (ii) pour un intérêt pratique: faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de manipulation et très bonne adaptation aux conditions expérimentales, l’intérêt majeur étant en premier lieu, l’historique de la connaissance de ces animaux, chez lesquels l’essentiel des traitements utilisés en clinique humaine de la douleur aujourd’hui ont été évalués et validés. Des animaux adultes (8-12 semaines) seront utilisés dans ce projet. Il s’agit d’animaux adultes qui sont généralement choisis dans les études de pharmacologie et qui répondent bien à l’expérimentation. Tous les animaux auront le même âge au début de chacune des études. L’induction de la pathologie chez des animaux jeunes adultes est efficace, fiable et reproductible, fournissant ainsi des résultats satisfaisants. Ce stade de développement est en parfaite adéquation avec la pathologie humaine, notamment en lien avec ses similarités physiologiques et moléculaires. De plus, il permet d'allier à la fois maturité sexuelle, hormonale et immunitaire. Ces modèles animaux sont ainsi adaptés aux études d'efficacité de nouveaux outils thérapeutiques.
Impact d’un prétraitement par nanoparticules lipidiques sur la biodistribution d’agents thérapeutiques
- Recherche appliquée
- Cancers
Deux injections d'agents thérapeutiques, dont une dans la veine de la queue sur animal éveillé, puis 30 minutes d'imagerie sous anesthésie et un prélèvement terminal du foie : 960 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Une partie d'entre elles est dépourvue de thymus, donc sans système immunitaire fonctionnel, pour recevoir des tumeurs humaines. Il s'agit d'occuper temporairement les voies hépatiques d'élimination avec une nanoparticule lipidique, afin qu'un médicament injecté circule plus longtemps dans le sang. Le porteur présente le suivi par imagerie sur animal vivant comme un moyen de réduire les effectifs, "sans avoir à les sacrifier à chaque étape", alors que les 960 souris sont toutes tuées pour prélèvement du foie.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’améliorer l’efficacité des traitements administrés par voie intraveineuse (IV) et de réduire leur toxicité en modifiant la biodistribution des agents thérapeutiques grâce à leur association à une nanoparticule lipidique. La circulation dans le sang des médicaments est essentielle à l’efficacité thérapeutique. Pour atteindre sa concentration maximale dans le tissu cible, comme la tumeur en oncologie, les médicaments doivent surmonter un obstacle biologique de taille : la clairance hépatique. Le rôle du foie est de filtrer le sang afin d’éliminer les composés toxiques, dont un grand nombre de médicaments. Ainsi, de nombreux candidats thérapeutiques prometteurs administrés par voie IV présentent une circulation dans le sang faible, qui se traduit par une accumulation faible ou nulle dans le tissu cible et par une toxicité hors cible potentiellement élevée. Par conséquent, si beaucoup de médicaments présentent un potentiel à l’échelle du laboratoire, la plupart n’ont pas d’avenir clinique. Afin de surmonter cet obstacle, une nanoparticule lipidique a été développée pour augmenter de façon temporaire la biodisponibilité des thérapies administrées par voie IV et pour minimiser le risque d’effets en dehors de la cible. La nanoparticule lipidique est destinée à occuper temporairement les voies hépatiques responsables de la clairance thérapeutique, afin de permettre à un médicament donné de plus fortement s’accumuler dans les tissus cibles pour augmenter son efficacité, tout en minimisant le risque de toxicité hépatique chez le patient. Cette étude a pour but de mieux comprendre comment certains médicaments se répartissent dans le foie après injection. Elle fait suite à une première recherche ayant montré que plusieurs de ces médicaments ont tendance à s’accumuler dans cet organe. Pour cela, ces médicaments vont être testés, seuls ou associés à la nanoparticule lipidique, sur des souris en bonne santé. L’objectif est d’observer comment les médicaments se répartissent entre les différents types de cellules du foie, et de voir si l’ajout de la nanoparticule lipidique permet de modifier cette répartition.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre comment une nanoparticule lipidique peut influencer la manière dont certains médicaments se répartissent dans le corps, en particulier dans le foie. À court terme, ces recherches permettront de faire progresser les connaissances sur les nanomédicaments et sur la façon dont ils sont éliminés par l’organisme. Elles aideront aussi à améliorer la composition des médicaments pour qu’ils soient plus efficaces et mieux tolérés. À plus long terme, la nanoparticule testée dans ce projet pourrait lever l’un des principaux obstacles qui empêchent certains traitements prometteurs d’être utilisés chez l’humain. En réduisant l’élimination rapide des médicaments par le foie, cette technologie pourrait renforcer l’efficacité de traitements déjà disponibles, et ainsi offrir de meilleurs résultats aux patients.
Procédures
Deux injections d’agents thérapeutiques par voie intraveineuse dans la veine de la queue ou une injection intraveineuse et une injection par voie intrapéritonéale seront effectuées sur animaux éveillés (durée 1-4 min). Prises d’images pendant 30 minutes sous anesthésie. Le prélèvement du foie est terminal et réalisé sous anesthésie générale terminale (5 min).
Impact sur les animaux
L’injection des composés thérapeutiques peuvent induire un stress bref qui diminue lorsque les souris retrouvent leur cage et leurs congénères. L’imagerie à fluorescence nécessite une anesthésie gazeuse courte qui peut entrainer dans de très rares cas un ralentissement du rythme cardiaque et de la respiration de quelques minutes (2-3 min) n’entrainant pas la mort de l’animal. Le prélèvement du foie est réalisé sous anesthésie générale et analgésie (5 min).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour prélèvement du foie.
Remplacement
L’utilisation de souris dans ce projet se justifie par le besoin d’étudier la manière dont les médicaments se répartissent et sont éliminés dans un organisme vivant complet. Les tests réalisés en laboratoire sur des cellules (in vitro) sont utiles au début, mais ils ne peuvent pas reproduire la complexité du corps entier, comme la circulation du sang, le fonctionnement du foie ou les réactions du système immunitaire. Certaines étapes essentielles, comme l’élimination des médicaments par le foie ou leur distribution dans les différents types de cellules, ne peuvent être correctement observées que chez un animal vivant. Le modèle de la souris, bien connu des chercheurs et largement utilisé dans le monde, permet donc d’obtenir des résultats fiables et utiles pour mieux comprendre comment les traitements agissent dans le corps.
Réduction
Le nombre de souris utilisé dans cette étude a été calculé afin d’obtenir des résultats fiables tout en limitant au maximum le nombre d’animaux. Ce calcul permet de s’assurer que les différences observées entre les groupes sont réellement dues au traitement testé, et non au hasard. Il s’appuie sur des méthodes statistiques reconnues, utilisant des formules ou des logiciels spécialisés. Par ailleurs, les nanoparticules utilisées dans l’étude sont rendues visibles grâce à des marqueurs fluorescents. Cela permet de suivre leur évolution dans l’organisme des animaux vivants à l’aide d’images, sans avoir à les sacrifier à chaque étape. Cette méthode permet donc de réduire le nombre total d’animaux utilisés.
