Souris

Tremblements, convulsions, posture anormale, absence de réaction à la stimulation : ce sont les signes dont l'apparition déclenche la mise à mort anticipée des rongeurs de ce projet. 300 souris et 300 rats vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont exposés à des situations stressantes et à des chocs électriques, puis soumis à des tests d'anxiété de cinq à quinze minutes et à des administrations pouvant aller jusqu'à deux fois par jour pendant huit semaines, pour construire un modèle de trouble de stress post-traumatique et y tester une dizaine de candidats médicaments. Cent vingt d'entre eux pourront être réutilisés après une période de repos, les autres seront tués en fin d'étude, le porteur expliquant que les effets à moyen et long terme des substances testées sont méconnus.

Objectifs

Dans l'histoire américaine, les troubles de stress post-traumatique (PTSD) ont été reconnus sous divers noms après les guerres : "cœur de soldat de la guerre civile", choc de la Première Guerre mondiale, fatigue de combat de la Seconde Guerre mondiale, stress retardé de la guerre du Vietnam avant d’être formalisés en 1980. Ces dernières années, on a assisté à une augmentation d’intérêt pour ces psychopathologies liées à l’exposition aux traumatismes, en particulier à cause du terrorisme, des catastrophes naturelles ou encore des violences urbaines. La prévalence des troubles de stress post-traumatique serait de 5 à 12% de la population générale. Les patients, suite à leur exposition à un évènement traumatique, souffrent de symptômes sévères tels que la peur intense, des flash-backs, des cauchemars et des pensées imposées et incontrôlables. Malgré les avancées scientifiques importantes dans ce domaine, il n’y a aujourd’hui aucune thérapie réellement efficace sur l’ensemble des symptômes des troubles du stress post-traumatique. Les modèles animaux demeurent indispensables pour mieux comprendre ces troubles et identifier de nouveaux candidats médicamenteux. Ce projet vise à mettre en place un modèle de trouble de stress post-traumatique chez le rat qui intègre la sensibilité au traumatisme observée chez l’humain et de tester l’efficacité d'une dizaine de candidats médicaments existants ou en cours de développement.

Bénéfices attendus

Ce projet participera à l'amélioration de la qualité de vie des patients et de leur entourage. Un traitement plus efficace pourrait réduire plus rapidement et plus durablement les symptômes des troubles de stress post-traumatique permettant ainsi une meilleure qualité de vie des patients, de maintenir un état de santé stable plus longtemps, de diminuer les taux d'invalidité . Ce projet permettra également d'avoir un impact socio-économique positif en réduisant les coûts de santé (nombre de consultations médicales, d'hospitalisations et de traitements complémentaires nécessaires).

Procédures

Les animaux sont exposés à différentes situations stressantes en fonction des procédures. Les tests comportementaux visant à évalualer le niveau d'anxiété des animaux sont généralement effectués 1 seule fois et leur durée varie de 5 à15 minutes environ. Les administrations de substances pourront être réalisées jusqu’à 2 fois par jour (en général 1 minute par administration) principalement par voie orale sous cutanée ou intrapéritonéale sur animal vigile. La durée du traitement peut aller jusqu’à 8 semaines.

Impact sur les animaux

Les animaux seront exposés à des situations induisant une état de stress. Les chocs électriques pourront également induire une faible douleur de très courte durée. Les manipulations/contentions réalisées notamment pendant les phases d'administration ou de prélèvements peuvent également entrainer un léger stress. Les candidats médicaments qui seront évalués ont été selectionnés en amont pour leur absence de toxicité sévère.

Devenir

Tous les animaux ayant reçu une substance d’essai dont les effets à moyen et long terme sont méconnus seront euthanasiés en fin d’étude afin de s’assurer que le traitement expérimental n’induira pas d’effet délétère sur l’animal, ce qui ne serait pas compatible avec un maintien des animaux en vie dans de bonnes conditions de santé.

