Souris
Régulation de la distribution leucocytaire par un récepteur activateur porté par les macrophages
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
L'extrémité de la queue coupée aux ciseaux chirurgicaux, des injections dans le ventre et quatre prises de sang espacées de trois à quarante-huit heures : 1 144 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue pour analyse post-mortem, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. Les nouveau-nés reçoivent une administration à deux et trois jours de vie, les plus âgées une administration par semaine. L'objectif tient en une phrase : tester le rôle d'un récepteur porté par des cellules immunitaires dans la répartition de ces cellules dans le corps. Ce qui est administré n'est jamais nommé, le gavage apparaît parmi les nuisances sans figurer parmi les procédures, et l'effectif de 1 144 animaux n'est adossé à aucun chiffre.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de tester le rôle d’un récepteur porté par des cellules immunitaires dans la distribution des cellules immunitaires dans le corps.
Bénéfices attendus
Ces résultats apporteront à court terme des données importantes sur le rôle d’un récepteur nommé RANK dans la distribution des cellules immunitaires entre les organes immunitaires et les tissues via le sang. Etant donné que la restriction du mouvement des lymphocytes s’exploite pour le traitement de maladies inflammatoires, ces résultats auront des retombées à long terme sur des applications biomédicales dans le traitement de maladies inflammatoires.
Procédures
Des souris nouveau-nés sont soumises à une administration à jour 2 et à jour 3 (durée < 1 min). Des souris juvéniles adultes sont soumises à une administration hebdomadaire (durée < 1 min). Les souris adultes sont soumises à une injection (durée < 1 min) par voie intrapéritonéale et à des prélèvements sanguins répétés. Chaque intervention est de courte durée (< 1 min) avec un potentielle douleur légère ne nécessitant pas d’anesthésie. Des prélèvements sanguins sont effectués 4 fois, avec un intervalle de 3h à 48h, chaque prélèvement dure quelques secondes.
Impact sur les animaux
Une douleur légère de courte durée peut être ressentie par l’animal lors du prélèvement de l’extrémité de la queue à l’aide d’une paire de ciseaux chirurgicale. Le geste dure moins d’une minute par animal. Le gavage, l’injection par voie intrapéritonéale et la prise de sang par la veine caudale peuvent être source de stress et de l’anxiété pour l’animal pendant quelques secondes.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux à fin du projet pour analyse post-mortem.
Remplacement
Il n’est pas possible de remplacer les animaux car les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant la distribution des cellules du système immunitaire dans le corps ne peuvent pas, à l’heure actuelle, être étudiés de manière reproductible et juste par des expériences en culture cellulaire.
Réduction
Les sites et la fréquence des interventions ont été choisis de manière à pouvoir diminuer la variabilité inter-expérimentale. Le nombre d'animaux par groupe a été défini afin d’utiliser le minimum d’animaux tout en assurant l’obtention de résultats statistiquement significatifs.
Raffinement
Les souris sont hébergées en groupe social dans une animalerie agrée avec un statut sanitaire contrôlé. Elles sont hébergées dans des cages enrichies par fratrie tout en respectant le nombre de souris admises. Si un animal devient agressif, il est aussitôt séparé du groupe. Les souris sont observées quotidiennement par un personnel expérimenté avec une mise en place de points limites évalués à l’aide d’une grille d’observation de critères définis. Des actions prévenant un possible stress ou inconfort sont entrepris. Les point limites ont été mis en place et seront appliqués.
Choix des espèces
Le modèle murin a été choisi pour connaitre la régulation de la distribution des cellules du système immunitaire entre les différents tissues via le sang et de mieux comprendre la fonction d’un récepteur dans ce contexte. Ce projet nécessite alors une bonne connaissance des mécanismes de contrôle de la distribution qui sont bien connues chez la souris et en plus semblent identiques à l’homme. De plus, la souris étant bien étudiée du point de vue génétique, est un très bon modèle d’étude pour ces travaux qui reposent sur des modifications génétiques. Les souris sont étudiées à un âge où le système immunitaire est mature (à partir de 4 semaines). Des nouveau-nés ont également été choisis, pour mieux intervenir dans le développement du système immunitaire.
Étude de l’efficacité de vaccins viraux dans un modèle orthotopique de cholangiocarcinome murin
- Recherche fondamentale
- Oncologie
5 296 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection de trois vecteurs qui déclenche un cancer des voies biliaires, puis jusqu'à seize échographies sous anesthésie et trente-deux passages en résonance magnétique sur animal éveillé, auxquels s'ajoutent des vaccins viraux et jusqu'à six traitements de chimiothérapie ou d'immunothérapie. Le porteur annonce une cachexie, une fièvre passagère et un risque de péritonite lié aux injections répétées, et précise qu'aucun médicament de confort ne sera donné pendant les expériences pour ne pas brouiller les résultats immunitaires. Il conclut à l'impossibilité de mener cette étude autrement qu'in vivo, faute d'autre modèle permettant d'évaluer une vaccination et ses mécanismes immunitaires.
Objectifs
Le but de ce projet est d’évaluer l’efficacité de vaccins viraux comme nouvelle approche à la fois prophylactique et thérapeutique du cholangiocarcinome, un cancer agressif et encore mal pris en charge qui affecte les voies biliaires. L’objectif est de stimuler le système immunitaire afin, non seulement, de prévenir l’apparition de la tumeur, mais aussi de limiter sa progression et d’améliorer la réponse aux traitements existants.
Bénéfices attendus
Le cholangiocarcinome est le second cancer du foie en fréquence avec une incidence de 1.5 sur 100.000 habitants en Occident. Il présente l’un des pronostics les plus sombres, avec moins d’un patient sur cinq encore en vie après cinq ans, en raison notamment d’un arsenal thérapeutique actuel peu efficace. Ce projet nous permettra de valider une nouvelle stratégie pour la prévention et le traitement du cholangiocarcinome.
Procédures
Toutes les souris seront soumises à une injection de 3 vecteurs pour l’induction tumorale (1 minute par souris vigile, 1 fois). Toutes les souris seront soumises à des examens par: échographie sous anesthésie (10 minutes par animal, 1 fois par semaine, 16 fois maximum) et résonance magnétique nucléaire sur animal vigile (2 minutes par animal, 2 fois par semaine, 32 fois maximum). Toutes les souris seront soumises à des injections pour la vaccination virale (pour un maximum de 2 au total, une minute par souris par jour, la moitié sous anesthésie). Une partie des souris sera soumise à des traitements de chimiothérapie et/ou immunothérapie (pour un maximum de 6 au total, moins d’une minute par souris vigile).
Impact sur les animaux
L’induction tumorale peut conduire à des effets indésirables (cachexie) et peut induire une gêne chez l’animal. L’anesthésie peut induire de l’hypothermie et de la détresse respiratoire. L’administration de virus pourrait induire une fièvre transitoire. Les traitements de chimiothérapie et immunothérapie peuvent entrainer une perte d’appétit et donc une perte de poids chez la souris. Les injections peuvent induire une douleur légère (éventuellement accompagnée d’une irritation au niveau du site d’injection) et un risque de péritonite associé aux administrations fréquentes. Les sites d’injections peuvent s’infecter. La manipulation et la contention des animaux peut induire un stress.
Devenir
Tous les animaux à la fin de la procédure seront euthanasiés selon une méthode réglementaire. La procédure requiert l’injection de cellules tumorales, ce qui implique l’impossibilité de garder les souris en vie à la fin de l’expérience. De plus, des analyses seront effectuées sur tissus et organes post-mortem.
Remplacement
Cette étude consiste à évaluer l’efficacité prophylactique et/ou thérapeutique de vaccins viraux dans un modèle de cholangiocarcinome orthotopique. Ces vaccins viraux ont été développés, in vitro, par clonage de 13 antigènes identifiés (ex vivo) par des analyses immunopeptidomiques et immunologiques complémentaires. Cette étude peut être conduite seulement in vivo car il n’y a pas d’autres modèles pour pouvoir étudier l’efficacité de la vaccination virale et ses mécanismes, notamment immuno-dépendants, vu sa complexité.é.
Réduction
Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 5296 souris. Pour sa réalisation, des groupes de 16 souris (8 femelles et 8 mâles) seront utilisés afin de garantir une évaluation statistique robuste des effets analysés. Nous appliquerons des tests statistiques appropriés pour comparer l’effet étudié entre les groupes, les croissances tumorales et la survie des animaux. Dans un souci de réduction du nombre des animaux contrôles, nous chercherons à regrouper les expérimentations lorsque cela est possible. Le nombre d’animaux pourra être réduit à la baisse si les hypothèses sont validées au cours des premières expériences. Il est prévu de réaliser une veille bibliographique attentive et continue afin de vérifier que les expériences planifiées n'ont pas déjà été rapportées dans la littérature scientifique existante. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux seront soumis à 7 jours d’acclimatation dès leur arrivée dans la structure. Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification, bâtons à ronger et tunnels en cartons). Les souris seront soumises à un suivi quotidien afin d’évaluer leur niveau de stress et leur poids sera mesuré une fois par semaine tout au long de l’expérience de croissance tumorale. Les critères définis pour atteindre un point limite seront strictement appliqués, et les souris seront euthanasiées à la fin de l’étude ou en cas d’atteinte de ces points limites préétablis. Toutes les interventions seront effectuées par des personnes expérimentées et éloignées des animaux hébergés. Toutes les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (anesthésie, tapis chauffants, ...). Aucune médication supplémentaire ne sera administrée au cours des expériences, car les effets secondaires sur le système immunitaire pourraient interférer avec les résultats.
Choix des espèces
Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques et éthiques : - Notre structure utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est le modèle animal le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Selon les procédures, les animaux seront utilisés à partir de 6 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et un système immunitaire efficient.
Effet de croquettes formulées à base d’huiles gélifiées sur la prise alimentaire et sa régulation chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
Faire accepter à des souris des croquettes fabriquées avec de l'huile de colza gélifiée, pour remplacer un jour les graisses solides des margarines et des pâtes à tartiner : 28 souris vont être utilisées pour ce test d'appétence, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles passent quatre semaines sous ce régime et sont pesées douze fois, avant de recevoir une injection d'anesthésiques dans le ventre pour qu'on leur prélève du sang au cœur. Le porteur écrit ne pas vouloir les utiliser "uniquement pour tester l'appétence des croquettes" et greffe donc au protocole des mesures du métabolisme et de l'inflammation. L'essai chez l'humain est écarté pour un motif réglementaire, les deux gélifiants n'étant pas encore autorisés sur le marché.
