Souris
Demostration de l’effet anti-tumoral sans dommages aux tissus sains grâce à un dispositif d’irradiation utilisant des rayons-X à ultra-haut débit de dose
- Recherche appliquée
- Cancers
Porteuses d'un glioblastome pour une partie d'entre elles, des souris sont transportées vers un site industriel, anesthésiées au gaz et irradiées en une fraction de seconde par un accélérateur Rhodotron. 120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 68 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, 32 un niveau modéré et 20 un niveau léger. Il s'agit de vérifier qu'une machine industrielle reproduit l'effet FLASH obtenu jusqu'ici avec des protons, et d'ouvrir la voie à une version clinique moins coûteuse. Le porteur écrit que l'irradiation par rayons X est "indolore pour tous les animaux, tout comme une radiographie", puis annonce une perte de poids, des troubles de la locomotion et des lésions cutanées aux zones irradiées, ainsi que des tests comportementaux dont il ne précise pas la nature.
Objectifs
Notre projet repose sur une technique innovante appelée radiothérapie FLASH. Contrairement à la radiothérapie classique, qui administre des rayons en plusieurs minutes, la radiothérapie FLASH délivre la dose en une fraction de seconde. Pourquoi est-ce une avancée majeure ? Nos recherches ont montré que cette méthode protège mieux les tissus sains tout en restant efficace contre les tumeurs, notamment les cancers du cerveau. Actuellement, la technique la plus prometteuse utilise des protons, mais ces équipements coûtent chers et ne sont pas accessibles à tous les patients. Nous travaillons donc à adapter cette technologie pour un usage clinique plus large. Pour cela, nous allons tester un appareil industriel appelé Rhodotron, capable de délivrer des doses très rapides utilisant des rayons X. Notre objectif est de vérifier qu’il peut reproduire l’effet FLASH et ainsi permettre d’adapter le Rhodotron en appareil clinique pour ouvrir la voie à des essais sur des patients à l’avenir. Ce projet pourrait transformer la radiothérapie et améliorer les traitements contre le cancer tout en réduisant les effets secondaires de ce traitement.
Bénéfices attendus
Ce projet s'inscrit dans un projet visant à transférer la radiothérapie FLASH en clinique humaine. La technique FLASH a été découverte il y a 15 ans et a récemment été reconnue comme l'une des avancées majeures pour l'avenir de l'oncologie par radiothérapie. Ce projet pré-clinique permettra le transfert clinique de la radiothérapie FLASH à rayon X avec le Rhodotron qui est une machine industrielle pouvant facilement être transformé en machine clinique. Cette avancée représente un espoir significatif pour les patients atteints de cancer à leur famille.
Procédures
Toutes ces expériences réalisées à Strasbourg se font sur une journée. Tous les animaux sont d’abord transportés vers le site d'irradiation dans leurs cages d’hébergement avec enrichissement, du gel hydrique et du complément alimentaire sous forme de gel. Tous les animaux seront irradiés sous anesthésies gazeuse. L’anesthésie et l’irradiation durera au maximum 10 minutes par souris. Les animaux contrôles qui ne sont pas irradiés seront anesthésiés pendant 10min. A la fin des irradiations et après avoir vérifié le réveil des animaux et leur état général, les animaux sont replacés dans leur cage d’hébergement et immédiatement retransportés vers leur animalerie pour minimiser l’impact du transport sur l’état général des animaux.
Impact sur les animaux
L'irradiation par rayons X est indolore pour tous les animaux, tout comme une radiographie. Effets indésirables de l’irradiation attendus à moyen/long-terme sur tous les animaux sont une perte de poids, un problème de locomotion, l'apparition de lésions de la peau au niveau des zones irradiées Nous ne pouvons exclure que la tumeur cérébrale pourrait modifier le comportement des souris et parfois induire des crises d’épilepsie même si cette nuisance n'a jamais été observée dans des expériences antérieures.
Devenir
A l'issue de la procédure d'irradation les animaux seront maintenus en vie et retourneront dans leur animalerie d'origine où ils seront mis à mort à l'issue de chaque étude pour réaliser des prélèvements post mortem pour analyses histologiques et moléculaires.
Remplacement
L’étude des effets protecteurs de la radiothérapie FLASH sur le tissu sain nécessite l’utilisation d’un organisme complexe dans lesquels on peut étudier les altérations de la fonction de l’organe irradié. Aujourd’hui, on ne peut pas évaluer la fonction d’un organe in vitro car l’organe est composé de cellules multiples qui interagissent entre elles. L’expression des dommages induit par le radiothérapie sur ces différentes cellules est différent : certaines meurent, d’autres entrent en sénéscence, d’autres ce différencient. C’est la conjonction de ces différents dysfonctionnements complexes qui induit la perte de fonction de l’organe. De la même manière, l’effet anti-tumoral des radiothérapies conventionnelle et FLASH in vitro ne reflètent pas la réponse d’une tumeur in vivo. Par exemple une dose de 10 Gy est suffisante pour tuer la majorité des lignées de cellules tumorales in vitro alors que des doses plus élevées sont nécessaires in vivo. Aujourd’hui, des recherches sont en cours avec des mini-organes cultivés en laboratoire (organoïdes) et des morceaux de tissus, mais ces méthodes n’ont pas encore montré les effets bénéfiques de la radiothérapie FLASH. Une autre approche prometteuse consiste à utiliser des embryons de poisson zèbre. Des expériences ont montré que la radiothérapie FLASH protège bien ces embryons lorsqu’on utilise un faisceau d’électrons. En revanche, nous ne disposons de modèle tumoral chez le ZFE, nous soomes entrain de le développer. En revanche, la souris permet l’étude de ces effets dans un système intégré. L’effet protecteur et anti-tumoral de la radiothérapie FLASH a été montré à plusieurs reprises avec des faisceaux d’électrons et de protons mais pas avec des rayons X et c’est ce que nous voulons faire ici. De plus, les études menées ces dernières années montrent que la réponse des souris à la radiothéarpie est similaire à celle de l’homme. C’est pourquoi nous concentrons nos efforts sur la souris pour valider un nouveau faisceau de radiothérapie FLASH utilisant des rayons X. La souris est le modèle animal le plus pertinent pour montrer l’effet de la radiothérapie FLASH. Ici l’objectif est de s’assurer que cette technologie fonctionne bien avant de l’adapter aux traitements pour les patients. ’L'utilisation d’un autre modèle expérimental nécessiterait des mises au point longue et de nombreux animaux contraire à notre objectif de réduction.
Réduction
Pour s’assurer que nos résultats sont fiables, nous utilisons des méthodes mathématiques rigoureuses pour déterminer combien d’animaux sont nécessaires dans chaque expérience. Le nombre d’animaux nécessaires au projet est calculé en prenant en compte la taille de l’effet attendu. Ces calculs nous permettent de tirer des conclusions solides tout en réduisant le nombre de souris utilisées. De plus, pour les tests comportementaux les résultats obtenus sur groupe contrôle d’animaux sans tumeur (cohorte 1) sont utilisés pour les analyses des animaux porteurs de Glioblastome et en rémission après les traitement de radiothérapie, ceci permet de résuire le nombre d’animaux au total.
Raffinement
Nous mettons en place plusieurs mesures pour assurer le bien-être des animaux tout au long des expériences. 1. Transport sécurisé: Les souris sont transportées dans leur cage d’hébergement avec enrichissement pour éviter le stress et préserver leurs liens sociaux. Elles ont accès à de l’eau en gel et à de la nourriture enrichie pour leur confort. L’irradiation et le transport sont faits le même jour pour limiter leur temps hors de l’animalerie. Les animaux porteurs de tumeur ont une période de récupération de 10j avant le transport. 2. Irradiation sous surveillance: Les souris sont anesthésiées et placées sur un tapis chauffant pendant la radiothérapie, qui dure moins de 10 minutes. Une caméra permet de les surveiller en temps réel. Pour protéger leurs yeux, un gel ophtalmique est appliqué. 3. Prévention des infections et de la douleur: Comme la radiothérapie corps entier peut affaiblir le système immunitaire, un traitement antibiotique préventif est donné dans l’eau de boisson, un traitement antalgique préventif est aussi administré pour contrôler la poussée fébrile.
Choix des espèces
Nous utilisons des souris dans cette étude car la souris est le modèle animal le plus pertinent pour répondre à nos questions qui concerne la radiothérapie: C’est l’animal de référence en radio-oncologie car sa réponse à la radiothérapie est semblable à celle de l’homme au niveau de la tumeur et du tissu sain. Nous utiliserons des animaux jeunes adultes âgés de 8 semaines car le glioblastome est un type de tumeur que l’on retrouve chez des patients adultes et la radiothérapie conventionnelle est efficace mais induit des déficiences cognitives sévères.
Rôles des perturbations métaboliques liées à l’obésité dans la progression du cancer colorectal
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
Vingt des 500 souris de ce projet sont dépourvues de système immunitaire, retenues pour l'étude pilote parce que la mortalité y est la plus faible après la greffe. L'ensemble des 500 souris va être utilisé dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Des cellules tumorales leur sont transplantées dans le rectum sous anesthésie, avec un risque d'hémorragie, de contractions abdominales et d'infection au site de greffe, puis elles reçoivent des régimes obésogènes, sont mises à jeun la veille des scanners et scannées deux fois par mois après injection d'un radiotraceur dans la veine de la queue. La mise à mort finale sert à prélever les tumeurs et les organes situés à distance du côlon, foie et tissu adipeux compris.