Remplacement

Dans le cadre du développement des médicaments, des tests in vitro ont déjà eu lieu avant l'utilisation chez l'animal. Ceux-ci constituent un point de départ permettant de générer des données préliminaires et d’effectuer un tri moléculaire pour ne retenir que les molécules présentant une certaine efficacité, réduisant de façon significative le nombre de substances à tester et donc le nombre d’animaux. L'impact des traitements pré-sélectionnés sur le comportement des animaux, et l'amélioration de symptômes liés aux états de stress et d'anxieté ne peut se faire que sur des animaux vigiles. Ainsi, les modèles d'animaux restent indispensables pour valider et optimiser de nouvelles thérapies pour leur utilisation en toute sécurité chez l'Homme.

Réduction

Les mesures de réduction s'intégrant à la règle des 3Rs vont consister à utiliser le plus petit nombre d’animaux possible pour chaque étude permettant d'obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte et d’éviter ainsi une répétition inutile des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet et la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif et éventuellement à un contrôle positif (substance de référence ou de comparaison) si cela s'avère pertinent. Selon les données de la littérature, il est estimé qu’un effectif de 12 animaux en standard par groupe (nombre d'animaux et groupes variables, selon l’objectif de l’étude) sera nécessaire pour atteindre une sensibilité correcte des tests. Le cas échéant, une réutilisation des animaux pourra être envisager après une période de repos entre l'évaluation de différentes molécules. L'analyse statistique prévue repose sur des tests paramétriques de type ANOVA "analyse de la variance" et/ou test de Student selon l'objectif de l'étude. Par ailleurs, des prélèvements terminaux (tissus, organes, sang) peuvent être ajoutés en fin de procédure pour éviter une répétition inutile de l'étude.

Raffinement

Les mesures de raffinement s'intégrant à la régle des 3Rs vont consister en un suivi des points limites clairement définis et spécifiques pour chaque procédure, permettant de stopper l'étude et/ou d'euthanasier, de façon précoce, tout animal présentant des signes de douleur et de souffrance (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont suivis par le vétérinaire et manipulés fréquemment par des techniciens préalablement formés et attentifs, prêts à agir lorsque les critères d'interruption prédéfinis sont atteints. Il est également mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de litière, objets de nidification, objets à ronger ou mastiquer, tunnels, présence de congénères (sauf cas contraire imposé par la procédure). En cas de doute, une évaluation approfondie sera réalisée quotidiennement jusqu'au retour aux paramètres physiologiques normaux ou attendus ou jusqu’à atteinte des points limites. Tous les points limites et leur cotation sont décrits dans un formulaire interne. Cette observation faite par du personnel formé inclut une surveillance de l'aspect général, l’aspect du pelage, des yeux, la posture, les réactions de l’animal sous stimulation, la respiration, l’appétit, l’état d’hydratation, les tremblements ou convulsions. Une évaluation interne impliquant la cellule de bien-être animal pourra permettre de réévaluer et d’adapter à postériori la catégorie éthique si nécessaire. Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. Prises dans leur ensemble, ces mesures tendent à limiter la variabilité des données.

Choix des espèces

Les troubles de stress post-traumatique sont largement évalués chez les animaux, en particulier chez le rongeur. Ainsi, divers tests ont été conçus pour mesurer ces différents aspects. L’impact de substances pharmacologiques sur le comportement de rongeurs est prédictif de leur efficacité en clinique. Tous les animaux seront utilisés à partir de 4 semaines de développement (après sevrage) que ce soient des rats ou des souris, conformément à la littérature. Les symptômes de stress et d'anxiété se retrouvent plutôt chez des sujets adolescents ou adultes, aussi les traitements qui seront appliqués dans ce projet seront appliqués sur des rongeurs dont le système nerveux central a atteint ce niveau de maturité.