Objectifs
Aujourd’hui, pour donner une texture solide à certains aliments mous (pâtes à tartiner, margarines), l’industrie agroalimentaire utilise des graisses dites « saturées » ou « trans ». Or, ces graisses sont mises en cause dans l’augmentation du risque cardiovasculaire, et leur consommation est de plus en plus encadrée par les autorités sanitaires. Il est donc essentiel de trouver des alternatives plus saines, capables de conserver la texture des produits. Les oléogels représentent une piste intéressante. Ils consistent à transformer une huile végétale liquide (ici l’huile de colza, reconnue pour ses bénéfices santé grâce à sa richesse en oméga-3) en une matière solide grâce à de petites molécules appelées oléogélateurs. Dans ce projet, deux oléogélateurs (nommés X et Y) sont testés. Cette étude pilote a deux objectifs : Objectif principal : Vérifier si les souris acceptent bien des croquettes fabriquées avec différentes formules d’huiles gélifiées. C’est un point essentiel, car il permettra de choisir, pour une étude plus large par la suite, la ou les croquettes les plus adaptées. Deux types de croquettes seront comparés : des croquettes à base d’huile de colza gélifiée par les oléogélateurs et des croquettes à base d’un mélange d’huile de colza et d’huile de palme gélifiées par les oléogélateurs (pour voir si l’ajout d’une huile naturellement solide change l’acceptabilité des croquettes). Objectif secondaire Comme nous ne voulons pas utiliser ces 28 animaux uniquement pour tester l’appétence des croquettes, nous allons profiter de l’étude pour observer si les oléogélateurs ont des effets positifs sur la santé, notamment s’ils influencent la régulation de l’appétit ainsi que des paramètres liés au métabolisme et à l’inflammation. L’oléogélateur X sera évalué à deux doses car sa tenue à la cuisson et sa texture finale varient selon la quantité utilisée. L’oléogélateur Y sera testé à une dose uniquement car à faible dose il ne résiste pas à la température de fabrication des croquettes. Chaque molécule sera utilisée pour gélifier soit uniquement de l’huile de colza, soit un mélange colza/palme, afin de comparer l’acceptabilité de deux stratégies : solidifier une huile liquide seule ou solidifier un mélange déjà partiellement solide.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de remplacer les graisses solides par des alternatives plus saines qui peuvent aussi donner une texture ferme aux lipides : les oléogels. Si les résultats de cette étude sont positifs, une deuxième phase sera lancée chez la souris pour rechercher les effets bénéfiques de ces régimes contenant des oléogels sur la santé, notamment sur l’inflammation et le fonctionnement du métabolisme des graisses. À long terme, ces molécules pourraient être utilisées dans l’industrie alimentaire pour fabriquer des produits comme les margarines ou les pâtes à tartiner, tout en améliorant leur qualité nutritionnelle et en réduisant les risques pour la santé.
Procédures
Les 28 souris de l’étude seront nourries avec des croquettes expérimentales contenant soit de l’huile de colza, soit un mélange d’huile de colza et d’huile de palme, gélifiés avec X ou Y tous les jours pendant 4 semaines consécutives, et pour le groupe contrôle avec les croquettes dites contrôles (c’est-à-dire formulées avec les mêmes ingrédients de base que les croquettes contenant les huiles). Les 28 souris seront pesées tous les lundis, mercredis et vendredis pendant 4 semaines (12 pesées par souris, durée du geste 30 secondes). Les 28 recevront une injection dans le ventre d’un mélange de produits anesthésiques afin de prélèver du sang (une injection par souris, durée du geste 30 secondes contention de l’animal comprise)
Impact sur les animaux
Les principales sources possibles d’inconfort pour les animaux dans ce protocole sont les suivantes : • Le régime alimentaire pourrait ne pas être appétent, ce qui peut entraîner une diminution de la consommation, une perte de poids et donc un certain stress pour l’animal. • Les manipulations répétées, comme les pesées tous les deux jours, peuvent causer un stress temporaire. • L’anesthésie par injection dans le ventre, réalisée à la fin de l’étude pour le prélèvement de sang, peut provoquer un stress et une douleur passagers. À noter que les huiles végétales et les gélifiants utilisés dans les régimes ne sont pas connus pour avoir des effets nocifs chez la souris.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de pouvoir prélever du sang et les tissus d'intérêt qui seront analysés par la suite.
Remplacement
Pour savoir si les régimes sont bien acceptés, il est important de mesurer avec précision la quantité de nourriture consommée. Cela permet de vérifier si les régimes sont appétents. Pour l’instant, il n’est pas possible règlementairement de faire une étude chez l’Homme, car les oléogels X et Y ne sont pas encore autorisés sur le marché. C’est pourquoi les tests doivent être faits chez l’animal, afin d’évaluer à la fois l’acceptabilité des régimes et leurs effets bénéfiques possibles sur la santé.
Réduction
Les oléogels testés dans cette étude n’ont jamais été utilisés dans un régime alimentaire auparavant. Comme il s’agit d’une première phase de test, le nombre de souris a été volontairement réduit à 4 par régime, afin de limiter le nombre d’animaux tout en pouvant évaluer si les régimes sont bien acceptés. Chaque groupe de souris sera son propre point de comparaison, ce qui permet d’éviter de créer trop de groupes différents. Comme cette étude est exploratoire, le nombre d’animaux a été réduit à 4 animaux par groupe.
Raffinement
L’état général et le comportement des animaux seront observés 5 jours par semaine. Le poids et la quantité de nourriture consommée seront mesurés trois fois par semaine : le lundi, le mercredi et le vendredi. À la fin de l’étude, les souris seront profondément anesthésiées (injection dans le ventre d’un mélange de produits anesthésiques adaptés) afin de pouvoir réaliser un prélèvement de sang au niveau du cœur et ainsi être en mesure de doser différents marqueurs circulants de la régulation de la prise alimentaire et de l’inflammation. Des signes d’alerte précis et faciles à détecter ont été définis à l’avance pour éviter toute souffrance et assurer le bien-être des animaux pendant toute la durée de l’étude.
Choix des espèces
La souris est le modèle le plus adapté pour ce projet. En effet, la plupart des études dans ce domaine ont été réalisées chez la souris. Cela permet donc de comparer plus facilement nos résultats avec ceux déjà publiés. De plus, les souris sont connues pour accepter facilement les nouvelles croquettes, notamment celles riches en graisses, ce qui en fait un bon modèle pour tester l’acceptabilité de nouveaux types de graisses dans l’alimentation. Enfin, la souris est un modèle très pertinent, car son métabolisme lipidique est proche de celui de l’Homme. Les croquettes enrichies en huiles et en gélifiants seront données à des souris âgées de 7 semaines. À cet âge, elles ont fini leur croissance initiale et tolèrent bien un changement de régime. Cela permet aussi d’éviter que les effets du régime soient confondus avec ceux liés à la croissance (chez des jeunes) ou au vieillissement (chez des plus âgées).
Impact d’une infection à Listeria monocytogenes du cerveau sur l’immunité cérébrale et la neurodégénérescence. MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
Les souris dont le score d'encéphalite atteint 4, ou qui perdent plus de 20 % de leur poids, sont mises à mort. 1 474 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Une partie reçoit des Listeria directement dans le cerveau sous anesthésie, une autre subit l'induction d'une encéphalite auto-immune qui peut la paralyser sept à quinze jours, et un troisième groupe passe tous les quinze jours pendant sept mois un test de mémoire dans un labyrinthe et un test d'équilibre sur cylindre rotatif. L'identification de cibles thérapeutiques contre les troubles cognitifs qui suivent une infection cérébrale reste annoncée au conditionnel, quand la paralysie des membres et la perte de poids figurent, elles, au protocole.
Objectifs
Nous cherchons à définir l’impact que peuvent avoir les infections du système nerveux central sur la santé cérébrale après l’infection. En effet, les altérations du système immunitaire cérébral sont susceptibles de favoriser ou au contraire protéger le cerveau contre des dommages ultérieurs, notamment les maladies neuronales et neurodégénératives telles que la sclérose en plaques, la maladie d’Alzheimer ou la maladie de Parkinson. Ce projet permettra à la fois d’étudier comment s’effectue la réparation du système immunitaire cérébral après la résolution d’une infection ainsi que les mécanismes menant à une sensibilité accrue ou diminuée aux futurs dommages neuronaux.
Bénéfices attendus
Sur un plan des connaissances scientifiques, nous chercherons à déterminer les rôles respectifs du système immunitaire cérébral (microglie) et périphérique (monocytes provenant du sang) dans la réponse aux infections du système nerveux central, ainsi que leur rôle dans l’apparition de troubles cognitifs après l’infection. La comparaison des séquelles neurologiques induites en présence ou absence de la microglie et/ou des monocytes permettra de mettre en évidence le rôle de chacune de ces populations immunitaires dans les séquelles neurologiques apparaissant après la guérison de l’infection. Nous chercherons à mettre en évidence les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans l’apparition de ces troubles cognitifs, pour comprendre comment les cellules immunitaires ayant joué un rôle dans la résolution de l’infection cérébrale (microglie ou monocytes recrutés) peuvent ensuite adopter un phénotype dommageable pour le bon fonctionnement cérébral. L’identification de ces mécanismes permettrait de mettre en évidence des cibles thérapeutiques utiles dans le traitement des séquelles neurologiques post-infectieuses.
Procédures
Procédure 1 : les animaux seront soumis soit à un gavage sur animal vigile (durée d’environ 1 minute), soit à une injection intracérébrale (Y COMPRIS UNE INJECTION DANS LE CERVEAU) sous anesthésie générale (durée d’environ 10 minutes). Puis ils seront soumis à 3 injections d’antibiotiques par voie intrapéritonéale sur animal vigile (durée d’environ 30 secondes). Procédure 2 : les animaux seront soumis à un gavage sur animal vigile (durée d’environ 1 minute), puis ils seront soumis à 3 injections d’antibiotiques par voie intrapéritonéale sur animal vigile (durée d’environ 30 secondes). Un groupe expérimental se verra également administrer des anticorps en même temps que les injections d’antibiotiques (portant la durée d’injection à environ 1 minute). Ils subiront 1 injection cutanée et intrapéritonéale sous anesthésie gazeuse (générale, durée des 2 injections : environ 5 minutes) pour induire la réponse auto-immune, et une dernière injection intrapéritonéale (durée d’environ 30 secondes) pour achever l’induction de la réponse autoimmune, sur animal vigile. Procédure 3 : les animaux seront soumis à une injection intraveineuse sur animal vigile (durée d’environ 2 minutes). Puis ils seront soumis à 3 injections d’antibiotiques par voie intrapéritonéale sur animal vigile (durée d’environ 30 secondes). Un groupe expérimental se verra également administrer des anticorps en même temps que les injections d’antibiotiques (portant la durée d’injection à environ 1 minute). Ils seront soumis à des tests cognitifs tous les 15 jours pendant 7 mois, consistant en un test de mémoire (trouver la bonne sortie parmi plusieurs qui se ressemblent, un test durant environ 30 minutes) et un test moteur (rester le plus longtemps possible sur un cylindre rotatif, durée d’environ 15 minutes).