Objectifs
Le cancer colorectal est l'un des cancers les plus fréquents et représente un enjeu majeur de santé publique. Bien que plusieurs facteurs génétiques jouent un rôle dans son initiation, la majorité des cancers colorectaux sporadiques sont imputables à des facteurs environnementaux tels que l'obésité, le tabagisme et les carcinogènes alimentaires. Il est bien connu que le risque de développer un cancer colorectal augmente avec l'obésité. Cependant, les mécanismes biologiques par lesquels les régimes alimentaires occidentaux influencent le développement du cancer colorectal ne sont pas bien compris. Ce projet de recherche a pour objectif global d’identifier comment les perturbations métaboliques déclenchées par une alimentation obésogène promeuvent la progression du cancer colorectal et de caractériser les liens complexes entre l'obésité et le contrôle du métabolisme. Pour cette étude regroupant les différentes parties pré-cliniques du projet (effet des régimes alimentaires), 500 souris seront nécessaires, soit 100 souris/an ; le nombre d’animaux pour chaque traitement ayant été déterminé afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en nous permettant de réaliser des études statistiques. Enfin, grâce à l'enrichissement du milieu mis en place, nous pourrons obtenir des résultats scientifiquement valides tout en réduisant au maximum l’éventuel inconfort de l’animal.
Bénéfices attendus
Ce projet représente un enjeu majeur de santé publique et permettra de développer de nouvelles voies thérapeutiques pour les patients obèses atteints de ce type de cancer.
Procédures
500 souris seront transplantées avec des cellules tumorales au niveau du rectum. Le geste technique sera réalisé sous anesthésie et la durée totale de l'expérimentation est 15 minutes. Les souris feront l’objet d’un suivi quotidien et seront pesées 2 fois par semaine (temps par pesée : 10 secondes). Afin de suivre l’évolution tumorale, un scanner sera réalisé deux fois par mois par une personne dédiée et sera couplé ou non à une technique d'imagerie permettant la visualisation des tumeurs par rayon X et de l’activité métabolique de la tumeur. Dans ce cas, les animaux seront mis à jeun la veille afin d’éviter toute interaction métabolique avec un radiotraceur administré aux animaux par voie intraveineuse au niveau de la veine caudale au moment de l'imagerie. L’animal sera anesthésié toute la durée de l’acquisition (15 minutes).
Impact sur les animaux
A la suite de la greffe, les nuisances éventuelles pour ce projet sont un risque d'hémorragies, de trémulations ou de contractions abdominales suite à la procédure de transplantation rectale ; ou un risque d'infection au site de greffe.
Devenir
Les souris seront euthanasiées en fin d'expérimentation afin de réaliser des prélèvements terminaux.
Remplacement
Les systèmes in vitro ne permettent pas d’appréhender la complexité d’un organisme entier, rendant indispensable l'utilisation d'un modèle animal. Nous avons besoin de connaitre les effets d'un régime obésogène sur un organisme vivant et d’étudier son impact directement sur la transplantation mais aussi sur des organes à distance du côlon, tels que le foie ou le tissu adipeux, qui pourraient avoir une incidence sur l'initiation et la progression du cancer colorectal.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe a été déterminé avec discernement, après calcul de l'échantillonnage nécessaire afin d'obtenir une puissance statistique satisfaisante (pour ne pas avoir à refaire l’expérience). Seuls les régimes alimentaires ayant démontré le plus d’effets sur la reprogrammmation métabolique seront utilisés. Chaque lot d’animaux comprendra 10 animaux afin de réaliser les tests statistiques pertinents sur un effectif suffisant, tout en tenant compte de la potentielle mortalité des souris suite au geste technique de transplantation des tumoroides . Une étude pilote avec des souris immunodéprimées, où le taux de mortalité est le plus faible, permettra, entre autre, de valider la transplantation des tumoroides dans notre animalerie et d'ajuster le protocole avant de poursuivre avec les procédures expérimentales plus complexes. Concernant l'analyse statistique, dans un premier temps, nous modéliserons la croissance tumorale (en fonction du nombre de jours post-greffe) et la comparerons entre les différents groupes de traitement en utilisant un modèle linéaire mixte. Puis, des comparaisons de processus biologiques seront effectuées sur les tumeurs prélevées des différents groupes de traitement.
Raffinement
Pour l’ensemble du projet nous avons prévu un nombre total de 500 souris dont 20 souris sans immunité. Pour l’hébergement, toutes les souris de ce projet sont hébergées dans une zone où les cages sont positionnées dans un portoir ventilé. En utilisant ce type de portoir, chaque cage peut être considérée comme une unité microbiologique. De plus, les cages contiendront des briques de peuplier et/ou des carrés de cellulose sont ajoutés à la litière. La présence d’autres congénères dans la cage permettra une diminution du stress grâce au contact social. Un environnement enrichi (carré de ouate ou igloo en carton et bâtonnets de peuplier) sera utilisé afin de limiter l’angoisse dans les jours qui suivent la procédure. Une grille d’évaluation clinique permettra d’adapter les soins à apporter si nécessaire.
Choix des espèces
Les souris sont des mammifères qui sont un modèle représentatif de l’homme et présentant une reproduction rapide, ce qui permet de raccourcir le temps des projets. De plus, les modèles de souris ont été validés dans l'étude de la physiopathologie intestinale car elles développent des tumeurs proches de celles observées chez l'Homme. Nous utiliserons des souris sans immunité et des souris avec immunité, qui seront traités à partir de 8 semaines d'âge, afin qu'ils soient matures sexuellement.
Efficacité de traitements innovants sur un modèle murin de fibrose rénale
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
Une injection déclenche une fibrose rénale, puis deux à six injections ou gavages de molécules suivent, avec des collectes d'urine obtenues par contention. 280 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue pour l'analyse histologique de leurs reins, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les gavages répétés peuvent irriter l'œsophage et les injections enflammer le site de piqûre, alors que le porteur écrit que ces souris "ne présentent aucun phénotype dommageable". Sur la réduction, il indique avoir dimensionné les groupes avec un plan d'expérimentation, sans donner un seul chiffre justifiant les 280 animaux.
Objectifs
La fibrose est une augmentation anormale de la quantité de tissu conjonctif fibreux dans un tissu ou un organe. Cette fibrose entraine des défauts d'organes puisque les cellules spécialisées de l'organe sont remplacées par des fibres non fonctionnelles d’où le nom de fibrose. Les maladies fibrotiques, telles que la fibrose rénale associée à l’insuffisance rénale chronique (IRC), constituent des enjeux thérapeutiques majeurs en raison de l’absence de traitements curatifs. Des résultats récents suggèrent que des récepteurs cellulaires de molécules présentes dans le rein lors de l'IRC jouent un rôle prépondérant dans l’initiation et la progression de la fibrose rénale. Dans ce projet, nous allons tester l’effet thérapeutique de molécules innovantes ciblant ces facteurs pro-fibrotiques dans un modèle murin de fibrose rénale. L’évaluation du degré de fibrose rénale après traitement avec les molécules innovantes permettra d’évaluer le potentiel thérapeutique de ces molécules pour traiter les patients atteints de fibrose rénale.
Bénéfices attendus
Les résultats générés par ce projet permettront d’envisager la mise en place en clinique de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant la fibrose rénale et ainsi d’améliorer la prise en charge des patients souffrant d’insuffisance rénale chronique.
Procédures
Les animaux recevront une injection pour induire la fibrose rénale. Les molécules thérapeutiques seront ensuite administrées par injections (2 à 6 maximum) ou par gavage. Durée des injections : 3 à 5 secondes. Durée des gavages : environ 10 secondes. Les collectes d’urines permettant de suivre la fonction rénale se feront par une méthode non-invasive, à savoir par miction spontanée lors de la préhension des souris.
Impact sur les animaux
Les souris utilisées dans ce projet ne présentent aucun phénotype dommageable. Le produit injecté en début d'étude va entrainer une fibrose rénale qui peut avoir des conséquences sur l’état de santé général des souris. Les injections répétées des produits thérapeutiques peuvent occasionner une gêne et une inflammation au niveau du site d’injection. Les gavages répétés peuvent induire une gêne et une irritation de l’œsophage. Les contentions pour traitement et prélèvement d’urine peuvent occasionner un stress.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés afin de permettre la réalisation d’analyses histologiques de leurs reins.
Remplacement
Les composés thérapeutiques innovants que nous testerons dans ce projet on fait l’objet d’études in vitro préliminaires. Néanmoins, le but de ce projet est de définir le potentiel thérapeutique de ces molécules dans l’apparition de la fibrose rénale. La complexité des processus cellulaires responsables de la fibrose ne peut être étudiée que dans un modèle in vivo intégrant tous ces facteurs.
Réduction
Pour cette étude nous avons dimensionné les groupes d’animaux en utilisant un plan d’expérimentation permettant d’obtenir des résultats statistiquement exploitables et ainsi de garantir l’obtention de résultat pertinents biologiquement et exploitable tout en minimisant le nombre d’animaux.
Raffinement
Notre expérience sur le modèle nous a permis d’adapter la fréquence de suivi et de préciser les différents points d’observation clinique qui caractérisent de manière précoce et prédictive les points limites. Ainsi nous accélèrerons la fréquence de suivi de animaux et de pesé dès la deuxième semaine après traitement afin de s’adapter à la cinétique réelle d’apparition de la maladie. Un examen clinique sera réalisé 2 à 3 fois par semaine dès le début des études et le remplissage d'une grille de score lors de ces examens cliniques permettra de déterminer de façon objective le devenir de l'animal.
Choix des espèces
Le but de ce projet est de tester l’effet thérapeutique de molécules innovantes ciblant la fibrose rénale. La souris apparait comme un excellent modèle pour répondre à cette question car elle présente de grandes similitudes avec l’être humain. En effet, le rein des souris est histologiquement et physiologiquement similaire à celui des humains. Dans ce projet, nous allons utiliser des animaux jeunes (2 à 6 mois). En effet, les animaux de cette tranche d’âge ont un fonctionnement rénal optimal qui n’est pas encore altéré par le vieillissement.