84 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent sous anesthésie une implantation tumorale sous la peau, puis neuf injections dans la veine de la queue ou en intrapéritonéale sur animal vigile, avec pesée et mesure du volume tumoral trois fois par semaine jusqu'à un point limite fixé sur ce volume. Le projet teste si l'ajout d'un stimulateur de l'immunité innée renforce l'effet d'un anticorps que le porteur décrit déjà comme "très efficace" contre le mélanome, les retombées pour les patients en échec thérapeutique étant renvoyées à un élargissement futur des pistes de recherche clinique. Sur le remplacement, il indique que l'efficacité de chaque composé a déjà été validée avant le passage à l'animal, et affirme que seule l'évaluation de leur combinaison sur un "organisme entier" reste possible chez la souris.

Objectifs

Même si les traitements d’immunothérapie ont amélioré les chances de survie pour les personnes atteintes d’un mélanome (cancer de la peau), certains patients ne répondent toujours pas à ces traitements. Pour aider ces patients, de nouvelles stratégies sont en cours de développement. Parmi elles, un anticorps qui agit comme un "pont" entre les cellules immunitaires et les cellules cancéreuses. Il reconnaît une protéine souvent présente sur les cellules de mélanome et aide les cellules immunitaires à mieux attaquer et détruire ces cellules cancéreuses. Ce traitement s’est montré très efficace pour freiner la croissance des tumeurs. D'autres substances sont testées pour booster encore plus cette réponse immunitaire, comme une version modifiée de l’interleukine-2 ou l’anti-PD1. Elles aident à activer les cellules immunitaires qui combattent les tumeurs, sans stimuler celles qui pourraient freiner cette réponse. L’ajout d’un stimulateur de l’immunité innée (appelé agoniste TLR4) permettrait de renforcer l’effet des autres traitements. Cette étude cherche donc à voir si une combinaison de tous ces éléments peut mieux activer les défenses immunitaires contre le mélanome chez la souris.

Bénéfices attendus

Ce projet va renseigner si l’injection d’un agoniste TLR4 en combinaison avec un anticorps et des stimulants est possible, et s’il améliore leurs effets. Cela va permettre l’élargissement des pistes d’études en recherche clinique, et également de proposer des alternatives aux patients atteints de mélanomes qui ne répondent plus aux thérapies.

Procédures

- 1 chirurgie (animal sous anesthésie générale) – durée 5 min - contention + injection du composé immunostimulant dans la veine de la queue et/ou en intra-péritonéale (animal vigile) – durée

Impact sur les animaux

- Stress lié à la contention, aux mesures des volumes tumoraux et pesées (durée de quelques minutes, 3 fois/semaine) - Douleur lors d’injection des traitements dans la veine de la queue et/ou en intra-péritonéale (durée de quelques minutes, 3 fois) - Douleur post-chirurgicale après implantation sous la peau et suture. - Gêne à la locomotion, nuisances possibles si le volume tumoral atteint le point limite.

Devenir

Les animaux seront à mis à mort à la fin des procédures.

Remplacement

Avant le passage sur modèle animal, l’efficacité des différents composés testés ont été préalablement validées. Le modèle animal doit être utilisé pour évaluer l’effet de combinaison de ces composés sur un organisme entier. En effet, la sensibilité des cellules tumorales aux molécules anticancéreuses dépend fortement du système immunitaire et de ses interactions complexes. Par ailleurs, plusieurs paramètres jouant sur la diffusion d’un composé dans le sang et les différents organes, la mise en place de la réponse immunitaire activée, sa migration et son effet sur la tumeur nécessitent de travailler sur un organisme entier. Pour ces raisons, les études chez le modèle souris s’avèrent essentielles.

Réduction

Selon les précédentes expériences, le nombre d’animaux strictement nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs a pu être déterminé grâce à un logiciel statistique, en tenant compte du pourcentage de prise tumorale.