Impact sur les animaux
Dans l’ensemble des procédures l’infection induit un degré de souffrance : perte de poids, « sickness behaviour » et atteinte cérébrale qui peut parfois induire des paralysies des pattes des souris. Dans la procédure n°1, un niveau de douleur modéré sera à prendre en compte suite à l’inoculation intracraniale de bactéries, qui sera pris en charge par antalgiques. L'INJECTION DE LISTERIA MONOCYTOGENES DANS DES REGIONS CEREBRALES SPECIFIQUES PEUT INDUIRE DES TROUBLES NEUROLOGIQUES LIE AU SITE D'INJECTION. LES SOURIS SERONT SURVEILLEES QUOTIDIENNEMENT AFIN DE DETECTER TOUT SYMPTOME NEUROLOGIQUE GRAVE. Dans la procédure n°2, l’induction d’encéphalite autoimmune est susceptible d’engendrer une perte de mobilité par paralysie des membres, d’une durée variable entre 7 et 15 jours selon la littérature. Dans la procédure n°3, au cours du vieillissement des souris de souche 5xFAD on notera l’apparition de signes associés à la maladie d’Alzheimer tels qu’une perte de mémoire et des capacités d’interaction sociale diminuée. Ces troubles apparaissent progressivement, à partir de 6 mois d’âge environ.
Devenir
Les procédures nécessitent toutes une mise à mort des animaux à la fin de la procédure afin d’étudier leurs organes par diverses techniques. Il n’y aura donc pas d’animaux laissés en vie à la fin du projet.
Remplacement
L’étude de l’interaction entre le système immunitaire et le fonctionnement du système nerveux central nécessite un hôte animal car les mécanismes d’interaction entre ces 2 systèmes cellulaires complexes ne peuvent pour l’instant pas être modélisés in vitro. En particulier pour comprendre les séquelles induites par une infection et les conséquences à long terme, il est absolument nécessaire de mener les études dans un hôte animal qui est capable de régénérer les tissus altérés.
Réduction
Pour l’observation du comportement des animaux, nous suivrons dans le temps les mêmes individus, ce qui permet 1) d’augmenter la puissance statistique de l’étude et 2) éviter de mettre à mort un animal après un unique test comportemental (sauf pour le test du labyrinthe de Barnes car les animaux s’habituent à ce test au fil du temps) . Pour les études de la réponse immunitaire au sein du cerveau, le cerveau des souris disséquées sera séparé en 2 hémisphères, un hémisphère étant utilisé pour l’analyse histologique par immunofluorescence et l’autre pour la cytométrie en flux. Cela permettra de diminuer par 2 le nombre de souris nécessaire pour ces expériences. Afin de vérifier que les 2 hémisphères cérébraux ne réagissent pas de manière différente à l’infection nous vérifierons l’absence de différence entre les analyses effectuées sur les hémisphères droits et gauches. Nous utiliserons également des souches de Listeria monocytogenes dites « fortement neuroinvasive » qui induisent de manière très reproductible une infection du système nerveux central après gavage. Ceci permet de réduire le nombre d’animaux inoculés par rapport à l’inoculation des classiques souches de laboratoire de Listeria qui n’induisent une infection du système nerveux central que dans une petite proportion des animaux inoculés. Les effectifs des populations de souris auxquelles nous aurons recours sont établis en tenant compte des tests statistiques permettant d’obtenir une significativité du résultat obtenu (test de Mann-Whitney (deux groupes non appariés), Wilcoxon (deux groupes appariés) ou ANOVA (plus de deux groupes) pour les comparaisons de valeur avec faible effectif, se basant sur une distribution non gaussienne des résultats).
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupe, avec une litière appropriée et des matériaux de nidification. L’état général des animaux sera suivi. Les paramètres observés seront : poil ébouriffé, apparence corporelle/body condition, expression faciale/mouvement. Une aide à la thermorégulation sera mise en place dans toutes les cages pour éviter l’hypothermie : abri en carton, matériel de nidification (coton/papier) et chaufferettes. Une réhydratation par voie sous-cutanée (Ringer Lactate) et mise à disposition d’eau gélifiée sera entreprise pour les animaux présentant des signes de déshydratation (perte de poids >10%, pli cutané). Les animaux présentant un état pathologique trop avancé (score de 2 pour un paramètre de la grille proposée par le comité d’éthique, ou perte de poids supérieure à 20% du poids initial, ou un score d’encéphalite ≥ 4) seront mis à mort. LES ANIMAUX SERONT EGALEMENT MIS A MORT EN CAS D'APPARITION DE SYMPTOMES NEUROLOGIQUES GRAVES SUITE A UNE INJECTION CEREBRALE STEREOTAXIQUE ET CEUX POUVANT AUSSI EMPECHER UNE ALIMENTATION ET UN ABREUVEMENT EFFICACES. La douleur induite par l’injection intracrâniale sera limitée en injectant les souris avec un antidouleur (buprénorphine) avant et après l’injection, qui se fera sous anesthésie gazeuse et en appliquant un anesthésique local sur la zone à injecter. Le stress induit par l’encéphalite autoimmune (paralysie → difficulté d’accès à la nourriture, de thermorégulation, de nettoyage) sera limité en multipliant les source d’accès à la nourriture et à de la gélose hydratante au niveau du sol de la cage, ainsi qu’en chauffant les cages avec des chaufferettes pour aider la thermorégulation des souris. Les animaux seront pesés le jour précédant l’infection puis, au minimum, à partir du jour 3 quand les animaux commencent à perdre du poids du fait de l’infection. La pesée aux deux premiers jours ne sera pas systématique et dépendra de l’état apparent de l’animal. Cela permettra de limiter les manipulations à un moment où les animaux ne perdent pas de poids d’après notre expérience.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est un modèle de choix pour l’étude de la réponse immunitaire, un grand nombre d’outils et de lignées transgéniques ayant été développés pour étudier la réponse immunitaire des souris. Il s’agit également d’un bon modèle en neurosciences, les souris ayant certaines capacités cognitives suffisamment développées pour étudier l’impact que peuvent avoir les infections du système nerveux central sur des fonctions neuronales ciblées pour ce mammifère. Nous utiliserons des souris adultes, pour ne pas interférer avec les phénomènes de neurodéveloppement dans notre étude. Les souris adultes seront âgées de 2 à 9 mois, les plus âgées (6 à 9 mois) seront utilisées pour 1) le suivi à long-terme des conséquences de l’infection, et 2) pour étudier le phénomène de neurodégénerescence dans les souris 5xFAD qui commencent à développer des troubles à partir de l’âge de 6 mois.
Etude fonctionnelle des cellules souches hématopoiétiques modifiées génétiquement
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Les souris utilisées sont immunodéficientes, choisies pour leur incapacité à rejeter des cellules humaines. 1 120 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une greffe de cellules souches du sang humaines modifiées par thérapie génique, après un conditionnement qui leur fait perdre du poids, et un prélèvement sanguin qui peut leur léser un œil. La mise à mort sert à récupérer leur moelle osseuse et à mesurer si les cellules injectées s'y sont installées, l'enjeu déclaré étant d'évaluer la toxicité à long terme de ces modifications avant leur passage chez des patients.
Objectifs
Parmi les méthodes thérapeutiques modernes, on retrouve la greffe de cellules souches sanguines (CSH). Le but est de permettre l’installation de ces cellules dans la moelle osseuse des patients au sein de « niches », où elles pourront produire de nouvelles cellules fonctionnelles et saines nécessaires à la personne traitée. Ces cellules peuvent être modifiées par thérapie génique dans le but d’améliorer et de corriger leur activité. Il est cependant nécessaire d’évaluer l’impact et l’efficacité de ces modifications, d’autant qu’elles peuvent induire une toxicité non souhaitée pour les CSH. Cette étude vise à déterminer si les modifications sont toxiques à long terme.
Bénéfices attendus
Cette étude portant sur les greffons sanguins permettra de caractériser les modifications apportées aux CSH modifiées par thérapie génique ainsi que leurs capacités de greffe (survie, auto-renouvellement, différenciation). Ces connaissances seront appliquées afin de (i) optimiser les greffons de thérapie génique avant leur infusion aux patients, (ii) optimiser les protocoles d'expansion des greffons hématopoïétiques modifiés par thérapie génique, et (iii) d'évaluer le risque à long terme de la toxicité de la thérapie génique.
Procédures
Les souris utilisées dans ce projet seront anesthésiées avant d’être soumises à une greffe de cellules. Il s'agit d’injections réalisées en quelques secondes (minimum 5 secondes - maximum 90 secondes). Les injections se feront sur animaux vigiles (2 à 24h d’intervalle). Le suivi de la prise de greffe se fait par un unique prélèvement sanguin sous anesthésie (30 secondes).
Impact sur les animaux
Le conditionnement des souris induit une légère perte de poids (
Devenir
A l'issue de la procédure, il est nécessaire de récupérer les moelles osseuses des souris afin d'évaluer la prise greffe par les cellules injectées initialement. L'ensemble des souris est donc euthanasié afin de procéder à ces analyses et à l'obtention des résultats expérimentaux.
Remplacement
L’absence d’alternative à l’expérimentation animale pour l’ensemble de ces études est justifiée par le fait que la greffe des cellules souches du sang (« nichage » et développement chez l’hôte) fait intervenir des microenvironnements cellulaires et moléculaires extrêmement complexes et impossibles à reproduire en culture in vitro. Néanmoins, dans le cadre de ce projet, toutes les expérimentations in vitro (notamment analyses phénotypiques ciblant des populations cellulaires enrichies en CSH, analyse de la génotoxicité) seront réalisées chaque fois que possible en vue de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Réduction
Pour chaque greffon utilisé et pour chacune des conditions d’optimisation testées, le nombre d’animaux injectés a été fixé à 7, qui est le nombre minimum d’animaux pour avoir une significativité suffisante lors de la réalisation des tests statistiques. Afin d'éviter toute utilisation inutile d'animaux, les greffons sont testés pour leur contenu en cellules immatures (contenant potentiellement les cellules souches) sur des critères phénotypiques et/ou métaboliques afin d’estimer la qualité du greffon et d’éviter des injections inutiles en cas de greffons dont la qualité est jugée insuffisante.
Raffinement
Afin de respecter la notion de raffinement, le bien-être de nos animaux sera pris en compte de leur naissance à leur mort. Les souris recevront notamment de la nourriture enrichie dès le départ de l'expérimentation. Les souris seront hébergées en animalerie adaptée aux souris immunodéprimés, suivies quotidiennement pour détecter d’éventuels signes cliniques. Elles seront hébergées en conformité avec la réglementation en présence de leur congénères (à raison de 5 souris par cage) afin de maintenir leurs relations sociales. Les conditions d’hébergement sont adaptées à la forte immunodépression de ces animaux. De plus, chaque cage reçoit un enrichissement du milieu adapté pour entretenir le bien-être des animaux. L’ensemble des animaux recevront un traitement analgésique et/ou anesthésique prévu pour parer à toute souffrance ou stress, réfléchit pour chaque acte pratiqué. Les points limites ont été définis et appliqués pour le suivi de ces animaux. Notamment, la souffrance et la gêne des animaux seront évaluées à travers une grille de points limites adaptée permettant d’anticiper au plus tôt la souffrance des animaux et de mettre en place les procédures conservatoires adéquates.
Choix des espèces
Pour cette étude nous utiliserons des souris immunodéficientes. Cette souche de souris est très largement utilisée dans la recherche sur les cellules souches hématopoïétiques en raison de sa capacité à permettre la génération d'une hématopoïèse humaine à partir des cellules souches injectées Cette capacité est obtenue grâce à la forte immunodépression. Cette souche de souris représente donc un modèle pertinent et efficace pour l'étude et la mise en évidence de cellules souches humaines ; ce modèle permet d'extrapoler la greffe chez l'humain. Les souris seront utilisées à l'âge adulte de 8 à 12 semaines de vie. À cet âge la taille de la souris facilite la manipulation expérimentale et l´inoculation de cellules.