Étude du rôle du récepteur plaquettaire GPIb dans les premières étapes de la dissémination métastatique
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
440 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue en raison du volume de sang prélevé ou de l'injection de cellules tumorales. Selon la procédure, chacune reçoit une injection éveillée et une ou trois autres sous anesthésie, puis une prise de sang de 20 minutes au plus sous anesthésie, ou la pose d'un cathéter intraveineux et une chirurgie qui peut durer 3 h 30 avec l'observation au microscope. Sous anesthésie, leur respiration peut devenir irrégulière ou marquer des apnées, et les molécules antiplaquettaires injectées peuvent provoquer des saignements. L'objectif est de savoir si le blocage du récepteur plaquettaire GPIb, avec deux agents conçus par l'équipe et des souris mutées qui expriment ce récepteur sous sa forme humaine ou en sont dépourvues, réduit les interactions entre plaquettes et cellules tumorales aux premières étapes de la formation de métastases. Le porteur affirme que "les modèles in vitro ne sont pas assez sophistiqués" pour reproduire ce processus, puis annonce des études in vitro préalables sur des plaquettes et des cellules tumorales humaines.
Objectifs
Les plaquettes sanguines ont un rôle primordial dans l’arrêt des saignements. Elles sont également impliquées dans diverses pathologies, notamment la thrombose artérielle, les processus inflammatoires et les cancers. Il est connu que les plaquettes favorisent le développement de métastases. Malgré l’implication des plaquettes, les traitements anti-plaquettaires actuels ne peuvent pas être utilisés en clinique chez des patients présentant un cancer en raison du risque de saignement qui y est associé. Le récepteur plaquettaire GPIb assure l’interaction entre les plaquettes et le facteur Willebrand conduisant à l’arrêt du saignement. Il est également une cible antithrombotique connue de par son rôle important dans la croissance du caillot. Nous avons généré 2 agents ciblant ce récepteur et bloquant son interaction avec le facteur Willebrand. Leur effet sur la thrombose a préalablement été validé, tout comme l’absence d’induction de saignement. Il a été montré dans la littérature que la GPIb plaquettaire serait impliquée dans la formation de métastases. Dans ce projet, nous souhaitons étudier le rôle de la GPIb dans la formation de métastases afin d’identifier une nouvelle cible pour réduire les interactions plaquettes – cellules tumorales et potentiellement réduire le développement de métastases dans le cadre de cancers du poumon, du sein et de la peau.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont l’éventuelle observation d’une réduction de l’interaction des cellules tumorales avec les plaquettes lorsque le récepteur GPIb est inactif. Un effet attendu serait également une réduction de la formation des métastases. L’identification d’un tel effet pourrait mener au développement d’un nouveau traitement permettant de réduire la formation de métastases et donc mener à une meilleure prise en charge des patients atteints de cancer.
Procédures
Pour la première procédure, les animaux sont soumis à une injection sur animal vigile et une injection sur animal anesthésié (moins d’une minute chacune). Un prélèvement de sang sur animal anesthésié est réalisé (maximum 20 min). Pour la seconde procédure, les animaux sont soumis à une injection sur animal vigile et 3 injections sur animal anesthésié (moins d’une minute chacune). Un cathéter intraveineux est mis en place et une procédure chirurgicale est réalisée (maximum 3h30, observation au microscope comprises).
Impact sur les animaux
Une des nuisances attendue est un impact de l’anesthésie sur le rythme respiratoire (irrégulier ou apnée). On pourra également observer une douleur localisée de courte durée après les injections. On pourra observer d’éventuels saignements dus à la nature antiplaquettaire des molécules injectées.
Devenir
A l’issue de la procédure, les animaux sont mis à mort car la quantité de sang prélevée n’est pas compatible avec un maintien en vie des animaux. De même, l’injection de cellules tumorales ne permet pas un maintien en vie des animaux pour réutilisation dans une procédure ultérieure.
Remplacement
Le processus de formation de métastases étant particulièrement complexe et faisant intervenir plusieurs types de cellules (plaquettes, globules blancs, cellules endothéliales, cellules tumorales etc), l’environnement de la tumeur ainsi que les conditions de flux sanguin (vaisseau, pression artérielle, flux sanguin), les modèles in vitro ne sont pas assez sophistiqués pour en reproduire toute la complexité. Nous disposons néamoins de modèles in vitro qui permettront d’étudier au préalable ce processus avec des plaquettes et des cellules tumorales humaines.
Réduction
Le projet se fera par étapes, comme indiqué dans le déroulé du projet. Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude est réduit au minimum. Ces effectifs permettent l’obtention de résultats statistiquement significatifs.
Raffinement
Une période d’acclimatation de 2 semaines entre l’arrivée des souris à l’animalerie et leur utilisation sera respectée. Une habituation est prévue 5 jours avant le début de l’expérimentation. Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum: •Par l’hébergement en groupes sociaux. •Par une anesthésie de l’animal avant et pendant la durée des procédures. •Par l’injection d’antalgique et d’analgésiant aux site d’incisions et application d’anesthésique local sur l’oeil •Contre la déshydratation, une injection de sérum physiologique est réalisée avant la procédure. •Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffée afin lutter contre l’hypothermie pendant la procédure. Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé pour vérifier l’absence de signe de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédure. Ces points limites permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter sa souffrance et son inconfort.
Choix des espèces
La souris est un animal pour lequel les modèles d’études in vivo sont largement maitrisés et caractérisés, notamment les modèles de cancer. Les techniques de mutation ont permis de générer des souris exprimant un récepteur humain permettant d’étudier l’effet de nouveaux traitements ciblant ce récepteur. De même, cela a permis la génération de souris déficientes pour ce récepteur. Les souris seront utilisées au stade adulte entre 2 et 6 mois pour toutes les procédures. Cet âge correspond à la période utilisant des souris pubères et ne présentant pas encore de vieillissement.
Impact d’une manipulation des contrôles inhibiteurs des neurones dopaminergiques en modèles de maladie de Parkinson EU1/2 (MODIFICATION)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Des souris de lignées génétiquement modifiées subissent vers six jours de vie une biopsie pour leur génotypage, éveillées, ou à défaut sous anesthésie après douze jours. Une partie passe ensuite une chirurgie d'au plus 1 h 30 ou 4 heures et jusqu'à 36 tests comportementaux de 10 à 45 minutes, répartis sur 20 semaines. 996 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour des prélèvements de tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger ou sévère, ou menées sous anesthésie sans réveil, et les séances d'IRM, deux examens de deux heures au plus sous anesthésie, ajoutent 40 souris à l'effectif. Il s'agit de tester si l'inhibition d'une structure cérébrale qui contrôle les neurones dopaminergiques soulage des symptômes nociceptifs, moteurs, cognitifs et anxiodépressifs provoqués par des lésions de ces neurones, dont des altérations des seuils de douleur que le porteur dit ne pas pouvoir soulager "car c'est l'objet de l'étude". Il ne nomme ni la méthode employée pour léser les neurones dopaminergiques, ni aucun des 36 tests comportementaux.
Objectifs
MODIFICATION: La perte des neurones dopaminergiques dans la maladie de Parkinson s’accompagne d’un dysfonctionnement de certains circuits cérébraux et de symptômes moteurs et non-moteurs qui restent difficiles à prendre en charge. La lésion d’une région cérébrale incluant une structure qui est un contrôle de ces neurones dopaminergiques peut améliorer certains symptômes. L’identification récente d’un marqueur moléculaire sélectif de cette structure permet désormais d’étudier les conséquences d’une modulation de l’activité de cette structure dans un modèle de la maladie de Parkinson. L’objectif du projet est ainsi de tester si l’inhibition sélective de cette structure peut soulager les symptômes nociceptifs, moteurs, cognitifs et anxiodépressifs. Les patients Parkinsoniens présentent par ailleurs des altérations structurelles et fonctionnelles de leur réseaux cérébraux, visibles par imagerie par résonance magnétique (IRM). Ces altérations de la connectivité cérébrale pourraient être modifiées par l’inactivation de notre structure d’intérêt. L’identification des changements de connectivité cérébrale et la mise en évidence de l’implication de zones spécifiques au niveau du cerveau pourraient aider la recherche préclinique et clinique, et accélérer les stratégies thérapeutiques. Ce projet se déroule dans 2 Etablissements Utilisateur: EU1 et EU2. La nécessité de procéder à des séances d'imagerie par IRM conduit à l'ajout de 40 animaux .
Bénéfices attendus
La structure cérébrale ciblée par ce projet exerce un contrôle inhibiteur sur les systèmes dopaminergiques, qui dégénèrent dans la maladie de Parkinson. Ce projet doit permettre de tester si une inhibition de cette structure peut améliorer les symptômes nociceptifs, moteurs, cognitifs et anxiodépressifs, apportant ainsi une preuve de concept sur le potentiel thérapeutique de cette cible anatomique. La maladie de Parkinson est la seconde maladie neurodégénérative la plus fréquente. Connue pour ses symptômes moteurs, cette maladie a aussi des conséquences délétères non-motrices, incluant douleur, troubles de l’humeur et déficits cognitifs. Les patients présentent en moyenne 14 symptômes dans les phases précoces de la maladie et plus de 20 dans des phases plus tardives, mettant en évidence le besoin de prendre cette complexité en considération dans la recherche préclinique.
Procédures
MODIFICATION Les animaux sont soumis à une biopsie de tissu pour réaliser leur génotypage, cette biopsie est effectuée sur animal vigile autour de 6 jours postnatal, ou à défaut sur animal sous anesthésie à partir de 12 jours postnatal. Les animaux sont soumis à une biopsie de tissu pour réaliser leur génotypage, cette biopsie est effectuée sur animal vigile autour de 6 jours postnatal, ou à défaut sur animal sous anesthésie à partir de 12 jours postnatal. Des animaux sont soumis à 1 chirurgie d’au maximum 1h30 ou 4h, et un maximum de 36 tests comportementaux de 10 à 45 minutes chaque, répartis sur 20 semaines avec au moins un jour de repos entre chaque test. Les animaux sont soumis à deux examens IRM sous anesthésie, incluant chacun au plus une séquence d'IRM fonctionnelle de 16min, une d'IRM anatomique de 10 min et une d'IRM de diffusion de 60 min (TOTAL=2 heures maximum par examen) (EU2).