Raffinement

Les souris seront observées quotidiennement en surveillant leur état général, leur comportement critères physiques, ou le moindre signe de douleur. L’altération de ces critères éventuels sera annotée sur une fiche de suivi, et comparée à une grille de score pour détecter le moindre signe de souffrance et prendre les mesures nécessaires afin que le bien-être de l’animal soit respecté. Les souris seront sous anesthésie générale et un antidouleur leur sera administré avant et après implantations des tumeurs. Lors de l’anesthésie, les yeux seront protégés du dessèchement et la baisse de température corporelle sera palliée. Les copeaux de litières seront remplacés par de la cellulose afin d’être moins irritants pour les souris présentant des tumeurs. Les souris seront randomisées par marquage à la queue (feutre de couleur) afin d’éviter le stress des changements de cages/congénères. Lorsque cela est possible, les traitements seront mélangés pour réduire le nombre d’injection à 1 au lieu de 2.

Choix des espèces

Les souris sont particulièrement adaptées pour l’étude de tumeurs de par la disponibilité de modèles tumoraux, de réactifs, et permettent de constituer des groupes avec un nombre de souris suffisant, compatibles avec des résultats suffisamment représentatifs. Les souris seront utilisées entre 5 et 10 semaines. Cette tranche d’âge permet aux souris d’avoir un système immunitaire mature tout en ayant une prise tumorale optimale. Des femelles et des mâles seront utilisés afin d'avoir une bonne représentation de l'effet du médicament.

6 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les actes expérimentaux déclarés tiennent en peu de choses : un gavage unique de trente secondes et, pour certaines, une prise de sang sous anesthésie. L'essentiel de ce que subissent ces souris vient de leur génome, trois lignées modélisant la maladie d'Alzheimer qui développent à partir de neuf mois pertes de mémoire, apathie, déclin cognitif, comportements sociaux altérés et troubles moteurs dont l'ataxie, observés jusqu'à douze mois. Le porteur annonce l'identification à terme de cibles thérapeutiques applicables à l'humain, quand l'objet immédiat reste de décrire la cinétique d'infiltration des macrophages cérébraux.

Objectifs

Ce projet a pour but d'étudier l'hétérogénéité des macrophages cérébraux dans les maladies neurodégénératives. Dans les 10 dernières années une grande diversité de cellulaire a été décrite dans les cerveaux neurodégénératifs grâce à des technique de haute résolution permettant de faire des analyses dans chaque type de cellules. Des macrophages particuliers associés aux plaques amyloïde beta dans la maladie d'Alzheimer ont été identifiés. Parmi ces cellules, une partie est dérivée de microglies embryonnaires et l'autre de monocytes circulants. Le développement de ces macrophages est donc un facteur déterminant leur diversité. Avec le vieillissement et les maladies neurodégénératives, des monocytes infiltrent le cerveau et se différencient en cellules ressemblant à des microglies , ce sont des macrophages inflammatoires associés à la maladie. Des premières expériences semblent montrer que ces programmes et dynamiques varient en fonction du sexe. Or la maladie d’Alzheimer est elle-même grandement corrélée au sexe. L'objectif de ce projet est de caractériser en détail les dynamiques d'infiltration de cellules dans des modèles murins mâles et femelles de vieillissement et maladies neurodégénératives, en particulier la maladie d'Alzheimer, et de comparer ces cellules aux cellules dérivées de macrophages embryonnaires. Cela permettra de donner une nouvelle compréhension des facteurs cellulaires inflammatoires influençant l’établissement de la maladie d’Alzheimer et comment ceux-ci varient en fonction du sexe.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche a pour objectif de déchiffrer les dynamiques cellulaires de macrophages cérébraux dans les cerveaux en vieillissement et neurodégénératifs. En étudiant avec des techniques et modèles murins innovants ces cellules à plusieurs temps de vieillissement, nous pourrons obtenir une cinétique de la neuro-inflammation et de l’infiltration cellulaire. La maladie d’Alzheimer concerne en majorité le sexe féminin. L’étude des deux sexes en parallèle permettra de donner des indications sur les caractères influençant ce déséquilibre . Cela permettra à terme d’identifier de potentielles cibles thérapeutiques pouvant être appliquées à l’Homme.

Procédures

Des procédures incluront un gavage unique (durée 30 secondes), sur animaux vigiles. Des prises de sang uniques seront faites sur certains animaux sous anesthésie générale (durée 1-2 minutes).