Raffinement
Pour garantir le bien-être des animaux, une période d’adaptation d’au moins 5 jours sera respectée avant le début des expérimentations. Pendant cette phase et tout au long de l’étude, les souris seront hébergées dans des cages ventilées, dans un environnement confortable et contrôlé (température, humidité, lumière, qualité de l’air), avec un système d’alarme pour signaler tout problème. Les animaux seront hebergés par petits groupes, selon les normes en vigueur, et les mêmes groupes seront maintenus autant que possible pour éviter tout stress lié aux changements. Des objets adaptés (comme des abris en carton ou des matériaux pour creuser ou s’abriter) seront ajoutés dans les cages pour enrichir leur environnement et favoriser leur comportement naturel. Les animaux seront surveillés chaque jour par du personnel formé, et un vétérinaire sera présent régulièrement pour s’assurer de leur bon état de santé. Des soins d’urgence seront également disponibles à tout moment, y compris les week-ends et jours fériés. Si un animal montre des signes de souffrance importants, il sera pris en charge rapidement et, si nécessaire, mis à mort pour lui éviter toute douleur inutile.
Choix des espèces
Les souris sont utilisées comme modèle préclinique pour étudier comment les traitements se répartissent dans l’organisme. Leur physiologie est bien connue, et il existe de nombreuses souches génétiquement définies, ce qui permet de suivre précisément l’effet des injections dans différents tissus. Deux types de souris seront utilisés dans ce projet : • Des souris qui possèdent un système immunitaire normal. Elles sont un modèle de référence pour étudier la pharmacologie. Elles permettront d’observer comment le système immunitaire peut influencer le traitement. • Des souris dépourvues de thymus et donc sans système immunitaire fonctionnel. Elles sont souvent utilisées pour tester l’efficacité de traitements contre des tumeurs humaines implantées chez la souris. Certaines des thérapies étudiées dans ce projet étant destinées à l’oncologie, ces souris permettront de vérifier l’efficacité et la distribution du traitement dans ce contexte particulier. En combinant ces deux modèles, il sera possible de mieux comprendre comment les traitements se comportent dans différents types d’organismes et s’assurer que les résultats sont fiables et transposables à des études d’efficacité. Les souris utilisées dans ce projet seront des adultes jeunes (entre 7 et 10 semaines), afin que leurs organes et leur système immunitaire soient pleinement développés. Cela permet d’étudier plus précisément comment les traitements se répartissent dans le foie.
Evaluation in vivo de nouveaux vecteurs viraux permettant une étude ciblée de différentes populations neuronales
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 48 d'entre elles et modéré pour 96. Un tiers reçoit une injection dans la veine de la queue, un tiers une injection dans le sinus situé derrière l'œil, et le dernier tiers une chirurgie intracérébrale de 35 à 45 minutes sous anesthésie, avec les risques de mort pendant l'anesthésie ou au réveil et d'infection postopératoire que le porteur rappelle. L'enjeu déclaré reste préparatoire, vérifier in vivo que des vecteurs viraux ciblent bien une sous-population de neurones, avant de servir dans d'autres projets sur les protéines étudiées au laboratoire depuis plus de vingt ans. Sur le remplacement, le porteur indique seulement que la validation in vitro a déjà eu lieu et qu'il est maintenant "nécessaire" de tester ces outils in vivo, les cerveaux étant prélevés après mise à mort pour analyse histologique.
Objectifs
Pour mieux comprendre comment fonctionne le cerveau il est nécessaire de pouvoir étudier les principales cellules qui le composent et en particulier les neurones. Il existe différents types de neurones dont les rôles sont bien définis. On distingue ainsi par exemple les neurones excitateurs des neurones inhibiteurs. Dans chacune de ces classes, il existe des sous classes de neurones caractérisées par des morphologies et des fonctionnements différents. Pour mieux comprendre le rôle de chaque type de neurones dans l'organisation cérébrale générale, il est important de pouvoir modifier spécifiquement le fonctionnement de tous les neurones d'une seule sous-classe. Pour cela nous souhaitons développer de nouveaux outils moléculaires qui ciblent spécifiquement tous les neurones d'une seule sous classe. Dans ce projet, nous souhaitons confirmer nos résultats produits à partir de cellules en culture et valider in vivo les nouveaux vecteurs que nous avons conçus. Une fois validés, ces nouveaux outils pourront être utilisés dans le cadre d'autres projets pour étudier le rôle des protéines d'intérêt du laboratoire dans la mise en place, la structure et le fonctionnement de chaque sous population neuronale. Ce projet nous permettra également de tester différentes voies d'administration de nos outils.
Bénéfices attendus
Notre projet permettra de valider in vivo des outils moléculaires destinés à mieux cibler les différentes sous-populations neuronales présentes dans le cerveau. Dans ce projet, maintenant que la validation in vitro a été réalisée, nous allons quantifier l'efficacité et la spécificité de chacun de nos outils in vivo. Une fois ces outils validés in vivo ils pourront servir dans un prochain projet à étudier les protéines d'intérêt que nous caractérisons dans notre laboratoire depuis maintenant plus de 20 ans en ciblant des sous populations neuronales. Ce projet s'inscrit donc dans le processus de connaissance et de découverte suivi par le laboratoire nous permettant de mieux décrire les processus normaux de neurodéveloppement pour mieux en comprendre les dysfonctionnements.
Procédures
Injections intraveineuses sous anesthésie via la veine de la queue : 48 animaux. L'intervention durera moins de 10 minutes. Injections intraveineuses sous anesthésie par voie retro-orbitaire : 48 animaux. L'intervention durera moins de 10 minutes. Injections intracérébrales sous anesthésie : 48 animaux. Temps estimé de l’acte chirurgical de 35 à 45 min/souris. Chaque animal ne sera soumis qu'à une seule intervention.
Impact sur les animaux
Les injections dans la veine caudale peuvent entrainer l'apparition d'hématome et d'inflammation si le produit est injecté en dehors de la veine (injections péri veineuses). Les injections intraveineuses dans le sinus rétro orbitaire peuvent entrainer exceptionnellement des lésions oculaires. Les injections intracérébrales sont des chirurgies. Les risques liés à ces injections sont les mêmes que ceux pouvant survenir au cours de toute chirurgie (décès lors de l'anesthésie ou au moment du réveil, infection post-opératoire,...)
Devenir
Les résultats attendus de ce projet nécessitent de réaliser des analyses histologiques ou immunohistologiques sur des coupes de cerveaux. Les animaux seront donc mis à mort à l'issue de chaque procédure.
Remplacement
Comme précisé préalablement les validations de ces outils ont déjà été réalisées in vitro. Il est maintenant nécessaire que nous puissions tester ces outils in vivo et que nous puissions vérifier que l'expression de nos protéines fluorescentes est suffisante et spécifique dans les sous-populations de neurones que nous souhaitons étudier.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe est réduit car nous ne pensons pas avoir une grande variabilité entre les animaux. Il est basé sur ce que nous avons pu lire dans la littérature. Une certaine variabilité peut survenir lors de la réalisation du geste technique. Le personnel de notre laboratoire possède une grande expérience des injections intracérébrales chez la souris et des injections intraveineuses.