Impact sur les animaux
MODIFICATION Une douleur légère et de courte durée peut être provoquée par la biopsie de tissus. La chirurgie peut entraîner une perte de poids transitoire, une douleur postopératoire modérée, une inflammation locale transitoire autour du dispositif des points de suture (peau du crâne). Les tests comportementaux peuvent s’accompagner d’un stress léger. Les lésions dopaminergiques modélisant la maladie de Parkinson peuvent entrainer une perte de poids sur les 10 premiers jours après la lésion. Des déficits moteurs liés à la modélisation de la maladie de Parkinson sont également attendus, ainsi que des altérations sensorielles des seuils de douleur qui ne peuvent être soulagées car c’est l’objet de l’étude. Le transport et l’environnement inconnu de la nouvelle animalerie peuvent également entrainer un stress chez les animaux au moment du changement d’EU.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour prélèvements de tissus.
Remplacement
MODIFICATION Compte tenu du sujet du projet, il est impossible de remplacer le modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. En effet, les comportements étudiés et la connectivité cérébrale nécessitent un système nerveux complet et un animal entier, vivant et vigile. L’existence et la localisation de la structure cérébrale étudiée n’ont pour l’instant été établies que chez les mammifères, ne permettant donc pas en l’état actuel des connaissances d’utiliser un autre modèle animal.
Réduction
Les expériences sont menées en cherchant à limiter le nombre d'animaux, tout en obtenant l’information scientifique recherchée. Pour les diverses expériences, ce nombre d'animaux nécessaire pour tirer des conclusions scientifiques statistiquement fiables est défini sur la base de notre expertise, de l'analyse de la littérature et de calculs de power analyse.
Raffinement
MODIFICATION Les animaux sont hébergés en groupe sociaux dans des cages enrichies (bâton, tunnel, coton et frisure) favorisant leur comportement naturel (ronger et faire des nids). Ils sont acclimatés aux conditions d’hébergement et habitués aux expérimentateurs. Ils sont habitués à la manipulation avant la chirurgie, ainsi qu’aux environnements des tests comportementaux avant leur réalisation. Les animaux seront suivis pour déceler tout signe de mal-être. Durant les chirurgies, des méthodes d’anesthésie et d’analgésie sont utilisées, la température maintenue (tapis chauffant) et les yeux protégés par du gel oculaire. Après la chirurgie, une grille d’évaluation est utilisée pour le suivi des animaux. Des soins, une administration d’antalgique ou d’anti-inflammatoire et/ou une séparation des animaux seront réalisés si besoin après concertation avec le vétérinaire ou la cellule chargés du bien-être animal. Des points limites sont mis en place pour l’ensemble des procédures pour limiter ou soustraire l’animal à la souffrance. Le transport entre les 2 EU se fera dans des cages sécurisées avec nourriture et eau gélifiée et une période de 1 semaine sera respectée avant le début des examens IRM. Durant celui-ci, une anesthésie sera utilisée pour réduire au maximum le stress de l'animal. Leurs yeux seront protégés du dessèchement par l’application d’un gel de protection. La température et la respiration des animaux seront en permanence surveillées par un système de monitorage et maintenue par un système de chauffage du berceau de l’IRM et un tapis chauffant. En cas de chute de la température et/ou d’une respiration altérée, l'acquisition en cours sera immédiatement interrompue et l'animal sorti de l'IRM et pris en charge. Il sera placé dans une enceinte chauffante jusqu'à son réveil, sous surveillance. Des points limites ont été établis afin de soustraire les animaux à la douleur.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris modifiées génétiquement pour cibler sélectivement les neurones de la structure cérébrale étudiée. Ceci implique l'utilisation de souris spécifiques et ne permet pas l'utilisation d'autres espèces. Étant donné que les études nécessitent des systèmes neurobiologiques matures, des animaux adultes seront utilisés. Le génotypage est prioritairement effectué entre 6 et 8 jours, et la chirurgie à partir de 8 semaines d’âge.
Évaluation de candidats médicaments sur des modèles de d’inflammation du péritoine et de septicémie
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Un score de 4 sur un seul critère clinique déclenche l'arrêt immédiat de l'expérience, et aucun anti-inflammatoire ni analgésique n'est administré, ces traitements interférant avec les voies inflammatoires étudiées. 7 680 souris vont être utilisées sur cette base, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. La péritonite est provoquée par ligature et perforation du cæcum sous anesthésie, ou par injection dans l'abdomen de contenu cæcal sur des animaux vigiles sans anesthésie, suivie d'administrations répétées et de prélèvements de sang pouvant atteindre 12 % du volume sanguin total. Les composés testés sont ceux de clients et le nombre de prises de sang est laissé "à l'appréciation du client", ce qui fait de ces 7 680 souris le support d'une activité de prestation.
Objectifs
La péritonite, ou inflammation du péritoine, est une infection assez grave qui peut amener au développement d’une septicémie voire à la mort si elle n’est pas traitée rapidement. Durant ces dernières années, la proportion des péritonites a considérablement augmenté et la prise en charge thérapeutique a évolué en combinant à la fois une prise en charge chirurgicale et médicamenteuse par un traitement antibiotique. Cependant, l’antibiothérapie n’est pas toujours efficace et suffisante et peut ainsi induire un délai dans la prise en charge des patients pouvant amener à la persistance de l’infection voire au décès. A ce jour, il est donc impératif de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le but de proposer un meilleur suivi des patients et d’aboutir à une rémission complète. L'objectif scientifique de l'étude est d'évaluer l’impact de nouvelles molécules thérapeutiques sur la capacité de récupération des souris suite à l’induction d’une péritonite ou une septicémie. La péritonite sera induite par l'injection de différents composés. Ainsi, l’agent inducteur utilisé va permettre de cibler différentes voies de l’immunité et donc de proposer différents modèles de péritonite. La septicémie sera induite par différentes techniques couramment utilisées chez la souris. Nous étudierons, à différents temps, l'infiltration des cellules dans le péritoine, signe d’une réponse immunitaire. Le sang et d'autres organes seront également prélevés en fonction des demandes du client pour évaluer l’état inflammatoire des animaux.
Bénéfices attendus
Depuis ces dernières années, la prise en charge thérapeutique de la péritonite a considérablement évolué en combinant à la fois une prise en charge chirurgicale et médicamenteuse par un traitement antibiotique. Cependant, l’antibiothérapie n’est pas toujours efficace et suffisante et peut ainsi induire un délai dans la prise en charge des patients pouvant amener à la persistance de l’infection voire au décès. A ce jour, il est donc impératif de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le but de proposer un meilleur suivi des patients et d’aboutir à une rémission complète. Ce projet permettra donc de tester l’efficacité et de mieux définir les fenêtres d’action thérapeutiques (doses, période optimale de traitement...) de différents candidats médicaments dans le développement de la péritonite et de la septicémie. De manière plus générale, les résultats obtenus permettront d’étayer les mécanises cellulaires et moléculaires fins contrôlant l’inflammation et sa résolution en mettant en avant de nouveaux effecteurs potentiels dans le déclenchement de la pathologie.
Procédures
Plusieurs interventions pourront être mises en place sur les animaux : i) Induction de la pathologie : a) Par chirurgie (une seule fois par animal) : les souris seront anesthésiées (5minutes) et subiront une ligation et perforation du caecum (10minutes). OU b) Par injection intrapéritonéale de contenu caecal ou d’inducteurs d’une péritonite (une seule fois par animal) : administration sur animaux vigiles sans anesthésie (1 minute maximum : saisie de l’animal, pesée de l’animal pour adapter la dose, puis administration de la substance). ii) Administrations répétées de composés client : les modes d’administration possibles incluent l’alimentation, l’eau de boisson, le gavage, les injections intrapéritonéale, sous-cutanée, intravasculaire, intradermique. Les modes d’administration considérés comme nuisibles incluent tous les modes d’injection. Ils dureront environ une minute par animal (saisie de l’animal, pesée de l’animal pour adapter la dose, puis administration de la substance). iii) Prélèvement de sang : A l’appréciation du client, un ou plusieurs prélèvements de sang pourrons être effectués. Les prélèvements de sang n’excèderont pas 12 % du volume de sang total de l’animal et seront suivis d’une semaine minimum de récupération avant le prochain prélèvement. Le volume prélevé est dépendant du poids de l’animal. Exemple de différents prélèvements qui pourront être effectués sur un animal de 25g. - Veine de la queue sur animal vigile : 10 μL – à la joue sur animal vigile : 135 μL - sinus retro-orbital sur animal anesthésie : 135 μL Les différents modes de prélèvements dureront maximum 1 minutes.
Impact sur les animaux
Les principaux effets indésirables attendus suite au développement d'une péritonite et/ou d’une septicémie sont une perte de poids et une baisse de la température corporelle. Le développement d'une telle infection chez les animaux va entrainer une réponse immunitaire importante afin d’éliminer l'infection. Dans un premier temps, les animaux vont présenter une baisse de leur température corporelle ainsi que la présence de fécès de moindre consistance (fécès mous voire liquides), entrainant une perte de poids, un manque de toilette (poils ébouriffés), et un comportement non provoqué altéré (vivacité réduite, prostration). La réalisation de prélèvements et d’administrations répétés pourra également générer un stress chez l’animal.
Devenir
Tous les animaux du projet seront mis à mort à l'issue des procédures afin de pouvoir procéder aux prélèvements d'organes et à la caractérisation du statut inflammatoire terminal.