Impact sur les animaux

Les principales nuisances attendues lors de cette étude proviennent des trois modèles murins Alzheimer utilisés dans cette étude. Ceux-ci développent des comportements ressemblant à la maladie d’Alzheimer humaine qui peuvent nuire au confort global de l’animal. Ces souris peuvent développer des comportements tels que l'altération de la mémoire, apathie, déclin cognitif, comportements sociaux aberrants à partir de 9 mois liés à la perte neuronale dans certaines zones du cerveaux et des troubles moteurs dont l'ataxie. Des nuisances sont également attendues lors de la manipulation des animaux, notamment un stress et un inconfort de courte durée lors de la contention de l'animal, du gavage qui entraîne un inconfort léger et temporaire.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure pour analyses sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

Pour étudier les dynamiques cellulaires complexes intervenant dans le cerveau neurodégénératifs, les modèles in vitro de culture cellulaires ne font pas intervenir suffisamment de types cellulaires. Les modèles de cérébroïdes et organes sur puces en développement reproduisent uniquement le cerveau embryonnaire mais pas encore le cerveau en vieillissement qui a des dynamiques plus complexes. L’étude de mécanismes au niveau cérébral et sanguin dans le contexte de maladies neurodégénératives requiert l’utilisation d’un organisme vivant complet avec une activité cellulaire complète. De plus, comme ce projet vise à étudier les dynamiques d’infiltration, un contexte physiologique global est nécessaire avec une génération de monocytes dans la moelle et un passage à travers une barrière hémato-encéphalique. Il est donc important de conserver l’activité de l’organisme et des mécanismes physiologiques dans un état dynamique (c'est à dire en mouvement et fonctionnel) dans le cadre d’une étude temporelle.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé par un calcul de puissance statistique afin de garantir une robustesse des résultats tout en limitant l’utilisation d’animaux. Pour une analyse comparative multi-groupes (effet du modèle Alzheimer, sexe, temps d'intêret), nous avons calculé et optimisé le nombres d'animaux nécessairesavec un calcul de puissance, basé sur les observations passées au laboratoire. Ce design expérimental permet d’atteindre une puissance statistique suffisante tout en respectant les principes éthiques de la réduction animale. Le caractère des expérimentations (études sur les cerveaux) ne permet malheureusement pas de suivre un animal. La mise en place des procédures finales sera réalisée en fonction des résultats obtenus dans les premières procédures

Raffinement

Les cages sont enrichies avec du matériel de nidification, maisons en cartons, bâtonnets. L'enrichissement pourra être augmenté pour les animaux vieillissants. Pour faciliter l'alimentation en cas de besoin, du u aliment adapté énergétique et facile à consommer sera utilisé. Les manipulations (contention, gavage, prélèvements) seront effectuées par des personnes formées et compétentes. Les méthodes d'analgésie et d'anesthésie des animaux permettront de diminuer toute souffrance ou détresse liées aux manipulations. Des mesures de surveillance quotidienne sont mise en place par des personnes compétentes et formées.Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Les souris sont des modèles expérimentaux largement utilisés dans la recherche biomédicale en raison de leur similitude génétique avec l'humain, leur taille modeste et leur cycle de vie relativement court, ce qui permet d'étudier les effets de traitements et de pathologies sur plusieurs générations. Des modèles ont été choisis pour cette étude en raison de leur pertinence dans la recherche sur la maladie d'Alzheimer et leur complémentarité. Ces modèles murins ciblent différents gènes associés à la pathologie et reproduisent des aspects clés de la pathologie, notamment les dépôts de plaques amyloïdes et les déficits cognitifs, permettant d'étudier les mécanismes sous-jacents de la maladie à différents stades de son développement. L'utilisation de trois stades de développement (3, 6, 9 et 12 mois) permet d'examiner l'évolution progressive de la pathologie, en ciblant des périodes spécifiques du développement de la maladie : l'apparition initiale des symptômes, leur progression intermédiaire, et les stades avancés.