Raffinement
Tous les gestes techniques seront réalisés sous anesthésie générale. Un soin particulier sera apporté dans les soins post-opératoires chez les animaux avec une chirurgie stéréotaxique. Une couverture analgésique péri et post-opératoire est prévue pour les animaux avec une chirurgie
Choix des espèces
La souris reste le meilleur modèle pour ce projet. Si nos vecteurs viraux répondent à nos critères, d'autres vecteurs, basés sur la même technologie et permettant d'inhiber ou d'activer certains gènes d'intérêt, seront construits avant d'être injectés chez des souris. Pour ce projet préliminaire nous prévoyons des injections sur des animaux adultes âgés au minimum de 10 semaines et au maximum de 8 mois. Nous souhaitons utiliser des animaux adultes pour lesquels la phase active de neurodeveloppement est terminée. Ce prérequis validé, l'âge exact des animaux a peu d'importance pour ce projet.
Evaluation des effets de candidats médicaments dans un modèle murin d’encéphalite auto-immune expérimentale.
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
1 014 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 840 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, chacune pouvant recevoir deux administrations du candidat médicament par jour pendant 25 jours et jusqu'à trois ponctions de liquide céphalo-rachidien espacées de sept jours. Une encéphalite auto-immune leur est induite par injections sous-cutanées et intraveineuses, ce qui déclenche une paralysie progressive partant de la queue vers les membres postérieurs, avec une perte de poids atteignant 30 % dans les cas les plus sévères. S'y ajoutent des prélèvements sanguins hebdomadaires ou quotidiens et quatre tests comportementaux répétés jusqu'à six fois, dont la durée va d'une minute à quatre heures, sans que leur nature soit précisée. Les bénéfices annoncés portent sur une meilleure compréhension de la sclérose en plaques "à moyen terme", quand la paralysie et les prélèvements incompatibles avec la survie sont, eux, programmés.
Objectifs
La sclérose en plaque (SEP) est une maladie auto-immune qui affecte le système nerveux centrale (SNC) et qui touche environ 1,8 million de personnes dans le monde selon l’organisation mondiale de la santé. Cette maladie, qui touche souvent les jeunes entre 25 et 35 ans, est connue comme la deuxième cause d’handicap acquis chez les jeunes adultes, après les traumatismes. La SEP se caractérise par la dégradation de la gaine de myéline, qui entoure et isole les fibres nerveuses dans le système nerveux central et qui permet la transmission des signaux nerveux entre les neurones, provoquant des inflammations au niveau des zones endommagées du SNC (plaques ou lésions) et menant ainsi à des perturbations cognitives, émotionnelles, motrices, sensitives ou visuelles. Jusqu’à nos jours aucun traitement ne parvient à guérir de la sclérose en plaque. Toutes les approches thérapeutiques existantes visent à limiter l’intensité et la fréquence des poussées inflammatoires et à soulager les symptômes. Le but de ce projet est de développer, chez la souris, un modèle d’Encéphalite Auto-immune Expérimentale (EAE) devant mimer la forme récurrente-rémittente de la SEP, qui est la forme la plus fréquente chez l'Homme caractérisée par des épisodes intermittents d’apparition de symptômes (poussées), suivis par des périodes plus ou moins longues d’absence de crises cliniques (rémissions), pour ensuite tester de nouvelles approches thérapeutiques qui peuvent être prometteuses dans le traitement de la SEP.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont, à moyen terme, une meilleure compréhension des mécanismes d’action impliqués dans la SEP et le développement de nouvelles molécules et approches thérapeutiques pour traiter cette maladie (= démontrer que le composé testé est actif dans un modèle expérimental de la pathologie ciblée (EAE) et évaluer ses éventuels effets secondaires avant son passage en phase clinique).
Procédures
Pour l’induction de la SEP, les animaux endormis recevront une ou deux injections en sous-cutané (moins d'une minute) et deux injections abdominales, en intraveineux, après l’induction (jour 0 et jour 2, moins d'une minute). Les souris seront généralement soumises à une ou des administrations du candidat-médicament en vigile (1-2 minutes environ) sur 25 jours pmaximum avec deux administrations maximum par jour. Les prélèvements sanguins répétés seront réalisés sur animaux vigile (environ une minute), à raison d’un prélèvement hebdomadaire ou quotidien en fonction du volume prélevé. Le prélèvement de liquide céphalo-rachidien (liquide dans lequel baigne le cerveau) après endormissement de l'animal (20 minutes) maximum 3 fois au cours de l'expérimentation avec 7 jours d'intervalle minimum. Des tests comportements seront réalisés au cours de l’expérimentation (un passage /test/ stade de développement de la maladie) qui peuvent durer entre 1 minute et 4h. Sur chaque groupe d'animaux, 4 tests maximum seront réalisés et répétés au maximum 6 fois.
Impact sur les animaux
L’induction d’une EAE consiste à déclencher une réaction immunitaire au niveau du système nerveux central avec apparition d’une paralysie progressive mais transitoire allant de la queue vers les membres postérieurs puis dans de rares cas vers les membres antérieurs. Cette procédure engendre, un affaiblissement de l’animal avec une perte de poids transitoire dès le début de l’apparition des symptômes (J9-J10) pouvant atteindre dans les cas les plus sévères jusqu’à 30%. D'autres nuisances sont possibles, en effet, lors de certaines administrations nécessitant une aiguille, telles que l'induction de l'anesthésie ou l'administration d'un candidat médicament, les animaux pourront aussi subir une douleur légère et brève liée à la piqûre avec une aiguille. De plus, la manipulation des animaux vigiles pour induire l'anesthésie, prélever du sang, du liquide céphalo rachidien, administrer les composés à tester et de réaliser les tests de comportement peuvent engendrer un stress mineur de courte durée.
Devenir
Mise à mort des animaux pour réaliser des prélèvements d’organe et des fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal Et/ou mise à mort des animaux suite aux effets indésirables provoqués par le développement de la maladie ou par le(s) produit(s) testé (s).
Remplacement
Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez la souris car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur la sclérose en plaque (modèle d’Encéphalite Auto-immune Expérimentale), Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, la souris est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.
Réduction
Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : 15 / par groupe.
Raffinement
Dans ce projet, le raffinement sera assuré par un ensemble de mesures visant à optimiser le bien-être animal et à minimiser toute forme de contrainte. Tout d’abord, des procédures rigoureuses seront mises au point et le personnel impliqué recevra une formation spécifique afin de garantir la fiabilité des pratiques et la qualité des soins. L’état de santé des animaux fera l’objet d’un suivi quotidien, permettant une détection précoce d’éventuels signes cliniques et une prise en charge rapide en se basant sur une grille de score définie. L’accès à l’eau et à la nourriture sera facilité (croquettes mouillées, tétine longues, etc) et placé dans les cages. Les interventions expérimentales reposeront sur des techniques aussi peu invasives que possible, et des points limites clairement définis permettront de décider rapidement du recours à une euthanasie lorsque cela s’avérera nécessaire. Par ailleurs, les méthodes d’analyse seront optimisées afin de limiter le volume sanguin prélevé, grâce à une amélioration de leur sensibilité. Le recours à l'anésthésie permettra de diminuer la douleur ressentie lors de certains actes et de réaliser de façon plus précise et plus rapide certains prélèvements biologiques. Enfin, une familiarisation progressive des animaux aux procédures expérimentales sera réalisée, dans le but de réduire leur appréhension et d’améliorer leur confort tout au long de l’étude.