Remplacement
Lorsque cela sera possible, les composés de nos clients seront préalablement testés sur culture cellulaire ou organes isolés permettant ainsi de mieux définir les doses à administrer par exemple. Cependant, l’utilisation des animaux ne pourra pas être éviter. En effet, les modifications physiopathologiques liées à la péritonite et à la septicémie sont très complexes et nécessitent la mobilisation de nombreux effecteurs cellulaires et moléculaires ainsi que la rupture dans la coordination de leur intervention au niveau systémique. Par ailleurs, la péritonite est une maladie évolutive qui, une fois déclenchée, s’aggrave progressivement et peut aboutir à une septicémie ou à une rémission avec mise en place d’un processus de résolution de l’inflammation. De plus, l’analyse de l’efficacité d’un candidat médicament nécessite de prendre en compte le caractère systémique afin d’appréhender son action sur les différentes complications dont la contribution dans la pathologie peut influencer positivement ou négativement l’impact thérapeutique. Nous devons être en mesure de prévoir l’apparition d’effets secondaires dans l’éventualité de l’utilisation future des candidats médicaments en clinique. Les procédures expérimentales présentées à l’appui de ce projet ne peuvent donc pas être remplacées par d’autres méthodes n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information.
Réduction
Au sein de cette étude, nous avons réduit le nombre d'animaux utilisés au maximum pour une étude statistique soit 10 animaux par groupes au début de l'étude. Nous souhaitons atteindre au moins 80% de survie chez les animaux au cours du protocole, les analyses statistiques réalisées doivent donc comprendre un nombre d'animaux d'au moins 8 à la fin de l'étude. La comparaison des groupes entre eux sera faite à l'aide de test statistiques. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés et, lorsque cela est possible, l’impact in-vitro ou ex-vivo des candidats médicaments sera initialement évalué en culture cellulaire ou sur organes isolés. Le nombre d’animaux nécessaires pour répondre aux différentes problématiques scientifiques exposées dans ce projet a été déterminé en se basant sur des travaux préliminaires ainsi que sur l’expertise de notre société sur l’utilisation de ces modèles animaux. Les doses à tester seront au préalable, systématiquement évaluées après documentation dans la littérature ou par retour d’expérience du client. Par ailleurs, compte tenu de la variabilité des paramètres observés au sein d’un groupe homogène, une analyse sur des groupes de 8 animaux sera nécessaire.
Raffinement
Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal, en limitant douleur, souffrance et stress, selon des points limites définis. Les souris seront hébergées conformément à la réglementation, avec enrichissement (igloo, ouate). Après induction de la pathologie (péritonite ou septicémie), un suivi régulier sera mis en place : toutes les 2h pendant 8h post-induction, puis 2 fois/jour pendant 2 jours, puis quotidiennement jusqu’à la fin de la procédure. Température corporelle et poids seront mesurés chaque jour durant les 3 premiers jours, puis hebdomadairement. L’état de santé général sera évalué quotidiennement selon un score comportemental et physique. Un score de 4 pour un seul critère entraînera l’arrêt immédiat de l’expérimentation. L’administration d’anti-inflammatoires ou d’analgésiques n’est pas possible, ces traitements interférant avec les voies inflammatoires cibles de l’étude, le comportement, l’état physique et la molécule testée. Les animaux seront néanmoins surveillés de manière rapprochée, et les expérimentateurs utiliseront une grille de score pour identifier les points limites et décider, si nécessaire, de la mise à mort. Les manipulations répétées (prélèvements, administrations) pouvant générer du stress, des enrichissements seront ajoutés dans chaque cage (igloo, ouate, buchettes si besoin). Les aiguilles et sondes seront adaptées au poids et à la voie d’administration. Un antalgique sera injecté avant l’anesthésie. Pendant la chirurgie, un gel ophtalmique sera appliqué pour éviter le dessèchement oculaire. La température corporelle sera maintenue via un tapis chauffant. Le niveau d’anesthésie sera vérifié (absence de réflexe au pincement). Après l’intervention, 1 mL de sérum physiologique chauffé à 37 °C sera injecté pour réhydrater l’animal. Il sera ensuite placé 30 min sur un tapis chauffant sous lampe UV, puis transféré en cage.
Choix des espèces
L’utilisation de souris dans la modélisation de pathologies présentes chez l’Homme a longuement été décrite et justifiée de par leur proximité avec l’Homme. Par ailleurs, la souris est largement décrite comme une espèce de choix dans les modèles de développement de maladies inflammatoires et infectieuses du péritoine telles que la péritonite et la septicémie compte tenu des outils cellulaires et moléculaires existants. Il s’agit en effet d’un modèle bien établi et bien documenté dans la littérature pour l’analyse de l’inflammation. Par ailleurs, ce projet basé sur l'étude de l'inflammation nécessite l'utilisation d'animaux dont le système immunitaire est mature, c'est à dire âgés de 7 et 20 semaines.
Test de nouveaux adjuvants de vaccins protéiques chez la souris et le rat
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Rats : 150
1 200 souris et 150 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit trois injections de vaccin sous anesthésie, espacées de quinze jours sur soixante jours, et subit cinq prélèvements de sang, avec une fièvre, une perte d'appétit et un gonflement au point d'injection attendus pendant un à deux jours. Il s'agit de tester de nouveaux adjuvants censés déclencher une réponse cellulaire cytotoxique que les adjuvants autorisés chez l'humain n'obtiennent pas. Le porteur écrit vouloir démontrer que ses modèles cellulaires pourraient à terme remplacer les animaux, et tire de cette comparaison même la "nécessité de l'utilisation d'animaux à des fins scientifiques".
Objectifs
Les vaccins protéiques sont une classe de vaccins qui utilisent des protéines spécifiques de pathogènes pour stimuler une réponse immunitaire protectrice chez l'organisme. A cette composante protéique est ajouté un adjuvant afin d’obtenir une réponse immunitaire capable de protéger contre le pathogène ciblé. A ce jour, les adjuvants acceptés chez l’homme induisent de bonne réponses anticorps, mais la réponse cellulaire cytotoxique est très faible. Ces vaccins protéiques sont donc à ce jour peu efficaces pour protéger des infections virales. Nous avons développé de nouveaux adjuvants dans le but d’augmenter fortement cette réponse cellulaire cytotoxique. Nous avons développé de plus des stratégies pour limiter les effets secondaires tel que fièvre, inflammation locale… Nous nous proposons maintenant de tester ces candidats adjuvants chez le rongeur sur un modèle de vaccination très classique nous permettant d’évaluer la réponse immunitaire ainsi que vérifier l’absence d’effets secondaires importants.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but premier de trouver de nouveaux adjuvants pour des vaccins protéiques capable d’induire une bonne réponse immunitaire humorale et cellulaire importante sans générer d’effets secondaires importants. Il est important de noter qu’à ce jour il n’y a pas d’adjuvants réellement efficaces pour les vaccins protéiques qui permettent d’obtenir une bonne protection contre les pathogènes viraux. Ce projet pourrait permettre de mettre au point des vaccins contre des maladies virales pour lesquelles il n’existe aucun vaccin efficace à ce jour.
Procédures
Les animaux anesthésiés auront 3 injections de vaccins (temps injection 1 min max) espacés de 15 jours sur une durée de 60 jours. Cinq prélèvements de sang seront effectués sur chaque animal (temps prèlèvement 1 min maximum) et sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sont ceux attendus après une vaccination : Une rougeur locale au site d’injection, un petit gonflement, une induration, et une douleur au toucher pourront être observés, leur intensité est légère à modérée sur une durée de quelques heures à 1 jour. De la fièvre, une perte d’appétit et des poils hérissés peuvent également apparaître et persister en théorie de 1 à 2 jours, entraînant une nuisance modérée.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort afin de pouvoir prélever des tissus dans le but d’étudier au mieux la réponse vaccinale.
Remplacement
Le recours à des animaux est justifié par la nécessité d’avoir un système immunitaire complet pour mesurer l’immunogénicité et la réactogenicité de nos formulations vaccinales. Le recours à des animaux semble donc inévitable à ce jour. L’un des buts de ce projet est aussi de démontrer l’intérêt de nos modèles cellulaires ainsi que nos modèles de diffusion /relarguage in vitro pour remplacer ou fortement diminuer à terme l’utilisation des animaux. Mais, pour obtenir cet objectif, nous devons comparer les réponses entre modèles cellulaire et modèles animaux, d’où la nécessité de l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques.
Réduction
Chaque expérimentation chez la souris est réalisée avec un maximum de 8 groupes de 6 souris. Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé à partir des publications de vaccination. D’après notre expérience, il est suffisant pour permettre à l’expérimentation de mettre en évidence des différences significatives sur le titre anticorps entre les groupes, notre critère majeur. Ces expériences chez la souris permettront de déterminer une ou 2 formulations vaccinales optimisées qui seront ensuite testées chez le rat. Les expérimentations chez le rat sont réalisées sur un maximum de 3 groupes de 5 rats. Ce nombre restreint permet de garder suffisamment d’animaux par groupe pour réaliser des études statistiques significatives.
Raffinement
Les animaux sont anesthésiés avant chaque injection ou prélèvement pour limiter au maximum le stress et la douleur. Les animaux immunisés ne sont pas censés avoir de troubles de leur santé suite à l’injection des candidats vaccins. Une réaction locale au niveau du site d’injection ou de la fièvre peut cependant être induite par la réponse immunitaire innée de l’animal vis-à-vis du vaccin. Une surveillance particulière avec examen clinique individuel 4h et 24h après injection sera réalisée en plus de la surveillance quotidienne. Une grille de « scoring » permettra de mettre en place un traitement pour palier à la douleur que pourrait ressentir l’animal. A l’aide de cette grille de scoring, les éventuels signes cliniques de douleur (locale ou générale) sont détectés, et un traitement d’analgésique locaux ou injectable est appliqué pour y remédier. Dans le cas exceptionnel de douleur non maitrisée par ces traitements, les animaux sont immédiatement mis à mort.