288 souris subissent une chirurgie de quarante minutes sous anesthésie et une injection, réalisée pendant la vie embryonnaire ou à la naissance, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur justifie le choix de la souris par le seul fait que ce travail fait suite à un autre projet mené chez la souris. Une partie des jeunes est ensuite hébergée seule pendant deux semaines, pour mesurer l'effet de l'isolement social à l'adolescence sur les neurones du gyrus denté. Toutes les femelles gestantes opérées sont mises à mort, jugées inutilisables ailleurs, tandis qu'une partie de la progéniture est gardée en vie pour la suite de l'étude et une autre mise à disposition de l'institut pour d'autres projets.

Objectifs

Ce projet vise à étudier comment l’isolement social à l’adolescence influence le développement des neurones d'une structure du cerveau très sensible au stress.

Bénéfices attendus

En caractérisant l’effet de l’isolement social sur l’architecture des neurones générés à différentes périodes de vie, cette étude pourrait contribuer à une meilleure compréhension des altérations neurobiologiques impliquées dans les troubles psychiatriques liés au stress social précoce.

Procédures

Les animaux seront soumis aux procédures suivantes : Anesthésie : Chaque animal recevra 1 anesthésie d'une durée de 30 min ; Procédure chirurgicale : Chaque animal sera soumis à 1 procédure chirurgicale d'une durée de 40 min ; Injection : Chaque animal sera soumis à 1 injection d'une durée de 5 sec lorsque réalisée durant la vie embryonnaire ou lorsque réalisée à la naissance. Une partie des animaux, provenant des groupes « isolement social » seront soumis à une période d’hébergement individuel de deux semaines.

Impact sur les animaux

Les nuisances majeures que pourraient subir les souris sont liés principalement à la chirurgie. La douleur associée à ces chirurgies pourrait avoir des répercussions sur le bien-être de l'animal. De plus, l'isolement social peut induire un état de stress et de détresse de degré modéré puisque de courte durée.

Devenir

Toutes les femelles, anciennement gestantes, seront mises à mort car ayant déjà subi une intervention chirurgicale, elles ne pourront pas être utilisé dans le cadre d’un autre projet. Une partie de la progéniture sera gardée en vie pour la réalisation de la suite de l’étude, et l'autre partie sera mis à disposition à l'ensemble de l'institut afin de réaliser d'autre projet, après accord de la vétérinaire de l'établissement. Tous les animaux ayant reçu les deux injections seront mis à mort à la fin de l’étude afin de pouvoir collecter et analyser les différentes populations de neurones. Les souriceaux de la portée n’ayant pas été soumis à la seconde injection seront mis à disposition au sein de l’Institut pour la réalisation d’autre projet, après accord avec la vétérinaire.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’étudier les caractéristiques anatomiques de neurones générés à différents moments de la vie dans une structure cérébrale particulièrement sensible au stress en réponse à un isolement social. Pour cela, il est nécessaire de réaliser ces manipulations sur des animaux vivants, car le stress et le développement de cette structure cérébrale ne peuvent pas être modélisés in vitro ou in silico.

Réduction

Nous prévoyons d’utiliser le nombre minimal de souris nécessaire pour obtenir des analyses statistiques fiables et cohérentes. Nos expériences précédentes ainsi que la qualité de nos procédures basées sur des années d'expertise, nous permettront de réduire significativement le nombre d'animaux utilisés. Les animaux d'une même portée seront utilisés pour deux temps d'analyse différents.

Raffinement

Pour réduire toute souffrance liée à la chirurgie, les règles suivantes seront appliquées pour le bien-être des animaux : 1- Avant les chirurgies, un analgésique sera administré, à titre préventif afin d’éviter la souffrance post-opératoire. 2- Les chirurgies se feront sous anesthésie générale. Un suivi post-opératoire sera assuré afin d'évaluer le bien-être de l'animal par la mesure du poids, l’évaluation de l’apparence et du comportement. Des points limites stricts et précis sont définis pour détecter précocement d'éventuelles souffrances des animaux. Si l'animal est en souffrance, un analgésique sera injecté. Un soin particulier sera également accordé à leurs conditions d’hébergement.