Évaluation de nouveaux traitements candidats pour le cancer du foie chez un modèle murin développant spontanément des carcinomes hépatocellulaires – MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Jusqu'à deux administrations par jour pendant vingt et un jours, cinq séances d'imagerie fonctionnelle de trente minutes sous anesthésie et une imagerie à rayons X par semaine : 480 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Les anesthésies gazeuses répétées peuvent gêner leur respiration et le gavage irriter leur œsophage, tandis que les tumeurs du foie qu'elles développent leur coupent l'appétit. Il s'agit de cribler des combinaisons de candidats médicaments sur des lignées qui produisent d'elles-mêmes un cancer du foie résistant aux traitements existants. Ces tumeurs n'apparaissant qu'entre la trentième et la quarantième semaine de vie selon le génotype, les souris atteignent cet âge avant d'entrer en procédure, et 80 d'entre elles, sorties sans tumeur, pourront être réutilisées dans un autre projet.
Objectifs
Le cancer du foie est le troisième cancer le plus mortel au monde. Sa prise en charge tardive et l’efficacité limitée de l’oncothérapie actuelle rendent inévitable l'acquisition d'une résistance aux médicaments et la formation de métastases, responsables du taux élevé de morbidité et de mortalité du cancer du foie. Il est donc urgent d'identifier des cibles et des combinaisons médicamenteuses puissantes et efficaces. Un modèle de souris unique génère spontanément un cancer du foie similaire au cancer humain en termes d’hétérogénéité des tumeurs, de résistance aux médicaments actuellement utilisés et d’interaction entre cellules cancéreuses et cellules immunitaires. Le modèle est également croisé avec d’autres souris, ce qui permet 1) d’avoir un modèle murin ayant les mêmes caractéristiques que les patients atteints de tumeurs du foie avec un type de mutation génétique spécifique ; 2) d’avoir un modèle où la fréquence et/ou le début de la formation des tumeurs est augmentée et/ou accélérée. Ainsi, ces modèles de souris de cancer du foie sont adaptés pour le criblage de nouvelles thérapies combinatoires dans un contexte de résistance aux médicaments actuellement utilisés. Le but de ce projet est d’évaluer de nouveaux candidats médicaments qui permettraient une meilleure réponse au traitement des tumeurs.
Bénéfices attendus
La détection et le traitement précoce du cancer du foie, ainsi qu’un suivi rigoureux, contribuent à augmenter l’efficacité des traitements. L’évaluation de nouveaux candidats-médicaments permet d’augmenter les taux de réponses et de cibler un maximum de la population atteinte du cancer du foie et ainsi de réduire le nombre de décès par an provoqués par ce cancer.
Procédures
Les animaux auront des imageries à rayons X (durée 4 minutes, sous anesthésie) une fois par semaine au maximum et des imageries fonctionnelles permettant de suivre le métabolisme ou la vascularisation(5 fois sur 21 jours, durée maximum de 30 minutes par imagerie, sous anesthésie). Une partie des animaux aura des administrations de candidats médicaments soit par injections soit par voie orale (maximum 2 fois pas jours pendant 21 jours, durée en moyenne 1 à 2 minutes, sur animal vigile en contention) et certain auront des prélèvements sanguins au niveau de la queue (2 fois maximum, sous anesthésie, 2min). Une partie des animaux aura une injection dans la veine de la queue une seule fois au début. Ce geste durera en moyenne 5 minutes.
Impact sur les animaux
Au cours du projet, les animaux sont passibles d’expérimenter ce qui suit : (1) Douleur et inconfort : l’apparition spontanée de tumeurs du foie peut engendrer une diminution de l’appétit chez l’animal, conduisant à une perte de poids et à une augmentation du stress. Les traitements réalisés sur les animaux vigiles peuvent entraîner des petites plaies cutanées au niveau des points d’injections. De mêmes, les prélèvements sanguins réalisés au niveau de la veine de la queue peuvent engendrer des petites plaies cutanées. (2) Les anesthésies gazeuses répétées peuvent entrainer des difficultés respiratoires lors de l’anesthésie, ainsi que des difficultés d’endormissement et de réveille au cours du temps. (3) l’administration des traitements par gavage peut entrainer du stress dû à la contention quotidienne et une irritation de l’œsophage. MODIFICATION : Concernant la technique d’injection hydrodynamique dans la veine de la queue, les nuisances supplémentaires attendues sont des petites plaies cutanées au niveau de la queue et l’apparition de tumeur du foie peut engendrer une diminution de l’appétit chez l’animal conduisant une perte de poids et une augmentation du stress.
Devenir
Tous les animaux qui iront au bout des procédures seront mis à mort afin de récupérer les tissus d'intérêts et de pouvoir compléter l’études avec des expérimentations biologiques, biochimiques et moléculaires. Les animaux qui n'auront pas généré de tumeurs qui seront sortis du projet en bonne santé pourront être réutilisés dans un autre projet.
Remplacement
Des stratégies sont mises en place pour limiter l’utilisation des animaux : (1) Les études préliminaires sont réalisées sur des cellules et des mini-tumeurs en culture pour identifier les mécanismes clés et les cibles. (2) Seuls les traitements prometteurs sont ensuite testés sur des organismes vivants pour confirmer leur efficacité dans un contexte physiologique. Ce projet final nécessite un organisme entier : des souris génétiquement modifiées, qui est le modèle le plus adapté pour étudier les effets des traitements sur les tumeurs du foie.
Réduction
Dans cette étude, nous utiliserons des appareils d'imagerie adaptés à la taille des rongeurs, comme des scanners ou des caméras spécialisées, similaires à ceux utilisés chez les patients. Ces outils permettent de suivre l'évolution des animaux, notamment la croissance des tumeurs, sur plusieurs semaines et de recueillir différentes mesures. Cela réduit le nombre d'animaux nécessaires tout en obtenant des résultats fiables. Pour limiter davantage le nombre d'animaux, nous avons calculé qu’un maximum de 10 par groupe suffira pour garantir des données exploitables. Enfin, chaque animal sera étudié au maximum en réalisant des analyses supplémentaires sur leurs tissus (foie, tumeurs) après l’étude.
Raffinement
Les injections intraveineuses et les séances d’imagerie se feront sous anesthésie générale gazeuse pour minimiser le stress des animaux et permettre un réveil rapide. Les souris anesthésiées seront toujours placées sur un tapis ou lit chauffant avec contrôle de la température pour éviter l’hypothermie. Avant les traitements, une semaine d’habituation à la contention sera réalisée pour réduire leur stress. Les traitements nécessitant un gavage seront effectués avec une sonde vétérinaire adaptée, à embout arrondi, pour protéger l’œsophage et l’estomac. La technique « d’administration de médicament guidée par micropipette » sera utilisée si possible : les souris apprendront à boire du lait concentré, puis le médicament y sera mélangé, évitant ainsi le stress de la contention. Les souris, qui développent spontanément des tumeurs hépatiques et parfois des métastases pulmonaires, seront suivies par scanner et imagerie spécialisée. Une fois les tumeurs détectées, leur évolution sera surveillée chaque semaine. Les animaux seront observés quotidiennement par du personnel qualifié. En cas de signe de souffrance (difficulté à respirer, isolement, perte de poids), des compléments alimentaires ou des soins adaptés seront apportés. Si la situation ne s’améliore pas ou si la perte de poids dépasse 20 %, l’animal sera retiré du protocole et euthanasié rapidement pour éviter toute souffrance inutile. Les souris seront hébergées en groupes (5 maximum par cage), avec accès libre à la nourriture et à l’eau, dans des conditions enrichies (dômes, tubes, bâtons à ronger, matériaux pour faire un nid) et un cycle jour/nuit de 12 heures. Cela permet de limiter les comportements répétitifs et de favoriser leur bien-être.
Choix des espèces
Les modèles de souris générés et étudiés : 1) récapitulent l’hétérogénéité du cancer du foie chez les patients ; 2) permettent de tester de nouvelles thérapies. Ils représentent par conséquent un modèle d’une grande valeur d’un point de vue expérimental pour mieux comprendre le cancer du foie et ainsi évaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour cette maladie humaine. Pour étudier la formation et l'évolution de tumeurs dans le foie et des tumeurs secondaires dans le poumon, les souris seront utilisées au stade adulte. Pour les tumeurs spontannées, les premières tumeurs apparaissent entre 30 ou 40 semaines en fonction du génotype de souris utilisé. Elles sont donc utilisées à partir de ces stades. Concernant le modèle par injection, les souris seront utilisées au stade adulte (2 mois) afin d'évaluer l'initiation et l'évolution tumorale dans des individus adultes, comme la majorité des cancers du foie.
Implication d’une cible thérapeutique dans le développement de la maladie hépatique liée au syndrome métabolique : Preuve de concept après déplétion génétique au niveau du foie dans un nouveau modèle de souris.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Un régime riche en graisses pendant huit ou seize semaines, appliqué pour installer une inflammation puis une fibrose du foie : 60 souris génétiquement modifiées pour ne plus exprimer une protéine dans cet organe vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur ne décrit comme atteintes que le stress de deux pesées par semaine et une perte de poids d'environ 5 % la première semaine, alors que la maladie qu'il provoque évolue chez l'humain vers la cirrhose et le cancer du foie. Il revendique un "besoin urgent" d'optimiser le traitement de cette maladie et écrit qu'il serait "intéressant d'affirmer" que sa protéine y joue un rôle. Toutes sont tuées après un prélèvement sanguin terminal sous anesthésie, pour qu'on collecte leurs tissus.
Objectifs
L’objectif du projet est d’étudier l’implication de l’expression d’une cible thérapeutique sur le développement de la Maladie Hépatique Associée au Syndrome Métabolique (MASH). La MASH est caractérisée par une inflammation et une dégradation des cellules hépatiques dues à une accumulation de graisse dans le foie. Au stade précoce, la MASH est souvent asymptomatique et généralement diagnostiquée lorsque la fibrose hépatique se développe, évoluant vers un cancer du foie dans les cas les plus graves. Le Resmetirom, 1er médicament approuvé par la FDA (mars 2024) pour la MASH, permet seulement de retarder l’échéance en réduisant la fibrose chez 24% des patients. Il y a donc un besoin urgent d’optimiser le traitement de la MASH. Au sein de notre laboratoire nous étudions une protéine localisée sur la membrane cellulaire, qui joue un rôle dans le développement de différents cancers, notamment celui du foie. Il serait maintenant intéressant d’affirmer que cette dernière joue un rôle important dans le développement de la MASH. Pour cela, un nouveau modèle de souris a été développé avec une suppression ciblée de cette cible au niveau du foie uniquement. Cela nous permettra d’affirmer l’implication de cette dernière sur le développement de la MASH. Afin d’induire un modèle pertinent de MASH avec fibrose hépatique in vivo, un régime spécifique riche en graisses sera appliqué.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet permettront de comprendre en profondeur le rôle de notre cible thérapeutique dans le développement de la MASH. Par exemple l’étude de son rôle fonctionnelle dans le foie et le métabolisme (réponse au stress oxydatif, inflammation, impact sur la signalisation immunitaire et métabolique) dans le cas de la MASH. Ce modèle avec une suppression ciblées de notre cible permettra de comprendre comment notre protéine d’intérêt participe à l’évolution de la maladie et d’identifier de nouveau biomarqueur ainsi que des signatures moléculaires spécifique.