Choix des espèces
Les espèces animales sélectionnées, souris et rats, sont les espèces couramment utilisées pour les premiers tests de vaccination : la souris est utilisée dans un premier temps car notre modèle d’étude est le modèle immunologique de référence chez la souris. Dans un second temps, le rat est utilisé comme second modèle car sa taille plus importante permet d’avoir une première idée de l’extrapolation des doses injectables à un plus gros animal. Ces expériences seront réalisées sur des souris ou rats adultes matures âgées de 8 à 12 semaines. A cet âge, le système immunitaire est totalement développé.
Mise au point du modèle de sclérose dermique induite par HOCl chez la souris C57 BL/6 et traitement avec les candidats
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune recevant jusqu'à trente injections intradermiques d'acide hypochloreux. Le produit épaissit et durcit la peau du flanc, provoque des croûtes et une inflammation chronique, avec des léchages et des grattages excessifs, une perte de poids et une altération du pelage. Six injections intraveineuses et sept prises de sang par animal s'y ajoutent, pour tester des anticorps censés traiter la sclérodermie. Les anticorps ne seront testés que si la première partie du projet parvient d'abord à installer la maladie chez la souris, ce qui range les bénéfices annoncés derrière une condition quand les lésions cutanées, elles, sont programmées.
Objectifs
La sclérose dermique, maladie auto-immune, plus connue sous le nom de sclérodermie, est une maladie rare où la peau devient anormalement dure et épaisse. Cette maladie est due à une surproduction de collagène, une protéine qui rend normalement la peau souple, mais qui, en excès, la rend rigide et moins fonctionnelle. Dans ce projet, nous souhaitons mettre en place ce modèle sur des souris (première partie du projet) pour ensuite tester nos différents anticorps candidats ciblant une protéine membranaire pour traiter cette maladie (deuxième partie du projet).
Bénéfices attendus
A ce jour, il n’existe pas de traitement curatif de la sclérose dermique. Les approches thérapeutiques visent à ralentir la progression de la maladie, à soulager les symptômes et à améliorer la qualité de vie. Le traitement est adapté selon la forme de la maladie et les organes atteints. C’est pourquoi le développement de nouveaux traitements est à ce jour nécessaire.
Procédures
Pesées : 8 pesées x 30 sec = 4 min Injections intradermales : 30 injections x 30 sec = 15 min Injection intraveineuses : 6 injections x 1 min = 6 min Prélèvements de sang : 7 prélèvements x 1 min = 7 min
Impact sur les animaux
Douleur et inconfort localisés : L’injection intradermique peut provoquer une légère douleur au point d’injection, avec un risque d’inflammation locale, d’œdème, de rougeur et de sensibilité accrue de la zone traitée. Développement de lésions cutanées : Les souris développent un épaississement local de la peau, une induration, ou des croûtes, pouvant gêner la mobilité ou entraîner des comportements de léchage ou de grattage excessifs. Inflammation et stress : L’administration répétée de d'acide hypocloreux induit une inflammation chronique locale, source d’inconfort, de stress pour l’animal. Altération de l’état général : Si la réaction inflammatoire est importante ou si les lésions sont étendues, on peut observer une baisse d’activité, une perte de poids ou une altération du pelage, signes d’une souffrance plus globale.
Devenir
Tous les animaux des différentes procédures seront euthanasiés. En effet, les organes et sites d’injections sont prélevés pour analyse
Remplacement
Il existe à ce jour des méthodes in vitro permettant de reproduire au mieux de manière limité l’induction de la sclérose dermique comme par exemple l’utilisation de cultures de cellules humaines ou de tissus reconstruits, tels que la peau artificielle ou des organoïdes cutanés. Ces modèles permettent d’étudier les mécanismes de la fibrose, de tester des molécules et d’observer les effets sur des tissus humains. Cependant il est toujours impossible de reproduire l’effet biologique et physiologique de l’organisme tout entier. Ainsi, les constructions testées dans ce modèle ont d’abord été validées par test in vitro, notamment pour tester leur efficacité sur la cible mais aussi leur tolérance
Réduction
Nous utiliserons donc un nombre minimal d’animaux par groupe : induction de la maladie chez 12 souris pour une inclusion dans les procédures de 10 souris par groupe minimum à la fin de l’expérience (le taux de réussite de l’induction de la sclérose dermique est de 80-90% selon la littérature). Ce nombre nous permettra d’arriver à des résultats statistiquement significatifs. Lors de la première partie du projet, nous développerons le modèle avant de tester dans une seconde partie nos candidats. Par conséquent, si le modèle n’est pas validé en première partie, les anticorps ne seront pas testés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe de 4 avec enrichissement du milieu (tunnel et fristotis en carton), et surveillés quotidiennement. Les injections intradermiques sur le flanc (induction) ainsi que les injections intraveineuses (traitement) sont réalisées par un expérimentateur entraîné, et réalisées sous anesthésie (lidcoaine au point d'injection). Observation quotidienne des animaux (apparence, consommation aliment et eau, comportement), pesée des animaux tout au long de la procédure (jour 0, 2, 4, 7 et 14 puis une fois par semaine jusqu’à la fin de l’étude). Pour chaque animal et donc chaque injection l’aiguille sera changée, nous utilisons ici des aiguilles stériles. La salle de manipulation est intégralement nettoyée (paillasse et sol) avant toute injection. Nous veillerons à ce que toutes les conditions environnementales pour l’injection soient les plus propres possible. Les points limites sont décrits dans chacune des procédures. De plus, tout autre signe clinique observé, indépendamment des procédures (pendant la période d’acclimatation par exemple), fera l’objet de soins tels que définis en accord avec le vétérinaire suivant le tableau fourni en annexe.
Choix des espèces
Les souris C57BL/6 présentent une réponse inflammatoire marquée, ce qui les rend particulièrement adaptées à l’étude des maladies auto-immunes et inflammatoires comme la sclérodermie. Elles permettent de reproduire de façon fiable les mécanismes de fibrose et de vasculopathie observés chez l’humain. Elles sont sensibles au développement de la fibrose cutanée, notamment lors de l’administration de substances comme l'acide hypochloreux. Ce profil permet de modéliser efficacement les différentes phases de la maladie et d’évaluer l’efficacité de nouveaux traitements Nous utiliserons des jeunes adultes âgés de 6 semaines au début du protocole (20-25g). Cet âge permet d’assurer une bonne santé générale, une réponse immunitaire stable et une croissance terminée, ce qui est crucial pour la reproductibilité et l’interprétation des résultats. En fin d’expérience les animaux seront âgés de 12-17semaines (30-40g).
Prélèvement de tissus pour génotypage de souris génétiquement modifiées
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Un morceau d'oreille de 2 mm est découpé sur des souriceaux de 21 à 28 jours, sous anesthésie, au moment du sevrage. 2 500 souris génétiquement modifiées vont être utilisées de cette façon, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance légère, et aucune n'est tuée dans le cadre de ce projet. L'établissement décrit le prélèvement de poils, non invasif, comme sa méthode courante et la biopsie d'oreille comme un recours quand le résultat n'est pas concluant, tout en en programmant 2 500. Les souris porteuses du génotype recherché partent vers les projets de recherche du laboratoire ou vers des prélèvements post-mortem, les autres pouvant être réutilisées pour "la formation du personnel".
Objectifs
Les souris génétiquement modifiées génotypées lors de ce projet seront utilisées dans les différents projets autorisés de notre établissement portant principalement sur la production de plaquettes et les fonctions plaquettaires. Les souris génétiquement modifiées doivent être identifiées individuellement pour faire correspondre chaque animal à un génotype spécifique. L’identification est réalisée par tatouage à l’encre aux doigts des souris. Le génotypage se fait de manière générale par prélèvement de poils (non invasif), cependant pour certaines lignées, il peut arriver que le génotypage poils donne des résultats non concluant. Il est alors nécessaire de réaliser une biopsie à l’oreille pour obtenir un génotypage fiable. L’objectif de ce projet est de prélever un bout d’oreille nécessaire à la bonne caractérisation génétique des animaux.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont de pouvoir fournir des animaux du génotype souhaité pour les projets autorisés et les prélèvements post-mortem. De plus, ce projet permet de caractériser génétiquement les animaux servant au maintien et à l’optimisation de la gestion d’élevage.
Procédures
Les souris anesthésiées sont soumises à un prélèvement de tissus à l’oreille (2 mm) qui dure 5 minutes.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont un stress pour les animaux. Une douleur légère et de courte durée peut être ressentie après le prélèvement prélèvement.
Devenir
Les animaux génotypés présentant le génotype souhaité iront en utilisation continue dans les projets de recherche autorisés dans notre laboratoire, pour des prélèvements de tissus post-mortem et pour le maintien de l’élevage. Les animaux ne présentant pas le génotype souhaité pourront être réutilisés pour le formation du personnel.
Remplacement
Les souris de ce projet seront utilisées dans des projets autorisés de notre laboratoire lorsqu’elles ont le génotype attendu. Les alternatives non animales et l’impossibilité de les utiliser sont détaillées dans les projets concernés. Il est indispensable de connaitre le génotype des animaux afin de les utiliser dans les projets autorisés. Il n’est donc pas possible de remplacer les animaux ici.
Réduction
Le nombre d’animaux génétiquement modifiés pour lesquels un prélèvement à l’oreille pour le génotypage sera fait est calculé en fonction des besoins expérimentaux. Les élevages sont optimisés pour produire un maximum d’animaux ayant le génotype d’intérêt pour les projets autorisés. Les animaux surnuméraires ou ne possédant pas le génotype d’intérêt peuvent être utilisés pour la formation du personnel. Le nombre d’animaux concernés par ce prélèvement de tissu invasif est réduit au maximum par la mise en place dans notre établissement de prélèvement de poils (méthode non invasive) pour la réalisation des génotypages. Cependant, cette méthode peut parfois conduire à un génotype non concluant et nécessiter un génotypage invasif par prélèvement à l’oreille.