Choix des espèces
La souris est l’une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour les modèles animaux de la recherche biomédicale et les études de médecine comparative en raison de leur similarité anatomique, physiologique et génétique avec l'homme (les souris et les humains partagent environ 95% de gènes). Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.
Effet d’un traitement par exposition au plasma froid sur le potentiel métastatique de cellules tumorales prostatiques humaines sur un modèle de souris immuno-déprimées NOD Scid. MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système urogénital
Les souris utilisées sont des NOD Scid, dépourvues de système immunitaire fonctionnel, condition posée par le porteur pour que des cellules tumorales prostatiques humaines s'implantent et se disséminent. 75 souris sont ainsi exploitées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour collecte des tissus. Chacune reçoit une greffe de cellules PC3-GFP par ouverture de la cavité péritonéale sur cinq à six millimètres, puis un traitement de 120 secondes par torche à plasma froid par la même voie d'entrée. Le porteur écrit que les lots déjà traités n'ont présenté "aucun signe d'inflammation ni aucun effets indésirables", tout en reconnaissant que l'implantation de cellules tumorales peut être associée à des douleurs et altérer l'état sanitaire de l'animal.
Objectifs
Le projet s’inscrit dans l’étude de l’évaluation du potentiel thérapeutique quant à l’utilisation d’une torche à plasma pour le traitement des marges chirurgicales au cours d’une chirurgie de prostatectomie radicale. Afin d’évaluer in vivo la pertinence de l’utilisation d’un tel dispositif, nous proposons de réaliser un traitement par torche à plasma sur des greffons de cellules PC3-GFP réaliser par implantation orthotopique intraprostatique.
Bénéfices attendus
Le cancer de la prostate peut, selon les options thérapeutiques retenues, conduite à une prostatectomie dans le but de supprimer le foyer tumoral primaire. Bien que les techniques actuelles soient aujourd’hui excellentes, notamment par le développement de procédure assistée par robotique, le risque de récidive par la présence de marges positives lors de la chirurgie reste un enjeu clinique de premier ordre. Ainsi, le développement de techniques permettant le traitement préventif du lit tumoral constitue un axe de recherche prioritaire. Les bénéfices attendus sont donc la validation par l'utilisation d'un modèle pré-clinique de l'efficacité du plasma froid pour le traitement des marges positives sur une chirurgie d'exérèse de tumeurs de la prostate et l'évaluation des risques de récidives avec ou sans traitemennt par plasma froid.
Procédures
Procédures chirurgicales : - 1 implantation intraprostatique par voie ventrale, ouverture sagitale de 5-6mm de la cavité peritonéale (6 minutes) - 1 traitement par plasma froid de 120 secondes, voie d'entrée identique à la première procédure (8 minutes)
Impact sur les animaux
La procédure d'implantation intraprostatiques des cellules PC3-GFP est maitrisée et a été conduite à plusieurs reprises dans le laboratoire. Ainsi nous avons un très bon recul sur cette procédure. L'implantation de cellules tumorales au long court sur une souris porte-greffe peut-être associée à certaines douleurs, voir altérer le statut sanitaire de l'animal. Toutefois, le protocole proposé se trouve en dehors de cette fenêtre puisque d'une durée n'exédant pas 4 semaines. Malgré tout, une attention particulière sera apportée sur l'état de bien être et de potentielle souffrance de l'animal pour identifier toutes nuisances inattendues. Concernant la réponse du traitement par la torche à plasma froid sur le site d'implantation, cette DAP correspondant à une extension d'une expérimentation précedemment autorisée, les lots d'animaux déjà traités n'ont présenté aucun signe d'inflammation ni aucun effets indésirables.
Devenir
L'ensemble des animaux seront mis à mort pour collecte des tissus.
Remplacement
Cette étude in vivo a été précéder par une caractérisation des paramètres physiques de la torche à plasma et des effets biologiques obtenus sur lignées cellulaires. Ainsi, nous avons pu définir les paramètres optimales d’utilisation de la torche pour une utilisation sur l’animal. Ainsi tout la phase de mise au point a été réalisé sur des systèmes de substitution in cellulo. En parallèle, les processus de dissémination métastatique sont très complexes et, même si certains paramètres peuvent être étudiés en culture de cellule, nécessitent d'être analysés sur un organisme mammifère proche de l'humain. Dans le cas présent, le modèle utilisé est le modèle préclinique incontournable pour valider l'utilisation du plasma froid en chirurgie et analyser son potentiel sur le risque de récidive.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été restreint au maximum et définit pour obtenir une puissance statistique satisfaisante à l’issue du protocole, ainsi 45 animaux seront utilisés au total sur des lots de 15. Les tests utilisés seront les suivants: Mann & Whitney, Wilcoxon, Kruskal & Wallis et/ou Friedman en fonction des comparaison de groupe effectué. MODIFICATION 75 ANIMAUX AU TOTAL
Raffinement
En parallèle, la dissémination de cellules tumorales peut conduire à l’apparition de lésions douloureuse pour l’animal. Un suivi régulier tout au long du protocole sera mis en place pour évaluer l’apparition de signe de douleur et une prise en charge par traitements antalgiques. Concernant la chirurgie, l'ensemble de la procédure est réalisée sous anesthésie et des traitements post-opératoires sont mis en place pour optimiser le bien-être de l'animal. Les points limites d’expérimentation seront particulièrement adaptés à ce risque et sont décrits dans la présente demande. Un enrichissement important de la cage est prévu dans le but d’optimiser le bien-être animal.
Choix des espèces
Le modèle murin correspond au standard pour la greffe de cellules tumorales humaines et l’étude de la dissémination métastatique chez les mammifères. En effet, le modèle souris vient en complément des modèles d’étude in vitro d’invasion et de mobilité cellulaire notamment permettant d’apprécier le tropisme tissulaire des cellules tumorales. Il est important de noter que l’utilisation de la torche à plasma in vivo, est consécutive à la validation des effets biologiques d’intérêts sur lignées cellulaires en culture. Nous utiliserons des individus de 2 à 4 mois. Les cellules utilisées étant des cellules prostatiques nous devons utiliser des animaux en période post-pubertaire.
Détermination de la biodistribution de nouveaux colorants fluorescents
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
Confirmer chez la souris qu'une nouvelle formulation de colorant fluorescent s'élimine par les reins plutôt que par le foie : 290 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue. Chacune reçoit une injection dans la veine de la queue et subit jusqu'à cinq anesthésies gazeuses, avec des séances d'imagerie à une, deux, trois et quatre heures. Le protocole reprend celui d'un précédent essai mené par le partenaire privé du porteur, et la mise à mort est justifiée par la volonté d'obtenir "des images plus précises de la biodistribution". Le total déclaré atteint 290 souris alors que le porteur ne décrit qu'un lot de sept animaux réparti sur deux expérimentations.
Objectifs
Les colorants spécifiques en mesure de cibler sélectivement une zone d’intérêt chirurgical sont une innovation pour améliorer le traitement des patients. Récemment, nos équipes partenaires ont mis au point une nouvelle formulation pouvant potentiellement modifier le mode d’élimination des colorants, en passant d’une voie d’élimination hépatobiliaire à une voie d’élimination rénale. Un tel produit permettrait de visualiser en temps réel et par fluorescence le système urinaire du patient en cours de chirurgie. Il permettrait alors de limiter considérablement le risque de lésions pendant l'opération, très lourdes de conséquences. Dans le cadre de ce projet, l’objectif est donc de confirmer sur le modèle souris le profil d’élimination rénal de cette formulation, d’analyser la distribution du produit post injection dans les différents organes de l’animal et d’étudier sa cinétique d’élimination.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'identifier des colorants d'intérêt pour améliorer la prise en charge chirurgicale de patients.