Procédures
Afin d’induire une fibrose hépatique les animaux suivront un régime riche en graisses tout au long de l’expérimentation (pendant 8 semaine dans un groupe et 16 semaines dans un autre). Les animaux subiront un prélèvement de sang terminal. Cette procédure est réalisée sur animaux anesthésiés et est réalisé en environ 1 minute.
Impact sur les animaux
Un modèle à base d’un régime alimentaire spécial, permettra de récapituler le développement de la maladie chez la souris permettant le développement d’une maladie hépatique liée au syndrome métabolique (MASH). Un stress de la souris peut être observé dû à la pesé des animaux 2 fois par semaine. Une légère perte de poids la première semaine du régime est observée (environ -5%).
Devenir
Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissues nécessaires qui seront utilisés pour des analyses ultérieures.
Remplacement
Afin de remplacer les études in vivo, nous avons procédé à des études in vitro afin de démontrer la validité de l’approche. Celle-ci nécessite maintenant une validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier pour une meilleure compréhension du mécanisme et avant une transposition chez l’Homme.
Réduction
Les tailles d’effectifs ont été déterminées grâce à une précédente étude afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.
Raffinement
Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont, l’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification, des briques de tremble à ronger, un tunnel pour se cacher, et des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance. Le prélèvement terminal sera réalisé sous anesthésie. Les animaux sont observés quotidiennement. A l’arrivé des souris dans l’animalerie, une période d’acclimatations de 7 jours sera appliquée avant le début de la procédure.
Choix des espèces
Les souris sont de petits mammifères très proches de l’homme. Le modèle proposé dans cette étude a contribué dans le passé à établir le potentiel curatif des approches thérapeutiques actuellement prescrites chez l’homme. C’est actuellement le modèle le plus pertinent en termes d’homogénéité et de reproductibilité dont nous disposons pour étudier le développement de la fibrose suite à une MASH. De plus le modèle de souris que nous utilisons est génétiquement modifiée pour ne pas exprimer notre cible thérapeutique au niveau du foie afin de compléter nos études sur cette cible. À présent, ce modèle n’est donc disponible que dans la souris. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de 8 semaines minimum. Ce choix se rapproche de l’âge chez l’humain lors du développement de fibrose hépatique (âge adulte).
Étude des mécanismes de développement des tumeurs cérébrales primitives à l’aide de modèles murins
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
À cinq à dix jours de vie, on leur coupe l'extrémité de la queue pour lire leur génotype. Celles qui portent les mutations recherchées reçoivent ensuite une injection quotidienne pendant cinq jours au plus, qui peut leur faire perdre du poids et de la mobilité pendant autant de temps, et une partie des femelles gestantes passe jusqu'à trois jours isolée. 4 078 souris vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés, pour décrire les étapes précoces d'un type de tumeur cérébrale qui représente moins de 10 % des gliomes. Les non-porteuses sont tuées faute de pouvoir être placées ailleurs, les reproductrices dès que leur fertilité baisse, les porteuses pour qu'on prélève leurs organes.
Objectifs
Les gliomes sont des tumeurs cérébrales primitives malignes de l’adulte. Les mutations génétiques impliquées dans l’apparition de ces tumeurs ont été caractérisées et ont permis de mettre en évidence différents sous-groupes de gliomes, dont la prise en charge peut différer en fonction des altérations identifiées. Cependant, les traitements actuels ne sont pas suffisants pour éradiquer ces tumeurs, qui récidivent fréquemment. Les études ont mis en évidence une forte complexité de la biologie de ces tumeurs. En effet, elles sont composées de nombreuses populations cellulaires dont les fonctions évoluent en fonction du stade de développement de la tumeur. Il apparait donc impératif de mieux caractériser la dynamique de ces populations cellulaires et de leurs interactions et d’identifier les mécanismes moléculaires sous-jacents. De plus, peu d’études scientifiques ont caractérisé les dynamiques cellulaires dans les étapes précédant la formation de tumeurs, lorsque seulement une ou deux mutations génétiques sont présentes. Ce projet aura pour objectif de renforcer les connaissances sur les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans le développement d’un type de gliome spécifique, les oligodendrogliomes, grâce à différentes lignées de souris génétiquement modifiées.
Bénéfices attendus
Les oligodendrogliomes représentent moins de 10 pourcents des gliomes qui touchent environ 4000 nouvelles personnes par an en France. Les oligodendrogliomes sont rares, ont un pronostique plus favorable que d’autres tumeurs cérébrales. Pourtant, il n’existe pas de traitement curatif pour ces tumeurs, qui récidivent fréquemment. Les différentes étapes du développement tumoral, notamment les étapes précoces, ne sont pas vraiment caractérisées pour le type de tumeurs cérébrales que nous souhaitons étudier au cours de ce projet (les oligodendrogliomes). Ainsi, ce projet pourrait permettre de décrire pour la première fois les conséquences des modifications génétiques spécifiques dans l’apparition et le développement des oligodendrogliomes. De plus, il pourrait permettre de comprendre comment un type de cellules spécifiques modifiées impactent le fonctionnement des autres cellules cérébrales. Les données obtenues pourront être évaluées sur de nouveaux modèles tumoraux in vitro, afin de réduire le recours aux animaux pour ce type de tumeurs. A terme ce projet renforcera les connaissances sur les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans le développement des oligodendrogliomes et pourrait permettre l’identification de biomarqueurs pronostiques ou diagnostiques qui pourraient améliorer la prise en charge des patients atteints de ces tumeurs.
Procédures
Un prélèvement de l’extrémité de la queue sera réalisé sur animal vigile pour l’ensemble des jeunes animaux produits pour identifier leur patrimoine génétique (une fois, durée inférieure à 1 minute par animal). Une partie des animaux recevra une injection quotidienne d’une molécule permettant de mettre en place le modèle (animal vigile, moins d’une minute par injection, maximum 5 jours consécutifs). Il pourra être nécessaire d’héberger individuellement une partie des femelles gestantes pendant 3 jours maximum. Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
Lors du prélèvement pour connaitre le patrimoine génétique des animaux ils ressentiront une légère et brève douleur. Les injections seront associées à une légère douleur et un inconfort. Les injections de la molécule permettant de mettre en place le modèle chez les souriceaux de deux lignées génétiquement modifiées peuvent s’accompagner d’une perte de poids et de mobilité, qui peut durer jusqu’à 5 jours. Il pourra être nécessaire d’héberger individuellement une partie des femelles gestantes, maximum 3 jours, cela pourra générer un stress social.
Devenir
Tous les animaux reproducteurs seront euthanasiés lorsque l’on observe une baisse de la fertilité. Les animaux générés non porteurs des modifications génétiques d’intérêts seront euthanasiés car il ne sera pas possible de les replacer du fait de leur modification génétique. Les animaux porteurs des modifications génétiques d’intérêts seront euthanasiés pour réaliser des prélèvements d’organes d’intérêt pour répondre à notre question scientifique.
Remplacement
Les tumeurs cérébrales, depuis la première mutation jusqu’à la tumeur formée, sont des pseudo-organes complexes qui ne peuvent se résumer exclusivement à des cellules tumorales. En effet, dans une tumeur cérébrale, il existe, en plus des cellules tumorales, un microenvironnement composé de molécules et cellules cérébrales saines (cellules immunitaires, vaisseaux sanguins, neurones). Ce microenvironnement joue un rôle clé dans le développement et la résistance au traitement des tumeurs. Ce microenvironnement est lui-même dépendant du macroenvironnement c'est-à-dire de l’organisme hôte. Nous utilisons des modèles in vitro qui nous permettent de mettre en évidence les effets directs des mutations sur la biologie de la cellule mais uniquement sur du court terme car ces modèles ne se maintiennent pas au-delà de 8 jours. Cependant ces modèles cellulaires ne nous permettent pas d’explorer les interactions avec d’autres populations cellulaires. Nous mettons actuellement en place des modèles de co-culture de plusieurs populations cellulaires afin de répondre à certaines de nos questions scientifiques tout en réduisant notre recours à l’animal. Malgré tout, ces modèles restent imparfaits car ne reconstituent pas complètement le contexte biologique (microenvironnement et macroenvironnement) interagissant avec les cellules tumorales. L’utilisation d’organismes entiers est donc importante pour décrire et comprendre, au cours du temps, les effets des mutations sur certaines cellules spécifiques dans le cerveau, et les conséquences sur les autres populations cérébrales. C’est la raison pour laquelle dans ce projet nous utiliserons des lignées de souris génétiquement modifiées présentant des mutations dans les gènes d’intérêt pour notre objectif scientifique.
Réduction
Nous veillerons à utiliser le moins d’animaux possible pour l’ensemble de nos expériences. Le nombre d’animaux choisi est basé sur des données que nous avons précédemment obtenues ainsi que sur des calculs utilisant des outils statistiques. Ces calculs nous permettent de déterminer le nombre minimal d’animaux à utiliser pour obtenir des données scientifiques valides. Nos lignées de souris génétiquement modifiées ont une génétique complexe, ce qui nécessite de nombreux croisements avant d’obtenir les animaux portant le patrimoine génétique d’intérêt. Nous optimiserons nos stratégies de croisement afin que le maximum de souris soient utilisés et nous piloterons notre élevage de manière raisonnée afin de ne produire que le nombre d’animaux nécessaires. Au total nous prévoyons 4078 souris dans ce projet afin de maintenir nos lignées et produire les lots expérimentaux nécessaires pour nos analyses.
Raffinement
Les conditions d’hébergement et les conditions d’enrichissement de l’environnement, de sociabilité et soins respectent la règlementation de la directive européenne et sont contrôlés quotidiennement. Les animaux bénéficient d’eau et de nourriture (adaptée au stade physiologique) à volonté. Ils sont observés quotidiennement par l’équipe de zootechnie et 2 fois par semaine par l’équipe de recherche. En cas d'anomalie un suivi est mis en place en collaboration entre l’équipe de recherche, la structure chargée du bien-être animal (SBEA) et le vétérinaire. Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale. Le prélèvement pour génotypage est rapide et parfaitement maitrisé. Il est réalisé sur de jeunes animaux (cicatrisation rapide) et est de la taille la plus petite possible. On utilise du matériel propre et désinfecté entre chaque animal, et on s’assure après le geste que le souriceau soit bien repris en charge par sa mère. Concernant les animaux dont l’état général peut être dégradé suite à l’injection de la molécule permettant d’induire la modification génétique, ils seront suivis quotidiennement, par examen de leur aspect physique. Un apport alimentaire et hydrique complémentaire sous forme de gel pourra être apporté, en consultation avec la SBEA. Les animaux recevant une injection d’un agent euthanasiant seront sédatés au préalable pour réduire leur stress et éviter toute douleur liée à l’euthanasiant.