Choix des espèces

Le modèle utilisé dans ce projet est la souris car il fait suite à un autre projet réalisé chez la souris. Dans la structure cérébrale étudiée, les neurones sont générés de la vie embryonnaire à l'âge adulte. Nous ciblerons les cellules à l'origine de ces neurones et ce à différents moments de la vie de l'animal : 1) pendant la vie embryonnaire, 2) à la naissance, 3) en période juvénile et à 4) l'âge adulte. Ces temps précis d'analyse ont été choisi en fonction de la littérature et de nos études précédentes.

Injectées de plasmides par voie hydrodynamique, soumises à des prélèvements sanguins répétés puis infectées par le virus de la fièvre jaune, 1 000 souris, dont des lignées immunodéficientes et des lignées humanisées, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique que l'injection de plasmides provoque des hématomes, des troubles cardio-respiratoires et une altération marquée de l'état général, et que l'infection peut entraîner perte de poids, hypothermie, paralysie des membres postérieurs et mort. L'effectif ne repose sur aucun calcul statistique : il est estimé à partir du nombre d'études des années précédentes et d'une croissance anticipée, "en accord avec le plan commercial". Deux cents souris pourront être transférées vers un protocole de formation interne aux gestes techniques, à condition de n'avoir pas été infectées, les autres étant tuées en atteignant les points limites ou sur décision du vétérinaire.

Objectifs

La fièvre jaune est une maladie virale transmise par les moustiques, principalement dans les régions tropicales. Elle peut causer de la fièvre, des douleurs musculaires et des nausées. Dans 15% des cas, la maladie évolue vers une forme grave, caractérisée par une jaunisse et des hémorragies pouvant entraîner le décès du patient. Il n’existe pas de traitement antiviral pour soigner cette maladie, mais la vaccination est efficace pour la prévenir. Le vaccin est préparé à partir d’un virus vivant atténué. Les objectifs de ce projet sont multiples : - Modéliser et caractériser l’infection par le virus de la fièvre jaune dans des souris - Evaluer l’innocuité de composés de recherche à visée prophylactique ou thérapeutique (traitements ou vaccins) - Caractériser les réponses immunitaires induites par ces composés de recherche - Evaluer l’efficacité antivirale de ces composés de recherche chez des souris infectées par le virus de la fièvre jaune Pour répondre à ces objectifs, nous utiliserons des souris conventionnelles non-humanisées (immunocompétentes ou immunodéficientes), ou des souris dites humanisées (système immunitaire ou foie), ou doublement humanisées (système immunitaire + foie).

Bénéfices attendus

Grâce à ce projet, nous mettons à disposition des chercheurs un modèle préclinique prédictif permettant d'étudier le virus de la fièvre jaune ainsi que l’efficacité de composés de recherche innovants.

Procédures

Des administrations de composés à visées thérapeutiques seront réalisées avec une fréquence définie par le protocole d’étude. Leurs durées seront de 10 à 15 secondes chacune. Des prélèvements sanguins seront réalisés sur souris avec ou sans anesthésie. Les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids et à l’âge de l’animal avec une limite fixée sur une période glissante de 14 jours. Une réhydratation avec du sérum physiologique sera réalisée si nécessaire. La répartition des prélèvements figurera dans le protocole de l’étude et sera contrôlé par un vétérinaire. Chaque prélèvement durera quelques secondes. Pour les analyses nécessitant un volume plus important, un prélèvement terminal sous anesthésie gazeuse sera réalisé. Les animaux recevront des injections de solution saline isotonique contenant des plasmides, une ou deux fois selon la durée de l’étude. Ces injections, administrées uniquement aux souris de plus de 18 g, dureront entre 10 et 15 secondes. Les injections pourront être répétées selon le protocole et dureront quelques secondes. À l’issue des études, les animaux seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires. Toutes les interventions seront réalisées sous un suivi clinique rigoureux afin de minimiser douleur et stress des animaux.