Procédures
Les animaux seront anesthésiés par voie gazeuse avant chaque intervention. Chaque souris aura une injection au niveau de la veine de la queue et sera imagée à différents temps (1h, 2h, 3h et 4h) avant d'être euthanasiée par injection d'euthanasiant. En tout, chaque souris subira au maximum 1 injections et 5 anesthésies, tel que réalisé dans un précédent protocole de notre partenaire privé.
Impact sur les animaux
Une douleur locale liée à l'administration intraveineuse du produit d'intérêt pourra être observée (inférieure à 1mn). Les anesthésies gazeuses pourront occasioner un stress transitoire chez les animaux le temps que le produit agisse (moins de 5 minutes).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de protocole afin d'obtenir des images plus précises de la biodistribution de nos produits d'intérêt.
Remplacement
Cette étude permet de définir la biodistribution d'un nouveau composé dans le corps. Le modèle animal vivant est nécessaire pour définir le trajet du produit après une injection dans la circulation sanguine. Les entrainements aux gestes techniques se feront dans un premier temps sur modèles factices avant de passer sur le modèle animal.
Réduction
Le nombre d'animaux est réduit pour obtenir des résultats exploitables. Un lot d'animaux (N=7) sera réparti sur 2 expérimentations. Si les premiers résultats sont concluants, le reste des animaux ne subira pas de procédure.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes sociaux stables dans des conditions de température, d’hygrométrie et de ventilation optimales. Ils bénéficieront d’un enrichissement varié de leur milieu (caches et matériel de nidification, environnement sonore). Nourriture et boisson seront ad libitum. Toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie gazeuse. Des points limites spécifiques sont mis en place afin de pouvoir prendre en charge rapidement la souffrance d'un animal (mise en place d'une analgésie ou mise à mort).
Choix des espèces
La souris est une espèce de référence pour ce type de test. Des souris de 8 semaines seront utilisées, afin de comparer nos études avec ce qui existe dans la littérature.
Imagerie moléculaire de la charge en cellules sénescentes
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles gastrointestinaux
Une tumeur implantée sous la peau du flanc, cinq injections dans le ventre, cinq jours de gavage consécutifs, puis une heure d'anesthésie pour l'imagerie : 696 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue pour analyse de leurs tissus, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Une partie d'entre elles est immunodéficiente, condition nécessaire pour que des cellules humaines prennent dans leur organisme. Il s'agit de mettre au point un agent d'imagerie repérant les cellules abîmées qui s'accumulent avec l'âge, pour suivre sans biopsie l'effet des traitements qui visent à les éliminer. Aucune atteinte concrète n'est décrite : le porteur écrit que le projet "garantit le bien-être animal" et que les effets indésirables sont limités par des "modèles bien tolérés".
Objectifs
Ce projet vise à développer une méthode d’imagerie pour repérer les cellules endommagées qui s'accumulent avec l'âge (appelées cellules sénescentes), impliquées dans des maladies liées au vieillissement. Après avoir identifié deux cibles spécifiques à ces cellules, des agents d’imagerie sont testés sur des modèles animaux pour vérifier leur efficacité. L’objectif : permettre une détection non invasive de ces cellules dans le corps, utile pour mieux comprendre et diagnostiquer certaines pathologies.
Bénéfices attendus
Actuellement, des traitements permettant l’élimination des cellules sénéscentes sont en cours d’évaluation pour leur effet sur le développement de différentes pathologies. Cependant la présence de ces cellules ne peut être détectée que par des analyses invasives et limitées à un tissu donné. Le développement d’un agent d’imagerie pour la détection des cellules sénescentes pourra donc permettre d’optimiser l’utilisation de ces traitements et de suivre leur efficacité de manière non invasive.
Procédures
Une implantation tumorale sera réalisée le flan d’une partie des souris. Elle entrainera un léger stress à l’implantation, cependant ce geste bien maitrisé au laboratoire est très rapide et se fait sous anesthésie volatile. Un suivi régulier permettra d’éviter toute souffrance de l’animal si les tumeurs atteignent un volume impactant le bien-être animal. Une partie des animaux sera soumis à des injections intrapéritonéales (5 injections par animal). Une partie des animaux sera traité par gavage (5 jours consécutifs de gavage par animal) Une partie des animaux recevront une injection intraveineuse d’un agent d’imagerie suivi d’une anesthésie volatile de courte durée (
Impact sur les animaux
Le projet garantit le bien-être animal tout en assurant la fiabilité des résultats. Grâce à des modèles bien tolérés, les effets indésirables sont limités. La surveillance rigoureuse des animaux permettra de détecter rapidement toute détresse. Ce cadre expérimental soigné assure des conditions optimales pour tester un outil de détection innovant, avec un impact minimal sur les animaux, renforçant ainsi la validité scientifique et éthique du projet.
Devenir
A l’issue de la procédure les animaux seront mis à mort. En effet, des analyses post-mortem seront nécessaires pour caractériser la sénescence induite et la distribution de l’agent d’imagerie à une échelle cellulaire et tissulaire.
Remplacement
La biodistribution de l’agent d’imagerie et sa capacité de détection des cellules sénescentes par imagerie ne peut être évaluée qu’in vivo. Toutefois, l’agent d’imagerie a été préalablement entièrement caractérisé et validé in vitro sur protéine et sur cellules. Sa spécificité et sa sensibilité pour lier sa cible ont ainsi été préalablement démontrées in vitro
Réduction
L’étude a été conçue pour limiter le nombre d’animaux utilisés, tout en conservant un effectif suffisant pour une analyse statistique permettant de se prononcer sur l’efficacité des interventions évaluées.
Raffinement
Une attention particulière sera apportée au bien-être des animaux avec enrichissement du milieu de vie, un hébergement par groupe et un suivi de leur bien-être sera effectué quotidiennement. Des points limites adaptés au modèle permettront de réduire le stress et la souffrance. L’imagerie sera réalisée sous anesthésie volatile.
Choix des espèces
Les modèles identifiés comme pertinents pour l’induction de la sénescence cellulaire ont été établis chez la souris. De plus les souris immunodéficientes permettent la prise tumorale de cellules humaines ce qui permet de se rapprocher davantage de la pathologie d'intérêt.
Amélioration de la compatibilité donneur/receveur dans un modèle de greffe rénale
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Deux opérations chirurgicales à une semaine d'intervalle, dix prises de sang et neuf prélèvements d'urine sur animal éveillé : 720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures dont les niveaux de souffrance déclarés vont du léger au sévère, une partie des animaux étant opérée sous anesthésie et tuée avant tout réveil. Une partie est tuée pour fournir des lymphocytes, une autre, transgénique, pour donner son rein, les dernières recevant la greffe puis le traitement à évaluer. L'objet déclaré est de valider une protéine chimérique censée bloquer le rejet humoral et élargir l'accès à la transplantation. Le porteur annonce des complications sévères possibles, mauvaise cicatrisation, saignement, infection du site de greffe, tout en affirmant que le rejet lui-même n'est pas douloureux "étant donné que le greffon n'est pas innervé".