Choix des espèces
La souris est le modèle animal classiquement utilisé dans les expériences et les études thérapeutiques menées en cancérologie. De très nombreuses connaissances sur les mécanismes de formation des tumeurs ont été découverts et caractérisés chez la souris. De plus nous avons dans cette étude besoin de mammifères modifiés génétiquement, et les souris sont les animaux pour lesquels cette technique est la plus développée. Nous utiliserons des souriceaux, jeunes adultes et adultes. L’utilisation des souriceaux (stades postnataux) permettra de cibler un nombre important de cellules d’intérêt afin d’étudier l’impact des gènes d’intérêt sur différents processus cellulaires. Les stades adultes permettront de déterminer si les cellules d’intérêt adultes sont également sensibles aux différentes mutations. Enfin, l’utilisation des animaux à différents temps post-induction des mutations génétiques permettra de comprendre les effets courts et long terme des mutations. Ceci est particulièrement important car chez les patients les mutations semblent apparaitre tôt au cours de la vie (enfance-adolescence) alors que les tumeurs sont diagnostiquées à l’âge adulte (40 ans). Nous prélèverons les animaux pour connaitre leur patrimoine génétique à l’âge de 5 à 10 jours afin de bénéficier de la cicatrisation rapide observée chez les jeunes animaux et de connaitre leur modification génétique très tôt pour leur inclusion dans nos lots expérimentaux.
Importance de l’activité mitochondriale des hépatocytes dans la progression des pathologies du foie liées à un dysfonctionnnement métabolique chez la souris (MODIFICATION)
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
408 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés, chacune passant jusqu'à 24 semaines sous un régime riche en graisse et en sucre. Un lot enchaîne six heures de jeûne, l'administration d'une solution puis cinq à six prélèvements sanguins en deux heures, et 72 heures d'hébergement individuel en cage métabolique. Un troisième lot reçoit un régime conçu pour déclencher une inflammation et une fibrose du foie, alors que le porteur écrit n'attendre l'apparition d'aucun signe clinique. Deux cents autres, réparties en quatre groupes de cinquante, sont opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil pour qu'on prélève leurs cellules de foie et les mette en culture.
Objectifs
Les maladies du foie associées à un dysfonctionnement métabolique (MASLD) débutent par la stéatose (une accumulation de graisse dans le foie) et peuvent progresser vers la stéato-hépatite (MASH) qui présente un état inflammatoire et un début de fibrose au niveau du tissu hépatique, et ce jusqu’à la fibrose/cirhhose. Au-delà des dysfonctionnements métaboliques du foie, ces pathologies sont également associées à la mortalité d’origine cardiovasculaire et à la survenue de carcinomes hépato-cellulaires. Il est donc important de comprendre les mécanismes qui amènent à leur progression. De nombreuses études soulignent un rôle de l’activité des mitochondries (organites intra-cellulaires entre autres responsables de la production d’énergie) dans le métabolisme du foie et dans la progression des MASLD. Mais la manière dont l’activité mitochondriale est potentiellement responsable de la progression des MASLD n’est pas clairement élucidée. Nous disposons d’un modèle dans lequel l’absence d’une protéine située au niveau de la membrane des mitochondries dans les hépatocytes de souris mâles a la capacité d’intensifier le processus de respiration mitochondriale couplée à la production d’énergie dans ces cellules et est corrélée avec une protection de ces animaux vis-à-vis de l’apparition d’une stéatose induite par un régime riche en graisse. Notre objectif est à présent de vérifier si ces résultats, initialement obtenus chez des mâles, peuvent également être confirmés chez des souris femelles, ce qui nous parait particulièrement important dans un contexte clinique où la survenue des MASLD a une fréquence différente en fonction du sexe des patients. Nous cherchons également à déterminer si une modulation de l’activité respiratoire mitochondriale, une fois la stéatose hépatique installée, a des vertus curatives, ce qui permettra d’envisager des voies thérapeutiques dans l’avenir. Enfin nous souhaitons déterminer si cette modulation de l’activité respiratoire mitochondriale a des vertus préventives également vis-à-vis de la progression de la stéatose en MASH. Enfin nous utiliserons des hépatocytes primaires en culture, afin d’élucider les mécanismes à l’origine des observations effectuées in vivo.
Bénéfices attendus
A terme, les résultats de ce projet permettront de comprendre plus précisément l’importance de notre protéine d'intérêt pour la fonction du foie. Ils permettront également de mettre en évidence des différences de réponses cellulaires entre mâles et femelles vis-à-vis de la progression des MASLD (maladies du foie liées à un dysfonctionnement métabolique), en particulier comment survient l’apparition d’un foie dit gras et comment cela peut évoluer en un foie inflammé et fibrosé . Nous résultats pourraient également permettre le développement de nouveaux médicaments ciblant les mitochondries, permettant ainsi de prévenir ou freiner le développement des maladies métaboliques et hépatiques chez les patients.
Procédures
(MODIFICATION) Un premier lot d’animaux sera soumis à un régime riche en graisse et en sucre (animal vigile, 24 semaines), période au cours de laquelle une moitié d’entre eux sera soumise à deux tests métaboliques pendant que l’autre moitié sera soumise à un test métabolique et à une mesure de la dépense énergétique. Les tests métaboliques sont tous précédés d’une mise à jeun de 6h et sont constitués d’une administration d’une solution (animal vigile, 5 sec, 1 fois), suivie de 5 à 6 prélèvements sanguins de faible volume sur une période de 2h. La mesure de la dépense énergétique implique un hébergement individuel temporaire (animal vigile, 72h). En fin de procédure, tous les animaux de ce premier lot seront soumis à un prélèvement sanguin (animal anesthésié, 1 min, 1 fois) pour la mesure de leurs paramètres biochimiques. Un second lot d’animaux sera soumis à un régime riche en graisse (animal vigile, 16 semaines), période au cours de laquelle chaque animal sera soumis à un prélèvement sanguin (animal vigile, 30 sec, 1 fois), à une injection intra-veineuse (animal anesthésié, 30 sec, 1 fois), et à un hébergement individuel (animal vigile, 72h). En fin de procédure, chacun des animaux du lot sera soumis à un prélèvement sanguin (animal anesthésié, 1 min, 1 fois). Un troisième lot d’animaux sera soumis à un régime riche en graisse capable d’induire une inflammation et une légère fibrose du foie (animal vigile, 16 semaines). Il sera également soumis à un prélèvement sanguin (animal anesthésié, 1 min, 1 fois). Enfin un quatrième lot d’animaux sera soumis à une procédure chirurgicale sans réveil (animaux sous anesthésie générale et analgésie, 1 fois 20 min). (MODIFICATION) Une modification de projet sans augmentation du nombre d'animaux est nécessaire car un régime alimentaire induisant une obésité et une résistance à l'insuline est remplacé par un régime entrainant une maladie du foie en plus de ces syndrômes métaboliques.
Impact sur les animaux
(MODIFICATION) Les régimes spéciaux peuvent engendrer une maladie du foie, de l'obésité et une résistance à l'insuline ce qui peut induire une douleur modérée, une modification de leur déplacement et de leur mobilité. Les tests métaboliques peuvent entrainer des hyper ou hypoglycémies transitoires chez les souris. L'hébergement individuel de courte durée en cage métabolique peut induire un stress chez les animaux. Les prélèvements de sang peuvent induire une douleur légère de courte durée. Les injections intrapéritonéales et intraveineuses peuvent engendrer une douleur légère de courte durée au site d'injection. Enfin, les procédures d’anesthésie peuvent engendrer un risque cardio-respiratoire.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire pour des analyses post-mortem. Concernant les 3 premiers lots d’animaux, les foies entiers seront collectés et leur analyse nous permettra d’évaluer la santé du foie en réponse aux différents régimes alimentaires et aux traitements à visée curative. Concernant le quatrième lot, une procédure chirurgicale sans réveil, réalisée sous anesthésie et analgésie, nous permettra d’isoler les cellules du foie pour effectuer des analyses plus poussées sur le fonctionnement de ces cellules, en présence ou absence de notre protéine d’intérêt. Ces résultats complémentaires devraient nous permettre d’expliquer les différents états de santé du foie observés chez les animaux.
Remplacement
Selon la règle des 3R, la caractérisation de notre protéine d'intérêt a d’abord été réalisée in vitro et dans un modèle invertébré. Ces modèles n’étant pas basés sur des pathologies des grands systèmes chez l’humain, ils ne permettent pas d’étudier son importance in vivo. Certaines questions d'intérêt scientifique nécessitent des expériences sur les animaux. Bien que nous réalisions des expériences sur les hépatocytes primaires de souris maintenus en culture, ainsi que l’exploration de certains mécanismes par simulation informatique, nous ne pouvons pas étudier la physiopathologie des maladies mitochondriales ex vivo car les phénomènes sont multifactoriels. Les modèles animaux sont nécessaires pour évaluer in vivo au cours de plusieurs mois le développement des altérations pathologiques propres aux organes en question.
Réduction
408 animaux seront utilisés pour ce projet. L’utilisation de souris génétiquement modifiées permettra de démontrer l’importance hépatique de notre protéine d'intérêt et son rôle potentiel dans la progression des maladies du foie associées à un dysfonctionnement métabolique (MASLD pour metabolic-associated steatotic liver disease) à la fois chez les mâles et femelles. Pour chaque condition de régimes, des groupes de 8 à 10 souris seront créés afin d’obtenir une puissance satisfaisante à la fin de l’étude pour des résultats significatifs. Pour l’isolement d’hépatocytes et leur mise en culture, 4 groupes de 50 animaux seront nécessaires afin de reproduire de manière fiable une variété d’expériences en culture cellulaire.
Raffinement
Les animaux sont stabulés en portoirs ventiles avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (5 par cage maximum) et l'isolement est évité au maximum. Les animaux sont acclimatés à l’animalerie et sont habitués à être manipulés avec un suivi de poids hebdomadaire qui permet de s’assurer du bon état de santé des animaux. Les animaux sont observés quotidiennement et tout comportement anormal sera directement communiqué à la personne responsable du projet. Nous n’attendons l’apparition d’aucun signe clinique. En particulier, les régimes alimentaires, déjà testés par notre équipe, ont été développés en vue de circonvenir aux effets délétères des précédents régimes qui engendraient d’importantes pertes de poids chez les animaux. Néanmoins, nous veillerons à détecter les premiers signes de douleurs visibles, de détresse ou de signes de toxicité qui pourraient être induits : respiratoire, abattement, perte de poids, dysfonctionnement hépatique. Nous appliquerons strictement les points limites définis dans le projet et la douleur sera limitée à son maximum. Lorsque cela est nécessaire une grille de score adaptée à la procédure sera mise en place. Les prélèvements sanguins et les injections seront réalisés sous anesthésie locale ou générale. La procédure chirurgicale sera réalisée sous anesthésie/analgésie.