Impact sur les animaux

-Injection de plasmides : les nuisances attendues sont des hématomes et des troubles cardio-respiratoires et une altération marquée de l’état général, pendant les minutes suivants l’injection. -Administration de traitements ou de virus : il n’y a pas de nuisances attendues, mais il existe un risque d’observer des effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques, hématome, douleur, lésion au site d’administration (notamment si administrations répétées). L’infection par le virus de la fièvre jaune peut entraîner une perte de poids, une hypo-activité, une diminution de la température corporelle, une paralysie des membres postérieurs traduisant une atteinte neurologique, et la mort. - Prélèvements sanguins : il n’y a pas de nuisance attendue mais un risque d’hématome, douleur, lésion au site de prélèvement (notamment si prélèvement répétés). La douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés soit parce qu’ils atteignent les points limites, soit par décision du vétérinaire. Certains animaux pourront être réutilisées dans le projet « Formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris », sous réserve que les souris n’aient pas subit de geste plus sévère qu'une injection hydrodynamique et qu’elles n’aient pas été infectées avec le virus. Cette réutilisation permet de ne pas commander des souris spécifiquement pour la Formation mais d’utiliser nos souris déjà présentes.

Remplacement

Il n’est à l’heure actuelle pas possible de recréer in vitro un modèle étudiant les interactions complexes qui peuvent exister entre le système immunitaire et le virus de la fièvre jaune, permettant de reproduire l’infection du virus tout en objectivant les effets thérapeutiques et toxicologiques de composés de recherche destinés à son traitement ou sa prévention. Les modèles murins constituent donc une approche scientifiquement valide, robuste et indispensable au développement et à la mise à disposition de thérapies innovantes pour les patients.

Réduction

Un total de 1000 souris seront utilisées, couvrant une période de 5 ans et permettant de réaliser environ 20 études précliniques de 50 souris. Aucune approche statistique n'a été réalisée pour le nombre total d’études, ou pour le nombre total d’animaux dans le projet, l’estimation du nombre d’animaux est réalisée sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial.

Raffinement

En début d'étude, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables de 5 individus maximum. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux (ex : Diet Gel). La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour limiter la douleur, la souffrance et l’angoisse, une échelle de scores cliniques (pelage, mobilité, état général, activité, comportement, etc…) sera appliquée dès le premier geste invasif ou dès qu’un signe d’altération sera observé lors de la surveillance quotidienne. Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur. Concernant les prélèvements sanguins, le volume maximal est défini, au-delà il s’agira d’un prélèvement terminal sous anesthésie. Les fréquences sont limitées et une réhydratation est prévue. Des mesures pour éviter tout stress au moment de l’euthanasie sont prévues. Les points limites conduisant à une euthanasie seront fonction des scores cliniques et de la perte de poids.

Choix des espèces

90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes produisent des effets différents entre souris et humain, le remplacement du gène de la souris par son équivalent humain ou de manière fonctionnelle par greffe de cellules humaines dans une lignée immunodéficiente permet la création de lignées humanisées. Le modèle murin a été choisi en raison de sa capacité à reproduire des aspects clés de la pathogénie de l’infection par le virus de la fièvre jaune, notamment en conditions d’immunodéficience ou après adaptation virale. Certaines souches ou lignées modifiées permettent de mimer la susceptibilité humaine (atteinte hépatique, réponse inflammatoire), ce qui en fait un modèle pertinent pour l’évaluation de composés antiviraux ou prophylactiques. Pour les souris non humanisées et humanisées avec des cellules sanguines provenant du sang périphérique, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 4 semaines, ces souris pouvant être utilisées dès leur sevrage. Pour les souris humanisées avec des cellules souches issues de cordons ombilicaux humains, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 8 semaines, première apparition des cellules humaines dans le sang. Pour les souris humanisées au niveau du foie ou double-humanisées (foie + système immunitaire), les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 13 semaines, première apparition des hépatocytes dans le foie.