Objectifs
L’insuffisance cardiaque, respiratoire ou rénale terminale constituent des problèmes majeurs de santé publique. La transplantation d’organe est le meilleur traitement, car elle permet d’améliorer la qualité et la durée de vie des patients. Cependant, la morbidité et la mortalité des patients transplantés restent élevées. Cela s’explique notamment par une forme particulière de rejet d’organe, le rejet humoral. Ce dernier est causé par les lymphocytes B qui produisent des anticorps contre les protéines du donneur, exprimées à la surface des cellules de l’organe transplanté. Certains patients possèdent déjà des anticorps contre ces protéines avant la transplantation, parce qu’ils ont été exposés à du matériel génétique étranger à l’occasion d’une transfusion, d’une grossesse ou d’une précédente transplantation. Ces anticorps préexistants compliquent l’accès à la transplantation pour de nombreux patients. Certaines protéines du donneur, très répandues dans la population, sont souvent en cause, car elles sont communes à une grande partie de la population. Actuellement, la seule prise en charge possible de cette immunisation du receveur contre les protéines du donneur repose sur une immunosuppression globale, visant toutes les sous-classes des lymphocytes. Cette immunodépression massive expose le receveur à un haut risque d’infections et de cancers. En outre, certaines cellules productrices d’anticorps ne peuvent pas être ciblées par les thérapeutiques actuelles, ce qui explique l’efficacité médiocre des protocoles existants. Nous avons donc développé une nouvelle protéine chimérique qui permettrait de cibler toutes les populations de lymphocytes B de façon antigène-spécifique, tout en épargnant les lymphocytes qui ne sont pas impliqués dans la production des anticorps contre les protéines du donneur. Notre preuve de concept est que ce traitement avec la protéine chimérique est capable de cibler cette population cellulaire délétère dans un modèle murin d’immunisation in vivo. Dans la continuité de ce projet, nous allons étudier l’efficacité du traitement pour inhiber la réponse humorale et cellulaire contre le greffon dans un modèle murin de transplantation rénale. A la fin de chaque procédure, les animaux seront mise à mort pour prelever leur organes (cellules ou rein) pour la greffe ou pour l’analyse après opération.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra la validation préclinique d’une nouvelle thérapie moléculaire visant à prévenir et à traiter le rejet humoral, afin de faciliter l’accès à la transplantation pour les patients sur liste d’attente.
Procédures
Les souris seront soumises aux interventions suivantes : - Souris donneuses de Lymphocytes B : 2 injections (15 secondes) et deux prélèvements sanguins (15 secondes) sur souris vigile. - Souris receveuse de lymphocytes B et greffe de rein : 1 injection de cellules (30 seconds), 4 injections de protéine chimérique (15 seconds), 10 prises de sang (10 seconds) et 9 prises d’urines (10 seconds) sur souris vigile, 2 opérations chirurgicales à une semaine d'intervalle (20 minutes chaque opération).
Impact sur les animaux
La greffe d’un organe vascularisé est une procédure délicate. Des complications engendrant des nuisances sévères éventuelles peuvent survenir au cours de la procédure de greffe, notamment une mauvaise cicatrisation, un saignement ou une infection du site de la greffe. Ensuite, la complication attendue en cas de rejet du greffon est la perte de fonctionnalité de celui-ci, éventualité qui sera monitorée régulièrement et entrainera la fin de la procédure expérimentale. Ce phénomène de rejet de greffe, en l’absence de complications, n’est pas douloureux pour l’animal, étant donné que le greffon n’est pas innervé.
Devenir
Dans le projet décrit, les souris seront reparties ainsi: - 1ere procédure : les souris seront utilisées pour générer les lymphocytes dirigés vers une protéine du complexe majeur d'histocompatibilité humaine et vers l'ovalbumine. Ces souris seront mises à mort pour purifier le lymphocyte à transférer. - 2ème procédure : Souris transgéniques seront mise à mort pour donner leur rein. - 3ème procédure : Souris receveuse de lymphocytes B immunisants et puis de la greffe de rein. Elles seront mises à mort à la fin de l’expérimentation pour analyse ou lors d'un point limite.
Remplacement
Le rejet humoral nécessite le contact entre la circulation sanguine du receveur et le système vasculaire du donneur. Cette interaction ne peut être étudiée in vitro, et nous ne pouvons pas nous affranchir d’un modèle murin pour aller plus loin dans notre étude préclinique.
Réduction
Les effectifs ont été ramenés au minimum permettant toutefois d’avoir un effet statistique significatif. Nous avons utilisé un outil informatique pour calculer le nombre d'animaux nécessaire et en utilisant des données préliminaires
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe de 4 ou 5 selon leur poids et en milieu enrichi. Ils seront surveillés quotidiennement (comportement, apparence, signes cliniques) par le personnel animalier d'une part, et par les personnes en charge de l'expérimentation d'autre part. Toute apparition de signes de douleur tels que prostration, dos vouté, isolement et poil hérissé entrainera l’ouverture d’une fiche de score avec des points limites bien définis. Une attention particulière sera portée au suivi des souris greffées (poids, protéinurie) et à la zone de chirurgie. Lors des chirurgies, les animaux sont injectés avec de la solution saline pour prévenir la déshydratation et un analgésique pour prévenir au mieux les douleurs inhérentes à la procédure de chirurgie. L’ensemble de la procédure de chirurgie est réalisé sur tapie chauffant et avec un champ opératoire et une désinfection préalable et post-chirurgie avec un antiseptique. Lors des mises à mort, une injection préalable de tranquillisant est réalisée pour limiter le stress au moment de la dislocation.
Choix des espèces
Le modèle murin permet une étude in vivo et permet de se rapprocher de la physiologie humaine. Il s'agit d'un prérequis indispensable à toute application de nos approches à l’Homme. De plus, l'utilisation de souris permet l'accès aux modèles transgéniques qui, ici, nous permettent de répondre à des questions précises. Les souris seront utilisées entre 8 et 16 semaines, soit à un stade de développement adulte (système immunitaire mature).
Évaluation de l’effet de composés sur la régénération de la myéline chez la souris modèle de sclérose en plaques
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Les souris paralysées par le modèle de sclérose en plaques peuvent être gardées jusqu'à trois semaines après l'apparition des premiers signes. 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères. Une partie subit une chirurgie de la moelle épinière de trente minutes pour qu'on y injecte un agent qui détruit la myéline, puis un traitement quotidien pendant quatre à dix-sept jours. Une autre est immunisée par quatre injections, ce qui installe une paralysie progressive des membres, une perte de poids et des difficultés à boire et à manger, pour évaluer des molécules censées régénérer la myéline, effet encore hypothétique quand la paralysie, elle, fait partie du protocole.