Choix des espèces
Le choix de la souris est lié à deux considérations : 1) tous les gènes de la dynamique mitochondriale sont conservés chez la souris et l’homme, ainsi que leur fonction ; 2) la souris est le modèle de choix pour les techniques qui visent à introduire des mutations. Les modèles murins proposés présentent plusieurs avantages notamment la possibilité d’étudier le fonctionnement du foie dans un contexte physiologique où il communique avec tous les organes ainsi que d’étudier la réponse du foie et de l’organisme aux stress hépatiques comme la fibrose hépatique dans le cadre des MASLD (maladies du foie associées à un dysfonctionnement métabolique) et le diabète. Les souris seront mises en conditions expérimentales à partir de l’âge adulte de 8-10 semaines pour ne pas interférer avec leur développement.
Quantification des paramètres mécaniques dans les tumeurs du sein et du pancréas en imagerie – MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Deux heures d'anesthésie d'affilée, dont un quart d'heure avec une aiguille-capteur enfoncée au centre de la tumeur : 110 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales du sein ou du pancréas leur sont injectées dans le flanc, la tumeur pousse deux à trois semaines, puis vient l'examen complet, une heure quinze d'IRM, trente minutes d'échographie et la mesure directe de la pression interne. Toutes sont tuées ensuite pour que la tumeur soit découpée et comparée aux images. Le porteur retient la souris parce que les appareils d'imagerie ont été conçus pour elle et qu'il est plus aisé de trouver des points de comparaison dans la littérature.
Objectifs
Les tumeurs solides sont principalement composées de cellules et d'autres éléments comme les fibres de collagène, qui affectent leurs caractéristiques physiques. Certaines caractéristiques sont connues pour rendre la tumeur plus sévère et plus résistante aux traitements médicaux. Parmi ces propriétés, seule la dureté de la tumeur peut actuellement être mesurée de manière précise et non invasive en imagerie. Il est alors intéressant de développer des techniques pouvant mesurer les autres caractéristiques tumorales, pour évaluer la sévérité tumorale de manière plus précise. La technique envisagée dans ce projet est l’élastographie par imagerie par résonance magnétique (IRM) sous compression. L’élastographie est la mesure des propriétés mécaniques du tissu comme l’élasticité, la dureté, etc… On utilise un dispositif vibrant pour générer des ondes à travers le tissu d’intérêt. Pour acquérir l’image de ces ondes qui se déplacent, on peut utiliser l’IRM (dont les images sont créées grâce à des champs magnétiques) ou l’échographie (dont les images sont créées grâce à des ultrasons). On peut également mesurer des propriétés plus complexes en réalisant un examen d’élastographie sous compression, c’est-à-dire en appuyant de manière continue sur le tissu pendant l’examen d’imagerie. Des études utilisant l’élastographie échographique sous compression ont été menées sur le foie en dehors du corps et ont montré que ces propriétés étaient liées à la manière dont sont organisées les fibres à l’intérieur du cancer, ce qui affecte sa sévérité. Le but de ce projet est de transposer cette méthode développée avec les ultrasons vers l’IRM. Ce type d’imagerie informe sur un volume entier, ce que ne fait pas l’échographie. Il y aura ainsi une information complémentaire et une meilleure précision dans les mesures. Cette nouvelle technique sera appliquée sur des tumeurs implantées chez la souris, avec deux modèles différents : des tumeurs du sein et des tumeurs du pancréas. Les valeurs obtenues seront ensuite comparées à des données provenant de la microscopie pour valider l’utilisation de cette méthode pour déterminer l’organisation des tissus et la sévérité de la tumeur. La validation de la méthode sera d’autant plus assurée que ces deux modèles possèdent des compositions et des propriétés physiques différentes. Cela permettra d’offrir une méthode sans douleur qui pourrait prédire la sévérité d’un cancer et adapter ensuite le traitement donné au patient. MODIF: Prolongation.
Bénéfices attendus
Ces travaux permettront d’approfondir les connaissances fondamentales relatives aux propriétés mécaniques du cancer. En particulier, l’objectif est d’obtenir des marqueurs non-invasifs d’imagerie pouvant indiquer la sévérité tumorale qui est liée à la fois à la composition de la tumeur et à sa pression. Cette étude pourra notamment permettre de définir de nouvelles méthodes d’imagerie afin d’aider le clinicien dans le diagnostic du cancer et, également, adapter le traitement aux caractéristiques de la tumeur.
Procédures
Dans un premier temps, les animaux seront anesthésiés pour une injection unique des cellules tumorales en sous-cutané dans le flanc. Cet acte aura une durée totale de 10 min par animal. Les animaux seront observés de manière bihebdomadaire pendant la croissance tumorale. Une fois que la tumeur aura atteint une taille suffisante (environ 2 à 3 semaines après l’injection des cellules), un examen complet sera effectué. Il comprendra un examen d’imagerie IRM, un examen d’imagerie échographie et une mesure de la pression tumorale, tous réalisés au sein d’une même anesthésie gazeuse. Pour la mesure de la pression tumorale, un capteur de pression ressemblant à une aiguille sera introduit au centre de la tumeur pour obtenir des mesures de pression qui seront comparées avec les mesures d’imagerie. Cette comparaison permettra de valider l’intérêt de l’imagerie IRM et échographie comme méthode de mesure de pression non-invasive. Au total, cette intervention aura une durée de 2h pour chaque animal, avec environ 1h15 d’acquisition d’images IRM, 30 min d’acquisition échographique et 15 min de mesures de pression.
Impact sur les animaux
Des cellules tumorales seront injectées dans le flanc droit de l’animal, ce qui peut occasionner un stress ou une légère douleur au point d’injection. La croissance tumorale peut engendrer une gêne, voire une perte de poids pour l’animal. Cette perte de poids sera en revanche limitée, car surveillée deux fois par semaine. De plus, la taille de la tumeur ne devrait pas excéder les 1000 mm3, ce qui limite de potentiels effets indésirables sur la mobilité de l’animal. Le fait d’être maintenu immobile pour l’imagerie et passer à l’intérieur d’un tunnel d’IRM avec un diamètre réduit peut être une source de stress pour l’animal. Cependant, les examens d’imagerie seront réalisés sous anesthésie, ce qui limitera le stress que l’examen peut engendrer. L’animal est surveillé et maintenu au chaud quand il est sous anesthésie, et la durée est limitée le plus possible, pour éviter d’éventuels effets indésirables de l’anesthésie tels que l’hypothermie (refroidissement de l'animal) et la diminution du rythme respiratoire.
Devenir
A la suite de l’examen complet (imageries et mesure de pression), les animaux seront euthanasiés et la lésion tumorale sera disséquée. Des analyses d’histologie seront réalisées pour obtenir des informations sur la composition tumorale. Ces analyses consistent en des coupes fines de la tumeur qui seront passées au microscope pour quantifier les éléments (cellules, fibres de collagène) qui composent la tumeur. Ces données seront corrélées avec les mesures obtenues en imagerie.
Remplacement
A notre connaissance, il n’y a pas d’alternatives en dehors d'un système vivant (construction de cellules ou morceaux de tumeurs) ou de modélisation numérique qui ont été validées et qui peuvent être utilisées comme solution de remplacement. Afin de valider l’imagerie comme solution non-invasive de mesure de la pression tumorale, les mesures doivent être effectuées sur des modèles animaux afin de reproduire l’environnement hétérogène et les propriétés tumorales qui pourront être retrouvés en clinique chez les patients atteints de lésions tumorales.
Réduction
Les dispositifs d’imagerie utilisés dans ce projet ont déjà été validés en amont, ce qui évite d’avoir une phase de test et de validation sur petit animal. Le nombre d’animaux par groupe a été défini selon des données obtenues précédemment et les données de la littérature.
Raffinement
En plus du suivi quotidien standard, un suivi clinique aura lieu deux fois par semaine : l’état de l’animal sera noté à l'aide d'une grille de score, avec surveillance du poids, de son apparence, de son comportement et de la taille de la tumeur. En cas d’atteinte des points-limites, l’animal sera euthanasié. En cas de score intermédiaire, une injection d’antidouleur sera réalisée et le suivi clinique sera réalisé quotidiennement. Tous les examens seront effectués sous anesthésie gazeuse afin de limiter la douleur et le stress provoqués par les examens. La durée des examens sera réduite au maximum (temps total prévu de 2 heures au maximum) et tous les examens seront réalisés au cours de la même anesthésie pour éviter plusieurs anesthésies successives. Les animaux seront maintenus dans des cages de cinq maximum afin qu’ils aient suffisamment d’espace et qu’ils maintiennent un comportement social. Du matériau favorisant la nidification leur sera fourni. Les animaux seront hébergés en animalerie avec un statut adapté et manipulés sous hotte.
Choix des espèces
Les souris ont été choisies pour cette étude, car elles permettent de greffer en sous-cutané des modèles de tumeurs humaines. Les dispositifs d’imagerie ont été développés pour les souris. De plus, la plupart des études d’imagerie sur tumeurs greffées en sous-cutané ont été réalisées sur des souris et il est donc plus aisé de trouver des informations dans la littérature scientifique. Les animaux seront utilisés au stade adulte (au moins 8 semaines) afin de bénéficier d’animaux plus grands et plus à même de supporter les lésions tumorales étudiées. De plus, les cancers du sein et du pancréas sont généralement observés chez des patients adultes.
Etude du rôle des cellules satellites gliales dans les comorbidités associées à la migraine
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
672 souris vont être utilisées, chacune pouvant recevoir dix injections, subir quatre heures de piqûres de filaments sur la face ou la patte les jours d'injection, boire pendant une semaine une eau qui irrite son intestin, et passer six séries de trente minutes de bruit au cours d'une même nuit. Les procédures sont classées en niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées pour le prélèvement d'organes. Le projet cherche un mécanisme commun entre migraine, fibromyalgie et douleurs viscérales, du côté des cellules satellites gliales qui entourent les neurones. Le porteur situe le bénéfice possible au-delà de ce projet, tester un jour de nouvelles molécules, quand les stimulations douloureuses, elles, sont datées et comptées.
Objectifs
Parmi les douleurs chroniques, la migraine qui affecte environ 15% de la population générale, est sur-représentée dans certaines autres maladies douloureuses chroniques. Ainsi, environ 20% des patients souffrant de douleurs du viscérales au niveau des intestins sont également migraineux. Cette proportion atteint jusqu’à 45 à 80% des patients fibromyalgiques (douleurs musculaires diffuses), selon les études. Malgré ces observations cliniques, le(s) mécanisme(s) pouvant expliquer la présence de la migraine dans d’autres maladies douloureuses est(sont) encore peu connu(s). Ainsi, le but de notre projet est de mieux comprendre si un mécanisme commun entre les douleurs viscérales, la fibromyalgie et la migraine pourrait exister. Parmi les mécanismes sous-tendant ce type de douleur chronique, une activation trop importante des neurones pourrait être à l’origine de la sensibilité exacerbée de ces patients. Des cellules particulières appelées les cellules satellites gliales, entourant les neurones dans les ganglions, semblent jouer un rôle clef dans la régulation de l’activité des neurones. Le but de notre projet est donc de caractériser le rôle des cellules satellites gliales entre différents modèles de douleur chronique, de fibromyalgie, douleur viscérale et migraine à la fois chez les mâles et les femelles. Pour cela, nous évaluerons l'expression de plusieurs marqueurs spécifiques d’activation des cellules satellites gliales dans (i) un modèle de douleur, mimant la fibromyalgie, induite par le stress sonore, (ii) un modèle de migraine induite par des injections répétées d’une molécule qui provoque des migraines chez les patients migraineux et (iii) un modèle de douleur viscérale induite par l'administration orale d’une molécule induisant une inflammation du côlon.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes qui expliqueraient pourquoi la migraine est plus fréquente chez des patients souffrant déjà d’autres douleurs (douleurs viscérales inflammatoires et fibromyalgie), notamment le rôle de cellules particulières, appelées les cellules satellites gliales qui entourent les neurones. A plus long terme, comprendre ces mécanismes permettrait de tester de nouvelles molécules pharmacologiques pour cibler plus spécifiquement les patients présentant la présence de la migraine et d’une autre maladie douloureuse viscérale ou de fibromyalgie.