Raffinement
Pour réduire le nombre de manipulations, la biopsie à l’oreille est réalisé au même moment que le sevrage des souriceaux. La biopsie est réalisée sous anesthésie par un personnel expérimenté et n’excède pas 5 minutes par animal. Les animaux sont surveillés sur 3 jours après le prélèvement.
Choix des espèces
Les modifications génétiques des souris produites et élevées dans notre établissement permettent de réaliser des projets de recherche autorisés et de répondre à des questions scientifiques concernant la production de plaquettes et les fonctions plaquettaires. La souris est un modèle largement connu d’un point de vu génétique, permettant de générer différentes modifications génétiques. Ses mécanismes physiologiques proches de ceux de l’Homme en font un très bon modèle d’étude pour les différents projets de notre laboratoire. Les souris seront prélevées à l’oreille entre 21 et 28 jours. La procédure de génotypage est réalisée à ce stade car elles doivent être utilisées dès l’âge adulte dans les projets autorisés ou pour des prélèvements de tissus post-mortem. Cela permet également de connaitre le génotype des animaux suffisamment tôt pour effectuer le maintien de l’élevage.
Développement d’un vaccin dirigé contre les flavivirus
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Vérifier si une émulsion de gouttelettes lipidiques chargées de protéines virales déclenche une production d'anticorps : 180 souris vont être utilisées pour cette seule question, toutes tuées à l'issue pour prélever leur rate, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent trois injections espacées de deux semaines, quatre prises de sang sur animal vigile, et sont manipulées chaque jour pour la pesée et la prise de température. Le porteur reconnaît que ces manipulations quotidiennes induisent du stress, que la piqûre provoque de la douleur et que l'émulsion peut enflammer le site d'injection. Il annonce poser "les bases d'une future formule vaccinale novatrice", à partir de groupes de cinq souris dimensionnés sur un effet statistique attendu élevé.
Objectifs
Les gouttelettes lipidiques sont de petites structures présentes dans nos cellules qui servent à stocker des graisses. Depuis quelques années, il a été découvert qu’elles jouent aussi un rôle important dans certaines infections par des virus. En effet, certains virus utilisent ces réserves de graisses à leur avantage : ils modifient leur fonctionnement pour se reproduire plus efficacement. Certains virus s’en servent même comme « plate-forme » pour fabriquer de nouvelles copies d’eux-mêmes avant de sortir de la cellule. Pour cette raison, l'interaction de protéines virale et de gouttelettes lipidiques émerge comme une cible pertinente pour des stratégies thérapeutiques chez l'homme et l'animal. Ces interactions ont été mises en évidence pour le virus de l'hépatite C mais également pour le virus de la Dengue et le Zika. Ce mécanisme de détournement de la gouttelette lipidique semble donc être une généralité pour les virus de la famille du virus de l’hépatite C , dont certains sont également à l'origine de zoonoses préoccupantes, avec un impact économique important sur les élevages (ex. Tembusu du canard). Dans ce projet, nous allons utiliser notre expertise pour fabriquer et purifier des protéines virales associées aux gouttelettes lipidiques. Ces gouttelettes seront utilisées pour vacciner des souris. Cette méthode repose sur les propriétés bien connues de ces gouttelettes, en particulier des mélanges d'huile et d'eau, qui sont reconnues pour leur capacité à stimuler efficacement le système immunitaire. Nous espérons par ces expérimentations, identifier les bases d’une future formule vaccinale novatrice.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à démontrer si l'immunisation par des émulsions de gouttelettes lipidiques intégrant des protéines virales peut induire une production d'anticorps, posant ainsi les bases d'une approche vaccinale innovante.
Procédures
Les interventions réalisées sur les souris seront les suivantes : Trois injections espacées de 2 semaines sur 180 souris vigiles. Durée de l’intervention :20 secondes. Manipulation et potentielle contention pour pesée et prise de température quotidienne sur 180 souris, durée de l’intervention inférieur à la minute. Quatre prises de sang espacées de 1 à 2 semaines, i.e. contention et prélèvement sur 180 souris vigiles, durée de l’intervention environ 1 minute.
Impact sur les animaux
Le protocole nécessite de manipuler tous les animaux quotidiennement pour évaluer certaines constantes (poids, température, etc…) donc induction de stress L’immunisation en elle-même nécessite l’injection de l’émulsion, la piqure provoque donc de la douleur, l’exposition à l’émulsion peut également induire une petite inflammation à la zone d’injection. De même, les prélèvements sanguins peuvent induire une douleur lors de la prise de sang.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de prélever leur rate.
Remplacement
Notre thématique de recherche est impossible à mettre en œuvre sans animaux. En effet la mécanistique permettant la production d’anticorps nécessite l’implication dynamique de multiples acteurs cellulaires dans des contextes tissulaires complexes ne pouvant être reproduit par des méthodes alternatives.
Réduction
Notre stratégie de réduction est basée sur l’emploi de tests statistiques nous permettant de valider nos hypothèses scientifiques sur la base de résultats obtenus avec le nombre minimal d’animaux en termes d’effectifs. Les comparaisons inter-groupes seront réalisées au moyen de tests non-paramétriques. Les principales mesures réalisées seront les quantités d’anticorps spécifiques induites par les différentes immunisations. Les tests utilisés sont : Test de Mann-Whitney,ANOVA de Kruskal-Wallis, Analyse en composantes principales. Nous anticipons des différences nettes entre les groupes témoins et les groupes vaccinés lorsque la présentation de l’antigène est efficace. Par ailleurs, nous nous attendons à une variabilité interindividuelle relativement faible. Dans ce contexte, la puissance statistique dépend principalement du rapport entre l'effet attendu et l'écart-type (Différence de Cohen). Un effet ≥ 2 nous permet raisonnablement d’envisager une puissance approchant 80 %, ce qui justifie le choix de groupes de 5 souris.
Raffinement
Des observations quotidiennes seront effectuées afin de s’assurer du bien-être des animaux. Nous surveillerons l’apparition des symptômes suivants : diarrhée, poil hérissé, léthargie, yeux clos et dos courbé. Le cas échéant, l’administration d’analgésique (AINS) pourra être envisagée en concertation avec le personnel de l’animalerie. Nous veillerons également à réduire les sources de stress afin d’augmenter le bien-être animal. Les prélèvements sanguins seront réalisés avec des micro-aiguilles pour minimiser le saignement et prélever le volume le plus petit possible nécessaire à la sérologie. D’autre part, les administrations de gouttelettes lipidiques seront faites par injections lentes afin de minimiser la douleur et de réduire la variabilité intra et inter-expériences que le stress pourrait engendrer. Les souris seront hébergées dans un local climatisé, dans des cages à couvercle filtrant avec boisson et aliments standard ad libitum (maximum de 5 animaux/cage). Aucun animal ne sera isolé et les souris seront dès leur transfert réparties en groupe de 5 et maintenues au sein du même groupe pendant la durée de l’expérimentation.
Choix des espèces
La souris a été sélectionnée en raison de sa capacité à reproduire de manière pertinente les mécanismes immunitaires spécifiques ciblés par notre protocole vaccinal, notamment la génération de réponses humorales et cellulaires adaptatives comparables à celles observées chez l’humain. De plus, des modèles murins permettent de moduler précisément les conditions expérimentales (ex. lignées transgéniques ou knock-out) pour explorer les voies immunitaires impliquées, ce qui est indispensable à la compréhension fine des mécanismes d’efficacité et de tolérance du vaccin. De plus, le modèle souris dispose d’une richesse incomparable en outils immunologiques. Souris femelles à l’âge de 8 semaines car le système immunitaire est mature.
Génotypage pour maintien de lignée et inclusion en protocole
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
Biopsie de l'extrémité de la queue, moins de deux millimètres, pratiquée de préférence dans la première semaine de vie, sur animal vigile ou sous anesthésie gazeuse selon l'âge : 1 250 souris subissent ce geste pour que leur génotype soit identifié, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le porteur écrit préférer l'intervention à une semaine parce que "les circuits de perception de la douleur ne sont pas encore matures à cette âge là", et n'attend qu'une douleur passagère. Les souris porteuses du génotype recherché rejoignent d'autres protocoles de recherche, une partie du reste est gardée pour le renouvellement de l'élevage. Celles qui n'ont pas le bon génotype, ne peuvent être utilisées en nécropsie ou ont dépassé l'âge de la reproduction sont mises à mort.
Objectifs
Afin de déterminer les animaux génétiquement altérés d'intérêt dans les cadre d'élevage et de projet APAFiS, il est nécessaire de réaliser un génotypage des souris présentes en élevage à l'animalerie. Pour ce faire, les souris subiront une biopsie de l'extrémité de la queue.
Bénéfices attendus
L'identification génétique nous permet de sélectionner les animaux à inclure dans les procédures expérimentales de recherche.
Procédures
Les souris subiront une biopsie au niveau de l'extrémité de la queue (≤2mm). Ce prélèvement se fera jusqu'à la 3e semaines de vie. L'opérateur effectuera cette biopsie préférentiellement lors de la première semaine de vie. Selon leur âge et leur capacité à répondre à une anesthésie, le geste pourra être réalisé sur animaux vigiles ou anesthésiés (anesthésie gazeuse).
Impact sur les animaux
Une douleur passagère est attendue au moment du prélèvement.
Devenir
Cette procédure vise à définir les animaux d'intérêt pour d'autres protocoles de recherche ou le maintien de la lignée. Outre les animaux d'intérêt, les animaux restants serviront au maintien des lignées et/ou seront proposés en nécropsie. Toutefois, les animaux qui n'auront pas le bon génotype et ne pouvant être utilisés en nécropsie; ou dont l'âge ne permettait plus la reproduction seront mis à mort.
Remplacement
Afin de déterminer les animaux d’intérêt pour des projets scientifiques, il est nécessaire d’effectuer une indentification génétique par un prélèvement au bout de la queue. Ce protocole étant préliminaire à des études autorisées utilisant des animaux transgéniques à des fins scientifiques, il n'est pas possible de remplacer l'utilisation des souris par une méthode alternatives.