Objectifs
La sclérose en plaques (SEP) est une maladie inflammatoire du système nerveux central (cerveau, moelle épinière et nerfs optiques) du jeune adulte au cours de laquelle la gaine de myéline protégeant les axones est détruite (démyélinisation). Cette perte de myéline se traduit, à long terme, par des troubles sensitifs et moteurs (fourmillements, troubles de l’équilibre, troubles visuels, paralysies…). La SEP a une plus forte prévalence chez la femme (3/4 de femme) et touche plus de 100 000 personnes en France. Deux mille cinq cents nouveaux cas de SEP sont diagnostiqués chaque année. Cette maladie représente la première cause de handicap sévère non traumatique du jeune adulte. Elle est caractérisée par des épisodes inflammatoires et de démyélinisation pouvant affecter toutes les structures du système nerveux central. A ce jour, les traitements de la SEP ciblent uniquement la composante inflammatoire de la maladie mais ces traitements ont peu d’effets sur la remyélinisation (régénération de la gaine de myéline). Le développement de stratégies pharmacologiques visant à promouvoir la remyélinisation est donc un enjeu thérapeutique majeur pour le traitement de la SEP. L’objectif de ce projet vise à évaluer l’effet de molécules au potentiel myélinisant prometteur, dans des modèles murins de la sclérose en plaques.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but d’évaluer l’effet de composés potentiellement capable de favoriser la régénération de la gaine de myéline endommagée. A terme, les résultats de ce projet pourraient permettre d’identifier une ou plusieurs molécules candidates permettant d’augmenter significativement la remyélinisation et donc de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement de la sclérose en plaques. En effet ces traitements induisant une régénération de la gaine de myéline pourraient venir compléter les traitements actuels qui agissent principalement sur la composante inflammatoire de la maladie, et ainsi aboutir à une prise en charge plus globale de la sclérose en plaques.
Procédures
Nous utiliserons deux modèles expérimentaux de la sclérose en plaques chez la souris, afin d’évaluer le potentiel thérapeutique de plusieurs molécules candidates. Le premier modèle consiste pour chaque animal en une injection d’un agent induisant une lésion de la myéline, au cours d’une chirurgie sous anesthésie générale et analgésie adaptée. Cette intervention dure environ 30 minutes et n’est réalisée qu’une fois par animal. Les animaux seront ensuite traités quotidiennement de 4 à 17jours avec les molécules d’intérêt (durée inférieure à 1 minute pour chaque administration). Le deuxième modèle est un modèle complémentaire où la perte de myéline est induite par immunisation. Pour cela les animaux recevront, sous anesthésie générale, 2 injections (durée inférieure à 1 minute par injection) et 2 injections espacées de 2 jours (durée inférieure à 5 minutes par injection). Pour cette partie de l’étude, les animaux vigiles seront traités quotidiennement durant 2 semaines avec les molécules d’intérêt (durée inférieure à 1 minute pour chaque administration). L’ensemble des animaux sera euthanasié par une méthode réglementaire afin de réaliser des prélèvements d’intérêt.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les animaux lors des procédures sont liées à la chirurgie et à l’immunisation. Lors de la chirurgie nécessaire à la réalisation de lésions de la moelle épinière, les risques sont l’hypothermie, des lésions musculaires, des saignements et des douleurs post-opératoires légères durant 48 heures. Pour l’immunisation: plaie au site d’injection, paralysie progressive et temporaire des animaux, suite à l’installation du modèle entrainant des difficultés à se déplacer et à s’abreuver. Les injections et le traitement peuvent entrainer respectivement un hématome au site d’injection et une irritation des voies supérieurs si le traitement est répété. La mise en place de notre modèle de lésion de la moelle épinière impliquera une chirurgie et une anesthésie générale. L’anesthésie sera associée à une hypothermie, une sécheresse oculaire et un risque de dépression cardiorespiratoire. La chirurgie pourra entrainer une douleur et un inconfort post-opératoire durant 48 heures environ. Le modèle d’immunisation peut entrainer une paralysie progressive et temporaire des animaux, une perte de poids et des difficultés pour se nourrir et s’abreuver à partir de 10 jours environ après l’immunisation. Les animaux seront gardés maximum 3 semaines après l’apparition des premiers signes cliniques liés à ce modèle. Des lésions cutanées peuvent également survenir suite aux injections (en lien avec le produit injecté pour l’immunisation). Les administrations de composés d’intérêt pourront générer un stress et une brève et légère douleur. Les injections des composés pourront entrainer l’apparition d’hématome ou d’induration au site d’injection. Les gavages répétés pourront être associés à une irritation des voies supérieures.
Devenir
Une analyse post mortem de tissus d’intérêt est nécessaire pour évaluer le potentiel des molécules testées dans les deux modèles ; cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux.
Remplacement
Après des essais préalables sur différents modèles cellulaires, seuls les meilleurs candidats seront retenus. Il sera ensuite nécessaire de recourir à un modèle animal pour évaluer l’effet des composés sur un organisme entier. Seul le modèle animal est pertinent pour cette étude car nous pouvons ainsi analyser l’effet de ces molécules dans un contexte in vivo reproduisant le mieux les caractéristiques des lésions observées dans la pathologie humaine.
Réduction
Des études seront menées en amont afin de raffiner et réduire au maximum le nombre de souris utilisées (détermination des doses à administrer par exemple). Les modèles de la pathologie qui seront utilisés ont déjà démontré leur pertinence pour l’analyse des mécanismes de réparation des lésions de la myéline et de la composante inflammatoire observée dans la maladie. Ils sont bien connus et reproductibles permettant donc l’évaluation de l’efficacité de composé. Le nombre d’animaux (600 au total) est limité au strict nécessaire pour obtenir des données statistiquement exploitables.
Raffinement
Pour éviter toute souffrance aux animaux durant les procédures, ils seront sous anesthésie générale et analgésie pendant toutes les interventions qui le nécessitent. Les animaux seront suivis régulièrement par les utilisateurs ainsi que par le vétérinaire. Ils seront hébergés dans une animalerie agréée dans des conditions de température et d’hydrométrie conformes à la réglementation. De plus, ils seront hébergés en groupe et bénéficieront d’un enrichissement de leur environnement (un nid et un bâton de bois à ronger). Durant nos procédures expérimentales nous assurerons une surveillance adaptée en fonction des étapes, telle qu’une surveillance rapprochée en période post-chirurgicale et lors de l’expression des signes cliniques de notre modèle d’immunisation. Nous apporterons un soutien nutritionnel aux animaux lorsque nécessaire pour faciliter leur accès à la nourriture et à l’eau. Nous nous assurerons que l’état général des animaux soit compatible avec l’administration des composés à évaluer avant de commencer les traitements. Pour ces composés, nous vérifierons les données de d’études précédentes pour nous assurer de choisir les bonnes conditions d’administration et l’absence de toxicité attendue avant de les utiliser chez nos animaux. Pour toutes nos procédures, des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale.
Choix des espèces
La souris, grâce à sa forte homologie génétique avec l’homme, est un modèle de choix pour l’étude de nombreuses pathologies humaines. Dans le cadre de l’étude de la sclérose en plaques il existe 2 modèles bien connus et caractérisés qui permettent de reproduire les caractéristiques de la pathologie. Ainsi, pour ce projet le seul moyen à notre disposition pour analyser le processus de réparation de lésions de la myéline est d’utiliser des modèles murins bien établis du processus de démyélinisation (destruction de la myéline) et remyélinisation (régénération de la myéline). Il nous est donc impossible de substituer ces travaux par d’autres méthodes n’utilisant pas les animaux, et plus précisément la souris. Les animaux utilisés seront âgés d’au moins 12 semaines, afin d’avoir atteint une maturité suffisante du système nerveux central (jeunes adultes). De plus à ce stade du développement, la chirurgie est facilitée par la relative faible masse musculaire et de tissus graisseux des animaux, permettant ainsi une meilleure accessibilité à la moelle épinière lors de la chirurgie.