Procédures
Les interventions seront : Injections d’une molécule : chaque injection dure moins d’une minute (au total 10 injections sur plusieurs semaines). Elles seront réalisées sur des souris en contention modérée. Mesure de la sensibilité cutanée : les jours d’injection pendant 4h toutes les 30 minutes ; cette mesure se fait par l'application de filaments fins sur la peau de l'animal au niveau de la face ou de la patte Le modèle de douleur viscérale est induit par l’administration d’une molécule dans l’eau de boisson sur une semaine. Les animaux peuvent être sous anesthésie gazeuse pour réaliser une chirurgie : elle a lieu une fois et elle sera sans réveil. La chirurgie dure environ 45 min. Stress induit par un son : série de sons pendant 30min, répétés toutes les 3 heures, soit 6 fois au cours de la nuit, ce qui représente un total de 3 heures de stress sonore.
Impact sur les animaux
Nous utilisons un modèle de migraine qui provoque une douleur modérée chez l’animal. Cette douleur est ressentie après les injections, mais n’empêche pas les mouvements de l’animal. Une douleur légère est provoquée par les injections de molécules. Elles seront réalisées sur des souris en contention modérée. Mesure de la sensibilité cutanée : cette mesure se fait par l'application de filaments fins sur la peau de l'animal au niveau de la face ou de la patte qui entraine une douleur modérée Le modèle de douleur viscérale est induit par l’administration d’une molécule dans l’eau de boisson sur une semaine. Cette molécule induit une irritation de l’intestin et la douleur provoquée est modérée. Les animaux seront sous anesthésie gazeuse pour réaliser une chirurgie : le début de cette anesthésie peut induire un stress transitoire de l’animal qui dure moins de 2 minutes. La répétition d’un son entraine un stress chez l’animal.
Devenir
Les procédures ne permettent pas de réutiliser les animaux. En effet, elles se terminent par des techniques qui nécessitent le prélèvement d’organes : les animaux seront donc mis à mort à la fin des procédures.
Remplacement
Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. En effet il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique simultanément.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum. Le nombre d'animaux est défini à partir de notre expérience et des tests statistiques donnant le nombre nécessaire pour la discrimination des effets. Ainsi pour toutes les procédures, nous aurons 12 animaux (6 males et 6 femelles) par groupe. Une fois les animaux mis à mort, un maximum d'organes sera prélevé et stocké afin d'être utilisés pour ce projet ou pour d'autres études. Cela limitera le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
La nuisance identifiée sur le bien-être des animaux est la douleur et le stress engendrés dans le cadre des différents modèles. Concernant la douleur générée par l’application des stimulations mécaniques (à l'aide de filaments en plastique), nous limitons les stimulations en durée et en intensité au minimum et l’animal a toujours la possibilité d’échapper à la stimulation puisqu’il est libre de ses mouvements. Les stimulations mécaniques ne dépassent pas les points limites fixés. Pour améliorer le bien-être des animaux, les cages sont enrichies à l'aide de rouleaux permettant aux animaux de se cacher ainsi que de papier de nidification, chose importante pour la souris. Une des procédures nécessite une chirurgie qui se fera sous anesthésie gazeuse par une personne expérimentée.
Choix des espèces
La souris est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires. C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Le choix de développer ce modèle chez la souris permettra d'utiliser des animaux génétiquement modifiés pour des cibles impliqués dans la migraine, ce qui est difficilement réalisable chez le rat. Les animaux seront âgés de 6-8 semaines pour la comparaison avec les autres données de la littérature. Ce stade de développement a été choisi car c’est chez le jeune adulte que le plus souvent la maladie migraineuse débute chez l’être humain.
Effets de l’expression d’une protéine membranaise sur la carcinogenèse de l’hépatocarcinome dans un modèle murin de xénogreffe dérivé de lignées cellulaires
- Recherche appliquée
- Cancers
Une partie des souris utilisées est immunodéficiente, incapable de rejeter les cellules cancéreuses humaines qu'on lui greffe et maintenue à l'abri des germes pour ne pas s'infecter. 40 souris en tout vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit sous la peau une injection de cellules de cancer du foie, puis sa tumeur est mesurée au pied à coulisse deux fois par semaine sous anesthésie, jusqu'à une possible ulcération de la peau au point de greffe. Toutes sont tuées après un dernier prélèvement de sang, pour que leurs tissus servent à mesurer l'effet d'une protéine membranaire sur la croissance de la tumeur.
Objectifs
Le cancer du foie qui est le 3ème cancer le plus meurtrier dans le monde. Le traitement de référence des formes graves fait appel à des anticorps ciblant le système immunitaire, mais seul un faible pourcentage de patients répond à ces traitements. Il y a donc urgence à mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la progression du carcinome hépatocellulaire afin d’améliorer les thérapies actuelles. Nous avons identifié une protéine localisée sur la membrane des cellules et connue pour participer au développement de différents cancers, et particulièrement le carcinome hépatocellulaire. Une expression élevée de cette protéine est notamment associée à un mauvais pronostic chez les patients, suggérant qu’elle pourrait être une cible thérapeutique pertinente dans le carcinome hépatocellulaire. Ce projet a donc pour objectif de comprendre les effets de la variation d’expression de cette protéine sur la croissance tumorale, en utilisant des lignées cancéreuses humaines ou murines dans lesquels l’expression de la protéine est supprimée (perte de fonction) ou surexprimée (gain de fonction). Ces cellules sont ensuite greffées sous la peau des souris, permettant le développement de tumeurs où il nous sera possible de suivre leur croissance. L’objectif à terme est de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la progression du carcinome hépatocellulaire et d’ouvrir de nouvelles pistes de traitement.
Bénéfices attendus
Le cancer du foie est un cancer pour lequel le nombre de cas est en augmentation constante partout dans le monde, et les traitements actuels ne permettent de soigner qu’un faible pourcentage de malades. Notre projet est une étape vers une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans la progression du carcinome hépatocellulaire. Ce projet pourrait ouvrir vers de nouvelles pistes thérapeutiques pour prendre en charge le cancer du foie, ainsi que les autres cancers exprimant fortement la protéine que nous avons identifiée.
Procédures
Pour étudier l’effet du gain ou de la perte de fonction du récepteur, les animaux seront soumis à une injection unique sous la peau de cellules cancéreuses du foie. Cette injection prend environ une minute à être réalisée sur animaux anesthésiés. Les tumeurs seront mesurées deux fois par semaine à l’aide d’un pied à coulisse sur animal anesthésié, et cette mesure prend moins d’une minute à être réalisée. A la fin de la procédure, les animaux subiront un prélèvement de sang terminal. Cette procédure est réalisée sur animaux anesthésiés et est réalisée en environ 1 minute.
Impact sur les animaux
La manipulation des animaux entraîne un stress physique modérée de courte durée. Dans certains cas la croissance de la tumeur peut entrainer l’apparition d’une ulcération cutanée au niveau du site d’implantation des cellules, entraînant une douleur modérée de courte durée.
Devenir
Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissus qui seront utilisés pour des analyses ultérieures.
Remplacement
Plusieurs stratégies de remplacement ont été mises en place afin de réduire au minimum le recours à l'expérimentation animale. Nous utilisons également en parallèle des modèles in vitro afin de confirmer notre hypothèse avant de passer sur le modèle animal. Néanmoins, dans les essais de pharmacocinétiques pour toutes substances thérapeutiques, les tests sur animaux entiers ne sont pas substituables par des tests simplifiés in vitro. Cela en raison du besoin de mesurer les variations de concentration de la substance thérapeutique dans le plasma d’un organisme ayant des organes et des systèmes pleinement fonctionnels. Également, les modèles cellulaires ne permettent pas de reconstituer l’effet de l’angiogenèse (formation de nouveaux vaisseaux qui peuvent influencer la réponse thérapeutique en entrainant l’activation de certaines voies de signalisation) ou toute la complexité biologique (interaction des éléments du microenvironnement tumoral avec le système biologique de la souris ou modélisation de l’hétérogénéité cellulaire et génétique d’une tumeur) d’un être vivant sur l’efficacité d’un traitement. La validation de ces dernières nécessite le recours à l'expérimentation animale en raison de sa grande complexité. De plus, les modèles cellulaires ne peuvent récapituler que partiellement la pathogenèse complexe du CHC.
Réduction
Pour garantir la fiabilité de nos résultats tout en limitant le nombre d’animaux, nous avons déterminé, grâce à des calculs statistiques, un effectif minimum par groupe qui nous permet de détecter une différence significative entre chaque condition. Nous avons prévu quelques animaux supplémentaires pour compenser d’éventuelles variations et n’avons pas inclus de groupes superflus. Les résultats seront analysés avec des méthodes statistiques reconnues pour valider nos comparaisons.
Raffinement
Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont, l’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification, des briques de tremble à ronger, et des tunnels kraft pour leur permettre de se cacher. Ils auront accès sans restriction à la nourriture et à l'eau pendant toute la durée de l'expérience. Les animaux immunodéficients seront maintenus en groupe sociaux dans des cages ventilées en zone exempt d'organismes pathogènes spécifiques, ce qui permet que les animaux immunodéprimés ne développent pas d'infection. Les animaux immunocompétents seront maintenus en groupe sociaux dans des cages ventilées. Les animaux seront manipulés à l’aide de tubes de manipulation afin d’éviter toute préhension stressante par la queue de l’animal. Des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance. Une méthode anesthésique sera appliquée lors des procédures le nécessitant. Les animaux sont observés quotidiennement, et une observation scorée est réalisée 2 fois par semaine.
Choix des espèces
Les souris sont de petits mammifères proches de l’homme. Les phénomènes biologiques mis en jeu chez ces 2 espèces sont très comparables lors d’un traitement anti-cancéreux. Ces modèles ont contribué dans le passé à établir une meilleure compréhension des voies moléculaires impliquées dans la carcinogenèse ainsi que le potentiel curatif de combinaisons thérapeutiques actuellement prescrites chez l’homme. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de 8 semaines minimum, afin de mimer la pathologie qui touche principalement les adultes. De plus, il est préférable de greffer les cellules sur des animaux adultes afin que les tumeurs grandissantes entravent le moins possible leur capacité de mouvement. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de 8 semaines minimum. Il est préférable de greffer les cellules sur des animaux adultes afin que les tumeurs grandissantes entravent le moins possible leur capacité de mouvement.