Réduction
La procédure ne sera réalisée que sur des animaux dont le croisement d'origine permet d'obtenir le génotype d'intérêt. La vérification du génotype au cours de l'élevage nous permet de limiter les dérives génétiques. La gestion de l'élevage sera raisonnée en fonction des inclusions à différents projets et du maintien de l'lélevage. Le nombre d'animaux est défni en fonction de notre protocole actuel pour le maintien de l'élevage. Ce nombre sera réduit en fonction des portées obtenues.
Raffinement
Après leur naissance, les animaux resteront hébergés en groupe avec leur mère dans une cage bénéficiant d'un milieu enrichi (coton foisonnant, aspen brick, tube carton et dôme) jusqu'à leur sevrage. Le geste sera réalisé au cours des 2 premières semaines de vie des souriceaux pour limiter la douleur associée à ce geste. Après sevrage, les animaux seront hébergés en groupe et avec un milieu enrichi. Les souris seront vérifiées quotidiennement et différentes mesures seront mises en place pour assurer leur bien-être. Dans le cas où un point limite serait atteint, l'animal concerné sera mis à mort.
Choix des espèces
Nos protocoles d'étude impliquent une vérification du génotype concernant les modèles expérimentaux murins transgéniques. Les souris seront préférentiellement génotypées à une semaine de vie car les circuits de perception de la douleur ne sont pas encore matures à cette âge là. Ainsi le geste ne sera pas traumatique et sera conforme aux bonnes pratiques. En cas de nécessié, le prélèvement sera réalisé avant leur sevrage (maximum 3 semaines).
Impact d’une manipulation des contrôles inhibiteurs des neurones dopaminergiques en modèles de maladie de Parkinson EU2/2 (MODIFICATION)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Transportées d'un établissement à l'autre pour y passer deux examens d'IRM de deux heures sous anesthésie, 996 souris vont être utilisées dans ce projet sur la maladie de Parkinson, dont 320 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 160 opérées sous anesthésie puis tuées avant tout réveil. Elles subissent une biopsie de queue sur animal vigile vers le sixième jour de vie, une chirurgie d'une heure trente à quatre heures, puis jusqu'à trente-six tests comportementaux de dix à quarante-cinq minutes répartis sur vingt semaines, avant d'être toutes mises à mort pour prélèvement de tissus. Le porteur indique que la lésion dopaminergique entraîne une perte de poids et des déficits moteurs, et que les altérations des seuils de douleur "ne peuvent être soulagées car c'est l'objet de l'étude". Sur le remplacement, il affirme que la structure cérébrale visée n'a été localisée que chez les mammifères, ce qui exclut selon lui tout autre modèle.
Objectifs
MODIFICATION: La perte des neurones dopaminergiques dans la maladie de Parkinson s’accompagne d’un dysfonctionnement de certains circuits cérébraux et de symptômes moteurs et non-moteurs qui restent difficiles à prendre en charge. La lésion d’une région cérébrale incluant une structure qui est un contrôle de ces neurones dopaminergiques peut améliorer certains symptômes. L’identification récente d’un marqueur moléculaire sélectif de cette structure permet désormais d’étudier les conséquences d’une modulation de l’activité de cette structure dans un modèle de la maladie de Parkinson. L’objectif du projet est ainsi de tester si l’inhibition sélective de cette structure peut soulager les symptômes nociceptifs, moteurs, cognitifs et anxiodépressifs. Les patients Parkinsoniens présentent par ailleurs des altérations structurelles et fonctionnelles de leur réseaux cérébraux, visibles par imagerie par résonance magnétique (IRM). Ces altérations de la connectivité cérébrale pourraient être modifiées par l’inactivation de notre structure d’intérêt. L’identification des changements de connectivité cérébrale et la mise en évidence de l’implication de zones spécifiques au niveau du cerveau pourraient aider la recherche préclinique et clinique, et accélérer les stratégies thérapeutiques. Ce projet se déroule dans 2 Etablissements Utilisateur: EU1 et EU2. La nécessité de procéder à des séances d'imagerie par IRM conduit à l'ajout de 40 animaux .
Bénéfices attendus
La structure cérébrale ciblée par ce projet exerce un contrôle inhibiteur sur les systèmes dopaminergiques, qui dégénèrent dans la maladie de Parkinson. Ce projet doit permettre de tester si une inhibition de cette structure peut améliorer les symptômes nociceptifs, moteurs, cognitifs et anxiodépressifs, apportant ainsi une preuve de concept sur le potentiel thérapeutique de cette cible anatomique. La maladie de Parkinson est la seconde maladie neurodégénérative la plus fréquente. Connue pour ses symptômes moteurs, cette maladie a aussi des conséquences délétères non-motrices, incluant douleur, troubles de l’humeur et déficits cognitifs. Les patients présentent en moyenne 14 symptômes dans les phases précoces de la maladie et plus de 20 dans des phases plus tardives, mettant en évidence le besoin de prendre cette complexité en considération dans la recherche préclinique.
Procédures
MODIFICATION Les animaux sont soumis à une biopsie de tissu pour réaliser leur génotypage, cette biopsie est effectuée sur animal vigile autour de 6 jours postnatal, ou à défaut sur animal sous anesthésie à partir de 12 jours postnatal. Les animaux sont soumis à une biopsie de tissu pour réaliser leur génotypage, cette biopsie est effectuée sur animal vigile autour de 6 jours postnatal, ou à défaut sur animal sous anesthésie à partir de 12 jours postnatal. Des animaux sont soumis à 1 chirurgie d’au maximum 1h30 ou 4h, et un maximum de 36 tests comportementaux de 10 à 45 minutes chaque, répartis sur 20 semaines avec au moins un jour de repos entre chaque test. Les animaux sont soumis à deux examens IRM sous anesthésie, incluant chacun au plus une séquence d'IRM fonctionnelle de 16min, une d'IRM anatomique de 10 min et une d'IRM de diffusion de 60 min (TOTAL=2 heures maximum par examen) (EU2).
Impact sur les animaux
MODIFICATION Une douleur légère et de courte durée peut être provoquée par la biopsie de tissus. La chirurgie peut entraîner une perte de poids transitoire, une douleur postopératoire modérée, une inflammation locale transitoire autour du dispositif des points de suture (peau du crâne). Les tests comportementaux peuvent s’accompagner d’un stress léger. Les lésions dopaminergiques modélisant la maladie de Parkinson peuvent entrainer une perte de poids sur les 10 premiers jours après la lésion. Des déficits moteurs liés à la modélisation de la maladie de Parkinson sont également attendus, ainsi que des altérations sensorielles des seuils de douleur qui ne peuvent être soulagées car c’est l’objet de l’étude. Le transport et l’environnement inconnu de la nouvelle animalerie peuvent également entrainer un stress chez les animaux au moment du changement d’EU.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour prélèvements de tissus.
Remplacement
MODIFICATION Compte tenu du sujet du projet, il est impossible de remplacer le modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. En effet, les comportements étudiés et la connectivité cérébrale nécessitent un système nerveux complet et un animal entier, vivant et vigile. L’existence et la localisation de la structure cérébrale étudiée n’ont pour l’instant été établies que chez les mammifères, ne permettant donc pas en l’état actuel des connaissances d’utiliser un autre modèle animal.
Réduction
Les expériences sont menées en cherchant à limiter le nombre d'animaux, tout en obtenant l’information scientifique recherchée. Pour les diverses expériences, ce nombre d'animaux nécessaire pour tirer des conclusions scientifiques statistiquement fiables est défini sur la base de notre expertise, de l'analyse de la littérature et de calculs de power analyse.
Raffinement
MODIFICATION Les animaux sont hébergés en groupe sociaux dans des cages enrichies (bâton, tunnel, coton et frisure) favorisant leur comportement naturel (ronger et faire des nids). Ils sont acclimatés aux conditions d’hébergement et habitués aux expérimentateurs. Ils sont habitués à la manipulation avant la chirurgie, ainsi qu’aux environnements des tests comportementaux avant leur réalisation. Les animaux seront suivis pour déceler tout signe de mal-être. Durant les chirurgies, des méthodes d’anesthésie et d’analgésie sont utilisées, la température maintenue (tapis chauffant) et les yeux protégés par du gel oculaire. Après la chirurgie, une grille d’évaluation est utilisée pour le suivi des animaux. Des soins, une administration d’antalgique ou d’anti-inflammatoire et/ou une séparation des animaux seront réalisés si besoin après concertation avec le vétérinaire ou la cellule chargés du bien-être animal. Des points limites sont mis en place pour l’ensemble des procédures pour limiter ou soustraire l’animal à la souffrance. Le transport entre les 2 EU se fera dans des cages sécurisées avec nourriture et eau gélifiée et une période de 1 semaine sera respectée avant le début des examens IRM. Durant celui-ci, une anesthésie sera utilisée pour réduire au maximum le stress de l'animal. Leurs yeux seront protégés du dessèchement par l’application d’un gel de protection. La température et la respiration des animaux seront en permanence surveillées par un système de monitorage et maintenue par un système de chauffage du berceau de l’IRM et un tapis chauffant. En cas de chute de la température et/ou d’une respiration altérée, l'acquisition en cours sera immédiatement interrompue et l'animal sorti de l'IRM et pris en charge. Il sera placé dans une enceinte chauffante jusqu'à son réveil, sous surveillance. Des points limites ont été établis afin de soustraire les animaux à la douleur.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris modifiées génétiquement pour cibler sélectivement les neurones de la structure cérébrale étudiée. Ceci implique l'utilisation de souris spécifiques et ne permet pas l'utilisation d'autres espèces. Étant donné que les études nécessitent des systèmes neurobiologiques matures, des animaux adultes seront utilisés. Le génotypage est prioritairement effectué entre 6 et 8 jours, et la chirurgie à partir de 8 semaines d’âge.