Rôle des plaquettes sanguines et de leur vesicules extracellulaire dans les maladies métaboliques hépatiques (EU (1/2))
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
2 184 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune pouvant enchaîner sept prises de sang sur animal éveillé, des injections dans l'orbite de l'œil et soixante-douze heures seule dans une cage métabolique de 500 cm2. Elles reçoivent des régimes hypercaloriques ou privés de méthionine et de choline, et sont mises à jeun huit à seize heures avant les tests de tolérance. Le porteur qualifie les perturbations du métabolisme hépatique ainsi provoquées de "non dommageable pour la souris", alors que le projet vise justement à installer une maladie hépatique métabolique. Une partie des souris est tuée trente minutes après une injection, le sang étant chassé de leurs vaisseaux par une perfusion dans le cœur, pour mesurer la perméabilité de ces vaisseaux.
Objectifs
Les maladies hépatiques métaboliques sont des conséquences hépatiques du syndrome métabolique. Elles peuvent rester asymptomatiques mais aussi évoluer vers une cirrhose et un cancer du foie avec un taux de survie de 10% sur 5 ans.Les maladies hépatiques métaboliques représentent un problème majeur de santé publique à l’échelon mondial. L'organisation mondiale de la santé les catégorise actuellement comme la cause numéro une des maladies hépatiques dans les pays occidentaux. Même si les maladies métaboliques hépatiques sont étroitement liées à l’obésité et au syndrome métabolique, les causes des maladies métaboliques hépatiques ne sont pas les mêmes chez tous les patients et demeurent actuellement en grande partie non élucidée, ce qui complique la prévention et la prise en charge de ces maladies. Comment les plaquettes sanguines et leur vésicules extra-cellulaires, acteurs clés du maintien de l’intégrité vasculaire, peuvent réguler l’installation des maladies métaboliques hépatiques est une question très intéressante et novatrice et aborde un problème médical important sous un angle à la fois moléculaire et de physiopathologie intégrée. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs.
Bénéfices attendus
Ces résultats devraient permettre de mieux appréhender le rôle et l’impact des plaquettes dans les maladies métaboliques hépatiques et ses conséquences. Ces résultats apporteront donc des informations à la fois fondamentales dans la connaissance de la physiopathologie hépatique et aideront à évaluer l’intérêt thérapeutique de cibler les plaquettes pour prévenir les maladies métaboliques du foie.
Procédures
La souris sera soumise à différents régimes alimentaires (hypercalorique et/ou déficients en méthionine ou/et choline) (réalisé dans l'Etablissement Utilisateur (EU) 1/2). La souris sera mise à jeun (8h ou 16h) pour les tests de tolérance (réalisé dans EU 1/2). La souris sera soumise à des procédures avec des injections sur souris vigiles ou anesthésiées (plusieurs injections successives par souris de quelques secondes) (réalisé dans EU 1/2). Sept prélèvements sanguins de 30 secondes sur souris vigile (réalisé dans EU1/2) et une prise de sang terminale sur la souris anesthésiée (d’une durée environ de 2 min) seront réalisées (réalisé dans EU1/2 ou 2/2 en fonction de l’expérimentation réalisée avec le sang et les organes prélevés). Pour l'évaluation du métabolisme in vivo, la souris sera isolée individuellement en cage métabolique d’une surface de 500cm2 sur une durée de 72h (réalisé dans EU 1/2). Pour l'évaluation de la structure et perméabilité des vaisseaux sanguin : une seule injection (injection d'une durée de quelques secondes) sera réalisée sur la souris anesthésiée suivie de la mise à mort de la souris 30 minutes après suite à une anesthésie générale et antalgie locale et une perfusion intra-cardiaque (EU 2/2).
Impact sur les animaux
La mise en régime hyperlipidique de la souris induit : une prise de poids pour la souris et des perturbations du métabolisme hépatique non dommageable pour la souris. Les actions suivantes vont induire un stress modéré et un inconfort des animaux : injections intra-orbitaire et intra-péritonéale (durée : 30 sec), mise en isolation de 72h pour les mesures de calorimétrie indirecte, test de tolérance (induction d’hyerglécemie et d’hypoglycémie et prise de sang) (durée 2h).
Devenir
La souris sera euthanasiée suite à un prélèvement sanguin terminal à la veine cave ou suite à l’isolement dans les cages métaboliques de 72h qui ne permettra pas de réaliser en suivant d’autres mesures métaboliques.
Remplacement
Les effets pléiotropes dans un contexte d’hémostase et thrombose et de maladies métaboliques hépatiques font intervenir des fonctions et types cellulaires multiples dans l’organisme non modélisables à ce jour par des approches in vitro. Le recours à l’expérimentation animale est donc l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiopathologiques dans un contexte intégré.
Réduction
Plusieurs résultats seront obtenus avec un seul animal. Nous limiterons aux seules expériences considérées comme absolument indispensables. Nous utiliserons 6 à 8 animaux par groupe en fonction de la procédure (nombre minimum nécessaire déjà défini par des expériences déjà réalisées au laboratoire). Ce nombre a été estimé en fonction des tests statistiques qui seront utilisés. Les paramètres évalués seront analysés par une analyse de variance.
Raffinement
Le suivi des souris sera réalisé 2 fois par jour par les zootechniciens et l’expérimentateur et un calcul de score général sera réalisé. En fonction du score général, une surveillance accrue est nécessaire. De l’aliment hydraté sera mis à disposition dans la cage. Du papier sopalin, du carton et/ou des cubes de bois seront rajoutés dans la cage. Des soins/désinfections seront prodigués à la souris. La souris peut être aussi momentanément séparée de ces congénères. Si l'animal atteint le point limite : mise à mort par l’expérimentateur ou par le service de zootechnie. Toutes les procédures invasives utilisent des analgésiques généraux ou locaux. Certains animaux seront transportés à pied selon un tracé bien défini de 5 minutes dans leur cage d’origine placée dans des sacs isotherme de transports à raison de 2 cages par sac de transport. Ceci permet de réduire le stress des animaux car dans l’obscurité et à une température contrôlée. Tout animal faible ou malade ne sera pas transporté et mis à mort avant transport par dislocation cervicale. Les animaux sont ensuite placés dans la salle d’expérimentaion pour une acclimation de 2 h avant l’expérimentation.
Choix des espèces
Nous utilisons des modèles murins car nous disposons de modèles de souris génétiquement modifiées ainsi que d'outils pharmacologiques commercialement disponibles et couramment utilisés pour modifier le compte plaquettaire chez la souris. Les modèles de drosophiles ou de poissons zèbres ne sont pas utilisables dans le contexte de ce projet de recherche car les plaquettes sanguines sont phénotypiquement et mecanistiquement très différentes de celles de l'Homme, ce qui n'est pas le cas chez les rongeurs. Nous utiliserons des souris de 10 à 12 semaines (âge adulte, système cardiovasculaire et métabolique mature).